RU2806690C2 - Вакцинация частицами репликона и масляным адъювантом - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложена вакцина против патогена, который вызывает заболевание у животного. Вакцина содержит иммунологически эффективное количество частиц РНК-репликона альфавируса, кодирующих антиген, происходящий из патогена животного. Вакцина также содержит масляный адъювант. Масляный адъювант содержит минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е. Предложен набор для иммунизации животного. Набор содержит два контейнера, один контейнер содержит частицу РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кодирующую антиген, происходящий из патогена животного, и один контейнер содержит масляный адъювант. Масляный адъювант содержит минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е. Предложен способ иммунизации животного с использованием указанной вакцины и применение частицы РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, в способе иммунизации животного. Изобретение позволяет проводить эффективную иммунизацию животных от различных заболеваний. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 11 ил., 8 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вакцинации против патогенов животных с использованием частиц РНК-репликонов альфавирусов и масляных адъювантов, к вакцине и составному набору, содержащему частицы репликонов и масляный адъювант, а также к методам и способам получения и применения вакцины и компонентов набора.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В течение многих лет для вакцин использовали ряд методов на основе векторов, направленных на защиту от патогенов животных. Один из таких методов на основе векторов включает использование частиц РНК-репликонов альфавирусов (RP) [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1): 1-9 (2012) doi: 10.1017/S1466252312000011; Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7): 1723-1727 (2010)], которые были разработаны на основе нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko et al., Virology 239: 389-401 (1997)], вирус Синдбис [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67: 6439-6446 (1993)] и вирус леса Семлики [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9: 1356- 361 (1991)]. Кодированные патогенные антигены экспрессируются частицей репликона после заражения клетки-мишени человека или животного. Результатом является индукция защитных антител к экспрессируемому антигену. RP обладают привлекательным профилем безопасности и эффективности по сравнению с некоторыми традиционными композициями вакцин [Vander Veen, et al., Anim Health Res Rev. 13(1): 1-9 (2012)]. RP-платформа является основой для нескольких вакцин, лицензированных USDA, которые включают: вакцину против эпидемической диареи свиньи, частицу РНК (код препарата 19U5.P1), вакцину против свиного гриппа, РНК (код препарата 19A5.D0), вакцину против птичьего гриппа, РНК (код препарата 19O5.D0) и рецептурный препарат, частицу РНК (код препарата 9PP0.00).

Частицы РНК-репликонов альфавирусов не содержат гены структурных белков альфавируса, но сохраняют элементы репликации, необходимые для самоамплификации цитоплазматической РНК, и экспрессию встроенных гетерологичных нуклеиновых кислот под контролем высокоактивного альфавирусного субгеномного промотора 26S. Соответственно, RP представляют собой инфекционные частицы с одним циклом репликации, которые являются дефектными по репликации вследствие отсутствия генов структурных белков. [Lundstrom, Vaccines 6: 2392-2415 (2014)]. Структурные белки, необходимые для упаковки и продукции частиц репликонов, соответственно должны предоставляться in trans в подходящих клетках-хозяевах для продуцирования RP. [см. Vajdy et al., Immunol. and Cell Biol. 82: 617-627 (2004)]. Обычно структурные белки получают посредством транзиторной котрансфекции репликоновой РНК и одной или нескольких “вспомогательных” РНК, кодирующих структурные белки. Альтернативно RP можно получить из пакующих клеточных линий, которые экспрессируют вирусные структурные белки, конститутивно или транзиентно, из одной или нескольких ДНК экспрессионных кассет. Таким образом, продуцирование частиц репликонов сохраняет репликационно-дефектные свойства векторов, поскольку структурные белки не включены в полученный в результате геном RP [Polo et al. Dev. Biol., 104: 181-185 (2000)]. Эти репликационно-дефектные частицы РНК-репликонов альфавирусов, при использовании для иммунизации мишени - человека или животного, вызывают защитные иммунные ответы in vivo. Например, альфавирусные векторы на основе VEE (венесуэльский энцефаломиелит лошадей) вызывают сильный мукозальный и системный иммунный ответ после системной иммунизации мышей и более крупных животных. [Davis et al., IUBMB Life 53: 209-211 (2002)].

Адъюванты представляют собой известные соединения, которые способны обеспечить неспецифическую стимуляцию иммунной системы мишени - человека или животного. В вакцинах на основе инактивированных или субъединичных антигенов используют стандартные адъюванты. Существует большое разнообразие типов и композиций адъювантов, например: соли алюминия, такие как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, липосомы, глюканы, альгинат, бактериальные компоненты, такие как компоненты стенки клеток, минеральные или неминеральные масла, синтетические адъюванты, такие как: неионные блок-полимеры, полиамины, такие как декстрансульфат, Carbopol™, пиран и сапонины, такие как: Quil A™ или Q-vac™. Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™.

Кроме того, пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, туфтсин, часто используются в качестве адъюванта. Аналогичным образом, используются комбинированные продукты, такие как композиции ISA ™ (Seppic, France).

Справочник по адъювантам, их применению и эффектам: “Vaccine adjuvants” (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).

Цитирование любой ссылки в настоящем описании не должно быть истолковано как признание того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня для настоящей заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей частицу РНК-репликона альфавирусов, кодирующую антиген, происходящий из патогена животного, где вакцина также содержит масляный адъювант.

В варианте осуществления вакцины по изобретению, масляный адъювант содержит по меньшей мере одно масло, выбранное из минерального масла и неминерального масла.

В варианте осуществления вакцины по изобретению, масляный адъювант содержит минеральное масло; предпочтительно минеральное масло представляет собой жидкое парафиновое масло.

В варианте осуществления вакцины по изобретению, масляный адъювант содержит неминеральное масло; предпочтительно неминеральное масло выбрано из синтетического масла, полусинтетического масла, животного масла и растительного масла. Более предпочтительно неминеральное масло выбрано из сквалана, сквалена, токоферола и растительного масла. В одном из вариантов осуществления, токоферол представляет собой альфа-токоферол; более предпочтительно, альфа-токоферол выбран из витамина Е и витамина Е-ацетата. В одном из вариантов осуществления, растительное масло представляет собой олеат, более предпочтительно, этилолеат.

Более предпочтительно неминеральное масло представляет собой сквалан.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению, масляный адъювант содержит более одного масла.

В варианте осуществления масляного адъюванта, содержащего более одного масла, адъювант включает минеральное масло и одно или более неминеральных масел. Более предпочтительно масляный адъювант содержит жидкое парафиновое масло в качестве минерального масла и одно или более неминеральных масел, выбранных из сквалана, сквалена, витамина Е, ацетатной формы витамина Е, олеата и этилолеата. Еще более предпочтительно, масляный адъювант содержит жидкое парафиновое масло и ацетатную форму витамина Е. Наиболее предпочтительно масляный адъювант представляет собой XSolve™.

В альтернативном варианте осуществления масляного адъюванта, содержащего более одного масла, адъювант содержит более одного неминерального масла. Предпочтительно масляный адъювант содержит более одного неминерального масла, выбранного из сквалана, сквалена, витамина Е, ацетатной формы витамина Е, олеата и этилолеата. Еще более предпочтительно, масляный адъювант содержит сквалан и ацетатную форму витамина Е. Наиболее предпочтительно масляный адъювант представляет собой SVEA™.

В варианте осуществления вакцины по изобретению, количество минерального масла в масляном адъюванте составляет 1-70% об./об. масляного адъюванта. Предпочтительно масляный адъювант содержит количество минерального масла, соствляющее от 5 до 60% об./об. масляного адъюванта.

В варианте осуществления вакцины по изобретению общее количество неминерального масла составляет 0,1-30% масса/об. масляного адъюванта. Предпочтительно масляный адъювант содержит общее количество неминерального масла, составляющего 0,5-25% об./об. масляного адъюванта.

В варианте осуществления, в случае, когда неминеральное масло содержит сквалан, масляный адъювант содержит сквалан в количестве 0,5-30% масса/об. масляного адъюванта; более предпочтительно масляный адъювант содержит сквалан в количестве 1-25% масса/об., 2-15% масса/об. или даже содержит сквалан в количестве 3-10% масса/об. масляного адъюванта.

Альтернативно или дополнительно, в варианте осуществления, когда неминеральное масло содержит ацетатную форму витамина Е, масляный адъювант содержит ацетатную форму витамина Е в количестве 0,1-30% масса/об. масляного адъюванта; более предпочтительно масляный адъювант содержит ацетатную форму витамина Е в количестве 0,5-20% масса/об., 1-16% масса/об., или даже содержит ацетатную форму витамина Е в количестве 2-10% масса/об. масляного адъюванта.

В варианте осуществления вакцины по изобретению, масляный адъювант получен в виде эмульсии масла и водной фазы. Предпочтительно масляный адъювант получен в виде эмульсии типа масло-в-воде (O/W).

В одном из вариантов осуществления, водная фаза включает воду фармацевтически приемлемого качества.

В одном из вариантов осуществления, эмульсия масляного адъюванта получена в виде микроэмульсии, причем мелкие капли внутренней фазы имеют размер меньше 1 мкм. Предпочтительно микроэмульсия представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, более предпочтительно микроэмульсию типа масло-в-воде получают с использованием энергичной гомогенизации, еще более предпочтительно ее получают методом микрофлюидизации.

В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению, эмульсия масляного адъюванта содержит эмульгатор, предпочтительно эмульгатор содержит полисорбат, более предпочтительно эмульгатор содержит полисорбат 80.

В одном варианте осуществления, вакцины по изобретению содержат эмульсию масляного адъюванта, предпочтительно вакцина содержит масляный адъювант, полученный в виде эмульсии типа “масло в воде”.

В одном варианте осуществления вакцины по изобретению, вакцина получена в виде эмульсии типа масло-в-воде (O/W).

В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению, частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В более конкретном варианте осуществления, частица РНК-репликона альфавируса VEE представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса VEE TC-83. В других вариантах осуществления, частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса Синдбис. В других вариантах осуществления, частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса леса Семлики.

В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению, для кодированного антигена, происходящего из животного патогена, патоген животного выбран из вируса, бактерии, паразита, простейшего, гриба, риккетсии и приона. Более предпочтительно кодируемый антиген, происходящий из патогена животного, представляет собой антиген, происходящий из вируса или бактерии. Наиболее предпочтительно антиген происходит из вируса.

В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению, RP кодирует антиген, происходящий из патогена животного, при этом животное является животным, имеющим отношение к ветеринарии. Предпочтительно, животное выбрано из рыбы, пернатого и млекопитающего. Более предпочтительно, животное представляет собой дикое, сельскохозяйственное или домашнее животное. К сельскохозяйственному животному относятся рыбы, птицы, свиньи или жвачные животные; предпочтительно к свинообразным относятся свиньи; предпочтительно к пернатым относятся курица, индейка, утка, гусь, перепел или страус; предпочтительно к жвачным животным относятся корова, овца, коза, буйвол, верблюд или олень; предпочтительно, к рыбам относится костистая рыба с плавниками, более предпочтительно, лосось или цихлида (то есть член семейства цихлид). Лососевая рыба предпочтительно выбрана из семги, стальноголового лосося, чавычи, кижуча, горбуши, кеты и нерки, радужной, ручьевой, озерной и бурой форели и голеца. К цихлиде предпочтительно относится тилапия. Домашнее животное предпочтительно выбрано из кошки, собаки и лошади. Более предпочтительно животное представляет собой тилапию, курицу или свинью.

В варианте осуществления вакцины по изобретению нуклеотидная последовательность гена, кодирующего антиген, происходящий из патогена животного по изобретению, оптимизирована для экспрессии в клетках целевых видов животных для вакцины. В одном из вариантов осуществления оптимизация нуклеотидной последовательности представляет собой кодон-оптимизацию. В одном из вариантов осуществления оптимизация нуклеотидной последовательности представляет собой оптимизацию вторичной структуры РНК-транскрипта.

В предпочтительном варианте осуществления оптимизация нуклеотидной последовательности гена, кодирующего антиген, происходящий от патогена животного по изобретению, относится как к использования кодона, так и вторичной структуры РНК-транскрипта. Предпочтительно, оптимизацию нуклеотидной последовательности проводят в соответствии с процедурами, описанными в одном или более из: US 7561972, US 7561973, US 7805252 и US 8126653.

В особенно предпочтительном варианте вакцины по изобретению масляный адъювант содержит минеральное масло и неминеральное масло, вакцина получена в виде эмульсии типа масло в воде, часть РНК-репликона альфавирусов представляет собой частицу РНК-репликона альфавирусов VEE, антиген патогена животного является антигеном вируса, а вирус является патогеном свиней.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению кодируемый антиген, происходящий из патогена животного, представляет собой белок гемагглютинин (HA) или нейраминидазу (NA) вируса гриппа или антигенный фрагмент такого белка HA или NA. Белок HA и/или NA предпочтительно происходит из вируса гриппа типа A, более предпочтительно из вируса свиного гриппа A или из вируса эпидемической диареи свиней (PEDV).

Настоящее изобретение также относится к поливалентным вакцинам, содержащим частицы РНК-репликонов альфавирусов по настоящему изобретению, где вакцина содержит более одной RP, кодирующей антиген, или вакцина содержит одну или более RP, каждая из которых кодирует один или более антигенов по изобретению.

Вакцина по изобретению содержит иммунологически эффективное количество частиц РНК-репликонов альфавирусов по изобретению. В одном из вариантов осуществления, вакцина содержит от около 1 × 10^3 до приблизительно 1 × 10^11 RP. В более предпочтительных вариантах осуществления, вакцина содержит от приблизительно 1 х 10^4 до приблизительно 1 × 10^10 RP. В еще более предпочтительных вариантах осуществления, вакцина содержит от приблизительно 1 × 10^5 до приблизительно 1 × 10^9 RP.

Вакцина по изобретению содержит иммунологически эффективное количество масляного адъюванта по изобретению. В одном из вариантов осуществления, вакцина содержит масляный адъювант в количестве от приблизительно 10% до 90% об./об. вакцины. Более предпочтительно вакцина содержит масляный адъювант в количестве от приблизительно 20% до 80% об./об., от 30 до 70% об./об. или даже от 40 до 60% об./об. вакцины. Наиболее предпочтительно вакцина содержит масляный адъювант в количестве приблизительно 50% об./об. вакцины.

В конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят в объеме на дозу для животного от 0,05 до 5 мл. В более предпочтительных вариантах осуществления, вводимая доза на одно животное составляет от 0,1 до 2 мл. В еще более предпочтительных вариантах осуществления, вводимая доза составляет от 0,2 мл до 1,5 мл. В еще более предпочтительных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,3 до 1,0 мл. В еще более предпочтительных вариантах осуществления, вводимая доза на одно животное составляет от 0,4 до 0,8 мл.

В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению, вакцина содержит дополнительный адъювант. Предпочтительно дополнительный адъювант выбран из группы, включающей компонент клеточной оболочки бактерии, цитокин и иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, содержащую неметилированный CpG. В одном из вариантов осуществления, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота соответствует одной или более, выбранным из WO 2012/089.800 (семейство X4), WO 2012/160.183 (семейство X43) и WO 2012/160.184 (семейство X23).

В варианте осуществления вакцины по изобретению вакцина содержит дополнительный антиген патогена животного. В предпочтительном варианте осуществления, дополнительный антиген выбран из группы: живой аттенуированный микроорганизм, инактивированный микроорганизм и субъединица микроорганизма.

В дополнительном аспекте изобретение относится к составному набору, содержащему по меньшей мере два контейнера, причем по меньшей мере один контейнер содержит частицу РНК-репликона альфавируса, кодирующую антиген, происходящий из патогена животного, и по меньшей мере один контейнер содержит масляный адъювант. Каждый из по меньшей мере двух контейнеров содержит частицу РНК-репликона альфавирусов или масляный адъювант в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах осуществления составного набора по настоящему изобретению, один или более или все из следующих компонентов: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, животный патоген и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или нескольких вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один содержащий RP контейнер содержит RP в качестве лиофилизата.

В альтернативном варианте осуществления по меньшей мере один содержащий RP контейнер содержит RP в водном растворе; водный раствор, предпочтительно содержащий буфер; водный раствор предпочтительно хранится в охлажденном или замороженном виде. В одном из вариантов осуществления, водный раствор представляет собой восстановленный раствор RP, полученный в результате смешивания лиофилизата RP и подходящего водного разбавителя.

В варианте осуществления, где по меньшей мере один контейнер содержит RP в качестве лиофилизата, составной набор по изобретению может содержать дополнительный контейнер, содержащий подходящий разбавитель для восстановления лиофилизированного RP. В предпочтительном варианте осуществления разбавитель представляет собой водный раствор, предпочтительно содержащий буфер и/или стабилизатор и воду фармацевтически приемлемого качества.

В предпочтительном варианте осуществления контейнер, содержащий масляный адъювант, содержит масляный адъювант, полученный в виде эмульсии масла и водной фазы; предпочтительно эмульсия представляет собой эмульсию типа масло-в-воде.

В варианте осуществления составного набора набор содержит инструкции по применению набора и/или его составных компонентов. В предпочтительных вариантах осуществления инструкции по применению предусмотрены для одного или нескольких компонентов набора; или предусмотрены посредством ссылки на инструкции, находящиеся в электронном виде, например информацию, доступную для просмотра или загружаемую с веб-сайта производителя или организации торгующей набором.

В одном из вариантов осуществления составной набор представляет собой коробку, содержащую по меньшей мере два контейнера и инструкции по применению, отображаемые на носителе информации (например, карточке или листке), прилагаемом к коробке или находящегося внутри нее.

В варианте осуществления составного набора набор также может быть предложением составляющих его компонентов (относящихся к коммерческой продаже), например, на веб-сайте в Интернете, для применения в способе иммунизации по изобретению.

В варианте осуществления составного набора один или более контейнеров могут содержать дополнительный адъювант, описанный в настоящем описании; также или альтернативно, один или более контейнеров могут содержать дополнительный антиген патогена животного, описанного в настоящем описании.

РНК-репликон альфавируса, кодирующий антиген, происходящий из патогена животного, и масляный адъювант, определенный в настоящем описании, можно вводить целевому животному. Такое введение будет вызывать эффективную иммунную защиту у указанного животного от инфекции или заболевания, вызванного патогеном животного. Введение может быть выполнено, например, в соответствии с рекомендациями EMA-CVMP (Европейское агентство лекарственных средств - Комитет по ветеринарным лекарственным препаратам) для сопутствующего применения иммунологических ветеринарных лекарственных средств.

Следовательно, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу иммунизации животного, включающему введение животному иммунологически эффективного количества частицы РНК-репликона альфавирусов, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, и масляного адъюванта.

В предпочтительном варианте осуществления способа иммунизации животного по настоящему изобретению способ включает введение животному вакцины по изобретению.

В предпочтительных вариантах осуществления способа иммунизации животного по настоящему изобретению один или более или все из следующих компонентов: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В предпочтительных вариантах осуществления способа иммунизации животного по настоящему изобретению кодируемый антиген, происходящий из патогена животного, представляет собой антиген, происходящий из патогена из рыбы, члена семейства цихлид, тилапии, млекопитающего, птицы и курицы.

В варианте осуществления способа иммунизации животного по изобретению частицу РНК-репликона альфавируса и масляный адъювант вводят в организм животного-мишени или наносят на него при одновременном или сопутствующем применении.

В предпочтительном варианте осуществления способа иммунизации животного по изобретению, частица РНК-репликона альфавируса и масляный адъювант вводят в организм животного-мишени или наносят на него при одновременном применении, то есть в виде единой композиции.

В предпочтительном варианте осуществления единая композиция представляет собой вакцину по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления единую композицию получают незадолго до введения целевому животному путем смешивания обоих композиций, композиции, содержащей RP, и композиции, содержащей масляный адъювант, как описано в настоящем изобретении; более предпочтительно путем смешивания содержимого контейнеров составного набора по изобретению; еще более предпочтительно путем смешивания водного раствора, содержащего RP, и композиции, содержащей эмульсию типа “масло в воде” масляного адъюванта. В альтернативном, даже более предпочтительном варианте осуществления, одну композицию получают путем восстановления RP лиофилизата эмульсией типа “масло в воде” масляного адъюванта, как определено в настоящем изобретении. Фактически, при получении единой композиции получают вакцину по изобретению.

Предпочтительно, “незадолго” до введения целевому животному обозначает, в порядке предпочтительности: “в течение 24 часов” до введения целевому животному, более предпочтительно “в течение 16 часов”, “в течение 12 часов”, “в течение 8 часов”, “в течение 4 часов” или даже “в течение 2 часов” до введения целевому животному.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления способа иммунизации животного по изобретению частицу РНК-репликона альфавирусов и масляный адъювант вводят в организм целевого животного или наносят на него при сопутствующем применении, то есть в составе отдельных композиций, которые вводят раздельно по месту и/или во времени.

В предпочтительном варианте осуществления сопутствующее применение включает введение в организм целевого животного, или наносят на него, частиц РНК-репликона альфавируса и масляного адъюванта, при этом разделенных по месту и/или во времени, которые включены в составной набор по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления сопутствующего применения по изобретению отдельные композиции вводят в организм целевого животного или наносят на него с ограниченным промежутком времени между введениями и одинаковым или разными способами введения в отдельные места; предпочтительно “ограниченный промежуток времени” между введениями находится в указанном порядке предпочтительности: в пределах 2 недель, более предпочтительно в пределах 1 недели, еще более предпочтительно в пределах 1 дня, в пределах 16 часов, в пределах 12 часов, в пределах 8 часов, в пределах 4 часов, в пределах 2 часов, в пределах 1 часа, в пределах 30 минут или даже в пределах 10 минут. Наиболее предпочтительно, сопутствующее применение является по существу одновременным.

В предпочтительном варианте осуществления сопутствующего применения по изобретению отдельные композиции вводят с ограниченным промежутком времени между введениями в организм целевого животного или наносят на него одним и тем же или разными способами введения в отдельные места. В соответствии с изобретением, в организме животного или на нем отдельные места введения удалены друг от друга в указанном порядке предпочтительности: по меньшей мере на 1 см друг от друга; предпочтительно по меньшей мере на 2 см, по меньшей мере на 5 см, по меньшей мере на 10 см или даже по меньшей мере на 25 см друг от друга.

В предпочтительном варианте осуществления сопутствующего применения по изобретению, отдельные композиции вводят с ограниченным промежутком времени между введениями в организм целевого животного, или нанесениями на него, одним и тем же или разными способами введения по существу в одном и том же месте в или на организме целевого животного, но достаточно разделено во времени друг от друга для предотвращения смешивания композиций на участке введения. В соответствии с изобретением, для предотвращения смешивания, достаточное разделение во времени происходит в указанном порядке предпочтительности: более 2 часов друг от друга, предпочтительно, более 6 часов, более 12 часов, более одного дня, более 2 дней или даже более одной недели друг от друга.

В одном из вариантов осуществления способа иммунизации животного по изобретению, введение в организм целевого животного или нанесение на него осуществляется путем парентерального введения. В альтернативном варианте осуществления, введение осуществляется способом мукозального введения. В еще одном альтернативном варианте осуществления, вакцина вводится способом местного введения.

Предпочтительный способ введения выбирают из внутрикожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного способов введения, иммерсии (погружения) и распыления. Способ внутрикожного введения предпочтительно представляет собой безыгольный способ введения, более предпочтительно с использованием устройства IDAL® (Intra-Dermal Application of Liquids).

В варианте осуществления введения вакцины по изобретению, вакцину вводят в виде праймерной вакцины и/или в качестве бустерной вакцины. В конкретных вариантах осуществления, вакцину по настоящему изобретению вводят в виде однократной (одноразовой) прививки, не требующей последующего повторного введения. В определенных вариантах осуществления, в случае введения как праймерной вакцины, так и бустерной вакцины, праймерную вакцину и бустерную вакцину вводят одним и тем же способом. В альтернативных вариантах осуществления, в случае введения как праймерной вакцины, так и бустерной вакцины, введение праймерной вакцины выполняется одним способом, а бустерной вакцины другим способом.

В некоторых вариантах осуществления введения вакцины по изобретению, вакцину вводят свиньям, причем праймерную вакцину и бустерную вакцину вводят путем внутрикожной инъекции. В альтернативном варианте осуществления, праймерная вакцина вводится путем внутрикожной инъекции, а бустерная вакцина вводится другим путем.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к способу получения вакцины по настоящему изобретению, включающему стадию смешивания частицы РНК-репликона альфавируса, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, и масляного адъюванта. Как частица РНК-репликона альфавируса, так и масляный адъювант смешиваются в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах осуществления способа производства вакцины по настоящему изобретению, один или более или все из следующих компонентов: вакцина, частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В варианте осуществления способа получения вакцины по настоящему изобретению, частица РНК-репликона альфавируса содержится в водном растворе.

В предпочтительном варианте осуществления способа получения вакцины по настоящему изобретению, смешивание выполняется таким образом, что частица РНК-репликона альфавируса, соответственно водный раствор, содержащий частицу РНК-репликона альфавирусов, и масляный адъювант смешиваются в объемном соотношении в указанном порядке предпочтительности: от 1:10 до 10:1; более предпочтительно в объемном соотношении от 1:5 до 5:1, от 1:4 до 4:1, от 1:3 до 3:1 или даже от 1:2 до 2:1. Наиболее предпочтительно частица РНК-репликона альфавирус, соответственно водный раствор, содержащий частицу РНК-репликона альфавируса и масляный адъювант, смешивается в объемном соотношении примерно 1:1.

В варианте осуществления, способ получения вакцины по настоящему изобретению включает смешивание содержимого контейнеров составного набора по настоящему изобретению.

В варианте осуществления способа получения вакцины по настоящему изобретению, частица РНК-репликона альфавируса, соответственно водный раствор, содержащий частицу репликона, смешивается с масляным адъювантом, описанным в настоящем изобретении, который содержится в другой эмульсии типа масло в воде, содержащей антиген патогена. Предпочтительно другая эмульсия типа масло в воде представляет собой вакцину, содержащую инактивированный вирусный и/или бактериальный патоген. В более предпочтительном варианте осуществления, RP, кодирующий антиген, полученный на основе SIV или из PEDV, смешивается с вакциной в виде эмульсии типа масло в воде, содержащей цирковирус свиней (PCV) и/или Mycoplasma hyopneumoniae, например Circumvent® PCVM.

В дополнительном аспекте изобретение относится к частице РНК-репликона альфавируса, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, для применения в защите животного от инфекции или заболевания, вызванного патогеном животного, причем частицу РНК-репликона альфавируса вводят в организм целевого животного или наносят на него при одновременном применении или при сопутствующем применении с масляным адъювантом. Как частица РНК-репликона альфавируса, так и масляный адъювант используются для защиты животных в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, один или более или все из следующих компонентов: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В предпочтительном варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, применение включает применение вакцины по изобретению.

В варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, защита является эффективной у целевых мишеней разных возрастов и типов.

В одном из вариантов осуществления, применение предназначено для защиты молодых животных. Предпочтительно молодыми животными являются свиньи в возрасте до 3 недель или цыплята в возрасте до 1 недели или лососевые рыбы в возрасте до 14 месяцев.

В дополнительном варианте осуществления, применение предназначено для защиты незрелых животных. Предпочтительно, незрелые животные представляют собой свиней в возрасте от 3 до 8 месяцев или цыплят в возрасте от 1 до 22 недель или лососевых рыб в возрасте от 14 до 24 месяцев.

В дополнительном варианте осуществления, применение осуществляется для защиты взрослых животных. Предпочтительно взрослые животные представляют собой свиней старше 8 месяцев или цыплят старше 22 недель или лососевых рыб старше 24 месяцев.

В отношении тилапии, предпочтительные периоды применения для защиты по изобретению обычно выражают не по возрасту, а по показателю диапазона общей массы тела: вакцинация с помощью погружной ванны предпочтительно проводится в случае, когда масса тилапии составляет от 0,5 г до 5 г. Вакцинация путем парентеральной инъекции предпочтительно проводится, когда масса тилапии составляет от 10 до 100 г; более предпочтительно, когда масса тилапии составляет от 20 до 25 г.

В варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, целевое животное может быть серопозитивным или серонегативным, либо в отношении антител к патогену животных, либо в отношении патогена животных, соответственно в отношении антигена, происходящего из патогена животных.

В варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, целевое животное представляет собой животное с положительным тестом на MDA (материнские антитела), в результате чего MDA взаимодействуют с патогеном животного, против которого предназначена защита. Более предпочтительно животное с положительным тестом на MDA, представляет собой птицу, жвачное животное или свинью. Еще более предпочтительно животное, положительное на MDA, представляет собой свинью.

В варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, целевым животным является беременное животное. Более предпочтительно беременное животное представляет собой жвачное животное или свинью. Еще более предпочтительно, беременное животное представляет собой свинью.

В варианте осуществления РНК-репликона альфавируса для применения в защите по настоящему изобретению, защита осуществляется в отношении продуктивных животных. Предпочтительно, продуктивными животными являются свиньи, которых держат на откорме, или куры-бройлеры или куры-несушки, или жвачные животные, которых содержат для производства молока или мяса, или лосось или тилапия.

В дополнительном варианте осуществления, защита осуществляется в отношении животных для восполнения популяции. Предпочтительно, животные для восполнения популяции представляют собой родительские или прародительские линии продуктовых животных.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к применению частицы РНК-репликона альфавируса, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, для получения вакцины для защиты животного от инфекции или заболевания, вызванного патогеном животного, включающей одновременное или сопутствующее применение указанной частицы РНК-репликона альфавируса с масляным адъювантом. Как частица РНК-репликона альфавируса, так и масляный адъювант используются в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах применения для получения вакцины по настоящему изобретению, один или более или все компоненты: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению частицы РНК-репликона альфавируса, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, для получения компонента составного набора, как определено здесь для изобретения, причем набор предназначен для защиты животного от инфекции или заболевания, вызванного патогеном животного, путем одновременного применения или сопутствующего применения компонентов указанного набора. Как частица РНК-репликона альфавируса, так и масляный адъювант используются в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах применения для получения компонента составного набора по настоящему изобретению, один или более или все следующие компоненты: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного, масляный адъювант и составной набор, являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению частицы РНК-репликона альфавируса, кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, для защиты животного от инфекции или заболевания, вызванного патогеном животного, причем применение включает одновременное применение или сопутствующее применение указанной частицы РНК-репликона альфавируса с масляным адъювантом. Как частица РНК-репликона альфавируса, так и масляный адъювант используются в иммунологически эффективных количествах.

В предпочтительных вариантах применения для защиты животного по настоящему изобретению, один или более или все компоненты: частица РНК-репликона альфавируса, кодируемый антиген, патоген животного и масляный адъювант являются такими, как определено в любом одном или более вариантах осуществления, описанных в настоящем описании.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут лучше понятны из следующих чертежей и подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигуры 1 и 2: Данные из примера 2:

Фигуры 1A-1B: Поражения легких

Фигуры 1C-1D: Назальные выделения

Фигуры 1E-1F: титры NI

Фигура 2A-2F: Данные титра HI (цифры пронумерованы слева направо, верхний ряд, затем нижний ряд)

Фигура 3: Образование сывороточных антител в ответ на N1-классический антиген у свиней, вакцинированных мультивалентным NA-RP примера 3:

Представлены образования ингибирующих нейраминидазы (NI) сывороточных антител, характерные для N1-классического штамма вакцинных композиций, как описано в примере 3. Образцы сыворотки собирали перед первой вакцинацией (возраст 3 недели), перед второй вакцинацией (возраст 7 недель) и перед контрольным инфицированием (возраст 10 недель).

Фигура 4: Эффективность комбинированной по четырем антигенам NA-RP вакцины против контрольных инфекций, в соответствии с результатами исследований, приведенными в примере 3, относительно показателей макроскопических поражений легких через 5 дней после инфицирования вирусом H1N1:

Показаны показатели поражения легких у свиней после введения вакцинных композиций, описанных в примере 3, и контрольное инфицирование H1-гамма-N1-классическим вирусом.

Фигуры 5 и 6: Результаты титров NI из примера 8:

На фигуре 5 представлены титры NI против N1 классического антигена NA в трех временных точках, измеренных во времени, включая стандартные отклонения. Это соответствует типичному профилю титра NI, измеренному для трех других типов NA.

На фигуре 6 представлены средние по группе титры NI комбинированных четырех типов NA через 7 дней после второй вакцинации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вакцинам, которые включают иммунологически эффективное количество одной или нескольких частиц РНК-репликонов альфавирусов, которые кодируют один или более антигенов патогена животного, и масляный адъювант. Частицы РНК-репликонов альфавирусов фактически аналогичны живому вирусу в том, что они могут инфицировать клетки-хозяина целевого человека или животного и экспрессировать содержащиеся в них гены. Это также демонстрируется тем фактом, что RP обычно определяют количественно по титрованию инфекционности на клетках. Следовательно, такие RP в фармацевтически приемлемом носителе обычно являются единственным компонентом эффективной вакцины, подобной живой (ослабленной) вирусной вакцине. Несколько вакцин на основе безадъювантных RP были разработаны и коммерциализированы.

Адъюванты используются в основном только в сочетании с антигенами для приготовления инактивированных или субъединичных вакцин. Также масляные адъюванты могут быть в достаточной степени агрессивными в отношении других компонентов вакцины, поэтому масляные адъюванты обычно не сочетаются с живыми вакцинами. Кроме того, известно, что вакцины на основе частиц РНК-репликонов альфавируса, в частности на основе альфавируса VEE, индуцируют (наряду с приобретенным иммунным ответом) уже сами по себе сильный антивирусный ответ от врожденной иммунной системы целевого субъекта. Тем самым эффективно предотвращается необходимость какой-либо дополнительной иммуностимуляции.

Тем не менее, было неожиданно обнаружено, что масляный адъювант может значительно повысить иммуногенную эффективность частиц РНК-репликонов альфавирусов, кодирующих антиген, происходящий из патогена животного. В этом отличие от адъюванта на основе алюминия, например гидроксида алюминия. Повышенную эффективность можно получить как в случае, когда RP и масляный адъювант используют с их объединением в одну композицию (то есть одновременное применение), так и когда их вводят в виде отдельных композиций (то есть сопутствующее применение). Степень повышения эффективности с применением масляного адъюванта также была неожиданной, при том, что минимальная эффективная доза RP могла бы быть уменьшена на несколько порядков величины, для вакцинации с RP и масляным адъювантом по сравнению с вакцинацией без (масляного) адъюванта. В дальнейшем применение масляного адъюванта обеспечило увеличение продолжительности иммунного ответа в результате вакцинации RP. Кроме того, сочетание масляного адъюванта и RP было способно обеспечить превосходный иммунный ответ в случае, когда применение только лишь одного компонента RP вообще не вызывало иммунизацию.

Для более полного понимания изобретения предоставлены следующие определения.

“Вакцина” представляет собой хорошо известную композицию с лечебным эффектом, которая включает иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. Водный раствор и/или масляный адъювант могут выполнять функцию “носителя” вакцины. “Иммунологически активный компонент” для вакцины по изобретению представляет собой кодируемый антиген, происходящий из патогена животного, который доставляется и экспрессируется посредством RP. Вакцина стимулирует иммунную систему вакцинированного целевого животного, вызывая защитный иммунологический ответ. Ответ может происходить от врожденной и/или приобретенной иммунной системы животного и может быть клеточного и/или гуморального типа.

Вакцина обеспечивает “защиту” “от инфекции или заболевания” путем снижения у вакцинированного животного риска последующего инфицирования или заражения, например, путем уменьшения количества патогенных микроорганизмов или сокращения продолжительности репликации патогенного микроорганизма в животном или на нем, и уменьшение количества, интенсивности или тяжести поражений, вызванных инфекцией или заражением. Также, или соответственно, вакцина эффективна для уменьшения или ослабления (клинических) симптомов заболевания, которые могут быть вызваны такой инфекцией, заражением или репликацией или реакцией субъекта на эту инфекцию, заражение или репликацию. Ссылка на такие заболевания и клинические признаки: “The Merck veterinary manual” (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X). Такую вакцину в обычной разговорной речи называют “вакциной против определенного патогена”.

Используемый в настоящем описании термин “содержащий” (а также варианты, такие как “содержать”, “содержит” и “содержащийся”) относится ко всем элементам и в любом возможном сочетании, допустимом для изобретения, которые охватываются или включены в текстовый раздел, фрагмент, формулу и т.д., в которых используется этот термин, даже если такие элементы или сочетания явно не указаны; и не исключает любой из таких элементов или сочетаний. Соответственно, любой такой текстовый раздел, фрагмент, пункт формулы изобретения и т.д. также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, в которых термин “содержит” (или его варианты) заменяется такими терминами, как “состоит из”, “состоящий из” или “состоит по существу из”.

Используемый в настоящем описании термин “репликон” относится к модифицированному геному РНК вируса, в котором отсутствует один или более элементов (например, кодирующие последовательности для структурных белков), которые, если бы они присутствовали, обеспечили бы успешное размножение родительского вируса в клеточных культурах или животных-хозяевах. В подходящих клеточных окружениях репликон амплифицируется самостоятельно и может продуцировать один или более видов субгеномных РНК.

Используемый в настоящем описании термин “частица РНК-репликона альфавируса”, сокращенно “RP”, представляет собой РНК-репликон, полученный из альфавируса, упакованный в вирусные структурные белки, например капсид и гликопротеины, которые также получены из альфавируса, например, описанные Pushko и соавт. [Virology 239 (2): 389-401 (1997)]. RP инфицирует соответствующую клетку-мишень, а затем экспрессирует встроенный гетерологичный ген(ы), но не может размножаться в клеточных культурах или животных-хозяевах (без плазмиды-помощника или аналогичного компонента), поскольку репликон не кодирует структурные компоненты альфавируса (например, капсидные и вирусные гликопротеины).

Использование для удобства описания терминов в единственном числе никоим образом не подразумевает ограничения. Так, например, ссылка на “частицу РНК-репликона альфавируса” включает ссылку на множество таких частиц РНК-репликона альфавируса, если не указано иное.

“Кодирование” RP антигена, относится к транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты для того белкового антигена, который содержится в RP, в результате чего экспрессируется белковый антиген. Обычно такая нуклеиновая кислота, кодирующая белок, представляет собой открытую рамку считывания (ORF), что указывает на отсутствие нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно прекращали бы трансляцию белка. Нуклеиновая кислота может представлять собой нативный ген, кодирующий нативный белок, или может представлять собой ген-фрагмент, кодирующий участок белка, например, кодирующий только зрелую или секретируемую форму белка, т.е. без “лидера”, “якоря” или “сигнальной последовательности”. Нуклеотидная последовательность может иметь природный или синтетический источник.

Конструирование и манипулирование последовательностью гетерологичной нуклеиновой кислоты, экспрессирующей антиген по изобретению, можно осуществлять посредством хорошо известных молекулярно-биологических методов, включающих клонирование, трансфекцию, рекомбинацию, отбор и амплификацию. Эти и другие методы подробно описаны в типовых учебниках, таких как Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler “PCR primers: a laboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540); и “PCR protocols” J. Bartlett and D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

“Белок” по изобретению представляет собой молекулярную цепь аминокислот. Белок может быть нативным или зрелым белком, пребелком или пробелком или частью белка. Пептиды, олигопептиды и полипептиды, в числе прочего, включены в определение белка.

“Антиген” по изобретению относится к белку, который может, при соответствующих условиях, вызывать защитный иммунологический ответ у целевого животного.

Термины “происходить из”, “происходит из” и “происхождящий из” используются взаимозаменяемо в отношении данного белкового антигена и патогена, или штамма того патогена, который его кодирует в естественных условиях. Эти используемые в настоящем описании термины означают, что немодифицированная и/или модифицированная аминокислотная последовательность этого данного белкового антигена кодируется этим патогеном или штаммом этого патогена. Кодирующая последовательность в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для белкового антигена, происходящего из патогена, могла быть генетически изменена так, чтобы приводить к модификации, усечению и/или удлинению аминокислотной последовательности экспрессируемого белкового антигена относительно соответствующей кодирующей последовательности этого белкового антигена в патогене или штамме патогена (включая аттенуированные в естественных условиях штаммы), из которого он происходит.

“Патоген животного” относится к любому биологическому объекту, способному вызывать инфекцию и/или заболевание у животного, имеющего ветеринарное значение, такого как дикие, сельскохозяйственные или домашние животные.

Патоген животного по изобретению может быть или не быть природным патогеном целевого животного, получающего вакцину по изобретению.

Термин “масло” используется в настоящем описании в его обычном значении и относится к неполярному химическому веществу с относительно высоким содержанием углеводородов, которое обычно является относительно вязкой жидкостью, имеет плотность ниже воды, а также является гидрофобным и липофильным. Масло может быть минеральным или неминеральным, например синтетическим, полусинтетическим, животным или растительным. Некоторые масла метаболизируются.

Термин “минеральное” означает, что соответствующее масло происходит из минерального источника, обычно из нефти.

“Полусинтетическое масло” представляет собой масло неминерального происхождения, такое как животное или растительное масло, но которое было модифицировано по структуре и/или составу химическим или физическим способом.

Термин “адъювант” используется в настоящем описании в своем обычном значении и обозначает композицию, способную стимулировать иммунный ответ у целевого животного неспецифическим образом.

“Жидкое парафиновое масло” представляет собой тип минерального масла, также называемого белым (минеральным) маслом или легким жидким парафиновым маслом, и имеет номер CAS: 8042-47-5. Также оно обычно доступно фармацевтической степени чистоты. Примерами являются: Drakeol® 6VR (Penreco), Marcol® 52 (Exxon Mobile) и Klearol® (Sonneborn).

“Ацетатная форма витамина Е” относится к химическому соединению с номером CAS: 58-95-7. Некоторые альтернативные названия: ацетат токоферила или ацетат альфа-токоферола. Ацетатная форма витамина Е представляет собой ацетатный эфир витамина Е (токоферол) и может быть получена из растительных материалов, таких как семена, орехи, фрукты или листья, или из жирного мяса, но также может быть произведена синтетическим способом. Таким образом, в определение ацетатной формы витамина Е включены природные, синтетические или полусинтетические формы или их смеси. Ацетатная форма витамина Е коммерчески доступна с разной степенью чистоты.

“Сквалан” относится к химическому соединению с номером CAS 111-01-3. Некоторые альтернативные названия: гидрогенизированное масло печени акулы, гексаметилтетракозан или пергидросквален. Его не следует путать со скваленом (CAS № 111-02-4), который представляет собой полиненасыщенное масло C30 и метаболизируется как соединение для синтеза холестерина.

Первоначально предшественник сквалана получали из печени акулы, однако из-за экологических проблем его стали получать из других природных источников, таких как оливковое масло, или путем химического синтеза. Поэтому в определение сквалана включены природные, синтетические или полусинтетические формы или их смеси. Сквалан коммерчески доступен с различной степенью чистоты, например: из растительного источника, от компании Worlee (Squalane, vegetable) или компании Croda (Pripure Squalane); или синтетический, например от компании Kuraray (Squalane-PE). Для изобретения предпочтительным является сквалан с высокой степенью чистоты в следующем порядке предпочтительности: предпочтительно чистота более 75%, более предпочтительно чистота более 80, 90 или даже более 95%.

“Эмульсия” представляет собой смесь, по меньшей мере, двух несмешивающихся жидкостей, причем одна диспергирована в другой. Обычно размер капель диспергированной фазы очень мал и находится в пределах микрометров или меньше. Эмульсия по изобретению включает масляную и водную фазы.

Процедуры и оборудование для приготовления эмульсии в любом масштабе хорошо известны в данной области и описаны, например, в таких руководствах, как: “Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Когда масляный адъювант по изобретению представляет собой эмульсию, эмульсия может представлять собой эмульсию типа вода-в-масле (W/O), где масло представляет собой непрерывную внешнюю фазу. Альтернативно, эмульсия может представлять собой эмульсию типа “масло в воде” (O/W), где масло представляет собой диспергированную внутреннюю фазу.

После выбора подходящего типа и концентрации эмульгатора(ов), такие эмульсии могут быть приготовлены и стабильно храниться.

Эмульгатор находится на границе раздела фаз, водной и масляной, и стабилизирует капли внутренней диспергированной фазы. Многие различные эмульгаторы известны и подходят для фармацевтического применения, например в вакцинах. Предпочтительным эмульгатором для масляного адъюванта по изобретению является полисорбат 80, также известный как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, и коммерчески доступный как Tween® 80. Твин 80 используется в масляном адъюванте по изобретению в количестве 0,1-10% масса/об. масляного адъюванта.

Масляный адъювант по настоящему изобретению, когда он находится в форме эмульсии типа масло в воде, состоит, таким образом, из внешней водной фазы и диспергированной внутренней масляной фазы. Это облегчает смешивание масляного адъюванта в форме эмульсии типа масло в воде с RP, кодирующим антиген, происходящий из патогена животного по изобретению. Например, путем смешивания водной композиции, содержащей RP, с масляным адъювантом в форме эмульсии типа масло в воде. Для соответствующего смешивания двух водных композиций достаточно простого встряхивания вручную в течение примерно 1 минуты.

Альтернативно, и высоко предпочтительно, масляный адъювант в виде эмульсии типа “масло в воде” можно использовать непосредственно для восстановления RP из лиофилизированной формы. Это означает, что RP может быть предоставлен в высоко стабилизированной форме в виде лиофилизата, и вакцина по изобретению может быть приготовлена путем смешиванием “на месте” в удобное время перед введением целевому животному.

Используемый в настоящем описании термин “приблизительно” используется взаимозаменяемо с термином “приблизительно” и означает, что значение находится в пределах пятидесяти процентов от указанного значения, то есть композиция, содержащая “приблизительно” 1 × 10^8 частиц РНК-репликонов альфавирусов на миллилитр, содержит от 5 × 10^7 до 1,5 × 10^8 частиц РНК-репликонов альфавирусов на миллилитр.

Примером масляного адъюванта в виде O/W эмульсии для вакцины по изобретению является: XSolve™. XSolve представляет собой сочетание двух компонентов адъюванта в виде O/W эмульсии: Diluvac Forte™, который основан на ацетатной форме витамина Е (см. ЕР 382.271), и Microsol™, который основан на жидком парафиновом масле (см. WO 2009/144.088).

В этих эмульсиях среднеобъемный размер капель масла минерального и неминерального масла может быть различным. Предпочтительно капли минерального масла имеют субмикронный размер.

Предпочтительно, масляный адъювант в виде эмульсии получают отдельно от RP по изобретению. Соответственно могут быть использованы методы и оборудование для эмульгирования масляного адъюванта, которые бы не соответствовали качеству RP, если бы они присутствовали в масляном адъюванте. Одним из примеров является способ эмульгирования с высоким усилием сдвига, используемый для получения субмикронной эмульсии путем гомогенизации под высоким давлением, например с использованием устройства Microfluidiser (Microfluidics, MA, USA).

Еще одним примером масляного адъюванта в виде O/W эмульсии для вакцины по изобретению является эмульсия SVEA™, которая содержит сквалан и ацетатную форму витамина Е, и описана в WO 2018/115.435.

В соответствии с изобретением, названия микроорганизмов или патогенов, таких как, например, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) и вирус птичьего гриппа и так далее, относятся к соответствующим таксономическим классификациям этих микроорганизмов, которые используются в настоящее время. Тем не менее, эти названия могут измениться со временем, поскольку новые данные могут привести к реклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет сами микроорганизмы или их антигенный репертуар, а только их научное название или классификацию, такие повторно классифицированные микроорганизмы остаются в рамках объема настоящего изобретения.

Ссылка на таксономическое семейство включает любой микроорганизм, который является видом, подтипом, вариантом, биотипом, серотипом или генотипом в пределах этого семейства.

“Свинья” по изобретению относится к животным семейства Suidae и предпочтительно к животным рода Sus, например: дикая или домашняя свинья, дикий кабан, бабируса или бородавочник. Включена также свинья, обозначенная произвольным названием, указывающим на пол, возраст или размер, например, свиноматка, кабан, боров, свинка, отъемыш или поросенок.

Используемый в настоящем описании термин “птица” относится к сельскохозяйственным птицам, таким как: курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепел, голубь, фазан, цесарка или страус. Предпочтительными птицами являются курица, индейка, утка или гусь. Более предпочтительными птицами являются курица или индейка. Наиболее предпочтительной птицей является курица.

Птицы могут относиться к любому типу, такому как несушки, порода птицы, бройлеры, комбинированные породы или родительские линии любых таких пород птиц. Предпочтительным типом птиц являются бройлеры.

Используемый в настоящем описании термин “тилапия” может включать приблизительно ста видов костной плавниковой рыбы cемейства цихлид. Тилапия представляет собой в основном пресноводную рыбу, обитающую в мелких ручьях, прудах, реках и озерах и реже встречающуюся в солоноватой воде.

“Составной набор” по изобретению обычно представляет собой сочетание упакованных контейнеров со специфическими композициями в заранее определенных количествах, причем этот набор может включать инструкции или ссылаться на инструкции для осуществления приготовления и вакцинации по изобретению.

Мишенью для вакцины, способа иммунизации, а также для соединений и применений для защиты животных по изобретению являются животные, нуждающиеся в вакцинации против инфекции или заболевания, вызванного конкретным патогеном, из которого происходит кодируемый антиген. Возраст, масса, пол, иммунологический статус и другие параметры мишени, подлежащей вакцинации/защите/иммунизации, не являются критическими, хотя очевидно, что вакцинирование здоровых неинфицированных мишеней является эффективным и осуществлять вакцинирование как можно раньше.

Используемый в настоящем описании термин “филогенетический кластер” представляет собой набор нейраминидаз вируса гриппа, которые были сгруппированы (в одной ветке) в филогенетическое дерево или эволюционное дерево, которое связано с аналогичным (гомологичным) предком. Для IAV-S нейраминидаз (NA), обнаруженных в США, существуют два основных филогенетических кластера N1, N1-классический и N1-пандемический, и два основных филогенетических кластера N2, N2-1998 и N2-2002. Классический филогенетический кластер N1 содержит NA, сгруппированные вместе с NA, полученной из вируса классического свиного гриппа H1N1. Пандемический филогенетический кластер N1 содержит NA, сгруппированные вместе с NA, полученной из вируса пандемического гриппа H1N1. Филогенетический кластер N2-1998 содержит NA, сгруппированные вместе с NA из вируса гриппа H3N2 человека, который поразил свиней в 1998 году, тогда как филогенетический кластер N2-2002 содержит NA, сгруппированные вместе с NA из вируса гриппа H3N2 человека, который поразил свиней в 2002 году. [См., Anderson et al., Influenza and other Respiratory Viruses 7 (Suppl. 4): 42-51 (2013)].

Термин “не-IAV-S” используется для модификации таких терминов, как патоген и/или антиген (или иммуноген), для обозначения того, что соответствующий патоген и/или антиген (или иммуноген) не является ни патогеном IAV-S, ни антигеном IAV-S (или иммуногеном) и что не-IAV-S белковый антиген (или иммуноген) не происходит из IAV-S.

В настоящем описании поливалентная вакцина представляет собой вакцину, которая содержит два или больше разных антигена, причем различие может быть на любом из ряда биологических уровней, таких как род, вид, серотип и т.д. В конкретном варианте осуществления этого типа, мультивалентная вакцина стимулирует иммунную систему целевого животного против двух или более различных патогенов животных или против иммунологически различных вариантов одного и того же патогена.

Используемый в настоящем описании термин “фармацевтически приемлемый” используется в качестве прилагательного для обозначения того, что модифицированное существительное подходит для применения в фармацевтическом продукте. При его использовании, например, для описания наполнителя в фармацевтической вакцине, он характеризует наполнитель как совместимый с другими ингредиентами композиции и не оказывающий вредоносного воздействия на предполагаемого животного-реципиента, например, свинью.

“Введение” вакцины, соответственно, компонентов набора по изобретению целевому животному может быть выполнено с использованием любого возможного способа и пути. Обычно оптимальный способ введения будет определяться типом применяемой вакцины/соединения, а также характеристиками мишени и заболевания, от которого оно предназначено защищать. В зависимости от того, в какой форме получена вакцина/соединение, могут применяться различные способы введения. Например, вакцины/соединения в виде O/W эмульсии по изобретению можно вводить энтеральным или мукозальным способом, то есть с помощью глазных капель, капель в нос, пероральных, энтеральных или перорально-назальных капель, спрея. Другая возможность заключается в способе объемного введения, например с помощью питьевой воды, крупнокапельного распыления, пульверизации, подачи корма и так далее.

“Парентеральное введение” включает подкожные инъекции, субмукозальные инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию.

“Мукозальное введение (через слизистую)” включает способы введения в глаз, в нос, пероральный, окуло-назальный, интратрахеальный, интестинальный, ректальный и вагинальный способ введения.

“Местное введение” включает кожные и трансдермальные способы введения.

Способ, время и объем введения вакцины, соответственно компонент набора по изобретению, предпочтительно интегрированы в существующие схемы вакцинации других прививок, которые могут потребоваться целевому животному для снижения у него стресса и снижения трудозатрат. Эти другие прививки сами по себе могут быть введены способом ассоциированного применения, в соответствии со своим сертифицированным применением.

Используемый в настоящем описании термин “антигенный фрагмент” в отношении конкретного белка (например, белкового антигена) представляет собой фрагмент этого белка, который является антигенным, то есть способен специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор Т-клеточного антигена. Например, антигенный фрагмент нейраминидазы IAV-S (NA) является фрагментом белка NA, который является антигенным. Предпочтительно антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для распознавания антителом и/или Т-клетой. В конкретных вариантах осуществления, антигенный фрагмент, в отношении данного белкового антигена, представляет собой фрагмент белка, который сохраняет, по меньшей мере, 25% антигенности полноразмерного белка. В предпочтительных вариантах осуществления, антигенный фрагмент сохраняет, по меньшей мере, 50% антигенности полноразмерного белка. В более предпочтительных вариантах осуществления, антигенный фрагмент сохраняет, по меньшей мере, 75% антигенности полноразмерного белка. Антигенные фрагменты могут содержать до 12 аминокислот или, с другой стороны, представлять собой крупные фрагменты, которые отличаются отсутствием всего лишь одной аминокислоты от полноразмерного белка. В конкретных вариантах осуществления, антигенный фрагмент содержит от 25 до 150 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления, антигенный фрагмент содержит от 50 до 250 аминокислотных остатков.

В контексте настоящего документа одна аминокислотная последовательность на 100% “идентична” или имеет 100% “идентичность” со второй аминокислотной последовательностью в случае, когда аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Соответственно, аминокислотная последовательность на 50% “идентична” второй аминокислотной последовательности в случае, когда 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнение последовательностей проводят по смежному блоку аминокислотных остатков, содержащихся в данном белке, например белке или части сравниваемого полипептида. В конкретном варианте осуществления, учитываются выбранные делеции или вставки, которые могли бы изменить соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.

В контексте настоящего документа процент идентичности нуклеотидной и аминокислотной последовательности может быть определен с помощью C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), PLC Oxford Molecular Group (1996) и алгоритма Clustal W с используемыми по умолчанию параметрами выравнивания и с используемыми по умолчанию параметрами для идентичности. Эти коммерчески доступные программы также можно использовать для определения сходства последовательностей с использованием идентичных или аналогичных стандартных параметров. Альтернативно можно использовать поиск Advanced Blast на условиях фильтрации по умолчанию, например, при использовании программы Pileup GCG Package v. 7 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) с использованием параметров по умолчанию.

В случае, когда частицы РНК-репликонов альфавирусов хранятся отдельно, но предназначены для смешивания с другими компонентами вакцины перед введением, частицы РНК-репликонов альфавирусов могут храниться в водном стабилизирующем растворе, аналогичном раствору других компонентов, например, в буфере или раствор с высоким содержанием сахарозы.

Вакцина по настоящему изобретению может быть легко введена любым стандартным “способом иммунизации животного”. Специалисту в данной области должно быть понятно, что способ введения выбирается с учетом характеристик целевого животного и вводимой вакцины. Предпочтительно композиция вакцины составлена соответствующим образом для каждого типа целевого животного и способа введения.

Используемый в настоящем изобретении термин “субъединица микроорганизмов” может представлять собой биологическую или синтетическую молекулу, такую как белок, углевод, липополисахарид, липид или молекула нуклеиновой кислоты.

Специалист в данной области может дополнительно оптимизировать вакцину, набор, способ или применение по изобретению. Обычно оптимизация включает корректировку эффективности вакцинации/иммунизации с дополнительным повышением ее иммунной защиты. Это может быть осуществлено путем адаптации дозы, объема, содержания адъюванта или антигена во вводимом веществе или введением другим путем, способом или с другим режимом. Все это включено в объем настоящего изобретения.

Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными конфигурациями, стадиями процесса и веществами, описанными в настоящем описании, поскольку такие конфигурации, стадии процесса и вещества могут, в некоторой степени, отличаться. Также следует понимать, что используемая в настоящем описании терминология используется только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO:	Описание (5’-> 3’)	Тип
1	ggcgcgccgcacc	нуклеиновая кислота
2	ttaattaa	нуклеиновая кислота

Следующие неограничивающие примеры служат для дальнейшего понимания изобретения, но не предназначены для ограничения каким-либо образом эффективного объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ ПОВЫШАЕТ СИЛУ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ (ГУМОРАЛЬНОГО ОТВЕТА) У СВИНЕЙ НА ЧАСТИЦУ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА, КОДИРУЮЩУЮ ГЕМАГГЛЮТИНИН ВИРУСА СВИНОГО ГРИППА

Вещества и методы

Векторы на основе репликона VEE, предназначенные для экспрессии гена гемагглютинина (HA), конструировали описанным ранее способом [см. патент США 9441247 B2; содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки] со следующими модификациями: последовательность подвергнута оптимизации путем вставка гена HA (ATUM, CA, USA). Вектор на основе репликона, полученного из TC-83 “pVEK” [раскрытый и описанный в патенте США 9441247 B2] расщепляли рестриктазами AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержащую оптимизированную по кодонам открытую рамку считывания последовательность генов N1 или N2 с 5'-фланкирующей последовательностью (5'-GGCGCGCCGCACC-3') [SEQ ID NO: 1] и 3'-фланкирующей последовательностью (5'-TTAATTAA-3') [SEQ ID NO: 2], аналогичным образом расщепляли рестриктазами AscI и PacI. Затем кассету синтетических геннов лигировали в расщепленный вектор pVEK, и полученные клоны переименовывали в “pVHV-N1-пандемический”, “pVHV-N1-классический”, “pVHV-N2-2002” и “pVHV-N2-1998”. Номенклатуру векторов “pVHV” выбирали для обозначения векторов на основе репликонов, полученных из pVEK, содержащих трансгенные кассеты, клонированные посредством сайтов AscI и PacI в сайте множественного клонирования pVEK.

Продукцию частиц РНК репликонов VEE штамма TC-83 проводили в соответствии с ранее описанными способами [США 9441247 B2 и США 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки]. Вкратце: pVHV векторные на основе репликона ДНК и хелперные ДНК плазмиды линеаризовали рестриктазой NotI перед транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы MegaScript™ T7 и КЭП аналога (Promega, Madison, WI). Важно, что хелперные РНК, используемые в продукции, не имеют VEE последовательность субгеномного промотора, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7): 1723-1727 (2010)]. Очищенные РНК для компонентов репликона и хелпера объединяли и смешивали с суспензией клеток Vero, электропорировали в кюветах шириной 4 мм и возвращали в среду для культивирования клеток OptiPro™ SFM (Thermo Fisher, Waltham, MA). После инкубации в течение ночи частицы РНК-репликонов альфавирусов очищали, готовили в фосфатно-солевом буфере с 5% масcа/объем сахарозы и 1% об/об свиной сыворотки, стерилизовали, пропуская через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональной RP определяли методом иммунофлуоресцентного анализа в монослоях клеток линии Vero. Партии RP были идентифицированы в соответствии с антигеном, кодируемым упакованным репликоном.

Десять поросят, отрицательных на антитела к вирусу свиного гриппа, распределяли случайным образом в группы по пять свиней. Вакцину на основе RP, экспрессирующая антиген гемагглютинин штамма свиного гриппа H3N2, приготовливали с титром 5 × 10^5 RP/дозу. Непосредственно перед вакцинацией, вакцину для группы, получающей только RP, разводили 1:1 (об./об.) стерильным разбавителем фосфатно-буферным раствором (PBS), при этом вакцину для группы, получающей RP+адъювант, разводили 1:1 (об./об.) адъювантом XSolve. Затем свиней вакцинировали внутримышечно 2,0 мл соответствующего материала. Процесс вакцинации осуществляли в дни исследования 0 и 21 каждый раз с использованием свежего препарата вакцины. Сыворотки, собранные в процессе исследования, анализировали на активность ингибирования гемагглютинации (HI) с использованием антигена вируса свиного гриппа H3N2. Результаты были представлены в виде наибольшего разведения с ингибирующей активностью; титры меньше 1:10 регистрировали как 1:9; титры >640 регистрировали как 1:641. Средние геометрические титры приведены в таблице 1.

ТАБЛИЦА 1: Средний геометрический титр ингибирования гемагглютинации (HI)

День иследования	0	21	28	35	56	70	84
RP	9,0	9,0	25,8	22,5	12,9	9,4	9,4
RP+Адъювант	9,0	9,2	242,7	211,1	91,9	52,8	52,8

При относительно низкой дозе 5 × 10^5 RP безадъювантная вакцина индуцировала титр со слабоинтенсивным и кратковременным и транзиторным ингибированием гемагглютинации (HI). Для сравнения, адъювантная вакцина индуцировала высокие титры HI после бустерной вакцинации, и эти титры HI оставались повышенными до конца 84-дневного исследования.

Эти данные явилось первым явным указанием на то, что XSolve может оказывать такой сильный эффект на RP иммунизацию свиней при очень низких дозах (5 × 10^5 RP). Предыдущие исследования с использованием RP вакцины без адъюванта должны были использовать гораздо более высокие количества компонента RP на дозу, например: 1 × 10^9 для RP FMD (эпизоотический стоматит) и 5 × 10^7 для RP SIV (вирус свиного гриппа)).

ПРИМЕР 2

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ УВЕЛИЧИВАЕТ У СВИНЕЙ ИНТЕНСИВНОСТЬ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ГУМОРАЛЬНОГО ОТВЕТА НА МУЛЬТИВАЛЕНТНУЮ ЧАСТИЦУ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА, КОДИРУЮЩУЮ АНТИГЕНЫ ВИРУСА СВИНОГО ГРИППА

Группы поросят-отъемышей из стада, отрицательного на свиной грипп, распределяли случайным образом в группы лечения, как указано в таблице 2. Мультивалентную вакцину против свиного гриппа на основе частицы РНК-репликона альфавируса смешивали, используя восемь отдельных антигенов частиц РНК, экспрессирующих либо HA, либо NA из различных штаммов свиного гриппа, каждый из которых смешивали до приблизительно 1 × 10^7 RP/доза. Включали два H3, четыре H1, один N1 и один N2 антиген, и осуществляли парный серологический анализ (HI или NI) для оценки ответа антител на каждый антиген. Исследование проводили с дублированием: половину животных заражали вирусом H1N1, а другую половину заражали вирусом H1N2.

ТАБЛИЦА 2: Протокол эксперимента примера 2

Группа	Количество свиней	Вакцина	Штамм для заражения/инфицирования
1	16	Мультивлентная на основе только RP	H1N1
2	16	Мультивлентная на основе RP+масляный адъювант
3	16	Плацебо
4	16	мультивлентная на основе только RP	H1N2
5	16	Мультивлентная на основе RP+масляный адъювант
6	16	Плацебо

Было обнаружено, что использование масляного адъюванта XSolve значительно повышает интенсивность серологической реакции для всех восьми фракций вакцины. Хотя обе вакцинные композиции защищали от поражений легких (фигуры 1A-1B), тем не менее добавление XSolve повышало эффективность вакцины при измерении по назальному выделению вируса гриппа H1N1 и H1N2 (фигуры 1C-1D). На фигурах 1-1F представлены соответствующие оценки титра NI.

Эффект адъюванта в отношении титров HI представлен на фигурах 2А-2F.

Это исследование продемонстрировало, что безадъювантные поливалентные SIV RP индуцировали антитела ко всем фракциям, причем добавление масляного адъюванта значительно усиливало иммунный ответ всех фракций. Снижение назального выделения и более плотная кластеризация показателей для легкого представляют важные клинические преимущества, например в отношении ограничения горизонтальной передачи инфекции в стаде или популяции.
10

ПРИМЕР 3

ЭФФЕКТИВНОСТЬ АДЪЮВАНТНОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ПО ЧЕТЫРЕМ АНТИГЕНАМ NA-RP ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ H1N1 У СВИНЕЙ-ОТЪЕМЫШЕЙ, ИМЕЮЩИХ N1-АНТИТЕЛА ВО ВРЕМЯ ПЕРВОЙ ВАКЦИНАЦИИ

Для определения эффективности и иммуногенности двух уровней дозы адъювантной комбинированной по четырем антигенам NA-RP вакцины осуществляли исследование с вакцинацией/экспериментальным инфицированием. Адъювантная вакцина включала четыре конструкции RP, каждая из которых по отдельности кодировала один отдельный ген NA существующего изолята U.S. IAV-S. Вместе эти гены NA представляют собой два филогенетических кластера N1 (N1-классический и N1-пандемический) и два кластера N2 (N2-1998 и N2-2002) (см. таблицу 3). Адъювантную вакцину вводили двумя внутримышечными (IM) прививками по 1 мл/доза поросятам-отъемышам с положительным тестом на антитела к N1-классическому антигену во время его первой вакцинации. Исследовали эффективность адъювантной комбинированной по четырем антигенам NA-RP вакцины против гетерологичной контрольной инфекции N1 (вирус H1N1).

Материалы и методы

Конструирование NA-RP антигенов:

Репликативно-дефектные частицы РНК-репликонов альфавирусов (RP) кодируют ген нейраминидазы (NA) и получают, по существу, способом, описанным в примере 1 настоящего документа.

ТАБЛИЦА 3: Гены N1 и N2, кодируемые в NA-RP конструкциях примера 3

Филогенетический кластер NA	Штамм - донор генов	Номер доступа в GenBank
N1-классический	A/porcine/Iowa/A01410307/2014 (H1N1)	KJ605083
N1-пандемический	A/porcine /Minnesota/A01483170/2014 (H1N1)	KP036969
N2-1998	A/porcine /Michigan/A02077465/2015 (H1N2)	KR982634
N2-2002	A/porcine /Illinois/A01475495/2014 (H1N2)	KJ941362

n=10 свиней на группу

Вирусы

Вирусы для контрольного инфицирования получали из Национальных лабораторий ветеринарной службы Министерства сельского хозяйства США. A/porcine/Illinois/A01554351/2015 (H1N1) содержит ген HA кластера H1-гамма и ген NA N1-классического кластера. Вирусы размножали в культуре MDCK-клеток. Сливающиеся клетки инфицировали в течение приблизительно 48 часов, пока цитопатический эффект не проявился в более чем 70% клеточного монослоя. Во время сбора, супернатант удаляли из сосудов и осветляли центрифугированием перед хранением вируса в замороженном состоянии.

Животные

Поросят-отъемышей отбирали из стада с высоким уровнем здоровья на основе серологического скрининга для подтверждения отсутствия ранее существовавших HI или NI (ингибирование нейраминидазы) антител к вакцинным штаммам и штаммам контрольного инфицирования. Животные представляли собой смесь самцов и самок, и на момент первой вакцинации их возраст соответствовал приблизительно трем неделям.

Вакцинация и контрольное инфицирование

Группы лечения представлены в таблице 4. Комбинированную по четырем антигенам NA-RP вакцину получали в количестве 10^6 копий каждой RP/дозу на основе иммунофлуоресцентного анализа эффективности для количественного определения функциональных RP. Антигены NA-RP объединяли со стабилизатором, состоящим из 1% свиной сыворотки и 5% сахарозы. Вакцина плацебо состояла из аналогичного стабилизатора, но без антигена. Вакцины смешивали с масляным адъювантом XSolve (1:1 об/об, доза 1 мл) незадолго до внутримышечного введения свиньям в возрасте 3 и 7 недель. Уровни доз анализировали обратным титрованием методом ИФА на оставшемся после вакцинации вакцинном материале. Образцы сыворотки собирали в день первой вакцинации, день второй вакцинации и день контрольного инфицирования.

За день до первой вакцинации всех свиней взвешивали и свиньям в группах, положительных по N1-классическому антителу, подкожно вводили дозу 2 мл/кг N1-классической гипериммунной сыворотки (титр анти-NI-антитела к N1-классикому антигену 1:2560).

ТАБЛИЦА 4: Лечебная группы со штаммом для контрольного инфицирования H1N1, описанным в примере 3

Группа	Статус на N1-классическое антитело	Вакцина ( + XSolve)	RP на 1 мл дозы
1	Положительный	Комбинированная по четырем антигенам NA-RP	10^6
2	Отрицательный	Комбинированная по четырем антигенам NA-RP	10^6
3	Положительный	Плацебо	---
4	Отрицательный	Плацебо	---

(n=10 свиней на группу)

Осуществляли контрольное инфицирование свиней через 3 недели после второй вакцинации. Вещества для контрольного инфицирования H1N1 (H1-гамма-N1-классический) объединяли в составе препарата до целевой дозы 10-6,5 TCID₅₀/свинью (объем 6 мл). Вещество для контрольного инфицирования вводили внутритрахеально. Дозы вируса для контрольного инфицирования подтверждали обратным титрованием оставшегося инфицирующего вещества. Назальные мазки собирали у всех свиней в дни -1, 1, 3 и 5 после контрольного инфицирования.

На 5 день после контрольного инфицирования осуществляли некропсию. На 5 день после контрольного инфицирования под наблюдением лицензированного ветеринарного врача свиней подвергали эвтаназии путем передозировки барбитурата. Легкие собирали и исследовали для документальной фиксации площади поверхности каждой доли, пораженной макроскопическими поражениями, что давало общую выраженную в процентах оценку поражения легких. Для измерения титров вируса у всех свиней собирали бронхоальвеолярные выделения и назальные мазки. Для гистопатологического анализа микроскопического поражения собирали срезы легких.

Анализ иммунного ответа:

IAV-S-специфичные антитела в образцах сыворотки свиньи определяли с помощью NI-теста. Сыворотки инактивировали нагреванием в течение 30-60 минут при 56°С. NI-тест осуществляли с небольшими изменениями в методе Sandbulte & Eichelberger (Methods Mol Biol 1161: 337-45, 2014). Вкратце, 2-кратные серийные разведения сыворотки смешивали с экспрессированным белковым антигеном в равных объемах на 96-луночных планшетах, покрытых фетуином, и инкубировали в течение ночи при 37°C. Конъюгат пероксидазы хрена с агглютинином арахиса добавляли в течение 2 часов при комнатной температуре для связывания молекул фетуина, лишенных сиаловой кислоты. Сигнал получали с использованием окрашивающего тетраметилбензидинового (TMB) субстрата и результаты считывали при 650 нм. Среднюю оптическую плотность (OD) отрицательного контроля, в котором отсутствовал NA антиген, вычитали из всех лунок. Затем значения OD анализируемых образцов нормировали по шкале 0-100%, где среднее значение OD лунок положительного контроля (содержащих антиген NA, но не сыворотку) определяли как 100%. Титр NI антител определяли как наибольшее разведение образца, которое ингибировало ≥50% активности нейраминидазы.

Патологическое исследование легких

Макроскопические поражения, наблюдаемые на наружней стороне всех долей легких (хорошо выраженные уплотнения от пурпурного до сливового цвета), фиксировали на сетчатых диаграммах переднего и заднего сегментов легких. Совокупные оценки (процент поражения легких) для каждой свиньи определяли в соответствии с количеством пораженных сеток.

Вирусовыделение

Мазки из носа и жидкости бронхоальвеолярного лаважа серийно 10-кратно разбавляли инфицирующей средой [минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM), с добавлением 0,3% бычьего сывороточного альбумина, фракции V; 2 мМ L-глутамина; 25 мкг/мл гентамицина; 2 мкг/мл трипсина IX] и 100 мкл каждого разведения добавляли в четыре лунки со сливающимися клетками Мадин-Дарби почек собак (MDCK) в 96-луночном планшете. Планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и через 72 часа исследовали на предмет наличия инфекционного вируса, посредством реакций гемагглютинации супернатантов из каждой лунки. Титры IAV-S вычисляли методом Спирмана-Кербера и выражали как Log₁₀ TCID₅₀ на мл.

Результаты

Иммунные ответы свиней, вакцинированных мультивалентным NA-RP, представлены на рисунке 3. Необходимо отметить, что:

- Свиньи, которые пассивно получали N1-классическую гипериммунную сыворотку за один день до первой вакцинации, имели титры N1-классических антител во время вакцинации, составляющие 40-80.

- После двух вакцинаний комбинированной по четырем антигенам NA-RP вакцины с адъювантом XSolve, как сероотрицательные, так и у сероположительные по N1-антителам свиньи показали значительное повышение своих титров N1-классических антител. Это указывало на то, что RP вакцинация с масляным адъювантом была эффективной даже у животных-мишеней, положительных на антитела против RP-кодированного антигена.

- титр NI свиней в отрицательной по N1-классическим антителам/плацебо-привитой группе оставался сероотрицательным.

Эффективность комбинированной по четырем антигенам NA-RP вакцины против контрольных инфекций относительно поражений легких представлена на фигуре 4. Необходимо отметить, что комбинированная по четырем антигенам NA-RP вакцина была высокоэффективной в снижении поражений легких как при вакцинации свиней с или без N1-классических антител во время их первой вакцинации. В обеих группах процент поражений легких был значительно снижен по сравнению с обеими привитыми плацебо группами.

ПРИМЕР 4

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ, В СРАВНЕНИИ С АЛЮМИНИЕВЫМ АДЪЮВАНТОМ ИЛИ ВОДОЙ, ПОВЫШАЕТ ИНТЕНСИВНОСТЬ ГУМОРАЛЬНОГО ОТВЕТА У СВИНЕЙ НА ЧАСТИЦУ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА, КОДИРУЮЩУЮ АНТИГЕН ВИРУСА ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ

Девять поросят, примерно трехнедельного возраста, распределяли случайным образом на группы по три животных в каждой группе. Получали вакцину на основе частицы РНК-репликона альфавируса, экспрессирующей гликопротеин шиповидных отростков (Spike) вируса эпизоотической диарея свиней (PEDV), лиофилизировали и помещали в двадцатидозные сосуды. В день исследования 0, свиней вакцинировали внутримышечно 1,0 мл вакцины на основе частицы РНК-репликона альфавируса, которую восстанавливали либо водой, либо адъювантом - гидроксидом алюминия, либо адъювантом XSolve. В день исследования 21, процесс повторяли с использованием сосудов со свежеприготовленной вакциной. Конечный титр частиц РНК-репликона альфавируса на дозу после восстановления определяли методом иммунофлюоресцентного анализа, и он составлял приблизительно 7 × 10^6 RP/дозу для всех групп. Сыворотки, собранные во время исследования, анализировали на PEDV-нейтрализующие антитела (см. таблицу 5).

ТАБЛИЦА 5: Эффект различных адъювантов на выработку нейтрализующих антител

Адъювант	Свинья #	Титр PEDV-нейтрализующих антител
		Предотбор	20 дней после вакцинации	6 дней после второй вакцинации	13 дней после второй вакцинации	20 дней после второй вакцинации
Без адъюванта	154	<20	<20	20	40	20
	157	20	<20	<20	20	<20
	158	<20	<20	<20	<20	<20
XSolve	151	<20	<20	160	320	160
	155	<20	<20	40	80	20
	159	<20	<20	160	160	160
Гель на основе гидроксида алюминия	152	<20	<20	<20	<20	20
	153	20	<20	<20	<20	40
	156	<20	20	<20	<20	40

Свиньи, получавшие вакцину без добавления адъюванта, имели низкие или не обнаруживаемые количества нейтрализующих антител после двух доз вакцины. Все свиньи, получавшие вакцину с добавлением адъюванта гидроксида алюминия, вырабатывали нейтрализующие антитела, количество которых были чуть выше предела обнаружения. В тоже время вакцина с добавлением адъюванта XSolve индуцировала более высокие количества нейтрализующих антител после двух доз вакцины, и все три свиньи достигли минимального титра антител, превышающего пиковый титр, наблюдаемый в других исследуемых группах. Таким образом, использование гидроксида алюминия в качестве адъюванта было неэффективным и значительно менее эффективным, чем масляный адъювант.

ПРИМЕР 5

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ ПОВЫШАЕТ У ЦЫПЛЯТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИНАЦИИ ЧАСТИЦЫ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА, КОДИРУЮЩЕЙ АНТИГЕНА ГРИППА

Суточных цыплят случайным образом распределяли на группы по десять птиц в каждую. Вакцину на основе частицы РНК-репликона альфавируса, экспрессирующую гемагглютинин-антиген штамма свиного гриппа H3N2, приготавливали с титром 1 × 10^8 RP/доза. Непосредственно перед вакцинацией, вакцину для группы, получавшей только RP, разводили 1:1 (об./об.) стерильным PBS разбавителем, при этом вакцину на основе частицы РНК-репликона альфавируса с добавлением вакцины адъювантной группы разводили 1:1 (об./об.) адъювантом XSolve. Сыворотки от цыплят анализировали на титр ингибирования гемагглютинации (HI) в дни исследования 0, 7 и 14 после вакцинации.

ТАБЛИЦА 6: Эффект масляного адъюванта в отношении титра HI

		Среднее геометрическое HI титра
Вакцина	Количество птиц	День 0	День 7	День 14
Только RP	10	25	25	18
RP+масляный адъювант	10	25	35	55
Плацебо	10	25	27	14

Добавление адъюванта XSolve к вакцине на основе частицы РНК-репликона альфавируса вызывало очевидное повышение HI титров птицы после однократной вакцинации, в отличие от вакцин без добавления адъюванта и плацебо.

ПРИМЕР 6

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ ПОВЫШАЕТ У ЦЫПЛЯТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ЧАСТИЦЫ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ АНТИГЕН ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БУРСИТА (IBDV)

В этом эксперименте вакцинации-контрольного инфицирования исследовали эффект масляного адъюванта в отношении эффективности вакцинации RP, экспрессирующей антиген - полипротеин VP2-4-3 из вируса инфекционного бурсита (IBDV) штамма Faragher 52/70. Подопытными животными были цыплята SPF (без специфического патогена), с отрицательным тестом по антителам против IBDV. Количество птиц в группе составляло 5 или 10. Вакцинацию осуществляли подкожным способом в первый день жизни (день вылупления); в одной группе (n=5) имитировали вакцинацию фосфатно-солевым буфером (PBS). Одна вакцинированная группа получала RP вакцину в водном буфере, другая группа вакцинирования получала RP вакцину, смешанную 1:1 с адъювантом XSolve. Через 28 дней после вакцинации во всех группах осуществляли контрольное инфицирование вирулентным штаммом IBDV CS89 посредством глазных капель. Эффективность вакцинации контролировали посредством некропсии, проведенной через 10 дней после контрольного инфицирования, оценивая ткани суставной сумки на наличие грубых поражений и по гистопатологии в соответствии с хорошо известными критериями для IBDV-инфекции.

ТАБЛИЦА 7: Эффект масляного адъюванта в отношении эффективности RP-вакцинации против контрольного инфицирования вирусом инфекционного бурсита (IBDV) острой формы

Группа	Вакцина	Количество птиц	% защиты
			На основе обширных поражений бурсы	На основе микроскопических поражений
1	RP-IBDV Полипротеин	10	0%	0%
2	RP-IBDV Полипротеин+XSolve	10	100%	100%
3	Плацебо	5	0%	0%

Очевидно, что добавление масляного адъюванта к RP вакцине оказало значительное положительное влияние на эффективность вакцинации против тяжелой контрольной инфекции: повышение иммунного ответа у цыпленка с нуля до полностью защитного.

ПРИМЕР 7

МАСЛЯНЫЙ АДЪЮВАНТ ТАКЖЕ ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ЧАСТИЦЫ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА У РЫБ

Вакцину на основе частицы РНК-репликона альфавируса, экспрессирующую основной капсидный белок иридовируса красного морского карася (RSIV), получали стандартными способами, описанными в настоящем описании. Тилапию вакцинировали внутримышечно 0,05 мл вакцины, а затем подвергали контрольному инфицированию в разные моменты времени после вакцинации. В исследовании использовали тридцать рыб на одну обработку и время контрольного инфицирования. Вакцины на основе частицы РНК-репликона альфавируса смешивали 1:1 (об./об.) с PBS или с SVEA, двойным адъювантом неминеральным маслом, незадолго до вакцинации. Титр RP на каждую обработку составлял 1 × 10^7 RP/дозу. Контрольных рыб вакцинировали вакциной-плацебо.

ТАБЛИЦА 8A: Эффект масляного адъюванта в отношении выраженного в процентах выживания тилапии

	Процент выживаемости через 14 дней после контрольного инфицирования
Группа обработки вакциной	3-недели контрольного инфицирования с низкой дозой	3-недели контрольного инфицирования с высокой дозой	6-недель контрольного инфицирования с низкой дозой	6-недель контрольного инфицирования с высокой дозой
RP-Иридо без адъюванта	77%	47%	83%	47%
RP-Иридо с масляным адъювантом	90%	43%	83%	70%
Невакцинированный контроль	43%	27%	67%	37%

ТАБЛИЦА 8B: Эффект масляного адъюванта в отношении выраженного в процентах относительного выживания тилапии

	Относительный процент выживаемости по сравнению с контролем
Группа обработки вакциной	3-недели контрольного инфицирования с низкой дозой	3-недели контрольного инфицирования с высокой дозой	6-недель контрольного инфицирования с низкой дозой	6-недель контрольного инфицирования с высокой дозой
RP-иридо без адъюванта	58,8	27,3	50,0	15,8
RP-иридо с масляным адъювантом	82,4	22,7	50,0	52,6
Невакцинированный контроль	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.

Как при “трехнедельном контрольном инфицировании с низкой дозой”, так и при “трехнедельном контрольном инфицировании с высокой дозой”, адъювант значительно повышал относительную выживаемость вакцинированной RP рыбы. Две другие контрольные обработки давали эквивалентные результаты. Таким образом, вакцина на основе частицы РНК-репликона альфавируса с адъювантом была значительно более эффективной по сравнению с RP-вакциной без адъюванта и обеспечивала эффективную вакцинацию даже при вакцинации только одной дозой.

ПРИМЕР 8

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОДНОВРЕМЕННОГО И СОПУТСТВУЮЩЕГО ПРИМЕНЕНИЯ RP И МАСЛЯНОГО АДЪЮВАНТА

Эксперимент проводили на свиньях с использованием комбинированной по четырем антигенам NA вируса свиного гриппа вакцины на основе частиц РНК-репликонов альфавирусов, как описано в примере 3. Это послужило иллюстрацией эффективности различных типов применения компонентов вакцины: RP и масляного адъюванта.

Вещества и методы

Свиней вакцинировали в возрасте примерно 4 и 7 недель. Комбинированная по четырем антигенам NA вакцина представляла собой смесь RP конструкций двойного гена N1 и двойного гена N2, как описано в примере 3, каждую из которых вводили в концентрации приблизительно 2 × 10^6 RP/дозу. Все группы содержали 4 свиньи. Схема протокола исследования представлена в таблице 9. Группа 2 получала NA RP, смешанные с адъювантом XSolve при одновременном применении.

В группах 3 и 4 исследовали эффект сопутствующего применения RP и масляного адъюванта: введения осуществляли с интервалом примерно 10 мин друг от друга и на одной и той же стороне шеи (на расстоянии более 5 см) или на противоположных сторонах шея.

Одна контрольная группа, группа 5, была включена с применением RP, кодирующего антиген HA H1 свиного гриппа. Ее вводили в концентрации приблизительно 1 × 10^7 RP/доза.

Сыворотки собирали в день первой вакцинации, в день второй вакцинации и через 7 дней после второй вакцинации. Эти сыворотки исследовали в отдельных анализах гомологичных NI для каждого из 4 типов NA.

Полученные в результате измеренные титры NI представлены на фиг. 5 и 6, причем на фиг. 5 представлены титры NI против N1 классического антигена NA в трех временных точках, измеренных во времени, включая стандартные отклонения. На фигуре 6 представлены средние по группе титры NI комбинированных 4 типов NA через 7 дней после второй вакцинации.

ТАБЛИЦА 9: Экспериментальный протокол примера 8

Группа	RP	Адъювант	Введение
1	комбинированная по четырем антигенам NA SIV	Отсутствует	Внутримышечное введение, 1 мл дозы
2		Xsolve	Смешивание и внутримышечная инъекция, 1 мл дозы
3			Раздельная инъекция RP и масляного адъюванта: 0,5 м каждая, внутримышечно, на одной и той же стороне шеи
4			Раздельная инъекция RP и адъюванта: 0,5 м каждая, внутримышечно, с противоположных сторон шеи
5	SIV HA H1	Отсутствует	Смешивание и внутримышечная инъекция, 1 мл дозы

Результаты и выводы

Из результатов, определенных в примере 8, можно наблюдать несколько эффектов:

- Профили титров NI для 4 типов NA в трех измеренных временных точках были практически идентичны, поэтому результаты, представленные на фиг.5 N1 классического NA, указывают на профили титров относительно других 3 типов NA.

-Также, профили титра NI в ответ на 4 типа NA в 7 день после второй вакцинации, как представлено на фиг.6, в основном аналогичны.

- Данные титра NI в контрольной группе с HA H1 RP (группа 5), как и ожидалось, показали отсутствие индуцирования титра NI; что соответствует порогу титра для конкретного ответа.

- За исключением некоторых изменений, определенных в эксперименте, большинство титров NI в группах 2-4, получавших RP и масляный адъювант, были значительно выше, чем в группе, получавшей только RP (группа 1). Это показывает, что масляный адъювант значительно повышает иммунизацию посредством RP.

- Группа, получавшая RP и масляный адъювант при одновременном использовании (группа 2), подтвердила сильный эффект масляного адъюванта, уже наблюдавшийся в предыдущих примерах.

- Иммунизирующий эффект сопутствующего применения RP и масляного адъюванта (группы 3-4) очень близок к эффекту одновременного применения: сильная стимуляция иммунного ответа на RP. Место введения не оказывало явного влияния на эффект.

Описанные в настоящем описании конкретные варианты осуществления не должны ограничивать объем настоящего изобретения. В этой связи можно заметить, что различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые описаны в настоящем описании, станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярной массы или веса, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и представлены для описания.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet Inc.

Intervet International BV

Mogler, Mark

Strait, Erin

Segers, Ruud

<120> ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ЧАСТИЦ РЕПЛИКОНА С МАСЛЯНЫМ АДЪЮВАНТОМ

<130> 24651

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 1

ggcgcgccgc acc 13

<210> 2

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3' фланкирующая последовательность

<400> 2

ttaattaa 8

<---

Claims (13)

1. Вакцина против патогена, который вызывает заболевание у животного, содержащая иммунологически эффективное количество частиц РНК-репликона альфавируса, кодирующих антиген, происходящий из патогена животного, причем вакцина также содержит масляный адъювант, где масляный адъювант содержит минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е.

2. Вакцина по п. 1, в которой количество минерального масла в масляном адъюванте составляет 1-70% об./об. масляного адъюванта.

3. Вакцина по п. 1, в которой общее количество неминерального масла в масляном адъюванте составляет 0,1-30% мас./об. масляного адъюванта.

4. Вакцина по п. 1, в которой масляный адъювант получен в виде эмульсии типа масло-в-воде.

5. Вакцина по п. 1, в которой частица РНК-репликона альфавируса является частицей РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).

6. Вакцина по п. 1, причем патоген животного представляет собой патоген животного, выбранного из группы, состоящей из рыбы, птицы и млекопитающего.

7. Вакцина по п. 6, причем млекопитающее представляет собой свинью.

8. Вакцина по п. 6, причем птица представляет собой курицу или индейку.

9. Вакцина по п. 6, причем рыба является членом семейства цихлид.

10. Набор для иммунизации животного, содержащий по меньшей мере два контейнера, причем по меньшей мере один контейнер содержит частицу РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кодирующую антиген, происходящий из патогена животного, и по меньшей мере один контейнер содержит масляный адъювант, содержащий минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е.

11. Способ иммунизации животного, включающий введение животному иммунологически эффективного количества любой из вакцин по пп. 1-9.

12. Применение частицы РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кодирующей антиген, происходящий из патогена животного, в способе иммунизации животного, причем частицу РНК-репликона альфавируса вводят в организм целевого животного или наносят на него при одновременном применении или при сопутствующем применении с масляным адъювантом, содержащим минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е.

13. Способ иммунизации животного, включающий введение животному иммунологически эффективного количества вакцины, содержащей частицу РНК-репликона альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кодирующую антиген, происходящий из патогена животного, причем частицу РНК-репликона альфавируса вводят в организм целевого животного или наносят на него при одновременном применении или при сопутствующем применении с масляным адъювантом, содержащим минеральное масло, представляющее собой жидкое парафиновое масло, и неминеральное масло, представляющее собой ацетатную форму витамина Е.

Images