CN102639702A - 使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗 - Google Patents

使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN102639702A
CN102639702A CN2010800404490A CN201080040449A CN102639702A CN 102639702 A CN102639702 A CN 102639702A CN 2010800404490 A CN2010800404490 A CN 2010800404490A CN 201080040449 A CN201080040449 A CN 201080040449A CN 102639702 A CN102639702 A CN 102639702A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
vaccine
plant
dna
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800404490A
Other languages
English (en)
Inventor
林文傑
徐宇虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
VaxGene Corp
Original Assignee
VaxGene Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VaxGene Corp filed Critical VaxGene Corp
Publication of CN102639702A publication Critical patent/CN102639702A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的抗病原体疫苗是在重组细菌和/或转基因植物中生产的，然后通过标准的疫苗注射方法或者通过口服方式施用。编译病原体抗原的DNA序列编码被连接至启动子上，所述启动子可以调节细菌或转基因植物中表面抗原的产生。在一实施方案中，外源基因被表达在植物某部分或细菌之中，所述植物或细菌作为疫苗使用。在一实施方案中，所述疫苗是通过口服方式施用。本发明还提供了一种使用经过基因改造的微生物作为口服疫苗的方法，这种微生物通常被认为可以食用和/或在摄入时对动物或人类无害，例如乳酸菌，其中包括乳酸链球菌菌种系。在一个实施方案中，能表达禽流感血凝素(HA)基因的乳酸链球菌可以用作预防H5N1病毒感染的口服疫苗。

Description

使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗
本申请以2009年11月20日提交的美国系列号61/263,215以及2009年7月13日提交的美国系列号61/224,973的专利申请作为优先权，其内容在此整体引入本申请中作为参考。
发明领域
本发明涉及一种对抗动物病毒、细菌、其它致病原生物和/或抗原体的疫苗，及制备该疫苗的方法。本发明涉及一种能表达外來的抗原体的可食用植物以及该植物作为疫苗的使用。本发明更涉及外來的抗原体在微生物(例如细菌)中的表达，以及该微生物作为疫苗的使用。在一個实施方案中，本发明提供一种使用乳酸乳球菌来表达禽流感血凝素(HA)，從而作为对抗H5N1病毒感染的口服疫苗的方法。本发明更涉及该产自植物或微生物的疫苗的制备和施用方法。
背景技術
家畜的疾病每年都带来严重的商业影响。在发达国家中可容易得到兽医服务和注射式疫苗，这些疾病虽然严重，但能得到改善。这在具有大规模的畜牧业和能夠制造過量食物的国家更为真确。但在发展中国家中，由于兽医服务和药物的缺乏，以及较差的粮食制造能力，家畜的疾病对人口造成严重的影响，包括导致食物短缺和人民的健康问题。
由于抗药性病原体的增加，使用抗生素来有效地控制致病细菌已经越来越困难。因此，许多畜牧业者已经自愿减少在动物饲料中添加抗生素。然而，由于传染病的预防比治疗较为便宜，越来越多的注意力放在了疫苗的研发上。
疫苗引发动物的免疫系统去制造抗体对抗病毒、细菌、和其他病原生物。在经济发达的国家，疫苗令很多疾病受控。尤其是很多病毒性疾病现已通过免疫计划得到预防。
但是很多疾病，如狂犬病、手足口病等的疫苗对于发展中国家仍然过于昂贵，沒法施用在它们大量畜牧的动物上。缺少这方面的预防措施常在这些国家中引起食物短缺的问题从而令人民的生存条件恶化。
致病微生物能通过以下方式感染宿主：进入创伤外皮的缺口；带菌者传播；或和粘膜表面接触。
大部分的动物病菌通过粘膜表面接触引起疾病。病菌和病毒首先在粘膜表面繁殖，或被覆蓋在培氏斑和淋巴小结上的一种特别细胞(M细胞)所吸收。能进入淋巴组织的微生物可在淋巴小结中被杀死，并由于抗原体被送到淋巴小结，从而引发潜在的保护性免疫反应。或者，能抵抗淋巴小结的防御的病原体能从小结中散播，造成局部或全面性的疾病(如沙门氏菌)。
除了昆虫传播的病原体或通过伤口进入的病原体外，大部分的病原体都通过粘膜表面进入体内。通过粘膜进入的病原体包括但并不局限于：放线菌、气单胞菌属、杆菌、类杆菌属、博德特氏菌、布鲁氏菌、弧菌、Capnbocylophaga、Clanrdia、梭菌、Corynebacteriurn、埃肯菌、丹毒絲菌、埃希氏菌、梭杆菌、嗜血杆菌、克雷白氏杆菌、军团杆菌、钩端螺旋体、Lisleria、分支杆菌、支原体、奈瑟氏菌、诺卡氏菌、巴斯德氏菌、Proteus、假单胞菌、立克次氏体、沙门氏菌、月形单胞菌、Shigelia、葡萄球菌、链球菌、密螺旋体、Bibro、以及耶尔森氏菌、Adetiovirus族群的致病组、冠状病毒、疱疹病毒、正粘病毒、Picornovirus、痘病毒、呼肠孤病毒、逆转录酶病毒、及轮状病毒、一般来自Aspercillus、子囊酵母菌、假丝酵母、球孢子菌、隐球菌组织胞浆菌和须霉的病原性真菌、和在一般艾美虫、内阿米巴和毛滴虫中的病原寄生物。
被病原体感染的哺乳类动物使用免疫反应來克服病原体。该免疫系统包括粘膜、体液及细胞三个分支。粘膜免疫力來自分泌液中的分泌性抗体(sIgA)，分泌液由所有分泌腺产生，且覆盖在所有粘膜表面，包括呼吸道、肠胃道、生殖泌尿道的粘膜。分泌性抗体IgA能阻止病原体在粘膜表面上繁殖，是第一道预防病原体通过粘膜表面繁殖和入侵的防线。sIgA的生产可由分泌腺或组织的局部免疫激发，或通过向肠相关淋巴组织(GALT或培氏斑)或支气管相关淋巴组织(BALT)提供抗原而激发。
膜微皱细胞，或称为M细胞覆盖在GALT和BALT的表面上，或在其他分泌性粘膜表面上。M细胞在粘膜表面旁的管腔采集抗原体，并传送它们至抗原呈递细胞(树突细胞和巨噬细胞)，此细胞从而传送抗原体到T淋巴细胞，T淋巴细胞把抗原体送到B细胞。B细胞被激发繁殖、迁徙并最终转化为能分泌抗体的浆细胞，从而制造IgA对抗被送到的抗原体。
当抗原体由覆蓋在GALT和BALT上的M细胞接收时，体内所有分泌组织都能制造能对抗抗原体的sIgA，造成一种全面的粘膜免疫力。由于大部分的病原体都是通过粘膜表面进入身体，且这些表面通常是对抗感染和促进身体免疫反应的第一道防线，因此能口服的疫苗是一种激发全面粘膜免疫力的重要途径，能激发口腔和肠胃道的分泌免疫反应。
分泌性IgA抗体能直接抑制微生物粘附在宿主的粘膜表皮细胞和牙齿上。这抑制的原因可以是微生物的粘合、疏水性或负电量的降低、以及微生物的粘附受到阻止。这些抗粘附的效果可由其他因素增強，如分泌性醣蛋白、表皮细胞的持续脱落和细菌相爭等。
人类口腔脊髓灰质炎病毒疫苗以及若干口腔或鼻腔病毒疫苗应用在動物上的临床经验显示出，在粘膜免疫系统对抗呼吸道和肠胃病毒感染的保护性效果上，sIgA具有决定性的角色。sIgA的作用似乎是阻止病毒进入人体细胞，而非阻止病毒的粘附。
能对抗感染生物的特定毒性因素的分泌性IgA抗体在整体粘膜免疫力中有重要的角色。在很多病例中，提高粘膜sIgA的生产量来对抗感染生物的相关毒性因素可以预防粘膜表面的初期感染。分泌性IgA能通过阻止附着和/或繁殖并且中和表面的毒素，来预防病原体和粘膜表面的初期反应，或阻止其进入人体细胞。
注射不活跃的完整细胞和完整病毒能有效地引发保护性血清IgG和延迟性的超敏感反应，从而对抗在致病過程中有明显血清阶段的生物(例如伤寒沙门氏菌和乙型肝炎的人类或动物病原体)。然而，注射的疫苗在诱发粘膜sIgA的反应并不有效，而且也不能有效地对抗只和粘膜表面相互反应但并不侵入的细菌((如霍乱弧菌等人类和动物病原体)。
因为培氏斑能优先引起IgA B-细胞的发展，如果抗原被送到培氏斑內的T和B淋巴细胞及其副卫细胞，口服免疫便能有效地诱发特定sIgA的反应。培氏斑含有辅助性T细胞(TH)，辅助性T细胞能把IgM直接转换成IgA B细胞，然后迁移至肠系膜淋巴结并进行分化、进入胸导管及循环系統、最终停留在包括肠鼓膜中层和呼吸道的所有体内分泌组织中，因而调控B细胞的同型。IgA然后由成熟的浆细胞所制造，与膜上的分泌成分形成复合物，并被运送到粘膜表面，从而能和入侵的病原体互相反应。这种粘膜免疫系统解释了口服疫苗和口服免疫如何能对抗从粘膜表面入侵而引起感染的病原体。
由于口服方法简单，现今世界对发展新的口服疫苗技术有很大的兴趣。由于在发展中国家給大量动物进行免疫注射并非可行或极难执行，因此适当地施用口服免疫原能刺激体液和细胞免疫，并有可能为发展中国家提供价格适宜和安全的疫苗。这样的疫苗可基于能表达病源体的保护性抗原表位的细菌或病毒载体系统(多价疫苗)，或基于净化后的抗原，能单独或和其他相关抗原或病原体联合传送。
已被采用來发展口服免疫的策略包括使用减弱的变种细菌(如沙门氏菌)作为异种抗原的载体、把抗原装入由聚-DL-乳酸-乙醇酸(PGL)组成的微球体，类蛋白聚合物，胶囊，不同的脂质体配方，把抗原吸附在纳米粒子上，使用亲脂免疫刺激性复合物，或加入有佐剂特性的细菌产品。
目前大部分疫苗的发展需要大规模种植致病媒介。现时，疫苗一般由已死或活着但减弱的病原体制造。如果病原体是病毒，大量的病毒必须在动物体内或人工培养的动物细胞中种植。如果使用活着但减弱的病毒，该病毒必须被证实缺乏毒性但保持感染能力及能导致体液和细胞免疫力。如果使用已死的病毒，该疫苗必须缺乏由存活的抗原导致免疫的能力。另外，表面抗原是导致免疫的主要病毒微粒，它可被分离并服用，从而代替活着但减弱或已死的病毒來导致免疫。
疫苗的生产常常使用复杂的技术，造成疫苗发展和制造的昂貴。无论疫苗是來自培养细胞、完整细菌、病毒、其它病原生物或它们的一些部分，疫苗必须浓缩和净化。虽然如此，但问题仍然存在。在已死的细菌细胞、病毒或其它病原生物中，病原体仍可能存活，疫苗的接种便会导致个别的病例。另外，疫苗的培养材料中的细胞物质有时会混杂在疫苗中。这些物质能导致接受疫苗的动物的不良反应，甚至死亡。
给小鼠肌肉注射质粒DNA是一种疫苗策略，可导致保护性免疫和引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在临床研究中使用DNA疫苗已被确立，多个不同的独立研究报告了DNA疫苗的保护性免疫力。在最近的研究中，除了人类外的灵长类动物在多种情形下能用1-2毫克的DNA疫苗引起抗体和CTL的反应。然而，使用高剂量的DNA并不化算，因此，有需要在兽医药物中使用更低更少的DNA剂量來导致有效的免疫，并提升免疫反应的幅度。
一些可能提高DNA疫苗效力的策略包括修改载体从而提升抗原的表达，提高DNA的传达，或加入佐剂。有报告指出monophoryl类脂A能提高对抗人类免疫缺陷病毒的DNA疫苗的体液和细胞介导免疫反应(Shin等人，1997)。与QS-21皂角苷相辅的DNA疫苗能通过肌肉和鼻腔的途径引发系统性和粘膜免疫反应(Shin S等人，1998)。Manmohan S已经发展出一种能传送DNA疫苗的阳离子微粒，而维生素D3也在DNA疫苗的免疫中扮演重要角色。
另据报道，被称为免疫刺激序列的细菌DNA序列可以是一种有效的辅助物。包含CpG-寡核苷酸CPG-ODN)但非甲基化的DNA回文序列能不依赖抗原(免疫刺激性DNA序列，ISS)来激活单细胞、NK细胞、dendrilic细胞和B细胞从而激活先天免疫反应。CpG-ODN的甲基化据报告能废除DNA疫苗的免疫原性。大量使用质粒来免疫可能只会克服体内转染的低效率，并以辅助的方式促进Th-1型的反应。
致病性高的H5N1禽流感(HPAI)病毒的繁殖仍然是一个全球性的重大忧虑。除了每年在全球不同鸟群中的病发外，超过385人已被报告感染H5N1[1]。因此，研制疫苗从而遏制动物中的病毒以及防止人类健康再次受到重大威脅和危机是非常重要的。
至今已有许多方法制造流感病毒疫苗。最常用的策略是服用已被热能灭活且在胚化的蛋中培养的完整病毒。但用蛋培飬的疫苗对抵抗致命的H5N1病毒不大有效；此外，由這种方式制造的疫苗需要高剂量才能引起保护性免疫反应。用蛋培养的疫苗不能达到理想的血清转换率和免疫反应的幅度[2-4]。其他较先进的方法包括使用以杆状病毒表达系统制造的重组亚组疫苗[5]、质粒DNA疫苗[6-8]及不能复制的腺病毒载体疫苗[9-12]。每一种疫苗都有潜力保护小鼠不受致命病毒的威胁[6-7]。然而，所有这些疫苗都需肌肉注射，对施用在大量动物上的应用造成困难。
若果能有一种可用在人和动物身上的实用和有效的流感疫苗，并能跟食物一起服用，这种疫苗则会大受欢迎。为此，本发明使用能安全口服的乳酸乳球菌(L.lactis)载体系统。乳酸乳球菌是一种革兰氏阳性的乳酸菌，被广泛用于一般被认为安全(GRAS)的发酵乳产品的生产和保存。它可以被设计成能表达多种蛋白质，包括细菌和病毒抗原[13-17]。小鼠接受这些载体后，能产生抗原特异粘膜及系统性免疫反应[13，14，17]。然而，由于大部分的生物都不能在胃部的强酸性环境及肠胃道的降解酶环境中生存，抗原接种效率仍然很低[20]。
植物遗传工程
本领域已知多种植物和植物组织的基因改造方法，外源DNA可稳定地引入植物的遗传物质中，即外源DNA能传給植物的后代。两种改造的方法是土壤杆菌介导的转化和直接的基因转移。
土壤杆菌介导的转化利用农杆菌，即冠瘿的病原体，是多种双子叶植物和裸子植物的疾病，这些疾病于植物感染的部位产生肿瘤或瘿。土壤杆菌的感染一般发生在植物伤口，且携带一个叫钛的大染色体外元素(能诱导肿瘤)质粒。
钛质粒含有诱发肿瘤所需的两个序列。一个序列为最後被稳定地转移至植物基因组DNA的T-DNA(转移DNA)。另一个序列为涉及转移過程的VIR(毒性)序列。虽然该毒性VIR序列在稳定改造中是必需的，但是virDNA并没有被转移到受感染的植物上。由农杆菌介导的植物细胞转化及T-DNA的转移已有文献纪录。例如，见Bevan，M.W.等人，Int.Rev.Genet.16，357(1982)。
许多实验室在经过几年的深入研究后，农杆菌系统已经发展到能被用来进行多种植物组织的转化。由这种技术转化的组织包括，但不局限于，番茄、烟草、向日葵、棉花、油菜籽、马铃薯、杨树和大豆。
A.rhizogenes也被用来作为植物转化的载体。它是一种能在双子叶植物中刺激根毛形成的细菌，並携带着大量称为Ri质粒(根诱导)的染色体外元素，该元素的功能与农杆菌的Ti质粒类似。使用A.rhizogenes的转化技术已发展至类似使用农杆菌的转化技术，并且已被成功用来转化如苜蓿和杨树的植物。
利用直接基因转移，外源遗传物质不需使用土壤杆菌质粒便可转化入植物组织中。直接转化涉及攝取外源遗传物质进入植物的细胞或原生质体中。化学物或电场可增强攝取力。外源物质可被结合到核基因组中。早期的直接转移是在双子叶Nicotiana tabacum(烟草)中进行的，並已证明外源DNA能被合併在植物后代中。此技术已用來转化一些单子叶植物原生质体，包括玉米和水稻。
脂质体的融合也是一种转化植物细胞的方法。把原生质体和带有所需基因的脂质体结合。当细胞膜合并时，外源基因就转移到原生质体中。
此外，聚乙二醇(PEG)介导的转化能达成直接的基因转移。PEG介导的转化已成功改造如烟草的双子叶植物和如lolium multWorum的单子叶植物。这种方法依赖化学物来引导原生质体攝取DNA，并基于镁+z，聚乙二醇及CA+z之间的相互作用。例如，见Negrutiu，R.等人，Plant Mal.Biol.8，363(1987)。
另外，外源DNA可通过微注射进入细胞或原生质体。这种技术用一种细玻璃針管把质粒DNA或DNA片段的溶液直接注射到细胞中。这种技术已被用來转化苜蓿。
最近发展的一种直接基因转移的方法用带有DNA的微彈丸來撞击细胞。这种方法一般被称为微粒撞击，它把被外源DNA覆盖的钨或金粒子加速射向目标细胞。粒子便带著DNA穿過细胞。微粒子的加速已成功地用在培养基中的细胞、原生质体和植物的幼胚(包括但不局限于，洋葱、玉米、大豆和烟草)來达成瞬间和稳定的表达。
一旦植物细胞被转化，便有多种植物再生的方法。原本的植物组织和种类決定不同的再生方法。近年来，植物的愈伤组织可用來再生不同种类的植物，包括单子叶植物，例如，但不局限于玉米、大米、大麦、小麦、黑麦和双子叶植物，例如，但不局限于向日葵、大豆、棉花、油菜和烟草。
由农杆菌转化的植物组织已被用來再生几个种类的植物。包括，但不局限于，向日葵、西红柿、白三叶、油菜、棉花、烟草、马铃薯、玉米、大米、以及众多的蔬菜种类。
从原生质体再生植物只是偶尔有用的技术。当一种植物可以从原生质体再生时，可使用直接基因转移的技术，而且转化并不需要农杆菌。从原生质体再生的植物包括，但不局限于烟草，马铃薯，杨树，玉米和大豆。
制造转基因植物的技术引致了很多研究者去研究怎样表达不同种类的植物或非植物基因。许多情况需要鉴定由病毒或细菌的基因所表达的重组蛋白质。在植物中用来表达外源序列的嵌合基因的制造方法需要把植物中的非编码监管序列接合到编码所需蛋白质的DNA序列的羧基端，并且把活跃于植物細胞中的多腺苷酸化信号的序列接合到编码所需蛋白质的DNA序列的羟基端。
5’端的监管序列经常被用來制造嵌合基因从而转化植物，它能致使转基因植物中的所有细胞，特定细胞或特定组织表达介入的基因。CAMV35-S启动子取自能致病的花椰菜花叶病毒，它经常被用来引导植物去表达外源基因。一个有监管作用的DNA序列被发现能控制patatin蛋白质只表达在块根中，这是基因表达在特定发展方面的一个例子；此patatin启动子序列能导致一些外源基因只在块根中表达。例如，见H.C.Wenzler等人(1989)PlantMot Biol.12：41-50。
嵌合基因的制造亦可包括将被引入转基因植物的结构基因的氨基酸编码序列的修改。例如，可加入或删除将被表达的蛋白质中氨基酸，该蛋白质的表达被用来影响在转基因植物的细胞中外源基因产物的细胞定位。
在至少一个蛋白质的羧基端引入KDEL(SEQ ID NO：1)和HDEL(SEQ ID NO：32)的氨基酸序列已被证明能提高该植物内质网滞留机理对该蛋白质的识别。S.Munro和H.R.B.Pelham，Cell 48，988-997(1987)；J.Denecke等人，EMBO-J 11，2345(1992)；E.M.Herman等人，Planta 182，305(1991)；C.Wandelt等人，The Plant Journal 2，181(1992)。然而，由于其它在转化细胞中如蛋白构象或蛋白质折叠得因素可能干扰植物内质网滞留机理的羧基端的信号，因此这样的修改仍然存在问题。S.M.Haugejorden等人，J Biol Chem.266，6015(1991)。
使用转基因植物制造口服疫苗的方法
由化学或发酵制造的合成肽的生产和净化的高成本能阻止其作为口服疫苗的广泛使用。在转基因植物中制造免疫蛋白以及这些在转基因植物中的蛋白的辅助作用提供了一种经济上可行的方法。
虽然口服疫苗能有效且廉价地诱导动物，包括人类的分泌性免疫反应，但仍需要成熟的技术从而制造能在消化后产生没有明显副作用但具有所需免疫反应的抗原的转基因植物或植物组织。
现时已有尝试通过制造转基因植物从而表达大肠杆菌及变性链球菌的抗原。Curtiss和lhnen，WO 90/0248，1990年3月22日发表。亦有尝试通过转基因植物表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，见H.S.Mason等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，89：11745.749(1992)。
在美国已经有一系列授予使用植物来制造疫苗的发明的专利。在1996年1月16日发出的美国专利5,484,719(Lam，Arntzen)中，质粒载体含有重组乙肝病毒表面抗原的蛋白质DNA和具有克隆植物蛋白的合成的植物功能性启动子。该专利亦披露质粒可用来制造转基因烟草植物细胞。在1997年3月18日发出的美国专利5,612,487(Lam，Arntzen)中，转基因烟草植物含有重组乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中该植物能够合成病毒蛋白抗原粒子。该专利亦披露了一种使用已转化的烟草植物制造抗原组合物的方法，从该烟草植物中取得的抗原粒子能被用作疫苗。在此两个披露中，发明人亦意识到在使用烟草植物作为重组疫苗的局限。烟草的生物碱和其他有毒物质都需要彻底的净化。
在1999年6月22日发出的美国专利5,914,123(Amtzen，Lam)中，食物含有转基因植物材料，该转基因植物材料具有其本身的营养价值，且能在被消化后表达出肝炎病毒或传染性胃肠炎病毒的重组免疫原。
在2000年3月7日发出的美国专利6,034,298(Lam，Arntzen，Mason)中，转基因植物，以及制造转基因植物的质粒和方法，都能表达一种传染性胃肠炎病毒的病毒抗原蛋白。此专利亦披露一种制造能预防传染性胃肠炎病毒的药物疫苗的方法及其疫苗。
在2000年10月24日发出的美国专利6,136,320(Amtzen，Lam/Prodigene)中，描述了一种免疫原的口服组合物，该口服组合物含有未经净化或部分净化的在植物中表达的病毒免疫原，表达的程度为能令组合物被动物口服后，免疫反应能被观测所得。尤其是，所述作为免疫蛋白的免疫原，从一个含有传染性胃肠炎病毒和肝炎病毒的组群中取得，而且含有该肝炎病毒的疫苗在植物中表达，而该免疫原能附着在的粘膜细胞表面的糖化分子上。一种含有病毒抗原的植物组合物，该病毒抗原能触发抗体的制造，而且由乙型肝炎病毒表面抗原或传染性胃肠炎病毒的刺突蛋白以及植物物质传送；所述抗原作为在转基因植物中表达免疫原的方法的产物，而所述植物物质選自植物整体、植物部分以及天然植物提取物。预防传染性胃肠炎的疫苗含有权利要求8所请的组合物，所述抗原来自传染性胃肠炎病毒的刺突蛋白。
在2001年2月27日发出的美国6,194,560(Atntzen，Mason，Haq/TAMU)专利中，一种能编码为LT-B的合成大肠杆菌基因，其中所属的基因含有能被植物密码子所用的优化DNA序列。此专利亦提及，那些未能制造出口服免疫植物物质的研究未能证明出在转基因植物中能制造能令动物免疫的口服疫苗。
动物疾病
猪瘟(HC)，是一种在猪中严重的系统性和出血性疾病，由Hog Choler病毒(HCV)引起。在全球多个国家中，猪瘟具有经济上的破坏性。在自然条件下，猪是已知的唯一能容易受猪瘟传染的动物。猪瘟是一种传染性极强的疾病，它能导致毛细血管壁变性，因而导致内脏的出血和坏死。起初，猪瘟的症狀为发烧、厌食、呕吐和腹泻，然後帶來一些長期問题，如母猪不孕，流产和及低接种。然而，几乎所有的猪在症状出现的最初2个星期内死亡。
猪瘟可通过直接接触从受传染的猪传染到健康的猪上。该疾病也可以通过接触受传染的身体分泌物和排泄物来传染。苍蝇、鸟类和人类都可以作为病毒传染的载体。
尽管猪瘟不会在人们食物中传染的疾病，但由于造成大量的猪只死亡，它能对养猪业造成严重经济损失。传统上，猪瘟综合征是一种发病率和死亡率高的急性疾病。病毒的进化亦不时导致亚急性和慢性的发病。
病毒株能引起急性疾病，特点为持续的能令体温升至华氏107度的发烧。其他急性疾病的征兆包括抽搐、食欲减退、白细胞减少、扁桃体坏死及食欲不振。在传染后的3-4天，一般会在上皮细胞中、内皮细胞及单核吞噬细胞系统中出现病毒复制的病毒血症。内皮细胞的变形和坏死导致血管崩溃、缺血，并引起弥漫性血管内凝血。血管的崩溃从而导致肾脏、膀胱和胃粘膜的出血，脾脏梗死以及淋巴结出血。一般在发病的5-14日后死亡。
慢性的猪瘟在猪身上能导致相似的临床症状，但具有较少的出血症状。腹部皮肤出现变色和耳朵周围出现红色斑点。传染慢性猪瘟的猪可以传染发病后存活超过100天。
猪瘟轻度或不明显的症状很少产生明显的临床症状。受传染的猪在患病后往往能康复。温和的病毒株可能只会导致较少的后代，死产和其他繁殖失败。在断奶的高致命率也可能证明温和猪瘟病毒的存在。
当怀孕的猪被较低毒性的病毒株传染时，可能会引起胎盘传染。取决于潜伏期的阶段，先天性传染能导致流产、死胎及胚胎畸形。低毒性病毒传染的最常见的后果为小猪以免疫耐受的状态下诞生并携带大量病毒。
猪瘟病毒(HCV)是Peslivirus属黄病毒家族的成员。(Francki，R.I.B.等人，1991，Arch of Virol Supp 2：223-233；Horzinek，M.，1991，Arch of Virol Supp 3：1-5；Collett，M.S.，1992，Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases15：145-154)。它主要在淋巴细胞和血管内皮中复制。大部分的猪瘟病毒株的复制都在细胞质中进行，而且并不会导致细胞病变效应。
猪瘟病毒已被证明在结构上和血清上与牛的毒性腹泻病毒(BVDV)和羊的边界病毒(BDV)相关，而且这两种病毒属于togaviridae中的pestivirus。HCV是一个小的单正链RNA病毒且基因组的大小约为12.3kb。(Vanderhallen，H.等人，1999，Arch Vii al 144：1669-1677)。它的基因组含有一个夹在羧基(5’)和羟基(3’)非编码区(NTR)中的长且开放的阅读区间(ORF)。同时，若它含有任何聚腺苷酸，它缺少的5’端和明显的3’端聚(A)序列。HCV病毒被认为能编码3-5个结构蛋白，其中两种可能含有多腺苷酸化。非结构病毒蛋白的数量仍然是未知之数。修改后的HCV疫苗(包含减毒或死亡的病毒)已经被指定且目前正在被用来防治猪瘟的传染。然而，从受传染的组织培养细胞中提取HCV材料从而修改病毒疫苗的病毒产量低，因而导致难以净化病毒粒子。修改后的活性病毒疫苗始终涉及令动物传染只是部分减弱的致病性HCV病毒的风险，该病毒仍然具有致病性并且能在受传染的动物或其后代中引起疾病，还能令该疫苗受其他病毒污染。此外，减毒的病毒可能会恢复到致命的状态。使用灭活疫苗亦有其他缺点，例如，只是部分灭活的病毒的风险，低程度的免疫因而需要额外的免疫接种的问题，以及抗原的改变从而引致灭活病毒不具备免疫性的问题。因此，使用修改后的HCV疫苗不适合根除病毒的计划。
只含有能对病原体产生免疫反应的HCV免疫材料的疫苗并不具有修改過的疫苗的缺点。传统式制造和服用的重组HCV疫苗已被披露为之含有若干HCV免疫的部分。例如，见美国向Meyers等人发出的美国专利5,935,582(1999年8月10日发出)，5,925,360(1999年7月20日发出)，以及5,811,103(1998年9月22日发出)。
由HCV染色体组RNA取得的cDNA序列是一个大概长为12,500核苷酸的连续序列。它含有一个长且开放的阅读区间(ORF)，以在364-366的ATG编码为起始，并以在12058至12060的TGA编码为结束。此ORF区间含有3898个编码，能编译成435kDa个蛋白质。
在体内，HCV病毒在受传染的细胞的复制过程中，该蛋白是以多聚蛋白前体分子的形式被合成，所述的多聚蛋白前体随后亦通过前体分子的酶切变成多肽碎片。在完成翻译后的改变后这些在碎片形成病毒的结构和非结构蛋白。据此，可以取得一种含有免疫性质遗传咨询的序列。该免疫性质能对抗HCV病毒、或具有HCV免疫特性的病毒、或含有对HCV有免疫特性的遗传信息的碎片。
多肽碎片在氨基酸中的位置大约为1-249，263-487，488-688或689-1067。该1-249区间主要代表核心蛋白质，然而263-487，488-688和689-1067区间主要分别代表44/48kD，33kD和55kD的醣蛋白。
HCV的直径为40-50nm，并且具有约29nm的核壳体。在病毒体的表面有约6-8nm的凸起。取决于梯度材料和用来传播病毒的细胞，浮力密度为1.12g/ml至1.17g/ml之间。
HCV在pH值5-10时最稳定；但在低于和高于这个pH区间时，HCV很快会丧失传染能力。HCV在例如乙醚、氯仿和脱氧胆酸的脂类溶剂中能迅速被灭活。虽然它在细胞培养基中的传染能力在60摄氏度时10分钟就能丧失，但病毒在68摄氏度的纤维蛋白的血液中30分钟后仍然保持活性。另外，该病毒能在冰冻的尸体中存活很长时间，而且能在猪肉和猪肉制品中几个月都保持传染力。因此，它在动物流行病学上具有重要的意义。
当比较基因组未翻译的5’区间(Hofmann，M.A.等人，1994，Arch Viral 139：217-229)、E2基因(Lowings，J.P.等人，1994，J.Gen Viral 75：3461-3468；Lowings，P.el al.，1996，J Gen Vral 77：1311-1321)或NS5B基因(Vilcek，S.等人，1996，Virus Res43：137-147)时，所有至今已发现的HC病毒株都属于2个主要的组群和5个副组群。
HCV5’至3’的基因包括N的非结构蛋白质、能编译C的核壳体、与外壳相关的醣蛋白(E)E0，E1和E2，NS2、N83、NS4A、NS4B、NSSA及NSSB的非结构蛋白质(NS)。
所造成的具有3900个氨基酸的多聚蛋白能在翻译中和翻译后由病毒和宿主细胞的蛋白酶用来制造出四种结构病毒蛋白质和七至8种非结构病毒蛋白质(Thiel，H-J.等人，1996，Fundamental Virology，3rd ed.Raven Press New York，1059-1079)。
核壳体蛋白质C以及三个与外壳相关的醣蛋白E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55)皆为HCV病毒的结构组成物。它们位于第3个多聚蛋白的N端中(Stark，It，等人，1990，Viral 174：286-289)。瘟疫病毒的衣壳蛋白在多聚蛋白中处于非结构蛋白p23的后方。
这种非结构性的核心蛋白质被认为是一种具有自体溶解性的蛋白酶(Thiel等人，1991，J.Virol 65：4705-4712；Wiskerchen，M.A.，等人，1991，J Vrol 65：4508-4514)。
E0缺乏典型的细胞膜固着点，并且受传染的细胞可大量分泌出的E0(Rumenapf，T.等人，1993，J Vrol，67：3288-3294)。虽然该蛋白质具有RNase活性，但是它在病毒生命周期中的酶促作用仍然是未知之数。
在某程度上，E2和E0是中和病毒的抗体的目標。另一方面，E1埋在病毒的外壳中(Weiland，E.等人，1990，J Virol 64：3563-3569)，而其他抗E1的抗体则很少被提及。在病毒体及受传染细胞中，醣蛋白能形成二硫化物链接的复合物，例如，100kDa的E0同型二聚体、75kDa的E1-E2异型二聚体、以及100kDa的E2同型二聚体(Thiel，H-J，等人，1991，J Vrol 65：4705-4712)。
传染性支气管炎(IB)是一项病征为气促、咳嗽和打喷嚏的急性和高度传染性的鸡呼吸道病毒疾病。在中国南方的家禽业每年都经历严重的IB爆发，尤其是近年来，其他病毒性呼吸道病也已经在中国珠江三角洲地区出现高发病率，因此，准确而快速地取得病毒的基因型是能否控制传染性支气管炎的一个重要因素。IB的病原体属于在全球已有20种血清型被发现的冠状病毒科的传染性支气管炎病毒(IBV)5。虽然中国已经使用大众型的疫苗进行免疫，但每年都有疾病发生的通报，亦有通报关于IVB病毒株在肾脏、输卵管、管道和腺体中进行复制。
IBV编码的三个主要的结构蛋白：核壳体蛋白(N)、膜醣蛋白和S蛋白。S蛋白在翻译后能被切断并从而释放出N-端S-1和C-端S-2蛋白质。N-端的亚组(S1)负责细胞附着、确定组织嗜性以及中和病毒的抗体诱导。然而C-端亚组(S-2)把S-1附着到细胞病毒外壳上。S-1蛋白质的N-端部分根据血清型的不同而有所差异，而且在同血清型中亦根据不同的病毒株而有所差异。Keeler和Kingham已在大众的IBV血清型中的S-1基因的N-端发现两种高变区间(HVRs)以及两种稳定区间。含有中和抗原决定部位的HVRs可能位于氨基酸区间56-69和117-137。所述两个稳定区间位于氨基酸区间43-47和229-236。以前H1和VN被经常用来诊断IBV，但这些方法也有缺点，例如非常费时和费力，而且H1并不十分可靠。
由于Jungher等人首先描述Mass和Conn之间的抗原差异，并指出IBV的抗原多样性。由于与加强TBV免疫相关的免疫选择性压力和其他低生物安全性的操作，现已发现超过20种能治病的病毒血清型以及额外的变种血清型。
基于农业的运作，在中国已经广泛采用大众型疫苗。近年来，中国南方密集型的家禽业导致了选择性免疫的上升，而同时，由于门户开放的政策，其他HBV疫苗的源头亦被引进到中国。这种野生株和疫苗株的结合亦可能导致IBV的爆发。
另外一个昂贵的疾病就是鸡传染性腔上囊病(IBD)，亦称为传染性法氏囊病。IBD是由鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)引起的。除了和受传染的鸟类直接接触外，老鼠和蚊子亦能传播疾病。
在International des Epizooties的63届会议(OIE，巴黎，1995年5月15-19日)中，由于现时有超过95％的成员国都有此疾病(Eterradossi，N.等人，1995，巴黎OIE)，因此IBD被估计为在国际层面上具有相当大的社会经济意义。
虽然IBDV并不传染人类，但它仍然导致严重的经济损失。所述疾病的经济意义可分为两大类。第一，有些病毒株能导致3周或更大的鸡20％的死亡率。第二，在鸡只的幼期延长免疫反应的抑制。
鸡只在3-6周岁的时候最容易受到IBDV的传染而且具有高死亡率。IBD的症状可以是临床症状或亚临床症状。对于非常剧毒的IBDV病毒株，受传染的年龄段则更广(Van denBerg TP，等人，1991.Avian Pathol 20：133-143；Nunoya T.等人，1992.Avian Drs.36：597-609)。在传染后的短时间内(传染后24小时内)，法氏囊出现损伤，并在法氏囊的覆盖表面出现凝胶状淡黄色渗出液。
在传染后的第3天，由于水肿和出血，法氏囊的大小和重量都增加。在传染后的第4天，法氏囊的大小增加了一倍。然后，法氏囊缩小并且在随后的几天减少分泌物。在传染后的第8天，法氏囊的重量一般能降到原重量的三分之一，也出现了粘膜表面的坏死和petcchial出血。
由于凝血机理受损，受传染的主体的胸肌变得座位和脱水。例如，其他主要器官，如肾，脾，胸腺及副泪腺，亦能被观察到出现受损和出血。
与出现临床症兆相反，幼鸡(一般小于三周岁)在传染IBD后出现延长了的免疫抑制作用。因此，受传染的主体会更容易被其他疾病传染。这样会引致鸟类更容易受到如colisepticaemia球虫病、传染性喉气管炎、传染性支气管炎、沙门氏菌和大肠杆菌等其他疾病的传染。另外，亦引致了病原体疫苗的低抗体反应。除了受传染鸡只明显的体液免疫抑制外，细胞介导的免疫亦被瞬间抑制。
IBDV是属于双核糖核酸病毒科，它主要传染淋巴细胞，尤其是前体B细胞。法氏囊是最经常被病毒严重传染的主要目标器官。
IBDV是一个单层、没有外壳和具有由32个壳粒组成的20面体对称病毒，并且直径为60-70nm。衣壳的对称性是斜的。完整IBDV粒子在氯化铯中的浮力密度范围为1.31g/ml至1.34g/ml。
IBDV能抵抗含有乙醚和氯仿的治疗。在pH值为2的情况下，IBDV不会受到影响。尽管处于56摄氏度下5小时，它仍然能保持活性。另外，在30摄氏度下处于0.5％苯酚和0.125％硫柳汞中1小时，所述病毒仍然不受影响。另一方面，所述病毒在pH值为0的情况下能被灭活。当处于0.5％福尔马林中6小时后，所述病毒的传染力能被降低。处于70摄氏度下30分钟，所述病毒甚至能被杀死。
两种IBDV的血清型以及每种血清型所含有若干种病毒株已经被发现。虽然他们能刺激抗体，但乙型病毒并不能引起临床疾病。因此，至今为止IBD疫苗只在甲型IBDV病毒中制造。乙型病毒抗体并不能提供预防甲型病毒的保护，也不能干扰对甲型病毒的反应。
IBDV的RNA聚合酶的高突变率造成了抗原的变异(变异株)以及体内毒性的改变(例如病毒株)。因此为了实现最大程度的保护，可能需要特殊的疫苗。交叉保护的研究表明由“传统”甲型病毒中支取的灭活疫苗需要高抗原含量从而提供预防这些变异的最好保护。
另外，IBDV的病毒株已经在过去10年中在多个国家出现并引致严重的疾病。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳所显示，IBDV病毒含有2部分(段)双链RNA，分别为A段和B段。较大的A段约为3.4kB，并含有两个开放的阅读区间(ORF)。较大的ORF是单向的而且能编译能成为结构蛋白VP2(40kDa-45kDa)的多聚蛋白以及IBDV的蛋白酶(28kDa)(Muller&Becht，1982 J.Virol.1982 Ocr44(1)：384-392；Azad，A.A.等人，1985，Viral 143：35-44；Azad A.A.等人，1987，Virol 161：145-152；Hudson，P.J.等人，1986，Nucleic Acids Res 14：5001-5012；Kibenge FS等人，1997.Arch Viral 142：2401-2419).同时，较小的且部分为与VP2重叠的ORF能编译VP5蛋白质(17kDa)。较小的B段(约为218kb)能编译90kDa的功能性蛋白质VP1(Muller H，Nitschke R.1987.Virology 159：174-177；Speis等人，1987，Virus Res 8：127-140)。IBDV的基因组含有两个VP2的酶切位点，分别名为AccI和SpeI。在VP5和VP2之间亦出现重叠。VP1的功能为依靠RNA的RNA聚合酶以及病毒体内复制的加帽酶。它依赖于一个多余的多态以及与基因组相连的蛋白质(Muller H，Nitschke R.1987，Virology 159：174-177；Kibenge FS，Dhama V.1997.Arch Virol142：1227-1236)。
除了被定为超变区间的Accl-SpeI酶切段，VP2在多个病毒株中的序列是很稳定的(Bayliss等人，1990，J.Gen Viral 71，1303-1312)。对病毒毒性和衰减都很重要的序列都能在此区间中找到(Yamaguchi T.等人，1996.Virology 223：219-223)，VP2是主体保护的主要IBDV免疫源，并含有能引起抗体中和的抗原部位(Azad等人，1987，Vral 161：145-152)，然而VP3蛋白质被认定为非中和的抗体。
VP2和VP3形成病毒的核壳体。VP2很可能在核壳的外围而VP3则在内围与病毒RNA相互作用。
VP4蛋白酶是非结构性多肽。它负责A段上的多聚蛋白质的酶切，但它并不包括在成熟的病毒粒子中。丝氨酸-赖氨酸催化dyade能引起VP4的蛋白水解活性(Birghan等人，2000，EMBO Journal 4：114-123)。
VP5并不是在细胞培养基中的病毒复制所必须的，但它的调节作用能在病毒的释放和传播中起重要作用(Mundt等人，1997，J Viral 71：5647-51)。另外一种能影响牲畜的疾病是猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)，并且由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起(PRRSV)。猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)被认为是在欧洲和北美养猪农业中对经济影响最严重的病毒疾病。症状首先在1980年代末并在致病源被隔离前在美国猪群中构成问题，此亦通常被称为神秘猪疾病。但病毒在1991年(Wensvoort G.等人，(1991))于欧洲和美国(VR-2332)in 1992(Bonfield A.A.等人，(1992).J Veterinary Diagnostic Investment 4，127-133)被发现(Leiystad病毒[LV])，PRRSV便成为全球猪群主要的病原体，并且持续出现新的症状。
PRRS可以导致新生和幼儿的呼吸系统疾病以及繁殖上的损失。因此，它能在养猪业中导致严重的经济损失。然而，临床症兆的内在变化亦能导致经济损失。在大众的基础上，最严重的爆发能导致年产量下降5-20％。
由于猪的先前健康状况的差异，病毒株以及对于不同农场、临床症兆以及产量损失的管理都大有不同。另外，很多案例都非常复杂，且带有能增强疾病严重性的二级传染。(De Jong，M.F.等人，1991，European Comm Seminar on the New Pig Disease，4：29-30#4；Bonfeld，D.W.等人，1992，J VetDiagn Invest.4：127-133)。
PRRSV的急性传染具有三个阶段：起始阶段、高潮阶段、和最后阶段(Raymakers，J.M.L.，1991，European Comm Seminar on PRRS 11：4-5，Brussels，#16)。在疾病的起始阶段，临床症状，如食欲不振、嗜睡、抑郁症和发热，已经出现在猪场中。在此阶段，呼吸系统疾病，如呼吸困难和呼吸气促，都有可能出现在成年的猪只中，但这些症状在幼猪中通常更为突出，而且一般维持1-3周。
在高潮阶段，过早的小猪分娩导致流产及死胎的增加，并导致preweaning死亡率的上升。同時，大部分的生长的减缓和死亡都是由二级传染引起的。成长的猪只尤其是幼猪中的二级传染正在增加。(De Jong，M.F.等人，1991，European Comm Seminar on the NewPig Disease 4：29-30#4；Benfeld，D.A.，等人，1992，Diseases of Swine 7i6 Ed，Ames，IA：Iowa State University Press：756-762)。一般地，此阶段维持8-12周。
在最后阶段，繁殖的参数恢复至PRRS之前的水平，并且在成长中或已长成的猪中出现各种呼吸系统疾病。这个阶段可能是慢性疾病或恢复至PRRS之前的水平的前奏。
在慢性PRRS中，活猪的出生数量长远地将会降低(Dial，D.，等人，1990，MSDCorn Mtg.Denver：Livestock Conservation Institute，3.6)，并且出生率减少的时间亦有所延长(Benfeld，D.A.，等人，1992，Diseases of Swine 7th Ed.Ames，IA：Iowa StateUniversity Press：756-762；Benfield，D.W.，等人，1992，J Vet Diagn Invest.4：127-133)。猪只在慢性PRRS中的群体中有食量大但生长慢的现象。同时，增加的二级传染亦导致在慢性传染的群体中产生持续性鼻炎和肺炎。
虽然繁殖失败的机理仍然是未知数，但猪胎的胎盘传染是传染后期常见的特征。另外，尽管病毒不能从睾丸或成熟的性腺中分离，但精液仍然能够传播PRRSV(Oblinger，V.，1992，Pig Dis Info Centre)。
猪繁殖及呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科中的Anterivirus属(Cavanagh，D.1997，Arch of Virol.142：629-633)。肺泡巨噬细胞是PRRSV在体内的标靶细胞。
PRRSV是一个球形，有外壳包围的病毒，大小为45-70nm(Benfeld，D.A.，等人，1992，Diseases of Swine 7’h Ed.Ames，IA：Iowa State University Press：756-762；Benfeld，D.W.，等人，1992，J Vet Diagn Invest.4：127-133)，并且含有20-30nm的二十面体核衣壳核。含有核壳的脂质双分子层含有两个主要的外壳组成部分，GP5和M，以及两个次要外壳组成部分，GP2和ON。外壳明显有细小的表面凸起。PRRSV在CsCI中的浮力密度为1.18g/ml-1.19g/ml，在蔗糖中的浮力密度为1.13g/ml-1.14g/ml。在净化的CsCI中，PRRSV的传染力比在蔗糖中强(Benfeld，D.A.等人，1992，Diseases of Swine 7`h Ed.Ames，IA：Iowa State University Press：756-762；Benfeld，D.W.，等人，1992，J Yet Diagn Invest.4：127-133)。
虽然病毒在-70摄氏度时传染性滴定量能超过4个月维持在稳定状态，但在-50摄氏度15-20分钟时或在37摄氏度10-24小时时，病毒能减少10倍(Bonfield，D.A.，等人，1992，Diseases of Swine 74 Ed.Ames，IA：Iowa State University Press：756-762；Benfield，D.W.，等人，1992，J Vet Diagn Invest.4：127-133).在pH值低于5或高于7时，病毒的传染性滴定里昂能降低超过90％。另外，在用氯仿或乙醚治疗后，病毒的复制被灭活。PRRSV是由多聚腺苷酸、大小为15.1kb的单链正RNA分子组成(Meulenberg，J.7，M，等人，1993，Viral 192：62-72)，并含有8个开放的阅读区间(ORFs)，名为Is，Ib，2，3，4，5，6&7(Conzelmann，K.K.等人，1993，Viral 193：329-339；Meulenberg，等人，1995.Virology 206：155-163)。在被PRRSV传染的细胞中，病毒的阅读区间被转录进6个信使RNA的3端上。6个mRNA都含有3端聚A尾段以及一个从染色体组RNA5端中取得的共用的领导序列。
ORF1a和1b在5端组成了75％的染色体组，并且编码了带有明显复制酶和RNA聚合酶活性的蛋白质。ORFs 2-6编码了和细胞膜相关的蛋白质。另外，由ORFs 2-5编码的多肽被糖基化并且名为GP2(29kD)、GP3(431cD)、GP4(31kD)及GPS(25kD)上。
GP2是在病毒外壳上的其中一种次要组成物。它的其中一个部分是通过二硫化物键折叠的，而且并没有形成同型二聚体，或带有其他病毒蛋白质的异型多聚体(Mculenberg，J.J.M.，等人，1996，Viral 225：44-51)。
北美和欧洲的病毒株，在缺少显著中和体液免疫反应的情况下，GP3能为小猪提供预防PRRSV传染的保护。在GP4的Nand C端有高度疏水的序列。虽然抗GP5的抗体能中和PRRSV传染，但却不比抗GP5抗体有效(Weiland，E.，等人，1999，Vet Microbiol 66：171-186)。
结合到病毒外壳上的GP5含有高甘露糖和复杂结构的N连接寡糖。由于抗GP5的抗体能中和受传染细胞的PRRSV传染，因此GP5是PRRSV的传染力的重要元素(Pirzadeh，B.等人，1997，Viral，78：1867-1873)。
名为M蛋白的多肽，由ORF6(19kD)编码而成，是一个未被糖基化的三型跨膜蛋白质。它形成二硫化物键的且带有醣蛋白的二质二聚体。在被PRRSV传染的细胞中，亦发现二硫化物键的M蛋白同型二聚体，但它没有结合在病毒体上(Mardassi，H.等人，1996，Vrol221：98-112)。
ORF7编码一个非醣基化的多肽(151cD)，并形成名为N的核壳体。N是一个非常基本的蛋白质，主要以二硫化物相连的同型二聚体的形式存在(Mardassi，H.等人，1996，Viral 221：98-112；Meulenberg，等人，1995.Virology 206：155-163)。
预防HCV、IBDV和PRRSV的疫苗
HC的经济意义引起了旨在清除该疾病的努力。灭活的疫苗株，例如，中国疫苗株，是最广泛使用的疫苗，并能有效保护猪只预防该疾病。
虽然灭活病毒的疫苗是安全和有效的，但它能干扰血清诊断且并不能区分已免疫和被传染的动物。因此，现时在欧洲对抗大规模病发的方法主要是靠大量隔离和屠宰。为避免贸易限制，屠宰政策主要针对毁灭被传染和血清诊断呈阳性(疑似被传染)的动物。该清除方案的巨大成本因而刺激了寻求替代方法控制该疾病的研究。
由于IBDV的坚固性，单是采用卫生措施并不足够用来控制疾病。因此，现时较可取的控制IBD的做法为在受孕前向鸟类接种油乳剂疫苗，从而在复制中诱导高程度的被动免疫，并因而保护复制。然后在7天后在复制中接种灭活的油乳剂疫苗，便能达到大概85-90％的保护率(Wyeth PJ，Chettle NJ.1990.Yet Rec 126：577-578)。尽管研究人员认为在饮用水中施加活性疫苗并不能提供额外的免疫，但此方法仍然会在2.5周岁、3.5周岁和4.5周岁时被使用(Wyeth&Chettle，1990 Yet Rec.Jun 9；126(23)：577-578；Goddard，等人，1994 Pet Rec.Sep 17；135(12)：273-274)。
然而，如果服用过早，被注射的疫苗能在具有高浓度母源抗体的情况下被中和。因此，量多血清是决定接种疫苗最佳时刻的必要步骤(Van den Berg TP，等人，1991.AvianPatho120：133-143)。
随着变异株(具有不同的抗原特性)以及剧毒株(能穿透高浓度母源抗体)的发生，传统的IBDV疫苗在对抗IBD上变得失效。
现时控制PRRSV的策略主要依赖于改变后的活性疫苗免疫，但存在着其本身的弊端。首先，活性疫苗具有回归到致命表型的风险。第二，在畜群中它不能区分已接种和受传染的动物。已经有报道指出对抗PRRSV的DNA疫苗能激发细胞介导免疫和体液免疫(Kwang，I.，等人，1999，Res in Vet Sci，67：199-201)。
然而，儘管有以上的进展，仍然有需要发展一种有效、容易生產和服用的疫苗來对抗HCV、IBDV及PRRSV及其他动物疾病。
发明詳述
为帮助对本发明有明确且一致的了解，以下是一些术语和它们的定义。
动物是指任何脊椎或无脊椎动物，包括但不局限于人、鸟和鱼。
抗原是一种大分子，能在人、哺乳类动物或其他动物体內刺激抗体的制造。本申请所述的抗原，指广义上的抗原，抗原定子或抗原本身，或含有抗原或抗原定子(有时被名为原生抗原表位)的溶合蛋白质。
抗原定子指一种细小的化学合成物，能决定抗原与抗体的特定反应。病原体的病毒和/或繁殖抗原包含至少一个抗原定子。
氨基酸域指蛋白质中的氨基酸序列，与一种特定功能或同源序列相关。
繁殖和病毒抗原指在病原微生物表面的抗原，所述抗原帮助微生物繁殖或入侵宿主。本申请的讨论及权利要求可提及繁殖或病毒抗原或其抗原定子。病原体可含有繁殖或病毒抗原，或两者都有，表达所述抗原的DNA序列可被转移到载体上用来改造植物，使植物能表达所述抗原。
免疫原剂指任何能在动物中导致免疫反应的抗原，例如动物吃下带有能表达抗原的载体的植物。
嵌合序列或基因指含有至少两个非同源部分的DNA序列，所述非同源部分来自已存在的DNA序列，或与已存在的DNA序列相当接近，在自然状态下，这些已存在的DNA序列并没有联系在一起。已存在的DNA序列可能是天然的或人工合成的。
编码的DNA序列指一种能提供资讯來制造多肽分子、mRNA或tRNA的DNA序列。DNA序列可以是基因、基因组合或基因片段。
外源DNA是指非天然存在於被改造的微生物或植物中的DNA。这些外源DNA包括病毒、原核和真核细胞的DNA，它們可以是天然的，化学合成的，cDNA，变异的DNA或这些DNA的组合。本发明的外源DNA来自或相当近似病原微生物和病毒的DNA，或是一种合成基因，能编码一种与原核细胞蛋白质的氨基酸序列相似的的蛋白质。
溶合蛋白是指由至少两组不同的氨基酸序列连接的蛋白，所述序列从來沒有被天然表达成一个蛋白。溶合蛋白经常是遗传工程的产物，来自不同基因的DNA序列被连接起來从而编码出一个蛋白，所述蛋白由原先的基因编码的氨基酸序列所组成。
基因指染色体的某一部位，能编码某一细胞产物。
微生物指以下的其中一种：细菌、真菌、原生物或病毒。
植物组织是指在自然状态下或培养中的植物的任何组织。这包括但不局限于：植物整体、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈合组织、培养细胞以及组成结构单位和/或功能单位的植物细胞群。
当这些术语有或沒有跟上述的植物组织同時使用时，并不排除任何其他的植物组织。根据本发明，适合改造的植物包括，但不局限于：如玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、水稻、香蕉和大蕉的单子叶植物，以及如土豆、西红柿、紫花苜蓿、大豆、一般的豆类、油菜、苹果、梨、一般的水果和其他蔬菜的双子叶植物。
植物改造载体是指一种质粒或病毒载体，所述载体能改造植物使其组织能含有并表达不是先天存在于植物组织中的DNA。
食物或可食用的植物材料是指任何可供动物或人作为营养品或副食品食用的植物材料。
已存在的DNA序列是指序列的整体或部分在用于本发明的方法前，序列已经存在。已存在通常意味天然来源，但是已存在的序列可以來自合成或其他根源。
免疫反应涉及抗体的制造，抗体是名为免疫球蛋白的蛋白质。抗体通过血管循环渗入其他体液，然后与招引这些抗体的外源抗原相结合。这样能阻止病毒和细菌毒素(如破伤风或肉毒杆菌毒素)与目标细胞结合，從而消除它們的活力。抗体的结合能令入侵的微生物更容易被吞噬细胞吞食，也能激活名为补充系统的血液蛋白来摧毁微生物。细胞介导的免疫反应是另一种免疫反应，它生产专门的细胞，与附在其他宿主细胞表面的外源抗原反应。反应的细胞能杀灭表面有病毒蛋白的细胞，因此在病毒复制前就消除被传染的细胞。在其他的情况下，反应的细胞能分泌化学信号从而激活巨噬细胞來摧毁入侵的微生物。
分泌免疫反应(SIR)指一种特定的免疫反应。它涉及IgA抗体在分泌液中的形成和制造，所述分泌液浸泡在人和其他动物的粘膜表面，或来自分泌腺。能导致所述抗体的形成和制造的物质被认为能刺激分泌免疫反应。分泌免疫有时也被称为粘膜免疫。
序列同源是指不同的核苷酸序列或不同的氨基酸序列在功能和/或结构方面非常相似。拥有同源序列的序列在功能和/或结构上存在极少的差异。
转基因植物是指拥有并能表达在被引进该植物内之前并不存在於该植物内的DNA的植物。
转基因植物材料是指任何植物物质，包括但不局限于天然和经加工的细胞、原生质体、组织、叶、茎、果实和块根，所述物质拥有并能表达在被引进该植物内之前并不存在於该植物内的DNA。另外，植物材料包括上述物质的加工提取物，包括但不局限于食物制品、食物、食品补充剂、榨取物、浓缩物、丸、含片、咀嚼品、粉末、配方、糖浆、糖果、硅片、胶囊和片剂。
可食用植物材料包括植物或任何可从植物取得并适合哺乳类动物、人或其他动物食用的物质。本术语包括可供动物食用的生的植物材料或可供动物及人食用的任何加工過的植物材料。从植物取得的材料包括植物任何可供人或其他动物食用的部分。
本发明提供了一种可口服的免疫组合物，所述组合物包含在植物或细菌中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，所述免疫原的表达程度足以在动物口服该组合物后引起免疫反应。重组免疫原的例子包括但不局限于HCV、IBDV、IBV、ILTV及PRRSV。在一个实施方案中，重组免疫原是一种嵌合蛋白。在另一实施方案中，HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫原能够与粘膜细胞膜反应时产生对HCV、IBCV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫反应。在一实施方案中，HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫原能够在粘膜细胞膜的表面与醣化分子結合，在另一实施方案，HDV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫原是嵌合蛋白。
本发明亦提供了一种可口服的免疫组合物，所述组合物包含在植物或细菌中表达的未净化或部分净化的药用重组免疫原。重组免疫原的例子包括但不局限于HCV、IBDV、IBV、ILTV及PRRSV。
本发明亦提供了一种可口服的免疫组合物的应用，所述组合物包含在植物或细菌中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，用来治疗由该免疫原引起的疾病。重组免疫原的例子包括但不局限于HCV、IBDV、IBV、ILTV及PRRSV。
本发明亦提供了一种可口服的免疫组合物，所述组合物包含在植物中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，所述免疫原在植物中的表达程度足以在动物口服该组合物后引起免疫反应。重组免疫原的例子包括但不局限于一种来自猪霍乱病毒的免疫原蛋白、来自猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫原蛋白以及来自传染性法氏囊病病毒的免疫原蛋白。
本发明更提供了一种含有在植物中表达的猪霍乱病毒免疫原、猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原或传染性法氏囊病病毒的免疫原，所述免疫原能和粘膜细胞膜表面的醣化分子结合。在某些实施方案中，免疫原是猪霍乱病毒免疫原。在其他的实施方案中，免疫原是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原。在另外的实施方案中，免疫原是传染性法氏囊病病毒免疫原。
本发明亦提供了一种含有病毒抗原的植物组合物，所述病毒抗原来自HDV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV，並能触发抗体的制造，所述抗原在转基因植物中表达所得，所述植物材料可以是植物整体、植物部分或植物提取物。
本发明亦提供了一种能表达一种核苷酸序列的转基因植物，所述核苷酸序列能编码一种重组病毒抗原蛋白，该蛋白来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒。在某些方面，所述蛋白是嵌合蛋白。在其他方面，所述植物是拟南芥。
本发明另外提供了一种含有重组病毒抗原蛋白和植物材料的疫苗组合物。所述蛋白在植物中制造并且来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒；所述疫苗组合物能在动物服用后引起免疫反应。
本发明亦提供了一种含有转基因植物材料並能作为营养品的食物，所述转基因植物能表达重组免疫原。重组免疫原的例子包括但不局限于：从猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒提取的免疫原。在某些实施方案中，所述植物是拟南芥。在其他实施方案中，所述植物选自西红柿和马铃薯。在另外的实施方案中，所述转基因植物材料选自可食用的水果、叶、果汁、根以及种子。
本发明亦提供了一种制造转基因植物细胞的方法，所述方法包含以下步骤：把能编码重组病毒抗原蛋白的DNA连接到在植物中有功能的启动子，从而建造DNA载体，例如，蛋白可来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒，所述启动子能指令該植物表达該DNA，然后使用DNA载体改造植物细胞。在某些实施方案中，改造包含用拟南芥介导的改造。
本发明另外提供了一种制造药用疫苗组合物的方法，所述组合物包括一种重组病毒抗原蛋白，所述方法包含以下步骤：把能编码病毒抗原蛋白的DNA连接到在植物中有功能的启动子，从而建造DNA载体，例如，蛋白可来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒，所述启动子能指令DNA在植物中的表达，然后使用DNA载体改造植物，并且提取在该植物中表达的药用疫苗组合物。在某些方面，所述植物是拟南芥。
本发明另外提供了一种免疫原组合物，所述组合物包含在细菌中表达的未净化或部分净化的重组免疫原。所述免疫原在细菌中的表达程度足以在动物服用该组合物后引起免疫反应。重组免疫原的例子包括但不局限于来自HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫原。在一个实施方案中，所述免疫原是嵌合蛋白。在某些方面，来自细菌的HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原未被净化。在其他方面，来自细菌的HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原已被部分净化，在一些实施方案中，HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原是嵌合蛋白。在其他实施方案中，服用包含注射；在其他方面，服用包含口服。
本发明亦提供了一种含有猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒免疫原的疫苗，所述免疫原在细菌中表达。在某些实施方案中，所述免疫原是猪霍乱病毒免疫原。在其他方面，所述免疫原是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原。在另外的方面，所述免疫原是传染性法氏囊病病毒免疫原。
本发明更提供了一种在动物中产生对一种免疫原的免疫反应的方法，所述方法包含在细菌中表达重组免疫原的步骤，所述免疫原在细菌中的表达程度足以在动物服用该细菌后引起对该免疫原的免疫反应。在某些方面，所述免疫原来自HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV。在其他方面，所述免疫原来自细菌并已被部分净化。
为预防病毒和流行病在全球突发，发展安全而有效的禽流感疫苗给人和动物使用是必要的。在本发明中，能表达禽流感血凝素(HA)基因的转基因乳酸菌，如乳酸乳球菌，能被用作保护H5N1病毒传染的口服疫苗。
在一个实施方案中，如果受试者能承受H5N1病毒传染的致命剂量，在此透露的口服转基因乳酸乳球菌能促使受試者对HA產生强烈的体液和粘膜免疫反应。
以上所述已经广泛地列出本发明的特点和优点，因此一下的发明详述能被更好地理解。本发明额外的特点和优点将在本发明的权利要求中被描述。
附图概述
图1展示表达载体NZ9700(HA)的构造和鉴定。一个有1704bp的血凝素(HA)基因片段被融合入分泌表达载体pNZ8110中(A)。(B)Lane 1，lane 2和lane 3分别代表DNA标记DL15,000、被双限制性内切核酸切割前的pNZ8110、以及被双限制性内切核酸切割后的pNZ8110。(C)Lane 1及lane 2代表DNA标记DL2,000和PCR檢测在电击后的重组L.lastic NZ9700。
图2展示NZ表达血凝素蛋白(HA)。HA蛋白的表达用SDS-PAGE(A)以及Westernblotting(B)查驗。
图3展示口服的微胶囊。
图4展示口服疫苗后對HA的免疫反应。在8周中，四组小鼠口服了5次(治疗方案1)或8次(治疗方案2)109 CFU的NZ9700(HA)；而NZ9700(pNZ8110)被用作负面对照。特定抗原的抗体(血清IgG)滴度由ELISA测定。抗体滴度是能产生较背景吸光度高两倍的血清稀释度(2n)的倒数。每个数据点是至少4隻动物的血清IgG滴度的平均值，所述数据代表两个实验；误差和标准偏差：与控制组相比，*p＜0.0001；与控制组相比**p＜0.05。D(↑)代表給药。S(↓)代表抽样。结果以平均值(log2)±S.D.的方式表达(n＝4)
图5展示由ELISA测定HA特定血清IgG。小鼠在0-3、7-10及21-24天通过口服免疫接种150ul 1010 CFUs的L.lactis-pEmpt、L.lactis-pHA(在细胞质中表达HA蛋白)、L.lactis-pSHA(HA蛋白被分泌)或L.lactis-pgsA-HA(HA蛋白在细胞壁表面)。在第34天提取免疫血清。*和**代表跟PBS对照組相比时有符合统计意义的差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。数据用两个实验的平均值(log2)±S.D.表达。
图6展示用ELISA测得的粪便IgA。IgA抗体滴度在首次免疫后的第10周开始检测。*组別间的平均值有显著差异(p＜.05)。
图7展示H5N1病毒感染后的存活率。BALB/c小鼠(每组6隻)口服NZ9700(HA)或NZ9700(pNZ8100)，并接受H5N1病毒的感染。在感染后的存活率如图所示。
图8展示NZ9700(HA)、NZ9700(pNZ8110)和L.lactis NZ9700的生长曲线。在0-16小时的生长阶段中抽取培养样本。根据600nm的光密度(0D)测量L.lactis的生长。方差的分析(ANOVA)以P值小于0.05才算有意义。
图9展示用ELISA测得的HA特定粘膜IgA。在第34天收集粪便颗粒。*和**代表跟PBS对照组相比时有符合统计学意义的差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。数据用两个实验的平均值±SD表达。
图10展示用ELISA测得的HA特定血清IgG抗体。
图11展示免疫的小鼠对抗致命的H5N1病毒感染的存活率。
图12展示载体pNZ8110-HA。
发明详述
本发明提供了一种可口服的免疫原组合物，所述组合物包含在植物中表达的未净化或部分净化的重组HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原，所述免疫原在植物中的表达程度足以在动物服用该组合物后引起免疫反应。
本发明提供了上述的口服免疫原组合物，当所述的HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原和黏膜反应时，能产生对HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫反应。
本发明提供了上述的口服免疫原组合物，所述的HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原能与黏膜细胞膜表面的糖化分子结合。在以上发明的一个实施方案中，所述HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原是嵌合蛋白。
本发明提供了一种可口服的免疫原组合物，所述组合物包含在植物中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，所述免疫原在植物中的表达程度足以在动物口服该组合物后引起免疫反应，所述病毒免疫原为来自猪霍乱病毒的免疫原蛋白。
本发明提供了一种可口服的免疫原组合物，所述组合物包含在植物中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，所述免疫原在植物中的表达程度足以在动物口服该组合物后引起免疫反应，所述病毒免疫原为来自猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫原蛋白。
本发明提供了一种可口服的免疫原组合物，所述组合物包含在植物中表达的未净化或部分净化的重组免疫原，所述免疫原在植物中的表达程度足以在动物口服该组合物后引起免疫反应，所述病毒免疫原为来自传染性法氏囊病病毒的免疫原蛋白。
本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包含在植物中表达的一种免疫原，所述免疫原是猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒的免疫原，能和黏膜细胞表面的糖化分子结合。上述疫苗的一个实施方案中，所述免疫原为猪霍乱病毒免疫原，在另一个实施方案中，所述免疫原是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原。在另一个实施方案中，所述免疫原为传染性法氏囊病病毒。
本发明提供了一种含有病毒抗原的植物组合物，所述抗原能促使抗体的制造，而且来自HCV、IBDV、IBV、ILTV或RSV抗原和植物材料；並是用转基因植物表达免疫原的方法所得，所述植物材料选自植物整体、植物部分或植物提取物。
本发明提供了一种能表达一种核苷酸序列的转基因植物，所述序列能编码一种重组病毒抗原蛋白，该蛋白来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒。在一个实施方案中，所述蛋白是嵌合蛋白。在另一个实施方案中，所述植物是拟南芥。
本发明提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含：一种重组病毒抗原蛋白，所述蛋白在植物中制造並来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒，以及植物材料。所述疫苗组合物能在动物服用后引起免疫反应。
本发明提供了一种含有转基因植物材料的食物，所述食物能作为营养品食用，所述植物能表达重组免疫原，所述免疫原来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒。在一个实施方案中，所述植物是拟南芥。
本发明提供了一种含有转基因植物材料的食物，所述食物能作为营养品食用，所述植物能表达重组免疫原，所述免疫原来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒。在一个实施方案中，所述免疫原来自于猪霍乱病毒。在另一个实施方案中，所述免疫原来自猪繁殖与呼吸综合征病毒。在另一个实施方案中，所述免疫原来自猪霍乱病毒。在一个实施方案中，所述植物选自西红柿和马铃薯。在另一个实施方案中，所述植物材料选自該植物可食用的果实、叶、果汁、根以及种子。
本发明提供了一种制造转基因植物细胞的方法，它包含以下步骤：建造DNA载体的步骤是把能编码重组病毒抗原蛋白的DNA连接到在植物中有功能的启动子，例如，蛋白可来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒，所述启动子能指令该植物表达该DNA，然后使用DNA载体改造植物细胞。在一个实施方案中，所述改造包含用拟南芥植物介导的改造。
本发明提供了一种制造药用疫苗组合物的方法，所述组合物包括一种重组病毒抗原蛋白，所述方法包含以下步骤：建造DNA载体的步骤是把能编码该重组病毒抗原蛋白的DNA连接到在植物中有功能的启动子，所述蛋白来自猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒，所述启动子能指令植物表达该DNA，然后使用所述DNA载体改造植物，并且提取在该植物中表达的药用疫苗组合物。在一种实施方案中，所述植物是拟南芥植物。
本发明提供了一种免疫原组合物，所述组合物包含在细菌中表达的未净化或部分净化的重组HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原。所述免疫原在细菌中的表达程度足以在动物服用该组合物后引起免疫反应。重组免疫原的例子包括但不局限于：来自HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV的免疫原。在一个实施方案中，来自细菌的HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原并未被净化。
在另一个实施方案中，HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原是从所述细菌部分净化出来的。在另一个实施方案中，所述HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV免疫原是嵌合蛋白。在另一个实施方案中，所述服用包含注射。在另一个实施方案中，所述服用包含口服。
本发明亦提供了一种包含猪霍乱病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或传染性法氏囊病病毒免疫原的疫苗，所述免疫原在细菌中表达。在一个实施方案中，所述免疫原是猪霍乱病毒免疫原。在另一个实施方案中，所述免疫原是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原。在另一个实施方案中，所述免疫原是传染性法氏囊病病毒。
本发明更提供了一种在动物中引起对一种免疫原的免疫反应的方法，所述方法包含在细菌中表达重组免疫原的步骤，所述免疫原在细菌中的表达程度足以在动物服用该细菌后引起对该免疫原的免疫反应。在一个实施方案中，所述免疫原来自HCV、IBDV、IBV、ILTV或PRRSV。在另一个实施方案中，所述免疫原来自所述细菌并已被部分净化。
本发明提供了新颖的DNA疫苗和动物传染病的可食用疫苗。传统上，疫苗包含弱化和/或死的病毒、亚组疫苗(以蛋白为基础)、和/或DNA疫苗(以DNA为基础)的组成物。在优选的实施方案中，本发明披露了DNA和亚组疫苗组成物以及制造和服用的方法。在另外一个实施方案中，此处所披露的是以植物为基础的疫苗组成物以及制造和服用的方法，且包括口服疫苗。
在此特别透露的是以DNA和植物为基础的疫苗，以及其制造和服用的方法。所述方法结合了疗效、安全性以及用血清去区分已免疫和受传染的动物的机会。
另外，在此透露的疫苗及其使用的方法能引出中和抗体，所述抗体被认为是对抗不同疾病的重要防御，疾病包括但不局限于HC、IBDV和/或PRRSV。在此透露的DNA疫苗有化学稳定性，以及能引起体液和细胞介导免疫的优点。本发明的疫苗在某些实施方案中相比其它针对同样或类似疾病的疫苗能提供更好的保护。使用和IBDV HK46的VP5-5.2及VP2-3.4结合的pcDNA3.1已被证明能有效对抗IBDV。
对于本技术领域的一般从业人员来说，用作疫苗的外源抗原能用标准的分子生物技术来制造。例如，在广泛已知的方法中，人类干扰素的外源DNA被拼接到质粒载体上，然后引入细菌细胞内复制。使用同一种限制性内切酶，人类干扰素的基因可从人类染色体上切除，並把细菌质粒拉直。干扰素基因与质粒用粘性末端结扎法連結，再用细菌摄取含有干扰素基因的质粒。每个细菌後裔都繼承了干扰素基因，栽培生产干扰素的细菌，并将干扰素从细菌分离出來給动物服用，尤其是病人。
这种方法经常在临床上用來制造作为疫苗成分的细菌抗原。这些抗原一般位于细菌的表面或是分泌物。这样的抗原包括但不局限于：至少一个致病分子、分泌蛋白、处理過的表面蛋白、外膜蛋白、包膜抗原、毒素、菌毛、和/或鞭毛抗原。
传统的DNA疫苗或“裸”DNA需要从宿主细胞(例如细菌细胞)中净化和分离重组质粒，从而取得临床级别的DNA疫苗。该疫苗一般以注射方式服用。DNA在组织体液中的弱点限制了裸DNA在粘膜免疫的应用。因此，若想达到有效的粘膜传送，一定要在DNA疫苗和细胞外的消化酶之间置放障礙。当阳离子脂在场时，用DNA疫苗转染不同细胞(例如胃部细胞和结肠细胞)是通过非特定的过程或生理途径进行的(Schmid，R.M.，等人，1994，Gastroenterol，32：665-670)。
然而，正如在此描述，DNA疫苗與大肠杆菌复合。在DNA疫苗优选的一个方面，能从DNA载体表达外源抗原的细菌可作为疫苗来服用。这样的疫苗组合物在此名为“DNA-Bac”疫苗。相对于其它种类的疫苗(如植物疫苗、重组疫苗、基于净化蛋白的疫苗、活的或弱化的抗原疫苗等)，本发明的DNA-Bac疫苗具有生产和应用简单的优点。因为不需要传统净化的部分或全部过程，本发明的DNA-Bac疫苗能降低疫苗生产成本，因此在预防和治疗各种动物传染病更具成本效益。只作为一个没有限制性的实施方案证明，一种改造细菌细胞包含能表达猪传染病毒(如HCV)的重组质粒，并且不需要净化过程便能被用为疫苗。所述疫苗能引起体液和细胞介导免疫反应。在某些实施方案中，DNA疫苗(如DNA-Bac疫苗)的目标是粘膜感性位置。
本发明可培养一种含有一个或多个基因的细菌，所述细菌能在一个或多个市售的表达载体上表达一个或多个外源抗原，所述载体包括但不局限于质粒、粘端质粒、BAC、PAC和/或P1 DNA载体。本技术的一般从业人员使用的方法和材料可把载体从细菌分离出來，所述方法和材料包括但不局限于：试点规模质粒制剂、ultrapure 100 columns、contract CANmanufacture、大规模质粒制剂、EndoFree Plasmid Kits、QlAflter Plasmid Kits、QIAGEN PlasmidKits、大型BAC/PAC/PI/粘端质粒制剂、QIAGEN Large-Constmet Kit、高通量质粒迷你制剂、QIAwell Plasmid Kits以及類似材料。例如，含有表达载体的细菌能通过离心沉淀做成彈丸，并进行碱裂解和内毒素的去除、然后载体用以下方法净化，例如用市售的QIAGEN阴离子交换色谱仪器、以及用异丙醇沉淀制得超纯质粒DNA。这样的方法能从20公升的LB培养基(60克细菌彈丸)制造高达100mg的高复制质粒DNA。
DNA疫苗的一个例子使用beta-Gal作为汇报结构。DNA-Bac在体外和体内都具有活性。对抗猪霍乱病毒的DNA-Bac疫苗比裸DNA更能提高血清抗体反应和细胞毒性T淋巴反应。具体地，比较低量DNA-Bac、高量DNA-Bac、DNA疫苗以及市售弱化疫苗在对抗猪霍乱病毒的中和滴度時，低量和高量的DNA-Bac都证明有效。一种兔子发烧反应的测试也被用来比较低量DNA-Bac、高量DNA-Bac、DNA疫苗、市售疫苗及对照品的退烧能力，并证明出低量和高量的DNA-Bac组合物有效。
本发明的另一方面是一种新颖的动物传染病的DNA疫苗配方。在此透露的DNA疫苗组合物、其制造方法或服用方法的优點包括价低和多种服用方式。这对于发展中国家是十分有用的。例如，香港和中国的鸡和猪的疫苗市场是区域集中的，而因为大部分的动物传染病毒都受地理的局限，因此外国公司用外地种系制造的疫苗大部分时间不能提供全面的保护。
例如，由于HCV和PRRSV皆为殺伤力大的猪病毒，它们已经在全球造成严重的经济损失。HC已经在很多欧洲和亚洲国家中的商业养猪场造成重大的死亡率和病发率。整个北美洲和欧洲已认识PRRSV。为帮助猪只对抗所述两种疾病，每头猪需要接受两套疫苗接种程序。这些程序耗时和/或昂贵。为克服这些缺点并提供对疾病的最大保护，在此透露了另外的疫苗接种方法和组合物。
另外，本发明的疫苗可用來保护鸟类。例如，传染性法氏囊病(IBD)是对全球家禽业有重大经济影响的疾病。传染性法氏囊病病毒(IBDV)已经被证实是病原体，并且是能导致免疫抑制的禽淋巴细胞病毒。
因此，在本发明的某些方面，DNA-Bac疫苗能用在动物(包括但不局限于猪和鸡)中对抗疾病，包括但不局限于IBD、HC和/或PRRS。在某些实施方案中，本发明包含对抗PRRS的DNA疫苗，并用它在养猪业中保护猪只。
由于传送疫苗的方法和位置能影响免疫反应的性质(Feltquate，D.M.，等人，1997；J.lmmunol，158：2278.2284；Tones，C.A.T.，等人，1997，J Virol，158：4529-4532)，合适的步骤必须能传送疫苗給大型动物并且产生最大的保护反应。虽然肌肉注射在很多动物模型中很流行，但它可能會影响用作肉食的动物的肉质。另外，在相关组织中有针孔或疫苗残余物是不受欢迎的。传送质粒进入上皮细胞(皮肤或粘膜表面)被认为是传送质粒的最佳方法，因为这些组织的免疫能力，他们具有高度发达的免疫监测功能。再者，由于这些组织是大部分病原体的入侵地方，在这些地方做免疫接种來对抗疾病比较有效。
肌肉注射被认为能导致DNA或被DNA转染的细胞迅速离开被注射的肌肉，因此免疫刺激发生在远端组织，从而引致抗体的制造和细胞毒性T淋巴细胞的反应。
来自骨髓并提供抗原的细胞，很可能是树突细胞，且已被证实是DNA质粒表达抗原时所需的(Ulmer，J.B.，等人，1996，Immunol，89：59-67；Ulmer，J.B.，等人.，1996 Cur OpinImmunol，8：531-536)，但是提供抗原的细胞是否本身被DNA转染或從其他细胞提取抗原则仍然不清楚。
虽然肌肉含有相对少的树突细胞、巨噬细胞或淋巴细胞，但最近发现的IL-15以及其在骨骼细胞中的高表达水平(Grabstein，K.H.，等人，1994，Science，264：961-965)表示这些肌肉细胞未必如想像中那样缺乏免疫性。因此，肌肉亦适合为DNA疫苗的接种地方。
现时，DNA疫苗通过肌肉或皮下注射来接种，能引起全身的反应，但通常沒有粘膜免疫反应。同时，肠胃道的粘膜表面经常是各种疾病传送的地方。因此，粘膜免疫反应是对抗病毒传染的重要一环。在其他的实施方案中，本发明的DNA疫苗在想像中可口服(例如DNA-Bac疫苗)。
在此具体透露的DNA疫苗，包括但不局限于peDNA3.1-VP5-5.2和VP2-3.4，及pHCV2.5，能被分别使用在包括但不局限于IBDV HK45种系以及HCV Alford种系。这两种接种到肠胃道表面的疫苗疗效已被证实。
肠道相关淋巴组织(GALT)包括沿胃肠道的有组织的淋巴组织。它包括分离的淋巴滤泡、Peyer氏斑、阑尾、扁桃体、以及肠系膜淋巴结。另外，许多小淋巴滤泡充斥着粘膜。从口部至肛门，这些滤泡都被一种特定的称为M细胞的表面上皮细胞所覆盖。它们在外源抗原样本从管腔跨过上皮细胞传递至有组织的淋巴组织的过程中发挥重要作用。在粘膜表面有GALT的地方被想像是與本发明的疫苗接触的最佳地方，不論是服用疫苗時或之后。
在此透露的是病毒外壳蛋白被插进哺乳动物的表达载体pcDNA3.l中作为DNA疫苗。DNA疫苗pcDNA3.I-VP5-52和VP2-3.4，pHCV2.5以及pcDNA3.1-ORFS已被报告在肌肉注射服用后，能分别有效对抗IBD，HC和PRRS。由于肌肉注射会影响作为肉食的动物的肉质而不适宜用在牲畜上，因此需要测试所述三种DNA疫苗传送至肠胃道的粘膜表面上的疗效。
合併的DNA免疫已被报告能在虹鳟鱼中引起双重特定的保护性免疫和非特定免疫(Pierre等人，1998，Virol 249：297-306)。然而，发明人不知悉任何关于预防猪类疾病的合併DNA疫苗的报告。在此透露了有效对抗HCV、IBDV和/或PRRSV的单独或合併疫苗组合物及其传送方法。
使用pHCV2.5和pcDNA3.1-ORFS结构的DNA疫苗已经被证实能有效地保护猪只对抗HC和PRRS。然而，接种两种疫苗非常耗时和昂贵。在此透露了合併DNA疫苗对抗HC和PRRS的疗效。
在经过ELISA及Western blot的分析后，IBD和IHC DNA疫苗能在口服后有效地引发各自的病毒抗体。
合併的HC-PRRS DNA疫苗能同时有效地引发对抗HCV和PRRSV的特定抗体。所述抗体的反应在质量和强度上都和单独的免疫接种相似。
本发明提供了一种使用转基因乳酸菌(如乳酸乳球菌种系)来表达禽流感血凝素(HA)基因，并用作对抗H5NA病毒传染的口服疫苗的方法。在一个实施方案中，口服包含重组乳酸乳球菌NZ9700(HA)的微胶囊能引起显著的HA特定体液和粘膜免疫反应，最重要是预防H5N1病毒侵袭。
在一个实施方案中，所述方法包含易於人或动物服用的口服程序。在另一个实施方案中，所述方法能产生粘膜免疫反应。
本发明提供了一种促使免疫反应來对抗抗原的方法，所述方法包含动物或人服用表达所述抗原的转基因乳酸菌的步驟。乳酸菌的例子包括但不局限于：乳酸链球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、小球菌、短杆菌和丙酸杆菌。在一个实施方案中，乳酸菌属于美国专利5,580,787、6,333,188和7,553,956所述的乳酸属。在一个实施方案中，乳酸菌为乳酸乳球菌。
本发明的转基因乳酸菌能在受試者服用后引起免疫反应。由本发明的细菌引起的免疫反应包括但不局限于：体液免疫反应和粘膜免疫反应。例如，本发明的细菌能引起全身的IgG反应和粘膜IgA反应。
在一个实施方案中，本发明的转基因乳酸菌能引起保护性免疫反应，例如，能保护免疫後的受試者对抗病原体(如病毒或细菌)的致命侵袭。
一般來說，本发明的乳酸菌能被基因改造來表达一个或多个抗原。在一个实施方案中，所述抗原是异源的。异源抗原的例子包括但不局限于：细菌、原生动物、真菌和病毒抗原。异源抗原的来源包括但不局限于，如美国专利6,551,830、7,432,354和7,339,461所述的流感病毒、幽门螺旋杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、呼吸道冠状病毒等。
在一个实施方案中，如禽流感病毒H5N1的血凝素的病毒抗原能在转基因的乳酸菌中被表达。
本技术领域的一般从业人员能测定本发明的转基因乳酸菌的服用剂量和方法。本发明的疫苗能以口服配方形式來服用，例如，配方可以是溶液或悬浮液、或适合在服用前溶解或悬浮在液体中的固体。藥物能被乳化，或配料能和赋形剂混合，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、钠糖精、纤维素、碳酸镁及类似物质。这些组合物能制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、滴鼻剂或粉末。
本发明的疫苗亦能以注射形式使用。合适的赋形剂包括，例如盐水或缓冲的盐水(pH约7至8)，或其他生理等渗液，所述等渗液可能亦含有葡萄糖，甘油或类似物質和它們的组合。然而，应避免使用能破壤或溶解脂膜的物质，例如强力洗涤剂，酒精或其他有机溶剂。另外，若有需要，疫苗可含有少量辅助物质来提高疫苗效用，如本领域熟知的润湿或乳化剂、pH缓冲剂、和/或佐剂。
一般來說，本发明的疫苗能以口服、皮下注射、皮内注射或肌肉注射方式服用，剂量能有效地导致所需的免疫反应。疫苗服用的方式符合剂量配方，且剂量具有预防和/或治疗的疗效。剂量取决于受试者、受試者产生所需的免疫反应的能力、以及所需的保护程度。本技术领域的一般从业人员能根据受试者和所用的抗原来测定准确的疫苗剂量。
在一个实施方案中，受試者可用多种方式服用本发明的转基因乳酸菌，例如美国专利7,541,044和7,476,686所述的口服、鼻腔给药、肌肉注射、皮下注射、以及阴道应用。
本发明的转基因乳酸菌能制造成多种配方，例如，封装在酸性不稳定的微胶囊中、肠溶微胶囊和胶囊、聚合水凝胶或粘合聚合物。
本发明亦提供了表达异源抗原的转基因乳酸菌。上面已描述乳酸菌和异源抗原的例子。在一个实施方案中，这些乳酸菌能被用作口服疫苗。
本发明亦提供了一种包含在此描述的转基因乳酸菌的组合物。在一个实施方案中，所述组合物更包含可药用的载体。
本发明亦提供了应用在此描述的转基因乳酸菌为药物，令受试者产生免疫反应。
本发明的另一方面，把一个或多个病原体基因置入植物和转基因植物中，并促使植物制造编码的抗原(如蛋白质)。
在一个优选的方面，植物是可食用的(如马铃薯植物)，疫苗随著食物被吞下。可食用的疫苗具有价格低廉的优点(例如，以植物为基础的疫苗比以细菌为基础的疫苗便宜，其生产方法比其他涉及净化过程的疫苗生产方法便宜)，而且容易服用(例如植物疫苗可加入动物饲料中)，没有注射带来的風险，也可消除或减少被动物病原体混杂的风险。
常用的有四种用来制造转基因植物的基因表达改造系统，所述植物能作为对抗特定抗原的口服疫苗中的一种活性剂。本发明利用所述四种系统来制造可食用疫苗。所列举的并不是所有可行的方法，而只是幫助了解本发明的范围和指引。
首先，转基因植物中包括CaMV 35S启动子和编码抗原的序列的表达载体能用来改造所述植物，叶片中的表达使基因表达和基因产物的生化鉴定被迅速分析。
在例如但不局限于Brassiea油菜(油菜籽)的植物中，包括2S白蛋白启动子和编码抗原的序列的表达载体能用来引发种子特定基因的表达，从而使常用作动物饲料的种子组织制造重组蛋白，并提供口服免疫原的分析。
在例如但不局限于马铃薯(土豆)的植物中，包括patatin启动子或大豆vspB启动子以及编码抗原的序列的表达载体能用来引发块茎特定的基因表达，从而使块茎组织而非其他组织制造重组蛋白，块茎组织常用作食物，并提供了口服免疫原的分析。
最后，在例如但不局限于Musa acuminala(香蕉)的植物中，包括果实成熟启动子以及编码抗原的序列的表达载体能用来改造可在成熟果实中生产重组蛋白的植物，所述重组蛋白能直接作为候选疫苗來研究动物和人对其的攝取。
植物中制造的重组蛋白能否保留其特性，特別是配体结合和抗原表位的呈献，是在转基因植物成功制造可食用疫苗的重要因素。生物活性是评估蛋白的药理价值的最终考验。用疫苗來研究蛋白表达特別令人感兴趣，因為疫苗在动物模型中的效果能被准确地量化。另外，由于疫苗的效果被免疫系统扩大，它的剂量需求不高。
以非限制性的例子在此透露了在转基因植物中表达HCV抗原的组合物和方法，所述植物能用作可食用疫苗來对抗猪霍乱病毒。用作示范本发明的一方面，本地的病原体种系(如HCV)被分离和鉴定。本发明的一方面用E2区域来设计架构(如pHCV I.25和pHCV2.5)。在所透露发明的一个方面，HCV密码子在转基因植物中的运用被改变。在想像中，改变密码子的运用可同样增强植物表达一个或多个病原体的一个或多个免疫原。
在某方面，在此透露的疫苗可单独使用或与一种或多种药理或治疗物品合并使用。在某些方面，所述物品可包含生物药物，包括但不局限于一种或多种细胞因子，所述因子包括但不局限于一种或多种干扰素、白介素、刺激繁殖因子、和/或肿瘤坏死因子；一种或多种反義核酸组成物和相似物质；一种或多种细胞因子；一种或多种基因治疗剂或方法；一种或多种单克隆抗体；一种或多种凝血因子；一种或多种其他疫苗或疫苗相关的组合物或服用方法；和/或一种或多种激素。
A.DNA疫苗的制造和生产
在此描述的制造和生产DNA IBD及HC疫苗的策略策略仅是本发明一方面的例子。然而，本发明并没有局限于在此描述的架构。本领域的一般从业人员了解到其他架构以及其他来自不同病原体的基因也能通过在此描述的技术来表达从而制造DNA疫苗。在某些优选的方面，DNA的架构能在微生物(如细菌)中表达。在某些方面，DNA/细菌疫苗(“DNA-Bac”)是部分净化的。如在此所述，“部分净化”意为从DNA的架构和/或表达的免疫原移除大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的细菌物质。在其它方面，DNA疫苗是口服的、或在粘膜上施用，或两者合用。然而，DNA和/或细菌疫苗能通过本技术的一般从业人员已知的技术来施用，DNA和/或细菌疫苗更可想像与一种或多种免疫或药理物品(例如佐剂)共同施用。
1.设计DNA架构
在IBD疫苗中，CMV启动子控制VP5-5.2和VP2-3.4被复制入pcDNA(+)载体中。
在HC疫苗中，能编码病毒结构醣蛋白的三个连串基因(E0、El和E2)被复制入带有CMV启动子的pcDNA3,1表达载体中。由于嵌入物的大小约为2.5kb，重组质粒被名为pHCV2.5。在PRRS疫苗中，PRRSV的ORFS能编码主要的外壳蛋白GP5，所述ORFS被复制入带有CMV启动子的peDNA3.1表达载体中。该载体被特别设计來表达真核细胞。这三种架构已被制造并鉴定。
2.大肠杆菌细胞的改造
501解冻的大肠杆菌和5 1质粒DNA被置入已在冰上冷却5分钟的试管中。然后把试管放进已定在1.8kV的细菌电穿孔机中(Bio Rad大肠杆菌脉冲改造仪器)。在试管进行脉冲后，立即加入1ml的SOC培养液(Gibco BRL)。在摄氏37度培养1小时后，100 l的改造细胞被铺在含有氨苄青霉素的LB琼脂板上，從而通宵培养。
3.大规模提取注射用的质粒
在LB琼脂板上选取一个改造群，然后放进2ml的含氨苄青霉素的LB中。让其在震动和摄氏37度下生长。把1.5ml的培养液加入1.5L含氨苄青霉素的LB中，并让其在震动和摄氏37度下生长。然后细胞用8000X g(Beckman JA-14 Rotor)轉動10分钟沉淀下來，去除上清液。然后将细胞再次悬浮在75ml的P1溶液中(50mM葡萄糖，25mM Tris，pH8，10mM EDTA)。加入102.5ml的P2溶液(0.2M氢氧化钠，1％十二烷基硫酸钠)后在室温下放置5分钟。然后加入150ml的P3溶液(5M醋酸钾溶液，pH4.8)。混合物放置在冰上30分钟后，用离心机(Beckman JA-14Rotor)以8000rpm的速度轉动10分钟。然后在上清液中加入375ml的异丙醇，并通宵放在摄氏4度下。然后用离心机(Beckman JA-14Rotor)以12000rpm的速度轉动10分钟。将彈丸悬浮于112.5ml含有核糖核酸酶A的水中。加入7.5ml P3溶液和112.5ml 100％乙醇，并放置在摄氏-20度下1小时。彈丸用离心机(Beckman JA-14Rotor)以12000rpm的速度轉动10分钟后，用150ml 70％的乙醇清洗。然后再用离心机(Beckman JA-14Rotor)以12000rpm的速度轉动10分钟。将所取得的彈丸悬浮于2ml的1X PBS中并使用荧光测量仪量度浓度。
大规模培养喂饲用的细菌
在琼脂板上的一个含有所需质粒的改造细胞群用2ml含有氨苄青霉素的LB接种。细胞在震动和摄氏37度下生长。然后将1.5ml的培养液加入1.5L含有氨苄青霉素的LB，让它通宵震动並在摄氏37度下生长。
细胞以8000X g(Beckman JA-14Rotor)的速度转动10分钟後沉淀下來，并去除上清液。大肠杆菌细胞在摄氏37度下通宵烘干，然后悬浮于1X PBS中。用超声波(Branson Sonifer 250)处理10分钟后加入1％v/v抗体(青霉素-链霉素，GIBCO BRC)。
植物疫苗的制造和生产
能表达HCV结构性基因的转基因A.thalianaii，其制造和生产的描述只是示范本发明的一方面。
然而，本发明并不局限于某种植物种類和病原体基因。如本领域一般的从业人员所了解，其它植物和各种病原体的基因也能根据在此描述的方法来制造以植物为基础的疫苗，尤其是可食用的植物疫苗。在某些方面，在植物中表达的免疫原是“部分净化”的。用在此处，“部分净化”意思为从DNA的架构和/或表达的免疫原移除大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的植物物质。在其它方面，疫苗是口服的、或在粘膜上施用，或两者合用。然而，植物疫苗或可食用疫苗能通过本技术的一般从业人员已知的技術来施用，植物或可食用疫苗更可想像與一种或多种免疫或药理物品(例如佐剂)共同施用。
1.策略
为了製造和生产能表达HCV结构基因的转基因拟南芥，用BarHI和Sstl來化解质粒pBI 121，并收拾载体的片斷。亦用BamHI和Xbal來化解pHCV2.5/pHCV1.25从而放出HCV2.5和HCVI.25片斷，用以嵌入被BamHI和XbaI化解的pBS质粒中。这个架构用BatnHl和Sstl化解。用重组PCR改变pHCV2.5密码子的運用，把改变過的HCV I.25 TA複製入pBS。用BamHI和Sstl化解并收拾片斷。
以上收拾的片斷以及由BamHI和Sstl化解后放出的HCV2.5/HCV 1.25经过若干连接反應后制造出pBI 121-HCV2.5、pBI 121-HCV 1.25和pBI 121-M 1,25载体。这些载体經過电击置入农杆菌中。然后拟南芥用floral dip改造，并接受抗卡那霉素的筛选。HCV转基因植物的制成由PCR、Southern hybridization和Northern hybridization来证实。Western hybridization和ELISA用來测定表达水平高的植物。最后，动物以口服接种转基因植物的材料。這些方法的额外细节如下述。
2.植物材料
拟南芥的种子购自LEHLE Company，P.O.Box 2366 Round Rock，TX 78680-2366USA。Columbia(Col-0)是野生型的拟南芥。该植物在摄氏22-25度和亮光不斷的温室或控制室中生长，植物的照顧根据标准程序(Jose M等人1998)。简言之包括2天的冷凍处理(摄氏2-4度)从而终止种子的休眠，把发芽的种子种植在有尼龙窗帘覆盖的9厘米寬的盘中，並經常用水和营养液灌溉。植物在3-4周后开花并適宜进行floral dip的转基因。种子在二级floral dip的3-4周后收获。
3.农杆菌
本计划使用农杆菌种系LBA4404(Ooms等人，Plant Mot Biol.1，265-276，1982)或BHA 105(Hood等人，Tansgenic Research.2，208-218，1993)。细菌具有二元质粒pBI12l，质粒具有不同DNA片斷，HCV2.5kb，HCVI.25kb和修改后的HCV1.25kb，它們编码成病毒结构醣蛋白，细菌接种在4ml带有卡那霉素和利福平的LB中。试管在摄氏25-28度下以250rpm的速度震动36-48小时。将小规模的培养液加进2L的瓶中，瓶中有500mL的相同培养液。大规模的培养液如小规模的培养液一样震动约16小时。细胞在室温下以6,000g的速度转动20分钟分离出來，使用前，将细胞悬浮在floral dip溶液中，直至OD600约为0.8。
4.转基因和筛选
用于植物转基因研究的方法是floral dip(Steven J等人，1998)。它简略地包括以下步骤(见实施例1)。在转基因前的3-5天，剪下主花，从而取得更多第二级的开花。每8-10盘植物使用大约从1L培养基中提取的500ml带有农杆菌的floral dip溶液。植物被黑色塑料袋覆盖并通宵放置在黑暗环境中。15-24小时后，植物被放回到温室中或控制室中。在下一周植物再次进行浸泡。在经过20-30ug卡那霉素/ml筛选后，收获种子。在筛选后的10-15天后，从筛选培养液中取出带有4-6块成年绿叶的植物(T1)以及在筛选培养液中已生长完整的根，并种植在湿润的泥土中。T2种子的收获是独立于T1种子的，T2种子的筛选也是使用相同的卡那霉素培养液。假转基因植物的复制(筛选中漏网的植物)并不能抵抗向植物中施加的卡那霉素。然而，真实的转基因T1，能够将卡那霉素抵抗基因遗传到大部分的T2苗中(比例为3/4)并成功成为转基因食物。
5.转基因植物的确认
从植物叶子中取下一小块根据以下程序制作用作PCR的DNA样本，并成功应用在油菜上。在液氮中用试管冷冻保留小块叶片(约50mg)。在加入50L的提取缓冲液后(100mM氯化钠，50mM Tris盐酸，pH值为8.0，1％PVP，0.5％SDS，5mM EDTA)，把试管放在火中煮5分钟。然后取出试管并放置上冰上。把试管放在离心机中以最高速度离心5分钟并取出上清液用作PCR。使用25L的PCR反应组合，并通过PCR检查转基因植物，其中需要使用2L的制备DNA。引物对位于HCV2.5kb、HCV1.25kb和修改后的1.25kb(M1.25)的不同位置上，并被用作确认在转基因植物中HCV基因的存在，使用染色体组DNA以及从不同转基因T2植物中取得的完整RNA来进行Southern和Norther hybridization，然后用二级筛选和PCR反应来确认。使用探针来标签32P-dATP并根据分子克隆的程序来结合DNA和RNA膜(Fritsch.，Maniatis andSambrook.，1989.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(Second Edition.pp18.47-18.75)。
6.用作转基因的重组质粒的建造
二元质粒pBI121(Clontech Company)被BmnHI和Sstl切断并且从琼脂糖凝胶中恢复载体片断。三种病毒DNA片断：HCV 2.5kb、HCV 1.25kb和修改后的HCV 1.25kb，能分别编码成HCV结构醣蛋白E(ms)/E1/E2，E2和修改后的E2，并被相同的内切酶切断，然后嵌进载体上。通过电击把重组质粒转化到农杆菌上。嵌入了HCV基因的转化物被使用在植物转基因中。
7.HCV2.5和HCV1.25的建造
HCV 2.5kb片断被嵌入进pcDNA 3.1中，命名为pHCV2.5，作为DNA疫苗在哺乳类动物细胞中表达。该2.5kb DNA片断覆盖1118至3701的单链RNA，所述RNA能编码成病毒外壳蛋白质E2以及另外两种结构醣蛋白Ems和E1。一个由HCV-12.5kb单链RNA编码的大型ORF被翻译为一个约有3900个氨基酸的大型聚合蛋白质，在病毒的聚合中，所述蛋白质被分裂成为个别的蛋白质。由于E2、Ems和E1都位于聚合蛋白的中间，人工制造的起始和终结密码子被连接在一起从而达到它们在植物中的正确表达。所述建造(见以上所述的策略)大致包括以下步骤：
(1)使用BamHI和XbaI切断pHCV2,5质粒DNA，并恢复2.5kb的片断，所述片断被加入至人工制造的起始和终止密码子的任意一端。
(2)将2.5kb DNA片断嵌入进pBluescript SK的相同内切酶位置中，从而获得合适的酶切位置并把它克隆进植物转基因载体pBIl21上。
(3)使用BanrHl和SsII切断pBluescript-HCV2.5，并恢复2.5kb的片断，然后将它嵌进具有相同酶切部位的植物表达载体pBI121中。
(4)在PCR、Southern hybridization和部分排序确认后，把pBI121-HCV2.5转化入农杆菌LBA4404和EHA105中。
使用相同的步骤来建造植物表达载体pBI121-HCV I.25。唯一的差别是编码E2病毒外壳蛋白质的HCV 1.25kb片断是从其它DNA疫苗的克隆pI-ICV1.25中取得，并且pBI121-HCV1.25由PCR通过pBIl21HCV2.5、pBI121 HCV1.25和pB1121 1.25、LA4404和EHA10S的PCR产物、LBA4404和EHA105中的pB1121 HCV1.25、以及LBA4404和EHA105pB1 121 M1.25的放大确认。额外的确认可通过独立的酶切进行，所述酶切为BamHI、Ssil+BamHI及Pstl的p81121 HCV2.5和pBI12I。另外，使用EcoRI+BamHI和PstI pBS来切断HCV2.5。使用HCV2.5探针来进行pBI121HCV1.25的Southern分析，也同样能被使用来进行确认和DNA排序(分别对HCV2.5和HCV 1.25的排序SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。
8.修改HCV1.25的建造
HCV 1.25kb片断的修改是通过级联重组PCR技术的方法来进行。一个设计了10个引物，其中7个是修改后的引物，另外3个位适应性引物。因此，导致改变了34个密码子，占HCV 1.25中合共424个密码子的8.02％l。修改包括两个步骤。通过PCR和被修改序列的引物，6个互相重叠的小片断被修改。然后将这些修改后的小片断通过若干次的重组PCR合并在一起。然后将修改后的小片断克隆病进行排序从而确认它们的修改。SEQ ID NO：S SEQ ID NO：53展示出未修改的HCV1.25序列，并且SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：54展示出修改后的HCV1.25序列，名为M1.25。M1.25拥有一个人工制造的起始ATG和终止TAG密码子，所述密码子都被引进到原HCV1.25序列的两端。
在修改后，M1.25密码子的使用和在植物中的使用相似，然而，与原病毒序列相比，氨基酸序列并没有改变。表1显示了修改前和修改后的HCV 1.25频率，以及与拟南芥的比较。
表1
Figure BDA0000142533540000451
Figure BDA0000142533540000461
植物转基因
在使用floral dip进行转基因时，共有10组植物参与。大概80棵转基因植物能在筛选培养液中表现出能抵抗卡那酶素，并从而被移植至土壤中，并且其他T1和T2植物也在卡那酶素培养液中被筛选。通过PCR，能确认一些T1植物(生长至足够大)具有HCV基因。表2总结了所有数据。
表2
Figure BDA0000142533540000462
a-2-5＝pBI121 HCV2.50 105＝EHA105
b-1.25＝pBI121 HCV1.25，4404＝LVA4404
*在T2筛选中卡那酶素的错误浓度或真菌污染导致失去可行的转基因种子和植物。
**此组植物在第一次转化中进行了过长的floral dip，并导致严重地伤害植物。在二级floral dip中，不幸地，在糖的浓度出现误差，从而导致植物在二级floral dip后死亡。
从表2可得，大部分的转基因植物都通过JHA10S株来转化，并且制以后1棵植物使用LBA4404来转化。LBA4404的转化频率为约1/175000，或为1/80000，如果卡那酶素的浓度过高，使用30g/mL卡那酶素筛选的幼苗并不能生长、甚至不能转化到具有卡那酶素抵抗基因NPT11。然而，EHA10S株能提供转化频率的平均值为0.02％，与其他的报告相似。虽然看起来频率很低，但由于在一个转基因试验中可得到约4克的种子并从而代表大概40棵转基因植物，因此所述频率仍然可被接受。
10.使用PCR来确认转基因植物
能抵抗卡那酶素的植物从筛选皿中移开并种植在泥土中。当植物在控制室中生长出8-10块叶时，从每株植物中取出一小块叶子并提取它们的DNA。然后使用不同的引物对来检查HCV2.5转基因植物中是否存在HCV基因。
根据引物ZW3和ZW5(分别为SEQ ID NOS：7和8)的预测，PCR产物的大小始终能正确地改变，所述引物被特别地设计成能基于拟南芥克隆T13M11(GenBank提取号AC005882)放大拟南芥中的BAN基因。预计的PCR产物为dihydroflavol4-还原酶基因的一部分，并且为拟南芥中的一个单独基因，并且所述引物正确地制造出一个780碱基对(bp)的放大产物。然而，在SEQ ID NOS：9和10中，HCV2.5特定引物正确制造了一个321bp的放大产物；通过引物F01/1106(SEQ ID NOS：11和12)来放大三种HCV2.5染色体基因和三种HCV1.25转基因植物，并从而制造出2.5kb的片断，所述片断包括编码E0、E1和E3肽的序列，以及能分别制造完整的HCV2.5和HCV1.25的F02/HQ6，(SEQ ID NOS：13和11)；使用两对对应M1.25不同部位的引物来确认M1.25和HCV1.25转基因植物，所述引物一般被用来取人M1.25转基因植物和非转基因植物对照组，并且使用引物放大的DNA模板能制造出1kb的片断，并证明使用此处披露的方法制备的DNA能适合使用于PCR，并从而确认在植物基因组中含有病毒基因。特定的引物被用来修改包括SEQ ID NOS：14-16的E2基因。特定的放大产物包括一个SEQ ID NOS：9的354bp产物和15(一种SEQ ID NOS：14的644bp产物)以及16，和一个SEQ ID NOS 1060bp产物(14和12)。几乎所有能抵抗卡那酶素的植物都能显示PCR阳性的结果。
本发明提供了一种对宿主中的抗原引导免疫反应的组合物，所述组合物含有一个能表达抗原的转基因细菌或植物。在一种实施方案中，细菌能被配方进微胶囊中。本领域的一般从业人员能随时将细菌配方进微胶囊中。此处描述了微胶囊的一个例子。在一种实施方案，细菌和一个能表达抗原的DNA复合在一起。在一种实施方案中，所述细菌属于乳酸菌。
在另一种实施方案中，本发明的组合物含有一种植物，或植物整体、植物部分或植物提取物，所述植物是可食用的植物。例如，所述植物是拟南芥。
在一种实施方案中，由转基因细菌或植物所表达的抗原是细菌抗原或病毒抗原。例如，抗原是禽流感病毒H5N1的血凝素抗原。在另一种实施方案中，抗原能和粘膜细胞膜表面的糖化分子相结合。然而在另一种实施方案中，抗原是嵌入蛋白质。
本发明亦提供了一种在宿主中引起免疫反应的方法，所述方法含有宿主服用此处描述的组合物。在一种实施方案中，免疫反应是体液免疫反应、粘膜免疫反应或保护性免疫反应。在另一种实施方案中，所述组合物是口服的。
本发明亦提供了一种此处描述的组合物u，所述组合物被用作药物引起宿主中的免疫反应。
本发明亦提供了一种此处描述的组合物的应用，所述应用为制备在宿主中引起免疫反应的药物。
通过以下所列出的实验细节，本发明能被更好地理解，但本领域的一般从业人员能随时理解这些特定的实验细节只是示范例子，而且并不是用来限制此处描述的发明，此处描述的发明则由随后的权利要求所限定。
纵观本发明申请，引述了多份参考文献。对这些参考文献的披露并且其内容在此引入作为参考是为了更全面地描述本发明的技术领域。
值得注意的是，过渡词“包含”与“包括”、“含有”或“以……为特点”同意，是范围广阔或自由的，并且在此处食用并不是排除额外的、未引用的元素或步骤。
实施例1
材料和方法
在本发明中，制造了一个重组乳酸乳球菌载体，所述载体能表达禽流感病毒H5N1的血凝素(HA)。将载体封存于海藻酸钠微胶囊或肠溶性胶囊中，从而保护它们免受酸的破坏并维持较长时间的抗原表达。所述载体能通过口服方式在小鼠体内引起预防H5N1病毒的免疫反应。
质粒的建造和改造
通过聚合酶链式反应(PCR)，放大来自pGEM-HA(中国武汉的Ze Chen教授提供)的含有HA基因的1704bp片断，所述反应使用以下的引物对(下划线为NaeI或HindIII部位)：5′-tctgccggcgagaaaatagtgcttctt-3′，5′-cccaagctttaaatgcaaattctgcattgtaacg-3′。然后確定PCR产物的序列。得出的NaeI/HindIII片断被克隆到不同的载体上，包括L.lactis-pHA(在细胞质中表达HA蛋白质)、L.lactis-pSHA(分泌的HA蛋白)、以及L.lactis-pgsA-HA(HA蛋白在细胞壁表面顯示)。
在摄氏30度下于含有0.5％(W/V)葡萄糖的M17培养基中通宵培养乳酸乳球菌。通过电击(使用Gene Pulser，Bio-Rad，25uF，1000V，0.1-cm电极试管，Bio-Rad)将pNZ8110-HA载体传送至乳酸乳球菌NZ9700内(购自NIZO(荷兰))。选出能表达最高HA的乳酸乳球菌克隆产物。作为反方对照物，乳酸乳球菌NZ9700使用了空的载体pNZ8110并从而制造出NZ9700(pNZ8110)。从乳酸乳球菌NZ9700中分离出质粒DNA来并用作PCR侦测或对目标基因进行排序之用。
表达HA抗原
为确认HA基因的表达，乳酸乳球菌被放置在含有10μg/ml氯霉素的GM17中并在摄氏30度的环境下进行通宵培养。然后将培养液放置在离心机中以5000×g的速度在摄氏4度下离心8分钟。然后使用磷酸盐缓冲液[PBS]清洗沉淀物两次，然后将细菌悬浮于等量的2X十二烷基硫酸钠(SDS)(125mM Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethane]-HCl，pH值为6.8，4％ SDS，20％甘油，0.01％溴酚蓝，以及10％β-巯基乙醇)。在煮沸10分钟后，将细胞溶解产物放在4％浓度凝胶和独立的10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。把另一块凝胶转移至硝酸纤维素膜上。然后使用老鼠抗HA抗体，和亲和净化后的山葵过氧化酶(HRP)羊抗鼠IgG来侦测蛋白质。使用ECL Western Blotting侦测系统在X-膜上拍得膜的放射照片。NZ9700(pNZ8110)被用作对照物。
藻酸盐微胶囊的制备
将浓缩藻酸钠溶液加入至乳酸乳球菌培养基中，并混匀。然后混入含有0.2％Tween-80的黄豆油，并同时以540rpm的速度均匀搅拌10分钟，从而得出乳液。然后将氯化钙溶液(1％w/v)逐渐注入乳液中，直至乳液沉淀。然后将悬浮液进行3000g的离心过滤从而取得微胶囊。将沉淀物再次悬浮于溶液中，用去离子水清洗，最后进行低压冻干。
肠溶性胶囊的制备
将右旋糖苷与乳酸乳球菌培养基混合并进行低压冻干。将低压冻干后的粉末装入肠溶性外衣所包的胶囊中。
小鼠的口服免疫接种
从SLC，Inc.(中国上海)购入8周大的BALB/c雌性小鼠，并放置于上海交通大学药学院动物中心中。小鼠被放置在没有病原体的环境中，并且能在实验过程中自由进食和喝水。
经过通宵禁食后，以10只为一组的小鼠通过使用口服zonde探针食用了200μl1010 CFU(colony-formation units)的乳酸乳球菌。小鼠在第0-3、7-10和21-24天接受免疫接种，并在第34天提取血清。
抗体滴定分析
在接受最后免疫接种两周后，采集小鼠血清和粪便样本(通过眼窝穿刺来采集)。血清存放于摄氏零下20度中。将粪便粒(100mg)悬浮于0.5mL无菌PBS中。在12000x g的速度离心处理5分钟后，采集悬浮物并通过ELISA来测试IgG或IgA。
酶联免疫吸附测试(ELISA)已在参考文献[21]有所描述。概括地说，将小鼠抗HA抗体覆盖在96孔的微滴定板上，并通宵存放于摄氏4度的环境中。随后将PBS-1％的牛血清蛋白(BSA)堵塞这些小孔并放置在室温中2小时。然后加入已被连续稀释的血清或粪便悬浮液(100μl)，并放置在摄氏37度的环境中1小时。接着使用HRP结合的山羊抗鼠IgG或HRP结合的山羊抗鼠IgA来检测结合的抗体。ELISA的终点滴定乃是能产生较同样稀释的反面对照样本所产生的OD450nm光密度高出两倍的最高稀释。
血凝抑制测试
在进行测试前，用宿主破坏酶(Receptor Destorying Enzyme)对血清的凝集反应非特定性抑制体进行减活。概括地说，三个单位的RDE被加入进一个单位的血清中，并通宵放在摄氏37度的环境中。然后将样本放置于摄氏56度中30分钟从而被热减活。在减活后，将PBS加入到样本中，并进行最终的1∶10血清稀释。在被测试前，被稀释了的样本可存放于摄氏4度中(最多6天)或摄氏零下20度中。
使用PBS调整鸡红血球细胞(CRBC)并从而获得1％(v/v)的悬浮液，并放置在摄氏4度中，直到制备前的一个星期。使用V形底微滴定板将小鼠血清样本连续稀释2倍。将等量的H5亚型标准抗原，约为8HAU/50μl，加入到滴定板的孔中。然后遮盖滴定板并放置在室温下30分钟，接着加入1％的CRBC。将混合了抗原、遮盖物和CRBC的滴定板放于室温下30分钟进行稳定。然后对含有非凝集CRBC的最后一行进行相互稀释从而测定HAI的滴定量。正和负的雪貂血清对照组都被加入到每一块板上。HA滴定值为23或更高的则被定义为阳性。
H5N1病毒的侵染
所有实验都使用8周大的BALB/c雌性小鼠。在病毒侵染中使用的是甲型流感病毒(A/chicken/Henan/12/2004(H5N1))。50％小鼠感染劑量的滴定度(MID50)，与50％致命劑量(LD50)的滴定度皆如参考文献[22]所述。为评估预防致命侵染的保护力度，已接种疫苗的小鼠通过鼻腔(i.n.)感染10LD50的甲型流感病毒(A/chicken/Henan/12/2004(H5N1))(致命劑量)。然后每组取出6只小鼠每日检查，看可否生存21天。
所有数值都被表达为标准误差(SE)。使用学生的t检验或方差分析(ANOVA)从而得出实验和对照组的统计分析数据。P值小于0.5的被定义为有统计意义。使用Fisher精确检验计算生存的概率，从而比较对照组和被重组乳酸乳球菌免疫接种的小鼠的存活率。
结果
重组乳酸乳球菌NZ9700(HA)的制造
将禽流感HA基因克隆到pNZ8110(图1A)并改造到乳酸乳球菌株NZ9700中。制造三种载体，包括乳酸乳球菌-pHA(在细胞质中表达HA蛋白)、乳酸乳球菌-pSHA(HA蛋白被分泌)、以及乳酸乳球菌-pgsA-HA(HA蛋白质表达在细胞壁表面)。图1B和图1C分别为表达载体的电泳分析和在克隆物中HA序列的PCR检测。在经过PCR放大后，HA基因的完整序列(1704bp)被排序并被证明成功复制。
由NZ9700(HA)表达HA蛋白。
为评估NZ9700(HA)细菌是否能制造编码蛋白，图2所示为使用SDS-PAGE和Western blotting的分析。HA蛋白(66.2kDa)由SDS-PAGE在乳酸乳球菌-pHA溶解物中测得，而非NZ9700(pNZ8110)的溶解物(图2A)。培养基的悬浮物亦被Western blot所分析，并且HA的条纹清晰可见(图2B)，意味着由于存在分泌信号Usp45，HA蛋白能在乳酸乳球菌外表达和分泌。
用作口服的微胶囊
使用藻酸盐微胶囊来封装NZ9700(HA)，从而方便口服并保护活性载体免受胃部的酸性环境破坏。图3A展示出含有乳酸乳球菌的藻酸盐胶囊的显微照片。该胶囊的大小大概为15um。图3C展示出微胶囊能保护乳酸乳球菌免受酸性环境破坏。
在小鼠中由口服疫苗NZ9700(HA)引起的免疫反应
在为期8周的时间中，给BALB/c小鼠(SPF等级)口服给药5次或9次乳酸乳球菌(1010 colony-formation units，CFUs)。然后在最终接种后进行为期5周的针对HA特定血清IgG和粪便IgA抗体制造的免疫效果检验。一共调查了两种接种计划(图4)。在接受了乳酸乳球菌-pHA接种的两个组别中都检测到IgG和IgA反应，然而接受NZ9700(pNZ8110)的组别则没有任何HA特定抗体(图4)。
如图4所示，在经过4周每周2次的口服后，血清IgG的滴定量显著提高，并在其后至少数月内维持高水平。增加口服给药的次数和频率能产生IgG在接种计划2中更快地被制造，但最终的滴定量仍然是和接种计划1相似的。血清IgG的最大稀释度为29.4(接种计划1)。
在启动免疫接种后的第10周检验粪便IgA抗体。两个乳酸乳球菌给药的计划都产生了HA特定粘膜IgA，然而使用NZ9700(pNZ8110)(图6)给药则没有产生任何HA特定粘膜IgA。有趣的是，计划1中的给药相比计划2似乎更能有效地促使IgA的产生(图4)。
血凝抑制(HAI)的检验
在口服接种后，使用传统的血凝抑制(HAI)检验来测试产生的IgG抗体的HA中和能力。在计划1中，在首次给药10周后取出小鼠的血清进行测试，测试数据已列于表1中。与NZ9700(pNZ8110)组的背景水平(＜23)相比，在NZ9700(HA)治疗组中，HI滴定量的几何平均数为27。
对致命H5N1病毒侵染的保护
为测试NZ9700(HA)能否抵抗H5N1病毒的侵染，在经过5周每周2次的口服给药后，我们在第10周进行了致命病毒侵染的实验。结果表明，在受到致命剂量(10 LD50)的H5N1病毒侵染后，接受NZ9700(HA)接种的小鼠能被完全(6/6)保护，存活率为100％。然而，对照组[接受NZ9700(pNZ8110)治疗]在7天内全部死亡(图7)。
表1
接种小鼠血清对H5亚型标准抗原的血凝抑制滴定
Figure BDA0000142533540000531
GMT：几何平均滴定量。a23的HI滴定量被记录为阳性。
实施例2
使用Floral-Dip的拟南芥农杆菌介导转化
A.植物培养
1.当大部分植物都形成了初期的花托时，剪下主要的花序。
(大约在把发芽的种子种植在土壤中3-4周后)
2.当大部分的次级花序长到1-10cm高时，将植物浸于农杆菌溶液中(剪辑后的2-4天)。
3.用黑色塑胶覆盖浸入农杆菌溶液的植物，从而维持湿度，并通宵放置于弱光或黑暗环境中。
4.在接种后，移除覆盖物并将植物放回到种植皿中12至24小时。
5.如有需要，可在6-7天后将花序再次浸入农杆菌溶液中。在每次应用之间，可将花序在6天内3次浸入到农杆菌溶液中。
6.让植物生长3-5周，直至角果呈现干燥和褐色。
7.隔着干净的绵纸用手指轻拉的方法收获种子。
8.将种子存放于离心管中并放置于干燥的4摄氏度环境中。
B.农杆菌培养
1.将农杆菌(LAB4404或EHA105)放置在LB(30g Kan+50g Rif/mL)中接种，并且通宵在25-28摄氏度下以250rpm的速度摇匀。
2.将通宵的培养物转移到另一个装着LB(30g Kan+50mg Rif/mL)的烧瓶中，并继续放置在相同的环境中摇匀18-24小时，直至培养物进入平稳期。
3.在室温下以6000g的速度离心获取细胞，并将细胞悬浮于floral dip溶液中，直至最终的OD600值为大约0.80。此时，农杆菌可以被浸泡使用。
C.F1oral dip接种
1.将接种液放入烧杯中，并将植物倒转插入悬浮液中直至浸没所有地面组织。
2.轻轻摇动植物3-5秒，然后将植物移离烧瓶。
3.根据以上的方法覆盖并培养该植物(以上植物培养的第3步)。
D.选择经改造后的植物
1.将改造后的种子(大约1250颗种子＝25mg＝50L)称重，并用95％乙醇消毒30-60秒，然后用20-50％含有0.03％Tween20的漂白剂(最终容量含有2.625％的次氯酸钠)消毒5分钟。最后用无菌水消毒2-3次。
2.将消毒后的种子悬浮于约10-20mg种子/mL的0.1％(w/v)琼脂糖中，并转移到0.8％的琼脂筛选板(带有20-30g Kan/mL)上，每块板上的密度大约为每150x15mm有3000颗种子。筛选板含有一个半强度的MS培养基(Murashige-Skoog).
3.密封筛选板并进行冷冻2天。
4.在受控的23h 50-100μ Einsteins m-2 s-1光照和24摄氏度的环境下生长12-15天。(轻轻打开筛选板并将盖上的多余湿气檫去。)
5.找出能在培养基中生长出绿叶和建立良好根系的卡那霉素抗性苗改造子。
6.将若干改造子移植到非常湿润的盆栽土壤中并种植直至成熟，直至最好长出3-5片成年叶子。
7.使用特定的引物来扩大卡那霉素抗性植物的基因组，并从而确认植物已被转基因。
E.溶液和培养液
1.Floral dip溶液(1000mL)：5％(w/v)蔗糖(加入100mL的50％蔗糖)，10mM氯化镁(可选)(加入10mLIM氯化镁，0.02-3％Silwet L-77(加入200-300I(L)，并将H2O加入至1000mL。
2.LB-卡那霉素/利福平培养液：分别带有30g卡那霉素和的501利福平的LB培养基。
3.筛选培养液：MS培养液的％times以及0.8％带有20-30g卡那霉素/mL的琼脂。
实施例3
在动物模型中DNA架构的示范
由香港大学的实验动物中心提供7-8周大的BALB/c小鼠(雄性)。这些小鼠在香港大学动物学系的动物动物中心中被存放并由技术员喂养。
A.动物接种的设计
将35只BALB/c小鼠随机分为7组，每组5只。分别重复这种方法2次(示范1和示范2)。
本实施方案的详情如表3所示：
Figure BDA0000142533540000551
在第1、3、5和6组中，在小鼠的胫骨上用27号针头通过肌肉注射的方式注射DNA疫苗。每次都只在一个部位注射DNA疫苗。在第2和第4组中，使用喂养针为小鼠喂食DNA疫苗(18060-20，Fine Science Tools)。
所有小鼠的接种计划都是相同的，且入下表中所示。
Figure BDA0000142533540000562
Figure BDA0000142533540000563
B.血液取样及血清的制备
在前三次取样中，都是在小鼠的尾部割下一小部分(-2mm)并因此取得200gl的血液。在最后一次取样中，对已被乙醚麻醉的小鼠进行心脏穿刺，并用27号探针取得700gl血液。将血液样本放置在室温下4小时进行凝固。然后将凝固后的血液放在5000rpm的离心机中离心10分钟，并取得血清。
C.培养CEF细胞
将1ml的CEF(鸡胚胎纤维细胞)细胞从液氮中解冻。然后使用10％被热灭活的小牛胎儿血清(FCS，Gibco BRL)和1％抗菌素(青霉素-链霉素，Gibco BRC)将细胞悬浮于Dulbecco’s Modified Minimal Essential Medium(DMEM)中，并将其转移进T-15烧瓶(Falcon)中。然后将细胞放入37摄氏度带有5％的二氧化碳的环境中通宵培养。
用1X PBS清洗100％汇合的CEF细胞单层两次，并用0.05％的胰蛋白酶EDTA(GigcoBRL)清洗5分钟。然后在MEM中用10％FCS中和胰蛋白酶，并用1000rpm离心5分钟。然后用10％FCS和1％抗菌素(青霉素-链霉素，Gibco BRC)将细胞沉淀悬浮于DMEM中。如有需要，可将细胞放入两个T-75烧瓶中，其中一个T-175烧瓶能分成3份作为次级培养。
D.培养PIC 15细胞/MARC-145细胞
将1ml PK-15/MARC-145细胞从液氮中解冻。然后用10％被热灭活的小牛胎儿血清(FCS，Gibco BRL)和1％抗菌素(青霉素-链霉素，Gibco BRC)将细胞悬浮于IOral MinimumEssential Medium(MEM)中，并将其转移进T-75烧瓶(Falcon)中。然后将细胞放入37摄氏度带有5％的二氧化碳的环境中通宵培养。
用1X PBS清洗100％汇合的CEF细胞单层两次，并用0.05％的胰蛋白酶EDTA(GigcoBRL)清洗5分钟。然后在MEM中用10％FCS中和胰蛋白酶，并用1000rpm离心5分钟。然后用10％FCS和1％抗菌素(青霉素-链霉素，Gibco BRC)将细胞沉淀悬浮于DMEM中。如有需要，可将细胞放入两个T-75烧瓶中，其中一个T-175烧瓶能分成3份作为次级培养。
E.从组织培养中净化病毒
使用CEF、PK-15和MARC-145细胞分别扩大IBDV、HCV和PRRSV。然后，在10％被热减活的PBS的辅助下，它们分别在DMEM(对CEF)或在MEM(对PK-15和MARC-145)中被病毒感染5天。然后通过冷冻和解冻3天的方法将病毒从细胞中释出。从烧瓶壁上刮走附着的细胞。使用2000rpm离心10分钟移除散落的细胞和细胞碎片。然后将含有部分净化病毒的上浮液放入Beckman 40-Ti旋转器中以30000rpm离心2小时。最终将含有净化病毒的沉淀悬浮于TNE中，以便在ELISA和Western blotting中使用。
F.免疫技术
使用6X填充缓冲剂buffer(30mM Tris-Cl，pH6.8，30％甘油，10％SDS，600mM二硫苏糖醇，0.012％溴酚蓝)将IBDV、HCV、PRRSV和预染的蛋白标记(board range，Bio-Rad)混合，并放在沸水中变性10分钟。然后使用垂直电泳对变性后的病毒蛋白进行SDS-PAGE。首先将样本放入5％的浓缩分离胶中。然后使用80V在蛋白运行缓冲剂中进行电泳2.5小时。然后用考马斯蓝将分离胶染色，或直接用作Western Blot。
1.Western blotting
使用转移缓冲剂将显示在SDS-PAGE胶上的条纹移送到用甲醇浸泡过的蛋白膜上(Immun-Blot PVDF membrane，Bio-Rad)，并通宵放在电流为40mA的垂直电极中。
然后用PBS清洗蛋白膜，并在室温(RT)下用封闭剂(5％脱脂奶及在1X PBS中的1％Tween-20)一边摇匀一边处理15分钟。
移除封闭剂并加入在封闭剂中稀释的小鼠抗血清，然后放在室温下2小时摇匀。然后用PBS清洗蛋白膜5次，每次5分钟。然后将与碱性磷酸酶(AP)结合的山羊抗鼠IgG(Zymed，1∶50)加入到蛋白膜上，并放置在室温中1.5小时。然后使用上述的PBS清洗蛋白膜。最后以酶作用物的方式加入10％5-Bromo-4-chloro-3-indo[y]phosphate(BCIP)和10％硝基四氮唑盐(NBT)。然后通宵放置在黑暗中从而上色。
2.酶联免疫吸附测试(ELISA)
修改ELISA测试方法，从而在已接种的小鼠体内测量IBCV-、HCV-和PRRSV-特定抗体。首先使用涂层缓冲剂PBSN(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠和0.05％叠氮化钠，在1X PBS中pH值为9.6*)将净化的IBDV、HCV或PRRSV稀释为1∶100。将100iii的稀释病毒加入到96孔ELISA板的每个孔中，并通宵放置于4摄氏度中。然后用PBST(在1X PBS中的0.05％Tween-20)清洗ELISA板三次，每次5分钟。然后在37摄氏度中用带有N牛血清白蛋白(BSA，USB Inc.)的PBS封闭非特定的结合部位2小时。然后将100μl稀释的小鼠血清(1∶50)以初级抗体的方式加入到已含有抗原的2个孔中，并放置在37摄氏度下1小时。然后如上所述用PBS清洗ELISA板。然后以次级抗体的方式加入HRP-结合的山羊抗鼠IgG(Zymed，1∶5000)，并放置在37摄氏度下1小时。然后如上所述用PBST清洗ELISA板。然后在ELISA板上的每个孔中加入100μl TMB酶作用物(Zymed)，并在黑暗中反应15分钟。最后加入100μl停止液(在盐酸中)并从而终止反应。使用酶标仪(Bio-Rad Model 550)在490nm中读取ELISA板的OD读数。
实施例4
ELISA及Western blotting
在整个接种程序中(实施例3)，其中三只小鼠在接种或抽血后死亡。这包括在示范1中一只第4组和第7组的小鼠，以及在示范2中一只第2组的小鼠。
为评估DNA架构在动物模型(例如，BALE/c mice)中诱发特定抗体的能力，进行ELISA和Western blotting。
A.ELISA
进行ELISA来研究在接受接种的小鼠中是否引起任何体液免疫反应。使用改良后的ELISA重复对小鼠血清中的特定抗-IBDV、抗-HCV或抗-PRRSV抗体进行测试。
结果如以下的表6至表26所示，并随后进行总结。
Figure BDA0000142533540000591
Figure BDA0000142533540000601
虽然在与第3次实验比较中，大部分的小鼠血清都在ELISA读数中有轻微下降，但读数仍然比初始值高。因此，使用的DNA疫苗能被证明是有效的。
在第一次和/或第二次接种后，某一特定小鼠的ELISA读数时出现短暂的增加。然而，读数随后便跌至起始时(治疗前)的水平。
在10只注射了pcDNA3.1-VP5-5.2和VP2-3.4(第1组)的小鼠中，示范1中的4号小鼠(表7)以及示范2中的1、3和5号小鼠(表8)都展示增加的IBDV-特定抗体。
Figure BDA0000142533540000602
Figure BDA0000142533540000603
在服用了含有100μg pcDNA3.1-VP5-5.2和VP2-3.4大肠杆菌细胞的9只小鼠中(第2组)，示范1中的1、2和3号小鼠(表9)和示范2中的所有小鼠(表10)都在口服接种后展示出增加了的IBDV-特定抗体。
Figure BDA0000142533540000611
Figure BDA0000142533540000612
*5号小鼠在第7天抽血后死亡
在注射了pHCV2.5的10只小鼠(第3组)中，示范1的2、3和4号小鼠(表11)的ELISA读数上升。同时，示范2中的4号和5号小鼠(表12)展示出增加了的HCV特定抗体。
Figure BDA0000142533540000613
在服用了含有100μg pHCV2.5大肠杆菌细胞的小鼠中(第4组)，虽然示范2中的5号小鼠只展示了短暂的HCV-特定抗体上升，示范1中的1、2和5号小鼠(表13)和示范2中的1、3和5号小鼠(表14)都展示出了增加了的HCV-特定抗体。
Figure BDA0000142533540000622
Figure BDA0000142533540000631
*3号小鼠在接种程序升始前死亡。
在注射了pcDNA3.I-ORF5的10只小鼠中(第5组)，示范1中的3、4和5号小鼠(表15)和示范2中的1、2和5号小鼠(表16)都在接种后展示出增加了的PRRSV-特定抗体。
Figure BDA0000142533540000633
Figure BDA0000142533540000634
Figure BDA0000142533540000641
在注射了pHCV2.5和pcDNA3.1-ORFS的10只小鼠中(第6组)，示范1中的所有小鼠(表17)和示范2中的4号和5号小鼠(表18)都展示出增加了的HCV-特定抗体。同时，示范1中的3、4和5号小鼠(表19)和示范2中的2号和4号小鼠(表20)都展示出增加了的PRRSV-特定抗体。
Figure BDA0000142533540000642
Figure BDA0000142533540000643
Figure BDA0000142533540000652
Figure BDA0000142533540000653
在负对照组中没有小鼠展示出任何抗-HCV或抗PRRSV抗体水平的上升(表21-26)。
Figure BDA0000142533540000654
Figure BDA0000142533540000661
*5号小鼠在开始接种程序前已死亡
Figure BDA0000142533540000662
Figure BDA0000142533540000663
*5号小鼠在开始接种程序前已死亡
Figure BDA0000142533540000671
Figure BDA0000142533540000672
*5号小鼠在升始接种程序前已死亡
Figure BDA0000142533540000673
B.Western Blotting
Western blot的分析能证明是否表达了病毒外壳蛋白。另外，Western Blottign亦能证明针对病毒蛋白的小鼠抗血清特异型。
由于病毒蛋白接受了10分钟100摄氏度的热处理，并溶解在SDS-PAGE中，因此病毒蛋白已被变性。因此，只有线性表位而非构象依赖表位能在blotting膜中被侦测。
所有小鼠血清(在第28天中采集)被收集在一起并使用封闭剂稀释，从而用作Western Blot分析。
虽然所表达的条纹强度有所变化，但所有在示范1和2中的小鼠血清都在Western Blot分析中显示为阳性。
对于从示范1中或示范2中采集的小鼠血清，并没有出现预防IBDV、HCV和PRRSV蛋白的条纹。也就是说，它们并未能制造出特定的抗IBDV、抗HCV或抗PRRSV抗体。
在第1组合第2组小鼠血清的Western blot中，测试了所述的来自示范1和示范2的血清，并在36.4kD和486kD的之间出现条纹。该条纹对应IBDV的VP2。在每项测试中重复测试病毒蛋白。
在第三组小鼠血清的Western blot中，在48.6kD和96kD之间出现2个条纹。在每项测试中重复测试病毒蛋白。在示范1的小鼠抗血清中其中一个条纹接近48.6kD，并代表HCV的E2蛋白(55kD)。另外一个条纹则处于29.8kD和36.4kD之间。该条纹代表HCV的E1(33kD)。同时，示范2的小鼠抗血清中的一个接近94kD的条纹则代表HCV异型二聚体E1-E2(75kD)。醣蛋白E0已经被描述为一个44kD至48kD的蛋白，并在Blotting膜中稍微低于48.6kD。
第4组小鼠血清的Western blot结果和第3组的结果相似。
在第5组的小鼠血清中，有一个仅仅在29.8kD下面的条纹，该条纹代表PRRSV的GP5。在示范1的测试中，最粗的条纹出现在29.8kD和36.4kD之间。虽然传统的GP5处于24.5kD-26kD之间，但是由于注射了pcDNA3.1-ORF5，所述的粗条纹代表GP5。由于变性不完全以及聚丙烯酰胺凝胶的溶解能力，可能会存在差异。
在第6组的血清Western blot中，在示范1抗血清测试的醣蛋白HCV条纹道中，仅高于94kD的条纹为HCV的E2-32同型二聚体(100kD)。醣蛋白E0(44kD至48kD)则在blotting膜中稍微低于48.6kD。另外，在29.8kD至36.4kD之间亦有一个条纹，该条纹对应HCV的E1(33kD)。在示范2抗血清测试的醣蛋白HCV条纹道中，在接近94kD的位置有一个对应HCV E1-E2异型二聚体(75kD)的条纹。
在PRRSV的条纹道中，有一个仅低于29.8kD的条纹，该条纹对应于示范1和示范2康血清测试中的PRRSV。在GP5条纹的上方，还有若干条可能由于GP5或二硫键连接的M及GP5异型二聚体的不完全的变性造成的条纹。
C.结果
在改良了的ELISA分析中，虽然ELISA板被封闭剂封闭从而避免了非特定的结合，但非特定的背景染色仍然在存在于某些ELISA的板孔中。例如，在示范1中的第3组中，第1、4和5号的初始读数则与另一块板的2号和3号读数不同。因此，ELISA测试的时间可被用来评估特定抗体的制造。
在ELISA分析中，注射了pcDNA3.I-VP5-5.2和VP2-3.4的10只小鼠中有5只能产生预防IBDV的特定抗体。同时，服用了含有pcDNA3.l-VP5-5.2和VP2-3.4的大肠杆菌的9只小鼠中有7只能产生预防IBDV的特定抗体。
注射了pHCV2.5的10只小鼠中有5只能产生预防HCV的特定抗体。同时，服用了含有pHCV2.5的大肠杆菌的9只小鼠中有6只能产生预防HCV的特定抗体。
以上结果表示以两种方式(肌肉注射和口服)服用的DNA疫苗能有效激发预防病毒的特定抗体。Western Blot分析能进一步确认这一结果。
在ELISA分析中，注射了pHCV2.5的10只小鼠中有5只能产生对抗HCV的特定抗体。同时，注射了pcDNA3.1-ORF5的10只小鼠中有6只能产生对抗PRRSV的特定抗体。
在第6组中，小鼠被注射了结合的DNA疫苗(pHCV2.5和pcDNA3,1-ORFS)，10只小鼠中有7只能产生对抗HCV的特定抗体。同时，10只小鼠中有5只能产生对抗PRRSV的特定抗体。另外，在此组别中有4只小鼠能产生同时对抗HCV和PRRSV的特定抗体。
以上结果表明通过肌肉注射的结合DNA疫苗能有效激发对抗两种病毒(HCV和PRRSV)的特定抗体。Western Blot分析能进一步确认这一结果。
在不同的小鼠中，通过结合接种而对抗各种病毒的抗体反应在质量上和强度上都相当于一次单独的接种。这表明小鼠的免疫系统能接受多个抗原并能为猪只提供制备多个多功能DNA疫苗的途径。
在IBDV中有至少三个依赖构象的中和表位和一个线性(依赖构象)的中和表位。其中两个依赖构象的表位位于VP3的C端(Yamagucki，T.，等人，1996，Virol 223：219-223)。虽然Western blot只能侦测线性抗原，但在膜上仍然能侦测到VP2，原因可能是VP2的不完全变性从而令其能被侦测。
在Western Blot分析中，能侦测到HCV的同型二聚体和异型型二聚体。HCV蛋白的二聚作用对在宿主免疫系统中的真正抗原和诱导一个稳定及长期的免疫力是很重要的。(Konig，M等人，1995，J Virol 69：5479-86)。另外，由于病毒蛋白是在非变性的环境下被分离的，因此能侦测到由分子间二硫键连接的HCV的E1-E2异型二聚体。在E2N端中的二硫键已被证明在特定抗体对抗原的识别上是很重要的。为证明E1和E2的单体，可以在还原性的条件下将蛋白分离(例如在2-mecaptoethanol存在的条件中)。
在HCV中找到了三种不同形式的醣蛋白E2，它们是E2单体、E2同型二聚体和E1-E2异型二聚体。在引入能表达E1和E2的pHCV2.5 E1-E2后，优先形成异型二聚体。出现双重或三重形式的现象可能归因于不同E2蛋白的骨干及不同的糖基化。另外，在羧基端的替代过程能产生具有不同表观分子量的E2分子。
在PRRSV特定抗体的Western blot分析中，出现了若干条纹。它们可能归因于以下原因。首先，PRRSV蛋白在被加入到SDS-PAGE之前已在100摄氏度中被热处理10分钟。因此，三种GPS可能都出现在膜上，第一种是被完全变性的GPS，第二种是被部分变性的GPS，第三种是部分分解了的GPS。
第二，在大约26.4kD至48.6kD之间，有一条很清晰的条纹，它可能对应硫化键连接的M-GP5异型二聚体。在形成分子间的硫化键时，很可能牵涉到位于外壳蛋白N端外功能区的半胱氨酸残余物。因此，抗GP5抗体能侦测到M-GP5异型二聚体的存在。
至少存在着两种与PRRSV的GP5有关的中和抗原决定子。在这些决定子中，有些是依赖构象的而有些是线性的。因此Western blot分析仍然能侦测到抗GP5的存在。另外，糖基化并非一定与中和表位关联。
实施例5
疫苗组成和方法的改良
此处所述疫苗的组成和方法能为本发明提供额外的详情。
首先，在比较中应包括每组的对应物。例如，除了向小鼠喂饲含有质粒(潜在DNA疫苗)的大肠杆菌外，额外一组的小鼠应该喂饲纯质粒DNA。除了向小鼠注射纯质粒DNA外，额外的一组小鼠亦应被包括并被注射带有质粒的大肠杆菌。另外，对照组应在接种过程中被注射PBS或载体(pcDNA3.1)，而非什么也不注射或喂饲。
第二，通过分析已被接种的含有Peryer’s patches的小鼠的冷冻小肠组织，能确认IgA和细胞活素的制造。而且口服接种已被证明能引发全身和粘膜抗体的制造(Gallichan WS，Rosenthal KL.1995.Vaccine.13：1589-1595)。
第三，虽然DNA疫苗(pcDNA3.1-VP505.2和VP2-3.4，pHCV2.5和pcDNA3.1-ORF5)能引发特定抗体的制造，如上所述，但DNA疫苗亦能保护动物预防疾病。为更进一步证明DNA疫苗的效用，可通过病毒中和检测来测试特定抗体的中和能力。
第四，DNA疫苗已被证明能引发体液和细胞免疫(Ulmer，J.B.，等人，1996，Immunol 89：59-67)Ulmer，J.B.，等人，Cur Opin Immunol 8：531-536)。然而，在每次接种疫苗后只量度体液免疫反应。T淋巴细胞可能被本发明的疫苗和组合物刺激从而产生预防病毒的免疫反应。用本发明的方法和组合物接种疫苗后產生的抗原特定细胞和辅助T淋巴细胞，其数量和对抗疾病的角色可用流式细胞仪来证實。
第五，被麻醉的动物可能更容易使用本发明描述的方法和组合物来接种。例如，在为小鼠注射DNA疫苗时，被接种动物在清醒时肌肉可能会收缩，并从而挤出疫苗溶液(如DNA疫苗)。
第六，为提高或促进动物(如小鼠)的免疫反应，可将此处描述的疫苗方法和组合物与一个或多个额外物结合使用。这些额外物可包括，但不局限于一个或多个化学(如完整的Freund’s佐剂)或遗传(如表达细胞活素的载体)佐剂。在一个非限制性的实施例中，免疫原性DNA疫苗(例如质粒)和遗传佐剂(例如其他质粒)可能导致特定抗原体液和/或细胞介导免疫反应的增加。
实施例6
猪病原体的分离和鉴定示范
此处描述的是识别、分离和鉴定病原，尤其是广州猪繁殖及呼吸病毒，的方法。此处特别描述的是，基于聚合酶链式反应(RT-PCT)从而复制用逆转录方式从病毒RNA中取得的DNA，在受感染的猪只样本中侦测猪繁殖及呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法。在广州不同的猪场中从受感染的猪只身上取得组织样本(肺、肌肉)。通过RT-PCR复制、序列分析和Western免疫印迹分析，此处描述的广州农场的病毒与北美洲的病毒株相似。正如本领域的从业人员所熟知的，这样的方法能在本发明的实践中确认、分离和鉴定其他病原体得到应用。
识别作为新病原体的PRRSV
在1980年代后期，在世界各地的养猪场爆发了一种神秘的疾病，疾病的特征为在任何年龄的猪只中出现严重的呼吸衰竭和呼吸问题(Mardassi等人，Can J Yet Res 58，55-64；Mardassi等人，1994.J Clinical Mcrobiology.Sept.2197-2203)。这种疾病首先于1987年在北美被报道，而欧洲在1990年和美国在1992年则首先分离病原体(Suarez等人，1994 Arch Virol.135，89-99)。在结构上，两个病毒株是相似的，但在病原上则不同。该疾病最终被命名为猪繁殖及呼吸综合征，且由猪繁殖及呼吸综合征病毒(PRRSV)引起。
PRRSV的鉴定
分子鉴定已证明病毒基因组含有单链的RNA分子，并且基因组大小为15kb。该基因组含有8个开放阅读区间(ORFs)，并具有ORFIa和ORFIb(位于5’端)，并接近病毒基因组的75％。它能编码具有聚合酶和复制酶功能的蛋白质。其余六个ORFs2至7的结构蛋白则位于基因组的3’端(Conzelmann，K.K.等人，1993，Viral 193：329-339)。球形的外壳PRRSV已经在动脉炎病毒属的形态学和形态遗传学的相似性上被描述，所述病毒属包括马动脉炎病毒(EAV)和小鼠的乳酸脱氢酶升降病毒(LDV)。很多初级建立的细胞系中还未能够复制所述病毒，但所述病毒能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)和在MA-104猴子细胞中取得的MARC-145中复制(Dea等人，Ultrastructural characteristics and morphogenesis of PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Vrus propagated in the highly permissiveMarc-145 cell clone.Plenum Press，New York 1995)。
PRRSV亚株的分离和鉴定
概括地说，使用不同寡核苷酸引物的多重PCR能被用来区分北美和欧洲所分离的来自广州的样本。把使用来自受侵染的细胞培养基的净化PRRS病毒体用作起始材料，并进行分子cDNA复制和排序。然后鉴定这些PRRSV的形态学和生理化学特性。
1.细胞和病毒的分离
在呼吸困难的猪只的肺部和肌肉组织中取得一共3组的广州PRRSV病毒，并在一种随意的细胞系MARC-145中繁殖(中国广州华南农业大学兽医学系，510642)。然后将MARC-145放在Minimum Essential Medium(MEM)中培养，并用10％γ-辐射处理过的胎牛血清(FBS)、10％胰蛋白磷酸培养液(TPB)及1％抗霉菌抗生素(Life Technologies，
Figure BDA0000142533540000731
)加以补充。具代表性的美国PRRSV和NVSL病毒分离物是从市场上可买到的改良活性疫苗中分离的(Animal and Plant Health Inspection Services，National Veterinary ServicesLaboratories.Ames，IA)。将1.5ml等量的组织样本放进75cm2的含有培养液但没有胎牛血清(FBS)的单层细胞培养皿中。然后每天观测受感染的细胞培养基中有否出现细胞病变效应(CPE)。
对于所有均匀的组织样本，在前6次MARC-145的细胞培养中并没有观察到任何细胞病变反应。在第7次的细胞后，能观察到CPE、在繁殖的24小时后能观察到细胞变大且带有气泡、还能观察到细胞合胞体以及在繁殖的3-4天后能观察到受侵染的细胞开始聚集。最后，将被侵染的细胞从培养皿中取出。在正对照组中，NVSL侵染的细胞在整个实验中都能观察到细胞病变反应。
2.病毒净化
储存的病毒是在MARC-145细胞中的最后7个连续培养中制造的。然后分别在零下80摄氏度和37摄氏度的环境中冷冻并解冻受侵染的细胞三次从而采集病毒。然后在4摄氏度中以4000x g离心20分钟从而去除细胞碎片。然后用75,000x g(21,000rpm)在BeckmanSW40Ti旋转器中离心3小时从而沉淀在上清液中的外细胞病毒。将沉淀悬浮于11100初始容量的THE缓冲剂中。然后通过30％-50％(w/v)的蔗糖梯度在Beckman SW55Ti旋转器中以110,000xg(35,000rpm)净化浓缩的病毒16小时。
3.RNA的制备
使用50pi TRIZOL(Life Technologies INC.，)并且依照生产商的说明书从被病毒侵染的MARC-145细胞中提取病毒RNA。
4.cDNA的合成
cDNA的合成是通过SuperscriptTM Preamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Life Technologies，GIBCO BRL)来取得。
5.引物的设计
根据北美(VR-2332)和欧洲(LV)在编码成聚合酶蛋白的ORFIb中的基因组序
列设计出若干组引物，从而能够进行迅速的多组PCR测试。PCR引物是根据在动脉炎病毒属中保留的ORFIb来设计的。其中一组内部引物则是根据Leiystad病毒(LV)的基因组序列设计的，而其他引物则是复合或嵌套复合PCR的特定内部引物和普通引物。引物是在两个北美PRRS病毒株(Minnesota MNIb和Quebec LHVA-93.3 isolates)的ORFIb部分被排序后设计的(Gilbert等人，1997，J.Clinical Mcrobiology Jan 35(1)，264-267)。用作嵌套复合PCR的寡核苷酸引物的详情如表27所示。
6.对PRRSV D2、D3和AV样本进行的嵌合复合PCR
在第一轮的PCR中，将2.5μl的cDNA加入到含有10x PCR缓冲剂、，25mM氯化镁、10mM dNTPs、12.5μM引物EU和ED以及5个单位的Taq DNA聚合酶(Life Technologies，GiBCRO，BRL)混合物中，总容量为25μl。在94摄氏度下变性3分钟后，聚合酶链式反应以以下方式循环4次：94摄氏度20秒、42摄氏度1分钟、72摄氏度1分钟；然后再以以下方式循环40次：94摄氏度20秒、47摄氏度1分钟、72摄氏度1分钟；最后一步为62摄氏度5分钟。
对于嵌合PCR，将2.5μl的模板(在第一轮PCR中的PCR产物)加入到含有12.5pM引物UI和D1、以及12.5pM引物U2和D2的反应混合物中。在94摄氏度下变性3分钟后，聚合酶链式反应以以下方式循环35次：94摄氏度20秒、47摄氏度30秒、72摄氏度30秒、最后一步为72摄氏度15分钟。扩大后的产物可用5μl通过在1.5％琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色来侦测，凝胶可在紫外线照射下进行拍照。
由于在欧洲的病毒株中未能观察到任何序列的扩大，因此可以确认对于北美病毒株的内部引物对U2和D2的结合性以及其在用于区分北美和欧洲PRRSV病毒株上的应用。
7.序列的断定/分析
使用Geneelean II Nucleic acid Purification Kit(BiolOl)可净化经过RT-PCR放大的产物。基因组区域可使用U2和D2引物在Automated Laser Fluorescent DNAsequencer(PERKIN ELMER，ABI PrismTM 310 Genetic Analyzer)中将双链进行排序，然后使用排序分析3.4程序以及MAC DNAsis Version.2.4软件对核苷酸和序列进行电脑分析。然后使用MAC DNAsis Version 3.6程序和Geneworks Version 2.2程序(Intelligenetics，Inc.，Mountain View，California，USA)计算同源核苷酸。
将取得的3个PRRSV ORFIb核苷酸序列与已公布的US病毒株参考序列(ATCCVR-2332)和欧洲病毒株(LV)参考序列以及NVSL参考序列相比较。如表28所示，在这3种PRRSV病毒株中，并没有出现核苷酸的替换，删除或插入。
Figure BDA0000142533540000761
Figure BDA0000142533540000762
根据病毒株以及NVSL、欧洲(LV)及美国(VR2332)上的聚合酶基因序列进行进化树的分析。在LV-ORF1b株和D2-ORFIb之间、VR2332-ORFIb、NVSL-ORFIb、D3-ORFIb和AV-ORFI b株之间观察到17.5％的同源核苷酸；在D2-ORFIb株和VR2332-ORFIb之间、NVSL-ORFIb、D3-ORFIb和AV-ORFIb株之间观察到95.1％的同源核苷酸；参考美国病毒株(VR2332-ORFI株、ATCC VR-2332)，在这些病毒株(例如NVSL-ORFIb、D3-ORFIb和AV-ORFIb株)中亦能观察到95.5％的同源核苷酸；在NVSL-ORFIb株和D3-ORFlb之间，以及AV-ORFIb株中能观察到100％的同源核苷酸；并且在D3-ORFIb和AV-ORF 1b株之间观察到100％的同源核苷酸。
这些PRRSV株的序列数据可以被用来通过加权对组合与算术平均法进行进化树的分析(Geneworks Version 2.2)。因此，PRRSV株能被分成北美基因型(NVSL-lb，Av-Lb，D3-1b，VR-2332 lb和D2-OREIb株)，并与欧洲LV参考株(LV-ORF1b)区分开。
因此如上所述，RT-PCR可被用来侦测若干RNA病毒。这样的技术已在本实施例中被应用从而鉴定从广州采集的病毒株，并因而确认来自北美或欧洲的新型猪病毒传染至中国内地。这已表明这不仅是合适的诊断方式，而且是区分北美和欧洲PRRSV病毒株的合适方法(Mardassi等人，Can J Vet Res 58，55-64；Mardassi等人，1994.J ClinicalMicrobiology.Sept，2197-2203(1994)。Meulenberg等人，(1993，Virology 192，62-74)已经证明大部分的PRRSV病毒株能在来自能肺(组织)匀浆的PAM(猪肺泡巨噬细胞)中繁殖，所述肺组织匀浆能维持病毒的复制。直至近期，北美PRRSV病毒株才能够成功地在MARC-145细胞中高度繁殖，MARC-145为源自MA-104细胞系且極具寬容度的PRRSV复制细胞。(Kim等人，1993，Arch Virol 133，477-483)。在本实施例中，能成功地在MARC-145中分离病毒，并且能被广州PRRSV病毒株侵入。
超结构特征的测定
对浓缩的外细胞病毒进行超离心，并在试管底部产生乳白色条纹，它代表50％蔗糖的密度梯度。从密度梯度中能看到病毒碎片。不同密度的样本中的病毒可点滴在塗有碳的格框上，只要把格框浮在30微升不同密度的樣本中30秒，並用pH6.3的3％磷酸钨酸水(PTA)负性染色30秒，紫外线照射格框15分钟后，用Philips EM 208s电子显微镜的不同电位查验格框，参考的AV和NVSL病毒颗粒的电子显微图表在蔗糖密度1.34g/ml和不同电位(90kY和31.5kV)下显示负性染色。经过电子显微查验，这个密度的样本包含多个直径60纳米的球形病毒颗粒，且颗粒與细胞碎片被笼罩
PRRSV的AV病毒株的形态特征与先前描述的从ATCC-VR2332美国PRRSV中取得的组织培养基一致(Murphy等人，1992，Vet.Mcrobiol.32，101-115；Pirzadeh，B.，Gagnon，C，A.and Dea，S.，1998，Can J Vet.Res.62，170-177)。
9.病毒多肽的识别
在非还原的条件下通过SDS-PAGE分析PRRSV AV病毒株的蔗糖梯度净化制备物(例如50％至30％的碎片)以及PRRSV NVSL的参考病毒株，并且使用市面上能买到的猪同源高免疫血清作为特定病毒抗体的材料将病毒多肽被从Western免疫印迹实验中还原出来。SDS-PAGE和Western免疫印迹测试都能根据Fritsch，Maniatis and Sambrook，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.(Second Edition.pp 18.47-18.75)来进行。
使用的材料和方法有：Western免疫印迹法，高免疫血清(Animal and PlantHealth Inspection Service，National Veterinary Services Laboratories，Ames，IA)，用碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG(Zymed)以及含有NBT和BCIP缓冲剂的酶底物溶液(Zymed，S.San Francisco，California，USA)。条纹在凝胶上移动的距离相对于大概的分子量为：15kDa、19kDa、26kDa、45kDa和80kDa。只有15kDa、19kDa、26kDa和45kDa的病毒多肽能使用阳性对照血清来进行免疫沉淀。
从Western免疫印迹实验的结果可得，通过SDS-PAGE所取得的条纹，只有对应为大约分子量为15kDa、19kDa、26kDa和45kDa的条纹代表病毒蛋白。其他被SDS-PAGE侦测到的条纹可能对应为与外细胞病毒体一起被净化的细胞蛋白。被识别的广州AV病毒株的多肽形式与已经被公布的在不间断CL2612细胞系(Francki等人，1992，Arch Virol.2，220-222)中繁殖的美国ATCC-VR2332参考病毒株以及NVSL参考病毒株相同。如其他文献所述(Plageman等人，1992，Adv.Virus Res.41，91-192；Mardassi等人，1994)，这些多肽形式与EAV和LDV的多肽形式互相匹配。从而类推到EAV和LDV，PRRSV中识别的15kDa、19kDa和26kDa多肽分别代表主要的核壳蛋白N、矩阵蛋白M和包膜蛋白E，而30kDa，31kDa和45kDa多肽则代表次要的病毒结构蛋白。
实施例7
分离和鉴别鸡病原病毒的示范
此处描述的实施例示范了根据Si基因的多样性分离并鉴别不同亚型的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。采用PCR排序可鉴别从中国南方不同地方采集到的区域I13V病毒株。根据已公布的序列数据，设计一对位于整条S-1基因两端的引物，而预期的PCR产物大小为1760对碱基对。将得出的PCR产物亚克隆到pGEM-T简易载体上并进行排序。这些病毒株的遗传关系分析得出这5种病毒株的S-1基因在南中国具有极高的多样性。在这5种病毒株中核苷酸的变异范围为8％ to 48％，而且这5种病毒株能根据进化系统树来分成3组。在这些病毒株中同时亦识别了两个稳定区域以及两个高变异区域。本实施例指出中国不同地区的养鸡场都应使用基因型对应的疫苗来对鸡只进行接种，从而防止接种失败。另外，亦可以识别其他病原体亚株从而制备更有效的疫苗并根据本发明的方法来服用。
采集病毒
IBV病毒株VI、V2、V3、V4和V5是在中国云南、湖南、湖北、广西、和广东省的兽医服务站取得的。
分离病毒
在37摄氏度下，在没有特定病原体(SPF)的10天大的鸡胚胎中对每一个病毒株进行48小时繁殖并滴定测量，并从胚胎中采集500微升的尿囊液，然后将尿囊液放到4摄氏度下并2500x g离心5分钟，并采集上清液；然后根据生产商的指引分离IRV的染色体RNA(Gibco BRL，Grand Island，NY)。
RT-PCR
根据superscriptase RT kit生产商(Gibco BRL，Grand Island，NY)的指引，使用病毒RNA作为母本并进行逆转录从而取得第一条cDNA。cDNA是使用随机的六聚物引物从1pl(200ng)病毒RNA中合成的。然后对容量为25μl的cDNA进行扩大，所述容量包括2.5pl 10x PCR反应缓冲剂、引物各50pmole。然后用蒸馏水调整至25μl的容量。然后进行35个循环(44摄氏度1分钟，52摄氏度2分钟，72摄氏度2分钟)的具有最终拉长步骤(72摄氏度10分钟)的PCR扩大。使用robocycler PCR仪器和具有1760个碱基对的引物扩大S1基因，所述的具有1760个碱基对的引物为这些病毒株产生的具有1760个碱基对的片断。使用一个LambdaDNA/Hindlll标识物从而量度扩大片断的大小。结果表明所有病毒株都为IBV，并分别命名为V1、V2、V3、V4和V5。
5种病毒株S-1基因的复制和排序
使用Geneclean II kit(101 Bio，Co)洗净S-1基因的PCR产物，并根据说明书将其复制入pGEM-T简易载体(Promega)中，然后使用质粒PCR和EcoRI酶切来确认扩大成功(pT-S)。使用Lambda DNA/Hinddlll标识物从而量度扩大片断的大小。然后用初级引物行走方法对扩大产物进行排序。引物和其位置已在表30列出，然后将得出的序列与MacDNAsis和PAUP作比较(Hitachi software engineer Co.Sun brew，CA)。
Figure BDA0000142533540000791
Figure BDA0000142533540000801
使用3个引物对(引物-1和引物-2；IBV-F和IBV-R，；IBV-FOR和IBV-REV)通过排序的初Si基因的完整序列。为得到Si基因的完整序列，首先用RT-PCR扩大了一个VI、V2、V3、V4和V5病毒株的具有800个碱基对的S-1片断，然后将3个阳性扩大产物亚克隆到pGEM-T简易载体上。
在S-I基因的N端区域中的核苷酸序列(表31)揭示了在5个病毒株中如Keeler等人发现的两个高变区域和两个稳定区域。
Figure BDA0000142533540000802
Figure BDA0000142533540000811
E.基因型的分析
根据8个IBV病毒株的S-1核苷酸序列的比较，进行进化系统树分析。所述的5个从南中国采集到的病毒株在核苷酸序列(范围48％-8％)上具有高度的异源性。V4和V5被分成同一组，并且由于相比mass-2(Beaudette株)来说与Holte病毒株高度同源(92％)，所以在遗传上比较接近。V1、V2和V3被分入不同的组别中。V1属于新的基因型。V2和V3都表现出与Holte同源，但在它们之间仍然存在明显的变异。而D41则与mass-2(Beaudette株)同源。
如上所述，先前在Mass-typed IBV S-1基因的N端氨基酸剩余物中已经识别了两个高变异区域56-60和117-113以及两个稳定区域43-47和229-236。在所述5种病毒株中都能找到这两个高变异区域和稳定区域。此结果表明这些病毒株属于Mass-typed。然而，进化系统树的分析表明这些病毒株与Mass-typed仍然有所不同。因此，Mass-type的变异被认为引起了南中国病毒的诞生。
这些已被示范的在病毒株中的高多样性表明在中国不同地区的养鸡场能使用相对应的基因型吻合的疫苗株来对鸡只进行免疫接种。病原体(例如IBV)的基因型能用来制造具有特定基因型的而又根据本发明所述方法使用的疫苗。
实施例8
抗猪霍乱病毒疫苗的接种示范
此实施例描述了已改良效用的DNA疫苗。为示范该效用已被改良的抗猪霍乱病毒疫苗，需制备一种天然的DNA疫苗。在制备和鉴定所述天然DNA疫苗后，让参与实验的动物服用所述的天然细菌DNA疫苗，并将引起的免疫反应与服用纯DNA的动物所引起的免疫反应相比较。比较后能明显看出，相比纯DNA疫苗，所述的天然DNA疫苗在抗体和CTL的引发上都具有显著提高了的免疫原性。尤其是，例如在兔的免疫接种中，与纯DNA相比，抗猪霍乱病毒的细菌DNA疫苗能引起显著提高了的血清抗体反应(体液)和细胞毒性T淋巴细胞(细胞介导)反应。
A.质粒DNA
此处已描述了与能驱动HCV醣蛋白E2基因表达的巨细胞病毒启动子架构在一起的免疫原性pHCV2.5和pHCV1.25。
i.接种和制备疫苗
为引起对抗HCV的免疫反应，根据以下步骤对动物进行免疫接种。从香港大学动物中心购得雌性兔子(1kg--2kg)。在兔子的二头肌股骨肌使用单次的肌肉内注射注射0.1ml和0.5ml的天然细菌制备从而对兔子进行基础免疫接种。所制备的0.1ml疫苗相等于100g纯质粒DNA并如此类推。在7天中两次增强药效。所述疫苗是按以下步骤制备的：
从加入了1mg/ml氨苄青霉素的1.51LB中取出1ml细菌种并进行培养。在37摄氏度中进行通宵培养，并同时以200rpm的速度摇匀。摇匀并取得病毒沉淀。称重并重组至指定浓度，用超声波降解10分钟，然后通宵加入1mg/l的氨苄青霉素以作服用。
ii.抗DNA抗体反应(ELISA)
根据生产商的指引(IDEXX-Co)，使用一个酶联接免疫吸附测试(ELISA)套装来量度抗HCV的抗体反应。被制备的DNA疫苗接种的兔子与其它两周后的兔子相比，具有最好的ELISA读数，比现有市场上的疫苗还要高。数据吻合与NA的参数吻合。
iii.流式细胞仪
单细胞悬浮液的制备(外周血PBLs)，将用肝素注射器通过心脏穿刺取得的完整血液样本放置在冰上。不加入酚红和1.5％胎牛血清(Sigma Chemical Co.St.Louis，Missouri)，用Han’s平衡盐溶液(HBSS)将血液稀释，并且用15ml的已引入HBSS人造羊毛柱过滤所述血液。取出5ml过滤后的血液，并放置在Ficoli Hypaque(Sigma)中，然后以2000rpm离心10分钟。用Pasteur吸管吸走交界处的白膜，再用5ml的HBSS清洗3次。最后清洗后，将每个样本中104个细胞里的所有淋巴细胞放置在流式细胞仪中进行分析。
用改良了快速荧光抑制试验(RFFIT)通过滴定法对CSFV中和抗体(VNAb)进行HCV病毒中和测试，使用PK.15来侦测抗CSFV的VNAb。然后在血清稀释中表达抗CSFV的VNAb滴定。将CSFV C株作为参考或作为能抑制50％荧光的相互血清稀释(rd)。
iv.侵染测试后兔子的发烧反应
病毒HCV在一般情况下不会导致发烧，但laprinized的HCV疫苗引致了兔子发烧。因此，制备的DNA疫苗若能引起兔子的免疫反应，其后的疫苗株将会被中和，并且不会引起发烧反应。
此处使用了5只兔子(2kg-2.5kg)作为示范。兔子1和兔子2被注射了高剂量和低剂量的DNA疫苗，3和4则分别注射了纯质粒DNA和传统疫苗，5被用作对照物。
首先，在实验前用以上材料标记每一只兔子。在所有兔子都通过静脉注射分别接种了laprinized疫苗、制备的疫苗和纯DNA后，在两周后给最后的两只兔子喂食。然后，对每只兔子进行一周两次的喂食。然后在两周后用laprinized疫苗株侵染这些兔子，然后持续一周每天测量这些兔子的体温。
从体温曲线中可看出，对照物兔子慢慢开始发烧，用纯DNA质粒接种的3号兔子在4天后发烧，用高剂量和低剂量疫苗接种的兔子则没有任何发烧反应。结果表明制备的DNA疫苗具有与HCV laprinized疫苗相同的疗效，然而相比制备的疫苗，纯质粒DNA只能延迟发烧4天，因而只具备部分保护能力。
v.肌肉注射DNA疫苗的病理检查
在病毒侵染的7天后，切除兔子的肌肉并浸泡在10％缓冲福尔马林中，然后用石蜡包裹。然后将该切除部分直接放入显微镜中观察。注射纯DNA和传统疫苗的兔子则作为对照物。
注射了所制备的疫苗的部分积聚了大量的单核细胞，表示注射导致了强烈的炎症，另外，严重的炎症细胞的产生亦导致了肌肉纤维的破坏。然而在被注射纯DNA和传统疫苗的肌肉中，单核细胞的侵袭程度以及肌肉纤维的变化明显地比较轻度。
vi.制备体液免疫中的DNA疫苗(VN)
当兔子被注入IICV DNA疫苗(Phcv2.5)的细菌制备时，低剂量或高剂量的两种兔子都在两周后出现体液反应。增强药效后，VN的滴定量继续增加，且在侵染1周后仍然维持在高水平。与注射纯DNA和传统疫苗的兔子相比，注射本发明所制备的疫苗的兔子具有较好的中和抗体反应。
vii.制备细胞介导免疫的DNA疫苗
使用流式细胞仪分析未凝固的兔子血液，分别测量了外周血的淋巴細胞、单核细胞和粒细胞。结果表明，使用本发明所制备的疫苗接种的兔子拥有最高浓度的炎症细胞，尤其是粒细胞。使用高剂量的制备疫苗的2号兔子则具有较高浓度的粒细胞，这反映了兔子的非特定免疫反应被大大地提升。使用较低剂量的制备疫苗的兔子则具有相对较高低浓度的粒细胞。
viii细菌DNA疫苗的特性
本实施例示范了细菌DNA疫苗比纯DNA疫苗有更好的疗效。所述DNA疫苗亦示范了Ab滴定的高级参数(ELISA)、中和反应、细胞免疫反应以及发烧反应。
对炎症细胞以及注射了所制备的DNA疫苗的肌肉进行的病理检查展示出大量炎症细胞的积聚和心肌细胞的区域变性和坏死。这些DNA细菌疫苗的特点表明了一种更有效的DNA疫苗的架构、制备和服用。例如，本发明的DNA疫苗能在被接种的兔子中引起细胞免疫反应。剂量越高，就能产生越高的免疫反应，证明比现时市面上的疫苗具有更高的特性。这些特点亦被认为归因于细菌蛋白或细菌系列。相反，由纯DNA所引起的疗效则不如本发明的DNA疫苗那么显著。另外，被接种的兔子亦被认为能对细菌的内毒素具有一定的抵抗力，和/或队由于长期的超声波技术所制造的细菌疫苗治疗所引起的毒素具有一定的抵抗力。另外，在注射的部位并没有出现严重的病变，而且被注射的低剂量已经被的兔子已经很好地吸收，只有被注射高剂量的兔子出现一些干酪变性，这表明该兔子从前出现过一次严重的炎症反应。
实施例9
示范DNA疫苗预防一地域性的PRRSV株
本实施例示范了能导致体液和细胞免疫反应的DNA疫苗，以及其作为天然细菌制备佐剂的能力。尤其是，本实施例示范了在猪只中DNA质粒架构的免疫原性，以及在T细胞识别并从而引起细胞介导眠中，PRRSV的ORF 5多肽的应用。
研发有效的疫苗前，需要对在接种后针对PRRSV结构蛋白的结构体液免疫反应有所认识。另外，重组疫苗的制造取决于病毒蛋白的选择，所述病毒蛋白能引起合适的预防动物疾病的抗体反应。通过ELISA、病毒中和(VN)以及来蛋白印迹法测试来监测此处描述的体液免疫反应(Nelson E.A.，等人，(1994).J.Veterinary Diagnostic Investigation 6，410-415)。细胞介导免疫(CMI)在对抗病毒疾病中的角色已被广泛记录。最值得注意的是，细胞毒性T细胞被认为在对某些病毒的清除中起重要作用。T细胞识别的表位鉴定已被证明能有效引起针对若干微生物病原体的免疫反应。从前的研究已经证明受感染的猪只能引起对抗PRRSV的CMI反应(Bautista E.M.，等人，(1996).Archives of Virology 14，1357-1365)。然而，PRRSV多肽在猪只中引起T细胞免疫反应的能力是否不同仍然是未知之数。
PRRSV ORF 5外壳蛋白和ORF 6基质蛋白区域被选取作为DNA疫苗的重组架构。如文献(Pirzadeh B.and Dea S.(1997).J General Virology 78，1867-1873)所述，PRRSVGP能参与病毒的感染，并且能附着到细胞的接收器上，和/或能参与病毒进入目标细胞的细胞质中。这表明最少有一个中和抗原决定子与PRRSV GP相联系。由于PRRSV GP只是部分连接在脂质外壳上而不是大量出现在病毒子中(Mardassi H.，等人，(1996).Virology 221，98-112；Meulenberg J.J.M，等人，(1995).Virology 206，155-163)，这表明GP是大部分康复期中的猪只血清所识别的主要病毒外壳醣蛋白(Meulenberg JJ.M，等人，(1995).Vrology 206，155-163；Nelson E.A.，等人，(1993).J Clinical Mcrobiology 31，3184-3189)。在ORF6基质蛋白的例子Bautista(Bautista E.M.，等人(1999).Archives ofVirology 144，117-134)展示了相比其他PRRSV的多肽，体外ORF6产物的刺激能引起较大的T细胞增殖反应。这表明基质蛋白能在预防PRRSV的细胞介导免疫中发挥主要作用。基质多肽基因是所有接受测试的PRRSV病毒株重罪稳定的基因(Kapur V.，等人，(1996).J GeneralVirology 77，1271-1276；Meng X.J.，等人，(1995).Archives of Vrology 140，745-755；Meng X.J等人，(1995).J General Virology 76，3181-3188；Meng X.J.，等人，(1996).JGeneral Virology 77，1265-1270；Meng X.J.，等人，(1994).J General Virology 75，795-801；Murtaugh M.P.，等人，(1995).archives of Vrology 140，1451-1460)，这表明此多肽的结构对PRRSV的积聚有重要作用。PRRSV的基质蛋白因此被选取作为本发明所示范的接种疫苗。
地域性PRRSV病毒株中编码ORFs 5和6的基因组区域被选取并复制到不如类动物表达载体pcDNA3.1(+)上，从而建造DNA疫苗。在人类巨细胞病毒启动子的控制下，使用能编码PRRSV的GPS或ORF 6的DNA免疫能在Balbfc小鼠及其的猪只中诱导抗GP5中和抗体或ORF6特定抗体。GP5蛋白的中和血清特异型能通过蛋白印迹法、ELISA以及中和测试来确定。结果表明地域性PRRSV病毒株的中和表位只存在于病毒外壳醣蛋白中。
如ELISA测试所示，与ORF5质粒架构结合的天然细菌能产生高水平的抗体。另外，用流式细胞仪能在已接种的小鼠和猪只中侦测到细胞免疫反应，并测量T细胞(CD4+和CD8+)增加的数量。与天然细菌结合ORF5质粒架构被证明能被使用作为预防地域性PRRSV的疫苗。
A.动物
从香港大学动物中心购买的7周大的雄性Balb/c小鼠被分装在笼子中，每只笼子有5只小鼠。将这些小鼠随机分为7个实验组别。从广州华南农业大学兽医学系饲养的猪只中取得8只5周大已断奶的猪只。这些猪只在测试后被证明对PRRSV呈阴性。本实施例使用的猪只被随机分为4组。
B.病毒
广州地区的PRRSV病毒株初始时是从广州被PRRSV感染的猪只组织中提取的，然后放在一种能允许PRRSV进入的MA-104细胞复制物MARC-145中繁殖(Kim H.S.，等人，(1993).Archives of Virology 133，477-483)。如先前所述，使用每毫升50(TCID50)的剂量用组织培养基表达病毒滴定(Dea S.，等人，(1992).Canadian Veterinary Journal 33，801-808)。
C.重组架构
如上所述，从PRRSV AV株感染的MARC-145细胞中提取感染病毒(Mardassi H.，等人，(1995).Archives of Virology 140，1405-1418)。根据美国株VR-2332的基因组序列，能设计出可以促使PRRSV ORFs 5和6复制的寡核苷酸引物。ORF5区间的HindIll或Xbal限制性内切位点(RE)和ORF6区间的BamHI或EcoPJ被融合进引物的5’端上。ORF 5和ORF 6区间被首先复制到TA-复制载体上(
Figure BDA0000142533540000871
-T和
Figure BDA0000142533540000872
-T简易载体系统Promega)，并随后被直接加入到特定的pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen)RE部位上，并且导致pcDNA3.1-ORFs 5和6架构的产生。然后通过排序确认所述重组架构，并且被放进大肠杆菌株中。将细菌培养基的沉淀烘干，并且用超声波降解，从而可被用作给动物注射。
D.重组蛋白的瞬间表达
在作为合流单层的HEIR-293细胞中通过瞬间表达测试pcDNA3.1(+)-ORF 5或6架构的体外表达。使用脂质体令5pg的质粒DNA感染在6孔组织培养板上的细胞。然后将细胞放于37摄氏度中，并用37％福尔马林在室温下浸泡15分钟，并在感染后(18-72小时)浸泡数次，从而进行免疫荧光染色。然后将单层与抗-PRRSV多克隆抗体反应1小时(NationalVeterinary Services Laboratories，Ames，IA)并且随后用结合FITC二级抗体检验免疫反应(Zymed)。
用免疫荧光染色能侦测扩大后的ORF 5和ORF 6的瞬间表达。蛋白质产物能在感染后72小时在HEIR-293细胞中表达。猪抗PRRSV血清则可被用来鉴别蛋白质产物。带有FITC结合物的二级抗体。在荧光显微镜下能看到绿荧光信号。受感染的细胞在使用多克隆抗体后能展示出明显的同源细胞质反应，并且所表达的蛋白质倾向于在核区周围积聚。为确认所表达的蛋白质为PRRSV外壳蛋白和基质蛋白，应进行使用猪抗PRRSV血清的Western免疫印迹测试，并能观察到分别代表外壳蛋白和基质蛋白的特定蛋白条纹，且大小为26kDa和19kDa。
E.小鼠接种程序
pcDNA3.I-ORF 5或6的体内表达能通过带有500μg ORF 5或ORF 6架构或100μgORF架构的5只Balb/c小鼠来检验。将100微克的各個架构或細菌混合50或10微克的ORF 5架构質粒，用250微升的PBS冲淡，然後用27號針把DNA注入脛骨顱肌。在两周中用等量的DNA向小鼠增强药效2次。对照组的小鼠以相同的方式服用100μg的pcDNA3.1(+)。
在注入DNA后，通过ELISA和所表达的蛋白质免疫印迹法能确定小鼠血清针对GP5或ORF6的蛋白特异型。在ELISA中预防PRRSV抗原的抗体在接种后被验得多次呈阳性，这表明已产生体液免疫反应。一般来说，特定针对PRRSV的抗体在所有小鼠第一次增强药效后(day0)已经增加。到第14天，进行第二次增强药效。对于被注射DNA质粒的组别，抗体滴定量在接种后(PI)的第21天达至最高值，并且随后开始下降。但对于注射了带有等量质粒的天然细菌的组别，抗体滴定量在PI的第14天达至最高值，并且随后维持在高水平。使用第35天的小鼠血清进行血清中和测试。将pcDNA3,1-ORF 5注入到4只小鼠中的3只的血清中，并且所述3只小鼠中其中1只被注入pcDNA3、l-ORES和pcDNA3.1-ORF6的混合物，并和5只小鼠的其中4只带有等量质粒的天然细菌pcDNA3.1-ORF的小鼠一起在PI的第35天进行体内中和试验。在注射了pcDNA3,1-ORF 6的小鼠体内、或注射了载体的对照物的血清中和接种前的血清中都未能观察到任何中和反应，这些结果表明PRRSV中和抗体能特定地针对由PRRSV ORF5编码的蛋白质表位。
F.猪只免疫程序
每个组别中各取两只猪只并在两周中进行三次注射，注射物为100μg ORF 5质粒架构或带有等量溶解于5ml PBS的100μg或500μORF5质粒架构天然细菌；让3号猪只和4号猪只服用100对照组载体peDNA3.1；让5号猪只和6号猪只服用带有100μg等量ORF5质粒的天然细菌；并且让7号猪只和8号猪只服用带有500μg等量ORF5质粒的天然细菌。对照组的猪只则通过相同的方式服用100μg pcDNA3.1(+)载体。使用22号针头将总量的3分之2注射到小腿胫骨肌肉中，并且将3分之1通过皮内注射注射到耳背中。在开始观察前的一天增强药物的疗效，然后在第14天进行第二次药效增强，并在第28天进行第三次药效增强。接种前和高免疫血清以及血液淋巴细胞是在每次质粒注射前从小鼠和猪只身上提取的，从而评估它们的免疫反应。
通过ELISA在猪只中进行血清转换，并通过免疫印迹法在接种后的35天后将猪血清的蛋白特异型转换为GP5。所有猪只都在接种后产生出抗体，但与只注射了ORF5质粒架构(第1-2号猪只)的猪只相比，注射了带有ORF 5等量质粒的天然细菌的猪只(第5-8号猪只)则展示出更强的抗体反应。每只猪都可能对疫苗产生有差异的反应，但第6号和第7号猪则在第3次药效增强后更快地产生抗体，但只有第7号猪能维持高抗体水平大约两个星期，然后才开始下降。仅在第二次药效增强注射的两周后，接受DNA接种的猪只的血清便能被侦测到中和抗体，并且体内的中和反应仍然持续直至实验结束。因此，这里示范了在另一种动物模型(例如猪只)中，DNA疫苗产生体液免疫的反应的能力。
G.病毒中和以及血清学试验
在某些情况下，作为疫苗接种，需要服用带有抗原的佐剂从而提高正常的免疫反应。佐剂能提高身体针预防原的免疫反应。至今已有大量的化合物被用作佐剂。在病毒片断中，如果给予和抗原一样的时间，内毒素也能增强抗体的形成。它们不会拖延的超敏性，但它们能破坏耐药性，并且具有一般的刺激活性。而外毒素则能刺激白细胞介素-1的巨噬细胞的产生。因此，使用天然细菌作为佐剂能在抗原特定的血清和抗体反应中产生促进作用。为了确定抗-ORF 5和抗-ORF 6蛋白质单克隆抗体能否中和病毒的感染力，可以在MARC-145细胞中，并且在带有106.4kD的病毒的情况下进行病毒中和测试。
在注入DNA后，再病毒中和测试检测抗体前，通过ELISA和免疫印迹方法能观察到每个动物所产生的体液免疫反应。相比其他测试，病毒中和测试则没有那么敏感；它不会被循环的免疫复合物所影响，或者抗体可能直至之后的首次感染也没有出现。同样，与病毒中和相关的抗原表位可能只是病毒蛋白中众多抗原的一种。因此，免疫印迹测试能在中和抗体的出现前侦测到抗体。
通过病毒中和(VN)、ELISA和Western免疫印迹方法检测小鼠和猪只的血清中是否存在特定抗GP5或ORF6抗体。将100 l病毒的稀释系列(1064kD50)与已被热灭活的50倍稀释测试血清放在37摄氏度下60分钟，从而进行VN测试两次。将混合物与先前已放置在96孔板中48小时的MARC-145细胞的汇合单层相接触。然后将细胞单层放在37摄氏度下，并每天观察细胞病变效应(CPE)的出现。减去最高log 10病毒滴定稀释值的倒数便能得住中和指数，从而证明从非免疫的对照物血清log10中没有测试血清的CPE。使用PRRSV抗体测试(IDEXXHERDCHEK_PRRS，Westbrook，ME)通过ELISA以及使用ORF5表达的蛋白质作为抗原通过Western blot(Pirzadeh B，and Dea S.(1997).J General Vrology 78，1867-1873)能监测每个动物中的体液免疫测试(Pirzadeh B，and Dea S.(1997).J General Vrology 78，1867-1873)。
此处示范了通过将带有或不带有天然细菌的DNA质粒简单注射入小鼠以及其宿主，从而在体内表达外源蛋白。针对PRRSV的循环抗体在PI的第14天中在第一次药效增强后可由ELISA测得，然而ELISA仍然能在整个抽样过程中侦测到抗体。有趣的是，这些注射了天然细菌的动物组别，作为佐剂，它们具有较高的抗体水平，并且能在第二次药效增强后稳定地维持在高水平，而非如其他只注射了质粒的组别中开始下降。在接种了DNA的小鼠和猪只中，与接种了天然细菌ORF5的动物相比，抗体的低滴定量能被解释为所注射的抗原能被B细胞及其他能刺激强烈抗体反应的抗原细胞吸收。
这些结果表明，在ORF5编码的蛋白质而非ORF6编码的蛋白质上存在中和表位。PRRSV的ORF 5已被描述为能在猪只和Balb/e小鼠中激发中和抗体(Pirzadeh B.和Dea S.(1998).J General Virology 79，989-999)。值得注意的是，中和抗体只能使用PRRSV蛋白上的构象中和标为来侦测。poDNA3.I-ORF5和ORF6DNA架构具有在哺乳类动物细胞中表达的优点，所述哺乳类动物细胞能模仿合适的病毒蛋白构象。这些架构因此具有在宿主动物中驱动抗原制造的能力，从而导致能以相关和预防性的方式识别自身PRRSV抗原的免疫反应(Kwang J.，反应，(1999).Research in Veterinary Science 67，199-201)。
H.对外周血淋巴细胞(PBL)的流式细胞分析
外周血淋巴细胞是从肝素化血中提取的。使用PYREX硼硅即用即弃的玻璃培养管(CORNING，NEW YORK)将0.2ml新鲜血液加入到5ml新鲜制备的红血细胞裂解缓冲剂中(0.8％氯化铵、0.083％碳酸氢钠以及0.003％不含EDTA的酸，pH值为7.3)，直至红血细胞彻底裂解。然后以2000rpm进行离心2分钟，从而取得淋巴细胞。用1ml 1x磷酸盐缓冲液通过2分钟2000rpm的旋转和自旋清洗淋巴细胞。然后用合适的FITC结合的CD4或R-PE结合的CD8a(BD PharMingen)以推荐的浓度(1μg per 1x106细胞)在黑暗中为淋巴细胞染色1小时，并同时摇匀。在启动流式细胞(EPICS ELITE ESP COULTER)分析前，将0.5ml清洗缓冲剂(0.1％叠氮化钠、在1X1％磷酸盐缓冲液PBS中的牛血清白蛋白BSA)加入到每支试管中至一致的容量。每个样本至少分析了5000个细胞。
通过估计CD4+和CD8+T细胞在小鼠接种后不同时间所增加的数量能计算得到DNA疫苗诱导细胞介导免疫(CMI)反应的能力。为测量CD4+，在第0和14天进行药效增强。针对用对照DNA质粒接种的小鼠，淋巴组织增生的分量可被忽略不计。83％的受接种小鼠产生细胞介导免疫反应。最突出的是CD4+T细胞百分比的改变，所述百分比在PI第14天的和25天的最高值百分比相比观察前的一天(day0)的水平高出约为50％和42％，都比观察前的一天(day0)的水平高。然而CD8+T细胞的百分比则在PI第14天和第28天分别相比第0天的水平高出约52％和37.5％。
在PI第14天，第5组小鼠注射了能引起两种T细胞的百分比强烈增加的两种架构混合物。在注射了ORF架构的第4组小鼠中也出现了T细胞的高百分比。这些结果表明了ORF6蛋白引起高T细胞繁殖反应的能力。
在猪只中，在第0、14和28天对涉及测量CD4+进行药效增强。在生长中的猪只中，外围T细胞的数量在接种后(PI)的第14天，除了在1号猪的CD8+T细胞数量外，全部瞬间下跌。针对T细胞数量的总趋势进行更进一步的分析，发现CD4+T细胞数量伴随CD8+T细胞数量的减少而增加，反之亦然。这一观察现象在1号和2号猪只中最为明显。CD8+T细胞数量的下降(一种细胞毒性T细胞标识物，能识别被病毒侵染的细胞)持续了至少3个星期，然而CD4+细胞的数量(包括免疫记忆中的T-辅助细胞)则上升，不同的猪只在第28-42天达到最高峰。由于该结果没有出现在小鼠的实验中，因此该结果可能可以确定PRRSV能抑制其宿主免疫系统的能力。
猪T细胞另外一个特点包括T细胞亚群的CD4/GD8比例的逆转，例如在猪只中，CD8+T细胞的数量高于CD4+T细胞，但在人类和小鼠中则相反。另外，由于存在大量的CD4+CD8+双重表达外周血T细胞，猪只的T细胞数量是唯一的，双重表达细胞的百分比同时随猪只年龄的增加而增加。在双色流式细胞分析仪中评估该结果。
通过估计个别T细胞的数量，例如CD4+和CD8+T细胞，使用DNA架构在体内引起CMI反应。在小鼠中DNA架构的接种过程中，在外周血中出现大量CD4+T细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的流入。这一发现表明在初级接种时外周血中的细胞毒性细胞是具有保护作用的。细胞毒性T细胞在受感染的细胞裂解过程中仍然能保持活性，并因此防治病毒的传播(SamsomJ-N.，等人，(2000).J General Virology 497-505)。
另外，这种细胞已经被证明能通过制造干扰素-y的制造调节细胞免疫力，而CD4+T细胞则被认为能引起抗体反应。
在另一方面，在生长中的猪只中，外周血T细胞的数量在接种后的第14天出现瞬间的下降。在整个抽样的过程中，在年幼的猪只中，CD4+细胞数量增加并且CD8+细胞数量减少，反之亦然。在二级暴露后繁殖反应的上升归因于CD4+细胞。至今已经有很多理论被提出从而解释PRRSV可以改变T细胞亚型的数量。在其他病毒能引起CD4+T细胞的死亡时，CD8+能同时产生的刺激或病毒可被视为T细胞在胸腺内的变异(Drew T.W.(2000).VeterinaryResearch  31，27-39)。Shimizu(Shimizu M.等人，(1996).VeterinaryIrrrnrunologicalImrrrunopathology 50，19-27)指出PRRSV侵染的结果便是引起CD8+细胞的繁殖。根据这一发现，PRRSV ORF5区域具有在被侵染的细胞的凋亡作用(Suarez P.，等人，(1996).J Virology 70，2876-2882)。
PRRSV能在宿主中引起免疫抑制。CD8+细胞毒性T细胞是否与PRRSV的ORF5区域的凋亡能力相关仍然是未知之数。凋亡是正常免疫系统中的重要过程。因此，CD8+T细胞在目标细胞上细胞毒性作用的灭亡是由凋亡来调节的。小鼠和猪只接种后在T细胞中不同的反应表明了在不同的宿主中同源病毒的致病性亦有所差异。
与其它动物一样，猪只在它们的外周血和二级淋巴器官中带有典型的CD4+CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞。这些细胞被证明带有辅助和细胞毒性功能。然而，与人类和小鼠不同的是，猪只亦带有突出的CD4/CD8双阳性(DP)淋巴细胞数量，含有8％至64％的循环T淋巴细胞(Zuckennann F.A-(1999)Veterinary Immunology and Immunopathology 72，55-66)。这些在猪只外周血中淋巴细胞亚型的相对数量和绝对数量都随年龄的增长而增加。这一细胞数量意味着独立的细胞系与成熟的CD4或CD8单阳性细胞无直接联系。然而，双阳性细胞能代表它所获取的的记忆CD4+T辅助淋巴细胞，保留致敏後轉回淋巴細胞的CD8抗原这些都是能产生抗体的辅助B细胞。并由于在较年长的猪只中DP细胞占多数，而且CD4和CD8的同时表达有利于识别抗原，它们被认为在保护型免疫中起重要作用。
本实施例展示出使用变码PRRSV GP5的DNA质粒接种能在小鼠及其自然宿主中引起体液和细胞介导免疫力。因此，ORF5可以作为预防地域性PRRSV的重组型疫苗的候选材料。然而，最近公布的北美与欧洲病毒株的ORF5基因组差异(Mardassi H.等人，(1995).Archives of Vriology 140，1405-1418)表明这些差异可以被用来评估本发明的疫苗制造所产生的保护中的抗原确定子。
在呼吸道感染病毒后，DNA接种并不足以抑制病毒(Pirzadeh B.和Dea S.(1998).J General Virology 79，989-999)。并且粘膜免疫力被认为在预防PRRSV感染、抵抗及抑制病毒中起重要作用，因此对这方面预防PRRSV的免疫进行了评估。因此，开始尝试研发针对PRRS的多价DNA疫苗以及相关的在另一个PRRSV抗原ORF5下的血清测试，并取得初步的体液免疫反应。最近，亦研发了具传染性的复制物(Meulenberg J.J，M.等人，(1998).JVirology.72，380-387)并且它被认为能在特定部位变异并从而引入一个标识物或降低毒性，因而研发出一种安全且有效的病毒标识疫苗。
实施例10
能预防两种病原体的双价疫苗的示范
本实施例描述了能有效对抗两种病原体的双价疫苗。如本领域的一般技术人员所理解，本发明的双价或多价疫苗能根据此处描述的方法通过现代的分子克隆技术制得。
喉气管炎病毒(ILTV)是一种能引起鸡只严重上呼吸道疾病的DNA疱疹病毒。传染性支气管炎病毒(IBV)是冠状病毒的一员，是一种单链RNA病毒。它们具有高度的物种特异型，而且两种病毒若不加以控制，都能导致家禽业重大的经济损失。在本发明的一个实施方案中，创造了一种能对抗这两种病毒的双价疫苗。通过从ILTV基因组中删除TK基因，并加入来自IBV基因组的SI基因，从而制造出一种重组疫苗。通过使用重组ILTV-IBV架构改造鸡胚胎的肾细胞，从而产生重组病毒。重组病毒被证明能在鸡只中引起预防ITLV和IBVR的免疫力。所述疫苗能在水和/或喷雾中服用。
参考文献
1.World Health Organization.Cumulative number of confirmed human cases of avianinfluenza A/(H5N1)
(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2008_06_19/en/index.html).
2.Bresson JL，Perronne C，Launay O，et al.Safety and immunogenicity of aninactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004(H5N1)vaccine：phase Irandomised trial.Lancet 2006；367：1657-64.
3.Lin J，Zhang J，Dong X，et al.Safety and immunogenicity of an inactivatedadjuvanted whole-virion influenza A(H5N1)vaccine：a phase I randomised controlledtrial.Lancet 2006；368：991-7.
4.Treanor JJ，Campbell JD，Zangwill KM，Rowe T，Wolff M.Safety andimmunogenicity of an inactivated subvirion influenza A(H5N1)vaccine.N Engl J Med2006；354：1343-51.
5.Treanor JJ，Wilkinson BE，Masseoud F，Hu-Primmer J，Battaglia R，O’Brien D，et al.Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans.Vaccine2001；19(13-14)：1732-7.
6.Kodihalli S，Goto H，Kobasa DL，Krauss S，Kawaoka Y，Webster RG.DNA vaccineencoding hemagglutinin provides protectivebimmunity against H5N1 influenza virusinfection in mice.J Virol 1999；73(3)：2094-8.
7.Chen Z，Yoshikawa T，Kadowaki S，Hagiwara Y，Matsuo K，Asanuma H，et al.Protection and antibody responses in different strains of mouse immunized withplasmid DNAs encoding influenza virus haemagglutinin，neuraminidase andnucleoprotein.J Gen Virol 1999；80(Pt 10)：2559-64.
8.Peggy A.Lalor，Richard J.Webby，Jane Morrow，Denis Rusalov，David C.Kaslow，Alain Rolland.and Larry R.Smith.Plasmid DNA-Based Vaccines Protect Mice andFerrets against Lethal Challenge with A/Vietnam/1203/04(H5N1)Influenza Virus.TheJournal of Infectious Diseases 2008；197：1643-1652.
9.Gao W，Soloff AC，Lu X，Montecalvo A，Nguyen DC，Matsuoka Y，et al.Protectionof mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-basedimmunization.J Virol.2006；80(4)：1959-64.
10.Epstein SL，Kong WP，Misplon JA，Lo CY，Tumpey TM，Xu L，et al.Protectionagainst multiple influenza A subtypes by vaccination with highly conservednucleoprotein.Vaccine 2005；23(46-47)：5404-10[Epub 2005 Jun 13].
11.Tompkins SM，Zhao ZS，Lo CY，Misplon JA，Liu T，Ye Z，et al.Matrix protein2 vaccination and protection against influenza viruses，including subtype H5N1.Emerg Infect Dis 2007；13(3)：426-35.
12.Toro H，Tang DC，Suarez DL，Sylte MJ，Pfeiffer J，Van Kampen KR.Protectiveavian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector.Vaccine 2007；25(15)：2886-91[Epub 2006 Sep 25].
13.Ke-Qin，Yuka Hoshino，Yoshihiko Toda，et al.Immunogenicity and protectiveefficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactis expressingsurface-bound HIV Env.Blood.2003
14.Robinson K，Chamberlain LM，Schofield KM，Wells JM，Page RWF.Oral vaccinationof mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis.Nat Biotechnol.1997；15：653-657.
15.Gilbert C，Robinson K，Le Page RWF，Wells JM.Heterologous expression of animmunogenic pneumococcal type 3 capsular polysaccharide in Lactococcus lactis.Infect Immun.2000；68：3251-3260.
16.Hirt H，Erlandsen SL，Dunny GM.Heterologous inducible expression ofEnterococcus faecalis pCF10 aggregation substance Asc10 in Lactococcus lactis andStreptococcus gordonii contributes to cell hydrophobicity and adhesion to fibrin.J Bacteriol.2000；182：2299-2306.
17.Hee-Jeong Cho，Hye-Jeong Shin，In-Kwon Han，et al.Induction of mucosal andsystemic immune responses following oral immunization of mice with Lactococcuslactis expressing human papillomavirus type 16 L1.Vaccine，2007；17：607-616.
18.Read RC，Naylor SC，Potter CW，Bond J，Jabbal-Gill I，Fisher A，et al.Effectivenasal influenza vaccine delivery using chitosan.Vaccine 2005；23：4367-74.
19.Lavelle EC.Lectins and microparticles for enhanced oral vaccination.Methods2006；38：84-9.
20.Davis SS.The use of soluble polymers and polymer microparticles to provideimproved vaccine responses after parenteral and mucosal delivery.Vaccine2006；24(Suppl.2)：S7-10.
21.Katz JM，Lu X，Young SA，et al.Adjuvant activity of the heat-labileenterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli for oral administration ofinactivated influenza virus vaccine.J Infect Dis 1997；175：352-63.
22.Lu XH，Tumpey TM，Morken T，et al.Amouse model for the evaluation ofpathogenesis and immunity to influenza A(H5N1)viruses isolated from humans.J Virol1999；73：5903-11.
23.Suguitan AL Jr，McAuliffe J，Mills KL，Jin H，Duke G，Lu B，Luke CJ，MurphyB，Swayne DE，Kemble G，Subbarao K.Live，attenuated influenza A H5N1 candidatevaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets.PLoS Med.2006Sep；3(9)：e375.
24.Steensels M，Van Borm S，Lambrecht B，De Vriese J，Le Gros FX，Bublot M，vanden Berg T.Efficacy of an inactivated and a fowlpox-vectored vaccine in Muscovyducks against an Asian H5N1 highly pathogenic avian influenza viral challeng.AvianDis.2007Mar；51(1 Suppl)：325-31.
25.Hoelscher MA，Garg S，Bangari DS，Belser JA，Lu X，et al.Development ofadenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distincthuman H5N1 strains in mice.Lancet.2006；367：475-481.
26.David H.Holman，Danher Wang，Nicholas U.Raja，Min Luo，Kevin M.Moore，JanWoraratanadharm，Nutan Mytle，John Y.Donga，Multi-antigen vaccines based on complexadenovirus vectors induce protective immune responses against H5N1 avian influenzaviruses.Vaccine(2008)26，2627-2639.
27.Peggy A.Lalor，Richard J.Webby，Jane Morrow，Denis Rusalov，David C.Kaslow，Alain Rolland，and Larry R.Smith.Plasmid DNA-Based VaccinesProtect Mice and Ferrets against Lethal Challenge with A/Vietnam/1203/04(H5N1)Influenza Virus.The Journal of Infectious Diseases 2008；197：1643-1652.
28.Ge，Q.，McManus，M.，Nguyen，T.，Shen，C.-H.，Sharp，P.A.，Eisen，H.N.，Chen，J.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA fordegradation and indirectly inhibiting all viralRNA transcription.Proc.Natl.Acad.Sci.2003；100：2718-2723.

Claims (15)

1.一种能在受试者体内对抗原引起免疫反应的组合物，所述组合物含有能表达抗原的转基因细菌或植物。
2.权利要求1的组合物，所述细菌能被制备进微胶囊中。
3.权利要求1的组合物，所述植物为可食用植物，形式可为植物整体，植物部分或植物提取物。
4.权利要求1的组合物，所述植物为拟南芥。
5.权利要求1的组合物，所述的抗原为细菌抗原或病毒抗原。
6.权利要求1的组合物，所述细菌含有能表达所述抗原的DNA。
7.权利要求1的组合物，所述细菌属于乳球菌属。
8.权利要求1的组合物，所述抗原为禽流感H5N1病毒的血凝素。
9.权利要求1的组合物，所述抗原能和粘膜细胞膜表面的糖化分子结合。
10.权利要求1的组合物，所述抗原为嵌合蛋白。
11.一种在受试者体内针对抗原引起免疫反应的方法，所述方法包含受试者服用权利要求1所述的组合物的步骤。
12.权利要求11的方法，所述免疫反应为体液免疫反应、粘膜免疫反应或保护性免疫反应。
13.权利要求11的方法，所述的组合物以口服的方式服用。
14.权利要求1的组合物作为在受试者体内引起免疫反应的药物。
15.使用权利要求1的组合物来制备能在受试者体内引起免疫反应的药物。
CN2010800404490A 2009-07-13 2010-07-13 使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗 Pending CN102639702A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22497309P 2009-07-13 2009-07-13
US61/224,973 2009-07-13
US26321509P 2009-11-20 2009-11-20
US61/263,215 2009-11-20
PCT/US2010/041792 WO2011008735A1 (en) 2009-07-13 2010-07-13 Oral vaccines produced and administered using edible micro-organism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102639702A true CN102639702A (zh) 2012-08-15

Family

ID=43449728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800404490A Pending CN102639702A (zh) 2009-07-13 2010-07-13 使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20120171230A1 (zh)
EP (1) EP2454374B1 (zh)
JP (1) JP2012532933A (zh)
CN (1) CN102639702A (zh)
WO (1) WO2011008735A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109718369A (zh) * 2019-02-26 2019-05-07 海南大学 益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服dna疫苗的制备及应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012072788A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Mab-Factory Gmbh Vaccine against influenza h5n1 viruses, medicament and treatment of h5n1 viral infections
ES2438690B1 (es) * 2012-06-15 2015-01-16 Fundació Institut Per A La Investigació En Ciències De La Salut "Germans Trias I Pujol" (Igtp) Unitat De Tuberculosi Experimental Micobacterias inactivadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis
US10617751B2 (en) 2017-07-13 2020-04-14 VisionTech International Limited Edible vaccines expressed in yeast for preventing and treating infectious diseases in animals and humans
CN113271983A (zh) 2018-10-30 2021-08-17 生命剂量公司 治疗性的哺乳动物细胞的口服递送

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040101531A1 (en) * 2002-04-16 2004-05-27 Roy Curtiss Immunogenic compositions and vaccines comprising carrier bacteria that secrete antigens
US20040234548A1 (en) * 2000-04-06 2004-11-25 Caplan Michael J. Microbial delivery system
CN1646020A (zh) * 2002-01-31 2005-07-27 圣必健公司 将核酸和/或蛋白质导入呼吸系统的方法与制剂
US20080124355A1 (en) * 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5484719A (en) * 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
EP1230257A4 (en) * 1998-12-23 2003-08-13 Thompson Boyce Plant Res EXPRESSION OF IMMUNOGENOUS HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN TRANSGENIC PLANTS
DK2133092T3 (en) * 2007-03-19 2016-01-11 Morishita Jintan Co Oral vaccine

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040234548A1 (en) * 2000-04-06 2004-11-25 Caplan Michael J. Microbial delivery system
CN1646020A (zh) * 2002-01-31 2005-07-27 圣必健公司 将核酸和/或蛋白质导入呼吸系统的方法与制剂
US20040101531A1 (en) * 2002-04-16 2004-05-27 Roy Curtiss Immunogenic compositions and vaccines comprising carrier bacteria that secrete antigens
US20080124355A1 (en) * 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109718369A (zh) * 2019-02-26 2019-05-07 海南大学 益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服dna疫苗的制备及应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012532933A (ja) 2012-12-20
WO2011008735A1 (en) 2011-01-20
EP2454374A4 (en) 2013-02-20
EP2454374A1 (en) 2012-05-23
US20120171230A1 (en) 2012-07-05
EP2454374B1 (en) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. A review of vaccine development and research for industry animals in Korea
Aguirreburualde et al. Efficacy of a BVDV subunit vaccine produced in alfalfa transgenic plants
CN106554944B (zh) 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用
CN103849632B (zh) 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用
CN102971417B (zh) 自浣熊分离犬细小病毒-2相关病毒
US20130004547A1 (en) Oral vaccines produced and administered using edible micro-organisms including lactic acid bacterial strains
CN101603035A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株及其生产活疫苗的方法
CN102639702A (zh) 使用可食用的微生物制造及施用的口服疫苗
CN108823218A (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用
Vimolmangkang et al. Expression of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in soybean seed yields an immunogenic antigenic protein
CN109055412A (zh) 一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法
Li et al. Insights and progress on epidemic characteristics, genotyping, and preventive measures of PEDV in China: A review
CN103509761B (zh) 表达猪圆环病毒ⅱ型orf2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法
CN104628871B (zh) 一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗的制备
WO2003013598A2 (en) Novel vaccine compositions and methods of vaccine preparation for veterinary and human diseases
Jain et al. Edible transgenic plant vaccines for different diseases
CN104208666B (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN107338227B (zh) 牛副流感病毒pbiv3-b株及其应用
CN100435844C (zh) 大肠杆菌热不稳定毒素作为鸟类和家禽的佐剂的用途
CN107164252A (zh) 一种rhdv的亚单位疫苗
Jivani et al. Veterinary vaccines: past, present and future. A Review
CN104497148B (zh) 一种重组泛素化蓝耳病疫苗的制备
CN109517044A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体
Yousif et al. Oral administration of hyperimmune IgY: an immunoecological approach to curbing acute infectious bursal disease virus infection
Meyers Diseases with limited research of plant-based vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1174940

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120815

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1174940

Country of ref document: HK