CN111944837B - 一种表达covid-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法 - Google Patents

一种表达covid-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达COVID‑19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法，该方法以COVID‑19的SP1或RBD蛋白为免疫原，并融合树突状细胞诱导肽DCpep，利用食品级乳酸菌作为免疫抗原传递载体，最终构建表达COVID‑19抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗，本发明方法使用方便、安全，无应激反应。

Description

一种表达COVID-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫 苗的构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途，特别涉及一种表达COVID-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗、其构建方法以及在防治COVID-19肺炎中的用途。
背景技术
2019年12月份武汉地区爆发的“不明肺炎”由中国疾控联合专家组宣布是由新型冠状病毒引起的。2020年1月12日，上海公共卫生临床中心联同武汉中心医院、华中科技大学、武汉市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心、中国医学科学院、悉尼大学等多家研究机构联合公布了其中一个不明肺炎感染个案的基因排序，世界卫生组织（WHO）将此新型冠状病毒（CoV）命名为COVID-19。
在新冠肺炎疫情爆发之后没多久，中国科学院上海巴斯德研究所和武汉病毒研究所的科学家先后分别发现：新型冠状病毒和SARS病毒一样，也是通过利用S蛋白结合人体细胞表面的ACE2蛋白进入细胞的，只不过二者的S蛋白同源性比较低，只有76.47%。新冠病毒S蛋白结构如下：
上海巴斯德研究所的科学家通过计算机模型，评估了新型冠状病毒和SARS病毒的S蛋白与人类ACE2分子相互作用的能力。结果发现，虽然新型冠状病毒的S蛋白与ACE2之间的作用力低于SARS病毒，但是仍然非常强大。随着疫情的蔓延，新冠肺炎表现出的传染性明显强于SARS。中国团队基于更大规模的数据评估的R0值3.77，基本明确了新冠肺炎的传染性强于SARS。
由于目前没有针对COVID-19的特效抗病毒治疗药物和疫苗，所以将COVID-19的SP1蛋白或RBD蛋白作为抗原制备疫苗是非常可行的。
黏膜免疫系统是机体发挥免疫功能的重要部位，其重要性表现为：（1）人体黏膜表面积巨大，仅小肠黏膜表面积即达400m2，乃阻止病原微生物等入侵机体的主要屏障；（2）机体50%淋巴组织存在于黏膜系统，黏膜免疫系统内淋巴细胞占全身淋巴细胞总数的3/4。
乳酸菌是人和动物体内最常见的原著菌群，其参与维系肠道内菌群平衡，通过产生有机酸、细菌素等抗菌物质抑制肠道内有害菌的生长，同时形成菌膜屏障，阻断病毒与黏膜细胞的直接结合。肠道上皮细胞可免疫识别定植在肠道内的乳酸菌及其片段，从而调节肠道黏膜免疫系统，促进淋巴细胞分化、提高sIgA的分泌、调节细胞因子的产生等，对动物机体的固有免疫和获得性免疫具有重要的影响。
本发明根据COVID-19利用S蛋白与人细胞ACE-2蛋白结合侵染人细胞的特点，以COVID-19的SP1蛋白或RBD蛋白为免疫原，利用乳酸菌作为免疫抗原传递载体，从黏膜免疫角度设计疫苗以预防该病，对防控COVID-19肺炎具有重要意义，也是本发明主要解决的技术问题。树突状细胞（DCs）是抗原呈递作用最强的专职抗原呈递细胞，被认为是连接特异性免疫应答和非特异性免疫应答的桥梁，并且可决定机体特异性免疫应答的类型，在肠道黏膜稳态中扮演着极其重要的角色。DCs可以通过活化初始T淋巴细胞激活初始的免疫应答，进而与周围环境中的多种细胞因子相互作用影响肠道的免疫应答和免疫耐受。DCpep可以促进DCs的分化和成熟，成熟的DCs分泌细胞因子促使活化的Th细胞辅助B细胞产生抗体，辅助Tc细胞杀伤靶细胞，进而解除免疫抑制，还可以促进γ干扰素（IFN-γ）和白介素2/12（IL-2/12）的生成，显著提高黏膜免疫制剂的免疫效率。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种表达COVID-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法，该方法以COVID-19的SP1或RBD蛋白为免疫原，并融合树突状细胞诱导肽（DCpep），利用食品级乳酸菌作为免疫抗原传递载体，构建表达COVID-19抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种表达COVID-19抗原的表达载体，其特征在于：所述表达COVID-19抗原的表达载体是通过将COVID-19抗原SP1或RBD序列以及树突状细胞诱导肽DCpep基因连接到乳酸菌表达载体pNZ8148上得到的。
优选的，所述乳酸菌表达载体pNZ8148为食品级表达载体，该乳酸菌表达载体pNZ8148经改造具有翻译增强子序列和大肠杆菌转录终止子序列，其利用Nco I和Hind III对乳酸菌表达载体pNZ8148进行双酶切，与T7g10-PgsA-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建组成型乳酸菌分泌表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB，其中T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，PgsA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MCS为多克隆酶切位点，至少包括Spe I和Xba I酶切位点。
一种表达COVID-19抗原的表达载体的构建方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：通过基因合成，合成经过密码子优化的COVID-19抗原SP1-DCpep或RBD-DCpep基因序列，SP1-DCpep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，RBD-DCpep基因序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤S2：将基因SP1-DCpep或RBD-DCpep连接到pMD19-T载体上，得到的重组载体命名为pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep；
步骤S3：乳酸菌分泌型表达质粒pNZ-T7g10-PB的构建，在质粒pNZ8148的基础上进行改造，利用NcoI和HindIII对质粒pNZ8148进行双酶切，与T7g10-PgsA-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型乳酸菌分泌表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB，其中T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PgsA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，MCS为多克隆酶切位点，至少包括Spe I和Xba I酶切位点；
步骤S4：利用限制性核酸内切酶Spe I和Xba I对质粒pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep和乳酸菌表达质粒pNZ-T7g10-PB进行双酶切处理，经胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的SP1-DCpep或RBD-DCpep基因片段与表达载体pNZ-T7g10-PB目的片段连接，构建重组表达质粒即为表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白以及树突状细胞诱导肽的融合蛋白的表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB-SP1-DCpep或pNZ-T7g10-PB-RBD-DCpep，简称pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep。
一种基因工程乳酸菌口服疫苗，其特征在于：所述基因工程乳酸菌口服疫苗是通过将表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白及树突状细胞诱导肽DCpep的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌NZ9000中得到的。
优选的，所述乳酸菌NZ9000为食品级乳酸乳球菌。
一种基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法，其特征在于具体步骤为：首先制备乳酸菌感受态细胞NZ9000，经电转化技术将上述构建的重组表达质粒pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep转入乳酸菌感受态细胞NZ9000中，加入恢复培养基GM17，于30℃培养3-5h，离心，用液体GM17培养基重悬菌体，涂布在含有氯霉素的固体GM17培养基上，30℃培养48-72h，筛选重组乳酸菌转化子，用菌液PCR验证，获得阳性重组乳酸菌，即为表达COVID-19抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗。
本发明所述的基因工程乳酸菌口服疫苗在制备预防或治疗COVID-19肺炎药物中的用途。
一种COVID-19亚单位口服疫苗，其特征在于：所述COVID-19亚单位口服疫苗含有上述基因工程乳酸菌口服疫苗。
本发明以COVID-19的SP1或RBD蛋白为免疫原，利用乳酸菌，优选为食品级乳酸乳球菌NZ9000作为免疫抗原传递载体，构建了预防COVID-19肺炎的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗，对防控COVID-19肺炎具有重要意义。
附图说明
图1为pNZ-SP1-DCpep重组表达质粒酶切验证结果；
M：MarkerIII DNA；1：Xba I单酶切pNZ-SP1-DCpep重组表达质粒；2：Spe I和Xba I双酶切pNZ-SP1-DCpep重组表达质粒。
图2为阳性重组乳酸菌液PCR验证结果；
M：DL2000 DNA Marker；1、2：阳性重组乳酸菌。
图3为重组SP1-DCpep蛋白的SDS-PAGE验证结果；
M：Protein Marker；1：含有表达质粒pNZ-T7g10-PB的乳酸菌；2：重组菌pNZ-SP1-DCpep-NZ未诱导；3、4：重组菌pNZ-SP1-DCpep-NZ诱导10h。
图4为重组SP1-DCpep蛋白的Western-blot验证结果；
M：Protein Marker；1：含有表达质粒pNZ-T7g10-PB的乳酸菌；2：重组菌 pNZ-SP1-DCpep-NZ未诱导，3、4：重组菌 pNZ-SP1-DCpep-NZ诱导10h。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
表达COVID-19的SP1或RBD蛋白的重组乳酸菌的构建
1、乳酸菌分泌型表达质粒pNZ-T7g10-PB的构建
在质粒pNZ8148的基础上进行改造，利用NcoI和HindIII对质粒pNZ8148进行双酶切，与T7g10-PgsA-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型乳酸菌分泌表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB，其中T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PgsA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，MCS为多克隆酶切位点，至少包括Spe I和Xba I酶切位点。
2、pNZ-SP1-DCpep表达载体的构建
（1）通过基因合成，合成经过密码子优化的COVID-19抗原SP1-DCpep或RBD-DCpep基因序列。采用PCR方法扩增SP1-DCpep或RBD-DCpep基因，所使用的引物为：
SP1-DCpep上游引物：5’-GG GGTACC AGTGCGAATAATTGCACTTT-3’， 如SEQ ID NO.5所示， GGTACC 为Spe I酶切位点。
SP1-DCpep下游引物：5’- TCTAGA TTAAGGACGTTGTGGTGTAGA-3’，如SEQ ID NO.6所示， TCTAGA 为Xba I酶切位点。
RBD-DCpep上游引物：5’-GG GGTACC ATGAGGAAGAGAATCAGCAAC-3’，如SEQ ID NO.7所示， GGTACC 为Spe I酶切位点。
RBD-DCpep下游引物：5’- TCTAGA TTAAGGACGTTGTGGTGTAGA-3’，如SEQ ID NO.6所示， TCTAGA 为Xba I酶切位点。
扩增的SP1-DCpep或RBD-DCpep基因经测序，SP1-DCpep基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，RBD-DCpep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
（2）将基因SP1-DCpep或RBD-DCpep连接到pMD19-T载体上，得到的重组载体命名为pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep。
（3）利用限制性核酸内切酶Spe I和Xba I对质粒pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep和乳酸菌表达质粒pNZ-T7g10-PB进行双酶切处理，经胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的SP1-DCpep或RBD-DCpep基因片段与表达载体pNZ-T7g10-PB目的片段连接，构建重组表达质粒即为表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白以及树突状细胞诱导肽的融合蛋白的表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB-SP1-DCpep或pNZ-T7g10-PB-RBD-DCpep，简称pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep。
pNZ-SP1-DCpep重组质粒酶切验证结果见图1。
3、表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白的重组乳酸菌的构建
制备乳酸菌感受态细胞，经电转化技术将构建的重组表达质粒pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep转入乳酸菌感受态细胞NZ9000中，加入恢复培养基GM17，于30℃培养3-5h，离心，用液体GM17培养基重悬菌体，涂布在含有氯霉素的固体GM17培养基上，于30℃培养48-72h，筛选重组乳酸菌转化子，用菌液PCR验证，获得阳性重组乳酸菌，即为表达COVID-19抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗。
阳性重组乳酸菌液PCR验证结果见图2。
阳性重组菌命名为pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ。
实施例2
重组SP1-DCpep或RBD-DCpep蛋白表达与Western-blot验证
1、重组SP1-DCpep或RBD-DCpep蛋白表达的SDS-PAGE验证
重组乳酸菌pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ按1wt%的接种量加入含氯霉素的GM17液体培养基中，于30℃培养至OD600=0.4-0.6时，加入诱导肽，诱导10h。诱导结束后，离心收集菌体，在冰浴条件下超声破碎细胞，离心取上清液，加SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10-20分钟，冷却后即为上样样品。用未经诱导的乳酸菌和只含有质粒pNZ-T7g10-PB且经过诱导的乳酸菌作为对照。
重组SP1-DCpep蛋白的SDS-PAGE验证结果见图3。
2、重组SP1-DCpep蛋白表达的Western-blot验证
重组乳酸菌pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ的SDS-PAGE部分见实施例2的1部分，将胶上的蛋白通过转膜仪转至PVDF膜上，封闭，孵育一抗，二抗，HRP-ECL显色。
重组SP1-DCpep蛋白的Western-blot验证结果见图4。
实施例3
重组乳酸菌pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ发酵条件的优化
1、重组乳酸菌pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ发酵培养基的优化
通过对培养基中碳源、氮源、碳氮比、微量元素配比的优化选出最佳初始培养基配方。该配方为：酵母粉或黄豆饼粉25-30g/L，葡萄糖或乳糖或麦芽糖15-30g/L，豆蛋白胨或骨蛋白胨5-15g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠20-25g/L。微量金属元素是氯化铁、硫酸镁、氯化钙、氯化锰和氯化铜中的一种或多种，含量为0.1wv%。115℃灭菌20-30分钟，灭菌完成并降温后，用氢氧化钠或氨水调pH至7.0。
2、重组乳酸菌pNZ-SP1-DCpep-NZ或pNZ-RBD-DCpep-NZ补料工艺的优化
对发酵过程的pH值进行在线检测确定最佳发酵pH值；通过高效液相色谱（HPLC）检测发酵液中葡萄糖的浓度对重组SP1或RBD蛋白乳酸菌表达的影响确定最佳补料工艺。最终确定：发酵过程补加氨水调节pH值，最佳pH范围为6.5-7.0，最佳葡萄糖浓度为15-20g/L。
以上实施例描述了以COVID-19的SP1或RBD蛋白为免疫原并融合树突状细胞诱导肽，利用乳酸菌为抗原传递载体，通过电转化转入乳酸菌中，构建了预防COVID-19肺炎的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗。
本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 一种表达COVID-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法
<130> 2020
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<170> patentin version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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<210> 3
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
atggttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctttttatccgagttatcatagtactcctcagcggcct 1872
<210> 4
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
aggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccagttttatccgagttatcatagtactcctcagcggcct 795
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<213> 人工序列（artificial sequence）
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ggggtaccat gaggaagaga atcagcaac 29
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种表达COVID-19抗原的表达载体及基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法
<130> 2020
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aataattttg tttaacttta ag 22
<210> 2
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60
aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120
atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt attctgacga cgtactctca 180
gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240
ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300
ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360
catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaattt cacggttctc 420
aacagcgcca acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480
gaatttgcga agcaaaatct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540
aagaaaattt cgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg cgacgcttgg ctttaccgat 600
gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660
gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg ctgacattgt tgttgtgcag 720
tcacactggg gccaagagta tgacaatgat ccaaacgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780
gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc atccgcacgt cttagaaccg 840
attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgaccaa 900
ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960
ggccgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcacc tgtgaaaaaa 1020
gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080
aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140
taa 1143
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<212> DNA
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atggttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 60
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 120
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 180
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 240
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 300
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 360
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 420
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 480
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 540
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 600
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 660
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 720
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 780
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 840
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 900
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 960
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1020
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1080
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1140
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1200
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1260
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1320
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1380
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1440
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1500
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1560
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1620
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1680
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1740
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1800
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgcttttt atccgagtta tcatagtact 1860
cctcagcggc ct 1872
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc cgcatcattt 60
tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg ctttactaat 120
gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc tccagggcaa 180
actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg ctgcgttata 240
gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta cctgtataga 300
ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga aatctatcag 360
gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt gttactttcc tttacaatca 420
tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt agtactttct 480
tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac taatttggtt 540
aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag gcacaggtgt tcttactgag 600
tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag acattgctga cactactgat 660
gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta caccatgttc ttttggtggt 720
gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagt tttatccgag ttatcatagt 780
actcctcagc ggcct 795
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tctagattaa ggacgttgtg gtgtaga 27
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ggggtaccat gaggaagaga atcagcaac 29

Claims (6)

1.一种表达COVID-19抗原的表达载体，其特征在于：所述表达COVID-19抗原的表达载体是通过将COVID-19抗原SP1或RBD序列以及树突状细胞诱导肽DCpep基因连接到乳酸菌表达载体pNZ8148上得到的；所述乳酸菌表达载体pNZ8148为食品级表达载体，该乳酸菌表达载体pNZ8148经改造具有翻译增强子序列和大肠杆菌转录终止子序列，其利用Nco I和HindIII对乳酸菌表达载体pNZ8148进行双酶切，与T7g10-PgsA-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建组成型乳酸菌分泌表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB，其中T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PgsA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MCS为多克隆酶切位点，至少包括Spe I和Xba I酶切位点；
所述的表达COVID-19抗原的表达载体的具体构建步骤为：
步骤S1：通过基因合成，合成经过密码子优化的COVID-19抗原SP1-DCpep或RBD-DCpep基因序列，SP1-DCpep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，RBD-DCpep基因序列如SEQ IDNO.4所示；
步骤S2：将基因SP1-DCpep或RBD-DCpep连接到pMD19-T载体上，得到的重组载体命名为pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep；
步骤S3：乳酸菌分泌型表达质粒pNZ-T7g10-PB的构建，在质粒pNZ8148的基础上进行改造，利用NcoI和HindIII对质粒pNZ8148进行双酶切，与T7g10-PgsA-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型乳酸菌分泌表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB，其中T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PgsA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MCS为多克隆酶切位点，至少包括Spe I和Xba I酶切位点；
步骤S4：利用限制性核酸内切酶Spe I和Xba I对质粒pMD-SP1-DCpep或pMD-RBD-DCpep和乳酸菌表达质粒pNZ-T7g10-PB进行双酶切处理，经胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的SP1-DCpep或RBD-DCpep基因片段与表达载体pNZ-T7g10-PB目的片段连接，构建重组表达质粒即为表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白以及树突状细胞诱导肽DCpep的融合蛋白的表达载体，命名为pNZ-T7g10-PB-SP1-DCpep或pNZ-T7g10-PB-RBD-DCpep，简称pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep。
2.一种基因工程乳酸菌口服疫苗，其特征在于：所述基因工程乳酸菌口服疫苗是通过将权利要求1所述的表达COVID-19抗原SP1或RBD蛋白及树突状细胞诱导肽DCpep的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌NZ9000中得到的。
3.根据权利要求2所述的基因工程乳酸菌口服疫苗，其特征在于：所述乳酸菌NZ9000为食品级乳酸乳球菌。
4.一种权利要求2所述的基因工程乳酸菌口服疫苗的构建方法，其特征在于具体步骤为：首先制备乳酸菌感受态细胞NZ9000，经电转化技术将上述构建的重组表达质粒pNZ-SP1-DCpep或pNZ-RBD-DCpep转入乳酸菌感受态细胞NZ9000中，加入恢复培养基GM17，于30℃培养3-5h，离心，用液体GM17培养基重悬菌体，涂布在含有氯霉素的固体GM17培养基上，30℃培养48-72h，筛选重组乳酸菌转化子，用菌液PCR验证，获得阳性重组乳酸菌，即为表达COVID-19抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗。
5.权利要求2所述的基因工程乳酸菌口服疫苗在制备预防或治疗COVID-19肺炎药物中的用途。
6.一种COVID-19亚单位口服疫苗，其特征在于：所述COVID-19亚单位口服疫苗含有权利要求2所述的基因工程乳酸菌口服疫苗。
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