CN104415350A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表达载体的沙门氏菌。该疫苗组合物解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗需通过注射免疫，及其免疫后所造成的易出现结块等副作用的问题；还解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗制备过程中，存在病毒逃逸的生物安全问题。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品，特别是涉及一种疫苗组合物，以及制备方法和应用。
背景技术
兔瘟是对养兔业造成危害最大的一种病毒性传染病，具有高度接触致死性，其病原体是兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）。RHDV经呼吸道和消化道的黏膜进行感染，主要感染3月龄以上的家兔，发病率为90%-100%，致死率为95%-100%。
RHDV为杯状病毒科（Caliciviridae）、兔病毒属（Lagovirus），为单股正链RNA病毒，其基因组长7437nt，含有2个开放阅读框（ORF），无囊膜，表面有壳粒。RHDV病毒粒子的衣壳由180个亚单位组成，这些亚单位在化学结构上完全相同，单体分子称为VP60。VP60是RHDV的主要结构蛋白，分子量约为60kDa，可刺激机体产生中和抗体。
目前，疫苗免疫对RHDV的预防和/或治疗起重要作用。然而市场上销售的兔瘟疫苗大多为组织灭活苗，需通过注射免疫，且免疫后易出现结块等副作用。另外，RHDV组织灭活疫苗在制备时，需将兔瘟病毒注射兔，取致死兔肝、脾组织进行灭活，从而导致出现病毒逃逸的生物安全问题。
陈宝林等公开了一种兔瘟疫苗（新剂型兔瘟疫苗的研究[J]中国畜禽传染病19971：28-30），将攻毒后兔肝脏等器官经研磨后加入福尔马林灭活加入油乳剂制成疫苗。然而该兔瘟油乳剂灭活苗吸收差，有大小不一颗粒及针头状出血点，免疫后25天尚未完全吸收。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物采用鼠伤寒沙门氏菌载体表达兔瘟病毒VP60蛋白，以制备RHDVVP60蛋白重组活载体疫苗，从而解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗需通过注射免疫，及其免疫后所造成的易出现结块等副作用的问题；还解决了现有的兔瘟组织灭活疫苗制备过程中，存在病毒逃逸的生物安全问题。
本发明的兔瘟疫苗组合物可通过口服途径进行免疫，解决了现有兔瘟病毒疫苗需注射免疫，以及免疫后注射部位出现结块等问题；制备过程也比较安全，同时避免了病毒逃逸的生物安全问题。
本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表达载体的沙门氏菌。
优选地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列为SEQ ID NO.2；更优选地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
优选地，所述表达载体为原核表达载体；更优选地，所述载体携带asd基因，可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；进一步优选地，所述载体为pYA3341、pYA3342、pYA248、pYA262中的一种或几种或其改进型。
优选地，所述沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌；更优选地，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型菌株；进一步优选，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550。
优选地，所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为脱脂奶粉、蔗糖、明胶、海藻糖中的一种或几种。
优选地，所述疫苗组合物中沙门氏菌含量为≥1×109cfu/头份；优选地，所述沙门氏菌含量为≥1×1010cfu/头份。
本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：（1）反转录兔瘟病毒VP60基因，将其连接到克隆载体扩增，然后连接到表达载体，获得重组表达质粒；（2）将所述重组表达质粒转入第一中间宿主菌扩增，然后转入第二中间宿主菌进行甲基化修饰，获得经甲基化修饰的重组质粒；（3）将所述重组质粒转入终宿主菌，诱导表达，获得兔瘟疫苗组合物。
优选地，所述步骤（1）中克隆载体为pGEM-T、pMD18-T、pMD19-T、PUC18的一种或几种；所述的表达载体为携带asd基因、可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的原核表达载体。
优选地，所述步骤（2）中所述的第一中间宿主菌为X6212，所述的第二中间宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730；所述步骤（3）中所述的终宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，更优选为所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550为asd基因缺陷型菌株。
本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗兔瘟病毒性传染病的药物中的应用。
基于此，本发明具有以下突出的优点：
（1）本发明的兔瘟疫苗组合物可通过口服途径进行免疫，不经过传统的注射途径，避免了现有组织疫苗免疫注射后，注射部位出现结块现象所带来的副作用，同时也不需添加增强免疫效力的添加物质。
（2）本发明所制备的兔瘟疫苗组合物含有兔瘟病毒的结构蛋白VP60基因，免疫动物后可同时产生细胞免疫和体液免疫应答，尤其可有效刺激动物黏膜产生分泌型的抗体；
（3）本发明所述的兔瘟疫苗组合物在制备过程中，不需要使用具有感染性的兔瘟病毒，比较安全，避免了病毒逃逸的生物安全问题。
序列表中：
序列1为兔瘟病毒RHDV毒株VP60蛋白核苷酸序列；
序列2为兔瘟病毒RHDV毒株VP60蛋白氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本实施例中所用的“免疫量”是指提供针对流感疫苗的免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。
本实施例中所用的兔瘟病毒VP60基因序列，来源于已报道的兔瘟中国分离株，在NCBI中的序列号为DQ280493.1。
下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1兔瘟病毒VP60克隆载体的构建
根据已报道RHDV毒株的VP60序列（NCBI登录号为DQ280493.1），设计上、下游引物，并在两端分别添加BamHI和PstI酶切位点，PCR扩增VP60基因全长序列。引物由Invitrogen公司合成，上游引物序列为CGGGATCCATGGAGGGCAAAGC，下游引物序列为CCCTGCAGTCAGAC ATAAGAAAAGC。将病兔肝组织样品加入10倍体积的生理盐水研磨，3000rpm离心10min，取上清，提取总RNA，同时，进行RHDV反转录以获得cDNA片段。将获得的cDNA片段作为模板，进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1%凝胶进行电泳检测。结果出现1740bp的条带，与目的基因片段大小相同。
将目的基因片段回收，与pGEM-T连接，连接体系：VP60基因20μl、pGEM-T载体0.5μl、连接酶缓冲液2.0μl、T4DNA连接酶1.0μl、灭菌双蒸水8.5μl。连接反应条件为16℃，30min。将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰上放置30min，然后42℃加热45s，置冰上1min，加入890μl的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养板，37℃培养过夜。结果显示：LB固体培养基出现白色小菌落。挑典型菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，200rpm培养10h。
实施例2兔瘟病毒VP60克隆载体pGEM-T-VP60的鉴定
PCR扩增上述实施例1中pGEM-T-VP60载体转化的DH5α细菌VP60基因，PCR程序如实施例1所述。提取PCR阳性的DH5α质粒，使用BamH I、PstI双酶切鉴定，所用酶切体系如表1所示，酶切反应条件为37℃反应4h。酶切产物使用1%凝胶电泳检测，并回收目的基因。将PCR和酶切鉴定均为阳性的质粒，送基因公司进行测序。
表1酶切反应体系
| 试剂 | 体积（μl） |
| 重组质粒 | 12.0 |
| 10×Buffer | 4.0 |
| BamH I | 1.5 |
| PstI | 1.5 |
| 灭菌水 | 1.0 |
结果：PCR扩增pGEM-T-VP60转化的DH5α，出现1740bp目的基因片段。提取DH5α转化菌质粒，酶切出现2.4kb的载体片段和1740bp的目的片段，表明目的基因整合到质粒，构建成功pGEM-T-VP60。将阳性菌提取的质粒测序，测序结果见SEQ ID NO.1。
实施例3兔瘟病毒VP60表达载体pYA3341-VP60的构建与鉴定
pYA3341质粒使用BamH I和PstI双酶切，酶切体系及方法如实施例2中的表1所示。酶切产物电泳后，出现约2600bp的目的条带，回收pYA3341载体基因片段，并与实施例2中回收的VP60片段连接，连接体系如表2，连接条件为16℃反应过夜，获得pYA3341-VP60。将pYA3341-VP60质粒转化X6212感受态细菌，转化方法同实施例1，转化后，接种含50μg/ml DAP的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑单菌落接种含50μg/ml DAP的LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜，同时构建含pYA3341空质粒的X6212对照。提取X6212转化菌质粒，按实施例2所述，使用BamH I、PstI双酶切。将鉴定为阳性的质粒送Invitrogen公司测序。
表2pYA3341与VP60连接体系
| 试剂 | 体积（μl） |
| pYA3341 | 9.0 |
| VP60基因 | 3.0 |
| Buffer | 2.0 |
| 连接酶 | 2.0 |
| 灭菌水 | 4.0 |
结果：X6212重组质粒经BamH I、PstI双酶切鉴定，出现约2.6kb的载体片段和1740bp的VP60基因，说明VP60目的基因连接至pYA3341载体。将质粒送基因公司测序，结果与目的基因VP60序列一致，说明：兔瘟病毒VP60表达载体pYA3341-VP60的构建成功。
实施例4重组表达质粒pYA3341-VP60转入减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730和X4550
采用电转化法将重组质粒pYA3341-VP60转入减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730，转化方法如实施例1所述，转化菌接种含50μg/ml DAP的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑单菌落接种含50μg/ml的DAP的LB液体培养基，37℃、200rpm培养10h后，进行菌液PCR鉴定，操作程序同实施例1；并使用BamH I、PstI双酶切鉴定，操作程序同实施例2。将鉴定为阳性的质粒，进一步转化入X4550终末宿主菌，转化方法同实施例1，并将转化菌分别进行PCR和酶切鉴定。
结果，pYA3341-VP60质粒分别转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730和X4550，PCR扩增后获得1740bp的VP60片段；双酶切鉴定，出现2.6kb的载体片段和1740bp的目的基因片段。
实施例5VP60蛋白在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550的表达鉴定
5.1SDS-PAGE鉴定
重组含pYA3341-VP60质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550接种10ml含50μg/ml DAP的LB液体培养基，37℃、200rpm培养8h，12000rpm离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，同时设置含pYA3341质粒的X4550对照。
结果显示：pYA3341-VP60重组质粒转入X4550菌，培养后，SDS-PAGE电泳，相对于含pYA3341质粒的X4550菌，在60KDa附近出现条带，而对照X4550菌，未出现相应目的条带。
5.2Western Blot鉴定
将含pYA3341-VP60质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550进行SDS-PAGE电泳鉴定。使用蛋白转膜仪转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，加入兔抗兔瘟病毒多克隆抗血清，室温作用2h，使用PBST洗涤4次，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗兔多克隆抗体，37℃作用2h后，进行显色。
结果表明：重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550菌pYA3341-VP60表达的VP60蛋白，可特异性的与兔抗RHDV阳性血清进行反应。
实施例6重组菌苗X4550（pYA3341-VP60）体外特性检测
6.1pYA3341-VP60质粒在X4550中的体外稳定性检测
将重组菌苗X4550pYA3341-VP60与X4550pYA3341按1%的量分别接种于不含DAP和含有DAP的LB液体培养基中再培养，重复10次，取少量等量菌液均匀涂于含DAP的LB平皿上，培养过夜，挑取单菌落分别接种于不含DAP的LB平皿，培养观察，并统计菌落生长状况及数量。若单菌落不能在该培养基中生长，表明重组质粒丢失；若能够正常生长则提取重组质粒，并进行PCR鉴定，观察重组质粒的稳定性。
结果：重组菌苗X4550（pYA3341-VP60）连续传代10次，重组菌苗在选择培养基生长良好，PCR鉴定表明各代培养菌中均含有重组质粒，表明重组质粒pYA3341-VP6在X4450菌中具有良好的稳定性。
6.2重组菌苗的安全性测定
将Balb/c小鼠30只随机分为6组，5只/组，各组攻毒免疫情况如表3所示，免疫途径为口服，免疫后，常规饲喂30天，观察和记录小鼠口服菌株后的反应及存活率。
表3pYA3341-VP60重组质粒的安全性试验
| 组号 | 数量 | 免疫原 | 免疫剂量 |
| 1 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×109cfu |
| 2 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×1010cfu |
| 3 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×1011cfu |
| 4 | 5 | X4550pYA3341 | 1×1012cfu |
| 5 | 5 | 野生型沙门氏菌 | 1×107cfu |
| 6 | 5 | PBS | 1ml |
结果：重组菌苗经口服免疫小鼠后，试验1、2、3、4组的小鼠，采食及饮水均无异常，存活率为100%，且体重变化无明显差别；口服野生型沙门氏菌小鼠的试验组5，1周内全部死亡,。口服PBS的小鼠，全部健康存活。表明重组菌苗X4550（pYA3341-VP60），即所制备的兔瘟疫苗组合物具有较好的安全性。
实施例7动物保护试验
7.1免疫
将体重1.5-2.0kg的试验兔，随机分为5组，5只/组，将含pYA3341的空质粒和免疫量的兔瘟疫苗组合物，分别免疫试验兔，各组免疫情况见表4，免疫途径为口服。免疫前，试验兔禁水6h，用5ml10%NaHCO3灌胃20min。同时，设生理盐水免疫对照组。免疫后第7、14、21天，耳缘静脉采集并分离免疫兔血清，使用血凝抑制试验HI检测免疫兔血清抗RHDV抗体效价。
表4pYA3341-VP60重组疫苗免疫情况
| 试验组号 | 免疫兔数量 | 免疫原 | 免疫剂量 |
| 1 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×1010cfu |
| 2 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×109cfu |
| 3 | 5 | X4550pYA3341-VP60 | 1×108cfu |
| 4 | 5 | X4550pYA3341 | 1×1010cfu |
| 5 | 5 | 生理盐水 | 1ml |
结果，试验1、2、3组的HI抗体滴度，免疫后一周，分别为1:23、1:22、1:22；免疫后两周，HI抗体滴度为1:24、1:23、1:23；免疫后三周，HI抗体滴度为1：211、1：210、1：29，而试验组4及试验组5，均未检测到相应的抗体。
表5pYA3341-VP60重组疫苗免疫后HI抗体滴度情况
7.2IgA检测
免疫后，第7、14、21天，分别收集兔粪便，使用ELISA方法检测兔肠道粘膜IgA的含量。将兔粪便加入到10倍体积的缓冲液中，混匀后，4℃，3000rpm离心10min，检测上清液中IgA的含量。
将RHDV感染兔并致死，然后取兔肝组织，添加10倍体积生理盐水进行匀浆，反复冻融三次，离心，8000rpm，10min，取上清，上清液用包被缓冲液进行稀释，包被ELISA板，100μl/孔，4℃冰箱过夜。用洗涤缓冲液洗涤3次，使用5%脱脂奶粉封闭，37℃封闭1h。加被检兔粪便离心后的上清液，100μl/孔，置37℃孵育1h，使用PBST洗涤液，洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔IgA作为二抗，37℃孵育1h，用PBST洗涤液洗涤3次后，加新配制的底物37℃作用5min，加2M/L的硫酸溶液终止，测样品的OD450值。
结果：ELISA检测兔肠道中抗RHDV特异性IgA，免疫三周后，试验1、2、3组兔肠道IgA抗体效价分别为1:2560、1:1280、1:1280，试验4、5组均未检测到相应的抗体。
实施例8攻毒保护试验
免疫后3周，使用RHDV感染致死兔的肝组织悬液进行皮下注射攻毒，攻毒剂量为1ml/只。攻毒后1周，比较各免疫组兔子死亡数量。
结果：免疫后三周，使用RHDV感染病兔肝组织悬液进行攻毒。攻毒后一周，试验1、2组保护率为100%，试验组3死亡率为80%，试验4、5组兔的死亡率为100%。由此可知，所制备的一定含量的兔瘟疫苗组合物可以用于预防和/或治疗兔瘟病毒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表达载体的沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列为SEQ ID NO.2；优选地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述表达载体为原核表达载体；更优选地，所述载体携带asd基因，可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；进一步优选地，所述载体为pYA3341、pYA3342、pYA248、pYA262中的一种或几种或其改进型。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌；优选地，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型菌株；进一步优选，所述沙门氏菌为asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为脱脂奶粉、蔗糖、明胶、海藻糖中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中沙门氏菌含量为≥1×109cfu/头份；优选地，所述沙门氏菌含量为≥1×1010cfu/头份。
7.一种疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：
（1）反转录兔瘟病毒VP60基因，将其连接到克隆载体扩增，然后连接到表达载体，获得重组表达质粒；
（2）将所述重组表达质粒转入第一中间宿主菌扩增，然后转入第二中间宿主菌进行甲基化修饰，获得经甲基化修饰的重组质粒；
（3）将所述重组质粒转入终宿主菌，诱导表达，获得兔瘟疫苗组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤（1）中克隆载体为pGEM-T、pMD18-T、pMD19-T、PUC18的一种或几种；所述的表达载体为携带asd基因、可编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的原核表达载体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤（2）中所述的第一中间宿主菌为X6212，所述的第二中间宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730；所述步骤（3）中所述的终宿主菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，更优选为所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550为asd基因缺陷型菌株。
10.权利要求1～6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗兔瘟病毒性传染病的药物中的应用。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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