CN115697398A - 包含两种不同rna复制子颗粒的甲型猪流感病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一和第二RNA复制子颗粒的免疫原性组合物。第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV‑S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列。第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984‑样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，且第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原。第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV‑S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列。第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994‑样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，且第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原。在其他实施方案中，本发明涉及可用于抵抗甲型流感病毒感染且包含免疫原性组合物的疫苗。进一步提供了制备疫苗的方法和疫苗的用途。

Description

包含两种不同RNA复制子颗粒的甲型猪流感病毒疫苗
本发明涉及包含第一和第二RNA复制子颗粒的免疫原性组合物。第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列。第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，且第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原。第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列。第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，且第四HA抗原是欧亚类禽(Eurasian avian-like)H1avNl(EA)谱系的HA抗原。在其他实施方案中，本发明涉及可用于抵抗甲型流感病毒感染且包含免疫原性组合物的疫苗。进一步提供了制备疫苗的方法和疫苗的用途。
背景技术
甲型流感病毒(IAV)在世界范围内对人类和动物的健康造成重大负担。IAV基于病毒表面糖蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，被分为不同亚型。IAV感染家禽、猪、马、猫、狗、海洋哺乳动物(例如，鲸)、蝙蝠和人。野生水禽和岸鸟(鸭、鹅、天鹅和鸥)是天然储存宿主(reservoir)，它们可以被16种不同的HA和9种不同的NA亚型感染[Webster等，MicrobiolRev 56：152-179(1992)]。
甲型猪流感病毒(IAV-S)是一种世界范围内的严重的家猪呼吸道病原体，其已被证明造成巨大经济损失，特别是对畜牧业[Holtkamp等，The American Association ofSwine Veterinarians Annual Meeting(2007)]。它的特征在于呼吸疾病的突然发作，并且通常伴有厌食、嗜睡和发烧。除了生产动物中的与IAV-S相关的临床并发症之外，已发表的报告还表明猪会将流感病毒传播给人类[Myers KP,Olsen CW,Gray GC.Clin Infect Dis2007；44(8):1084–8,Krueger和Gray,Curr Top Microbiol Immunol 370:201-225(2013)]，这代表重大的公共卫生威胁，为控制猪群中的IAV提供了更大的动机。
针对这一问题，许多养猪户现在应用市售疫苗对其猪进行疫苗接种以抵抗IAV-S。但是，用常规疫苗控制IAV-S是困难的，因为许多不同的IAV-S毒株在田间共同传播并持续进化[Gao等，J Gen Virol 98(8):2001-2010(2017)]。IAV-S的多样性和可变性是由病毒的遗传结构引起的。与其他甲型流感病毒一样，IAV-S具有在8个RNA片段上编码的基因和引入频繁突变的基因组复制机制。这些遗传特征使得IAV-S能够进行快速适应，包括逃避由暴露先前的毒株诱导的现有中和抗体。因此，美国市场上可商购的灭活病毒IAV-S疫苗虽然包含多达5种不同的IAV-S毒株，但已被证明是不合适的，因为连续的抗原漂移和/或转移将产生新出现的毒株。
甲型流感病毒的分类开始于HA和NA的亚分型，它们是病毒表面上的两种主要糖蛋白。HA蛋白介导病毒与宿主细胞的附着和融合。神经氨酸酶是在流感病毒复制周期的最后阶段起作用的酶，其通过裂解由宿主细胞新形成的病毒颗粒，从而使新的子代病毒能够传播并感染其他细胞。最近的研究表明，NA免疫相对于更关键的HA免疫仅能发挥补充和/或互补作用[Nayak等，J Virol 84(5):2408-2420(2010)；Pavlova等，Vaccine 27(5):773-785(2009)；Sylte等，Vaccine 25(19):3763-72(2007)]。实际上，似乎在不存在血凝素抗原的情况下，神经氨酸酶甲型流感病毒疫苗的效力不足以预防甲型流感病毒感染或预防甲型流感病毒诱发的疾病。
尽管人甲型流感通常具有在给定流感季节期间全球传播的1或2个优势毒株，但是更多的IAV-S毒株同时共同传播，这些毒株在地理区域之间不同。类似地，IAV-S毒株也是抗原性可变的，但主要包含HA的H1或H3亚型和NA的N1或N2亚型。在IAV-S的每个HA和NA亚型内存在进一步的系统发育多样性。
美国猪群中存在H1的四种主要系统发育簇(γ、δ1、δ2、大流行)、H3的两种主要簇(IV簇和人样簇)、N1的两种主要簇(经典、大流行)和N2的两种主要簇(N2-1998和N2-2002)。[参见，Anderson等，Influenza and other Respiratory Viruses 7(Suppl.4)；42-51(2013)；和Anderson等，mSphere 1(6)e00275-16:1-14(2016)]。
欧洲存在H1的三种主要谱系(欧亚类禽H1、Scotland/410440/1994-样H1和2009大流行样H1)、H3的一种主要主要谱系(Gent/1/1984-样H3)、N1的两种主要谱系(欧亚类禽N1、2009大流行样N1)、N2的两种主要谱系(Gent/1/1984-样N2、Scotland/410440/1994-样N2)和N2的两种次要谱系(Italy/4675/2003样N2、人季节性样N2)[Watson等，J.Virol.,89:9920–9931(2015)；doi:10.1128/JVI.00840-15]。
针对IAV-S的疫苗接种代表了减少猪的临床并发症以及降低从猪到人的另外的重配和动物传染病传播的机会的最佳选择。直到最近，唯一可广泛使用的疫苗是由在鸡胚中生长的流感病毒制备的灭活疫苗，但是它们的供应在很大程度上受到缺乏特定无病原体卵的限制，由此大家公认需要流感疫苗的新制备方法。
对于常规的灭活病毒IAV-S疫苗，病毒株的选择基于HA抗原特性。诱导HA抑制(HI)抗体滴度的IAV-S疫苗保护猪免受抗原性类似毒株的实验性感染[Kyriakis等，VetMicrobiol 144(1-2):67-74(2010)]。但是，HA基因的相对快速的遗传漂移允许不受疫苗诱导的HA抗体功能性抑制的新毒株出现。
因此，市售的疫苗通常不能与预防新的和新出现的病毒亚型/簇，而针对异源亚型攻击仅提供有限的保护，因为抗原不匹配在该领域中传播的所有当代毒株[Lee等，Can JVet Res 71(3):207-12(2007)；Vincent等，Vaccine 28(15):2782-2787(2010)]。因此，此类疫苗必须定期更新以匹配当前传播的毒株。
因此，本领域需要开发新的IAV-S疫苗，其是安全、有效的，并且可以快速改变以抗原性匹配新出现的毒株。
因为大多数病毒，例如流感病毒，是相对简单的结构，使用来自其抗原谱的单一抗原有时足以产生保护性免疫反应。这种亚单位疫苗可通过从病毒或其培养物中提取，或通过特定抗原的重组表达来制备。或者，病毒抗原可通过作为载体的活重组载体微生物递送至靶动物并在其中表达。载体可以是活的减毒的或灭活的。多年来，许多基于载体的策略已被应用于疫苗，以努力抵抗某些病原体。
使用病毒载体疫苗的变化是基于复制子颗粒的使用[RP；参见Lundstrom,2014,Vaccines,vol.6,p.2392-2415]。这些是病毒样颗粒，但包含缺陷型病毒基因组和典型的异源基因。这些复制子颗粒通常包含包装于颗粒中的RNA(即，它们被衣壳包封)，使得它们能够进入靶动物宿主细胞并进行一轮病毒基因组扩增，而不具有形成新颗粒的能力。复制子颗粒不从受感染的细胞中繁殖，因为它缺乏必需的结构蛋白编码序列。因此，相比于其他复制子疫苗(例如裸RNA疫苗)或包含由DNA质粒产生的RNA的疫苗，它们更类似于野生型病毒(例如在向性方面)。
RP的基因组通常表达编码免疫保护性抗原的异源基因。使用最广泛且研究最广泛的是甲病毒属RNA复制子颗粒[Vander Veen等，2012,Anim.Health.Res.Rev.,vol.13,p.1-9；和Kamrud等，2010,J.Gen.Virol.,vol.91,p.1723-1727]，因此出于实践原因其是优选的，并且其已经通过用异源基因替换结构蛋白基因由病毒基因组获得。当所得的RNA(称为复制子)被引入宿主细胞的细胞质中时，它们能够指导它们自己的复制并表达高水平的异源基因。由于这些复制子缺乏甲病毒属结构蛋白基因，它们不能形成病毒体并扩散到相邻细胞。但是，通过将复制子引入至以反式提供结构蛋白的细胞中，它们可以被有效地包装至病毒复制子颗粒(RP)中[Pushko等，1997,Virology,vol.239,p.389-401]。
而且，甲病毒属RP被认为是比本领域已知及基于其他病毒(例如布尼亚病毒)的其他RP更强的免疫增强剂。几种甲病毒属种类已被用于开发RP疫苗，例如：委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)[Pushko等，1997,Virology,vol.239,p.389-401]、辛德毕斯病毒[Bredenbeek等，1993,J.of Virol.,vol.67,p.6439-6446]、和塞姆利基森林病毒[Liljestrom&Garoff,1991,Biotechnology(NY),vol.9,p.1356-1361]。
RP疫苗可在靶动物免疫接种后引发粘膜和全身免疫反应[Davis等，2002,IUBMBLife,vol.53,p.209-211]。基于VEE的RP疫苗也是几种USDA许可的疫苗的基础，包括：猪流行性腹泻疫苗，RNA(产品货号19U5.P1)；猪流感疫苗，RNA(产品货号19A5.D0)；禽流感疫苗，RNA(产品货号19O5.D0)和处方产品，RNA颗粒(产品货号9PP0.00)。
由于RP载体系统可以容易地在分子水平上操作，所以可以快速产生疫苗以响应新出现的病毒亚型。
因此，存在对新疫苗的持续需求，所述新疫苗提供针对IAV-S传播毒株的广泛保护，特别是针对在欧洲传播的四种主要IAV-S毒株欧亚禽(EurAsianAvian)H1N1、Gent84H3N2、Scot/94H1N2和2009大流行H1N1的大部分或全部提供广泛保护，并且可进行快速适配以响应新出现的病毒亚型和抗原漂移。
但是，RP载体系统(例如甲病毒属复制子平台)不允许插入任何所需数目的抗原，例如将四种主要传播的IAV-S毒株的所有NA和HA基因插入复制子载体，以实现最广泛的保护。甲病毒属载体平台通常是由含有与其相关的包装信号的非结构基因的RNA构成的三组分系统，并且结构蛋白被去除且用异源基因序列替换。两种辅助RNA包含不具有包装信号的病毒结构蛋白。这些基于复制子的三组分系统在它们可以包装的RNA数量上受到病毒衣壳体积的限制[Nanda K.等，Vol.390(2)，2009，368-373]。RP载体系统的这种固有限制使其难以满足提供针对大多数或所有传播IAV-S毒株具有广泛保护作用的疫苗的持续需求。
发明内容
在本发明的第一方面，令人惊奇地发现，在插入多于一种甲型猪流感病毒血凝素(IAV-S HA)抗原的情况下，RNA复制子颗粒的病毒基因组内编码HA抗原的基因的位置极大地影响诱导的免疫力的水平。
因此，本发明提供了以特定顺序编码来自不同谱系的两种IAV-SHA抗原的组合的核酸构建体。这些核酸构建体可用于RNA复制子颗粒。本发明的这些RNA复制子颗粒可用于免疫原性组合物中，以提供用于在被接种的受试者(例如人、伴侣动物或家畜，特别是猪)中预防由甲型猪流感病毒(IAV-S)引发的疾病的疫苗。
在本发明的第一个实施方案中，核酸构建体包含Scot/94谱系和欧亚类禽(EA)谱系的IAV-S HA抗原的组合，其中Scot/94谱系的IAV-S HA位于第一位(以核酸序列的5’至3’的顺序)且EA谱系的IAV-S HA位于第二位。术语“在5’至3’方向上”(也称为：“在下游方向”)是本领域公知的。与术语“以此顺序”一起，用于表示其后元件一起相对于彼此需要具有的相对取向，以便与宿主细胞的基因表达机器一起发挥功能，即其中包含核酸构建体的根据本发明的RP可以被复制和表达。如本领域技术人员将认识到的，在当前情况下，该方向涉及作为‘编码链’的基因组的核酸链。基因可以5’至3’方向的连续顺序存在，即不存在表达到构建体中存在的蛋白中的中间基因。在这种情况下，核酸构建体通常以5’至3’的顺序包含骨架病毒非结构蛋白开放阅读框、亚基因组启动子、随后是第一HA抗原基因序列、间质序列(interstitial sequence)、第二亚基因组启动子序列、随后是第二HA抗原基因和最后是骨架病毒3’非翻译区。
因此，本发明提供了一种核酸构建体，其以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一血凝素(HA)抗原的第一核酸序列，和
编码欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
在本发明的第二个实施方案中，核酸构建体包含Gent/84谱系和pdm09谱系的IAV-S HA抗原的组合，其中Gent/84谱系的IAV-S HA位于第一位(以核酸序列的5’至3’的顺序)且pdm09谱系的IAV-S HA位于第二位。因此，本发明提供了一种核酸构建体，其以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的IAV-S的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
在本发明的第二方面，令人惊讶地发现，与其他毒株相比，四种主要传播的IAV-S谱系的某些毒株的甲型猪流感病毒血凝素(IAV-S HA)可提供针对IAV-S的改善的免疫力。尤其是，已经发现IAV-S HA的特定组合可以提供改善的免疫性。因此，IAV-S HA的这种组合可以有利地用于可包含在RNA复制子颗粒中的核酸构建体。这些RNA复制子颗粒可用作免疫原性组合物，该组合物用于提供有助于保护接种的受试者(例如人、伴侣动物或家畜，特别是猪)抵抗IAV-S(例如，有助于预防IAV-S病毒感染)的疫苗。
因此，本发明进一步提供了编码本文定义的特定毒株的两种IAV-S HA抗原的组合的核酸构建体。
在第一个实施方案中，本发明提供了一种包含第一和第二核酸序列的核酸构建体：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的A/swine/Scotland/410440/1994样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一HA抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
在第二个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中预防或治疗由甲型猪流感病毒引发的疾病的核酸构建体，所述核酸构建体包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一血凝素(HA)抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/England/373/2010(H 1N1)的A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
在另一个重要的实施方案中，提供了包含本发明的核酸构建体的RNA复制子颗粒。因此，RNA复制子颗粒可包含根据第一个或根据第二个实施方案所述的核酸构建体。
本发明所包含的是本文所述的第一和第二方面的实施方案的任何组合。因此，本发明进一步提供了核酸构建体，其中IAV-S HA抗原以第一方面定义的特定顺序排列，并且其中IAV-S抗原来自第二方面定义的特定毒株。
在另一个重要方面，本发明提供了一种包含本文所述的核酸构建体的RNA复制子颗粒。
在另一重要方面，本发明提供了一种包含本文所述的RNA复制子颗粒的免疫原性组合物。
在另一个重要方面，本发明提供了一种包含RNA复制子颗粒的组合的免疫原性组合物，所述组合包含含有根据第一个实施方案所述的核酸构建体的第一RNA复制子颗粒和含有根据第二个实施方案所述的核酸构建体的第二RNA复制子颗粒。
本发明的另一个实施方案涉及一种包含本文所述免疫原性组合物的疫苗。
在另一个重要的实施方案中，本发明的疫苗可用于在受试者中预防或治疗由甲型猪流感病毒引发的疾病。
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了一种对猪进行免疫接种以抵抗甲型猪流感病毒的方法，该方法包括向猪施用免疫有效量的本发明的疫苗。
在第三方面，令人惊讶地发现，两种RNA复制子颗粒的组合可提供针对IAV-S的改善的免疫性，所述两种RNA复制子颗粒各自包含编码不同谱系的IAV-S的第一和第二HA抗原的核酸构建体。
因此，本发明进一步提供包含第一和第二RNA复制子颗粒的免疫原性组合物，所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一和第二HA抗原的第一和第二核酸序列，其中
第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，和
第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
第四HA抗原是欧亚类禽H1 avN1(EA)谱系的HA抗原。
本发明所包含的是本文所述的第三方面的实施方案与第一和第二方面的实施方案的任何组合。因此，本发明进一步提供了如第三方面所述的复制子颗粒，其中所述核酸构建体编码IAV-S HA抗原，所述IAV-S HA抗原以第一方面定义的特定顺序排列和/或所述IAV-S抗原是来自如第二方面所定义的特定毒株。
在第四方面，令人惊讶地发现，包含本文所述的三种不同谱系的IAV-S神经氨酸酶(NA)抗原的特定组合的核酸构建体可用于提供针对所有四种主要传播的IAV-S谱系的免疫力。
因此，本发明进一步提供了一种包含编码IAV-S的第一、第二和第三NA抗原的第一、第二和第三核酸序列的核酸构建体，其中
第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，和
第三NA抗原选自A(H 1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系。
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了一种包含如第四方面所述的核酸构建体的RNA复制子颗粒。
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含如第四方面所述的RNA复制子颗粒。
本发明的另一个实施方案涉及包含如第四方面所述的免疫原性组合物的疫苗。
在另一个重要的实施方案中，第四方面所述的疫苗可用于在受试者中预防或治疗由甲型猪流感病毒引发的疾病。
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了一种对猪进行免疫以抵抗甲型猪流感病毒的方法，该方法包括向猪施用免疫有效量的如第四方面所述的疫苗。
在另一个重要方面，本发明提供了一种包含RNA复制子颗粒的组合的免疫原性组合物，所述组合包含根据第三方面所述的第一和第二RNA复制子颗粒和含有根据第四方面所述的核酸构建体的第三RNA复制子颗粒。
本发明所包含的是本文所述的第四方面的实施方案与第一、第二和/或第三方面的实施方案的任何组合。因此，本发明进一步提供了如第三方面所述的复制子颗粒，其中所述核酸构建体编码IAV-SHA抗原，所述IAV-S HA抗原以第一方面定义的特定顺序排列和/或所述IAV-S抗原是来自如第二方面定义的特定毒株与如第四方面所述的复制子颗粒组合。
附图说明
图1：由编码欧亚禽谱系IAV-S的一种HA抗原的单基因RNA颗粒诱导的血凝抑制(HI)抗体滴度。
图2：由编码Scot 1994谱系IAV-S的一种HA抗原的单基因RNA颗粒诱导的HI抗体滴度。
图3：由编码Pdm 2009谱系IAV-S的一种HA抗原的单基因RNA颗粒诱导的HI抗体滴度。
图4：由编码Gent 1984谱系IAV-S的一种HA抗原的单基因RNA颗粒诱导的HI抗体滴度。
图5：由编码欧亚禽(EUHA1-2、EUHA1-3和EUHA1-5)的一种HA抗原和Scot1994(EUHA1-15或EUHA1-17)谱系IAV-S毒株的另一种HA抗原的不同组合的双基因RNA颗粒诱导的HI抗体滴度。
图6：由编码大流行(EUHA1-11)的一种HA抗原和Gent1984(EUHA3-4)的另一种HA抗原，或Scot1994(EUH1-15、EUHA1-17)的一种HA抗原和欧亚禽(EUHA1-3和EUHA1-5)谱系IAS毒株的另一种HA抗原的双基因RNA颗粒在两个不同位置诱导的HI抗体滴度。
图7：由编码欧亚禽(EA)谱系IAV-S的一种NA抗原的单基因RNA颗粒诱导的神经氨酸酶抑制(NI)抗体滴度。
图8：由编码Pdm09谱系IAV-S的一种NA抗原的单基因RNA颗粒诱导的(NI)抗体滴度。
图9：由编码Scot/94谱系IAV-S的一种NA抗原的单基因RNA颗粒诱导的(NI)抗体滴度。
图10：由编码Gent/84谱系IAV-S的一种NA抗原的单基因RNA颗粒诱导的(NI)抗体滴度。
图11：由编码欧亚禽(EUNA1-2)的一种NA抗原和Gent1984(EUNA2-7)的另一种NA的双基因RNA颗粒，或编码欧亚禽(EUNA1-2)、Gent1984(EUNA2-7)和Scot1994(EUHNA2-6)谱系IAS毒株中每者一种NA抗原的三基因RNA颗粒在不同位置诱导的NI抗体滴度。
图12：由编码欧亚禽(EUNA1-2)的一种NA抗原和Gent1984(EUNA2-7)的另一种NA的双基因RNA颗粒，或编码欧亚禽(EUNA1-2)、Gent1984(EUNA2-7)和Scot1994(EUHNA2-6)或Pdm09(EUNA1-4)谱系IAV-S毒株中每者一种NA抗原的三基因RNA颗粒在不同位置诱导的NI抗体滴度。
术语的定义：
为了充分理解本发明，提供以下定义。
核酸构建体是人工构建的核酸片段(例如DNA、RNA、mRNA)，其通常用于移植到靶细胞中。
为了便于描述使用的单数术语并不旨在限制。因此，例如，提及包含“多肽”的组合物包括提及一种或多种此类多肽。此外，除非另有说明，提及“甲病毒属RNA复制子颗粒”包括提及多个此类甲病毒属RNA复制子颗粒。
如本文所用，术语“大约”可与术语“约”互换使用，并且表示在所示值的50％内的值，即，含有每毫升“大约”1×108个甲病毒属RNA复制子颗粒的组合物包含每毫升5×107至1.5×108个甲病毒属RNA复制子颗粒。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“猪(pig)”或“猪(swine)”或“猪的”可互换使用，且包括所有家养猪种类。
如本文所用，“系统发育簇(phylogenetic cluster)”是一组流感病毒抗原，例如血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)，其已经在被追溯回相似(同源)祖先的系统发育树或进化树中被分组在一起(在相同分支上)。对于在美国发现的IAV-S神经氨酸酶和血凝素，主要的系统发育簇被描述于：[Anderson等，Influenza and other Respiratory Viruses 7(Suppl.4):42-51(2013)]中。
如本文所用，“谱系”是一组流感病毒血凝素，其已经在被追溯回相似(同源)祖先的进化树中被分组在一起(在相同分支上)。已经对欧洲血凝素和神经氨酸酶进行了这些分组，并且这些分组与美国病毒的系统发育簇相似，但不等同。可通过使用现成的软件(即Clustal Omega[Sievers F.等，(2011)Mol.Syst.Biol.7:539])或H1 HA序列的网络可访问注释工具[Anderson TK等，mSphere,2016；1(6):e00275-16]，利用预先建立的参考序列对所讨论的HA或NA序列进行系统发育分析来进行谱系确定。
对于在欧洲发现的IAV-S血凝素(HA)，存在四种主要谱系，如描述于：[Watson等，J.Virol.89:9920-9931(2015)]中，其对应于Anderson等，mSphere 1(6):e00275-16(2016)中描述的3个H1 HA进化枝和一个H3 HA进化枝[Anderson等，未公开]。1979年前，欧洲猪只被CS谱系病毒感染，当时从比利时和德国的猪中分离出一种被称为“欧亚类禽猪H1N1”(EA)的禽类H1N1病毒，其在基因上与CS谱系不同。EA谱系继续在欧洲猪中传播，并且自其出现以来已经与人类季节性来源病毒重配，从而导致三种不同病毒亚型在欧洲的共同传播：(i)欧亚类禽H1avN1(EA或进化枝1C.2.)；(ii)A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84或进化枝3.1970.1)；和(iii)A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94或进化枝1B.1)。自2009年4月起，命名为(iV)A(H1N1)pdm09或进化枝1A.3.3.2的猪源的新型H1N1 IAV病毒在整个人类群体中传播。在本发明的背景下，这四种谱系因此被称为“EA”、“Gent/84”、“Scot/94”和“pdm09”。
如本文所用，术语“复制子”是指缺乏一个或多个元件(例如，结构蛋白的编码序列)的经修饰的RNA病毒基因组，如果存在所述元件，能够使亲本病毒在细胞培养物或动物宿主中成功增殖。在合适的细胞环境中，复制子将自我扩增且可产生一种或多种亚基因组RNA种类。
如本文所用，术语“RNA复制子颗粒”，缩写为“RP”，是包装在结构蛋白(例如，衣壳和糖蛋白)中的RNA复制子，其可衍生自甲病毒属，例如是Pushko等[Virology 239(2):389-401(1997)]中描述的甲病毒属RNA复制子颗粒，但也可以是辛德毕斯病毒[Bredenbeek等，1993,J.of Virol.,vol.67,p.6439-6446]和塞姆利基森林病毒[Liljestrom&Garoff,1991,Biotechnology(NY),vol.9,p.1356-1361]。RP不能在细胞培养物或动物宿主中繁殖(没有辅助质粒或类似组分)，因为复制子不编码甲病毒属结构组分(例如，衣壳和糖蛋白)。优选地，本发明的RNA RP是甲病毒属RNA RP。
术语“非IAV-S”被用于修饰例如病原体和/或抗原(或免疫原)等术语，以表示相应的病原体和/或抗原(或免疫原)既不是IAV-S病原体也不是IAV-S抗原(或免疫原)，并且非IAV-S蛋白抗原(或免疫原)不来源于IAV-S。
术语“来源于”在本文中用于表示给定蛋白抗原的未修饰和/或截短的氨基酸序列是由该病原体或该病原体的毒株编码。在本发明的核酸构建体内，来源于病原体的蛋白抗原的编码序列可以被遗传操纵，从而导致相对于其来源的病原体或病原体的毒株(包括天然减毒株)中该蛋白抗原的相应序列，所表达的蛋白抗原的氨基酸序列的修饰和/或截短。
如本文所用，术语“治疗”或“进行治疗”、“预防”或“进行防预”、“保护”或“提供保护”、或“引起保护性免疫”、“有助于疾病的预防”和“有助于保护”不要求完全保护免受任何感染迹象。例如，“用于预防”可意指所提供的保护足以使得在攻击后潜在感染的症状至少减少，和/或导致引发症状的潜在细胞、生理或生化原因或机制的一种或多种减少和/或消除。应当理解，在此背景下，所用的“减少”是指相对于感染状态，其中包括感染的分子状态，而不仅仅是感染的生理状态。因此，术语“预防疾病”或“治疗”包括针对病毒感染或针对由感染引发的病症的预防性治疗。
如本文所用，“疫苗”是适合应用于动物，例如猪(在某些实施方案中包括人类，而在其他实施方案中不特定适用于人类)的组合物，其包含通常与药学上可接受的载体(例如，含水液体)组合的一种或多种抗原，其在施用于动物后诱导足够强的免疫反应以最低限度地有助于保护动物免受由野生型微生物感染引发的疾病，即足够强以有助于疾病预防和/或预防、改善或治愈疾病。
如本文所用，多价疫苗是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方案中，多价疫苗针对两种或多种不同的病原体刺激接受者的免疫系统。
术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此背景下，佐剂被用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫反应。因此，“佐剂”是一种非特异性地增强对特定抗原的免疫反应的试剂，从而减少任何给定疫苗中必需的抗原的量，和/或减少产生对目标抗原的足够的免疫反应必需的注射频率。在此背景下，佐剂被用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫反应。
如本文所用，“无佐剂的疫苗”是不包含佐剂的疫苗或多价疫苗。
如本文所用，术语“药学上可接受的”作为形容词被用于表示所修饰的名词适用于医药产品。例如，当它被用于描述医药疫苗中的赋形剂时，它将赋形剂表征为与组合物的其他成分相容且对预期的受体动物(例如猪)没有不利的危害。
“肠胃外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。
IAV-S的血凝素和神经氨酸酶抗原可以涉及如本文定义的序列中指定的完整的(即，全长的)蛋白，或者可以涉及其抗原性片段，该片段同样可以适合于诱导足够的免疫反应，正如流感疫苗领域中众所周知的(参见例如，PLOS ONE研究文章“An Influenza A/H1N1/2009Hemagglutinin Vaccine Produced in Escherichia coli”,JoséM.Aguilar-
Figure BDA0004003198460000171
等，2010年7月22日；https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011694；Vaccines(Basel)“Optimal Use of Vaccines for Control of Influenza A Virus in Swine”,Matthew R.Sandbulte等，2015Marc 3(1)22-73)。
通常，特定蛋白(例如，蛋白抗原)的抗原性片段是该蛋白的具有抗原性的片段，即能够与免疫系统的抗原识别分子(例如，免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性地相互作用。例如，IAV-S血凝素(HA)的抗原性片段是HA蛋白的具有抗原性的片段，即它实现免疫原性表位的功能。优选地，本发明的抗原性片段对于抗体和/或T细胞受体识别是免疫显性的。在特定的实施方案中，与给定蛋白抗原相关的抗原性片段是保留全长蛋白的抗原性(即通过如下所述的HI或NI抑制试验建立的诱导相应抗体的能力)的至少25％的该蛋白的片段。在优选的实施方案中，抗原性片段保留全长蛋白的抗原性的至少50％。在更优选的实施方案中，抗原性片段保留全长蛋白的抗原性的至少75％。抗原性片段可以小至20个氨基酸，或在另一个极端，是从全长蛋白中缺失小至单个氨基酸的大片段。在特定的实施方案中，抗原性片段包含25-150个氨基酸残基。在其他实施方案中，抗原性片段包含50至250个氨基酸残基。
如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100％“同一”或具有100％“序列同一性”。因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二个氨基酸序列50％“同一”。序列比对是在给定蛋白(例如，蛋白或被比较的多肽的一部分)所包含的连续氨基酸残基嵌段上进行的。在一个特定的实施方案中，考虑了可另外改变两个氨基酸序列之间的对应性的选定的缺失或插入。
如本文所用，核苷酸和氨基酸序列百分比同一性可以使用基于Clustal Omega，一个具有默认参数的多序列比对程序来测定[Sievers和Higgins,Protein Sci.2018Jan；27(1):135-1452018]。百分比同一性值是针对每对比对序列测定的单个数值分数。它测量相对于比对长度的相同残基(“匹配”)的数量。除了Clustal Omega，可用于测定核苷酸和氨基酸序列同一性百分比的其他程序为C，MacVector(MacVector，Inc.Cary，NC 27519)、VectorNTI(Informax，Inc.MD)、Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数及同一性默认参数的Clustal W算法。或者，可以使用默认过滤条件下的高级BLAST搜索，例如使用GCG(Genetics Computer Group，Program Manual for the GCG Package，Version 7，Madison，Wisconsin)堆积程序，其使用默认参数。
具体实施方式
本发明的第一方面的第一个实施方案涉及第一核酸构建体，其以特定顺序组合编码血凝素(HA)抗原的至少第一和第二核酸序列。由在核酸构建体的5’至3’方向上的第一核酸序列编码的第一HA抗原是Scot/94谱系的HA抗原。由在核酸构建体的5’至3’方向上的第二核酸序列编码的第二HA抗原是EA谱系的HA抗原。
Scot/94谱系的第一HA抗原可以是任何毒株的，例如来自毒株A/sWine/Italy/3033-1/2015(H1N2)或A/sWine/France/35-140041(H1N2)。在一个优选的实施方案中，Scot/94谱系的第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)。
进一步优选地，第一HA抗原包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列或具有至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步更优选地由根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列或具有至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。进一步优选地，第一HA抗原由SEQ ID NO：3的氨基酸序列或具有至少90％，优选至少93％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。
EA谱系的第二HA抗原可以是任何毒株的，例如来自毒株A/swine/Denmark/101048-2/2011(H1N1)、A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)或A/swine/France/44-120070/2012(H1N1)。在一个优选的实施方案中，EA谱系的第二HA抗原来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。
进一步优选地，第二HA抗原包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步更优选地由根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。进一步优选地，第二HA抗原由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有至少93％，优选至少95％，进一步优选至少96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。
本发明的第二个实施方案涉及第二核酸构建体，其以特定顺序组合编码血凝素(HA)抗原的至少第一和第二核酸序列。由在核酸构建体的5’至3’方向上的第一核酸序列编码的第一HA抗原是Gent/84谱系的HA抗原。由在核酸构建体的5’至3’方向上的第二核酸序列编码的第二HA抗原是pdm09谱系的HA抗原。
Gent/84谱系的第一HA抗原可以是任何毒株的，例如来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)。在一个优选的实施方案中，Gent/84谱系的第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)。
进一步优选地，第一HA抗原包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步更优选地由根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。进一步优选地，第一HA抗原由SEQ ID NO:9的氨基酸序列或具有至少93％，优选至少95％，进一步优选至少96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。
pdm09谱系的第二HA抗原可以是任何毒株的，例如来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)。在一个优选的实施方案中，EA谱系的第二HA来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)。
进一步优选地，第二HA抗原包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步更优选地由根据SEQID NO:12的氨基酸序列或具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。进一步优选地，第二HA抗原由SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有至少95％，优选至少96％，进一步优选至少97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在第二方面的第一实施方案中，提供了一种包含第一和第二核酸序列的核酸构建体：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的A/swine/Scotland/410440/1994样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一HA抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
优选地，来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的Scot/94谱系的IAV-S的第一HA抗原的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的序列或具有至少85％、优选至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:3的序列或具有至少85％、优选至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性进一步优选为至少91％、92％，更优选至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更高。
优选地，来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的EA谱系的IAV-S的第二HA抗原的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的序列或具有至少90％，优选至少93％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:6的序列或具有至少90％，优选至少93％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性进一步优选为至少94％、95％，更优选至少96％、97％、98％或甚至99％或更高。
在第二方面的第二实施方案中，提供了一种用于在受试者中预防或治疗由甲型猪流感病毒引发的疾病的核酸构建体，所述核酸构建体包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一血凝素(HA)抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)的A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
优选地，来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的Gent/84谱系的IAV-S的第一HA抗原的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的序列或具有至少90％，优选至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:9的序列或具有至少90％，优选至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选为至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
优选地，来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)的pdm09谱系的IAV-S的第二HA抗原的氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的序列或具有至少90％，优选至少95％序列同一性的氨基酸序列，且进一步优选地由SEQ ID NO:12的序列或具有至少90％，优选至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选为至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
根据第一和/或第二方面的第一个和/或第二个实施方案的核酸构建体可以包含在表达盒中，所述表达盒合并编码如上所述血凝素(HA)抗原的核酸序列作为异源基因以及转录和/或表达控制核酸序列，例如甲病毒亚基因组启动子序列等，并且其适合于HA抗原的表达。这种表达盒可以使用众所周知的技术通过将编码HA抗原的异源核酸序列掺入载体例如DNA载体或RNA载体而产生。载体可以是病毒复制子骨架，例如RNA复制子颗粒(RP)，并且优选甲病毒属RNA复制子颗粒。
因此，在本发明的第一和第二方面，进一步提供了包含根据第一个实施方案所述的核苷酸构建体的RNA RP，优选甲病毒属RNA RP。此外，本发明还提供了包含根据第二个实施方案所述的核苷酸构建体的RNA，优选甲病毒属RNA RP。
众所周知，“甲病毒属RNA复制子颗粒(RP)”是“不可传播的”、“单循环的”或“无繁殖能力的”病毒样颗粒载体。基因组可以编码来自其26S亚基因组启动子的一个或多个异源基因。RP可以在靶细胞内复制而不产生子代，并且以这种方式将异源抗原递送至靶动物的免疫系统且在靶动物的免疫系统中表达。甲病毒属RNA RP可以基于人委内瑞拉马脑炎疫苗(VEEV)TC-83毒株。
用于抗原异源表达的RP表达系统在本领域中是可获得的，并且包括，例如，市售的用于制造疫苗的基于RP载体的平台，例如，基于VEE病毒的Alphavaccine Platform System和可获取自MSD/Merck Animal H ealth,USA的SEQUIVITYTM技术。因此，在进一步优选的实施方案中，RNA复制子颗粒是基于委内瑞拉马脑炎(VEE)甲病毒属的RNA复制子颗粒。
例如，病毒HA抗原基因然后可以由(26S-甲病毒)亚基因组启动子表达，并且可以通过由包装细胞系表达结构蛋白，或通过将复制子RNA和编码结构蛋白的一种或多种“辅助”RNA共转染至合适的宿主细胞中，将转录的复制子RNA包装至RP中。VEE TC-83RNA复制子颗粒的产生描述于例如US 9,441,247和US 8,460,913中。简言之，使用来自SIV毒株的序列从头合成(DNA2.0)HA或NA基因。使用单向表达盒将两个HA或三个NA基因串联地克隆至复制子载体质粒中，并确认序列以确保在克隆过程中未引入突变。如前所述，通过使用T7 RNA聚合酶体外转录线性化的复制子质粒DNA产生RNA[Kamrud等，Virology.2007；360(2):376–387]。通过HA或NA复制子RNA和结构基因辅助RNA的共电穿孔至Vero细胞中并随后收获颗粒来产生RP[Hooper等，Vaccine.2009；28(2):494–511]。
涉及克隆、转染、重组、选择和扩增的一般分子生物学技术在例如标准教科书如Sambrook&Russell:“Molecular cloning:a laboratory manual”[2001,Cold SpringHarbour Laboratory Press；ISBN:0879695773；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology,J.Wiley and Sons Inc.,NY,2003,ISBN:047150338X；C.Dieffenbach&G.Dveksler:“PCR primers:a laboratory manual”,CSHL Press,ISBN0879696540；和“PCR protocols”,J.Bartlett and D.Stirling,Humana press,ISBN:0896036421]中有详细解释。
本发明的核酸构建体可用于包含核酸构建体的免疫原性组合物中。优选地，免疫原性组合物包含多种含有本发明的核酸构建体的复制子颗粒的一种。因此，本发明的复制子颗粒可用于包含复制子颗粒的免疫原性组合物，例如疫苗中。免疫原性组合物或疫苗可由复制子颗粒组成或可包含复制子颗粒与另外的组分(例如，载体或佐剂)的组合。本发明的免疫原性组合物可在用于在受试者中预防由甲型猪流感病毒(IAV-S)引发的疾病的疫苗中使用。
因此，在第一和/或第二方面，本发明进一步提供了一种包含RNA RP或由RNA RP组成的免疫原性组合物，所述RNA RP包含根据第一个实施方案所述的核酸构建体。或者，本发明还提供了一种包含RNA RP或由RNA RP组成的免疫原性组合物，所述RNA RP包含根据第二个实施方案所述的核酸构建体。
在第一和/或第二方面的优选实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含含有根据第一个实施方案所述的核苷酸构建体的第一RNA RP和含有根据第二个实施方案所述的核苷酸构建体的第二RNA RP。本发明中可显示，包含根据第一个和第二个实施方案所述的复制子颗粒的组合的免疫原性组合物提供针对现有IAV-S谱系的广泛保护，并且因此这种免疫原性组合物可以有利地用作有助于保护(即，有助于预防或治疗)接种疫苗的受试者(例如，母猪或仔猪)抵抗IAV-S感染的疫苗。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，例如疫苗，其包含第一和第二RNA复制子颗粒，
(i)第一RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
第一HA抗原是Gent/84谱系的HA抗原，和
第二HA抗原是pdm09谱系的HA抗原，
(ii)第二RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
第三HA抗原是Scot/94谱系的HA抗原，和
第四HA抗原是EA谱系的HA抗原。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，例如疫苗，其包含第一和第二RNA复制子颗粒：
(i)第一RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，
其包含第一核酸构建体，所述第一核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码Scot/94谱系的IAV-S的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码EA谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列，并且所述免疫原性组合物还包含：
(ii)第二RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含第二核酸构建体，所述第二核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码Gent/84谱系的IAV-S的第三HA抗原的第三核酸序列，和
编码pdm09谱系的IAV-S的第四HA抗原的第四核酸序列。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，例如疫苗，其包含第一和第二RNA复制子颗粒：
(i)第一RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，
其包含第一核酸构建体，所述第一核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码Scot/94谱系的IAV-S的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码EA谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列，并且所述免疫原性组合物还包含：
(ii)第二RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含第二核酸构建体，所述第二核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码Gent/84谱系的IAV-S的第三HA抗原的第三核酸序列，和
编码pdm09谱系的IAV-S的第四HA抗原的第四核酸序列。
因此，在第三方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，例如疫苗，其包含第一和第二RNA复制子颗粒，
(i)第一RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体以核酸序列的5’至3’顺序包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
第一HA抗原由来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的Gent/84谱系的第一核酸序列编码，优选SEQ ID NO.9或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，
第二HA抗原由来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)的pdm09谱系的第一核酸序列编码，优选SEQ ID NO.12或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，
(ii)第二RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体以核酸序列的5’至3’顺序包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
第三HA抗原由来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的Scot/94谱系的第三核酸序列编码，优选SEQ ID NO.3，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，
第四HA抗原由来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的EA谱系的第四核酸序列编码，优选SEQ ID NO.6或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
第三方面的核酸构建体、免疫原性组合物和复制子颗粒如上文本发明第一和第二方面所述。因此，本发明进一步所包含的是本文所述的第三方面的实施方案和第一和第二方面的实施方法的任何组合。因此，本发明进一步提供了如第三方面所述的复制子颗粒，其中所述核酸构建体编码IAV-S HA抗原，其以第一方面定义的特定顺序排列和/或其中IAV-S抗原来自第二方面定义的特定毒株。
免疫原性组合物可适配为同时或连续施用如上所述的第一和第二RNA复制子颗粒，即，同时或连续施用包含根据第一和第二实施方案所述的核酸构建体的RNA RP。优选地，免疫原性组合物适配为同时施用第一和第二RNA复制子颗粒。因此，在优选的实施方案中，免疫原性组合物包含单位剂型的第一和第二RNA复制子颗粒。
在进一步优选的实施方案中，免疫原性组合物可以包含一种或多种另外的RNA复制子颗粒。这种另外的RNA RP可以包含编码一种或多种另外的抗原的核酸构建体。例如，另外的RNA RP可以包含编码IAV-S的一种或多种神经氨酸酶(NA)抗原的核酸构建体。在具体的实施方案中，核酸构建体编码两个或三个，优选三个IAV-S的NA抗原或其免疫原性片段。
在特别优选的实施方案中，另外的RNA RP包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三NA抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
第一NA抗原是Scot/94谱系的NA抗原，
第二NA抗原是Gent/84谱系的NA抗原，并且
第三NA抗原选自pdm09谱系或EA谱系。
因此，在本发明的第四方面，提供了一种核酸构建体，其包含编码IAV-S的第一、第二和第三NA抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
由第一核酸序列编码的第一NA抗原是Scot/94谱系的NA抗原，
由第二核酸序列编码的第二NA抗原是Gent/84谱系的NA抗原，并且
由第三核酸序列编码的第三NA抗原选自pdm09谱系或EA谱系。
优选地，Scot/94谱系的IAV-S的第一NA抗原的氨基酸序列来自毒株A/swine/England/61470/2013(H1N2)。第一NA抗原的氨基酸序列优选地包含SEQ ID NO:15的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:15的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
优选地，Gent/84谱系的IAV-S的第二NA抗原的氨基酸序列来自毒株A/swine/Italy/248147-8/2015(H3N2)。第二NA抗原的氨基酸序列优选地包含SEQ ID NO:18的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:18的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选为至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
优选地，pdm09谱系的IAV-S的第三NA抗原的氨基酸序列来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)或A/swine/Italy/179057/2015(H1N1)，优选来自毒株A/swine/Italy/179057/2015(H1N1)。第三NA抗原的氨基酸序列优选地包含SEQ ID NO:21的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:21的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选为至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
或者，EA谱系的IAV-S的第三NA抗原的氨基酸序列来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。第三NA抗原的氨基酸序列优选地包含SEQ ID NO:24的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步优选地由SEQ ID NO:24的序列或具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。氨基酸同一性优选为至少96％、97％，更优选至少98％或甚至99％或更高。
进一步提供了RNA复制子颗粒，优选甲病毒属RNA复制子颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
第一NA抗原是Scot/94谱系的NA抗原，
第二NA抗原是Gent/84谱系的NA抗原，并且
第三NA抗原选自pdm09谱系或EA谱系。
包含根据第四方面所述的核酸构建体的复制子颗粒可单独使用或与本文所述的根据本发明第一、第二和/或第三方面所述的复制子颗粒组合使用，并且有利地与复制子颗粒组合使用，所述复制子颗粒包含如本发明第一、第二和/或第三方面所述的血凝素抗原。
根据该第四方面所述的复制子颗粒没有特别限制，并且优选为复制子颗粒，例如甲病毒属复制子颗粒，最优选为如第一、第二和/或第三方面所述的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)甲病毒属RNA复制子颗粒。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，例如疫苗，其包含至少第一、第二和第三RNA复制子颗粒，
第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含编码IAV-S的第一和第二HA抗原的第一核酸序列和第二核酸序列，其中
第一HA抗原是Scot/94谱系的HA抗原，并且
第二HA抗原是EA谱系的HA抗原，
第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体以核酸序列的5’至3’的顺序包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
第三HA抗原是Gent/84谱系的HA抗原，并且
第四HA抗原是pdm09谱系的HA抗原，和
第三RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三NA抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
第一NA抗原是Scot/94谱系的NA抗原，
第二NA抗原是Gent/84谱系的NA抗原，并且
第三NA抗原选自pdm09谱系或EA谱系。
上述免疫原性组合物，例如疫苗，可以有利地用作有助于保护接种疫苗的受试者例如猪(例如母猪或仔猪)抵抗IAV-S感染的疫苗。
免疫原性组合物可适配为同时或连续施用如上所述的第一、第二和第三RNA复制子颗粒，即，同时或连续施用包含根据第一、第二和/或第三方面所述的核酸构建体与根据第四方面所述的核酸构建体的组合的RNA RP。优选地，免疫原性组合物适配为同时施用第一、第二和第三RNA复制子颗粒。因此，在优选的实施方案中，免疫原性组合物包含单位剂型的第一、第二和第三RNA复制子颗粒。
本发明还提供了针对多种猪病原体的疫苗。例如，用于猪疫苗的蛋白抗原或其抗原性片段的编码序列，或这些蛋白抗原编码序列的组合可被添加到RNA复制子颗粒(RP)中和/或在与编码源自疫苗中IAV-S的HA或NA的RP相同的RP中组合，如本文所述。一种或多种蛋白抗原或其抗原性片段可源自的病原体的示例包括猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRS)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGE)、猪伪狂犬病病毒(PPRV)、猪细小病毒(PPV)、猪轮状病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PED)、多种血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、沙门氏菌属、大肠杆菌，例如(血清型K99、K88、987P或F41)、副猪嗜血杆菌、胞内劳森菌、支原菌属(例如，猪肺炎支原体)、支气管炎博德特菌、丹毒属(Erysipelasssp.)、弯曲杆菌属、胸膜肺炎放线杆菌、产气荚膜梭菌和艰难梭菌。
此外，本发明提供了包含一种或多种本发明的RP与编码这些猪抗原中的一种或多种的一种或多种其他载体(例如，编码来自猪圆环病毒2(PCV-2)和/或猪圆环病毒3(PCV-3)的ORF-2蛋白和/或源自这些猪病原体中的一种或多种的灭活类毒素的杆状病毒载体)组合的疫苗。此外，此类疫苗可以包括任何RNA复制子颗粒(其编码来源于本发明疫苗中的IAV-S的HA和/或NA)以及一种或多种杀灭的和/或经修饰的(减毒的)活猪病毒分离株和/或猪细菌。
因此，编码来源于IAV-S的一种或多种HA和/或NA的一种或多种RNA RP可以与编码一种或多种猪抗原和/或一种或多种杀灭的和/或经修饰的(减毒的)活病毒分离株的一种或多种其他载体一起添加，所述活病毒分离株是例如一种或多种杀灭的或经修饰的活IAS-V株、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PRRS病毒、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PCV、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活TGE、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PPRV、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PPV、一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PRV和一种或多种杀灭的和/或经修饰的活PED。此外，编码来源于IAV-S的一种或多种HA或NA的一种或多种甲病毒属RNA复制子颗粒(RP)可以与编码一种或多种猪抗原的一种或多种其他载体一起添加，和/或与也可感染猪的一种或多种杀灭的和/或经修饰的(减毒的)活细菌一起添加，包括一种或多种杀灭的和/或经修饰的活的多杀性巴氏杆菌(一种或多种多血清型)、沙门氏菌属、大肠杆菌(一种或多种多血清型)、副猪嗜血杆菌、胞内劳森菌、支原菌属(例如，猪肺炎支原体)、支气管炎博德特菌、丹毒属、弯曲杆菌属、胸膜肺炎放线杆菌、产气荚膜梭菌和艰难梭菌。
因此，本发明还包括本发明的所有RNA复制子颗粒，包含本发明的核酸构建体的裸DNA载体，包含本发明的核酸构建体的裸RNA载体，包括合成信使RNA和RNA复制子的本发明的核酸构建体，以及包含本发明的核酸构建体(例如合成信使RNA、RNA复制子)、甲病毒属RNA复制子颗粒、裸RNA载体和/或裸DNA载体的所有免疫原性组合物和/或疫苗。
本发明的免疫原性组合物可用作疫苗，其可以是无佐剂的疫苗或佐剂疫苗。因此，本发明还包括含有本发明的免疫原性组合物的疫苗(多价)疫苗。在特定的实施方案中，疫苗是无佐剂的疫苗。在其他实施方案中，疫苗包含佐剂。适用于本发明的疫苗的佐剂没有特别限制，且可以包含选自下组的一种或多种佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
在特定的实施方案中，佐剂是可生物降解的油。在这种类型的具体实施方案中，可生物降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯(维生素E乙酸酯)。在其他实施方案中，佐剂包含具有2.5％-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在具体实施方案中，佐剂包含具有2.5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在相关实施方案中，佐剂包含具有5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在其他实施方案中，佐剂包含具有12.5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在其他实施方案中，佐剂包含具有25％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在其他实施方案中，佐剂包含具有50％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在更具体的实施方案中，佐剂包含可生物降解的油与矿物油佐剂的混合物。在具体的实施方案中，可生物降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯且矿物油是液体石蜡。在更具体的实施方案中，可生物降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯且矿物油是轻质液体石蜡。
在相关制剂中，佐剂是两种组分的混合物。第一组分由具有约1μm的近似平均(体积称重)尺寸的矿物油液滴组成，其用聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)水溶液稳定。第一组分可包含25重量％的矿物油和1重量％的聚山梨醇酯80，其余为水。第二组分可以由可生物降解的dl-α-生育酚乙酸酯的液滴组成，其具有约400nm的近似平均(体积称重)尺寸，其也用聚山梨醇酯80稳定。特定制剂包含15重量％的dl-α-生育酚乙酸酯和6重量％的聚山梨醇酯80，其余为水。在具体的实施方案中，佐剂是X-SOLVETM(其是两种组分佐剂的组合：基于dl-α-生育酚乙酸酯的DILUVAC FORTETM，基于轻质液体石蜡的MICROSOLTM[参见例如，US 8,597,662])。在相关制剂中，佐剂包含亚微米尺寸的油滴和可生物降解的油滴，其中可生物降解的油滴具有不同于矿物油滴的平均尺寸的平均尺寸[参见例如，US 9,084,768]。
在某些实施方案中，疫苗有助于预防由IAV-S引发的疾病。在相关的实施方案中，当用疫苗免疫猪时，在猪受试者中诱导抗体。在某些实施方案中，猪受试者是母猪。在相关的实施方案中，疫苗为接种疫苗的母猪的后代提供保护性母体抗体。在其他实施方案中，猪受试者是仔猪。在这种类型的具体实施方案中，早在3日龄时就向仔猪施用疫苗。在具体的实施方案中，疫苗作为加强疫苗施用。在某些实施方案中，疫苗作为单剂量疫苗施用。在这种类型的具体实施方案中，疫苗作为加强疫苗施用。在其他实施方案中，疫苗作为多剂量疫苗施用。在这种类型的具体实施方案中，疫苗作为双剂量疫苗施用。
本发明还提供了对猪(例如，母猪或仔猪)进行免疫使其抵抗猪病原体(例如IAV-S)的方法，所述方法包括向猪施用免疫有效量的本发明的疫苗或多价疫苗。在特定的实施方案中，疫苗通过肌内注射施用。在备选的实施方案中，疫苗通过皮下注射施用。在其他实施方案中，疫苗通过静脉内注射施用。在其他实施方案中，疫苗通过皮内注射施用。在其他实施方案中，疫苗通过口服施用。在其他实施方案中，疫苗通过鼻腔给药施用。优选的方法是皮内施用。另一种优选的方法是肌内施用。
因此，本发明的疫苗和多价疫苗可以作为初始疫苗和/或加强疫苗施用。在具体的实施方案中，本发明的疫苗作为单剂疫苗(一个剂量)施用，而不需要后续施用。在某些实施方案中，在施用初始疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以通过相同的途径施用初始疫苗和加强疫苗。
在这种类型的某些实施方案中，初始疫苗和加强疫苗均通过皮内注射施用。在这种类型的其他实施方案中，初始疫苗和加强疫苗均通过肌内注射施用。在备选的实施方案中，在施用初始疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以通过一种途径施用初始疫苗并通过另一种途径施用加强疫苗。在这种类型的某些实施方案中，可以通过皮内注射施用初始疫苗并可以口服施用加强疫苗。在这种类型的相关实施方案中，可以通过肌内注射施用初始疫苗并可以口服施用加强疫苗。在这种类型的其他实施方案中，可通过肌内注射施用初始疫苗并可通过皮内注射施用加强疫苗。在这种类型的其他实施方案中，可通过皮内注射施用初始疫苗并可通过肌内注射施用加强疫苗。本领域技术人员将理解，疫苗组合物优选针对各类型的受体动物和施用途径适当地配制。
本发明还提供了对猪进行免疫以抵抗IAV-S的方法，该方法包括向猪施用免疫有效量的本发明的疫苗。该方法优选地包括疫苗的皮内施用。本发明还提供了对猪(例如，母猪或仔猪)进行免疫以抵抗IAV-S的方法，其包括给猪注射免疫有效量的上述发明疫苗，使得猪产生合适的IAV-S抗体。在特定的实施方案中，疫苗可包含例如约1×104至约1×1010RP或更高。在更具体的实施方案中，疫苗可包含约1×105至约1×109RP。在甚至更具体的实施方案中，疫苗可包含约1×106至约1×108RP。
在特定的实施方案中，本发明的疫苗以0.05mL至3mL的剂量施用。在更具体的实施方案中，施用的剂量为0.1mL至2mL。在更具体的实施方案中，施用的剂量为0.2mL至1.5mL。在甚至更具体的实施方案中，施用的剂量为0.3至1.0mL。在更具体的实施方案中，施用的剂量为0.4mL至0.8mL。
因此，在第一方面，本发明提供了以下实施方案：
[1]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒(IAV-S)引发的疾病的预防中使用的核酸构建体，所述核酸构建体以所述核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一血凝素(HA)抗原的第一核酸序列，和
编码欧亚类禽H1 avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
[2]如[1]中所定义的使用的核酸构建体，其中所述第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)。
[3]如[1]或[2]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[4]如[1]至[3]中任一项所定义的使用的核酸构建体，其中所述第二HA抗原来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。
[5]如[1]至[4]中任一项所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[6]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒(IAV-S)引发的疾病的预防中使用的核酸构建体，所述核酸构建体以所述核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的IAV-S的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
[7]如[6]中所定义的使用的核酸构建体，其中所述第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)。
[8]如[6]或[7]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[9]如[6]至[8]中任一项所定义的使用的核酸构建体，其中所述第二HA抗原来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)。
[10]如[6]至[9]中任一项所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[11]一种RNA复制子颗粒，其包含如[1]至[5]中任一项所定义的核酸构建体。
[12]一种RNA复制子颗粒，其包含如[6]至[10]中任一项所定义的核酸构建体。
[13]如[15]或[16]中所定义的RNA复制子颗粒，其为甲病毒属RNA复制子颗粒。
[14]如[13]中所定义的RNA复制子颗粒，其为委内瑞拉马脑炎(VEE)甲病毒属RNA复制子颗粒。
[15]一种免疫原性组合物，其包含[11]至[14]中任一项所述的RNA复制子颗粒。
[16]如[15]中所定义的免疫原性组合物，其包含[11]和[12]所述的RNA复制子颗粒。
[17]如[16]中所定义的免疫原性组合物，其适配为同时施用如[11]和[12]中所定义的甲病毒属RNA复制子颗粒。
[18]一种疫苗，其包含如[15]至[17]中任一项所定义的免疫原性组合物。
[19]如[18]中所定义的疫苗，其是无佐剂的疫苗。
[20]如[18]中所定义的疫苗，其包含选自下组的佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
[21]如[18]至[20]中任一项所定义的疫苗，其用于在受试者中预防由甲型猪流感病毒引发的疾病。
[22]一种对猪进行免疫接种以抵抗甲型猪流感病毒的方法，所述方法包括向所述猪施用免疫有效量的[18]至[20]中任一项所述的疫苗。
[23]一种核酸构建体，其以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码欧亚类禽H1 avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
[24]一种核酸构建体，其以核酸序列的5’至3’的顺序包含：
编码A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的IAV-S的第一HA抗原的第一核酸序列，和
编码A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原的第二核酸序列。
在第二方面中，本发明提供了以下实施方案：
[1]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用的核酸构建体，所述核酸构建体包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的A/swine/Scotland/410440/1994样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一HA抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
[2]如[1]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[3]如[1]或[2]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[4]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用的核酸构建体，所述核酸构建体包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一血凝素(HA)抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)的A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
[5]如[4]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[6]如[4]或[5]中所定义的使用的核酸构建体，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[7]一种RNA复制子颗粒，其包含如[1]至[3]中任一项所定义的核苷酸构建体。
[8]一种RNA复制子颗粒，其包含如[4]至[6]中任一项所定义的核苷酸构建体。
[9]如[7]或[8]中所定义的RNA复制子颗粒，其为甲病毒属RNA复制子颗粒。
[10]如[9]中所定义的RNA复制子颗粒，其为委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)甲病毒属RNA复制子颗粒。
[11]一种免疫原性组合物，其包含如[7]至[10]中任一项所定义的RNA复制子颗粒。
[12]如[11]中所定义的免疫原性组合物，其包含如[7]和[8]中所定义的RNA复制子颗粒。
[13]一种疫苗，其包含如[12]中所定义的免疫原性组合物。
[14]如[13]中所定义的疫苗，其是无佐剂的疫苗。
[15]如[13]中所定义的疫苗，其包含选自下组的佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
[16]如[13]至[15]中任一项所定义的疫苗，其用于在受试者中预防由甲型猪流感病毒引发的疾病。
[17]一种对猪进行免疫以抵抗甲型猪流感病毒的方法，所述方法包括向所述猪施用免疫有效量的如[14]至[16]中任一项所定义的疫苗。
[18]一种核酸构建体，其包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)的A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一血凝素(HA)抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/England/373/2010(H 1N1)的A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
[19]一种核酸构建体，其包含第一和第二核酸序列：
第一核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)的A/swine/Scotland/410440/1994样H1huN2(Scot/94)谱系的IAV-S的第一HA抗原，和
第二核酸序列编码来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)的欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的IAV-S的第二HA抗原。
在第三方面中，本发明提供了以下实施方案：
[1]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用的免疫原性组合物，所述组合物包含第一和第二RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原。
[2]如[1]中所定义使用的免疫原性组合物，其中第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)。
[3]如[1]或[2]中所定义使用的免疫原性组合物，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[4]如前述[1]至[3]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中所述第二HA抗原来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)。
[5]如前述[1]至[4]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸。
[6]如前述[1]至[5]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中所述第三HA抗原来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)。
[7]如前述[1]至[6]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中由所述第三核酸序列编码的所述第三HA抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[8]如前述[1]至[7]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中所述第四HA抗原来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。
[9]如前述[1]至[8]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中由所述第四核酸序列编码的所述第四HA抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[10]如前述[1]至[9]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其适配为同时施用所述第一和第二RNA复制子颗粒。
[11]如前述[1]至[10]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其还包含第三RNA复制子颗粒，
所述第三RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的的NA抗原，并且
第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系。
[12]如前述[1]至[11]中任一项所定义使用的免疫原性组合物，其中所述RNA复制子颗粒是甲病毒属RNA复制子颗粒。
[13]如[12]中所定义使用的免疫原性组合物，其是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)甲病毒属RNA复制子颗粒。
[14]一种疫苗，其包含如前述[1]至[13]中任一项所定义的免疫原性组合物。
[15]如[14]中所定义的疫苗，其是无佐剂的疫苗。
[16]如[14]中所定义的疫苗，其包含选自下组的佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
[17]如[14]至[16]中任一项所定义的疫苗，其用于在受试者中预防由甲型猪流感病毒引发的疾病。
[18]一种对猪进行免疫接种以抵抗甲型猪流感病毒的方法，所述方法包括向所述猪施用免疫有效量的如[14]至[16]中任一项所定义的疫苗。
[19]一种免疫原性组合物，其包含第一和第二RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原属于欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原。
[20]一种免疫原性组合物，其包含第一、第二和第三RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1 avN1(EA)谱系的HA抗原，
所述第三RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
所述第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
所述第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，和
所述第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1 avN1(EA)谱系。
在第四方面，本发明提供了以下实施方案：
[1]一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用的核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
所述第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
所述第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，和
所述第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系。
[2]如[1]中所定义使用的核酸构建体，其中所述第一NA抗原来自毒株A/swine/England/61470/2013(H1N2)。
[3]如[1]或[2]中所定义使用的核酸构建体，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一NA抗原包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[4]如[1]至[3]中任一项所定义使用的核酸构建体，其中所述第二NA抗原来自毒株A/swine/Italy/248147-8/2015(H3N2)。
[5]如[1]至[4]中任一项所定义使用的核酸构建体，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二NA抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[6]如[1]至[5]中任一项所定义使用的核酸构建体，其中所述第三NA抗原来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)或A/swine/Italy/179057/2015(H1N1)。
[7]如[1]至[6]中任一项所定义使用的核酸构建体，其中所述第三NA抗原来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。
[8]如[1]至[7]中任一项所定义使用的核酸构建体，其中由所述第三核酸序列编码的所述第三NA抗原包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[9]一种RNA复制子颗粒，其包含如[1]至[8]中任一项所定义的核酸构建体。
[10]如[9]中定义的RNA复制子颗粒，其为甲病毒属RNA复制子颗粒。
[11]如[9]或[10]中所定义的RNA复制子颗粒，其为委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)甲病毒属RNA复制子颗粒。
[12]一种免疫原性组合物，其包含如[9]至[11]中任一项所定义的RNA复制子颗粒。
[13]一种免疫原性组合物，其包含第一、第二和第三RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原，和
所述第三RNA复制子颗粒是如[9]至[11]中任一项所定义的RNA复制子颗粒。
[14]一种疫苗，其包含如[12]或[13]中所定义的免疫原性组合物。
[15]如[14]中所定义的疫苗，其是无佐剂的疫苗。
[16]如[14]中所定义的疫苗，其包含选自下组的佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
[17]如[14]至[16]中任一项所定义的疫苗，其用于在受试者中预防由甲型猪流感病毒引发的疾病。
[18]一种对猪进行免疫接种以抵抗甲型猪流感病毒的方法，所述方法包括向所述猪施用免疫有效量的如[14]至[16]中任一项所定义的疫苗。
[19]一种核酸构建体，其包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
所述第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
所述第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，并且
所述第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的NA抗原。
以下实施例用于提供对本发明的进一步理解，但不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。
实施例
材料和方法
甲病毒属RNA RP疫苗的制备
单HA或NA基因复制子颗粒(RP)的产生。
如先前所述构建被设计用于表达血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)基因的VEE复制子载体[参见，U.S.9,441,247 B2；其内容通过引用并入本文]，并进行以下修改。用限制性内切酶Ascl和Pad消化TC-83衍生的复制子载体“pVEK”[在U.S.9,441,247 B2中公开和描述]。用限制性内切酶Ascl和Pad类似地消化含有具有5’-侧翼序列(5’-GGCGCGCCGCACC-3’)和3’-侧翼序列(5’-TTAATTAA-3’)的HA或NA基因(表1a和b)的密码子优化的开放阅读框序列的DNA质粒。然后将合成的基因盒连接到消化的pVEK载体中，并将得到的克隆重新命名为“pVHV”各自的RP代码。选择“pVHV”载体命名法来指示含有通过pVEK的多克隆位点中的Asc1和Pad位点克隆的转基因盒的pVEK衍生的复制子载体。
根据先前描述的方法构建产生TC-83RNA复制子颗粒(RP)[U.S.9,441,247 B2和U.S.8,460,913 B2；其内容通过引用并入本文]。简言之，在使用MegaScript T7 RNA聚合酶和帽类似物(Promega，Madison，WI)进行体外转录之前，用NotI限制性内切酶线性化pVHV复制子载体DNA和辅助DNA质粒。重要的是，如前所述，生产中使用的辅助RNA缺乏VEE亚基因组启动子序列[Kamrud等，J Gen Virol.91(Pt 7)：1723-1727(2010)]。合并用于复制子的纯化RNA和辅助组分，并与Vero细胞的悬浮液混合，在4mm比色皿中电穿孔，并返回至OptiProSFM细胞培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)。过夜孵育后，纯化甲病毒属RNA复制子颗粒，在含有5％蔗糖(w/v)和1％猪血清的磷酸盐缓冲盐水中配制，通过0.22微米膜滤器，并分为等份以用于储存。通过对感染的Vero细胞单层进行免疫荧光试验来测定功能性RP的滴度。根据由包装的复制子编码的基因鉴定RP批次(表1a和b)。
多HA或NA基因复制子颗粒(RP)的产生。
如前所述构建用于表达HA或NA基因的VEE复制子载体[参见，U.S.9,441,247 B2；其内容通过引用并入本文]，具有以下修改。用限制性内切酶AscI和PacI消化TC-83衍生的复制子载体“pVEK”[在U.S.9,441,247 B2中公开和描述]。对于双基因HA和NA构建体，用侧翼的AscI和PacI位点密码子优化并合成选定的开放阅读框序列。此外，两个合成HA或NA开放阅读框之间的间质序列由47个核苷酸的非编码异源序列、以及天然TC-83亚基因组(sg)RNA启动子的第二拷贝和5’非翻译sgRNA区序列组成。这些双基因构建体被称为“pVDG”以将它们与具有单sgRNA启动子序列的亲本载体区分开。在三基因NA构建体的情况下，如下进一步修饰含有两个NA基因的基于pVDG的构建体。用侧翼的PacI和SphI位点密码子优化并合成第三选定的NA开放阅读框，以用于定向克隆至两个现有NA基因的pVDG载体下游。新的合成构建体也包含50个核苷酸的异源非编码序列、以及天然TC-83sgRNA启动子的第三拷贝和连接至第三NA基因序列的5’端的5’非翻译sgRNA区序列。第三NA基因序列的3’区由TC-83的3’非翻译区组成，直至亲本pVDG载体的相应SphI位点。三基因载体被称为“pVTG”以将它们与相关载体pVEK、pVHV和pVDG区分开。
如上所述，使用来自实施例1和3的HA(表1a：EUHA1-3、EUHA1-2、EUHA1-5、EUHA1-15、EUHA1-17、EUHA1-8、EUHA1-11和HA3-4)或NA(表1b：EUNA1-2、EUN 1-4、EUN2-6和EUN2-7)基因的选定序列来合成质粒载体pVDG或pVTG中的多HA或NA基因。
根据先前描述的方法构建生产TC-83RNA复制子颗粒(RP)[U.S.9,441,247 B2和U.S.8,460,913 B2；其内容通过引用并入本文]。简言之，在使用MegaScript T7 RNA聚合酶和帽类似物进行体外转录之前，用NotI限制性内切酶线性化pVDG或pVTG复制子载体DNA和辅助DNA质粒。重要的是，如前所述，生产中使用的辅助RNA缺乏VEE亚基因组启动子序列[Kamrud等，J Gen Virol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]。合并用于复制子的纯化RNA和辅助组分，并与Vero细胞的悬浮液混合，在4mm比色皿中电穿孔，并返回到无血清培养基中。孵育过夜后，通过使悬浮液穿过深层滤器、用含有5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲盐水洗涤、并最后用200mM Na2SO4+5％蔗糖(w/v)缓冲液洗脱保留的RP，从细胞和培养基中纯化甲病毒属RNA复制子颗粒。或者，在制备的Cellufine
Figure BDA0004003198460000522
树脂的存在下离心细胞和培养基，用含有5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并200mM Na2SO4+5％蔗糖(w/v)缓冲液洗脱。使洗脱的RP穿过0.22微米膜滤器，并分为等份以用于储存。通过对感染的Vero细胞单层进行免疫荧光试验来测定功能性RP的滴度。
在实验中构建并使用以下复制子颗粒：
表1a.RNA颗粒、HA来源毒株、谱系、进化枝和GenBank登录号(登录#)
Figure BDA0004003198460000521
Figure BDA0004003198460000531
表1b.RNA颗粒、NA来源毒株、谱系和GenBank登录号(登录#)
Figure BDA0004003198460000532
注：进化枝信息不适用于NA抗原
如果实施例或图中没有另外指出，以下毒株和谱系被用于HI试验：
表1c.图1、2、3和4中用作HI试验的HA抗原来源的SIV毒株
Figure BDA0004003198460000541
表1d.图5和6中用作HI试验的HA抗原来源的SIV毒株
# 毒株名称 HA谱系
1 A/swine/France/53-130065/2013(H1N1) EA
2 A/swine/Belgium/113/2013(H3N2) Gent/84
3 A/swine/MN/A01483170/2014(H1N1) pdm09
4 A/swine/England/041118/2013(H1N2) Scot94-1
5 A/swine/France/22-130212/2013(H1N2) Scotland 1994-2(Scot94-2)
表1e.图7、8、9和10中用于NI试验的SIV毒株或表达的NA抗原来源
Figure BDA0004003198460000551
Figure BDA0004003198460000561
*表达各自NA抗原的Vero细胞的裂解物被用作NA抗原的来源
表1f.图11和12中用于NI试验的NA抗原来源
Figure BDA0004003198460000562
*表达各自NA抗原的Vero细胞的裂解物被用作NA抗原的来源
总体研究设计
用5-10×106(每头猪每次)的编码单或多HA或NA基因的RNA颗粒疫苗和Xsolve50佐剂对大约5周龄的血清反应阴性或具有抗SIV的低抗体的健康猪(每种疫苗3头猪)进行肌内疫苗接种。在大约8周龄时重复各自的疫苗接种，在大约9周龄时收集血样，并用于血凝抑制(HI)试验或神经氨酸酶抑制(NI)试验以定量抗原特异性抗体水平的水平。
血凝抑制(HI)试验：
在56℃下热灭活所有血清样品30分钟，随后用0.25％高碘酸盐处理，然后用0.75％甘油处理并用2.6％鸡红细胞吸附以去除非特异性凝集素。对于HI抗体滴定，用8个血凝单位的表1c或1d中所列的SIV毒株(作为HA抗原)将预处理血清的连续稀释液孵育1小时。随后，将混合物在室温下用0.2％鸡红细胞孵育1小时，并读取板以观察凝集抑制。将完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度的倒数称为HI滴度并以log base2值表示。
血清神经氨酸酶(NA)抑制(NI)试验：
将用编码各自NA(表1e和1f)基因的复制子RNA电穿孔的表达NA抗原的Vero细胞裂解物的SIV毒株用作NA抗原的来源。在37℃下孵育过夜期间，通过96孔板上胎球蛋白的唾液酸裂解来定量那些NA的酶活性。然后室温下2小时加入花生凝集素-辣根过氧化物酶结合物(PNA-HRP)，与去除唾液酸的胎球蛋白分子结合。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物获得信号并在450nm下读数。滴定测试抗原以测定能够产生70％最大信号的稀释度。在37℃过夜孵育期间，将等体积的NA抗原加入至胎球蛋白包被的孔中的血清的连续稀释液中。相对于不含血清的阳性对照孔的值标准化光密度(OD)值。神经氨酸酶抑制滴度被定义为相比于对照具有等于50％抑制的消光值的内插血清稀释度的倒数，并以log base2值表示。
神经氨酸酶和血凝素抗体滴度与针对SIV-A的疫苗诱导的保护的相关性被描述于[Hobson D.等，J Hyg(Lond)70，767-777(1972)；Ohmit SE等，J.Infect.Dis 204，1879-1885(2011)；Walz L等，J Virol.2018；92(17)：e0 1006-18.(2018)]中。因此，以下实施例中描述的Hi和Ni抑制试验中的血清学结果指示由SIV-A引发的疾病的预防。实施例1：由编码单HA抗原的RP诱导的血凝抑制(HI)抗体滴度
为了测定编码毒株欧亚禽(EA)、Gent/84、Scot/94和pdm09中每一个的单HA抗原的甲病毒属RNA RP的保护和交叉保护，进行了以下研究：
以间隔约3周的初次-加强方案，用各自的RNA颗粒和XSolve50佐剂对5周龄猪(每组3只)进行疫苗接种。在加强接种后1-2周收集血清，以测定流感抗原特异性血凝抑制抗体滴度，其与针对流感的保护相关。HI试验测量防止流感病毒诱导的红细胞的血凝的最高血清稀释度。该稀释度的倒数被定义为以Log 2base计的HI滴度。所报告的值是3只动物的平均值。该试验的检出限为4(图中的虚线)，因此低于4的滴度在图中报告为3。
HI实验的结果示于图1-4中。可得出以下结论：
·图1：EA谱系的毒株EUHA1-3的RP显示出针对几乎所有测试的IAS的EA抗原的最高抗原特异性HI抗体滴度，随后是EUH 1-5和EUH1-2。此外，可以观察到针对一些Scot/94和pdm09 HA抗原的交叉反应滴度。测试毒株均未显示出针对Gent/84IAS抗原的任何交叉反应滴度(所有HI滴度均低于4)。
·图2：毒株EUHA1-15的RP显示出针对几乎所有测试的Scot/94抗原的最高抗原特异性HI抗体滴度，随后是EUH 1-17，因此对于进化枝2和3的Scot/94抗原表现最好。毒株EUHA1-8的RP显示出针对测试的进化枝1的Scot/94抗原的最高抗原特异性HI抗体滴度。此外，可以观察到针对一些EA和pdm09 HA IAS抗原的交叉反应滴度。测试毒株均未显示出针对Gent/84IAS抗原的任何交叉反应滴度(所有HI滴度均低于4)。
·图3：Pdm09谱系的毒株EUHA1-11的RP显示出针对几乎所有pdm09抗原的最高抗原特异性HI抗体滴度。此外，可以观察到针对大多数EA和Scot/94HA抗原的交叉反应滴度。测试毒株均未显示出针对Gent/84IAS抗原的任何交叉反应滴度(所有HI滴度均低于4)。
·图4：Gent/84谱系的毒株EUHA3-4的RP显示出针对所有测试的Gent/84抗原的最高抗原特异性HI抗体滴度。没有观察到针对EA、Scot/94和pdm09抗原的HA抗原的明显的交叉反应滴度。
实施例2：由编码双HA抗原的RP诱导的血凝抑制(HI)抗体滴度
为了测定编码双HA抗原的甲病毒属RNA RP与以下抗原的组合的血清学功效：
1)pdm09和Gent/84谱系的HA抗原，或
2)EA和Scot/94抗原的HA抗原，
进行了具有如实施例1所描述的设计的研究。
HI试验的结果示于图5中。可得出以下结论：
可以观察到并非所有测试的组合都诱导强烈的血清学反应。此外，可以令人惊讶地观察到复制子颗粒的病毒基因组中的基因顺序对于诱导血清学反应很关键。
·谱系Pdm09和Gent/84的HA抗原的组合：在复制子颗粒的病毒基因组中，只有Gent/84在前且pdm09位于其后的组合诱导了强烈的血清学反应。相反，在复制子颗粒的病毒基因组中，以Pdm09在前且Gent/84位于其后的顺序，仅能观察到针对Gent/84HA抗原的低得多的血清学反应和针对Pdm09 HA抗原的非常弱的血清学反应。
·谱系EA和Scot/94的HA抗原的组合：并非所有测试的组合都诱导强烈的血清学反应。Scot/94的毒株EUHA1-17和EA的EUHA1-3的组合显示出最好的血清学反应(针对两种谱系的IAS抗原的最高HI滴度)。
此外，只有在复制子颗粒的复制子RNA中Scot/94在前且EA位于其后的组合才诱导强烈的血清学反应。相反，复制子颗粒的复制子RNA中以EA在前且Scot/94位于其后的顺序，未观察到针对EA HA抗原的显著的血清学反应。
·在测试的各种组合中，EUHA3-4+EUHA1-11和EUHA1-17+EUHA1-3毒株的组合诱导以HI滴度测量的最佳免疫力。因此，这些组合有利地用于组合两种复制子颗粒的制剂中，即用于组合以此顺序编码EUHA3-4+EUHA1-11毒株的第一RNA复制子颗粒与以此顺序编码EUHA1-17+EUHAl-3毒株的第二RNA复制子颗粒。
因此，可以令人惊讶地证明RNA复制子颗粒内HA基因的位置和/或HA抗原的特定组合决定以HI滴度测量的诱导的免疫力水平。实施例3：由编码单NA抗原的RP诱导的神经氨酸酶抑制(NI)抗体滴度
为了测定编码毒株欧亚禽(EA)、Gent/84、Scot/94和pdm09中每一个的单HA抗原的甲病毒属RNA RP的血清学功效，进行了以下研究：
以间隔约3周的初次-加强方案，用各自的RNA复制子颗粒和XSolve50佐剂对5周龄猪(每组3只)进行疫苗接种。在加强接种后1-2周收集血清，以测定流感抗原特异性神经氨酸酶抑制(NI)抗体滴度。如上所述，使用基于凝集素(花生凝集素)的试验测定NI滴度，与对照孔相比抑制NA活性至少50％的血清的最高稀释度的倒数被定义为NI滴度。该试验的检出限为2(图中的虚线)。
NI实验的结果示于图7-10中。可得出以下结论：
·图7：EA谱系的毒株EUNA1-2的RP显示出针对几乎所有测试的IAS的EA抗原的最高抗原特异性NI抗体滴度。此外，可以观察到针对一些Scot/94、pdm09和Gent/84NA抗原的交叉反应。
·图8：毒株EUNA1-4的RP显示出针对大多数测试的pdm09抗原的最高抗原特异性NI抗体滴度，尽管观察到的NI滴度的水平低于EA谱系的RP实现的NI滴度。此外，可以观察到针对EA、Scot/94和Gent/84NA IAS抗原的交叉反应滴度。测试毒株之间测得的滴度差异较低。
·图9：Scot/94谱系的毒株EUNA2-6的RP显示出针对所有测试的Scot/94抗原的最高抗原特异性NI抗体滴度。此外，对于毒株EUNA2-6，可以观察到针对EA、pdm09和Gent/84NA抗原的高水平的交叉反应。
·图10：Gent/84谱系的毒株EUNA2-7的RP显示出针对所有测试的Gent/84抗原的高抗原特异性NI抗体滴度，并且还显示出针对EA、Scot/94和pdm09抗原的NA抗原的明显的交叉保护。
实施例4：由编码双或三NA抗原的RP诱导的NI抗体滴度
为了测定编码双或三HA抗原的甲病毒属RNA RP的血清学功效，设计并产生编码来自以下所列谱系的NA抗原的RP：
1)EA和Gent/84谱系的NA抗原，或
2)EA、Gent/84和Scot/94抗原的NA抗原，
进行了具有如实施例3所描述的设计的研究。
NI实验的结果示于图11中。可得出以下结论：
结果表明所有测试的组合均诱导血清学反应，而与基因的顺序无关。因此，可以令人惊讶地观察到与HA抗原相反的观察结果(参见上述实施例2)，复制子颗粒的病毒基因组中NA基因的顺序对于诱导血清学反应并不重要。
实施例5：由编码双和三NA抗原的RP诱导的NI抗体滴度
图7-10中显示的结果揭示EA谱系、Gent/84谱系的毒株与Scot/94谱系的毒株的组合应该提供针对IAS的最佳保护，其具有针对全部四种谱系的最佳保护和交叉保护。因此，测试这种交叉保护的最佳候选毒株是Scot/94谱系的毒株EUNA2-6与Gent/84谱系的毒株EUNA2-7的组合，然后其可进一步与EA谱系的毒株(例如毒株EUNA1-2)或pdm09谱系的毒株(例如毒株EUNA1-4)组合。由此测试这些毒株的组合的血清学反应。
因此，为了测定编码双和三NA抗原的甲病毒属RNA RP与以下抗原的组合的保护作用：
1)EA和Gent/84谱系的NA抗原
2)Scot/94、Gent/84和EA抗原的NA抗原，或
3)Scot/94、Gent/84和pdm09抗原的NA抗原，
进行了具有如实施例3所描述的设计的研究。
结果示于图12：
·与HA抗原观察到的结果相反，仅来自三种谱系的NA抗原的组合足以诱导针对全部四种IAS谱系的血清学反应。
·仅使用来自两种谱系的NA抗原的组合已经可以实现针对全部四种IAS谱系的弱血清学反应，而与RNA复制子颗粒中基因的顺序无关。
·用Scot/94和Gent/84NA抗原的组合与pdm09或EA谱系的NA抗原进一步组合可实现最高血清学反应。
表2：SEQ ID NO的列表
Figure BDA0004003198460000631
Figure BDA0004003198460000641
实施例6：多价IAV-S疫苗的疫苗功效的评价
进行研究以测定包含两个双HA RP(编码EUHA1-17和EUHA1-3抗原的EUSIV-T8 RP以及编码EUH3-4和EUH1-11抗原的EUSIV-K RP，表1a和2)和一个三NA构建体(编码EUN2-6、EUN1-2和EUN2-5抗原的EUSIV-R，表1b和2)的多价IAV-S疫苗的免疫原性和功效。在5和8周龄时，以两次肌内(IM)疫苗接种方式向5头猪施用含佐剂的疫苗(2mL/剂；3×5×106RP/剂，接种疫苗)。相同数量的未接种疫苗的猪接受含佐剂的磷酸盐缓冲盐水。10周龄时，通过定量实验感染前收集的血清样品中HI和NI滴度来测量疫苗的免疫原性。10周龄时(研究第32天)，通过气管内途径针对Gent/84[A/swine/Belgium/113/2013(H3N2)]攻击感染测试疫苗的功效。感染后3天，针对IAV-S感染诱导的发热(即直肠温度升高)和肺损伤测定疫苗功效。
该实验的结果示于图13A、13B、13C和13D。多价IAV-S疫苗诱导针对属于所有四种谱系的异源IAV-S毒株的功能性HI滴度(图13A)和针对所有三种谱系的同源NA抗原的NI滴度(图13B)。此外，多价IAV-S疫苗保护猪免受实验感染诱导的直肠温度升高、发热(图13C)和猪病变(图13D)。这些结果证明测试的多价IAV-S具有免疫原性且是有效的。
实施例7：ID施用后疫苗功效的评价
进行研究以测定包含两个双HA RP(编码EUHA1-17和EUHA1-3抗原的EUSIV-T8 RP以及编码EUH3-4和EUH1-11抗原的EUSIV-K RP，表1a和2)和一个三NA构建体(编码EUN2-6、EUN1-2和EUN2-5抗原的EUSIV-R，表1b和2)的多价IAV-S疫苗的血清学功效。在5和8周龄时，使用
Figure BDA0004003198460000651
无针注射器以两次皮内(ID)疫苗接种方式向3头猪施用含佐剂的疫苗(200μL/剂；3×3×106RP/剂，接种疫苗)。相同数量的未接种疫苗的猪接受含佐剂的磷酸盐缓冲盐水。10周龄时，通过定量收集的血清样品中HI和NI滴度来测量疫苗的免疫原性。
该实验的结果示于图14A和B中。多价IAV-S疫苗诱导针对属于所测四种谱系中三种的异源IAV-S毒株的功能性HI滴度(图14A)和针对所测三种同源NA抗原中两种的NI滴度(图14B)。这些结果证明多价IAV-S疫苗的皮内施用也是有效的。
Figure IDA0004003198500000011
Figure IDA0004003198500000021
Figure IDA0004003198500000031
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Claims (20)

1.一种用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用的免疫原性组合物，所述组合物包含第一和第二RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原。
2.根据权利要求1所述使用的免疫原性组合物，其中所述第一HA抗原来自毒株A/swine/Italy/240849/2015(H3N2)。
3.根据权利要求1或2所述使用的免疫原性组合物，其中由所述第一核酸序列编码的所述第一HA抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中所述第二HA抗原来自毒株A/swine/England/373/2010(H1N1)。
5.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中由所述第二核酸序列编码的所述第二HA抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中所述第三HA抗原来自毒株A/swine/Italy/3033-1/2015(H1N2)。
7.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中由所述第三核酸序列编码的所述第三HA抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中所述第四HA抗原来自毒株A/swine/Italy/28762-3/2013(H1N1)。
9.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中由所述第四核酸序列编码的所述第四HA抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其适配为同时施用所述第一和第二RNA复制子颗粒。
11.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其还包含第三RNA复制子颗粒，
所述第三RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
所述第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
所述第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，并且
所述第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系。
12.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫原性组合物，其中所述RNA复制子颗粒是甲病毒属RNA复制子颗粒。
13.根据权利要求12所述使用的免疫原性组合物，其是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)甲病毒属RNA复制子颗粒。
14.一种疫苗，其包含根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物。
15.根据权利要求14所述的疫苗，其是无佐剂的疫苗。
16.根据权利要求14所述的疫苗，其包含选自下组的佐剂：可生物降解的油、具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂、以及与具有2.5-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂混合的可生物降解的油。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的疫苗，用于在受试者的由甲型猪流感病毒引发的疾病的预防中使用。
18.一种对猪进行免疫接种以抵抗甲型猪流感病毒的方法，所述方法包括向所述猪施用免疫有效量的根据权利要求14-16中任一项所述的疫苗。
19.一种免疫原性组合物，其包含第一和第二RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原。
20.一种免疫原性组合物，其包含第一、第二和第三RNA复制子颗粒，
所述第一RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲型猪流感病毒(IAV-S)的第一和第二血凝素(HA)抗原的第一和第二核酸序列，其中
所述第一HA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的HA抗原，并且
所述第二HA抗原是A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系的HA抗原，
所述第二RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第三和第四HA抗原的第三和第四核酸序列，其中
所述第三HA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的HA抗原，并且
所述第四HA抗原是欧亚类禽H1avN1(EA)谱系的HA抗原，所述第三RNA复制子颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码IAV-S的第一、第二和第三神经氨酸酶(NA)抗原的第一、第二和第三核酸序列，其中
所述第一NA抗原是A/swine/Scotland/410440/1994-样H1huN2(Scot/94)谱系的NA抗原，
所述第二NA抗原是A/swine/Gent/1/1984-样H3N2(Gent/84)谱系的NA抗原，并且
所述第三NA抗原选自A(H1N1)pdm09(pdm09)谱系或欧亚类禽H1avN1(EA)谱系。
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