CN116528893A - 用于ha抗体阳性靶标的ha茎疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对靶标的流感病毒感染或疾病的疫苗，所述靶标具有预先存在的针对流感病毒HA头部结构域的抗体。本发明涉及表达HA茎多肽的重组载体，包含所述载体或具有所述载体的宿主细胞的疫苗，所述载体、宿主细胞或疫苗的用途，以及减少流感病毒感染或疾病的方法。重组载体可以是核酸如真核表达质粒或RNA、病毒或复制子颗粒(RP)。这种疫苗接种可以诱导针对流感病毒诱导的感染或疾病的早期和有效的免疫应答，而不受预先存在的抗HA头部结构域抗体的阻碍。
Description
本发明涉及疫苗学领域，具体涉及针对流感的疫苗。特别地，本发明涉及针对靶标的流感病毒感染或疾病的疫苗，所述靶标具有预先存在的针对流感病毒HA蛋白的抗体。本发明涉及表达HA茎多肽的重组载体，包含所述载体或具有所述载体的宿主细胞的疫苗，所述载体、宿主细胞或疫苗的用途，以及减少流感病毒感染或疾病的方法。
流感病毒在世界范围内出现并感染人和动物。引起的疾病主要是呼吸道疾病，并伴有多种附加症状。病理学从轻微到致命不等，导致许多不适和经济损失。此外，被感染的鸟类或猪有可能使人感染人畜共患病。
流感病毒是来自正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的有包膜病毒，并且具有分段的单链负义RNA基因组。流感病毒A-D是该家族中的独立的属，基于其结构蛋白(基质和核蛋白)而区分。世界上最著名的是甲型、乙型和丙型流感病毒。其中，甲型流感病毒属涵盖了仅感染特定靶标物种的几种病毒株，以及具有多物种宿主范围的一些病毒株。在表达的病毒包膜糖蛋白的基础上作出血清学细分：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。目前已知18种不同的HA抗原，表示为H1-H18，和11种NA抗原：N1-N11。关于流感病毒和其可诱导的疾病的详细信息描述于熟知的手册中，诸如：费氏病毒学(LWW publ.,ISBN:9781451105636)；默克兽医手册(2010，第10版，C.M.Kahn编辑，ISBN:091191093X)；以及：禽类疾病(2008，第12版，Y.Saif编辑，爱荷华州立大学出版社，ISBN-10:0813807182)。禽类中的流感感染还称为：鸡瘟、禽流感或鸟流感。
HA蛋白是甲型和乙型流感病毒的主要抗原，并且是病毒识别、结合和进入宿主细胞的中心。在其天然形式中，HA蛋白是显露在病毒的包膜(或“外壳”)和受感染宿主细胞膜上的同型三聚体。每个单体具有经茎结构域与跨膜结构域连接的球状头部结构域。头部结构域提供三聚作用，并介导与宿主细胞受体的初始接触。在病毒内吞后，HA的茎(或秆)结构域诱导与宿主细胞的内体膜的融合。
为了防止成熟前膜融合，在自然界中HA蛋白被表达为无活性的前蛋白HA0(HAzero)，其被宿主蛋白酶翻译后切割成HA1和HA2节段。HA1的中心部分形成HA单体的头部结构域。HA2的主要部分与HA1的N-和C-末端部分一起形成茎结构域。另外，HA2在其C-末端含有跨膜结构域和短胞质结构域。
在HA抗原中，头部结构域是免疫显性部分。因此，当用包含HA头部结构域或其抗原性部分的制剂，如全长HA蛋白或甚至整个流感病毒制剂免疫靶标时，靶标中产生的抗体主要针对HA头部结构域。因为编码头部结构域的HA基因部分在序列上是可变的，这解释了由流感病毒的(季节性)变体显示的大量抗原性漂移。因此，持续需要新的和更新的针对流感病毒的疫苗，用于人和动物靶标。
流感疫苗常规应用于人和兽医医疗实践。目标通常是降低临床症状的严重程度和持续时间，并且优选地还降低被感染宿主的病毒脱落的量和持续时间。几种不同类型的疫苗是可用的，例如基于活的减毒病毒、或基于灭活病毒的佐剂制剂、病毒制剂如去污剂提取(所谓的“裂解”)疫苗，或HA和/或NA蛋白的亚单位疫苗。疫苗也可以基于重组产物，例如表达质粒、mRNA、载体病毒或病毒样颗粒。
在兽医实践中，针对多种动物物种有可用流感疫苗。此类疫苗接种可以作为暴发情况下的紧急疫苗接种偶然地应用于例如禽类或猪。或者，在流感病毒的感染压力高的国家，可以常规地对猪和禽类及其幼龄后代进行疫苗接种。
经接种的靶标人或动物可能具有(母系来源)抗流感抗体，所述抗流感抗体由靶标本身或者是其母体先前与来自接种或野外感染的病毒接触而产生。已知靶标中这种预先存在的抗体会干扰流感疫苗接种的效力。这严重降低了此类抗体阳性靶标的流感疫苗接种的效力，使之暴露于野外感染。迄今为止，还没有针对该问题提供有效的解决方案。
与HA头部结构域相反，HA的茎结构域在流感病毒株中更保守，并且当在没有HA头部结构域(即“无头部”)的情况下施用时可用于诱导广泛的病毒识别抗体。这已经在1993年被认识到(Okuno等人，1993，J.of Virol.，第67卷，2552-2558页)。自此以后，许多研究已使用所谓的“无头部HA”，“微型HA”或“HA茎”多肽作为疫苗抗原，试图提供通用流感疫苗。相关综述参见例如Krammer&Palese(2013,Curr.Opin.Virol.,vol.3,p.521-530)，和Ostrowsky等人(2020,Curr.Opin.Virol.,vol.40,p.28-36)。
关于流感HA蛋白结构的许多细节是已知的。综述包括例如：Skehel&Wiley(2000,Annu.Rev.Biochem.,vol.69,p.531-569)；Sriwilaijaroen&Suzuki(2012,Proc.Jpn.Acad.,Ser.B，vol.88,p.226-249)；和Russell(2016,Ref.Module inBiomed.Sci.,doi:10.1016/B978-0-12-801238-3.95721-0)。Lu等人(2014,PNAS,vol.11,p.125-130)的图1提供了甲型流感HA蛋白的各种结构域和节段的说明性图示。
WO 2011/123495(’495)描述了流感HA茎结构域多肽及其作为疫苗的用途。HA茎多肽包含HA1 N-末端茎节段，HA1 C-末端茎节段和HA2，任选地具有一个或多个接头和三聚结构域。在其图1和2中，’495提供了HA氨基酸序列的示例性多重比对，并且在其表1-7中描述了来自甲型流感病毒和乙型流感病毒的不同HA血清型的各种结构域的示例性氨基酸序列。尽管’495提到了具有或不具有跨膜结构域的HA2的形式，但是没有公开这种构建体在重组载体中的存在，也没有提供任何将茎多肽接种到靶标人或动物中的结果，更不用说任何接种-攻击实验。’495也没有公开在具有预先存在的母系来源或其他来源的抗流感HA抗体的靶标中的用途；事实上，在’495中，特别不鼓励在年幼靶标，例如小于6个月大的人类儿童中使用(参见’495，第397、404和405段)。
WO 2013/079473描述了来自H1和H3型流感病毒的HA茎抗原作为广泛保护性疫苗抗原的用途。将几种突变引入HA2以增加稳定性和免疫原性。接头序列和信号序列用于优化表达构建体。为了在不存在头部结构域的情况下提供多聚化，在一些构建体中，HA茎抗原具有三聚结构域和跨膜(TM)结构域。使用表达质粒在特定的无病原体(SPF)小鼠中进行接种，有时使用佐剂化的可溶性蛋白质进行加强接种，并且在一些情况下应用攻击感染。
Impagliazzo等人的论文(2015,Science,vol.349,p.1301-1306)进行了WO 2013/079473的后续工作，在SPF小鼠和血清阴性猕猴中测试了可溶性HA茎抗原(即无TM结构域)。
Sunwoo等人(2018,Vaccines,vol.6,p.64)将嵌合HA蛋白用作具有抗流感病毒母系来源抗体(MDA)的猪的疫苗。这是为了研究疫苗增强性呼吸道疾病(vaccine-enhancedrespiratory disease)和茎特异性抗体之间的联系。测试的抗原由嵌合的全长HA蛋白组成，其头部结构域不同，但茎结构域保持不变。将它们以活的减毒重组流感病毒、灭活病毒或病毒提取物(裂解疫苗)的形式给予H1 HA MDA阳性猪。虽然在接种后没有检测到茎特异性抗体，但使用异源初免-加强接种方案获得了一定水平的针对攻击-感染的保护。
本发明的目的是适应本领域的需要，并提供对在接种疫苗时具有抗流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标有效的流感疫苗。
令人惊讶地发现，通过使用能够表达具有无头部HA茎结构域与跨膜结构域和三聚结构域的多肽的重组载体，用于对具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标进行疫苗接种，可以实现该目的，并因此可以克服现有技术的一个或多个缺点。
在对鸡接种疫苗以抵抗流感时，发明人失望地发现在用如WO 2013/079473和Impagliazzo等人(同上)描述的可溶性HA茎抗原单次接种后几乎不提供保护。显然，文献中描述的由HA茎抗原提供的有效和广泛的保护不容易复制，甚至在无抗体的动物中和当使用佐剂时也不容易复制。文献中没有任何指示表明如何进行改变。
只有当HA茎抗原通过重组载体的表达递送，并具有跨膜结构域从而在宿主细胞的表面上表达时，HA茎抗原才能在流感MDA的靶标中提供良好的疫苗效力，甚至是在单次接种后。这之前在现有技术中没有公开。
通过施用不同类型的重组载体，例如表达质粒、复制子RNA、重组病毒载体或作为复制子颗粒(RP)，可以在靶标中表达具有跨膜结构域的HA茎结构域抗原。这提供了用作在接种疫苗时具有预先存在的针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标的流感疫苗的广泛机会。
在预先存在HA抗体的情况下，不知道载体表达的和膜展示的HA茎结构域如何或为什么作为抗原比可溶性HA茎抗原有效得多。尽管本发明人不想被任何可以解释这些发现的理论或模型所束缚，但是他们假定膜锚对HA茎抗原的大分子结构有影响，这进而导致茎抗原更有效地呈递到靶标的免疫系统。这允许通过HA茎结构域抗原在经接种的靶标中诱导早期和有效的免疫应答，而不受预先存在的抗HA头部结构域抗体的阻碍。
因此，在一个方面，本发明涉及能够在靶标中表达重组流感病毒血凝素(HA)茎多肽的重组载体，其用于减少在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病，其特征在于所述多肽包含无头部流感病毒HA茎结构域、三聚结构域和跨膜结构域。
“载体”在本发明的领域中熟知为一种分子结构，其携带用于编码多肽的遗传信息(核酸序列)，具有合适的信号以允许其在合适的条件下，例如在宿主细胞中表达。对于本发明，“表达”涉及通过转录和/或翻译从遗传信息表达蛋白质的公知原理。
这种载体的许多类型和变体是已知的并且可以用于本发明，范围从核酸分子如DNA或RNA，到更复杂的结构如病毒样颗粒和复制子颗粒，直到复制性重组微生物如病毒。
根据所用载体的类型，需要以顺式(即在重组载体自身内提供)或反式(即从单独来源提供)提供或多或少的表达信号。
本发明的“重组”载体是遗传组成与其天然对应物不完全匹配的载体。这样的载体因此具有改变的分子组成，通常通过分子克隆和重组蛋白表达技术在体外操作其遗传信息实现。所进行的改变可用于提供、改善或适配载体和/或其表达的蛋白质的表达、操作、纯化、稳定性和/或免疫学行为。这些和其他技术在标准教科书如Sambrook&Russell:“Molecular cloning:a laboratory manual”(2001,Cold Spring Harbour LaboratoryPress；ISBN:0879695773)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(J.Wiley and Sons Inc,NY,2003,ISBN:047150338X)；和C.Dieffenbach&G.dveksler：“PCR primers:a laboratory manual”(CSHL Press,ISBN 0879696540)；及“PCRprotocols”,J.Bartlett和D.Stirling(Humana press,ISBN:0896036421)中有详细解释。
本领域技术人员能够很好地选择所需的信号并将其组合成可操作的组合，以制备用于本发明的重组载体，该重组载体在适当的条件下“能够表达”本发明的HA茎多肽。除了有助于构建和克隆的元件(例如限制酶识别位点或PCR引物)之外，众所周知的元件可选自以下的一种或多种：启动子、终止密码子、终止信号、聚腺苷酸化信号、7-甲基鸟苷(7mG)帽结构和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
“流感病毒”在本发明的领域中是众所周知的，并且这种病毒具有其分类学组的特征，如形态学、基因组和生物化学特征，以及生物学特征如生理学、免疫学或病理学行为。
关于这些病毒的一般信息可从例如本文指出的参考手册中获得。本发明中使用的流感病毒的样品可以从各种来源获得，例如作为来自人、或来自野生或农场的动物、或来自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学的野外分离物。使用常规血清学、生物化学或分子生物学工具可以容易地鉴定流感病毒。此外，关于流感病毒的许多序列信息可在公共序列数据库如NCBI的Genbank和EMBL的EBI中数字化获得。此外，关于HA蛋白的详细结构信息可在结构生物信息学研究合作组织(RCSB)蛋白数据库(PDB)中在www.rcsb.org获得，或者在流感研究数据库中在www.fludb.org获得。
本领域还已知，微生物在特定分类组中的分类基于其特征的组合。因此，本发明还包括病毒种的变体，其是以任何方式亚分类的，例如为亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等。
此外，对于本发明领域的技术人员显而易见的是，虽然本发明的特定病毒目前可被分配给该物种，即分类学分类，其可随时间改变，因为新的观点可导致重新分类为新的或不同的分类学组。然而，由于这并不改变病毒本身或其抗原所有组成集合(antigenicrepertoire)，而仅改变其科学命名或分类，因此这种重新分类的病毒仍在本发明的范围内。
“血凝素”(HA)(也称为血凝素)是一种众所周知的甲型或乙型流感病毒的包膜糖蛋白，由病毒基因组的第四节段编码。甲型流感HA基因编码大小约566个氨基酸(aa)的前蛋白。不带信号序列，成熟HA0蛋白大小约为550个氨基酸，HA1约为329个氨基酸，HA2区段约为221个氨基酸。
对于本发明，流感HA蛋白的不同结构域、节段和区段的命名根据Lu等(同上)。此外，关于不同亚型的HA蛋白中氨基酸的编号，本技术领域中使用的标准统一编号是基于所谓的“H3编号”。这是因为流感病毒分离株A/Aichi/2/68(H3N2)的HA是第一个对其晶体结构进行了充分分析，并随后进行了测序的病毒(Verhoeyen等人，1980，Nature，vol.286p.771-776)。566个氨基酸的全长H3 HA蛋白的氨基酸序列以GenBank登记号AAA43178表示，其中H3编号系统适用于成熟HA蛋白，因此没有16个氨基酸的信号肽。该方法也是Burke和Smith(2014，PLoS One 9(11)：e 112302)提出的编号方案的基础，其允许鉴定在所有HA亚型中结构和功能上等同的氨基酸。基于Burke和Smith的该出版物，FluDB网站(同上)甚至提供了方便的“HA亚型编号转换”工具。因此，本文将使用H3编号系统来鉴定HA多肽的特定氨基酸残基编号。
然而，当考虑HA蛋白的结构域、节段和区段的大小和序列时，可以考虑来自各种流感病毒株的HA蛋白的生物学变异。例如，组1(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)和组2(H3、H4、H7、H10、H14和H15)的HA蛋白之间存在一些差异。因此，对于本文所用的大小指示，“约”是指大小围绕所指示的氨基酸残基H3数目或多或少地变化1至5个氨基酸。
类似的指示适用于乙型流感HA蛋白，其编码的HA0大小约为585个氨基酸，HA1约为345个氨基酸，HA2约为223个氨基酸。
HA蛋白可以以不同的方式表征，例如生物化学或血清学方式，这些都是本领域技术人员熟知的。此外，根据现有技术和公知常识，本发明领域技术人员将知道并容易识别HA蛋白的不同结构域和区域。
对于甲型流感HA，HA2区段始于约H3编号329的aa处的精氨酸(用于HA0的蛋白水解裂解)之后，且从保守氨基酸序列开始，称为“融合肽”，包含氨基酸序列GLFGAIAGFIE(SEQID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的aa序列；在约H3编号330-340的aa处。
在HA2区段的茎结构域中，来自HA2约aa 75-90处的区域是天然茎三聚体之间的界面，这是在约H3编号405-420的aa处。
在其C末端侧，甲型流感HA2具有约27个aa的跨膜结构域，H3编号是aa 514-540；以及约10个aa的胞质结构域，H3编号是aa541-550。
“多肽”是指氨基酸的分子链。多肽可以是天然的或成熟的蛋白质、前蛋白质或原蛋白质、或蛋白质的片段。因此，蛋白质、肽和寡肽包括在本发明多肽的定义中，只要它们仍然含有流感病毒HA蛋白的指定结构域。
本发明的“靶标”是易受流感病毒感染的任何人或动物。动物可以是例如禽类、猪、犬科动物、马科动物或鼬科动物。
靶标可以具有任何体重、性别或年龄，在这些情况下，对用根据本发明使用的重组载体进行的疫苗接种易感。然而，显然有利的是治疗健康的未感染的靶标，并且尽可能早地治疗以预防任何野外感染及其后果。
因此，重组载体可用作预防性或治疗性治疗，或两者，因为其可表达的多肽可诱导能干扰流感病毒感染的建立和进展两者的免疫应答。
本发明的重组载体的“用途”涉及人或兽医医学用途，其中使用了载体表达的多肽的免疫学特性。通常，这涉及用重组载体作为下文描述的疫苗中的活性成分进行免疫。
术语“减少”涉及部分或全部减少流感病毒生产性感染在易感靶标的细胞和器官中的建立或增殖，或减少随后的疾病体征。这例如通过降低病毒载量或缩短病毒复制的持续时间来实现。进而导致靶标中病变的数量、强度或严重程度以及由病毒感染引起的疾病的相关临床体征的减少。
这种感染或疾病的减少可以容易地检测到，例如通过监测用本发明使用的重组载体接种后的免疫应答，和通过检测接种的靶标感染后临床症状或死亡率的出现，例如通过监测靶标的疾病体征、临床评分、血清学参数，或通过感染病原体的再分离。在动物中，可以将这些结果与模拟接种动物中对攻击感染的应答进行比较。评估流感病毒感染和疾病症状的不同方法是本领域公知的。
“由流感病毒引起的感染或疾病”是指由流感病毒引起的感染，以及感染的后续众所周知的症状或这种感染引起的疾病，以及它们的健康安全和经济后果。
采用本发明使用的重组载体由本发明HA茎多肽表达诱导的对于流感病毒感染或疾病的保护提供了用该载体免疫的靶标的改善的健康，和经济性能。这可以例如从诸如健康状况、存活率、生长速度、饲料转化率和产蛋率的增加以及(兽医)保健成本的降低等参数来评估。
本发明用于“在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体”的靶标。这种预先存在的抗体干扰包含全长流感病毒HA蛋白或这种HA头部结构域的抗原性部分的免疫。然而，如本文所公开的这样的抗体不干扰或至少少得多地干扰用本发明的HA茎多肽进行的免疫。
针对HA头部结构域的预先存在的抗体通常在用含有HA头部结构域或其部分的抗原性制剂感染或免疫后获得，因为头部结构域是免疫显性的。这样的制剂可以是完整的或部分的、活的或灭活的流感病毒的制剂，或包含全长HA蛋白、HA头部结构域或其一部分的重组疫苗。
在流感病毒感染或免疫靶标本身后，靶标可获得针对HA头部结构域的此类抗体。或者，可通过接种或摄入抗体被动获得这些抗体。当从靶标母体获得时，抗体是“母系来源的抗体”(MDA)。MDA在几种类型的靶标(人或动物)中发生。
在哺乳动物中，MDA可来源于抗体从母体到后代的跨胎盘转移。备选地，或另外地，MDA可以通过摄入这样的抗体，例如通过摄入含有抗体的母乳(所谓的初乳)而获得。然而，摄入初乳以获得针对疾病的被动保护并不限于幼龄的靶标，也可用于年长的靶标和跨物种使用。
在禽类中，MDA存在于蛋黄中，未出生的鸡在蛋内成熟期间将其吸收进腹部。
本发明的“抗体”涉及任何类型的免疫球蛋白：例如IgA、IgG、IgM、IgD、IgE或IgY或其部分，例如单链可变片段(ScFv)或Fv、F(ab’)或F(ab’)2片段。
在没有免疫刺激或补充的情况下，靶标中的抗体水平(所谓的“滴度”)由于抗体有限的生物半衰期而随时间降低。这适用于例如出生后的靶标或当靶标停止摄取奶时。因此，“在接种时”的目的是将免疫的时机与根据本发明使用的重组载体以及该靶标中抗HA头部结构域抗体的滴度联系起来。该抗体水平可以例如通过在接种时从靶标采集血清样品来测定，以确定针对HA头部结构域的抗体的滴度。
对于本发明，接种时靶标中的抗体水平是接种时前后±3天内的某一时间点靶标中的抗体滴度。
然而，这并不排除可以在接种后相当长的时间对预先存在的滴度值的实际测定本身，即对接种时采集的血清样品进行血清学检测，和/或分析和解释该检测的结果，条件是将血清样品储存在适当的条件下以保持抗体足够完整，例如储存在-20℃或更冷的条件下。类似地，这并不妨碍计算接种时预先存在的滴度并从在接种之前或之后的某段时间采集的样品中测定的水平外推，只要可以获得抗体滴度随时间下降的相当准确的数据。
对于本发明，当来自靶标的血清中抗HA头部结构域抗体的滴度高于背景水平时，靶标“具有”抗体，所述背景水平是未接触过流感病毒和流感抗体的同类靶标人或动物中检测到的。在动物中，这可以是例如相同年龄和物种的SPF(无特定病原体)动物血清中存在的滴度。
对于本发明，针对HA头部结构域的“抗体”是指特异性结合(即特异于)包含这种流感HA头部结构域(例如HA亚单位抗原或流感病毒制剂)的多肽的抗体。本领域技术人员可以容易地确定这种特异性，例如在ELISA中，在使用包被的HA抗原的试验中通过抗血清的线性稀释进行。当抗血清中的抗体是特异性的时，测试将显示检测到的结合信号的逐渐和线性降低。
“HA头部结构域”是本领域公知的，是HA蛋白的HA1区段的中心部分，其能够形成3D球状结构，并且是本领域技术人员已知和容易识别的。当从约550个氨基酸的成熟甲型流感HA0蛋白计数时，头部结构域构成包含基于H3编号从约aa编号44到约aa编号274的氨基酸序列的多肽，对应于Lu等人(同上)中给出的指示。同样，特定大小和aa数目的变化也可以发生在不同的甲型流感病毒HA蛋白中，参见例如WO 2011/123495中针对血清型H1-H16的甲型流感病毒HA序列的图1A；甲型流感H1 HA序列也参见WO 2013/079473中的表7。
因此，本发明的“无头部”HA茎结构域多肽不包含对应于如上定义的流感病毒HA头部结构域的氨基酸序列。
本文中使用的术语“包含”(以及诸如“包括”，“含有”和“包含有”等变体)旨在表示由使用该术语的文本部分、段落、权利要求等涵盖或包括在其中的本发明可想到的所有要素和任何可能的组合，即使没有明确地叙述这些要素或组合；并且不排除任何这样的要素或组合。
因此，任何这样的文本部分、段落、权利要求等因此还可涉及一个或多个实施方案，其中术语“包含”(或其变体)被诸如“由……组成”，“由以下组成”或“基本上由……组成”等的术语替代。
“流感病毒HA茎结构域多肽”是本领域公知的，其包含两个部分：来自HA蛋白的HA2区段的主要部分和HA1区段。茎多肽可以例如通过使用对多种流感HA蛋白的HA茎结构域具有特异性的熟知的单克隆抗体来鉴定，例如：FI6、CR9114和MEDI8552，这些都是众所周知的和可商购的。
具体而言，并基于Lu等人(同上)给出的指示，对于成熟流感病毒HA0蛋白，本发明的茎结构域包含：
-HA1 N-末端茎节段，起始于信号序列切割后留下的第一个氨基酸并延伸至头部结构域的起点：基于H3编号从约aa编号1至约aa编号43，
-HA1 C-末端茎节段，在头部结构域之后开始，并延伸至HA1和HA2的切割位点：基于H3编号从约aa编号276至约aa编号329，及
-HA2胞外域，在HA1和HA2的切割位点之后开始，并延伸至跨膜结构域：基于H3编号从约aa编号330到约aa编号513。
如下文更详细描述的，在H3 HA中，HA1 N-末端茎节段的长度偏离超过5个氨基酸，并且长约10个氨基酸。因此，对于H3，这使各个结构域的“H3编号”向上移位10aa。
由于本发明的多肽表达为一种融合肽，其构成部分直接或通过一个或多个插入间隔子和/或接头氨基酸序列共价连接到一条氨基酸链中。可以通过在不同部分的半胱氨酸之间形成的二硫键提供进一步的连接。
茎结构域多肽的构成部分可以是天然的或异源的，因此对于本发明，如果与本发明多肽中的HA2茎结构域相比，多肽部分来源于不同的来源，则它是“异源的”。使用一个或多个异源元件产生本发明多肽的嵌合形式，这在本发明的范围内。
对于本发明，“衍生的”表示本发明多肽的来源，因此表示其编码核酸。这些可从生物来源分离或可基于序列信息重组或合成产生。
用于本发明的多肽相对于天然HA茎结构域的改变例如涉及：用异源信号序列替换天然信号序列；改变传导HA1-HA2切割的信号的碱性氨基酸；和/或添加标签以促进纯化，例如6x组氨酸标签。此外，在组成本发明的流感病毒HA茎多肽的指定结构域之间，可以使用一个或多个aa接头序列。
“三聚结构域”是众所周知的多肽，其提供与其连接的同聚体多肽的三倍多聚化。多种这样的三聚结构域是本领域中已知和可用的，例如：来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的GCN4转录激活因子的异亮氨酸拉链3结构域(“GCN4结构域”)，和噬菌体T4纤连蛋白的折叠结构域(“折叠结构域”)。
根据本发明使用的重组载体可以以不同的方式包含三聚结构域：例如在构成根据本发明使用的重组载体的节段和结构域之前、之后或之间。
众所周知，“跨膜结构域”是具有疏水特征的氨基酸序列，其可以提供附着和/或锚定在脂双层膜中。与本发明的HA茎结构域多肽连接的跨膜区可以是用于根据本发明使用的重组载体中的HA2茎结构域的天然跨膜结构域，或者可以是来自不同流感病毒HA蛋白或来自另一种蛋白的异源跨膜结构域。
跨膜结构域可以掺入或不掺入流感病毒HA蛋白的胞质结构域。
下面将详细描述本发明的实施方案和其他方面。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，由流感病毒引起的疾病是由甲型流感病毒或乙型流感病毒引起的；优选地，所述疾病由甲型流感病毒引起。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，表达的流感病毒HA茎多肽来源于甲型流感病毒或乙型流感病毒；优选地，HA茎多肽衍生自选自以下任一血清型的甲型流感病毒HA蛋白：H1至H18；更优选地，HA茎多肽衍生自选自以下任一血清型的甲型流感病毒HA蛋白：H1、H3、H5、H7和H9。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，表达的HA茎多肽的氨基酸序列是共有序列。
众所周知，为了获得这样的共有序列，比较氨基酸序列或编码核苷酸序列，并且从该比较得到共有序列；例如通过使用合适的计算机程序比对几种H9 HA茎结构域核苷酸序列。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，表达的HA茎多肽的组成部分的一般顺序是从N-末端到C-末端：
·HA1 N-末端茎节段，
·HA1 C-末端茎节段，
·HA2胞外域，
·跨膜结构域，和
·胞质结构域。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，表达的HA茎多肽在以下一个或多个之间含有接头序列：
·HA1 N-末端茎节段和HA1 C-末端茎节段之间；
·HA1 C-末端茎节段和HA2胞外域之间；以及
·HA2胞外域和跨膜结构域之间。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，表达的HA茎多肽包含如本文所述的一个或多个接头；优选地，接头氨基酸序列是GGGG(SEQ ID NO:2)。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，表达的HA茎多肽含有三聚结构域；优选地，三聚结构域是GCN4结构域或是折叠结构域；更优选地，三聚结构域是GCN4结构域；甚至更优选地，将GCN4结构域置于HA2胞外域内部；甚至更优选地，将GCN4结构域置于HA2区段内如本文所述的天然茎-三聚体界面的位置中。
对于本发明，三聚结构域在HA2胞外域内的这种放置可以取代该区段的氨基酸，或添加到该区段的氨基酸，使得它可以构成取代或插入。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，表达的流感病毒HA茎多肽具有选自SEQ ID NO:4、6、8、10和12之一的氨基酸序列。
如本领域技术人员将认识到的，SEQ ID NO:4、6、8、10和12的流感病毒HA茎多肽全部具有相同的总体布局，其在表1A和1B中进一步详述。简言之：
-所述天然HA蛋白信号序列的16aa被来自CD5的信号序列的25aa取代；
-HA头部结构域缺失，而HA1 N-和C-末端茎结构域节段通过SEQ ID NO:2的aa接头连接，由此HA1 N-末端节段位于HA1C-末端节段之前(即N-末端于之)；
-H3编号残基329处的精氨酸残基被谷氨酰胺取代以防止HA1-HA2切割；
-在HA2胞外域中间引入GCN4三聚结构域，HA2该位点茎-三聚体界面的15个相应氨基酸缺失；以及
-包括HA2的跨膜结构域和胞质结构域。
在SEQ ID NO:4、6、8、10和12的HA茎多肽中，HA茎结构域、跨膜结构域和胞质结构域的节段分别对H1、H3、H5、H7和H9具有特异性。H1、H3和H9茎结构域序列也是共有序列，通过比对许多最近的甲型流感病毒分离株确定：H1和H3来自猪流感病毒(SIV)分离株，H9来自禽流感病毒(AIV)分离株。H5 HA茎序列取自AIV株：H5N1 A/Vietnam/1203/2004(GenBank：ABW90134)；H7 HA茎序列取自AIV株：H7N9A/Anhui/1-YK_RG05/2013(GenBank：ABW41079)。
此外，引入许多aa突变以稳定多肽和/或增加其溶解度；这些如WO 2013/079473中所述应用。
在表1A中给出的指示中，H7 HA茎多肽(SEQ ID NO:10)与SEQ ID NO:4、8和12(分别为H1、H5和H9 HA茎多肽)的差异很小，因为HA1 N-末端茎节段长1个氨基酸，而HA2片段2短1个氨基酸。H3 HA茎多肽(SEQ ID NO:6)在HA2片段2中具有相同的小差异，但在HA1 N-末端茎节段中具有更显著的差异，其长10aa；这在表1B中表示。
表1A：SEQ ID NO:4、8、10和12的详细共同布局
| SEQ ID aa号 | H3编号 | |
| CD5异源信号序列 | 1-24 | -- |
| HA1 N-末端茎节段 | 25-59 | 11-45 |
| 4X甘氨酸接头 | 60-63 | -- |
| HA1 C-末端茎节段 | 64-86 | 307-329 |
| HA2胞外域，第1部分 | 87-161 | 330-404 |
| 三聚结构域 | 162-176 | -- |
| HA2胞外域，第2部分 | 177-272 | 420-514 |
| 跨膜结构域 | 273-295 | 515-537 |
| 胞质结构域 | 296-308 | 538-550 |
表1B：SEQ ID NO:6的详细布局
| SEQ ID aa号 | H3编号 | |
| CD5异源信号序列 | 1-24 | -- |
| HA1 N-末端茎节段 | 25-69 | 11-55 |
| 4X甘氨酸接头 | 60-63 | -- |
| HA1 C-末端茎节段 | 64-86 | 317-339 |
| HA2胞外域，第1部分 | 87-161 | 340-414 |
| 三聚结构域 | 162-176 | -- |
| HA2胞外域，第2部分 | 177-272 | 430-524 |
| 跨膜结构域 | 273-295 | 525-547 |
| 胞质结构域 | 296-308 | 548-560 |
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，靶标是人；优选地，靶标人是年轻的、年老的、患病的或免疫受损的人。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，靶标是动物；优选地，所述动物选自禽类、猪、犬科动物、马科动物或鼬科动物。
更优选：
·所述禽类选自鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑(quail)、雉类(quail)、山鹑(partridge)和鸵鸟；
·所述猪选自：野生猪或家猪、野猪(wild boar)、鹿豚(babirusa)和疣猪(warthog)；
·所述犬科动物是狗；
·所述马科动物是马；
·所述鼬科动物选自雪貂和貂。
甚至更优选地，靶标是猪或鸡。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，抗流感病毒HA头部结构域的抗体是母系来源的抗体(MDA)。
如上文描述的，根据本发明使用的重组载体能够表达本发明的流感病毒HA茎多肽，因为它包含编码HA茎多肽的核酸序列。在大多数情况下，编码核酸对于载体是异源的。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，编码流感病毒HA茎多肽的核酸是密码子优化的。
密码子优化是众所周知的，并且用于在与HA茎多肽来源不同的情况下提高HA茎多肽的表达水平。它涉及核苷酸序列的改编以编码预期的氨基酸，通过与重组载体、宿主细胞或表达该序列的靶标生物的密码子偏好(tRNA库)相匹配的核苷酸序列进行。因此，所应用的核苷酸突变是沉默的。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，HA茎多肽由针对靶标生物密码子优化的核酸序列编码；优选地，靶标生物选自：人、禽类、猪、犬科动物、马科动物和鼬科动物。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，HA茎多肽由选自SEQ ID NO:3、5、7、9和11之一的核酸序列编码。
如本领域技术人员将认识到的，SEQ ID NO:3、5、7、9和11中所示的核苷酸序列是指DNA核酸，并且是指“编码链”。对于互补DNA链，“模板”链，序列是反向互补的。
而且，不言而喻地，当根据本发明使用的重组载体包含用于表达HA茎多肽的RNA核酸时，则除了任何T被U取代之外，应用与SEQ ID NO:3、5、7、9和11中相同的编码序列。
此外，SEQ ID NO:3、5、7、9和11或作为RNA核酸的相应序列分别编码SEQ ID NO:4、6、8、10和12的HA茎多肽。
如上文描述的，根据本发明使用的重组载体可以具有不同的形式，范围从核酸分子如DNA或RNA，到更复杂的结构如病毒样颗粒和复制子颗粒，直到复制性重组微生物如病毒。
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的重组载体选自核酸、病毒和复制子颗粒(RP)。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，载体是核酸。
在其中载体是核酸的根据本发明使用的重组载体的实施方案中，核酸是真核表达质粒。
真核表达质粒，通常是DNA，在真核细胞中有活性的启动子的操作控制下，具有插入质粒的异源基因表达的合适信号。然后可通过一些转染方法，例如使用生化物质作为载体，通过机械方法或通过电穿孔将质粒插入真核宿主细胞或宿主生物，并开始表达异源基因插入片段。通常这种表达将是瞬时的，因为质粒缺乏用于稳定整合到宿主细胞基因组中的信号；因此，这种质粒通常不会转化或永生化宿主或宿主细胞。所有这些材料和方法都是本领域公知的，并描述于手册中。这样的真核表达质粒可从多个供应商商购获得，例如质粒系列：pcDNATM、pCR3.1TM、pCMVTM、pFRTTM、pVAX1TM、pCITM、NanoplasmidTM、pCAGGS等。
在一个优选的实施方案中，真核表达质粒是pFRT质粒(ThemoFisher)或pCAGGS质粒(Niwa et al.,1991,Gene,vol.108,p.193-199)。
真核表达质粒可以包含用于调节表达、纯化等的几个特征。一种可能的信号是抗生素抗性基因，其可以在构建和克隆过程中用于筛选。然而，当预期施用于人或动物靶标时，由于担心产生抗生素耐药性，这种抗生素筛选是不期望的。
在根据本发明使用的重组载体的优选实施方案中(其中载体是核酸，核酸是真核表达质粒)，质粒不含有抗生素抗性基因。
根据本发明使用的重组载体(以真核表达质粒的形式)可以递送到宿主细胞或靶标生物，它将在宿主细胞中表达本发明的HA茎多肽。表达质粒的递送可以以几种方式进行，例如通过机械或化学方式，如裸DNA，或用合适的(纳米颗粒)载体如蛋白质、多糖、脂质或聚合物包封。核酸载体的众所周知的例子是树枝状聚合物、脂质纳米颗粒、阳离子聚合物和鱼精蛋白。
根据本发明使用的重组载体的具体形式(为真核表达质粒形式)是当质粒提供复制子RNA的递送时。
因此，在根据本发明使用的重组载体的实施方案中(其中载体是核酸并且核酸是真核表达质粒)，质粒编码复制子RNA。
“复制子RNA”也称为自扩增mRNA，是自我复制性RNA，除了编码本发明的HA茎多肽的核酸外，它还含有RNA复制所必需的元件，如复制酶基因。然而，与复制子颗粒(RP)不同，复制子RNA不被病毒结构蛋白包装，因此在进入宿主细胞方面效率较低。
编码复制子RNA的表达质粒可以以与表达蛋白质的质粒相同的方式递送至宿主细胞。在这种情况下，没有以反式形式共同提供病毒结构蛋白，因此复制子RNA将不会包装到RP中。
用编码复制子RNA的真核表达质粒接种提供了优于用表达蛋白的真核表达质粒接种的优点，因为复制子RNA提供了扩增步骤：复制酶的翻译使复制子RNA产生编码HA茎多肽的亚基因组信使RNA。这使得本发明的HA茎多肽分别在宿主细胞和靶标中高量表达。
在根据本发明使用的重组载体的优选实施方案中(其中所述载体是核酸，所述核酸是真核表达质粒，并且所述质粒编码复制子RNA)，所述复制子RNA是基于甲病毒的复制子RNA；更优选地，基于甲病毒属的复制子RNA是基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的复制子RNA。
编码VEEV复制子RNA的真核表达质粒的实例是例如pVAX质粒，其包含由真核启动子如人CMV立即早期基因1启动子驱动的VEEV非结构蛋白基因1-4。
这种质粒的具体实例是基于pVAX质粒(ThermoFisher)，例如SEQ ID NO:12所示的‘pVAX-CMV-T7-HHR-VEEV-dPS-Rep’。该特定质粒具有10.709个碱基对，其组成如表2中描述的。
表2：如SEQ ID NO:12所示的质粒pVAX-CMV-T7-HHR-VEEV-dPS-Rep的组成
在根据本发明使用的重组载体的替代实施方案中(其中载体是核酸)，核酸是RNA分子。
本发明的RNA分子可以具有不同的形式和功能，例如可以是mRNA或可以是复制子RNA。
根据本发明使用的重组载体(为RNA分子形式)可以以不同的方式递送到靶标或宿主细胞，例如通过机械或化学方法，或用合适的(纳米颗粒)载体如所描述的蛋白质、多糖、脂质或聚合物包封。为了稳定RNA，可以将某些化学修饰应用于例如核苷酸或其主链，或掺入核苷酸类似物。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中(其中载体是核酸并且核酸是RNA分子)，RNA分子是mRNA。
“mRNA”是本领域公知的，通常具有5'7mG帽和3'poly-A尾。可以通过转染和/或使用合适的载体，例如聚合物或阳离子脂质将mRNA递送至真核宿主生物或宿主细胞。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中(其中载体是核酸并且核酸是RNA分子)，RNA分子是复制子RNA。
复制子RNA可以在体外产生，例如使用如上文所描述的pVAX-CMV-T7-HHR-VEEV-dPS-Rep质粒，然后使用任何合适的方法给予宿主细胞或靶标生物。
以复制性重组病毒载体形式表达和递送异源抗原的重组载体是本领域公知的。这些提供了有效的疫苗接种方法，因为病毒载体在靶标中复制和扩增。重组载体病毒的组装和修饰使用标准分子生物学技术的常规方法。
随着时间的推移，许多不同的病毒种类已被用作重组载体，并用于各种人和动物靶标。
因此，在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，重组载体是病毒。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中(其中所述载体是病毒)，所述病毒选自疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、副粘病毒、弹状病毒和腺病毒。
为了用于人靶标，重组载体病毒优选是腺病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎病毒)、或副粘病毒(例如麻疹病毒)。用于禽类靶标的重组载体病毒优选疱疹病毒，更优选火鸡疱疹病毒(HVT)或血清型1或2的马立克氏病病毒(Marek’s disease virus)。用于猪靶标的重组载体病毒优选是疱疹病毒，例如伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1)。
因为重组载体病毒相对较大，所以可以插入不仅单个而且甚至多个用于表达的异源基因插入片段。在WO 2012/052384和EP 19218804.3中描述了表达和递送流感HA基因的重组病毒载体的实例：将HVT作为载体。WO 2007/106882在一个实例中描述了将新城疫病毒(NDV；禽副粘病毒)作为载体。
为了构建重组病毒载体，通常将表达盒插入载体基因组中的基因座。不同的技术可用于控制该插入的位置和取向。例如通过使用来自载体基因组的适当侧翼区段来指导盒通过同源重组过程的整合，例如通过使用US 5,961,982中所描述的重叠粘粒。或者，可通过使用CRISPR/Cas技术进行整合。
“表达盒”是包含至少一个异源基因和驱动该基因转录的启动子的核酸片段，以使编码的蛋白质能够表达。转录的终止可以由表达盒的基因组插入位点提供的序列提供，或者表达盒本身可以包含终止信号，如转录终止子。在这样的盒中，启动子和终止子都需要与它们调节其表达的基因非常接近；这被称为“可操作地连接”，由此在它们之间不存在显著的其他序列，所述其他序列将分别干预转录的有效起始-终止。对本领域技术人员显而易见的是，表达盒是自包含的表达模块，因此其在载体病毒基因组中的取向通常不是关键的。
根据本发明使用的重组载体也可以通过类似病毒体的大分子结构递送到靶标和表达。实例是病毒样颗粒(VLP)或复制子颗粒(RP)。已知为“单循环”感染性颗粒，这些颗粒含有感染宿主细胞并表达其携带的编码多肽的异源基因所必需的特征，然而，作为内置的安全特征，由于缺乏构建它们的病毒基因组(的相关部分)，它们通常不能完全病毒复制。
“RP”是众所周知的，并且已经开发了几种RP作为表达和递送多种蛋白质的平台。RP的有利基础是甲病毒，因为其广泛的宿主范围和快速的复制。当然，需要采取适当的安全措施来减弱和控制这些RP的感染，因为一些甲病毒在其野生型形式时是高度致病性的。有关综述请参见：Kamrud等人，2010，J.Gen.Virol.,vol.91,p.1723-1727，和：Vander Veen等人，2012,Anim.Health Res.Rev.,vol.13,p.1-9。
因此，在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，载体是RP。优选地，RP是甲病毒RP；更优选地，甲病毒RP是VEEV RP。
优选的甲病毒RP基于VEEV，其已经被用作人、猪、禽类和鱼的重组载体疫苗。构建、测试和使用基于VEEV的甲病毒RP的方法和工具是众所周知的和可用的，参见例如：Pushko等人，1997，Virology，vol.239，p.389-401，和：WO 2019/110481。优选的VEEV RP技术是SirraVaxsm RNA颗粒技术(Harrisvaccine)。
在一个实施方案中，pVAX-CMV-T7-HHR-VEEV-dPS-Rep质粒用于产生RP：从质粒产生RNA，然后将其与反式编码VEEV结构蛋白的辅助RNA一起转染到宿主细胞中。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，应用一种或多种选自以下的条件：
-由流感病毒引起的疾病是由甲型流感病毒或乙型流感病毒引起；优选地，所述疾病由甲型流感病毒引起；
-表达的HA茎多肽源自甲型流感病毒或乙型流感病毒；优选地，HA茎多肽衍生自选自以下任一血清型的甲型流感病毒HA蛋白：H1至H18；更优选地，HA茎多肽衍生自选自以下任一血清型的甲型流感病毒HA蛋白：H1、H3、H5、H7和H9；
-表达的HA茎多肽是共有序列；
-表达的HA茎多肽的构成部位的一般顺序为，从N-末端至C-末端：
o HA1 N-末端茎节段，
o HA1 C-末端茎节段，
o HA2胞外域，
o跨膜结构域，和
o胞质结构域；
-表达的HA茎多肽在以下一个或多个之间含有接头序列：
o HA1 N-末端茎节段和HA1 C-末端茎节段之间；
o HA1 C-末端茎节段和HA2胞外域之间；以及
o HA2胞外域和跨膜结构域之间；
-表达的HA茎多肽包含一个或多个根据本发明的接头；优选地，接头氨基酸序列是GGGG(SEQ ID NO:2)；
-表达的HA茎多肽含有三聚结构域；优选地，三聚结构域是GCN4结构域或是折叠结构域；更优选地，三聚结构域是GCN4结构域；甚至更优选地，将GCN4结构域置于HA2胞外域内部；甚至更优选地，将GCN4结构域置于HA2区段内如本文所描述的天然茎-三聚体界面的位置中；
-表达的HA茎多肽具有SEQ ID NO:4、6、8、10和12之一所示的氨基酸序列；
-靶标是人；优选地，人靶标是年轻人、老人、病人或免疫受损的人；
-靶标是动物；优选地，所述动物选自禽类、猪、犬科动物、马科动物或鼬科动物；更优选地：
o所述禽类选自鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉类、鹦鹉和鸵鸟；
o所述猪选自：野生猪或家猪、野猪、鹿豚和疣猪；
o 所述犬科动物是狗；
o 所述马科动物是马；
o所述鼬科动物选自雪貂和水貂；
-靶标是猪或鸡；
-针对流感病毒HA头部结构域的抗体是母系来源的抗体(MDA)；
-编码HA茎多肽的核酸是经密码子优化的；
-HA茎多肽由针对靶标生物密码子优化的核酸序列编码；优选地，靶标生物选自：人、禽类、猪、犬科动物、马科动物和鼬科动物；
-HA茎多肽由SEQ ID NO:3、5、7、9和11中所示的核酸序列编码；以及
-根据本发明使用的重组载体选自核酸、病毒和RP；优选地：
o所述核酸是真核表达质粒或RNA分子；
o所述病毒选自疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、副粘病毒、弹状病毒和腺病毒；或
o所述RP是甲病毒RP。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，表达的HA茎多肽具有如SEQ ID NO:4、6、8、10和12之一所示的氨基酸序列；靶标是猪或鸡；针对流感病毒HA头部结构域的抗体是母系来源的抗体；编码HA茎多肽的核酸是针对靶标生物密码子优化的；并且所述载体选自核酸、病毒和RP。
根据本发明使用的重组载体可有利地用于将本发明的流感病毒HA茎多肽递送至靶标和表达，例如以接种该靶标的方式。这涉及在某一阶段将该载体导入合适的宿主细胞。如上文所述，根据所用重组载体的类型，导入宿主细胞可能需要载体(carrier)、一些转染方法，或可由载体本身指导。然而，一旦载体在宿主细胞内，就表达HA茎多肽，从而用重组载体感染或转染的宿主细胞本身可用于本发明，例如，因为感染或转染的宿主细胞可用于靶标接种。
本发明的“宿主细胞”是在例如通过转染或感染将根据本发明使用的重组载体导入所述宿主细胞后允许本发明的HA茎多肽自其表达的细胞。
本发明的宿主细胞可以是原代细胞，例如靶标生物中的细胞，或体外保存的细胞，如悬浮液、单层或组织中的细胞。典型地，当在体外时，原代细胞只能进行少量和有限次数的细胞分裂。
或者，宿主细胞可以是永生化细胞，例如来自已建立的细胞系，其可以几乎无限地生长和分裂。根据宿主细胞的类型，本发明的HA茎多肽的表达将包括或多或少广泛的翻译后加工，例如信号肽切割、二硫键形成、糖基化和/或脂质修饰。
原代或永生化宿主细胞可以与根据本发明使用的重组载体的靶标相同或来自不同物种。
使用的很多宿主细胞是成纤维细胞和淋巴细胞。在使用HVT作为根据本发明使用的重组病毒载体的情况下，宿主细胞优选为原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，其可以如参见例如WO 2019/121888中描述的使用和储存。
本发明的宿主细胞优选是永生化禽类细胞。已经描述了几种永生化禽类细胞系，例如在WO 97/044443和WO 98/006824中；更优选地，本发明的永生化禽类宿主细胞是永生化CEF；甚至更优选WO 2016/087560中公开的永生化CEF。
如所描述的，根据本发明使用的重组载体和本发明的宿主细胞可有利地用于疫苗中以减少由流感病毒引起的感染或疾病。
因此，在另外的方面，本发明涉及用于减少在接种疫苗时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的疫苗，所述疫苗包含根据本发明使用的重组载体或包含所述重组载体的宿主细胞，和药学上可接受的载体。
众所周知，“疫苗”是在药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。“免疫活性化合物”或“抗原”是由被接种的靶标的免疫系统识别并诱导来自靶标的体液和/或细胞免疫系统的保护性免疫应答的分子。
根据本发明使用的疫苗是“抗流感”疫苗，并且提供由流感病毒引起的感染或疾病的体征的减少，如上文描述的。
具体地，如上文描述的，根据本发明使用的疫苗在具有预先存在针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中是有效的。
众所周知，“药学上可接受的载体”有助于疫苗的稳定和给药，同时对靶标无害且耐受良好。这种载体可以是例如无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以是例如缓冲剂，其可以包含另外的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如描述于熟知的手册中，例如：“Remington:the science and practice of pharmacy”(2000,Lippincott,USA,ISBN:683306472)，以及：“Veterinary vaccinology”(P.Pastoret等人编.,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN 0444819681)。
对于本发明，当疫苗包含细胞相关HVT重组病毒载体时，那么药学上可接受的载体优选是包含血清和DMSO的培养基的混合物。该载体还提供HVT载体感染的宿主细胞在冷冻和冷冻贮存期间的稳定性。血清可以例如是胎牛血清或新生小牛血清。
类似地，当根据本发明使用的疫苗包含核酸或RP时，药学上可接受的载体可以是简单的缓冲液，例如含有5％w/v蔗糖的磷酸盐缓冲液。
此外，可以加入额外的载体以稳定和/或递送根据本发明使用的重组载体，例如用合适的(纳米颗粒)载体(如描述的蛋白质、多糖、脂质或聚合物)包封。优选地，用于本发明的RP的另外的载体包含纳米凝胶，所述纳米凝胶是如WO 2012/165953中描述的可生物降解的聚丙烯酸聚合物。
根据本发明使用的疫苗可以包含另外的免疫活性成分。这可用于增强已经提供的免疫保护，或将其扩展到其他病原体。
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗包含至少一种另外的免疫活性成分。
这样的“另外的免疫活性成分”可以是抗原、免疫增强物质、细胞因子、另外的疫苗或其任何组合。这在成本、效率和福利方面提供了优点。或者，根据本发明使用的疫苗本身可加入疫苗中。
通过根据本发明使用的疫苗减少靶标中流感病毒载量的另一个有利作用是预防或减少由受感染靶标脱落的病毒，从而防止或减少流感病毒在垂直方向上传播到后代，以及在群或群体内及地理区域内水平传播。因此，使用根据本发明使用的疫苗导致流感病毒流行率的降低。
因此，本发明的其他方面是：
-根据本发明使用的疫苗的用途，用于降低群体或地理区域中流感病毒的流行；以及
-根据本发明使用的疫苗，用于减少群体或地理区域中流感病毒的流行。
根据本发明使用的疫苗通过众所周知的方法制备，例如如本文描述和举例说明的方法，例如包括将根据本发明使用的重组载体或本发明的宿主细胞与药学上可接受的载体混合的步骤。
此外，可以将各种其他化合物加入到根据本发明使用的疫苗中，例如稳定剂、载体、佐剂、稀释剂、乳剂等。这些添加剂描述在众所周知的手册中，例如：“Remington”和“Veterinary Vaccinology”(均同上)。
以此方式，当本领域技术人员需要时，使用常规技术可以进一步优化根据本发明使用的疫苗的效力。
适用于根据众所周知的药品生产标准生产疫苗的一般技术和考虑因素载于政府指令和法规(药典，9CFR)和熟知的手册(“Veterinary Vaccinology”和“Remington”，均同上)中。通常这样的疫苗是无菌制备的，并且使用药用质量等级的赋形剂制备。
这样的制剂将包括无菌微生物测试，并且不存在外来试剂，并且可以包括用于确认效力和安全性的体内或体外研究。完成质量、数量、无菌、安全性和效力测试后，疫苗可上市销售。所有这些都是本领域技术人员公知的。
根据本发明使用的疫苗的施用途径，可能需要调整疫苗的组成。这完全在本领域技术人员的能力范围内，并且通常涉及疫苗效力或安全性的微调。这可以通过调整疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用另一种形式或制剂的疫苗，或通过调整疫苗的其他组成成分(例如稳定剂或佐剂)来实现。
优选地，根据本发明使用的疫苗被配制成可注射的液体，适于胚内、皮内或肠胃外注射。可注射液体可以是例如悬浮液、溶液、分散体或乳液。
在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗用于通过肠胃外途径施用。优选通过肌内或皮下途径施用。
在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗用于通过皮内途径施用。更优选地，皮内施用途径应用于猪靶标。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明使用的重组载体的用途、或包含所述重组载体的宿主细胞的用途、和/或根据本发明使用的疫苗的用途，用于减少接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病。
类似地，在另一方面，本发明涉及减少在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的方法，所述方法包括向所述靶标施用根据本发明使用的重组载体、包含所述重组载体的宿主细胞、和/或根据本发明使用的疫苗。
在根据本发明的用途或根据本发明的减少感染的方法的优选实施方案中，根据本发明使用的疫苗另外包含含有全长HA蛋白的疫苗。
在这种组合中，根据本发明使用的疫苗可以在MDA的背景下提供针对流感的早期免疫，并且另外可以提供长持续时间的流感病毒免疫。
根据本发明使用的疫苗的每靶标剂量体积可以根据预期的施用途径来优化：胚内接种通常以约0.01至约0.5ml/卵的剂量施用，而肠胃外注射通常以约0.1至约10ml/靶标的剂量进行。
确定使用根据本发明的疫苗的免疫有效量或优化疫苗的每剂量体积都完全在本领域技术人员的能力范围内。
用于将根据本发明使用的疫苗施用于靶标生物的给药方案可以是单剂量或多剂量，以与疫苗制剂相容的方式，并且以免疫有效的量进行。
优选地，将施用根据本发明使用的疫苗的方案整合到靶标可能需要的其他疫苗的现有接种计划中，以降低对靶标的压力和降低劳动成本。这些其他疫苗可以以与其许可使用相容的方式同时、并行或顺序施用。
优选地，根据本发明使用的疫苗仅作为单次注射施用一次。
当用根据本发明使用的重组载体、用包含所述载体的宿主细胞、或用根据本发明使用的疫苗治疗的靶标是禽类时，所述治疗优选在非常早的年龄施用：在孵化当天(“第1天”)或在胚内(例如在胚胎发育的18天)施用，其都是本领域公知的。
现在将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1：重组构建体的制备
1.1.HVT疫苗：
使用基本上如WO 2012/052384和WO 2016/102647中描述的用于转染、重组、选择和扩增的方法制备HVT病毒载体疫苗。在HVT中，全H5 HA基因和H5 HA茎编码构建体(SEQ IDNO:7)由PRV gB基因启动子驱动，并将表达盒插入HVT基因组的Us2基因座。
1.2.复制子颗粒
使用如WO 2005/113782、WO 2008/156829和：Kamrud等人(2010,J.Gen.Virol.,vol.91,p.1723-1727)中描述的分离辅助系统(split-helper system)构建、生产和选择VEEV RP。用于RP的插入片段是用于鸡实验的H5 HA茎编码构建体(SEQ ID NO:7)和H9 HA茎编码构建体(SEQ ID NO:11)，和用于猪的H1 HA茎编码构建体(SEQ ID NO:3)。在猪-动物实验中使用的细节如WO 2019/110481中所描述的。
1.3.质粒
除了使用pFRT或pVAX1系列的表达质粒作为载体递送这些插入片段，VEEV复制子RNA样品具有与HVT和RP实验中使用的基本相同的HA茎编码插入片段。
在LB培养基中扩增含有pFRT或pVAX质粒的转化的大肠杆菌K12。使用EndoFreeTM质粒试剂盒(QIAGEN)进行质粒DNA分离。质粒DNA在注射用水或TE缓冲液中洗脱。
实施例2：在SPF和MDA+鸡中的疫苗接种-攻击实验
2.1.引言
2.1.1.目标
目标是评价不同类型的流感疫苗在1日龄MDA+或SPF鸡中提供针对高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒实验性攻击感染的保护的能力。对于SPF鸡，在2周和3周p.v.进行攻击；对于MDA+鸡，在4或5周p.v.(p.v.)进行攻击，在有或没有预先存在的抗体的靶标中测定多个方面的疫苗效力和不同滴度。
作为测试流感疫苗效力的模型，最可靠的参数是靶标动物死亡率和攻击病毒复制和排泄的评分。这例如在2015年陆生动物诊断试验和疫苗的OIE手册第2.3.4章禽流感(OIEManual ofDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2015,chapter2.3.4.Avian Influenza)中有描述。
2.1.2.研究设计
对于该研究，使用n＝80(+n＝4备用)只1日龄健康MDA+和n＝55(+n＝4备用)只1日龄健康SPF蛋鸡，并在研究的第0天、第8天、第14天和第21天运输至合同研究组织(CRO)。SPF鸡对流感病毒的抗体(在许多其他抗体中)呈阴性。
对于本研究，使用n＝20只1日龄健康MDA+和n＝10只1日龄健康SPF蛋鸡进行第0、7、14和21天的血液取样，在研究的第0、第8、第14和第21天将其运送至CRO。
将鸡分配到10个组并在到达当天免疫，如表3所示。
在研究期间，将鸡圈养在两个动物房中，并且每个处理组(T01-T05，T06-T10)置于单独的围栏中。
在攻击当天，对鸡进行血清学取样(研究第35天)。用攻击病毒HPAI H5N1 A/turkey/Turkey/01/2005(进化枝2.2.1)接种所有鸡。攻击感染后的10天，每天至少两次监测鸡的临床疾病和死亡率，并且在攻击感染后(dpci)第1、2、3、5和7天每天一次收集后鼻孔拭子。在dpci 10，安乐死攻击感染后存活的所有鸡，结束研究。
研究在D45结束。
表3：分组分配和动物处理
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2.2.材料和方法
2.2.1.测试品
HVT疫苗以感染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)的悬浮液形式使用。将材料储存在液氮中直至使用，然后在商业HVT稀释缓冲液Solvent CATM(MSD Animal Health)中稀释，然后保持在环境温度下，并在1小时内使用。
HVT疫苗以2000PFU/动物剂量0.2ml使用，在研究第0、8、14或21天颈部皮下(sc)施用。每个处理组使用一个注射器和针头。
测试品：HVT-全H5 HA基因插入片段的载体疫苗
所用的HVT载体构建体含有驱动全H5 HA基因的伪狂犬病病毒gB基因启动子，和驱动NDV F基因的人CMV立即早期基因1启动子，其中PRV gB启动子+HA基因插入片段如WO2012/052384所述，和hCMV IE1启动子+F基因插入片段如WO 2016/102647中所述。将这些启动子+基因插入片段各自尾-头插入HVT基因组的Us2基因座中。双盒包括来自hCMV-IE1基因的下游转录终止子。
测试品：HVT-H5 HA茎的载体疫苗
用于递送和表达H5 HA茎多肽的HVT载体基本上是如WO2012/052384中所述的构建体，并且含有驱动H5 HA茎多肽的伪狂犬病病毒gB基因启动子，由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码，并且插入HVT基因组的Us2基因座中，并且之后是转录终止子。
攻击病毒：HPAI H5N1株A/turkey/Turkey/1/2005
将攻击病毒保持在-80℃，直到在0.2ml中稀释至约6Log10EID50(即5Log10TCID50当量)。将接种物保持在冰上直到使用，并且回滴定剩余的接种物以确定施用的实际攻击剂量。
攻击病毒以0.1ml鼻内(一个鼻孔)和0.1ml气管内施用。
NB：使用强毒流感病毒的工作需要适当的许可和生物安全预防措施。
2.2.2.试验动物
在本研究中使用135只1日龄混合性别的白色来亨蛋鸡(White leghom layerchickens)，其中仅将健康动物运送至CRO。如果鸡在到达后看起来健康状况不佳，则将其从该研究中排除(在研究第0天)。在疫苗接种之前，当它们到达时，在颈部用swifttack标签标记鸡，如表3所示编号。MDA+：研究中n＝80；n＝20用于T＝0和T＝7采血，和n＝4备用；SPF：研究中n＝55，n＝10用于T＝14和T＝21采血，n＝4备用。
MDA+鸡是用由HPAI H5N1 A/turkey/Turkey/01/2005(进化枝2.2.1)制备的灭活和佐剂化AIV疫苗接种的SPF蛋鸡的后代。因此，MDA与编码的H5 HA茎多肽同源，产生最坏的情况。
1日龄的鸡在到达当天免疫。来自T01、T05和T08组的未接种鸡分别具有14、28和35天的适应期。
将鸡在适当条件下分组饲养，每个处理组(最大n＝15)置于具有封闭壁的单独围栏中以防止物理接触。
2.2.3.实验步骤
由生物技术员每天至少观察和记录一次一般健康情况，并在需要时致电兽医。
从攻击病毒接种当天直到接种后10天，由动物技术员每天进行流感体征的临床观察并记录。第一次观察在接种前进行。根据评分系统进行临床观察，评分为0-3，随以下体征的严重程度增加：抑郁、流涕、打喷嚏、呼吸不畅(breathing)、皮肤异常、水肿、神经症状和腹泻。
在研究的第20天从所有鸡的翅静脉收集用于血清学的血样(每只动物约2mL)。凝血和离心(10分钟，1300x g)后分离血清。血清样品储存在-20℃。
在第36、37、38、40和42天从所有鸡收集后鼻孔拭子样品。使用棉签(干燥的人造丝头，Copan 155C)收集样品。取样后，将拭子在约2mL补充有抗生素的胰蛋白磷酸盐缓冲液中搅动，并在运送至实验室期间保持在融化的冰上。未对发现死亡的鸡取样，但在安乐死之前对垂死的鸡取样。在实验室中，将拭子挤压并取出，将样品离心(10分钟，1300x g)并且将上清液储存在-80℃下。
当鸡在第一次观察中表现出抑郁、呼吸窘迫或神经障碍的严重症状(评分3)或在第二次观察中表现出抑郁、呼吸窘迫或神经障碍的中度症状(评分2)时，根据对实验动物人道终点临床体征的识别、评估和使用标准对其实施安乐死。
在活体阶段完成后，基于动物和研究日对流感体征临床观察结果进行总结。基于处理组，计算中位临床评分并随时间以图形显示。此外，计算严重程度评分的频率(天数)、总和和分布。
使用与疫苗抗原和攻击抗原同源的HA抗原对血清样品进行血凝抑制(HI)测定。此外，对样品进行特异性AIV-H5 HA抑制ELISA(IDInfluenza H5 AntibodyCompetition(IDVet))。基于动物和研究日对血清样品的HI滴度和ELISA评分进行总结。计算每个处理组的平均滴度。/>
使用后鼻孔拭子样品进行流感实时qPCR。基于动物和研究日总结Ct值。基于处理组，计算平均Ct值并随时间以图形显示。另外，计算平均Ct峰值和PCR结果为阳性的天数。
当下列情况发生时，测试被发现是有效的：取自一日龄SPF幼雏和未接种的SPF幼雏的血清样品不含有针对AIV-H5的抗体。以及，未接种疫苗的受攻击鸡需要在攻击后10天内死亡。
2.3.结果
在实验期间但是在攻击之前，有几只鸡死亡。原因无法确定或与试验无关。
2.3.1.攻击
为了确定攻击剂量，对未稀释的攻击病毒、攻击前稀释的病毒和攻击后从动物设施中回收的稀释的攻击病毒进行TCID50测定。使用稀释后(给药前和给药后)的滴度平均值计算接种剂量，其测定为：10^3.95TCID50/动物。
攻击后，监测死亡率和发病率10天。所有未免疫的SPF鸡在攻击前或攻击后第2天死亡或不得不被安乐死，因此，HPAI H5N1的攻击是严重的和非常有效的。未免疫的AIV MDA+动物在孵化后4周的攻击导致70％的死亡率，这表明残留的MDA滴度仍然导致受攻击动物获得部分保护。相反，在孵化后5周MDA滴度不再是保护性的。
2.3.2.接种对存活的影响
在SPF动物中，HVT-全H5 HA疫苗接种在2周和3周p.v.在攻击动物中产生100％存活。因此，HVT-全H5 HA疫苗在SPF动物中的免疫起效(OOI)<2周。HVT-H5 HA茎疫苗在SPF动物中的效力仅在3周p.v.测定，因为其起效稍晚。HVT-H5 HA茎疫苗导致60％的部分保护，因此其在SPF动物中的免疫起效>3周。
然而，与SPF动物中的结果相反，在AIV MDA+动物中，HVT-全H5 HA在4和5周时分别仅产生43％和46％的保护。令人惊讶的是，HVT-H5 HA茎疫苗在AIV MDA+动物中产生86％和93％的保护。
2.3.3.攻击病毒复制
在攻击后第1、2、3、5和7天，从未免疫鸡(n＝5)和免疫鸡(n＝10)中取后鼻孔拭子，并通过测量气管中的AIV RNA载量用于确定攻击病毒复制。RT-qPCR结果表示为PCR当量病毒滴度(EID50当量)，包括标准偏差(SD)。未免疫的SPF鸡在攻击后第1天在气管中具有高病毒复制载量(平均10^4.3EID50当量)。在未免疫的AIV MDA+鸡中，孵化后4和5周的滴度分别为10^3.2和10^3.8EID50当量。
用HVT-全H5 HA接种的SPF动物中攻击病毒的滴度在2周p.v.降低2Log10，并且在3周p.v.时降低>4Log10。用HVT-H5 HA茎疫苗接种SPF动物仅导致攻击病毒复制降低1Log10。
尽管对AIV MDA+动物接种疫苗对存活具有强影响，特别是对于HVT-H5 HA茎疫苗，但对气管中的攻击病毒复制仅有微小影响。用HVT-全H5 HA接种AIV MDA+动物也仅具有较小的效果，病毒载量的减少小于1Log10。HVT-H5 HA茎疫苗导致攻击病毒复制减少1-2Log10，两者均在4周和5周p.v.。
2.3.4.血清学结果
2.3.4.1.血凝抑制(HI)滴度
来自攻击前分离的血液的血清用于使用HA抗原的HI测定。一式两份测定HI滴度。如所预期的，HVT-H5 HA茎疫苗不诱导导致血凝抑制的抗体，因为仅针对头部结构域的抗体会抑制血凝。
所有SPF孵化配对动物(hatch mate)(对照，T＝0)在2周p.v.均为阴性，与未免疫的SPF动物相同。HVT-全H5 HA接种导致14只动物中有12只在2周p.v.血清转化，平均HI滴度为10.2。在三周p.v.，HVT-全H5 HA导致14只动物中有13只血清转化，平均HI滴度为52.8。
所有AIV MDA+孵化配对动物(对照，T＝0)在HI试验中呈阳性，平均滴度为46.9。在孵化后4周和5周，滴度降至<2的值(对照)。令人惊讶地，在接种后的MDA+鸡中，HVT-全H5 HA未能在4周和5周p.v.诱导任何血清转化。
2.3.4.2.AIV-H5特异性ELISA
根据制造商的说明书使用商业抑制ELISA测试试剂盒(AIV-H5ELISA，IDVet)来测试在实验期间从鸡获得的血清样品。
来自接种前采集的SPF孵化配对动物的血清显示0％的抑制滴度。未免疫的SPF动物(阴性对照)也显示出7％的抑制，其在背景水平。
用HVT-全H5 HA疫苗接种后SPF动物中的ELISA滴度从2-3周p.v.缓慢增加：从2周时的35％的抑制滴度到3周p.v.的57％。
与在SPF动物中诱导的这些相对高的抗体滴度相反，用HVT-全H5 HA疫苗接种MDA+动物在4周仅导致32％的抑制，在5周p.v.仅导致22％的抑制。这些H5抗体滴度与在未免疫的MDA+动物中观察到的抑制性抗-H5滴度相当。因此，HVT-全HA H5疫苗被接种时存在的MDA滴度严重抑制。
用HVT-H5 HA茎疫苗接种SPF动物在3周p.v.产生33％的抑制滴度。因此，与SPF鸡中的全HA载体疫苗相比，HVT-H5 HA茎疫苗在SPF动物中诱导相对较低的滴度。
然而，令人惊讶地发现，用HVT-H5 HA茎疫苗接种的MDA+动物在4周时具有41％的抑制性Elisa滴度，并且在5周p.v.具有44％的抑制性Elisa滴度。因此，与HVT-H5 HA茎接种的SPF动物相比，这些滴度在3周p.v.更高并且与未接种的MDA+对照相比高得多。因此，HVT-H5 HA茎疫苗不受接种时存在的AIV-H5 MDA滴度的影响。
2.4.结论
在1日龄SPF和AIV MDA+鸡中评价HVT-全H5 HA和HVT-H5HA茎疫苗。SPF动物在2周和3周p.v.接受同源H5N1攻击，AIV MDA+动物在4和5周p.v.接受攻击。评估气管中的血清学反应、死亡率和攻击病毒复制。
在SPF动物中，HVT-全H5 HA接种导致OOI小于2周，具有100％的保护作用。在2周p.v.，攻击病毒滴度降低2Log10，以及3周p.v.时降低>4Log10。在2周和3周p.v.，100％保护与高HI滴度和H5 ELISA滴度良好相关。令人惊讶的是，一些鸡的HI滴度<2，但它们仍受到HPAI H5N1攻击的保护。因此，HI滴度不总是与保护相关。
与HVT-全H5 HA疫苗相比，HVT-H5 HA茎疫苗在SPF鸡中表现较差。在3周p.v.只有60％的鸡受到保护。此外，气管中攻击病毒复制的减少仅减少1Log10。
与HVT-全H5 HA疫苗在SPF动物中的良好保护形成强烈对比，该疫苗在AIV MDA+动物中表现非常差，在4周和5周p.v.分别仅43％和46％的保护。较差的保护还与较差的血清学应答和对气管中攻击病毒复制的边缘效应相关。显然，高AIV H5 MDA水平严重阻碍了HVT-全H5 HA疫苗。
有趣的是，尽管HVT-H5 HA茎疫苗在SPF动物中表现不佳，但疫苗在AIV MDA+动物中在4周和5周p.v.分别引起86％和93％的保护。此外，与HVT-全H5 HA疫苗相比，HVT-H5 HA茎疫苗更有效地降低气管中的病毒滴度。在HVT-H5 HA茎疫苗接种的鸡中，有效的保护也与攻击当天较高的抗体滴度相关。
总之，HVT-全H5 HA疫苗在SPF动物中具有<2周的免疫起效时间(OOI)，但被MDA滴度强烈削弱。HVT-H5 HA茎疫苗在SPF动物中具有>3周的OOI，但在流感MDA的情况下在4周和5周时引起高水平的保护。因此，用本发明HA茎多肽形式的抗原接种不受预先存在的流感抗体的影响。
实施例3：在没有预先存在的抗体的鸡中的测试
上述实施例2中描述的实验成功地进行了本发明人在SPF鸡中进行的初始实验，并且得到了一些部分令人失望的结果。在与上述实施例2所述相同的一般设置和性能的实验中，使用异源AIV H5N1毒株测试不同HA茎多肽在3周p.v.针对严重流感病毒攻击感染的保护效力。作为初始实验，这在没有预先存在的流感抗体的靶标动物中进行，即在SPF鸡中进行。所测试的不同类型的HA茎多肽疫苗是：纯化的亚单位、两种类型的HVT载体疫苗和RP疫苗。
3.1.材料和方法
具体地，如下制备疫苗：
-亚单位疫苗含有与SEQ ID NO:7相同的氨基酸组成的H5 HA茎多肽，但仅有最高272个氨基酸，因此它不含有HA2的TM和胞质结构域。为了纯化的目的，它含有C-末端Flag-标记/EK-切割位点，随后是三重Strep-标记。该亚基在HEK293T细胞中表达、纯化、并用标准液体石蜡矿物油佐剂化，配制成油包水乳液。亚单位以4μg/动物剂量施用。
-HVT载体疫苗包含SEQ ID NO:7的H5 HA茎多肽，或含有完整的H5 HA蛋白。
-RP是包含SEQ ID NO:7的H5 HA茎多肽的基于VEEV的RP。基本上如所述制备和纯化RP。以1×10^8RP/动物剂量在水性缓冲液中施用RP，并用XSolveTM佐剂(MSD AnimalHealth)以1：1佐剂化为O/W乳液。
本发明人的目的之一是证实HA茎多肽的保护性质，如WO2013/079473和Impagliazzo的相应论文(同上)中所述。然而，这给出了出乎意料的不良结果。
与实施例2一样，在日龄时通过sc途径用0.2ml HVT-全H5 HA、HVT-H5 HA茎、VEEV-H5 HA茎RP或佐剂化HA茎亚单位疫苗接种鸡。一组5只鸡保持未处理，一组10只鸡作为未接种的攻击对照。在T＝0(接种当天)和T＝20(攻击前一天)采集血清样品并用于HI测试和H5特异性ELISA测定。在T＝21时，用致死剂量的HPAI AIV毒株：A/duck/Biddinghuizen/NL/2016(H5N8，进化枝2.3.4.4)攻击动物，发病率和死亡率追踪10天。为了测定攻击病毒的复制，取气管拭子并使用流感病毒M-基因特异性RT-qPCR测定进行分析。
3.2.结果
结果显示所有对照均符合预期：所有未接种的攻击鸡在攻击后第2天死亡或垂死，阴性对照在HI和ELISA中呈血清阴性。此外，用全HA蛋白接种的所有鸡显示强HI滴度，并且所有接种的鸡显示高于背景值的ELISA滴度，表明所有疫苗已被适当施用。
攻击后10天接种组的攻击存活结果为：
-HVT-全H5 HA：100％
-HVT-H5 HA茎：70％
-VEEV-H5 HA茎RP：80％
-H5 HA茎可溶亚基：0％
HVT-全H5 HA疫苗在接种3周后诱导强烈的血清转化。强血清学与该疫苗在SPF鸡中对抗同源和异源攻击的100％保护密切相关。有趣的是，全HA蛋白在血清反应阴性的动物中作为疫苗作用非常好；当应用于具有预先存在的流感抗体的动物时，与实施例2中发现的结果对比鲜明。
令人惊讶的是，HA茎亚单位疫苗不能保护鸡免受HPAI攻击；虽然死亡率有一定程度的延迟，但该组中的所有鸡到p.c.第4天死亡或濒死。该结果与公开的阳性报告形成鲜明对比。
然而，当HA茎多肽具有TM结构域时，当通过病毒载体递送时和当作为RP递送时都存在显著水平的保护。
所用的H5N8攻击菌株与疫苗是异源的，它具有91.7％的氨基酸序列同一性。
3.2.1.血清学
根据制造商的说明书使用商业抑制ELISA测试试剂盒(AIV-H5ELISA，IDVet)来测试在实验期间从鸡收集的血清。
来自接种前SPF动物(孵化配对动物)的血清仅显示4％抑制，其在背景水平内，同样适用于p.v.第3周未接种对照的滴度，其仅显示2％抑制，表明在SPF鸡中完全不存在抗H5HA抗体。
在用HVT-全H5 HA疫苗接种SPF动物后，在p.v.第3周发现58％的抑制滴度。这与实施例2中给出的结果非常相关。
类似地，用表达本发明的HA茎多肽的载体疫苗接种SPF鸡，导致HVT-H5 HA茎疫苗的抑制滴度为32％，VEEV-H5 HA茎RP疫苗的抑制滴度为28％。这两个结果与实施例2中的结果相匹配。
最后，用可溶性HA茎抗原作为亚单位疫苗接种鸡，在ELISA中仅诱导9％抑制的滴度。
这些ELISA滴度与本实验中发现的攻击-存活结果匹配良好。而且，它们表明，与基于可溶性HA茎抗原的亚单位疫苗相比，本发明的HA茎多肽作为膜相关抗原(因此具有TM结构域)和通过重组载体疫苗的表达诱导更有效的免疫应答。
实施例4：攻击保护的扩展测试
4.1.引言
在如上述实施例2和3的进一步实验中，在有和没有预先存在的流感抗体的鸡中再次测试针对HPAI H5N1 AIV攻击病毒的保护。然而，为了确定疫苗在更“像野外的”条件下的效力，使用接触攻击模型，其中接种的动物被攻击感染并与接种的未受攻击的岗哨动物(sentinel animal)一起圈养。作为对照，未接种过疫苗的动物也被攻击，并与未接种过疫苗的未受攻击的岗哨动物一起饲养。通过气管拭子测量攻击病毒复制，并通过泄殖腔拭子测试攻击病毒脱落。
在一日龄的鸡中评价HVT-全H5 HA和HVT-H5 HA茎疫苗，所述鸡是SPF或AIV H5HAMDA+(接种SPF的后代，如上所述)。一半接种或未接种的对照SPF动物用H5N1攻击病毒进行p.v.攻击5周。一半的AIV MDA+接种或未接种的动物经受类似的攻击，但在6周p.v.。攻击后8小时，将岗哨鸟类加入到直接攻击的动物组中。评价血清学应答、死亡率和攻击病毒在气管中的复制以及病毒在泄殖腔中的脱落。
发现与实施例1和2中所述相似的保护水平，根据本发明使用的疫苗也能很好地减少攻击病毒的传播。
4.2.设置
在实验开始前从5只SPF和10只MDA+鸡孵化配对动物中取对照血样，以确定第0天的抗体状态。除对照外，SPF和MDA+组都有76只鸡，这些鸡又分成不同处理的单独组：未接种/全HA/HA茎疫苗；攻击/无攻击；和岗哨/测试动物。在最低水平，每个试验组有6只鸡。在第1天通过sc途径将疫苗以约2000PFU/剂量(0.2ml)给予预定组。就在攻击前，在第35天(SPF)和第42天(MDA+)，从各动物取血样用于HI测试。攻击病毒为HPAI H5N1A/turkey/Turkey/01/05(进化枝2.2.1)；确定给予的攻击剂量分别为10^3.6TCID50/动物。直到攻击后8小时才将受攻击的动物与岗哨组合。在第1、2、3、4、6和8天p.c.从受攻击的鸡收集泄殖腔拭子样品。使用棉签(干燥的人造丝头，Copan 155C)收集样品。取样后，直接将拭子在约2mL补充有抗生素的胰蛋白磷酸盐缓冲液中搅动，并在运送至实验室期间保持在融化的冰上。在攻击后2周，分别在第49天和第56天结束实验。
4.3.结果
4.3.1.死亡率
结果再次显示所有对照均符合预期：所有未接种的受攻击鸡在攻击后第2天死亡或垂死，阴性对照在HI和ELISA中呈血清阴性。未接种的受攻击的MDA+鸡在攻击后第3天至第6天死亡或不得不被安乐死，平均死亡时间为4.3天。因此MDA-水平确实引起一些保护，但不足以在致死攻击中存活。所有全HA蛋白接种的鸡都显示出强的HI滴度，并且所有接种的鸡都显示高于背景值的ELISA滴度，表明所有疫苗已经被适当地施用。
所有未接种并与受攻击动物接触的SPF岗哨动物从攻击后第3天至第7天死亡或必须被安乐死。同样，与受攻击动物接触的所有未接种的MDA+岗哨动物从攻击后第6天至第11天死亡或不得不被安乐死。因此，H5N1 TT05病毒从受攻击动物到岗哨动物的传播是非常有力的。
试验组结果：
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在SPF动物中，在p.v.第5周，HVT-全H5 HA疫苗接种导致受攻击动物产生100％保护。该结果证实并完全符合先前试验中的结果。
然而，同样地，在MDA+动物中在6周p.v.攻击，HVT-全H5 HA疫苗仅可保护22％的动物免于死亡。这甚至更糟，因为在实施例2中在4周和5周p.v.测量到43％和46％的保护。
由HVT-H5 HA茎疫苗提供的抵抗严重攻击的保护是非常有效的，在6周p.v.给出83％的存活率。这些结果表明包含根据本发明的HA茎多肽的疫苗不受高水平的预先存在的流感HA抗体的阻碍。
4.3.2.减少攻击病毒传播
攻击病毒有效地从未接种的SPF和MDA+动物传播到未接种的岗哨SPF和MDA+动物。用HVT-全H5 HA疫苗接种SPF动物将攻击病毒的传播降低至不可检测的水平。相反，用HVT-全H5 HA疫苗接种MDA+动物仅在一定程度上降低了传播，但不能防止攻击岗哨动物的传播，结果导致甚至死亡。
HVT-H5 HA茎疫苗能够保护大多数SPF和MDA+鸡免于攻击死亡。此外，在SPF和MDA+动物中，攻击病毒的传播被完全阻断。因此，根据本发明的HA茎多肽在具有预先存在的流感抗体的群体中的应用将保护大多数靶标免于临床疾病，并完全切断病毒传播。
在接种动物和岗哨动物中病毒复制的结果显示相似的模式，HVT-全H5 HA疫苗在SPF中有效，但在MDA+动物中无效，HVT-H5HA茎疫苗的结果相反。
4.3.3.血清学
在第0天MDA+孵化配对动物中的HI滴度为159，其显著高于实施例2中描述的实验中的那些。
根据制造商的说明书使用商业抑制ELISA测试试剂盒(AIV-H5ELISA，IDVet)来测试在实验期间从鸡获得的血清样品。
来自接种前SPF动物的血清(孵化配对动物)显示5％的抑制，未接种的SPF动物(阴性对照)显示6％的抑制，两者均在背景水平。
用HVT-全H5 HA疫苗接种SPF动物在p.v.第5周产生82％的抑制滴度。与SPF动物中的这些高抗体滴度相反，用HVT-全H5 HA疫苗接种的AIV-H5 MDA+动物在6周p.v.产生的血清仅具有38％抑制。这些H5抗体滴度仅略高于在未接种的MDA+动物中观察到的26％，这表明HVT-全H5 HA疫苗受到在接种当天预先存在的AIV-H5抗体滴度的严重阻碍。
用HVT-H5 HA茎疫苗接种SPF动物导致在p.v.第5周48％的抑制滴度。令人惊讶地，用HVT-H5 HA茎疫苗接种AIV-H5MDA+动物在6周p.v.产生具有53％抑制的血清。与HVT-H5HA茎疫苗SPF动物相比，这些H5抗体滴度在5周p.v.时更高，并且与未接种MDA+动物相比高得多。因此，HVT-H5 HA茎疫苗在接种时不受预先存在的H5抗体的影响。
4.4.结论
在1日龄SPF-和AIV MDA+鸡中评价HVT-全H5 HA和HVT-H5 HA茎疫苗。一半接种或未接种对照SPF动物在5周p.v.用HPAI H5N1病毒攻击。一半接种或未接种的AIV MDA+动物在6周p.v.进行攻击感染。攻击后8小时，将另一半动物加入组中，以确定从直接攻击的动物到岗哨动物的攻击病毒传播。评价血清学应答、死亡率和攻击病毒在气管中的复制以及病毒在泄殖腔中的脱落。
SPF动物的HVT-全H5 HA接种导致97％的动物血清转化和100％的对抗攻击的保护。口腔中的攻击病毒复制强烈减少2-3Log10。病毒RNA的脱落也强烈地减少到几乎不可检测的水平。基于RT-qPCR结果，从直接攻击的禽类到岗哨禽类的传播减少了89％，但所有岗哨禽类都受到保护免于临床疾病。
HVT-全H5 HA接种AIV H5 MDA+动物6周p.v.没有诱导可检测的HI滴度。较差的血清转化与攻击后22％的较差保护相关。口腔中的攻击病毒复制仅减少约1Log10，尽管从泄殖腔中脱落的病毒RNA显著减少。然而，这种降低不能阻止直接攻击岗哨动物的传播，基于RT-qPCR结果，传播速率的降低仅为56％。
SPF动物的HVT-H5 HA茎接种将口腔中的攻击病毒复制减少了2Log10，这仅比HVT-全H5 HA疫苗的效率略低。这与致死攻击的72％的轻微降低的保护相关。来自受攻击动物的泄殖腔的病毒RNA的脱落强烈减少约3Log10，因此基于RT-qPCR结果，从直接受攻击的鸟类到岗哨鸟类的传播减少72％。
HVT-H5 HA茎接种AIV H5 MDA+动物6周p.v.导致83％的保护，而在用HVT-全H5 HA疫苗接种后仅22％的鸟受到保护。此外，基于RT-qPCR结果，HVT-H5 HA茎接种AIV H5 MDA+动物将传播降低89％。
综上所述：HVT-全H5 HA疫苗在保护SPF鸡致死性H5N1攻击方面非常有效，同时有效地阻断传播。然而，在AIV MDA+动物中，HVT-全H5 HA疫苗的保护仅为22％，并且在直接攻击和岗哨动物之间也可持续传播，死亡率为22％。这表明HVT-全H5 HA疫苗受到AIV H5 MDA滴度的强烈影响。如之前观察到的，HVT-H5 HA茎疫苗在SPF动物中引起中等保护水平。然而，在AIV H5 MDA+动物中，HVT-H5 HA茎疫苗导致83％的保护并非常有效地阻断向岗哨动物的传播。因此，基于根据本发明的HA茎多肽的疫苗似乎不受预先存在的流感HA抗体的影响，因此，当应用于MDA+靶标时，该抗原可以是填补基于全HA蛋白的疫苗的免疫空白的解决方案。
实施例5：HA茎-组合疫苗的试验
在随后的实验中，测试之一是用本发明的HA茎-多肽和全HA蛋白的组合接种是否可以改善由单独接种提供的免疫保护。使用AIV H5 HA MDA+鸡，实验设置基本上如以上实施例2-4中所述。
在颈中通过s.c.途径施用2000pfu/剂量HVT-全H5 HA(0.2ml)，和在腿上通过i.m.注射施用具有XSolve的O/W乳剂中1×10^8/剂量VEEV RP的H5 HA茎多肽(0.2ml)，来施行组合疫苗。每种疫苗基本上如上面实施例3所描述的。一组40只AIV H5 HA MDA+蛋鸡在1日龄接受组合接种。一组25只鸡用作未接种的MDA+对照。在实验期间的不同时间采集血样，直至接种后8周。
5.1.血清学，通过ELISA
在整个实验中，使用市售抑制ELISA测试试剂盒(AIV-H5ELISA，IDVet)测试从鸡获得的血清样品。
来自MDA+孵化配对动物的血清显示高H5抗体滴度，平均抑制为89％。这些MDA滴度在未免疫动物中在6周和7-8周分别降低至22％和8％。
组合疫苗在MDA+动物中诱导非常高的抗H5 HA抗体滴度，在所有鸡中和在6、7和8周p.v.测试的所有时间点评分>65％抑制。这种高水平的抗体与对甚至异源H5株流感病毒感染的100％保护相关。
在接种AIV H5 HA MDA+动物后如此高水平的H5抗体滴度本发明人之前没有获得过；使用HA茎多肽疫苗未获得过，当然使用HVT-全H5 HA疫苗也未获得过。
实施例6：猪中的试验
6.1.SIV H1 RP疫苗在MDA-和MDA+仔猪中的效力。
为了测试MDA对猪中全长HA的影响，将表达猪流感病毒(SIV)H1 HA蛋白的RP疫苗施用于MDA阴性和H1 SIV阳性的幼猪。
为了产生MDA+仔猪，SIV血清阴性的高健康母猪在妊娠期间接种两次SIV大流行H1N1病毒的γ射线灭活疫苗：A/swine/Minnesota/A01483170/2014，所述病毒用XSolve佐剂配制成O/W乳剂。母猪疫苗具有10^6TCID50当量/ml。
出生后两周，从经接种的母猪的所有健康仔猪取血。使用标准HI方案测定SIV MDA滴度。基于这些结果，形成10只仔猪的混合组，其具有相同的组平均MDA滴度：6.6Log2 HI，并且个体MDA滴度在4和8Log2 HI之间等分。
两组仔猪，一组MDA-，一组MDA+，接受PBS模拟疫苗。另外两组，一组MDA-和一组MDA+接受表达SIV毒株(A/swine/England/10/2010(H1N1))(GenBank：AFR75956))的全长H1 HA蛋白的VEEV-RP疫苗；其具有97.5％的氨基酸序列同一性。将RP与XSolve佐剂一起配制成O/W乳剂。
仔猪接种两次：在5周龄(实验第1天)进行初免接种，在8周龄(实验第21天)进行加强接种。RP疫苗以5x10^6个颗粒/动物剂量施用，以1ml在颈部肌肉内给药。
在实验过程中的若干次，采集血样用于血清分离。HI滴度测定的结果如图1中所示。
未接种的MDA-对照动物在整个实验中保持HI阴性。在未接种的MDA+对照动物中，MDA滴度从约6.6Log2 HI(14日龄)下降到背景水平(约65日龄)，并保持到实验结束(T＝56)。
在接种的仔猪中，MDA-动物在初免接种后HI滴度增加很少，但在加强接种后HI滴度有非常强的增加。加强免疫后9天达到的组平均滴度为10.2Log2 HI。另一方面，在MDA+仔猪中，HI滴度最初在初免免疫接种后略微下降，而在加强免疫后确实增加，但仅增加到6.8的组平均滴度，与在MDA-猪中达到的滴度相比低得多。
这表明，如在鸡中一样，在猪中，在接种时预先存在的抗HA头部抗体的存在也严重阻碍了用全HA蛋白接种的效力。
6.2.使用H1-HA茎多肽的实验
为了证实用根据本发明的HA茎多肽接种可以克服预先存在的HA抗体的作用，并且为了比较用于递送和表达的不同平台，准备在猪中进行进一步的接种-攻击实验。用H1 HA茎多肽和全H1 HA接种MDA-和MDA+仔猪，并用活H1 SIV攻击。疫苗将是DNA质粒表达的VEEV复制子RNA和VEEV RP，具有油性佐剂。
按照第6.1节所述制备SIV H1 MDA+仔猪并分组。MDA-和MDA+猪都将接受两次疫苗接种：在5和8周龄时。主要测试疫苗将是：pVAX质粒递送全H1 HA或如SEQ ID NO:4所述的H1HA茎多肽的VEEV复制子RNA。对照将是全H1 HA的RP疫苗，如上文6.1节所述，预期其在MDA+靶标中表现不佳。
RP疫苗为5x10^6颗粒/动物剂量，质粒疫苗为50μg/动物剂量。两种疫苗类型都将与XSolve佐剂一起配制成O/W乳剂，并在颈部肌内给予2ml。
攻击感染将在约11周龄时给予。攻击病毒将是：A/Swine/Minnesota/A01483170/2014(H1N1pdm)，将以每只动物1x10^6TCID50在5ml PBS(10mM)中气管内给药，并将在BSL2水平应用必要的遏制措施。
为了监测攻击病毒的复制，在攻击前和攻击后3天从所有猪取鼻拭子。将观察感染的临床体征，如厌食、呼吸短促(呼吸困难)、发热、咳嗽和流涕。
攻击后3天，给所有动物镇静并放血，用于肺损伤的尸检研究。在宏观评分后，取肺组织样本进行攻击病毒定量。
实施例7：宿主细胞中的表达的试验
为了研究HA茎多肽在宿主细胞中的表达，使用不同形式进行一系列实验以将本发明的多肽递送至宿主细胞。应用不同的染色技术显现这些表达的类型和位置。
7.1.Hela细胞
在一种方法中，用HA茎表达质粒转染Hela R19细胞，简言之：将细胞接种在96孔板中并培养过夜以达到约80％融合。第二天，制备转染混合物，每孔为：0.1μg质粒DNA，0.3μl(Promega)(非脂质)转染试剂和4.6μl/>培养基(ThermoFisher)，将其在室温下孵育15分钟。然后将其加入到DMEM+10％v/v血清(但无抗生素)中的细胞中，并孵育过夜。24小时后，用含1％甲醇的3.7％甲醛固定细胞。这种类型的固定确保细胞-膜仍然是完整的，因此观察到的任何信号必须是在细胞表面表达的。在标准IFT方案下，细胞用FI6(人抗HA茎)抗体和次级山羊抗人IgG Alexa 488抗体(Molecularprobes，Thermofisher)染色。
结果显示H1 HA茎多肽和H9 HA茎多肽在HeLa细胞的细胞表面均可清楚地检测到，而模拟转染的细胞保持阴性。这表明HA茎多肽正确表达，并展示在用本发明载体转染的宿主细胞的表面上。
7.2.Vero和CHO细胞
在类似的一系列实验中，用表达本发明的H1 HA茎多肽或H9HA茎多肽的质粒转染Vero Ames细胞和CHO-K1细胞。转染和孵育后，将细胞用4％甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定并在室温下孵育15分钟。这种类型的固定确保细胞仍然是完整的，因此任何观察到的信号必须是暴露于细胞表面的。一些细胞另外用含有0.1％Triton-X100的PBS处理，其透化细胞以允许抗原的细胞内和细胞外染色。接下来，使用FI6作为一抗进行IFT测定。
结果显示，虽然模拟转染的细胞保持阴性，但在Vero细胞和CHO细胞中H1 HA茎多肽和H9 HA茎多肽均表达良好。在透化的细胞中，在整个细胞中都观察到染色；同样在没有透化作用的情况下，可以通过FI6抗体清楚地检测多肽。这证明了这些多肽在CHO和Vero宿主细胞中的有效表达。此外，这表明H1 HA茎多肽和H9HA茎多肽也在这些类型的宿主细胞中的细胞表面上呈递。
在随后的实验中，用表达本发明的H1 HA茎多肽、H5 HA茎多肽和H9 HA茎多肽的质粒或用表达H1、H5或H9的全HA蛋白的质粒转染Vero细胞。
转染和孵育后，将细胞用福尔马林/PBS固定以保持它们完整，并用FI6作为一抗在IFT测定中染色。
结果显示(虽然模拟细胞是阴性的)表达全HA蛋白或HA茎多肽的Vero细胞在细胞表面都显示清楚的染色。因此，本发明的H1 HA茎多肽、H5 HA茎多肽和H9 HA茎多肽以与全HA蛋白相同的方式展示在细胞表面。
实施例8：用H9 HA茎多肽进行的测试
为了测试流感病毒的其他变体，并证明可以使用不同的载体类型，准备用H9 HA进行实验：将在SPF和H9 MDA+鸡中测试全HA蛋白和HA茎多肽(作为质粒递送的复制子RNA分子和作为RP两者)。质粒递送的复制子RNA和RP将提供SEQ ID NO:12的H9HA茎多肽的表达，其是最近的H9 AIV分离株的共有序列，并且含有如本文描述的修饰：头部结构域缺失，被4xG接头取代，并含有三聚结构域、TM结构域和胞质结构域。将编码核苷酸(SEQ ID NO:11)针对鸡的转录谱进行密码子优化，并应用多个稳定突变。
通过用灭活的H9N2 AIV疫苗接种SPF亲本产生H9 MDA+鸡，其中H9氨基酸序列与H9HA茎多肽具有97％同一性，从而提供接近同源的MDA。接种将在1日龄时进行。
在接种后4周对SPF鸡进行攻击，并在5周p.v.对MDA+动物进行攻击。攻击材料是LPAI株A/chicken/Egypt/V1527/2018(H9N2)的卵生尿囊液，其中H9 aa序列与所用H9 HA茎多肽具有94％同一性。这将以0.2ml，每只动物10^6EID50鼻内施用。
激发后第一周取拭子，激发后两周监测临床体征。
为了比较MDA对全长HA的作用，使用相似的质粒和RP疫苗，用相似序列的全长H9HA进行接种。此外，将HVT-H9 HA重组病毒载体皮下给予另一组鸡。该HVT载体含有插入HVT基因组UL44和UL45基因之间的HA基因，并由PRV gB启动子驱动。
复制子RNA疫苗将作为质粒给予，肌肉内给予10μg/动物剂量，0.2ml。一组将仅接受1μg/剂量以测试质粒剂量的作用。将质粒配制在聚丙烯酸聚合物纳米凝胶(20MedTherapeutics)中，浓度为2.5mg/ml，于20mM HEPES+5％海藻糖中。RP是VEEV RP并且将在水性缓冲液中以0.2ml佐剂化乳剂形式以每只动物10^8RP的剂量肌内施用。
在实验之前、整个实验期间和实验结束时，从选定的动物采集血样以监测初始和发展中的血清学状态。还将监测动物，并记录临床体征。由于攻击菌株仅为LPAI，预期无死亡或严重临床体征。
附图说明
图1：
用表达全H1 HA的RP疫苗接种的猪的随时间变化的HI滴度值(以Log2计)。在实验开始时，仔猪对于H1 HA为MDA-或MDA+。详细信息描述于实施例6.1中。
Claims (7)
1.一种用于减少靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的重组载体，所述重组载体能够在靶标中表达重组流感病毒血凝素(HA)茎多肽，所述靶标在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体，其特征在于：所述多肽包含无头部的流感病毒HA茎结构域、三聚结构域和跨膜结构域。
2.根据权利要求1所述使用的重组载体，其特征在于：表达的所述流感病毒HA茎多肽具有选自SEQ ID NO:4、6、8、10和12中的一个的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述使用的重组载体，其特征在于：
所述载体选自核酸、病毒和复制子颗粒(RP)。
4.根据权利要求3所述使用的重组载体，其特征在于：
-所述核酸是真核表达质粒或RNA分子；
-所述病毒选自疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、副粘病毒、弹状病毒和腺病毒；或
-所述RP是甲病毒RP。
5.一种用于减少在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1－4中任一项使用的重组载体或含有所述重组载体的宿主细胞，及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求1－4中任一项所述使用的重组载体、或包含所述重组载体的宿主细胞、和/或根据权利要求5所述使用的疫苗用于减少在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的用途。
7.用于减少在接种时具有针对流感病毒HA头部结构域的抗体的靶标中由流感病毒引起的感染或疾病的方法，所述方法包括向所述靶标施用根据权利要求1－4中任一项所述使用的重组载体、包含所述重组载体的宿主细胞、和/或根据权利要求5所述使用的疫苗。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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