CN1896107A

CN1896107A - 类天蚕素a－马盖宁杂合基因工程抗菌肽

Info

Publication number: CN1896107A
Application number: CN 200610085397
Authority: CN
Inventors: 陈溥言; 王秀青; 曹瑞兵; 周斌
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2006-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2007-01-17

Abstract

本发明涉及类天蚕素A－马盖宁杂合基因工程抗菌肽，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA，CA)N端第1－7个氨基酸残基，马盖宁(magainin，M)N端第2－12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1－7)－M(2－12)基因，同载体pPICZα－A连接后，利用点突变技术对其进行突变得到了突变体pPICZα－CA－Mu－1、pPICZα－CA－Mu－2、pPICZα－CA－Mu－3；转化毕赤酵母受体菌SMD1168，在醇氧化酶启动子调控下，分子量约1.9kD的类CecA－Mag杂合抗菌肽获得表达来开发研制相关的基因工程产品。

Description

类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽

一技术领域

本发明类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。

二背景技术

1929年发现青霉素以来，抗生素在预防细菌感染、防治畜禽疾病方面发挥了重要作用，特别是β-内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性疾病的治疗产生了革命性飞跃，抗生素成为临床治疗的强有力武器，现代畜牧兽医学的许多成就，都是建立在抗生素应用的基础上的。但抗生素长期、广泛、不分选择的使用，不仅导致了严重的病原菌耐药性问题，而且也造成了药物残留等公共卫生隐疾。许多耐药性突变菌株出现，大大增加了疾病治疗的困难，我们面临重新回到无抗生素时代的危险。

面对问题的严峻性，人们不断研制新抗生素或通过改造原有抗生素来对付耐药菌，然而，抗生素的研制速度远远不及耐药菌产生的速度，且从本质上并没有超越原有抗生素的杀菌机制。针对于此，“无毒、无残留、无耐药性”是新一代抗菌制剂的发展趋势和要求。研制和应用新型抗菌剂代替抗生素在饲料添加剂及畜禽疾病防治中的应用，也已经成为当前饲料学科及兽医工作者的一项重要内容。近期的研究发现，抗菌肽不但广谱抗菌，能抑杀耐药性菌株，而且它的杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变，从而成为最具开发前景的抗生素替代品之一，为解决细菌耐药性这一棘手难题提供了新途径。

抗菌肽(antibacterial peptides，ABPs)，是生物体产生的一种具有抗菌作用的阳离子小肽，是生物先天性免疫的重要组成成分。迄今为止，已从许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中分离、鉴定了近千种抗菌活性肽。

现在国内外研究比较多的天然抗菌肽，包括有天蚕素(cecropin)，哺乳动物的防御素，两栖动物的蛙皮素magainin，蜜蜂的蜂毒素milittin等。为了寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的多肽抗生素，一些新型杂合抗菌肽相继研制并合成，例如，通过固相合成法人工合成的CN1-13MN1-13，是由cecropin和melittin的前13个氨基酸组成的杂合肽，具有比cecropin更强的抗菌活性而无蜂毒素溶血活性。

从目前研究进展来看，虽然抗菌肽体外抗菌活性具有无可比拟的优越性，显示出了很好的饲料添加剂应用前景和药用前景，抗菌肽基因工程也得以长足进展。但抗菌肽走向实际应用，还需进一步提高其表达产量；若真正将抗菌肽应用到临床治疗，则还需要解决抗菌肽的免疫原性、延长其在动物体内半衰期、消除其对宿主系统的损害作用等关键问题，这些问题，无疑是今后抗菌肽走向临床应用的瓶颈环节。抗菌肽的基因工程生产、长效抗菌肽的研制及抗菌肽对畜禽胃肠道正常菌群的影响的相关研究，势在必行，迫在眉睫！

从天然资源中提取的抗菌肽，成本高、得率低、工序繁琐；固相合成肽又价格相当昂贵，不适合我国国情，都难以应用于实际临床。由于抗菌肽基因一般都较小，故采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽则更切实可行，具有实际意义。

抗菌肽的本质是一种肽。和其它蛋白质药物一样，主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用方式在体内被清除。由于其分子量小于20kDa，在代谢过程中易于由肾小球滤过，并在通过肾小管时被蛋白酶部分降解而从尿中排出。

三发明内容

技术问题：

本发明的目的在于研制出具有良好抑杀各种致病性革兰氏阳性和阴性细菌的基因工程抗菌肽，为抗生素研制出合适的替代品，为临床上的疾病防治和治疗提供一个合适的药物，也可以成为无危害的饲料添加剂。

技术方案：

类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽的制备方法，包括：

1)类天蚕素A-马盖宁(CecA-Mag)杂合肽母体基因合成

选取Genbank上登录号为X06672的天蚕素A(CecA)成熟肽段1-7个氨基酸和Genbank上登录号为J03193的马盖宁(Mag)成熟肽段2～12个氨基酸，设计两个引物片段F1和F2，以F1序列和F2序列片段互为模板和互为引物进行SOE法PCR扩增，获得合成的CecA-Mag杂合肽基因；

引物F1，SEQ.ID.NO.1；

5‘CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGCTGTTCAAGAAGATCGGTCCAGGTAAG3’

引物F2，SEQ.ID.NO.2；

5’TAGTCTAGACTAGAACTTCTTGGCACTGTGCAGGAACTTACCTGGACCGATCTTCTT3’

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1和引物F2，各2μL；TaKaRaExTaqTM 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃ 30s，退火温度从65℃降至50℃，每循环1min，每个循环降低0.5℃，72℃ 1min，共30个循环后温度降至50℃，再在最适退火温度52℃的条件下进行15个循环；72℃延伸6min，胶回收PCR产物获得天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因，SEQ.ID.NO.9，表达后为天蚕素A-马盖宁杂合肽，SEQ.ID.NO.10；

2)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因酵母表达载体的构建

PCR产物和pPICZαA均用XhoI、XbalI双酶切，T4 DNALigase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行缺失酶切位点鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pPICZα-CA；

3)类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因的合成

以构建成功的pPICZα-CA为模板，设计4条引物：

通用引物M，SEQ.ID.NO.5：CTAGTCTAGAACAAAAACTC

特异引物M1，SEQ.ID.NO.6：AACTTCTTGGCCTTGTGCAGGAA

特异引物M2，SEQ.ID.NO.7：AACTTCTTCTTACTGTGCAGGAA

特异引物M3，SEQ.ID.NO.8：AACTTCTTCTTCTTGTGCAGGAA

进行PCR扩增，反应体系为：5×PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 5μL；dNTP，10mmol/L，1μL；模板1μL，设计通用引物M和特异引物M1扩增pPICZα-CA-Mu-1，40pmol/L，各2μL；PrimeSTAR^TM DNA Polymerase 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃ 1min，退火65℃，1min，72℃ 2min，共30个循环；72℃延伸10min.扩增出3700bp片段，回收，转化后测序，获得三个类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因片段的重组表达质粒，基因片段测序正确后，命名pPICZα-CA-Mu-1；以同样的方法设计通用引物M和特异引物M2扩增pPICZα-CA-Mu-2；设计通用引物M和特异引物M3扩增pPICZα-CA-Mu-3。

4)重组表达载体pPICZα-CA、pPICZα-CA-Mu-1、pPICZα-CA-Mu-2、pPICZα-CA-Mu-3的转化

感受态毕赤酵母，SMD1168，80μL与SacI线性化的重组表达载体5μg相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；详细步骤参照PichiaExpression Kit；

采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮--冻--煮法制备PCR模板，设计引物：

P3，SEQ.ID.NO.3：GTCTCCACATTGTATGCTTC

P4，SEQ.ID.NO.4：CTGTGCAGGAACTTGAT

反应体系同上，PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s；48℃ 45s；72℃ 45s，25个循环；72℃ 6min；鉴定扩增出4种大小均为406bp的克隆定为pPICZα-CA、pPICZα-CA-Mu-1、pPICZα-CA-Mu-2和pPICZα-CA-Mu-3的阳性转化子；

5)重组毕赤酵母菌在摇瓶中的诱导表达

将筛选到的pPICZα-CA、pPICZα-CA-Mu-1、pPICZα-CA-Mu-2和pPICZα-CA-Mu-3的阳性转化子接种到5mL BMGY中，30℃ 230r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到3～6；室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mLBMMY培养基，进行诱导表达28℃，250r/min培养60h，期间每24h补加终浓度为1％的甲醇；72h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的类天蚕素A-马盖宁(CecA-Mag)杂合肽产物。

有益效果

1：表达系统简单

本发明应用缺陷性的酵母表达宿主菌SMD1168作为表达载体，在材料选择上具有新意，巴斯德毕赤酵母由于兼具原核表达系统的高表达量和真核表达系统可进行蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优点，在表达外源活性蛋白中倍受青睐。影响外源基因表达水平的因素很多，而密码子的选择是左右表达量的参数之一，基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。在此，为了提高抗菌肽在毕赤酵母中的表达效率，我们对抗菌肽基因进行密码子优化；为保持完整杀菌活性，进行表达产物的天然N端设计；利用基因重组技术，建立了新型抗菌肽的高效毕赤酵母表达体系。

2：本发明可大量生产

从天然资源中提取的抗菌肽，成本高、得率低、工序繁琐；固相合成肽又价格相当昂贵，不适合我国国情，都难以应用于实际临床。

本发明抗菌肽基因一般都较小，故采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽则更切实可行，具有实际意义。大量生产发酵具有很好的应用前景。

3：生产成本低廉，适于推广

本发明研制的基因工程抗菌肽生产成本低廉，所需要的培养基和发酵用的实验设备均具有价格低廉和易于操作的优点，十分适于推广。

4：无毒害物质

酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对机体细胞有毒害的物质，而且，许多资料显示，抗菌肽也不会像抗生素一样产生耐药性，因为抗菌肽是蛋白质药物，而抗生素是化学药物。

四、附图说明

图1：抗菌肽CecA-mag的Tricine-SDS-PAGE

Lane 1：SMD1168/pPICZα-A所表达上清，Lane2：cecA-mag表达上清Lane3：cecA-mag-mu-1所表达上清，LaneM：Marker，(Marker，从上到下依次为26.6，17.0，14.4，6.5，3.5，1.05KD购于sigma公司)Lane5：cecA-mag-mu-2所表达上清Lane 6：cecA-mag-mu-3所表达上清，

图2：重组抗菌肽对耐药的大肠杆菌的抑菌活性：

A：氨苄青霉素药物对照25μg/mL；1 cecA-mag表达上清，2，cecA-mag-mu-1所表达上清，3，cecA-mag-mu-2所表达上清4，cecA-mag-mu-3所表达上清.5，6所表达上清SMD1168/pPICZα-A所表达上清

图3：重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌活性：

A：氨苄青霉素药物对照25μg/mL，1：cecA-mag表达上清，2：cecA-mag-Mu-1所表达上清，3，cecA-mag-Mu-2所表达上清4，cecA-mag-Mu-3.5，6所表达上清5，6，SMD1168/pPICZα-A所表达上清

五、具体实施方式

类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽的制备方法，包括：

1)类天蚕素A-马盖宁(CecA-Mag)杂合肽母体基因合成

引物F1，SEQ.ID.NO.1；

5‘CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGCTGTTCAAGAAGATCGGTCCAGGTAAG3’

引物F2，SEQ.ID.NO.2；

5’TAGTCTAGACTAGAACTTCTTGGCACTGTGCAGGAACTTACCTGGACCGATCTTCTT3’

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，1μL；引物F1和引物F2，各2μL；TaKaRaExTaqTM 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃ 30s，退火温度从65℃降至50℃，每循环1min，每个循环降低0.5℃，72℃ 1min，共30个循环后温度降至50℃，再在最适退火温度52℃的条件下进行15个循环；72℃延伸6min，胶回收PCR产物获得天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因，SEQ.ID.NO.9，表达后的天蚕素A-马盖宁杂合肽，SEQ.ID.NO.10；

2)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因酵母表达载体的构建

PCR产物和pPICZαA均用XhoI、XbaI双酶切，T4 DNALigase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行缺失酶切位点鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pPICZα-CA；

3)类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因的合成

以构建成功的pPICZα-CA为模板，设计4条引物：

通用引物M，SEQ.ID.NO.5：CTAGTCTAGAACAAAAACTC

特异引物M 1，SEQ.ID.NO.6：AACTTCTTGGCCTTGTGCAGGAA

特异引物M 2，SEQ.ID.NO.7：AACTTCTTCTTACTGTGCAGGAA

特异引物M 3，SEQ.ID.NO.8：AACTTCTTCTTCTTGTGCAGGAA

进行PCR扩增，反应体系为：5×PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 5μL；dNTP，10mmol/L，1μL；模板1μL，设计通用引物M和特异引物M1扩增pPICZα-CA-Mu-1，40pmol/L，各2μL；PrimeSTAR^TM DNA Polymerase 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃ 1min，退火65℃，1min，72℃ 2min，共30个循环；72℃延伸10min.扩增出3700bp片段，回收，转化后测序，获得三个类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因片段的重组表达质粒，基因片段测序正确后，命名pPICZα-CA-Mu-1，SEQ.ID.NO.11；以同样的方法设计通用引物M和特异引物M2扩增pPICZα-CA-Mu-2，SEQ.ID.NO.12；设计通用引物M和特异引物M3扩增pPICZα-CA-Mu-3，SEQ.ID.NO.13。

P3，SEQ.ID.NO.3：GTCTCCACATTGTATGCTTC

P4，SEQ.ID.NO.4：CTGTGCAGGAACTTGAT

反应体系同上，PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s；48℃ 45s；72℃ 45s，25个循环；72℃ 6min；鉴定扩增出4种大小均为406bp的克隆定为pPICZα-CA、pPICZα-CA-Mu-1、pPICZαCA-Mu-2和pPICZα-CA-Mu-3的阳性转化子；

5)重组毕赤酵母菌在摇瓶中的诱导表达

将筛选到的pPICZα-CA、pPICZα-CA-Mu-1、pPICZα-CA-Mu-2和pPICZα-CA-Mu-3的阳性转化子接种到5mL BMGY中，30℃ 230r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到3～6；室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mLBMMY培养基，进行诱导表达28℃，250r/min培养60h，期间每24h补加终浓度为1％的甲醇；72h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的类天蚕素A-马盖宁(CecA-Mag)杂合肽产物。四种杂合肽的表达量分别为：pPICZα-CA：504mg/L；pPICZα-CA-Mu-1：502mg/LpPICZα-CA-Mu-2：498mg/L；pPICZα-CA-Mu-3：518mg/L。

6)Tricine-SDS-PAGE参考Schagger H，von Jagow G.Tricine-sodium decylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis forthe separation of proteins in the rangefrom 1 to 100KD Analytical Biochemistry，1987，166 368-379.进行。

7)重组杂合肽的初步抗菌活性测定

采用标准琼脂孔穴扩散法，以金黄色葡萄球菌(CowanI)、大肠杆菌(K88)为实验菌株，将供试菌悬浮液(OD600＝0.2~0.3)200μL与55℃的LB固体培养基25mL混匀后铺平板待其凝固后，用灭过菌的打孔器(直径5mm)打孔，孔中滴加20μL待测的表达上清(重组杂合肽)，37℃培养过夜(8~12h)，以同体积的pPICZαA空载体转化酵母的上清做为阴性对照，Amp为阳性对照，第2天测量抑菌直径。试验结果显示，杂合肽CecA--Mag对E.coli DH5α、金黄色葡萄球菌等菌株均有良好的抑杀作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达23.4mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径达21.4mm。

高保真的pyrobestDNA聚合酶、T4 DNA ligase、dNTP、限制性内切工具酶购于TaKaRa公司；Tricine购于上海生物工程公司；SDS-PAGE超低分子量Marker(C6210)购于Sigma公司；Zeocin购于Invitrogen公司；其它试剂均为进口或国产之分析纯。

序列表

<110>南京农业大学

<120>类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽

<130>说明书

<140>00

<141>2006-06-06

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ.ID.NO.1

<211>51

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(51)

<400>1

cctctcgaga aaagaaagtg gaagctgttc aagaagatcg gtccaggtaa g 51

<210>SEQ.ID.NO.2

<211>57

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(57)

<400>2

tagtctagac tagaacttct tggcactgtg caggaactta cctggaccga tcttctt 57

<210>SEQ.ID.NO.3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(20)

<400>3

gtctccacat tgtatgcttc 20

<210>SEQ.ID.NO.4

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(17)

<400>4

ctgtgcagga acttgat 17

<210>SEQ.ID.NO.5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(20)

<400>5

ctagtctaga acaaaaactc 20

<210>SEQ.ID.NO.6

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>6

aacttcttgg ccttgtgcag gaa 23

<210>SEQ.ID.NO.7

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>7

aacttcttct tactgtgcag gaa 23

<210>SEQ.ID.NO.8

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>8

aacttcttct tcttgtgcag gaa 23

<210>SEQ.ID.NO.9

<211>54

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)..(54)

<400>9

aagtggaagc tgttcaagaa gatcaagaag gacgtgtcac ggttcttcaa gatc 54

<210>SEQ.ID.NO.10

<211>18

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>aminoacids

<222>(1)..(18)

<400>10

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Ala Lys

1 5 10 15

Lys Phe

<210>SEQ.ID.NO.11

<211>18

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>aminoacids

<222>(1)..(18)

<400>11

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Lys Lys

1 5 10 15

Lys Phe

<210>SEQ.ID.NO.12

<211>18

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>aminoacids

<222>(1)..(18)

<400>12

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Lys Ala Lys

1 5 10 15

Lys Phe

<210>SEQ.ID.NO.13

<211>18

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>aminoacids

<222>(1)..(18)

<400>13

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Lys Lys Lys

1 5 10 15

Lys Phe

Claims

1、类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽是由以下制备方法得到的：

1)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因合成

引物F1，SEQ.ID.NO.1：

5‘CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGCTGTTCAAGAAGATCGGTCCAGGTAAG3’

引物F2，SEQ.ID.NO.2：

5’TAGTCTAGACTAGAACTTCTTGGCACTGTGCAGGAACTTACCTGGACCGATCTTCTT3’

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1和引物F2，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRaExTaqTM 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃30s，退火温度从65℃降至50℃，每循环1min，每个循环降低0.5℃，72℃1min，共30个循环后温度降至50℃，再在最适退火温度52℃的条件下进行15个循环；72℃延伸6min，经过胶回收后获得天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因；

2)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因酵母表达载体的构建

上述PCR产物和pPICZαA均用XhoI、XbalI双酶切，T4 DNALigase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行缺失酶切位点鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pPICZα-CA；

3)重组表达载体pPICZα-CA的转化

感受态毕赤酵母，SMD1168，80μL与SacI线性化的重组表达载体5μg相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；

P3，SEQ.ID.NO.3：GTCTCCACATTGTATGCTTC

P4，SEQ.ID.NO.4：CTGTGCAGGAACTTGAT

反应体系同上，PCR反应条件：94℃5min；94℃45s；48℃45s；72℃45s，25个循环；72℃6min；扩增出大小为406bp的克隆定为pPICZα-CA阳性转化子；

4)重组毕赤酵母菌在摇瓶中的诱导表达

将筛选到的阳性转化子接种到5mL BMGY中，30℃230r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到3～6；室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mLBMMY培养基，进行诱导表达28℃，250r/min培养60h，期间每24h补加终浓度为1％的甲醇；72h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽产物。

2、类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽突变体，其特征在于，该类抗菌肽是由以下制备方法得到的：

1)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因合成，方法同权利要求1，获得合成的CecA-Mag杂合肽基因；

2)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因酵母表达载体的构建，方法同权利要求1，获得pPICZα-CA；

3)类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因的合成：

以构建成功的pPICZα-CA为模板，设计4条引物：

通用引物M，SEQ.ID.NO.5：CTAGTCTAGAACAAAAACTC

特异引物M1，SEQ.ID.NO.6：AACTTCTTGGCCTTGTGCAGGAA

特异引物M2，SEQ.ID.NO.7：AACTTCTTCTTACTGTGCAGGAA

特异引物M3，SEQ.ID.NO.8：AACTTCTTCTTCTTGTGCAGGAA

进行PCR扩增，反应体系为：5×PrimeSTAR^TMHS DNA Polymerase 5μL；dNTP，10mmol/L，1μL；模板1μL，设计通用引物M和特异引物M1扩增pPICZα-CA-Mu-1，40pmol/L，各2μL；PrimeSTAR^TM DNA Polymerase 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃ 1min，退火65℃，1min，72℃2min，共30个循环；72℃延伸10min.扩增出3700bp片段，回收，转化后测序，获得三个类天蚕素A-马盖宁杂合肽突变体基因片段的重组表达质粒，基因片段测序正确后，命名为pPICZα-CA-Mu-1；以同样的方法设计通用引物M和特异引物M2扩增pPICZα-CA-Mu-2；设计通用引物M和特异引物M3扩增pPICZα-CA-Mu-3；4)重组表达载体pPICZα-CA-Mu-1、pPICZα-CA-Mu-2、pPICZα-CA-Mu-3转化和表达，方法同权利要求1，获得的产物既为类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽突变体。