CN104788568A - 一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽cc29及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法，将实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽与中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽，进行杂合设计，获得了低溶血、高抗菌活性的新型杂合肽及其高效表达的发酵菌株，与天然肽相比具有更大的优势，为抗菌肽的规模化生产奠定基础。

Description

一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体涉及一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法。

背景技术

抗菌肽是生物先天性免疫系统的重要组成部分，是经免疫诱导产生的一类抵抗外界病原体感染具有生物活性的小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因此，如何能够获得抑菌效果好、产量高的抗菌肽一直受到研究者的普遍关注。目前，抗菌肽的获得方法主要有三种：(1)直接从生物体中提取天然肽，但含量非常少，且提取工艺复杂，成本较高，难以满足大规模生产的要求；(2)化学方法合成。这种方法只适用于非常短的抗菌肽，但大多数抗菌肽分子量都比较大，不适合化学合成；(3)分子量比较大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，该方法研究的比较透彻，而且是生产抗菌肽的有效途径。因此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。

杂合抗菌肽的设计特点是集两个(或以上)天然肽的优点于一身，经过适当的人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(Cec Md)是本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的(同源性81％)。而Chensirin是近年来发现的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。如果能够对两者进行杂合设计，将会为抗菌肽的规模化生产奠定基础。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29，所述抗菌肽CC29包括两对引物，其核苷酸序列为：

CCG TTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACT TTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

所述核苷酸序列前端引入三肽序列(波浪线部分)，方便后期标签蛋白的切割，所述核苷酸序列两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点(方框内)和保护性碱基(两尾端)，末端加上终止密码子(TAA)。下划线部分为家蝇天蚕素抗菌肽Cec Md的部分成熟肽基因序列，未划线部分为Chensirin部分成熟肽基因序列

所述抗菌肽CC29的分子量为3236.00；电荷数为+7.5；等电点为11.22；疏水力矩为0.35。

上述的一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29通过以下方法获得：

S1、根据Genbank中Chensirin序列(登录号ABI95142、ABF13216、ABF13217、ABG66418)以及实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽序列(GWLKKIGKKIERVGQHTRDATUQTIGVAQQAANVAATLKG)，选取具有潜力的片段进行组合，应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，筛选出医疗潜力指数最大的组合CC29，在其两端加上Xho I和Xba I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成CC29融合蛋白基因；它的两对引物序列为：

F1为5’-CCGCTCGAGAAAAGAGGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAG-3’，

R1为5’-GGCAACAAAGTGTGTTGACCAGCCTTCAACTTCTTACCCAAC-3’，

F2为5’-GCTGGT CAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCT-3’，

R2为5’-CTAGTCTAGATTAAGTCTTCTTAGCGAAGTAACCCAATGGC-3’。

F1与R1，F2与R2分别进行延伸，得到延伸液F1R1、F2R2，然后进行第二次PCR延伸，此时延伸液F1R1与F2R2互为模板与引物。

将回收的杂合抗菌肽基因与克隆载体pUC57链接，提取质粒后进行PCR和双酶切鉴定，并将含有重组载体的菌液送至生物公司测序；将鉴定和测序正确的克隆载体转化至大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆的质粒，并进行PCR、酶切和生物公司测序鉴定

S2、构建CC29克隆载体、pGAPZαA/CC29并测序鉴定，构建表达载体pGAPZαA/CC29并测序鉴定，将重组的克隆pGAPZαA/CC29与表达载体pGAPZαA同时双酶切，获得的目的基因与同样酶切的表达载体连接构建重组表达载体pGAPZαA/CC29，将杂合抗菌肽CC29表达载体转化到宿主菌SMD1168中，获得杂合抗菌肽CC29的重组原核表达基因工程菌；

S3、使用IPTG对培养至对数期的杂合抗菌肽CC29大肠杆菌基因工程菌进行诱导，通过SDS-PAGE和western blot技术对CC29融合蛋白进行检测，以便确定其表达水平和表达方式；

S4、将杂合抗菌肽基因构建在毕赤酵母表达载体pGAPZαA上，电转化到宿主菌SMD1168后，使用YPD液体培养基培养3天，杂合抗菌肽表达出分泌蛋白；对表达载体表达出的蛋白进行层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留；

S5、CC29的生物学活性鉴定。

其中，所述步骤S5过程中包括：将杂合抗菌肽CC29经沸水浴2min、5min、10min、30min和60min的热稳定性检测；将杂合抗菌肽CC29在pH为1、2、5、7、10、12、14缓冲液中，以沙门氏菌为指示菌的杀菌活性检测；通过抑菌圈法和连续倍比稀释法测定杂合抗菌肽CC29对大肠杆菌、乳酸杆菌、鸡沙门氏菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌浓度；采用红细胞血红素的释放测定杂合抗菌肽CC29的溶血活性。

本发明具有以下有益效果：

获得了低溶血、高抗菌活性的新型杂合肽及其高效表达的发酵菌株，与天然肽相比具有更大的优势，为抗菌肽的规模化生产奠定基础。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29的获得方法，包括如下步骤：

S1、合成CC29融合蛋白基因

杂合抗菌肽CC所含有的核苷酸序列：

CCG TTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACTTTGT TGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

根据杂合抗菌肽CC29所含有的核苷酸序列，设计了它的两对引物：F1与R1，F2与R2。

F1为5’-CCGCTCGAGAAAAGAGGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAG-3’，

R1为5’-GGCAACAAAGTGTGTTGACCAGCCTTCAACTTCTTACCCAAC-3’，

F2为5’-GCTGGT CAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCT-3’，

R2为5’-CTAGTCTAGATTAAGTCTTCTTAGCGAAGTAACCCAATGGC-3’。

采用SOEing PCR方法合成两条杂合抗菌肽基因，方法如下：

第一次PCR时，F1与R1，F2与R2引物分别进行延伸，得到延伸液F1R1、F2R2。反应体系为2×Taq MasterMix25μL，上游引物F1(10μM)2μL，下游引物R1(10μM)2μL，双蒸水21μL，体积共计50μL。将上述组分加入到PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。反应体系为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环之后72℃终延伸2min。PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

第二次PCR时，以相应延伸液(F1R1与F2R2)混为模板和引物进行PCR，反应体系为2×Taq MasterMix25μL，上游引物F1R12μL，下游引物F2R22μL，双蒸水21μL，体积共计50μL。将上述组分加入到PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。反应体系为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环之后72℃终延伸2min。PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

S2、构建杂合抗菌肽CC29毕赤酵母菌基因工程菌

(1)构建克隆载体

将杂合抗菌肽的基因胶回收之后，与pUC57连接，将其转接到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，并验证试验结果的正确性。

①PCR产物的胶回收：按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书方法进行，具体如下：

a在紫外灯照射下，小心的切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，凝胶表面液体用纸巾吸尽，小心切碎。称量后计算凝胶的重量(实验前记录1.5mL离心管重量)，将该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

b向离心管中滴加3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后，将其置于75℃水浴中加热，每2-3min间断混合一次，6-8分钟后使凝胶块完全熔化。

c加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀，由于目的片段小于400bp，添加1个凝胶体积的异丙醇。

d吸取上面步骤的混合液，转移到DNA制备管(置于试剂盒提供的2mL离心管)中，12,000×g离心1min，弃滤液。

e将制备管放回2mL离心管中，滴加500μL Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

f将制备管放回2mL离心管中，滴加700μL Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min，弃滤液。

g将制备管放回2mL离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液。

h将制备管放入试剂盒内提供的洁净的1.5mL离心管中，在制备膜的中央上方滴加25-30μL的65℃预热的Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

j取5μL胶回收产物在含有EB的1％Agarose gel电泳中检测回收是否成功。

②感受态细胞的制备：使用TakaRa的Competent Cell Preparation Kit制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法如下：

a菌种纯化：使用LB平板培养基。用无菌的接种针挑取大肠杆菌DH5α(-80℃甘油保存菌)，在平板培养基上分级划线，于37℃恒温培养箱中倒置，过夜培养，以能够长出单菌落为宜。

b菌体培养：

a取20mLφb×broth转入100mL的三角烧瓶中，塞上棉塞，高温高压灭菌，然后冷却至室温；在划线平板上挑取单菌落，接种到上面灭菌后冷却的培养基中；37℃振荡(120rmp)培养；

b测定OD600值，当OD600值达到0.35-0.5时(大约培养5小时)放置冰上停止培养；进行下一步操作。

C感受态细胞的制备：取上述②中的1mL菌液置于1.5mL的无菌EP管中；1,500×g4℃离心5min，弃上清；在EP管中加入100μL冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，操作中禁止剧烈振荡；1,500×g4℃离心5min，弃上清；在EP管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，操作中禁止剧烈振荡；感受态细胞制作完成后立即使用或保存于-80℃。

③克隆载体的构建：将杂合抗菌肽基因与克隆载体pUC57-Simple载体连接，步骤如下：

a在微量离心管中，加入pUC57-Simple1μL，杂合抗菌肽基因3μL，ddH2O1μL，共5μL；加入冰上融化的Solution15μL，混匀后瞬时离心；放入连接仪中，4℃反应过夜；

b将-80℃冰箱中保存的100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞放在冰中融化，10min后将感受态细胞放入另一新的离心管中，添加过夜反应的重组载体(10μL)，混合均匀后，冰中放置30min；

c样品在42℃水浴中放置45s后，立即放入冰中1-2min；加入890μL37℃预热的SOC培养基；37℃振荡培养1h；

d取20μL样品进行涂板，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养一夜，直至长出单菌落。

克隆载体的鉴定：

a质粒提取：使用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，步骤如下：

挑取上述平板上的大肠杆菌单菌落于5mL的含有AMP的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养；取1-4mL上述菌液，12,000×g离心1min，弃上清液；滴加250μL Buffer S1，均匀的悬浮细菌沉淀，使液体中没有小的菌块；滴加250μL Buffer S2，温和并充分的上下翻转4-6次，混合均匀直至形成透亮的溶液，此步骤不超过5min；

加350μL Buffer S3，温和并充分的上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min；取上清液并转移到制备管里，制备管置于试剂盒中提供的2mL离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液；

将制备管放回离心管中，滴加500μL Buffer W1，12,000×g离心1min，弃滤液；将制备管放回离心管中，滴加700μL Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液；将制备管放回2mL的离心管中，12000×g离心1min；将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管的中央滴加70μL Eluent，室温下静置1min，12000×g离心1min。取5μL产物进行电泳检测，1μL测定回收质粒DNA的浓度，剩余的样品-20℃保存。

b克隆质粒的PCR检测：以质粒DNA为模板进行PCR，反应体系为2×TaqMasterMix25μL，Forward Primer(10μM)2μL，3’AOX1Primer(10μM)2μL，质粒DNA 2μL，双蒸水19μL，体积共计50μL。将上述组分加入到PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。反应体系为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环之后72℃终延伸2min。PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

c克隆质粒的双酶切鉴定：克隆质粒用限制性内切酶Xba I和Xho I进行双酶切鉴定。在PCR反应管中加入克隆质粒DNA 5μL，限制性内切酶Xba I和Xho I各1μL，CutSmart Buffer 2μL，加灭菌的双蒸水至20μL。充分混匀后瞬时离心，37℃水浴4h，使酶切反应完全。取5μL酶切产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

d克隆质粒的测序鉴定：将PCR检测和双酶切检测正确的含有克隆质粒的大肠杆菌菌液送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果用DNAMAN与所设计的基因进行对比。

(2)构建表达载体和基因工程菌

①杂合抗菌肽基因的克隆载体和表达载体的双酶切

将含有表达载体pGAPZαA的大肠杆菌接种到5mL含有25μg/mL Zeocin的低盐LB培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养，按照3.1.2方法提取质粒。将其与-20℃保存的克隆质粒同时进行双酶切，酶切体系如下：质粒DNA 3μL；Xho I1μL；Xba I1μL；CutSmart Buffer2μL；灭菌的双蒸水13μL。取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37℃水浴3-4h后，使酶切反应完全。取5μL反应液与1μL6×Loading Buffer在含有EB的1％的Agarose gel电泳检测。检测确定正确后，将剩下的试剂按照3.1.2方法进行胶回收。完成后1％的Agarose gel电泳检测是否回收正确。

②杂合抗菌肽基因与表达载体pGAPZαA的连接

将①中回收的杂合抗菌肽基因片段和表达载体片段进行连接，在无菌的PCR反应管中加入DNA片段与载体片段摩尔比约为3∶1-12∶1的下列成分：载体pGAPZαA的片段2μL，杂合抗菌肽基因DNA片段6μL，10×T4DNA LigaseBuffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL，总体积为10μL，混匀后瞬时离心，4℃过夜。

③连接产物的转化

将步骤(2)中的连接产物按3.1.2方法转化到大肠杆菌DH5α中，37℃振荡1h后，涂布在含有25μg/mL Zeocin的低盐LB平板培养基上，倒置在37℃恒温培养箱中，过夜培养直至形成单菌落。

④重组表达载体的鉴定

a质粒的小量提取：挑取单菌落，无菌接种到5mL含有25μg/mL Zeocin的低盐LB培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养，按照3.1.2方法提取质粒。提取后的质粒分别命名为pGAPZαA/CC29。提取的表达质粒-80℃保存。

b PCR鉴定：以重组质粒DNA为模板进行检测。反应体系为2×TaqMasterMix25μL，Forward Primer(10μM)2μL，3’AOX1Primer(10μM)2μL，质粒DNA 2μL，双蒸水19μL，体积共计50μL。将上述组分加入到PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

c重组质粒的双酶切鉴定：依据设计在基因两端的限制性内切酶位点，用Xba I和Xho I来切割上述实验中提取的重组质粒DNA，以此鉴定挑选的重组子是否具有正确的酶切位点。所有重组质粒与空质粒均采用与克隆载体鉴定相同的酶切反应条件。反应结束后，取5μL反应液与1μL 6×Loading Buffer混合后于含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。观察双酶切反应结果。

d重组表达质粒的测序鉴定：取鉴定为阳性的重组菌液850μL加入150μL的无菌甘油，混合均匀后，-80℃冻存，送生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用DNAMAN与所设计的基因进行对比。

S3、杂合抗菌肽CC29融合蛋白的IPTG诱导表达和乳糖诱导表达

将测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌按1％的接种量接种于LB/AMP液体培养基中，37℃200rpm过夜培养后，以1％接种量接种于10mLLB/AMP液体培养基，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.6时(大约需2.5h)，分别取1.0mL菌液作为诱导前对照(0h)，然后分别加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导表达，37℃继续培养，并于诱导后2h和4h分别取1.0mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，加入1×蛋白上样缓冲液180μL与20μL DTT重悬菌体，沸水浴5min后，12000rpm离心1min，上清于-20℃保存备用。

乳糖诱导方法同上。并于诱导后2h、4h、6h、8h、10h取菌液，样品相同处理。应用SDS-PAGE技术检测目的蛋白表达情况，并对两者的诱导表达效果进行比较。使用凝胶分析软件Quantity one进行杂合抗菌肽CC29融合蛋白占细菌总蛋白含量的计算，结果以百分比的形式表示。

S4、杂合抗菌肽的表达载体的转化

(1)毕赤酵母SMD1168感受态细胞的制备

将划线培养的毕赤酵母SMD1168单菌落接种于3mL YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃200rpm振荡培养过夜。取上述过夜培养的浑浊菌液500μL接种于50mL YPD液体培养基中，30℃200rpm过夜培养，至OD600达到1.3-1.5，停止培养。1500×g，4℃离心5min，倒掉上清液，再用50mL预冷的双蒸水重悬细胞。1500×g，4℃离心5min，倒掉上清液，再用25mL预冷的双蒸水重悬细胞。1500×g，4℃离心5min，倒掉上清液，再用5mL预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞。1500×g，4℃离心5min，倒掉上清液，再用110μL预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞。取80μL浑浊菌液分装至无菌的1.5mL EP管中，-80℃保存，12周内使用。

(2)重组质粒的线性化

将-80℃中保存的阳性重组质粒的DNA用限制性内切酶Avr II进行线性化处理。反应体系为：CutSmart Buffer 2μL，Avr II内切酶1μL，重组质粒DNA 3μL，灭菌双蒸水14μL。在PCR反应管中加入上述成分，混合均匀后瞬时离心，在37℃中水浴4h，取5μL反应液和1μL 6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。观察酶切反应结果。

(3)重组质粒的电转化

将80μL处理好的毕赤酵母SMD1168感受态细胞和5-20μg(约5-10μL)经过线性化的重组DNA加入到一个无菌的1.5mL预冷离心管中，轻轻混匀。然后将混匀液转化到预冷的电转杯(0.2cm型)中。将装有混合液的电转杯在冰中预冷5min。将电转仪上的电压参数设置为1.5kv，施加一个5ms左右的脉冲后立即加入1mL预冷的山梨醇，然后将转化液转入到另一个无菌的1.5mL EP管中。30℃静置培养1-2h。取50μL菌液涂布于含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上。30℃恒温培养2-4天，直至形成单菌落。在平板上随机挑选单菌落接种到含有500μg/mL Zeocin的YPD平板上筛选高抗性转化株。

(4)高抗性转化株的鉴定

使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取高抗性转化株的DNA。取酵母培养液1mL，细胞不超过5×107个，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。向菌体中加入600μL山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase，充分混匀，30℃处理1h，4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。滴加200μL的缓冲液GA使沉淀重悬，充分混匀。加入4μL RNaseA(100mg/mL)溶液，振荡15s，室温放置5min。加入20μL Poteinase K溶液，混匀。加入320μL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，在70℃中水浴1h后溶液变清亮，简短离心去除管内壁的水珠。加入320μL的无水乙醇，充分颠倒混匀，出现絮状沉淀为正常现象，简短离心去除管内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作上一步骤。将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置5min，使吸附材料中的残余漂洗液彻底晾干。将吸附柱CB3放入另一个干净的离心管中，向吸附柱的中间悬空滴加70μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。完成后，取5μL回收的高抗性转化株的DNA与1μL 6×Loading Buffer混合后于含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。观察提取结果。

PCR鉴定：以上述提取的DNA为模板进行PCR检测。反应体系为2×TaqMasterMix25μL，Forward Primer(10μM)2μL，3’AOX1Primer(10μM)2μL，DNA 4μL，双蒸水17μL，体积共计50μL。将上述组分加入到PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。

重组质粒的酶切鉴定：依据设计在基因两端的限制性内切酶位点，用限制性内切酶Xba I和Xho I切割上述实验中提取的重组质粒DNA，以此鉴定挑选的转化株DNA是否具有正确的酶切位点。反应结束后，取5μL反应液与1μL6×Loading Buffer混合后于含有EB的1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。观察酶切结果。

重组表达质粒的测序鉴定：取鉴定为阳性的重组菌液850μL加入150μL的无菌甘油，混合均匀后，-80℃冻存，送生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用DNAMAN与所设计的基因进行对比。

S5、高抗性转化株的表达

(1)重组表达菌的表达

无菌挑选具有Zeocin抗性的单菌落，接种到5mL YPD液体培养基中，30℃200rpm振荡，过夜培养。按1％接种到50mLYPD液体培养基中培养，72h后取40mL菌液，8，000rpm离心10min，收集培养上清液。在上清液中小心慢慢的加入17.44g的硫酸铵固体，完全溶解后，4℃过夜，8，000rpm离心10min，去除上清液后收集沉淀。沉淀溶解于PBS溶液中，-80℃保存。

(2)融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE检测

由于目的蛋白较小，我们采用可分离大小在1-100kDa蛋白质的Tricine-SDS-PAGE来检测。安装1.5mm制胶版(短玻璃板面朝内)，密封好以避免漏胶。按表1配置12mL含6M尿素的16％分离胶，在液面顶部缓缓加入蒸馏水，待凝胶聚合(约1h)后，倒掉蒸馏水，用滤纸将夹层内的水吸干。按表1配置4mL 10％的间隙胶，将其覆盖在已经聚合的分离胶上面，在液面顶部缓缓加入蒸馏水，待凝胶聚合(约30min)后，倒掉蒸馏水，用滤纸将夹层内的水吸干。按表1配置4mL 4％的分离胶，将其缓缓加入已放好梳子的夹层内，让凝胶在室温下聚合30min。在1.5mL的离心管中，用4×Tricine加样缓冲液按1∶3稀释蛋白样品，于37℃水浴30min。将电泳槽安装好，下缓冲液槽中加入阳极缓冲液，上缓冲液槽中加入阴极缓冲液(见表2)，小心拔出梳子，加样孔用缓冲液冲洗干净。用微量移液器吸取10μL的蛋白样品加入孔中，对照孔中加蛋白marker。将电泳槽放入冰水中，连接电源，在30V电压下电泳至浓缩胶和间隙胶之间，接着在60V电压下电泳至间隙胶和分离胶之间，接着在90V电压下电泳，电流恒为20mA。当考马斯亮蓝G-250显示到达距离凝胶底部1cm处时，电压调回0并断开电源。

电泳完成后，将凝胶在固定液中培养30min。取出凝胶，用蒸馏水冲洗几遍，在考马斯亮蓝染色液中染色2-3h。取出凝胶，用蒸馏水冲洗几遍，用脱色液进行脱色，当蛋白条带清晰后，用凝胶成像系统照相保存。

表1Tricine-SDS-PAGE凝胶配方

表2Tricine-SDS-PAGE电极和凝胶缓冲液

(3)蛋白分离纯化与分子结构检测

将杂合工程菌的表达上清液通过Mini超滤系统5000kda膜分离，分离液过G50层析柱后上液相分离。取3μL分析级HPLC分析粗品，流动相是水和乙腈，进行30min的梯度洗脱。首先将HPLC用含95％的水和5％的乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入准备好的样品，反应时间为40min，收集从检测器中出来的样品。最后用25％的水和75％的乙腈混合液清洗30min。收集的样品达到85％的纯度后送生物科技有限公司进行质谱检测。

实施例1

抑菌圈法检测杂合抗菌肽抑菌活性

采用琼脂孔穴扩散法来初步检测目的蛋白的抗菌活性。实验使用的菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌、停乳链球菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌和卷曲乳杆菌。将上述各种细菌分别接种于合适的固体培养基上，待长出单菌落后，于对应的液体培养基中进行振荡培养。使用平板稀释法将上述各种处于对数生长期的菌株悬浮液稀释为108个/μL，将其按1％接种到适宜的固体培养基中，混匀后倒置平板。待平板冷凝后，用高压灭菌处理的打孔器(3mm)打孔，向每孔中分别滴加20μL液体。37℃恒温培养24h后，观察杂合抗菌肽的抑菌活性。

结果：杂合抗菌肽CC29对大肠杆菌和鸡沙门氏菌具有一定的抑制作用。

实施例2

最小抑菌浓度(MIC)的测定

挑平板中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球杆菌、沙门氏菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌和卷曲乳杆菌的单菌落于适宜液体培养基中，37℃，200rpm空气震荡培养过夜。将6条杂合抗菌肽分级稀释为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625mg/mL共计8个梯度。将过夜培养菌稀释至2×105-7×105CFU/mL，将稀释好的测试菌液分别滴加到96孔培养板中，每行的1-12孔，每孔50μL，然后每孔滴加50μL的杂合抗菌肽。每个样品设定3个重复，以不含测试菌作为阴性对照，Amp为阳性对照；于37℃，恒温培养，转速为100rpm，培养24h；490nm下用酶标仪测定其吸光度。

结果：杂合抗菌肽CC29对大肠杆菌和鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度均为25μg/mL。

实施例3

抗菌肽溶血活性检测

采用Nomura等(2005)方法通过测定血红素的释放量来探索抗菌肽的溶血活性。采取绵羊的新鲜血液，2000rpm离心收集红细胞，用无菌的生理盐水清洗2遍后，配置浓度为2％的新鲜绵羊血红细胞悬浮液，与0.1mL测试杂合抗菌肽混合均匀。测试抗菌肽混匀后的浓度为100、50、25、12.5μg/mL，混合均匀后在37℃恒温培养箱中温育1h，2000rpm离心10min。将上清液转移至96空板，使用酶标仪在570nm下测定吸光值。使用无菌的生理盐水和0.1％(v/v)的Triton-100作为溶血百分比0％和100％的标准。每个样品设定3个平行，结果取其平均值。溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100％。

结果：杂合抗菌肽CC29在浓度为100、50、25和12.5μg/mL下的溶血活性为1.22％、0.99％、0.80％和0.55％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29，其特征在于，所述抗菌肽CC29包括两对引物，其核苷酸序列为：

CCG TTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACT TTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

所述核苷酸序列前端引入三肽序列，所述核苷酸序列两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，所述抗菌肽CC29的分子量为3236.00；电荷数为+7.5；等电点为11.22；疏水力矩为0.35。

2.一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、根据Genbank中Chensirin序列以及实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽序列，选取具有潜力的片段进行组合，应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，筛选出医疗潜力指数最大的组合CC29，在其两端加上Xho I和Xba I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成CC29融合蛋白基因；

S2、构建CC29克隆载体、pGAPZαA/CC29并测序鉴定，构建表达载体pGAPZαA/CC29并测序鉴定，将重组的克隆pGAPZαA/CC29与表达载体pGAPZαA同时双酶切，获得的目的基因与同样酶切的表达载体连接构建重组表达载体pGAPZαA/CC29，将杂合抗菌肽CC29表达载体转化到宿主菌SMD1168中，获得杂合抗菌肽CC29的重组原核表达基因工程菌；

S3、使用IPTG对培养至对数期的杂合抗菌肽CC29大肠杆菌基因工程菌进行诱导，通过SDS-PAGE和western blot技术对CC29融合蛋白进行检测，以便确定其表达水平和表达方式；

S4、将杂合抗菌肽基因构建在毕赤酵母表达载体pGAPZαA上，电转化到宿主菌SMD1168后，使用YPD液体培养基培养3天，杂合抗菌肽表达出分泌蛋白；对表达载体表达出的蛋白进行层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留；

S5、CC29的生物学活性鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29的获得方法，其特征在于，所述步骤S5过程中包括：将杂合抗菌肽CC29经沸水浴2min、5min、10min、30min和60min的热稳定性检测；将杂合抗菌肽CC29在pH为1、2、5、7、10、12、14缓冲液中，以沙门氏菌为指示菌的杀菌活性检测；通过抑菌圈法和连续倍比稀释法测定杂合抗菌肽CC29对大肠杆菌、乳酸杆菌、鸡沙门氏菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌浓度；采用红细胞血红素的释放测定杂合抗菌肽CC29的溶血活性。