CN102993278B - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法。FnbA1为采用生物信息学方法，从MRSA的纤连蛋白结合蛋白A中预测出的活性片段，经大肠杆菌基因工程菌表达获得。其纯化步骤为：对高密度发酵的FnbA1重组表达菌按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶酶切，离子交换层析、疏水层析和脱盐的顺序组合进行纯化。本发明提供的纯化方法简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明纯化的抗原可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20％。自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。MRSA因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点及重要的生物战剂，被称为“超级细菌”，当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解决的感染性疾病，并位居首位。万古霉素被认为是治疗MRSA的最后一道防线，但2002年以来耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。
目前，在我国各大医院，由于抗生素的滥用，MRSA的分离检出率逐年上升，已由1978年的5％发展到2009年的79％，且菌群的毒力基因改变明显，并且耐万古霉素的金葡菌也呈蔓延趋势。基于这种严峻形势，我国已将MRSA列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。2010年“中国MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示，我国内地医院院内感染发生率约为8％，全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。因此，加强对MRSA感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型MRSA疫苗将对有效控制MRSA耐药性蔓延和临床MRSA广泛感染具有重大应用价值。美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验，研发具有自主知识产权、高效、安全、经济的MRSA疫苗对有效控制MRSA耐药性蔓延和临床MRSA广泛感染，提升我国的国际竞争力具有重要意义。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附于寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A(FnbA)是重要的粘附素之一，编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。它能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。
申请人采用生物信息学的方法从FnbA中预测出了一段活性片段FnbA1，通过克隆表达并纯化后，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。FnbA1具有序列表1所述的核苷酸序列和序列表2所述的氨基酸序列。
发明内容
本发明旨在针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原(FnbA1)制备中的抗原蛋白纯化，，提供一种工艺简捷、所获得目标蛋白纯度高、回收率较好的纯化工艺和方法。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案。
一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原的纯化方法，包含步骤：
收集发酵的表达FnbA1的工程菌后，按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，离子交换层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
步骤具体为：
1)高压破菌：将收集的抗原的菌体以pH为7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
2)硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为40％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；
3)沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量体积比为1∶10比例加入pH为7.0-7.5的10-20mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；
4)GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBSpH7.0-7.5的条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；
5)离子交换层析纯化：步骤4)收集的样品，pH调至9.0，使用pH为9.0、10～50Tris、0～0.1MNaCl的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱，然后采用pH为9.0、10～50Tris0.5～1MNaCl的buffer梯度洗脱；
6)疏水层析纯化：将步骤5)纯化获得的样品，按1∶1的比例与pH为7.5的20mM PB，3M(NH4)2SO4混合，采用缓冲液pH为7.5的10mMPB，1.5M(NH4)2SO4平衡层析系统和疏水层析柱后上样，采用pH为7.5的10mM PB梯度洗脱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白。
7)脱盐：采用PBS平衡脱盐柱，将步骤6)纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。
优选地，步骤1)采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，高速离心获取破菌上清。
优选地，步骤2)和步骤3)硫酸铵分步沉淀再复溶。
优选地，步骤4)所述的GST亲和纯化所使用的填料为GST-Sepharose4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP之一。
优选地，步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除Prescission Protease酶。
优选地，步骤5)所使用的离子交换层析填料为Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere之一。
优选地，步骤6)所述的凝胶层析柱为Superdex75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一。
本发明所述抗原是通过以下步骤制备的：
1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA1蛋白活性片段的核酸序列；
2)将步骤1)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。
本发明的有益效果是：本发明采用的此纯化方法，从表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组基因工程疫苗候选抗原(本申请中命名为FnbA1)的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98％的FnbA1，得率50％以上，整个纯化过程无需额外置换缓冲液。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原FnbA1为采用生物信息学方法，从MRSA的纤连蛋白结合蛋白A中预测出的的活性片段，经大肠杆菌基因工程菌表达获得。
通过上述工艺处理不同批次的FnbA1作12％SDS-PAGE，呈现出单一目标蛋白条带，分子量约为72KD，纯度在98％以上。蛋白等电点在pH4.5左右。不同FnbA1肽指纹图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10Sec内波动，说明肽图谱重现性好。纯化后的FnbA1与氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现FnbA1加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P＜0.01)，证明使用本发明纯化方法获得的FnbA1可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用MRSA标准株252(购自ATCC)感染，发现FnbA1加免疫佐剂组感染率为80％作用，且具有良好的重复性，表明该蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保护性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重组基因工程疫苗的候选抗原。
附图说明
图1为FnbA1发酵菌体破菌样品SDS-PAGE。
在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1-2为FnbA1破菌上清。
图2为硫酸铵沉淀及GST亲和层析样品SDS-PAGE。
在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1为40％硫酸铵沉淀后复溶样本，泳道2为PP酶酶切后第一次洗脱样本，泳道3为PP酶酶切后第二次洗脱样本，泳道4为PP酶(Prescission Protease酶)酶切后第三次洗脱样本。
图3为离子交换层析图。
图中分别列出了280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。
图4为离子交换层析样品SDS-PAGE。
在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1-5为峰1样品，泳道6为峰2样品，泳道7为峰3样品，泳道8为峰4样品。
图5为两次疏水层析的层析图。
图中分别列出了280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。
图6为疏水层析样品SDS-PAGE。
在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1为离子交换层析样本，泳道2-3为第二次疏水层析样本，泳道4-7为第一次疏水层析样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述。
实施例一：抗原FnBA1的制备
本实施例所使用的菌株与各种试剂如下：
1.菌株
金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；
2.试剂
质粒pGEX-6p-2、大肠杆菌菌株XL-1blue为申请人教研室保存，
primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamHI和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
T4DNA Ligase为Fermentas公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。
本实施例的具体步骤如下：
(一)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBA1活性片段的克隆
1.首先根据MRSA-252FnBA蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的FnBA1目的基因片段。所述FnBA1目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白的的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增FnBA1目的基因片段，扩增步骤如下：
1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：3-4(下划线示酶切位点碱基序列)
FnBA1-F：SEQ ID NO：3
5′-CGCGGATCCATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3′
BamH I
FnBA1-R：SEQ ID NO：4
5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATCCATTATCCCATGTTAATGTAT-3′
Not I
2)-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。
3)以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增FnBA1基因片段
PCR体系：
| 模板(239.2nngμl) | 2.5μl |
| FnBA1-F(50μM) | 1μl |
| FnBA1-R(50μM) | 1μl |
| Taq酶 | 2.5μl |
| dNTP | 2μl |
| Buffer | 15μl |
| 灭菌双蒸水 | 26μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR扩增反应条件98℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。
4)使用凝胶回收试剂盒回收FnBA1PCR产物。
3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和FnBA1PCR产物
酶切反应体系：
| BamH I | 3μl |
| Not I | 3μl |
| 10×K Buffer | 3μl |
| 0.1％BSA | 6μl |
| Product | 45μl |
| 总体积 | 60μl |
37℃酶切2h。
2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。
3)连接和转化
通过紫外分光光度计测定FnBA1酶切回收产物核酸浓度：21ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl。
连接反应体系：
| soultion I | 5μl |
| FnBA1酶切回收产物 | 4.5μl |
| PGEX-6P-2酶切回收产物 | 0.5μl |
| 总体积 | 10μl |
混匀，16℃连接2h。
4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5)pGEX-6p-2/FnBA1阳性重组质粒的筛选、鉴定
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
双酶切反应体系：
| BamH I | 0.5μl |
| Not I | 0.5μl |
| 10×K Buffer | 0.5μl |
| 0.1％BSA | 1μl |
| 重组质粒 | 8μl |
| 总体积 | 10.5μl |
37℃酶切2h；
④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2/FnBA1重组质粒；
⑤pGEX-6p-2/FnBA1重组质粒送往上海英俊公司测序，测序结果比对结果示于图6，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。
(二)MRSA-252FnBA亚单位活性片段FnBA1在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
1.目的蛋白诱导表达
1)取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp抗性的TB培养基中，80rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp抗性的TB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，25℃5h，16℃过夜诱导表达。
2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL lysis buffer混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。
2.处理上清
取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20ul 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
3.处理沉淀
在沉淀中加入500μL lysis buffer重悬菌体，取80uL重悬菌液加入20μL5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
4.SDS-PAGE电泳，将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。
5.将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图3，PGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue在16℃、25℃、30℃均为可溶性蛋白，且无明显差异。
(三)FnBA1抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入80ul IPTG(终浓度为200uM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加20mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的GlutathioneSepharose 4B凝胶珠(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。
2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取FnBA1目的蛋白
向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μLPBS和120μL PreScission protease(PP酶)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在96kDa左右，酶切下来的FnBA1蛋白分子量在72kDa-95kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图4，其中泳道1表示酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道2表示酶切后，由于目的蛋白与结合与凝胶珠的GST标签分离，因此在上清获取的目的蛋白；泳道3表示酶切后，洗涤Glutathione Sepharose 4B凝胶珠(beads)获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道4表示酶切后，非特异性结合在beads上的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。
3.BCA法测定蛋白含量，最高浓度为1.7mg/mL。
实施例二：高压破菌、离心
将构建的表达可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原FnbA1的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，目标蛋白表达率为18％，4℃，10000g离心15-30min收集菌体备用。
菌体200-500g以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液，按重量体积比为1∶10比例混匀悬浮，4℃预冷。
高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。
预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。
高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000离心15-30min，收集上清备用。上清电泳结果如图1所示，FnbA1表达量极高，可能在30％以上。
实施例三：硫酸铵分步沉淀、复溶
4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30％的固体硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清。上清中继续缓慢加入终浓度为40％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；
沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量体积比为1∶10比例加入复溶液(10-20mM，pH7.0-7.5，0.5％Triton)，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清。复溶后的样品电泳结果如图2泳道1所示，蛋白经过复溶后纯度达到60％左右，已经除掉了大量杂蛋白。
实施例四：GST亲和纯化
1.结合选择GST亲和层析填料进行初步纯化，将实施例二中收集的上清加入用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶珠(beads)中，4℃结合3h以上，结合过程采用垂直旋的方法以促进蛋白与beads的结合。
2.酶切将目的蛋白和GST标签分开，获取FnBA1目的蛋白
将上述结合蛋白的beads采用复溶液洗涤3-5个体积后，采用PBS继续洗涤3-5个体积，除去未与beads结合的杂蛋白。然后向beads中加入一定体积的PreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切3h左右后，用PBS洗涤3次，4℃保存用于后续精细纯化。同时，各取10μL样品变性处理后，上样5μL进行SDS-PAGE蛋白电泳。电泳结果如图2泳道2-4所示，经过GST初纯，目的蛋白的纯度进一步提到，达到80％左右，仍有待进一步的纯化，除去痕量杂质。
实施例五：离子交换层析纯化
实施例三收集的样品，采用NaOH将pH调至约9.0，同时采用bufferA(10-50mM Tris pH9.0)稀释样品，使其电导降至8.0mS/cm以下。同时，采用buffer A平衡层析系统及离子交换层析柱(Q HP、RESOURCE Q、QFF、Adhere均可)，待电导和UV指数稳定后上样，上样结束后采用bufferA洗柱至UV280不再下降为止，此时采用buffer B(10-50mM Tris pH9.0，0.5-1MNaCl)梯度洗脱并收集各个洗脱样品，4℃保存并进行SDS-PAGE电泳鉴定。层析图如图3所示，在离子交换层析过程中，有少量的蛋白流穿，由于UV吸收值太小，未取样电泳，可能是部分杂蛋白流穿。洗脱过程中共出现4个峰，分别命名为峰1、峰2、峰3和峰4。结合电泳结果(图4)发现，峰1主要为目的蛋白，纯度达到90％以上，而且峰的左半部分纯度明显高于右半部分。峰2和峰3中虽然目的蛋白仍很多，但杂蛋白含量明显提高，在目的蛋白上方出现大量杂蛋白。峰4中杂蛋白更多。由此，将峰1的样品保存在4℃备用。
实施例六：疏水层析纯化与脱盐
将实施例四纯化获得的峰1样品按照1∶1的比例加入buffer C(20mMPB，pH7.5，3M(NH4)2SO4)中，边加边搅拌。采用疏水层析柱(phenyl或butyl)前先用buffer D(10mM PB，1.5M(NH4)2SO4)平衡层析系统和层析柱，然后将上述蛋白样品上样，上样结束后采用buffer C洗柱至UV280不再下降为止，此时采用buffer D(10mM PB，pH7.5)梯度洗脱并收集洗脱样品，并对收集的样品进行SDS-PAGE检测。图5为两次疏水层析的层析图。图6为两次层析的电泳结果，结果表明：最后得到的蛋白中基本没有杂带，蛋白纯度达到98％以上。
收集疏水层析的样品后，采用PBS平衡脱盐柱，然后将样品通过脱盐柱置换缓冲液，得到最终的目的蛋白，即纯化的抗原。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
Claims (10)
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组基因工程疫苗抗原，其特征在于，该抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种权利要求1所述抗原的纯化方法，其特征在于，包含步骤：收集制备的所述抗原；按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶酶切，离子交换层析、疏水层析和脱盐的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：
1）高压破菌：将收集的菌体以pH为7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；
3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量体积比为1：3-10比例加入pH为7.0-7.5的10-20 mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；
4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS pH7.0-7.5的条件对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；
5）离子交换层析纯化：步骤4）收集的样品，pH调至9.0，使用pH为9.0，10~50mM Tris，0~0.1 M NaCl 的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱，然后采用pH为9.0，10~50 mM Tris，0.5~1 M NaCl的buffer梯度洗脱；
6）疏水层析纯化：将步骤5）纯化获得的样品，按1:1的比例与pH为7.5的20 mM PB，3M (NH4)2SO4混合，采用缓冲液pH为7.5的10 mM PB，1.5M (NH4)2SO4平衡层析系统和疏水层析柱后上样，采用pH为7.5的10 mM PB梯度洗脱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白；
7）脱盐：采用PBS 平衡脱盐柱，将步骤6）纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤1）采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，高速离心获取破菌上清。
5.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤2）和步骤3）硫酸铵分步沉淀再复溶。
6.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤4）所述的GST亲和纯化所使用的填料为GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP之一。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，步骤4）所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除Prescission Protease酶。
8.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤5）所使用的离子交换层析填料为Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere之一。
9.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤6）所述的疏水层析柱为phenyl或butyl。
10.如权利要求2至9任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的：
1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组基因工程疫苗抗原蛋白活性片段的核酸序列；
2）将步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。
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