CN107619816A - 一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在防治鸡大肠杆菌病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在防治鸡大肠杆菌病中的用途。所述的疫苗株是通过将表达鸡致病性大肠杆菌ompC蛋白和fimA蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌中得到的，其中ompC蛋白和fimA蛋白之间通过柔性序列连接，所述的融合蛋白的连接顺序为ompC‑fimA‑M细胞靶向肽‑DC细胞靶向肽。本发明以鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白为免疫原并融合能够靶向M细胞和DC细胞的靶向肽，利用乳酸菌为抗原传递载体，构建了预防鸡大肠杆菌病的靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗，可有效地抑制鸡致病性大肠杆菌的感染，并且使用方便、安全，对环境友好。

Description

一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在 防治鸡大肠杆菌病中的用途

技术领域

本发明涉及一种重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途，特别涉及一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗株、其制备方法以及在防治鸡大肠杆菌病中的用途，本发明属于医药技术领域。

背景技术

禽大肠杆菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大肠埃希氏菌(APEC)感染禽类引起的多种临床病型的总称，主要表现有胚胎和幼雏的死亡、败血症、气囊炎、心包炎、输卵管炎、肠炎、腹膜炎和大肠杆菌性肉芽肿等。病原性大肠埃希氏菌血清型众多，抗原结构复杂，药物防治是治疗该病的重要措施，但流行株广泛存在耐药性，为该病的防控带来困难。

目前预防禽大肠杆菌病的疫苗产品有混合多种血清型大肠杆菌的甲醛灭活铝胶疫苗、甲醛灭活油乳剂疫苗、蜂胶灭活苗，菌毛油乳剂甲醛灭活苗等，以铝胶疫苗和油乳剂疫苗为主。虽取得一定的免疫效果，但免疫注射后易在注射部位形成结节、吸收不彻底，对免疫鸡群应激反应大，影响肉质及生长，同时从食品安全卫生角度来看，油佐剂在动物体内的残留会对食品安全造成潜在影响。此外，治疗大肠杆菌感染还常使用各种抗菌药物，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环，同时也加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，影响食品安全。

禽大肠杆菌病主要是由大肠杆菌污染饲料、饮水、用具及环境后，病原菌通过鸡的呼吸道、消化道和种蛋等途径进行传播。基于大肠杆菌可经肠道黏膜感染而致病的特点，结合具有免疫原性的致病因子来研制口服疫苗，是科学防治禽大肠杆菌病的理想途径。

乳酸菌是一种食品级微生物，利用乳酸菌作为疫苗抗原传递载体逐渐获得了研究者认可，并成为该领域的研究热点。乳酸菌黏膜免疫制剂在禽类研究及应用上的前景广阔，顺应了当前养殖业注重绿色、安全和环保的理念。益生菌乳酸菌具有耐受消化道环境胁迫能力、肠道定殖能力、维护肠道微生态平衡、免疫佐剂等特性，是研制预防禽大肠杆菌病口服黏膜免疫疫苗的理想活菌载体。

本发明根据致病性大肠杆菌主要经动物肠道致病的特点，以禽致病性大肠杆菌黏附素和外膜蛋白为免疫原，利用乳酸菌作为免疫抗原传递载体，从黏膜免疫角度设计疫苗以预防该病，对防控鸡大肠杆菌病具有重要意义，也是本发明主要解决的技术问题。黏附素是禽致病性大肠杆菌的重要致病因子，其中Ⅰ型菌毛普遍存在于禽致病性大肠杆菌，在感染过程中发挥重要作用；外膜蛋白(OMPs)是革兰氏阴性菌细胞壁的特有结构，也是一种致病因子，具有较强的免疫原性，可加快巨噬细胞对抗原的摄取，刺激机体的体液免疫，同时对细胞免疫有刺激作用，并可抵抗同源和异源菌的攻击。微褶皱细胞(M细胞)作为抗原转运细胞，树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞，在黏膜免疫中起到至关重要的作用，研究表明M细胞靶向肽和DC靶向肽能显著提高黏膜免疫制剂的免疫效率。基于上述问题的考虑，本发明以禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白FimA和外膜蛋白C(ompC)为免疫原，并融合M细胞靶向肽(Co1)和DC靶向肽(DCpep)，利用鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneriM-11为疫苗抗原传递载体，构建靶向给药预防鸡大肠杆菌病的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株、其制备方法以及在防治鸡大肠杆菌病中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株，所述的疫苗株是通过将表达鸡致病性大肠杆菌ompC蛋白和fimA蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌中得到的，ompC蛋白和fimA蛋白之间通过柔性序列连接，所述的融合蛋白的连接顺序为ompC-fimA-M细胞靶向肽-DC细胞靶向肽。

其中，优选的，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌。

其中，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillussaerimneri M-11。

其中，优选的，所述的表达载体通过以下步骤制备得到：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；

(2)将M细胞靶向肽(Co1)和DC细胞靶向肽(DCpep)编码基因通过融合PCR方法构建到fimA的下游，得到融合基因fimA-Co1-DCpep，将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，fimA-Col-DCpep融合基因与ompC基因通过柔性序列连接，得到的重组载体命名为pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep；

(3)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒，即为所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体，命名为pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep。

其中，优选的，所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体通过电转化方法转入乳酸菌的感受态细胞中。

其中，优选的，步骤(1)中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示，柔性序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述DC细胞靶向肽(DCpep)及M细胞靶向肽(Col)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14以及15所示。

进一步的，本发明还提出了一种构建所述基因工程乳酸菌口服疫苗株的方法，包括以下步骤：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；

(2)将M细胞靶向肽(Co1)和DC细胞靶向肽(DCpep)编码基因通过融合PCR方法构建到fimA的下游，得到融合基因fimA-Co1-DCpep，将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，fimA-Col-DCpep融合基因与ompC基因通过柔性序列连接，得到的重组载体命名为pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep；

(3)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒，即为所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体，命名为pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep；

(5)制备乳酸菌感受态细胞，经电转化技术将构建的重组质粒pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep转入乳酸菌感受态细胞，筛选重组乳酸菌转化子，获得阳性重组乳酸菌，即为靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗株。

其中，优选的，步骤(1)中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示，柔性序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述DC细胞靶向肽(DCpep)及M细胞靶向肽(Col)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14以及15所示。

其中，优选的，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌。

其中，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillussaerimneri M-11。

更进一步的，本发明还提出了所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株在制备预防或治疗禽大肠杆菌病药物中的用途。

再进一步的，本发明还提出了一种禽大肠杆菌病亚单位口服疫苗，其含有所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株

本发明以鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白为免疫原并融合能够靶向M细胞和DC细胞的靶向肽，利用乳酸菌，优选为分离于鸡肠道源乳酸杆菌Lactobacillus saerimneriM-11为抗原传递载体，构建了预防鸡大肠杆菌病的靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗，可有效地抑制鸡致病性大肠杆菌的感染，并且使用方便、安全，对环境友好。

附图说明

图1为重组表达载体构建流程；

(A)：pPG-T7g10-PPT；(B)：pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA(pPG-OF)；(C)：pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep(pPG-OF-Co1-DCpep)

图2为重组质粒鉴定结果；

(A)：1.Sac I和Apa I双酶切pPG-OF质粒结果；2.Sac I/Apa I双酶切pPG-OF-Co1-DCpep质粒结果；M.DNA分子量标准Trans 2K。(B)：1.pPG-OF质粒PCR结果；2.阴性对照；M.DNA分子量标准Trans 2K；3.阴性对照；4.pPG-OF-Co1-DCpep质粒PCR结果；

图3为重组ompC和fimA蛋白的Western blot鉴定结果；

(A)：fimA蛋白表达的Western blot鉴定结果；(B)：ompC蛋白表达的Western blot鉴定结果；M：蛋白质分子量标准；

图4为重组乳酸菌pH、胆盐耐受及生长曲线结果；

(A)：酸环境耐受试验结果；(B)：胆盐耐受力试验结果；(C)：42℃生长曲线.

图5为重组乳酸菌在鸡肠道内的定植能力检测结果；

(A)：重组乳酸菌cFDA-SE标记效率；(B)：流式细胞FSC/SSC设门方法；(C)：M-11定植情况；(D)pPG-OF/M-11定植情况；(E)pPG-OF-Co1-DCpep/M-11定植情况；

图6为免疫鸡粪便中抗fimA和ompC蛋白的sIgA水平检测结果；

(A)：免疫SPF鸡粪便中抗fimA的sIgA水平；(B)：免疫SPF鸡粪便中抗ompC的sIgA水平；

图7为免疫鸡盲肠及鼻腔冲洗液中sIgA抗体水平检测结果；

(A):免疫鸡盲肠黏液中抗fimA的sIgA水平；(B):免疫鸡盲肠黏液中抗ompC的sIgA水平；

(C):免疫鸡鼻腔冲洗液中抗fimA的sIgA水平；(D):免疫鸡鼻腔冲洗液中抗ompC的sIgA水平；

图8为免疫鸡血清中抗fimA和ompC特异性IgG抗体水平检测结果；

(A):免疫鸡血清中抗fimA的IgG水平.(B)：免疫鸡粪便中抗ompC的IgG水平；

图9为口服重组乳酸菌的免疫保护结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应当理解的是，以下所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

实施例1 融合表达鸡大肠杆菌fimA和ompC蛋白的重组乳酸菌的构建

1、乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，将胶回收后获得的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体pPG-T7g10-PPT，其中芽孢杆菌Geobacillus toebii组成型分泌表达启动子HCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，T7g10翻译增强子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，大肠杆菌rrnBT1T2转录终止子序列如SEQ ID NO.5所示。载体图谱如图1所示。

具体构建方法可参考文献(组成型乳酸菌表达载体的构建及表达效果的比较，鞠珑株，东北农业大学硕士学位论文)方法进行。且该载体pPG-T7g10-PPT已记载在文献(融合表达TGEV 6Ds与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统，王玉赛，东北农业大学硕士学位论文)中，由东北农业大学保存并提供。

2、pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep(pPG-OF-Co1-DCpep)载体的构建

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA，以提取的鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增ompC基因和fimA基因，所使用的引物为：

上游引物ompC-f：GAGCTCGCTGAAGTTTACAACAAAGACGGCA(SEQ ID NO.6所示)，含SacI酶切位点GAGCTC；

下游引物ompC-R:GGATCCGAACTGATAAACCAGGCCCAGA(SEQ ID NO.7所示)，含BamHI酶切位点GGATCC)

上游引物fimA-f：GGATCCGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCA-GGTGGCGGTGGCTCAACGACTGTAAATGGTGGGACCGT(SEQ ID NO.8所示)，含有BamHI酶切位点GGATCC以及柔性linker序列GGTGGCGG-TGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCA(SEQ IDNO.9所示)；

下游引物fimA-R：TGAACCTCTAGATTGATACTGAACCTTGAAGGTCGC(SEQ ID NO.10所示)，含有linker序列TGAACC以及Xba I酶切位点TCTAGA。

扩增得到序列中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示。

以扩增得到的fimA基因为模板，通过融合PCR方法将M细胞靶向肽(Col)序列及DC细胞靶向肽(DCpep)序列融合至fimA基因3’末端，上游引物为fimA-f；下游引物为GGGCCCTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGATATGATGGAT-AAAATGAGCCACCGCCACCTGGTAATGGTGAACGAGCTGGTAATTGATG-AAATGATGAACCTCTAGA(SEQ IDNO.13所示)，含有Apa I酶切位点GGGCCC，DC靶向肽DCpep序列TGGACGTTGTGGAGTTGAATGATATGATGGATAAAA(SEQ ID NO.14所示)，M细胞靶向肽Col序列TGGTAATGGTGAACGAGCTGGTAATTGATGAAATGA(SEQ ID NO.15所示)，柔性linker序列TGAACC以及Xba I酶切位点TCTAGA，制备融合基因fimA-Col-DCpep。然后，将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体，构建了重组质粒pMD18-ompC-fimA-Col-DCpep。利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段。将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep。

具体构建过程见图1所示，重组质粒的酶切鉴定结果见图2。

同时构建不含有M细胞靶向肽(Col)序列及DC细胞靶向肽(DCpep)序列的重组表达质粒pPG-PPT-ompC-fimA，简称pPG-OF。

3、融合表达鸡大肠杆菌fimA和ompC蛋白的重组乳酸菌的构建

制备鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11感受态细胞(鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11已记载在文献(组成型表达鸡致病性大肠杆菌fimA与ompC融合蛋白的重组乳酸杆菌的构建及其在鸡肠道定殖特性的研究，韩乐濛，东北农业大学硕士学位论文)中，由东北农业大学保存并提供。)，经电转化技术将构建的重组质粒pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA(pPG-OF)及pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep(pPG-OF-Co1-DCpep)转入L.saerimneri M-11感受态细胞，在含有氯霉素抗性的选择培养基平板中筛选重组乳酸菌转化子，阳性重组乳酸菌命名为pPG-OF/M-11,pPG-OF-Co1-DCpep/M-11。

实施例2 重组fimA和ompC蛋白的表达与鉴定

重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11菌体样品处理后，经Westernblot方法检测，结果如图3所示，该结果显示，重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11表达蛋白可被鼠源抗fimA血清和鼠源抗ompC血清识别。

实施例3 重组乳酸菌在消化道内生存性能

3.1 酸环境耐受性试验

重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11分别以10％接种量接种于pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0无菌PBS中，37℃静置处理2h；再按1％接种量接种到MRS中，置于37℃孵育箱静置培养8h，测定OD600吸光度值。结果见图4-A所示，重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11在pH为3时的培养基中可以缓慢生长。

3.2 胆盐耐受力试验

重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11分别以1％接种量接种胆盐质量份数为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的MRS液体培养基，37℃厌氧培养8h，测定OD600吸光度值，结果见图4-B所示，重组乳酸菌在含0.3％胆盐的培养基中生长缓慢。

3.3 生长曲线测定

以MRS培养基做为对照，将重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11置于42℃静置培养，每隔2h测定OD₆₀₀值，结果见图4-C所示。

4.4 重组乳酸菌肠道定植力检测

本发明以1日龄肉鸡为动物模型，采用cFDA-SE标记法，评价重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11在鸡肠道内的定植能力。共60只鸡，随机分成4组。具体方法：试验组I每只鸡灌服100μL 10⁹CFU/mL的M-11乳酸菌；试验组II每只鸡灌服100μL 10⁹CFU/mL的pPG-OF/M-11；试验组III每只鸡灌服100μL 10⁹CFU/mL的pPG-OF-Co1-DCpep/M-11。每天灌服1次，连续3天，在灌服之后的第1、3、7、14、21天无菌解剖取鸡的回肠、盲肠和结肠段，去除内容物，收集鸡肠黏膜PBS冲洗液，进行流式细胞仪分析，结果见图5所示，重组乳酸菌的定植能力未受到影响。

实施例4 重组乳酸菌口服黏膜免疫疫苗的免疫效力评价

本发明以SPF鸡为动物模型评价了该重组乳酸菌口服疫苗的免疫原性。将SPF鸡分成3组，其中实验I组和实验II组分别口服接种重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11，每只鸡每次接种100μL 10¹⁰CFU/mL的菌量，每2周免疫1次，共免疫2次。口服接种PBS作为对照。采用ELISA方法检测实验鸡粪便、盲肠及鼻腔黏液中sIgA抗体水平以及血清中IgG抗体水平，并对经免SPF鸡进行了攻毒保护性试验。结果如下：

4.1 免疫鸡粪便中特异性sIgA抗体检测

结果见图6所示：口服免疫重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11组SPF鸡粪便中检测出了较高水平的抗fimA和ompC蛋白的sIgA抗体，而对照组(非重组乳酸菌组)鸡粪便中免疫前后sIgA抗体水平无差异。且pPG-OF-Co1-DCpep/M-11(靶向传递免疫原)组产生抗体速度强于pPG-OF/M-11组(非靶向)。

4.2 免疫鸡盲肠黏液及鼻腔冲洗液中特异性sIgA抗体检测

于免疫后的不同时间点分别采集免疫鸡盲肠冲洗液和鼻腔冲洗液样品，经ELISA方法检测样本中抗fimA和ompC蛋白的sIgA抗体水平，结果见图7所示，口服免疫重组乳酸菌pPG-OF/M-11组和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11组SPF鸡盲肠冲洗液和鼻腔冲洗液中均检测出了较高水平的sIgA抗体，并且pPG-OF-Co1-DCpep/M-11(靶向传递免疫原)诱导机体产生的IgA抗体水平高于pPG-OF/M-11(非靶向)。对照组(非重组乳酸菌组)sIgA抗体水平免疫前后差异不显著。

4.3 免疫鸡血清中特异性IgG抗体检测

结果见图8所示，口服免疫重组乳酸菌pPG-OF/M-11组和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11组鸡血清中检测出了高水平的抗fimA和ompC特异性IgG抗体，并且pPG-OF-Co1-DCpep/M-11(靶向传递免疫原)组诱导机体产生的IgG抗体水平高于pPG-OF/M-11(非靶向)组，而对照组(非重组乳酸菌组)鸡血清中特异性IgG抗体水平免疫前后无差异。

4.4 免疫保护性评价

于第2次免疫后15天进行攻毒试验，每组SPF鸡20只，每只鸡口服2倍最小致死剂量的鸡致病性大肠杆菌ATCC1553活菌，以评价重组乳酸菌的免疫保护效力。结果见图9显示，口服免疫重组乳酸菌pPG-OF/M-11组免疫保护率为70％，口服免疫重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M-11组保护率达80％，而口服PBS组的SPF鸡在攻毒后3天内全部死亡，口服空载体乳酸菌的鸡在5天内全部死亡。结果表明，口服免疫重组乳酸菌pPG-OF/M-11和pPG-OF-Co1-DCpep/M-11能够有效诱导鸡只产生抗鸡致病性大肠杆菌的免疫保护力，并且重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M-11(靶向传递免疫原)免疫保护力强于pPG-OF/M-11(非靶向)。

综上，本发明以鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白作为免疫原，并融合M细胞及DC细胞靶向肽，利用组成型表达载体pPG-PPT及鸡肠道源乳酸杆菌Lactobacillussaerimneri M-11作为传递抗原的活载体菌，成功构建的基因工程乳酸菌口服疫苗菌株pPG-OF-Co1-DCpep/M-11具有良好的免疫保护作用，可用于预防鸡大肠杆菌病。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在防治鸡大肠杆菌病中的用途

<130> klpi170631

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> VP60

<400> 1

atggagggca aaacccgcac agcgccgcaa ggcgaagcag caggcactgc taccacagca 60

tcagtccccg gaaccacgac cgacggtatg gaccctggcg tggtggccgc aactagtgtg 120

gtcactgcag aaaactcatc cgcatcggtt gcaacggcgg ggattggcgg cccaccccaa 180

caggtggatc aacaagagac atggaggaca aacttttact acaatgatgt tttcacttgg 240

tccgtcgcgg atgcgcccgg cagcattctc tacactgtcc aacactctcc acagaacaac 300

ccattcacag ccgtgctgag ccagatgtac gctggctggg ctgatggcat gcagttccgc 360

tttatagttg ccggatcagg tgtgtttggt gggcgactgg ttgcggctgt gataccgcca 420

ggcatcgaga ttggaccagg gttggaggtc aggcaattcc ctcatgttgt catcgacgcc 480

cgttcacttg aacctgttac catcaccatg ccggacttgc gtcccaacat gtaccatcca 540

actggtgacc ctggcctcgt ccccacacta gtccttagtg tctacaacaa cctcatcaac 600

ccgtttggtg ggtccaccag cgcaatccaa gtaacggtgg aaacaaggcc aagtgaggac 660

tttgagttcg tgatgattag agccccctcc agcaagactg ttgactcaat ctcacccgca 720

cgcctcctca cgaccccagt tctcactggg gttggcaatg ataacaggtg gaacggccaa 780

atagtgggac tgcaaccagt gcctggaggg ttttccacgt gcaacaggca ctggaactta 840

aacggcagca catacggctg gtcaagccct cggtttgccg acattgacca tcgaagaggc 900

agtgcaagtt attctgggaa caactcaacc aacgtgctcc agttttggta tgccaatgct 960

gggtctgcaa ttgacaaccc tatctcccag gttgcaccag acggctttcc tgacatgtca 1020

ttcgtgccct ttaacagccc caacattccg accgcagggt gggtcgggtt tggtggaatc 1080

tggaacagta acaacggtgc ccccgctgct acgactgtgc aggcctatga attaggtttt 1140

gccactgggg caccaaacaa cctccagccc accaccaaca cctcaggtgc acagactgtc 1200

gctaagtcca tttatgccgt ggtaaccggc acaatccaaa acccaaccgg actatttgtg 1260

atggccccgg gcattatctc caccccaaac gccaacgccg tcacatacac gccccaacca 1320

gacagaattg tgaccacacc cggtactcct gctgctgcac ctgtgggtaa gaacacaccc 1380

atcatgttcg cgtccgttgt caggcgcacc ggtgacgtca acgccgcagc tgggtcaagt 1440

aacgggaccc agtacggcac aggctcccaa ccactgccag taacaattgg actttcgctc 1500

aacaattact cgtcagcact catgcccgga cagtttttcg tttggcagtt aacctttgca 1560

tctggtttca tggagattgg tttgagtgtg gacgggtacc tttatgcagg aacaggagcc 1620

tcaactacgc tcattgactt gacagaactc attgatgtac gccccgtggg acccaggccg 1680

tccaaaagca cactcgtgtt caacctgggg ggcacagcca atggcttttc ttatgtctga 1740

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> HCE

<400> 2

gaaaaaagga gctggaaccg atg 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> T7g10

<400> 3

aataattttg tttaacttta ag 22

<210> 4

<211> 1143

<212> DNA

<213> PgsA anchor

<400> 4

atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60

aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120

atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt actctgacga cgtactctca 180

gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240

ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300

ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360

catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaatct cacggttctc 420

aacagcgcaa acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480

gaatttgcga agcaaaacct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540

aagaaaattt tgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg caacgcttgg ctttaccgat 600

gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660

gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg ctgacattgt tgttgtgcag 720

tcacactggg gacaagagta tgacaatgat ccaaatgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780

gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc acccgcacat cttagaaccg 840

attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgatcaa 900

ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960

ggccgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcacc tgtgaaaaaa 1020

gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080

aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140

taa 1143

<210> 5

<211> 404

<212> DNA

<213> rrnBT1T2

<400> 5

ttggcttatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 60

tgataaaaca gaatttgcct cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 120

actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 180

ccaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 240

atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 300

aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 360

catcaaagga atcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgc 404

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

gagctcgctg aagtttacaa caaagacggc a 31

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

ggatccgaac tgataaacca ggcccaga 28

<210> 8

<211> 74

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ggatccggtg gcggtggctc aggtggcggt ggctcaggtg gcggtggctc aacgactgta 60

aatggtggga ccgt 74

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

ggtggcggtg gctcaggtgg cggtggctca ggtggcggtg gctca 45

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

tgaacctcta gattgatact gaaccttgaa ggtcgc 36

<210> 11

<211> 1038

<212> DNA

<213> ompC

<400> 11

gctgaagttt acaacaaaga cggcaacaaa ttagatctgt acggtaaagt agacggcctg 60

cactatttct ctgacaacaa agatgtagat ggcgaccaga cctacatgcg tcttggcttc 120

aaaggtgaaa ctcaggttac tgaccagctg accggttacg gccagtggga atatcagatt 180

cagggcaaca gcgctgaaaa cgaaaacaac tcctggaccc gtgtggcatt cgcaggtctg 240

aaattccagg atgtaggttc tttcgactac ggtcgtaact acggcgttgt ttacgacgta 300

acttcctgga ccgacgtact gccagaattc ggtggcgaca cctacggttc tgacaacttc 360

atgcagcagc gtggtaacgg cttcgcgacc taccgtaaca ctgacttctt cggtctggtt 420

gacggcctga actttgcagt tcagtaccag ggtaaaaacg gtagcgtaag cggcgaaggc 480

atgaccaaca acggtcgtgg tgctctgcgt cagaacggcg acggcgttgg cggatctatc 540

acttatgatt acgaaggctt cggtatcggt ggtgcgatct ccagctccaa acgtactgat 600

gatcagaaca gcccgctgta catcggtaac ggcgaccgtg ctgaaaccta caccggtggt 660

ctgaaatacg acgctaacaa catctacctg gctgctcagt acacccagac ctataacgca 720

actcgcgtag gttccctggg ttgggcgaac aaagcacaga actttgaagc tgttgctcag 780

taccagttcg acttcggtct gcgtccgtct gtagcatacc tgcagtctaa aggtaaaaac 840

ctgggtacca tcgctggtcg taactacgac gacgaagata tcctgaaata tgttgatgtt 900

ggtgctacct actacttcaa caaaaacatg tccacctacg ttgactacaa aatcaacctg 960

ctggacgaca accagttcac tcgtgacgct ggcatcaaca ctgataacat cgtagctctg 1020

ggcctggttt atcagttc 1038

<210> 12

<211> 471

<212> DNA

<213> fimA

<400> 12

acgactgtaa atggtgggac cgttcacttt aaaggggaag ttgttaacgc cgcttgcgca 60

gttgatgcag gctctgttga tcaaaccgtt cagttaggac aggttcgtac cgcatcgctg 120

gcacaggaag gagcgaccag ttctgctgtc ggttttaaca ttcagctgaa tgattgcgat 180

accaatgttg catctaaagc cgctgttgcc tttttaggta cggcgattga tgcgggtcat 240

accaacgttc tggctctgca gagttcagct gcgggtagcg caacaaacgt tggtgtgcag 300

atcctggaca gaacgggtgc tgcgctggcg ctggacggtg cgacatttag ttcagaaaca 360

accctgaata acggaaccaa caccattccg ttccaggcgc gttattttgc aaccggtgcc 420

gcaacctcgg gtgctgctaa tgcggatgcg accttcaagg ttcagtatca a 471

<210> 13

<211> 108

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

gggcccttat ggacgttgtg gagttgaatg atatgatgga taaaatgagc caccgccacc 60

tggtaatggt gaacgagctg gtaattgatg aaatgatgaa cctctaga 108

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> DCpep

<400> 14

tggacgttgt ggagttgaat gatatgatgg ataaaa 36

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> Col

<400> 15

tggtaatggt gaacgagctg gtaattgatg aaatga 36

Claims (10)

1.一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将表达鸡致病性大肠杆菌ompC蛋白和fimA蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌中得到的，其中ompC蛋白和fimA蛋白之间通过柔性序列连接，所述的融合蛋白的连接顺序为ompC-fimA-M细胞靶向肽-DC细胞靶向肽。

2.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillussaerimneri M-11。

3.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的表达载体通过以下步骤制备得到：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；

(2)将M细胞靶向肽(Co1)和DC细胞靶向肽(DCpep)编码基因通过融合PCR方法构建到fimA基因的下游，得到融合基因fimA-Co1-DCpep，然后将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，fimA-Col-DCpep融合基因与ompC基因通过柔性序列连接，得到的重组载体命名为pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep；

(3)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒，即为所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体，命名为pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep。

4.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体通过电转化方法转入乳酸菌的感受态细胞中。

5.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，步骤(1)中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示，柔性序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述DC细胞靶向肽(DCpep)及M细胞靶向肽(Col)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14以及15所示。

6.一种构建权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；

(2)将M细胞靶向肽(Co1)和DC细胞靶向肽(DCpep)编码基因通过融合PCR方法构建到fimA基因的下游，得到融合基因fimA-Co1-DCpep，将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，fimA-Col-DCpep融合基因与ompC基因通过柔性序列连接，得到的重组载体命名为pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep；

(3)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒，即为所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体，命名为pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep；

(5)制备乳酸菌感受态细胞，经电转化技术将构建的重组质粒pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep转入乳酸菌感受态细胞，筛选重组乳酸菌转化子，获得阳性重组乳酸菌，即为靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗株。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示，柔性序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述DC细胞靶向肽(DCpep)及M细胞靶向肽(Col)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14以及15所示。

9.权利要求1-6任一项所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株在制备预防或治疗禽大肠杆菌病药物中的用途。

10.一种禽大肠杆菌病亚单位口服疫苗，其特征在于含有权利要求1-6任一项所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株。