CN117683137B - 靶向新城疫病毒和h9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明从免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选出两条分别针对新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列，通过柔性连接肽连接后定向克隆至载体pPIC9K构建重组质粒，转化至毕赤酵母X‑33感受态细胞中筛选用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株，经甲醇诱导，收集上清并纯化后获得能同时靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体。该重组双特异性纳米抗体的相对分子质量大小为28.6kDa，浓度为0.8mg/mL，纯度大于90％，产量高达3.5mg/L，生物学活性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病。新城疫病毒(NDV)仍只一个血清型，但根据F基因高变区的遗传进化分析可将所有毒株分为ClassⅠ和ClassⅡ大类，其中ClassⅠ又可分为3个基因型，ClassⅡ分为至少25个基因型。分子流行病学研究结果表明，目前在鸽群中流行的NDV以ClassⅡ中的基因VI型为主(潘群兴，等。新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[J].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。
H9N2亚型禽流感病毒虽然属于低致病性，但是病毒可以侵害家禽的多个系统，如呼吸、系统、免疫系统等。单一感染后家禽往往不表现明显的临床症状，有时只表现轻微的呼吸道症状，如咳嗽、喷嚏。但病毒对免疫系统的抑制作用，使其容易与其他病毒混合感染，或者继发细菌感染，从而导致家禽发病加重，出现较为严重的诸如呼吸道症状、产蛋率和孵化率下降、蛋品质下降，肉禽出现生长迟缓、料肉比上升以及后期死亡率升高、死淘率增加，对家禽养殖业造成的经济损失巨大(蒋文明,张琳,彭程等.2019—2020年9株H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析及候选疫苗株筛选[J].畜牧与兽医,2023,55(11):72-78.)。
新城疫(ND)和H9亚型禽流感(H9-AI)是严重危害养禽业的重大动物疫病。近年来，虽然ND和AI疫苗的广泛使用，使疫病的爆发流行明显减少，但是出现了“老病新发”的非典型性症状等流行新特点，家禽免疫带毒、免疫失败、区域流行以及混合感染现象普遍，直接及间接造成的经济损失巨大，防控面临着新挑战，寻求防控ND和AI新途径已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。
新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)均属于有囊膜的RNA病毒，因其基因组的结构特点，病毒极易发生变异，根据AIV和NDV表面糖蛋白(HA蛋白和F蛋白)的遗传变异情况，可将AIV和NDV划分为不同血清型和基因型，其中H5、H7、H9亚型AIV和基因VII、VI型NDV严重危害养禽业。一方面，不同地区、不同时间分离的AIV和NDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异；更值得关注的是，临床上缺乏免疫禽群中出现非典型性症状的针对性防治产品，尤其是ND和H9-AI。因此，研制安全、高效、廉价、易于标准化的生物治疗制剂已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体，从免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选出两条分别针对新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列NDV-Nb043和H9-Nb055，通过柔性连接肽连接这两条重链抗体可变区序列NDV-Nb043和H9-Nb055获得连接产物NDV-Nb043+H9-Nb055，并将其定向克隆至载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055，再转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中筛选用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株，并对工程菌株进行甲醇诱导，收集上清并纯化后，获得能同时靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体。
作为优选的，所述重链抗体可变区序列NDV-Nb043的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为优选的，所述重链抗体可变区序列H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
作为优选的，所述连接产物NDV-Nb043+H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
作为优选的，所述重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。
作为优选的，所述重组双特异性纳米抗体的相对分子质量大小为28.6kDa，浓度为0.8mg/mL，纯度大于90％。
本发明的一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体的方法，具体包括以下步骤：
利用鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫羊驼，同时通过两轮套式PCR扩增羊驼抗体的重链抗体可变区序列，将扩增产物与质粒pComb3Xss进行双酶切后，经T4连接酶连接并转化至大肠杆菌TG1感受态构建免疫羊驼的VHH噬菌体文库；从免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选出一条针对新城疫病毒的重链抗体可变区序列NDV-Nb043和一条针对H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列H9-Nb055，用柔性连接肽连接这两条重链抗体可变区序列NDV-Nb043和H9-Nb055获得连接产物NDV-Nb043+H9-Nb055，并在其末端添加His标签，然后将其定向克隆至载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055；将重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055经电转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中，筛选出用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株，对工程菌株复壮及甲醇诱导，收集上清及纯化后，获得能同时靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体。
作为优选的，所述两轮套式PCR扩增中的第1轮PCR引物为CALL-1和CALL-2，第2轮PCR引物为Sac1-VHH-F和Spe1-VHH-R；
CALL-1：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，
CALL-2：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
Sac1-VHH-F：GAGCTCATGGATGTGCAGCTGGT，
Spe1-VHH-R：ACTAGTTGAGGAGACGGTGACCT。
作为优选的，所述两轮套式PCR扩增的反应程序为：第一轮，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环反应，72℃再延伸10分钟；第二轮，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环反应，72℃再延伸10分钟。
本发明的一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体在制备预防和/或治疗新城疫和H9亚型禽流感的纳米抗体制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
纳米抗体是仅由单独的重链抗体可变区(VHH)构成的抗体片段，且只展现出最小的功能性抗原结合活性区域。单域抗体(sdAb)具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强、亲和力高、溶解性好、组织渗透性强以及可识别抗原缝隙表位、易于基因改造、生产成本低、形式模块化、免疫原性弱等特点，表现出更好的应用价值。这些优势使得单域抗体(sdAb)成为开发新型生物治疗制剂的热点和趋势。有鉴于此，本发明提供了一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体及其制备方法以及该重组双特异性纳米抗体在制备预防和/或治疗新城疫和H9亚型禽流感的纳米抗体制剂中的新用途，并且本发明提供了两条分别针对新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列NDV-Nb043(其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2)和H9-Nb055(其核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4)，以及重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055(核苷酸序列为SEQ ID NO:7)和利用该重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055构建的用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株。
本发明所制备的重组双特异性纳米抗体的相对分子质量大小为28.6kDa，浓度为0.8mg/mL，纯度大于90％，产量高达3.5mg/L，具有安全、高效、易于标准化生产的优点。同时，该重组双特异性纳米抗体对于新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的最低抑制浓度分别为25μg/mL和50μg/mL，生物学活性显著，可用于制备预防和/或治疗新城疫和H9亚型禽流感的新型纳米抗体制剂。
本发明制备的一种靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体对于防控新城疫和H9亚型禽流感具有重大科学意义，为新城疫和H9亚型禽流感的预防和/或治疗提供了一条新途径。
附图说明
图1为重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055示意图。
图2为VHH噬菌体文库的PCR鉴定结果。
图3为针对新城疫病毒的重链抗体可变区序列筛选的ELISA检测结果。
图4为针对H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列筛选的ELISA检测结果。
图5为用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株的鉴定结果。
图6为靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体的SDS-PAGE检测结果。
图7为靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体的Westernblot鉴定结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1构建VHH噬菌体文库
将鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(购自福建圣维生物科技有限公司)以颈部肌肉注射的方式并按照注射量为3mL每只注射2岁龄雄性羊驼(购自江苏登源河生物科技有限公司)，分别于免疫后的第14、28、42、56天加强免疫一次，然后测量血清抗体效价，待血清抗体中的ELISA效价达到1:25600时开始收集羊驼外周血。利用骆驼外周血淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)分离淋巴细胞，采用RNA提取试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)和反转录试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)抽提其RNA并反转录成cDNA，利用两轮套式PCR(反应程序为：第一轮，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环反应，72℃再延伸10分钟；第二轮，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环反应，72℃再延伸10分钟。)扩增羊驼抗体的重链抗体可变区(VHH)序列，第1轮PCR引物为CALL-1(GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG)和CALL-2(GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC)，第2轮PCR引物为Sac1-VHH-F(GAGCTCATGGATGTGCAGCTGGT)和Spe1-VHH-R(ACTAGTTGAGGAGACGGTGACCT)。上述引物均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。将扩增的重链抗体可变区(VHH)序列与质粒pComb3Xss(购自南京翼飞雪生物科技有限公司)经限制性内切酶SacI和SpeI(均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)进行消化处理，然后用T4连接酶(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)连接并转化至大肠杆菌TG1感受态(购自上海唯地生物技术有限公司)，次日挑取95个单菌落，进行菌液PCR。PCR鉴定结果如图2所示，这95个单菌落均为阳性，对这95个单菌落进行测序可知，它们的序列都不相同，因此，根据这些结果可知所构建的VHH噬菌体文库阳性率达100％(95/95)，多样性丰富(95/95)，并且根据平板计数和稀释比例计算得出VHH噬菌体文库的库容量为2.84×108个。综上，本发明成功构建了免疫羊驼的VHH噬菌体文库。
实施例2重链抗体可变区序列筛选
将灭活的新城疫病毒LaSota株(购自福建圣维生物科技有限公司)和H9亚型禽流感病毒JY株(购自福建圣维生物科技有限公司)分别包被酶标板，采用抗体库固相筛选技术分别筛选出能与新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒相结合的重链抗体可变区序列即VHH序列。针对筛选出的两条重链抗体可变区分别进行ELISA检测。结果如图3和表1中的数据可知，针对新城疫病毒的VHH序列中编号NDV-Nb043的序列的OD值最高(2.034)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，因此，将重链抗体可变区NDV-Nb043序列作为最终筛选的针对新城疫病毒的VHH序列。结果如图4和表1中的数据可知，针对H9亚型禽流感病毒的VHH序列中编号H9-Nb055的序列的OD值最高(2.402)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，因此，将重链抗体可变区H9-Nb055序列作为最终筛选的针对H9亚型禽流感病毒的VHH序列。
表1重链抗体可变区序列的ELISA筛选结果
实施例3构建重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055
如图1所示，将所筛选的重链抗体可变区NDV-Nb043和H9-Nb055序列先通过柔性连接肽(GSGSGSGSGSGS)进行连接，并在末端添加His标签(HHHHHH)，连接后得到的NDV-Nb043+H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。之后与载体pPIC9K(购自赛默飞世尔科技公司)分别经限制性内切酶EcoRI和NotI(均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)消化后，再经1％琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态(购自上海唯地生物技术有限公司)，经过涂板过夜培养，于次日挑取单菌落进行鉴定，将测序鉴定正确的重组质粒命名为pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，置于-20℃保存。
实施例4构建用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株
用限制性内切酶SalI(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)将实施例3构建的重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055进行线性化，然后将其加入到毕赤酵母X-33感受态细胞(购自长沙爱科博生物科技有限公司)，轻轻混合均匀，转移至预冷电转杯，冰浴5分钟后再转移至电转仪(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司)，设置电转化参数：电压为1.5kV，电阻为250Ω，电容为25μF，然后开始电转化。电转化完成后需要立即加入1mL、1M预冷的山梨醇(购自上海碧云天生物技术有限公司)，吸打两次后转移至离心管中，置于30℃培养箱中静置培养1h，室温下，4000r/min离心4分钟，离心后收集菌体，并用100μLYPG培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)进行重悬，将重悬后的菌液涂布至YPG固体培养基(含100μg/mL博莱霉素(购自上海碧云天生物技术有限公司))上，置于37℃条件培养3天，最终挑取单菌落进行PCR鉴定。结果如图5所示，获得长度为384bp的单菌落，与预期相符。综上，本发明成功构建了用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株。
实施例5制备靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体
首先将实施例4构建的工程菌株接种至YPG培养液中进行复壮处理，并于次日取其中的5mL接种至含有250mLYPG培养液的1L摇瓶中，然后在28℃、200r/min条件下进行培养过夜，经离心后收集菌体，用BMMY液体培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)(等体积)进行重悬，然后在28℃、200r/min条件下诱导120小时，诱导过程中需要每隔24小时补加甲醇(终浓度0.5％)。
诱导完成后收集上清液，按亲和层析柱(购自上海碧云天生物技术有限公司)说明书进行纯化，然后进行SDS-PAGE与Westernblot鉴定。SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果分别如图6和图7所示。根据鉴定结果可知，纯化产物的相对分子质量大小为28.6kDa，与预期大小相符，其浓度达0.8mg/mL，并且纯度能够达到90％以上。综上，本发明成功制备了靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体。
试验例1靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体的生物学活性检测
按照现有固定病毒稀释抗体方法，先将DF-1细胞(购自中国科学院细胞库)进行消化，然后接种于96孔细胞板中。将重组双特异性纳米抗体进行2倍系列稀释，将系列稀释后的重组双特异性纳米抗体添加至细胞培养基中，并控制重组双特异性纳米抗体的浓度分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。然后分别加入100TCID50新城疫病毒LaSota株悬液(预先用含有TPCK-胰酶(购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)的培养基进行稀释)和100TCID50H9亚型禽流感病毒JY株悬液(预先用含有TPCK-胰酶的培养基进行稀释)混合均匀，同时设立病毒对照以及正常细胞对照，于37℃、5％CO2温箱中培养3天，观察细胞病变(CPE)，每个梯度重复5次(复孔)，以超过50％孔未出现CPE(-)所对应最小抗体浓度即为最低抑制浓度。
结果如表2所示，本发明制备的重组双特异性纳米抗体对于新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的最低抑制浓度分别为25μg/mL和50μg/mL，具有显著的生物学活性。
表2重组双特异性纳米抗体的生物学活性检测
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体，其特征在于，从免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选出两条分别针对新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重链抗体可变区序列NDV-Nb043和H9-Nb055，通过柔性连接肽连接这两条重链抗体可变区序列NDV-Nb043和H9-Nb055获得连接产物NDV-Nb043+H9-Nb055，并将其定向克隆至载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055，再转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中筛选用于表达重组双特异性纳米抗体的工程菌株，并对工程菌株进行甲醇诱导，收集上清并纯化后，获得能同时靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体；所述连接产物NDV-Nb043+H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示；所述重组质粒pPIC9K-NDV-Nb043+H9-Nb055的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体，其特征在于，所述重组双特异性纳米抗体的相对分子质量大小为28.6kDa，浓度为0.8mg/mL，纯度大于90％。
3.如权利要求1或2所述的靶向新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的重组双特异性纳米抗体在制备预防和/或治疗新城疫和H9亚型禽流感的纳米抗体制剂中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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