CN107201376A - 一种兔瘟口服疫苗il‑2佐剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兔瘟口服疫苗IL‑2佐剂及应用，该兔瘟口服疫苗IL‑2佐剂是由重组菌SL7207‑pVAX1‑IL‑2和重组菌SL7207‑pVAX1‑VP60混合制备而成。本发明分别构建减毒沙门氏菌SL7207递呈的重组菌株SL7207‑pVAX1‑IL2和SL7207‑pVAX1‑VP60并将两种重组细菌共同免疫家兔，IL‑2能够发挥免疫刺激作用从而增强口服疫苗的免疫效果。本发明的佐剂安全、生物安全性高，免疫方式简单高效，疫苗制备简单并且具有双重佐剂效果。

Description

一种兔瘟口服疫苗IL-2佐剂及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种兔瘟口服疫苗IL-2佐剂及应用。
背景技术
兔病毒性出血症(Rabbit haemorrhagic disease,RHD)是由兔病毒性出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、高致性传染病，又称“兔瘟、兔出血症”。本病主要以实质性器官出血、淤血及水肿，气管出血，肺脏的出血肿胀及高烧(>40℃)为主要特征。兔病毒性出血症于1984年在中国江苏江阴、无锡等地首次报道，在不到一年的时间里约1亿4千万家兔因本病死亡，感染面积近5万平方公里。兔病毒性出血症只感染兔，其中对家兔和欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)危害最大，经过实验表明其它兔类动物感染本病后并未表现出明显的临床症状，包括黑尾兔(Lepus californicus)、火山兔(Romerolagus diazi)和棉尾兔(Sylvilagusfloridanus)。本病主要感染二月龄以上青壮年家兔与成年兔，乳兔及一月龄仔兔并不易感。RHD的爆发暂无明显季节性因素，但北方多在较寒冷的季节发生，可能与环境因素等条件影响了家兔抵抗力有关。RHDV的传播可分为直接传播与间接传播；直接传播指接触病兔及带毒兔，或者接触带毒兔的排泄物和分泌物；间接感染主要指接触感染兔使用过的食具、笼具、饲养器械等。另外，RHDV还可以通过附着于商品上通过贸易活动及迁徙的鸟类进行传播。本病爆发来势凶猛，感染家兔通常呈急性死亡症状，病死率高达70％-90％。
VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白，分子量大小约为60ku，180个VP60单体共同组成病毒粒子的核衣壳。是病毒免疫保护性抗原，在诱导宿主免疫反应中起重要作用。Torrecuadradan等研究发现VP60蛋白N端的第31位至第250位氨基酸残基是RHDV的主要抗原区域，并且C端的第477位至第579位氨基酸残基也是RHDV的抗原区域。Farnos等将RHDVAST/89株的VP60基因转入毕赤酵母系统中进行表达，免疫VP60蛋白的兔子能够产生强烈的特异性反应，并能够抵御攻毒计量为100LD50的同型病毒。
由于体外培养系统的缺乏，目前生产上针对RHD的预防主要以来注射组织灭活苗，为了增强疫苗免疫效应常常将佐剂与疫苗共同免疫以增强机体免疫应答反应，常用的免疫佐剂主要有油佐剂、铝佐剂、皂苷类佐剂和细胞因子佐剂等，但研究发现，油佐剂和皂苷类佐剂易引起较为严重的不良反应或副作用，铝佐剂针对细菌或寄生虫性抗原为良好佐剂但对Th1免疫应答(细胞免疫)较弱，然而细胞因子来源于宿主本身安全性高，能够促进机体免疫应答反应因此可作为基因工程疫苗的良好佐剂。
1976年，Morgan等利用丝裂原刺激T淋巴细胞后在其表面发现一种对T细胞增殖具有正向调控作用的因子，故称为T细胞增长因子(T cell growth factor,TCGF)，1979年正式更名为白细胞介素-2。IL-2与细胞膜上的受体结合是其发挥功能的首要条件，1981年，Robb等首次证实了白介素-2受体(IL-2R)的存在，随后在活化的T、B淋巴细胞、大颗粒细胞(LGL)等细胞表面均证实了数量结构不同的IL-2R受体的存在。IL-2R主要由3个亚基组成分别为α、β和γ链。根据与IL-2亲和力的不同可分为强、中、弱三类分别由α、β、γ链组成；α、β链组成；α链组成，其中IL-2Rα只与IL-2特异性结合；同时，β链是IL-15受体的重要组成部分；γ链是IL-2、IL-4、IL-7等受体的必要组成成分。IL-2R(α、β、γ)和IL-2R(α、β)是IL-2功能信号传导的主要受体，在信号转导过程中发挥重要作用。
IL-2作用的细胞种类广泛，主要作用与于CD4+、CD8+T细胞、B淋巴细胞、NK细胞和中性粒细胞；主要表现为诱导CD4+T细胞的增殖与分化、促进细胞凋亡、诱导Th1和Th2型细胞的分化但抑制Th17型细胞，参与CD8+T效应细胞的增殖与分化、增强溶细胞活性、同时促进CD8+T的增殖与分化，IL-2主要通过自分泌的方式反作用于T淋巴细胞，即由T淋巴细胞分泌的IL-2又可作用与T淋巴细胞本身，从而促进自身的增殖与分化；IL-2可促进活化的B淋巴细胞的增殖、提高抗体(IgG和IgM)分泌水平；促进NK细胞的增殖及相关细胞因子的产生、提高溶细胞能力；促进中性粒细胞细胞因子的分泌。IL-2可作用于多种细胞因子受体(图1)，IL-2通过调节细胞因子受体的表达量从而调节细胞的分化，IL-2能够通过诱导IL-12Rβ2和IL-12Rβ1的表达促进Th1型细胞的分化；诱导IL-4Rα的表达从而促进Th2型细胞的分化；通过增强IL-2Rα的表达来对调节性T细胞的分化进行正向调节；除此之外IL-2对部分淋巴细胞同样存在抑制作用，例如IL-2对Th17型细胞的分化起负向调控作用，IL-2对IL-7Rα同样具有抑制作用以达到促进细胞凋亡和记忆型T细胞的生成。
白细胞介素-2发现至今已约40年之久，随着人们对其研究的深入，IL-2已成为在人类医学和动物医学上进行疾病的预防、诊断和治疗的首选细胞因子，并且在基因工程疫苗的制备方面展现出良好的应用前景。虽然关于人类在健康和疾病状态下的血清IL-2的水平认知仍然相对有限，但是部分研究仍然证明了IL-2在疾病发生过程的二者的相关性：如升高的IL-2的水平与非小细胞肺癌相关；此外，血清中高水平的IL-2与自身免疫性疾病如硬皮病和类风湿性关节炎相关；无独有偶，在慢性乙型肝炎患者体内IL-2水平也呈现升高的趋势；然而，值得注意的是，在许多研究中已经证实可溶性IL-2受体(sIL-2R)的表达水平与部分自身免疫性疾病相关且sIL-2R水平的升高与疾病的严重程度呈正相关，因此有人预测可以通过这一现象监测疾病的复发。IL-2对自身免疫性疾病的治疗同样有促进作用，Koreth等(Koreth J,Matsuoka K,Kim H T,et al.Interleukin-2and regulatory Tcells in graft-versus-host disease[J].New England Journal of Medicine,2011,365(22):2055-2066.)对经糖皮质激素治疗无效的GVHD活动期患者，注射适量的IL-2发现受试者病情均得到好转且部分患者的糖皮质激素的注射剂量明显低于使用前；Saadoun等(Saadoun D,Rosenzwajg M,Joly F,et.al.Regulatory T-Cell Responses to Low-DoseInterleukin-2in HCV-Induced Vasculitis[J].New England Journal of Medicine,2011,365(22):2067-2077.)采用类似的方法治疗丙型肝炎患者，同样取得成效。
IL-2不仅在人类疾病治疗与预防发面发挥重要作用，在动物疾病防治方面同样如此。多项研究表明，IL-2可以提高机体的特异性免疫应答能力，并且可以促进多种细胞因子的分泌与表达从而增强机体抵御和预防疾病的能力。IL-2作为免疫治疗剂和免疫增强剂在畜禽疾病治疗方面发挥重要作用。随着我国畜禽养殖业的蓬勃发展，迫于养殖条件、养殖环境等因素的影响，疾病的爆发也愈发严重，尤其是鸡的马立克氏病、鸡的新城疫、传染性法氏囊病、猪的呼吸与繁殖障碍综合症、圆环病、猪瘟等免疫抑制性疾病对畜禽业的发展造成巨大危害。作为免疫治疗剂，IL-2在上述疾病的治疗上具有良好效果，Lowenthal等(Lowenthal J W,Connick T E,Mcwaters P G,et al.Development of T cell immuneresponsiveness in the chicken[J].Immunology&Cell Biology,1994,72(2):115-122.)将IL-2注入刚孵化的T淋巴细胞的小鸡可产生一定保护力，秦翠丽等(秦翠丽,李松彪,邱智军,等.白细胞介素-2对兔大肠杆菌病的治疗试验[J].中国畜牧杂志,2007,43(9):61-62.)利用IL-2治疗患大肠杆菌病的家兔，治愈率高达95％，IL-2在犬传染性肝炎的治疗上同样取得良好成效；另一方面，鉴于IL-2具有提高机体免疫性应答水平、促进各种炎性细胞的增殖及分化等功能，研究者逐渐将目光转向IL-2作为疫苗佐剂或与疫苗联合表达以期望达到更好的免疫效果上。余波等(余波.鹅白细胞介素-2成熟蛋白基因表达及其免疫佐剂效应的研究[D]；四川农业大学,2008.)通过将鹅白介素2与小鹅瘟弱毒苗共同注射青年鹅发现，佐剂组可以有效的增强细胞及体液免疫应答并明显提高免疫保护率；谢荣辉等(谢荣辉,万旺军,李龙,等.鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2007,33(3):237-242.)通过口服重组IL-2质粒与IBDV联合免疫雏鸡发现，实验组中IL-2能够明显增强T、B淋巴细胞的增殖反应且具有较高的免疫保护率；希尼尼根等(希尼尼根，程安春，汪铭书，等，猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSV-ORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究[J].畜牧兽医学报，2007，38(9):1003-1008)将构建好的真核质粒与PRRS疫苗联合免疫猪发现实验组的IgG含量、T淋巴细胞增殖活性、CD4+和CD8+的比例明显增高。在基因工程疫苗的研制过程中常常将细胞因子基因与抗原基因串联在一起进行融合表达，一方面克服细胞因子在体内半衰期短、价格昂贵等缺陷、另一方面在一定程度上增强单基因核酸疫苗的免疫效果。亓丽红等(亓丽红,朱剑英,艾武,等.鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性[J].农业生物技术学报,2012,20(11):1327-1332.)将鸡IL-2与新城疫病毒的F蛋白进行串联表达并免疫SPF鸡发现，免疫后20d实验组抗体水平达到峰值并明显高于纯疫苗组，保护率达到70％；侯洪烈等(侯洪烈,张许科,李运娜,等.ADF-IL-2基因重组卡介苗的构建及免疫保护效果[J].中国兽医学报,2013,33(7):1016-1020.)将柔嫩艾美尔球虫ADF基因与IL-2基因融合表达免疫雏鸡，抗球虫指数高达172.89并且在一定程度上能够抵御球虫卵囊的攻击；吴志明等(吴志明,闫若潜,王东方,等.PCV2ORF2/IL-2嵌合表达质粒在猪体免疫及免疫保护效果研究；中国畜牧兽医学会2010学术年会暨中国兽医临床大会,2010[C])将猪IL-2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因进行嵌合表达，动物实验结果表明融合组的抗体水平显著高于无佐剂组，攻毒后28d融合质粒组免疫猪的Tc含量显著高于单基因疫苗组，免疫保护力也明显高于后者。综上，IL-2在畜禽基因工程疫苗的研制方面已取得了显著的效果，事实表明，IL-2与保护性抗原基因的融合表达对疾病的预防与治疗具有一定效果，奠定了IL-2作为基因疫苗佐剂的研究基础。
现有针对细胞因子佐剂的制备方法主要为原核表达方法，对目的基因进行克隆连接至原核表达载体如pET-32等，然后将重组表达载体转入大肠杆菌中进行表达，同时需要对表达的相关条件进行优化以达到最优条件，同时需要对重组表达蛋白的可溶性进行检测。原核表达蛋白的纯化主要通过对细菌的大量培养破碎后进行目的蛋白的纯化最终应用于动物的免疫，主要流程如下：将目的基因克隆至原核表达载体上，然后通过转化到BL21等菌株中，诱导蛋白表达，然后进行蛋白纯化。原核表达的缺点如下：(1)由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA；(2)由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；(3)表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；(4)很难表达大量的可溶性蛋白，因此需要对蛋白表达的条件进行优化等等，费时费力；(5)原核表达后的蛋白免疫时多需要进行乳化，乳化过程虽简单但较为费时，且乳化后的蛋白免疫方式多为注射，易使动物产生应激反应，影响免疫效果。
目前对于兔病毒性出血症(Rabbit haemorrhagic disease,RHD)的预防主要通过注射组织灭活苗的方式，虽取得了一定效果，但随着灭活苗的应用同样发现些许弊端，疫苗制备原材料的获取困难、制备过程的繁琐及存在生物安全性问题等弊端在一定程度上限制了本病的预防。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种兔瘟口服疫苗IL-2佐剂及应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种家兔IL-2的真核表达载体pVAX1-IL-2，该载体装载有家兔IL-2基因。
本发明还公开了一种含有上述的真核表达载体pVAX1-IL-2的重组菌。
进一步地，所述重组菌为重组沙门氏菌。
进一步地，所述的重组沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207，命名为SL7207-pVAX1-IL-2。
本发明还公开了一种上述的真核表达载体pVAX1-IL-2或者上述的重组菌SL7207-pVAX1-IL-2在制备预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗中的应用。
本发明还公开了一种预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗，是由上述的重组菌SL7207-pVAX1-IL-2和重组菌SL7207-pVAX1-VP60混合制备而成。
进一步地，所述重组菌SL7207-pVAX1-IL-2与重组菌SL7207-pVAX1-VP60的体积比为1:1，所述重组菌SL7207-pVAX1-IL-2与重组菌SL7207-pVAX1-VP60的浓度均为5×109cfu/mL。
本发明还公开了一种上述的预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗在制备预防兔病毒性出血症的药物中的用途。
进一步地，所述预防兔病毒性出血症的药物的剂型为口服剂。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)安全、生物安全性高：本发明所制疫苗属基因工程疫苗，相比于常规组织灭活苗仅包被部分抗原基因即可达到较高的抗体水平，避免了组织灭活苗因灭活不彻底而导致的易散毒问题，同时提高了生物安全性。
2)真核表达产物更接近天然构象且具有活性：运用真核表达系统对重组质粒进行表达，使目的蛋白更真实地接近天然构象，从而使蛋白有生物活性。相比之下传统的原核表达产物通常是没有活性或者活性很低，经常需要复性才能获得有活性的蛋白，因为原核细胞内缺少如分子伴侣和一些与糖基化，乙酰化以及二硫健形成的一些维持蛋白正确构象的功能蛋白。
3)免疫方式简单高效：将表达质粒转入减毒细菌载体SL7207通过口服免疫的方式避免了常规疫苗注射方式给动物带来的应激；同时减毒沙门氏菌较强的肠道侵袭性能够保证重组表达系统在体内的充分表达；疫苗的制备仅需培养细菌即可省时省力。
4)疫苗制备简单：只需通过培养细菌即可，同时运输及保存方便；从实验结果显示疫苗佐剂组在抗体水平和IL-4表达水平上相比于单疫苗组均有显著的提高，可以有效的增强机体的体液免疫促进特异性抗体分泌及IL-4的表达。
5)双重佐剂效果：试验所使用的减毒沙门氏菌SL7207虽已减毒但仍保留了沙门氏菌较强的肠道侵袭性能够保证重组表达系统在体内的充分表达，另一方面在一定程度上SL7207同样可以被看作一种疫苗佐剂促进并刺激机体免疫应答。
5)本发明分别构建减毒沙门氏菌SL7207递呈的重组菌株SL7207-pVAX1-IL2和SL7207-pVAX1-VP60并将两种重组细菌共同免疫家兔，IL-2能够发挥免疫刺激作用从而增强口服疫苗的免疫效果。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是背景技术中IL-2对细胞因子受体的调节作用；
图2是本发明兔IL-2基因PCR扩增结果，其中，M:DL2000Marker；1:阴性对照；2：IL-2基因扩增产物(482bp)；
图3是本发明pMD19-T-IL-2重组质粒鉴定结果，其中，M:DL 2000Marker；1:IL-2PCR产物；2：pMD19-T-IL-2重组质粒单酶切产物3：pMD19-T-IL-2重组质粒双酶切产物；
图4是本发明pVAX1-IL2单双酶切鉴定结果；其中，1代表DL2000Marker，2代表IL-2单基因片段，3代表pVAX1-IL2的质粒模板的单酶切，4代表pVAX1-IL2的质粒模板的双酶切；
图5是本发明转染后的细胞蛋白免疫印迹试验；其中，M：Marker1：细胞蛋白；
图6是本发明重组细菌SL7207-pVAX1-IL-2及单双酶切鉴定；其中，M代表DL2000Marker；1代表SL7207-pVAX1-IL-2PCR鉴定；2代表SL7207-pVAX1-IL2双酶切结果；3代表SL7207-pVAX1-IL-2单酶切结果；
图7是本发明重组沙门氏菌16Sr DNA测序鉴定结果；
图8是本发明实施例4中的抗体水平，其中，空载：SL7207-pVA X1，VP60：SL7207-pVAX1-VP60，混合：SL7207-pVAX1-VP60+SL7207-pVAX1-IL-2(不同字母表示差异显著)；
图9是本发明实施例4中的IL-4含量检测，其中，空载：SL7207-pVAX1，VP60：SL7207-pVAX1-VP60，混合：SL7207-pVAX1-VP60+SL7207-pVAX1-IL-2(不同字母表示差异显著)。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1家兔IL-2基因(登陆号：NM_001163180.1)和VP60基因的克隆
1.1总RNA提取(以健康家兔脾脏为材料进行组织RNA的提取)具体操作步骤如下：
(1)在无菌条件下用剪刀对组织(100mg)进行破碎，无菌条件下液氮研磨至粉末状，加入1mL裂解液。
(2)将研磨后的组织液装入离心管中室温静置5min。
(3)静置后的组织液4℃、12000r/min离心5min，除脂肪蛋白等，吸取上清液加入2mL离心管中。
(4)向离心管中加入氯仿200μL，猛烈振荡15sec，静置5min。4℃、12000r/min离心15min。
(5)离心后的溶液分为上中下三层(无色水相、白色蛋白质、有机相)，将上层无色相加入新的离心管中。加入适量异丙醇，轻微混匀，静置10min。
(6)静置后的离心管12000r/min、4℃条件下离心10min(一般管底会出现白色沉淀)。
(7)小心弃去上清液，沿管壁缓慢加入预冷的75％乙醇，轻轻混匀，12000r/min、4℃、5min。
(8)弃去酒精，室温条件下干燥2-5min，加入10μL(RNAise-free)DEPC水溶解，-80℃保存，待反转录用。
1.2cDNA的合成
参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书，进行RNA的反转录。具体反应体系如下：
(1)去除基因组DNA反应如下表：
表1去除基因组DNA反应
反应条件：42℃、2min，反应结束后立即进行反转录
(2)反转录反应体系如下表
表2反转录体系
反应条件：37℃、15min，85℃、5sec，反应结束后cDNA保存至-20℃备用。
1.3引物的设计与合成
参照NCBI GenBanK中已公布的家兔IL-2序列和VP60序列，运用生物软件Oligo6.0或primer 5.0设计1对引物序列如下表，用于兔源IL-2基因和VP60基因的扩增及后续表达载体的构建，预期扩增产物大小分别为482bp和1760bp。
注：GCTAGC、AAGCTT分别为Nhe I、Hind III酶切位点；ATGATGATGATGATGATG为组氨酸标签；GCTAGCATG为kozak序列。
1.4目的基因的PCR扩增
以得到的cDNA为模板，采用高保真酶对IL-2和VP60基因进行扩增，反应体系和反应条件如下表：
表3PCR反应体系
反应条件分别为：
IL-2基因的扩增：95℃4min；95℃1min，58℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃延伸10min，产物12℃保存。
VP60的PCR扩增条件如下：95℃4min；95℃1min，65℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min，产物12℃保存。
反应结束后，取5μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，120V，30min，在紫外灯下观察目的片段大小与预期片段大小进行比较，PCR产物送公司进行测序比较。
1.5目的基因PCR产物的TA克隆
(1)PCR产物的纯化
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后在紫外灯下观察并切下对应目的片段大小的凝胶，放入EP管中使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit)进行胶回收，具体操作方法参照试剂盒说明书进行。将胶回收产物分别与6×Loading Buffer按照1：5体积比混匀后再次进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小与目的片段比较以确定所回收片段为目的基因。
(2)连接
采用19-T Simple Vector试剂盒对目的基因片段分别进行T/A克隆，具体反应体系如下：19-T Simple Vector 1μL、Solution I 5μL、DNA模板3μL、dH2O 1μL(共10μL)，16℃条件下反应过夜。
(3)转化
a.将连接产物(10μL)全部加入100μL DH5α感受态细胞中冰上孵育30min。
b.反应结束后立即42℃热刺激90sec，随后在冰水中孵育5min。
c.向离心管中加入890μL LB液体培养基，37℃(150r/min)培养2h。
d.取400μL菌液均匀的平铺在事先温浴好的Amp-LB平板上，待菌液完全吸收后，将平板置于37℃培养箱中翻转静置培养过夜。
(4)鉴定
挑取单个白色菌落一部分加入预混合好的PCR反应液进行菌落PCR鉴定，反应条件参照1.4，反应结束后进行凝胶电泳与目的片段大小进行比对，菌落另一部分接种于10mLAmp-LB肉汤中扩大培养，37℃(180r/min)培养过夜，对鉴定为阳性的菌落培养的菌液进行质粒提取，送公司测序鉴定。将克隆得到的重组质粒进行酶切(反应体系见下表4)和测序鉴定，将测序正确的大肠杆菌分别命名为DH5αpMD19-T-IL-2和DH5αpMD19-T-VP60，质粒分别命名为pMD19-T-IL-2和pMD19-T-VP60。
表4酶切反应体系
2、结果与分析
(1)以家兔脾脏RNA为模板，加入特异性引物PCR扩增后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果发现扩增片段大小与预期相符(图2)。
(2)将PCR产物经纯化后连接中pMD19-T载体，重组质粒经Nhe I和Hind III单双酶切鉴定后与预期大小片段相符。阳性大肠杆菌命名为DH5αpMD19-T-IL-2，质粒命名为pMD19-T-IL-2(图3)，同理，得到质粒pMD19-T-VP60。
实施例2家兔IL-2和VP60的真核表达载体的构建及表达
1重组载体的构建
(1)T克隆鉴定正确的质粒，按照下表5中的酶切体系同时对T-IL2以及pVAX1载体进行酶切。
表5酶切体系
将酶切后的片段进行胶回收并16℃过夜，反应体系如下表6：
表6T4连接酶连接反应体系
(2)转化及鉴定
转化具体操作流程参照实施例1中的1.5(3)，将Amp-LB平板换为Kan-LB，将pMD19-T载体更换为pVAX1真核表达载体；鉴定同上，将Amp换为Kan。
结果如图4所示，通过菌落PCR鉴定及特异性限制性内切酶酶切鉴定可以得出IL-2已成功连接至真核表达载体pVAX1，重组真核表达质粒构建完成，获得的重组真核表达质粒分别命名为pVAX1-IL-2，同理，构建成重组真核表达质粒pVAX1-VP60。
2目的蛋白表达的鉴定
2.1质粒的制备
取100μL重组细菌接种于10mL Kan-LB液体培养基中，37℃培养过夜，无菌条件下取1mL菌液加入100mL Kan-LB液体培养基中，过夜培养。采用无内毒素质粒大提试剂盒进行去内毒素质粒抽提并保存于-20℃备用。
293T细胞的培养：将293T细胞接种于75mm2的细胞培养瓶中，待细胞基本平铺整个细胞瓶后，弃培养液，使用10mL预热好的PBS溶液冲洗三遍，然后加入经预热处理的0.25％胰酶300μL，轻轻摇晃、缓慢吹打至细胞呈单个散在游离状态，立即加入15mL细胞营养液终止胰酶消化反应，轻轻吹打至在显微镜下细胞漂浮于营养液之上的状态。将消化下来的细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种量约为2mL，细胞汇合度达到80％待用。
2.2293T细胞的转染
用6孔细胞培养板进行细胞培养，待细胞汇合度达到80％进行转染，按照DNA FectTransfection Reagent说明书进行pVAX1-IL2质粒的转染，取4μg质粒DNA与10μL DNA转染试剂分别稀释于100μL的Opti-MEM中，将稀释的DNA与转染试剂均匀混合后室温孵育20min，缓慢加入细胞板，轻轻摇动混匀，设置空质粒载体pVAX1为空白对照，在5％CO2条件下培养48-72h后进行目的基因表达产物的检测。
2.3Western-blot检测
2.3.1293T细胞蛋白的提取
待转染后培养48-72h进行目的基因表达的检测，将培养液吸净，每孔加入1mLTRizol裂解细胞，充分吹打几次后将裂解液移入新的离心管中，加入氯仿200μL/管，摇晃混匀，室温下静置3-5min。静置后离心15min(12000r/min，4℃)，离心后裂解液分上中下三层吸取中下层并加入5倍体积的丙酮，冰上孵育1h，离心20min(2000r/min，4℃)，弃去上清后室温干燥，加入5×Loading Buffer，95℃恒温30min，-20℃保存待SDS-PAGE用。
2.3.2Western-blot检测
Western-blot具体操作如下：
转膜：将处理好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，同时参照凝胶大小裁剪PVDF膜一片和6片滤纸，将PVDF膜和滤纸分别放入甲醇溶液、转膜缓冲液中浸泡10-15min备用，从下至上依次放置三层滤纸、PVDF膜、胶、三层滤纸，放置过程中运用玻璃棒滚动以免形成气泡影响转膜效率，100-150V，转膜90min。
膜的封闭：将PVDF膜取出后放入干净的平皿中加入适量3％BSA的TBST缓冲液(没过膜)，37℃轻摇2h。
洗膜：弃去封闭液，用TBST缓冲液洗膜3次(10min/次)。
一抗孵育：弃去TBST，将一抗Anti-6X His tag抗体按1：1000的比例稀释于0.5％BSA/TBST，迅速加入平皿中，37℃轻摇1h。
洗膜：弃去一抗，用TBST缓冲液洗膜3～5次(10min/次)。
二抗孵育：弃TBST，将二抗HRP标记的羊抗鼠IgG稀释于0.5％BSA/TBST(稀释比例1：5000)，加入平皿37℃温和孵育2h。
洗膜：弃去二抗，用TBST缓冲液洗膜3～5次(10min/次)。
显色：将ECL试剂盒的A液和B液在试管内等体积混合(共2mL)，迅速滴加于PVDF膜的正面，直接进行曝光显色。
结果：对转染后的细胞进行蛋白提取，并进行蛋白免疫印迹试验，结果发现，在17Kda左右出现单一条带(如下图5)，与目的片段大小近似，由此看出，真核表达载体pVAX1-IL-2在细胞中能够完成瞬时转染及表达。
实施例3减毒沙门氏菌口服疫苗佐剂的构建
3.1沙门氏菌感受态的制备
将-80℃低温保存的减毒沙门氏菌(SL7207)划线接种于普通LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取形态均匀的单个菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃振荡(160r/min)培养12-16h后，提取细菌DNA进行PCR鉴定并送测序。将鉴定正确的沙门氏菌(SL7207)接种至10％甘油中，分装并保存于-20℃中备用。
将复苏后的沙门氏菌划线接种于LB平板上，37℃培养过夜后，挑取单个均一菌落接种到5mL LB肉汤中，37℃(160r/min)振荡培养12-16h后，吸取1mL菌液接种到100mL LB肉汤中，37℃(160r/min)振荡培养至OD600为0.5～0.6左右，将菌液4℃(4000r/min)离心10min，用预冷的去离子水重悬清洗菌体以去除胞内分泌物，重复两次以充分洗涤菌体，将沙门氏菌分装成小量接种于500μL的15％甘油中，-80℃保存备用。
3.2电转化
(1)电转杯依次经70％和100％乙醇浸泡过夜后，用去离子水对电转杯内外进行反复冲洗以去除酒精，擦净后，将电转杯置于紫外灯下光照过夜以充分灭菌。
(2)将-80℃保存的沙门氏菌感受态置于冰上解冻后加入电转杯中，分别加入pVAX1空载体、pVAX1-VP60和pVAX1-IL-2质粒2-5μg，微量移液器轻轻混匀，以上操作均在冰上进行。
(3)取出电转杯，用纸巾擦干杯壁外侧的水，放入电转仪中准备电转，具体参数如下：电压：1800V，电阻：200Ω，电容：25μF。
(4)迅速取出电转杯，将电转杯中的菌液接种至800μL LB液体培养基中，37℃振荡培养1h。
(5)将培养后的菌液进行低速离心(4000r/min，5min)以收集菌体，离心后弃去约400μL上清液，重悬菌体后均匀的平铺在Kan-LB平板上，待完全吸收后，37℃翻转倒置培养过夜。
3.3重组菌的鉴定
挑取单个形态均一的菌落，加入预混合的PCR反应液中进行菌落PCR鉴定并进行革兰氏染色鉴定，同时将菌落的另一部分加入含Kan的10mL LB液体培养基中进行扩大培养，将鉴定为阳性的克隆子扩大培养后收集菌体，分别提取细菌基因组DNA和质粒；运用细菌通用引物进行细菌16S rDNA的鉴定、对提取的质粒进行单双酶切鉴定，将构建成功的重组菌分别命名为SL7207-pVAX1、SL7207-pVAX1-VP60和SL7207-pVAX1-IL-2。
实施例4动物免疫
4.1口服重组菌株的制备
(1)活菌计数：将重组沙门氏菌SL7207-pVAX1-VP60和SL7207-pVAX1-IL-2划线接种于含Kan的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单个菌落接入10mL LB肉汤中，37℃、120r/min培养过夜，吸取适量菌液以1：100的比例加入100mL的Kan-LB中，160r/min培养6h后，取适量菌液分别进行10-3、10-4、10-5倍比稀释后接种至含Kan-LB平板上，每个浓度3个重复，培养24h后进行细菌计数。
(2)口服疫苗的制备：按照(1)中方法确定好细菌浓度后，以7000r/min沉淀菌体，并用0.01mol/L的无菌PBS洗三遍以除去胞外产物，并利用PBS将细菌浓度调整至5×109cfu/mL，每试验组各制备20mL，置于4℃备用。
4.2免疫及采血
45只(30日龄)家兔购自成都天元兔业有限公司，免疫前暂养7d以观察实验兔健康状况，并抽取耳中动脉血进行RHDV特异性抗体检测以确定实验兔RHDV为阴性。暂养7d后，45只家兔共分为3组，每组15只，第一组至第三组分别口服1mL浓度为5×109cfu/mL的SL7207-pVAX1、SL7207-pVAX1-VP60、SL7207-pVAX1-VP60+SL7207-pV AX1-IL-2(SL7207-pVAX1-VP60和SL7207-pVAX1-IL-2的体积含量均为0.5mL)，第一组至第三组分别在第21d进行加强免疫，免疫前断水8小时。在免疫后的7d、14d、28d、42d各实验组随机选取4只家兔进行耳中央动脉采血。
4.3血清制备
将采集的兔血37℃静置1h后，置于4℃过夜，以便血清更易析出，4000r/min离心15-20min收集血清，-20℃保存备用。
4.4抗体水平监测
将采集的兔血37℃静置1h后，置于4℃过夜，以便血清更易析出，4000r/min离心15-20min收集血清，将待测血清稀释50倍后采用兔瘟抗体ELISA检测试剂盒进行血清特异性IgG的检测，具体操作参照试剂盒说明书。
如图8所示，免疫后7d开始，单疫苗组与混合疫苗组抗体水平均有明显上升，在免疫后28d，混合疫苗组特异性抗体水平显著高于单疫苗组并且在免疫后42d混合疫苗组抗体水平达到峰值，仍显著高于单疫苗组。
4.5IL-4含量水平监测
兔源白介素-4检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，利用试剂盒中标准品建立标准曲线后，将血清稀释10倍后进行兔白介素4表达量的检测，反应结束后立即将样品放入酶标仪中进行读数，按照标准品含量制定标准曲线，计算IL-4的表达量。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 一种兔瘟口服疫苗IL-2佐剂及应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggctagcat gggttacaaa gtacaactct tg 32
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaagctttt aatgatgatg atgatgatgt gaactcgatg ctgagatg 48
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggctagcat ggagggcaaa gcccgcac 28
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaagctttc aatgatgatg gacataagaa aagccattg 39

Claims (9)

1.一种家兔IL-2的真核表达载体pVAX1-IL-2，其特征在于，该载体装载有家兔IL-2基因。
2.含有权利要求1所述的真核表达载体pVAX1-IL-2的重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述的重组沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207，命名为SL7207-pVAX1-IL-2。
5.权利要求1所述的真核表达载体pVAX1-IL-2或者权利要求2所述的重组菌SL7207-pVAX1-IL-2在制备预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗中的应用。
6.一种预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗，其特征在于，是由权利要求2所述的重组菌SL7207-pVAX1-IL-2和重组菌SL7207-pVAX1-VP60混合制备而成。
7.根据权利要求6所述的预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗，其特征在于，所述重组菌SL7207-pVAX1-IL-2与重组菌SL7207-pVAX1-VP60的体积比为1:1，所述重组菌SL7207-pVAX1-IL-2与重组菌SL7207-pVAX1-VP60的浓度均为5×109cfu/mL。
8.权利要求6所述的预防兔病毒性出血症的口服疫苗免疫佐剂或口服疫苗在制备预防兔病毒性出血症的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述预防兔病毒性出血症的药物的剂型为口服剂。
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