CN117417441B - 一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法 - Google Patents
一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法，涉及生物领域，本发明从已建立的免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选到一条抗新城疫病毒的重链抗体可变区序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。将该序列定向克隆至真核表达质粒pPIC9K中构建重组真核表达质粒，并将其转化至毕赤酵母表达系统中筛选表达工程菌株，对其进行甲醇诱导、上清收集、亲和层析纯化后获得重组纳米抗体。该重组纳米抗体产量达到15mg/L，抗新城疫病毒的中和活性效价为10log2，具有显著的生物学活性，可用于预防和/或治疗新城疫。本发明的制备方法操作简单，成本低，适用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病。目前，在生产实践中典型性的新城疫已得到较好控制，但局部地区病毒污染比较严重，疫情呈持续性地方流行。近年来，虽然ND疫苗的广泛使用，使疫病的爆发流行明显减少，但该病呈现出新的流行特点，如出现了非典型性症状、免疫带毒、免疫失败、区域流行以及混合感染等流行新特点，使新城疫防控复杂化，直接及间接造成的经济损失巨大，防控面临着新挑战，寻求防控ND已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。更值得关注的是，临床上缺乏免疫禽群中出现非典型性症状的针对性防治产品。因此，研制安全、高效、廉价、易于标准化的生物治疗制剂已成为当务之急。
纳米抗体是由重链抗体可变区(VHH)构成的最小功能性抗原结合活性片段，具有高亲合力、高特异性、强穿透性和易于改造和表达等特点，在新型生物制剂研发方面表现出巨大潜力。纳米抗体是仅由单独的重链抗体可变区(VHH)构成的抗体片段，且只展现出最小的功能性抗原结合活性区域，其具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强、亲和力高、溶解性好、组织渗透性强以及可识别抗原缝隙表位、易于基因改造、生产成本低、形式模块化、免疫原性弱等特点，表现出更好的应用价值。这些优势使得纳米抗体成为开发新型生物治疗制剂的热点和趋势。
目前，关于抗新城疫病毒的纳米抗体报道研究有限。高小龙和胡湘云等报道从双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库(即非免疫文库)中筛选到2条针对新城疫病毒F蛋白纳米抗体，具有一定的中和活性(高小龙，等.新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定[J].畜牧兽医学报，2016，47(8)：1645-1651.)(胡湘云.新城疫病毒融合蛋白纳米抗体的筛选与鉴定[D].西北农林科技大学，2015.)。然而，从非免疫文库筛选的纳米抗体序列在结合活性方面弱于从免疫文库中筛选的纳米抗体，因此从免疫文库中筛选到的纳米抗体与流行病毒株具有更高的结合适配性。另一方面，赵钦等公开了两株抗新城疫病毒纳米抗体及其表达制备方法和应用，通过大肠杆菌表达系统制备的重组纳米抗体可用于检测新城疫病毒(赵钦,等.两株抗新城疫病毒纳米抗体及其表达制备方法和应用[P].陕西省：CN110776564B,2022-02-08.)。然而，现有资料尚未报道关于抗新城疫病毒纳米抗体作为新型预防或治疗制剂方面的研究。并且，大肠杆菌表达系统制备的重组蛋白存在内毒素残留、包涵体变性复性损失、纯化步骤繁琐、蛋白修饰水平低等缺点，不利于纳米抗体制剂的生产。
毕赤酵母表达系统是最简单和最可靠的外源基因表达系统，在很多外源蛋白的工业化生产中已经取代了传统的大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统。毕赤酵母表达系统的优势在于：含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能(罗士强.毕赤酵母表达的RBD蛋白的免疫原性受其N-糖基化修饰的影响[D].安徽大学,2021)。
发明内容
本发明的目的是提供一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法，以解决现有技术存在的问题。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体，从免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选到一条抗新城疫病毒的重链抗体可变区序列，将该序列定向克隆至真核表达质粒pPIC9K中构建重组真核表达质粒，并将其转化至毕赤酵母表达系统筛选表达工程菌株，对其进行甲醇诱导、上清收集、亲和层析纯化后获得重组纳米抗体。
作为优选的实施方式，所述重组纳米抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、免疫羊驼的VHH噬菌体文库的构建与重链抗体可变区序列筛选；
步骤二、重组真核表达质粒的构建与鉴定；
步骤三、重组纳米抗体的表达工程菌株的构建；
步骤四、重组纳米抗体的制备。
作为优选的实施方式，步骤一中，构建免疫羊驼的VHH噬菌体文库时，首先制备新城疫病毒VII-NJ株灭活抗原，将其与矿物油佐剂等比例乳化，然后将所得新城疫病毒VII-NJ株灭活疫苗颈部皮下注射雄性羊驼，于免疫后第14、28、42、56天加强免疫一次，测量血清抗体ELISA效价，待效价达到1:20000时，收集羊驼外周血，利用骆驼外周血淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，采用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒抽提其RNA并反转录成cDNA，通过两轮套式PCR扩增羊驼抗体的重链抗体可变区序列；将所扩增的VHH序列与pComb3Xss质粒经限制性内切酶Sac I和Spe I消化处理，再经T4连接酶连接并转化至大肠杆菌TG1感受态，次日挑取多个单菌落，进行菌液PCR，经鉴定后表明免疫羊驼的VHH噬菌体文库构建成功。
作为优选的实施方式，两轮套式PCR扩增步骤中，第一轮引物序列为CALL-1和CALL-2，第二轮引物序列为Sac1-VHH-F和Spe1-VHH-R；引物序列信息如下：
CALL-1：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
CALL-2：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
Sac1-VHH-F：GAGCTCATGGATGTGCAGCTGGT；
Spe1-VHH-R：ACTAGTTGAGGAGACGGTGACCT。
作为优选的实施方式，所述免疫羊驼的VHH噬菌体文库的阳性率为100％，库容量为3×108个。
作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：
将筛选到的重链抗体可变区序列与pPIC9K载体分别经限制性内切酶EcoR I和NotI消化后，经1％琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，经测序将鉴定正确的重组真核表达质粒命名为pPIC9K-NDV-Nb-1C9，-20℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：
用限制性内切酶Sal I将重组真核表达质粒线性化，加入至毕赤酵母X-33感受态细胞中混匀后转移至预冷电转杯，冰浴后转移至电转仪进行电转化，电转化后加入预冷的山梨醇，吸打后转移至离心管，30℃培养箱中静置培养，室温下离心，收集菌体并用YPG培养基重悬，涂布至含有博莱霉素的YPG固体培养基上，37℃培养2-3天，挑取单菌落进行PCR鉴定，鉴定正确后获得重组纳米抗体的表达工程菌株，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
作为优选的实施方式，步骤四的具体操作步骤如下：
将重组纳米抗体的表达工程菌株接种至YPG培养液中复壮，次日接种至含有YPG培养液的摇瓶中，28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基重悬，28℃、200r/min诱导120小时，且每间隔24小时补加终浓度0.5％的甲醇，收集上清液，利用亲和层析柱从收集的上清液中纯化获得重组纳米抗体；采用SDS-PAGE法与Westernblot法分析重组纳米抗体的分子量大小及纯度。
本发明还提供一种用于表达所述一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体的表达工程菌株。
本发明的有益效果是：
本发明研制了一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体，该重组纳米抗体是通过毕赤酵母表达系统制备而成，其产量达到15mg/L，抗新城疫病毒的中和活性效价为10log2，具有显著的生物学活性，可用于制备预防和/或治疗新城疫的新型纳米抗体制剂。
其优点如下：
1、本发明的一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体序列是从已建立的免疫羊驼的VHH噬菌体文库中筛选到，其免疫抗原为当前流行的基因VII型新城疫病毒株，筛选到的纳米抗体与流行病毒株具有更高的结合适配性。
2、本发明的一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体(抗新城疫病毒的中和活性效价为10log2，即10-3.01)显著高于已报道的数值(10-1.96和10-1.70)，是目前报道中和活性最高的抗新城疫病毒的重组纳米抗体。
3、本发明的一种重组纳米抗体的表达工程菌株是采用毕赤酵母表达系统构建的，该策略属首次公开。
4、本发明的一种重组纳米抗体的制备方法，操作简易、成本低，能够保证重组纳米抗体的产量、活性、安全性和生产实用性，适用于大规模生产。
附图说明
图1为免疫羊驼的VHH噬菌体文库的鉴定结果。
图2为免疫羊驼的VHH噬菌体文库的固相筛淘的ELISA检测结果。
图3为重组真核表达质粒pPIC9K-NDV-Nb-1C9的图谱。
图4为重组纳米抗体的表达工程菌株的PCR鉴定结果。
图5为重组纳米抗体的Westernblot鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1免疫羊驼的VHH噬菌体文库的构建与重链抗体可变区(VHH)序列筛选
(1)制备新城疫病毒VII-NJ株灭活抗原；
所采用的新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：V201945。
新城疫病毒VII-NJ株灭活抗原的制备过程(参照公开号为CN112831476A的中国专利《新城疫病毒VII-NJ株及其应用》说明书实施例2进行制备)，具体如下：
将新城疫病毒VII-NJ株接种9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)，48h后收集尿囊液，8000r/min离心30min，取上清，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，采用BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)确定病毒浓度，-70℃保存备用。加入灭活剂BEI(购自Sigma公司)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验(将液接种细胞观察96小时后细胞是否出现病变，重复三次，均无出现细胞病变后确定灭活成功)，-70℃保存备用。
(2)将所制备的新城疫病毒VII-NJ株灭活抗原与矿物油佐剂等比例乳化(见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页)，将所得新城疫病毒VII-NJ株灭活疫苗按照颈部皮下注射方式注射3岁龄雄性羊驼(购自嘉祥县好客养殖场)，注射量为3mL/只，于免疫后第14、28、42、56天分别加强免疫一次，测量血清抗体效价，待血清抗体中的ELISA效价达到1:20000时，收集羊驼外周血，利用骆驼外周血淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)分离淋巴细胞，采用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)抽提其RNA并反转录成cDNA。通过两轮套式PCR扩增羊驼抗体的重链抗体可变区(VHH)序列，第一轮引物序列为CALL-1和CALL-2，第二轮引物序列为Sac1-VHH-F和Spe1-VHH-R。上述引物均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。上述引物序列信息如下：
CALL-1：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
CALL-2：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
Sac1-VHH-F：GAGCTCATGGATGTGCAGCTGGT；
Spe1-VHH-R：ACTAGTTGAGGAGACGGTGACCT。
(3)将所扩增的VHH序列与pComb3Xss质粒(购自南京翼飞雪生物科技有限公司)经限制性内切酶Sac I和Spe I(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)消化处理，再经T4连接酶(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)连接并转化至大肠杆菌TG1感受态(购自上海唯地生物技术有限公司)，次日挑取24个单菌落，进行菌液PCR。结果如图1所示，24个单菌落均为阳性，且经测序鉴定这些序列均不相同，表明该免疫羊驼的VHH噬菌体文库阳性率达100％(24/24)，多样性丰富(24/24)，免疫羊驼的VHH噬菌体文库构建成功。经计算(根据平板计数和稀释比例推算)该免疫羊驼的VHH噬菌体文库库容量达3×108个。
(4)将新城疫病毒包被酶标板，采用抗体库固相筛选技术(参照MeganA.Schladetsch,等人.Generation ofSingle-ChainVariable Fragment(scFv)Libraries for Use in Phage Display[J].Currentprotocols,2021,1(7)：e182.)筛选能与新城疫病毒结合的VHH序列(即抗新城疫病毒的重组纳米抗体序列)，固相筛淘的ELISA检测结果如图2所示，筛选到34个VHH序列，其中Nb-1C9的OD值最高，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
实施例2重组真核表达质粒的构建与鉴定
将实施例1中筛选到的VHH序列(Nb-1C9)与pPIC9K载体(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)分别经限制性内切酶EcoR I和Not I(EcoR I和Not I均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)消化后，经1％琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)中，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，经测序将鉴定正确的重组真核表达质粒命名为pPIC9K-NDV-Nb-1C9(图3)，-20℃保存备用。
实施例3重组纳米抗体的表达工程菌株的构建
用限制性内切酶Sal I(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)将重组真核表达质粒pPIC9K-NDV-Nb-1C9线性化，加入至毕赤酵母X-33感受态细胞(购自长沙爱科博生物科技有限公司)中轻轻混匀后转移至预冷电转杯，冰浴5分钟，转移至电转仪(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司)，设置电转化参数：电压为1.5kV，电阻为250Ω，电容为25μF，电转化后立刻加入1mL预冷的浓度为1M的山梨醇(购自上海碧云天生物技术有限公司)，吸打2次后转移至1.5mL离心管，30℃培养箱中静置培养1h，随后室温下4000r/min离心4分钟，收集菌体并用100μLYPG培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)重悬，涂布至含有100μg/mL博莱霉素(Zeocin，购自上海碧云天生物技术有限公司)的YPG固体培养基上，37℃培养3天，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果如图4所示，长度为333bp。鉴定正确后获得用于表达重组纳米抗体的表达工程菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例4重组纳米抗体NDV-Nb-1C9的制备
将实施例3获得的表达工程菌株先接种至20mLYPG培养液中复壮，次日取5mL接种至1L摇瓶(含250mLYPG培养液)中，28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)重悬，28℃、200r/min诱导120小时(每隔24小时补加终浓度0.5％的甲醇)，收集上清液，参照亲和层析柱(购自上海碧云天生物技术有限公司)说明书纯化获得重组蛋白，采用SDS-PAGE法与Westernblot法分析重组蛋白的分子量大小及其纯度。Westernblot鉴定结果如图5所示，所获得的重组蛋白相对分子质量大小为14.7kDa，与预期值大小相符，表明该重组蛋白为重组纳米抗体NDV-Nb-1C9，浓度为0.677mg/mL，纯度达到90％。
实施例5重组纳米抗体NDV-Nb-1C9的中和活性检测
采用固定病毒稀释抗体的方法，将DF-1细胞(购自美国ATCC公司)消化后，接种于96孔细胞板中。将2倍系列稀释的重组纳米抗体NDV-Nb-1C9与等体积含200TCID50的新城疫病毒VII-NJ株悬液混合均匀，37℃作用1小时，取该病-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立病毒对照及正常细胞对照，置于37℃、5％CO2温箱培养，观察结果。结果显示，重组纳米抗体NDV-Nb-1C9的中和效价为10log2(即10-3.01)，显著高于已报道的中和效价10-1.96和10-1.70(参考“胡湘云.新城疫病毒融合蛋白纳米抗体的筛选与鉴定[D].西北农林科技大学，2015.”)。
本发明所制备的重组纳米抗体NDV-Nb-1C9具有较高的生物学活性，可用于制备预防和/或治疗新城疫的新型纳米抗体制剂。本发明制备重组纳米抗体NDV-Nb-1C9的方法操作简易、成本低，能够保证重组纳米抗体的产量、活性、安全性和生产实用性，适用于大规模生产。
本发明公开了一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
Claims (2)
1.一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.用于表达权利要求1所述的一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体的表达工程菌株。
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Inventor after: Liu Dafang Inventor after: Sun Weidong Inventor after: Qian Jing Inventor after: Yin Ruifang Inventor after: Ren Jiaojiao Inventor after: Li Na Inventor after: Yan Rongliang Inventor after: Wang Yunlei Inventor after: Liu Shuangshuang Inventor after: Bian Jinhui Inventor before: Liu Dafang Inventor before: Sun Weidong Inventor before: Qian Jing Inventor before: Yin Ruifang Inventor before: Ren Jiaojiao Inventor before: Li Na Inventor before: Yan Rongliang Inventor before: Wang Yunlei Inventor before: Liu Shuangshuang Inventor before: Bian Jinhui |
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