CN1006903B - 白细胞介素-2的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产白细胞介素-2改进的方法，该方法通过在培养基上培养能生产白细胞介素-2的大肠杆菌转化体，然后将其接种到pH4.8到6.0的培养基中，并在此pH范围内使细菌生长。通过本发明的方法，白细胞介素-2的产率得到可观地改善。

Description

本发明有关一种生产白细胞介素-2的方法。

白细胞介素-2[以下简称为IL-2，也称为T细胞生长因子（TCGF）]是由凝集素、同种异型抗原等刺激T细胞而产生的一种淋巴因子。（《科学》杂志，193卷，1007页，1976年）

利用IL-2可获得许多克隆，诸如：T杀伤细胞克隆、T辅助细胞克隆和天然杀伤细胞的克隆等等。（《自然》杂志，268卷，154页，1977年）。除了将其直接用于T细胞或天然杀伤细胞的克隆之外，IL-2也可用于抗原特异性的杀伤T细胞的体外增殖。这种抗原特异性的杀伤T细胞能够识别并摧毁诸如肿瘤抗原等特异抗原。还可以通过把这样增殖的肿瘤特异性杀伤T细胞转移至动物，来抑制肿瘤的生长（见《免疫学杂志》，125卷，1904页，1980年）。

这些试验结果意味着应用IL-2作为一种抗肿瘤制剂具有很大的潜力。人们已知，IL-2具有促进缺乏胸腺裸鼠，辅助T细胞恢复的功能（见《欧洲免疫学杂志》，10卷，719页，1980年）;也有促进杀伤T细胞诱导生成辅助T细胞的功能（见《自然》杂志，284卷，278页，1980年）。因此，IL-2可望被用于治疗免疫缺陷性疾病。

从人的T细胞可得到人的IL-2，但其数量极为微小。然而，由于近年来基因重组技术的发展，可以通过培养含有IL-2基因重 组载体的大肠杆菌，得到作为生物活性蛋白的人IL-2。（见《自然》杂志，302.卷，305页，1983年和《核酸研究》，11卷，4307页，1983年）

通常生产人IL-2的方法，由于其产率低，不适合工业应用。在这种情况下，本发明者大量研究了培养能够生产IL-2的大肠杆菌的方法。发现将大肠杆菌培养在PH4.8-6.0的酸性条件下，就能可观地改善IL-2的产率但大肠杆菌的发酵一般是在pH约为6.5-7.5的中性条件下进行的，因为认为大肠杆菌倾向于在中性或微碱性条件下生长（见《生化工程》，东京大学出版，25-26页，1965年）。

基于上述发现，发明者进一步研究得到了本发明的成果。

本发明提供了一种生产白细胞介素-2的方法。就是在培养基中培养能生产白细胞介素-2的大肠杆菌转化体，将其接种到PH4.8-6.0的培养基中，使其在该PH范围内生长。

上面所说能生产IL-2的大肠杆菌具有用基因重组技术得到的IL-2基因。

本发明推荐使用哺乳动物的IL-2基因，可优选人的IL-2基因编码，其氨基酸顺序如图1所示（含1-133个氨基酸）。其中该基因的碱基顺序（密码1-133）示在图2。

还包括为下述一些其生理活性与IL-2相似的肽编码的DNA：一个其氨基酸顺序如图1所示的DNA，其中半胱氨酸密码（如：125位半胱氨酸）被丝氨酸或苏氨酸密码所替换;另一个具有与IL-2相同的氨基酸顺序的DNA，但其N端的四个氨基酸编码的片段被除去。（见日本专利公告126088/1985）。

上述基因（DNA）必须有一个启动子或多个上游启动子。可用的启动子包括色氨酸（trp）启动子，乳糖（Lac）启动子，蛋白链延长因子Tu（tuf    B）启动子和rec    A启动子等等。本发明优选使用的是色氨酸启动子。

上面提及的基因和启动子一般转化到一个质粒中作为转化载体，最常用的是pBR    322。它是质粒Col    El的衍生体（见《基因》，2卷，95页，1977年）。但也可用其它质粒，只要它们在大肠杆菌细胞中能复制、保留便可。例如：pBR    313（见《基因》，2卷，75页，1977年）;pBR    324和pBR    325（见《基因》，4卷，121页，1978年）;pBR327和pBR328（见《基因》，9卷，287页，1980年）;pKY    2289（见《基因》，3卷，1页，1978年）;pKY    2700（见《生物化学》，52卷，770页，1980年）;pACYC    177和pACYC    184（见《细菌学杂志》，134卷，1141页，1978年）;以及pRK    248    pRK    646和pDF    41（见《酶学方法》，68卷，268页，1979年）。

作为表达载体的有：属于λgt系统的λgt·λc噬菌体、（《美国科学院学报》，71卷，4579页，1974年）λgt·λB噬菌体、（同上，72卷，3416页，1975年）λDam噬菌体（见《基因》，第1卷，255页，1977年）;卡龙载体（《科学》，196卷，161页，1977年和《病毒学杂志》，29卷，555页，1979年）和丝状噬菌体。

上述的表达载体可用常规的方法组建（见《自然》，302卷，305页，1983年和《核酸研究》，11卷，4307页，1983年）。

用大肠杆菌作为宿主细菌，用连接有人IL-2基因的表达载体进行转化。大肠杆菌K-12菌株的衍生体，从操作和安全角度看， 是特别好的。例如：大肠杆菌菌株PR13，C-4，294，DH1，W    3110和C600使用结果都很好。

大肠杆菌C-4是一个从PR13分离出的菌株（见《细菌学杂志》，97卷，1522页，1969年），它是K-12（母本菌株）的衍生体。它具有下列细菌学特征：

a）显微特征

1）形状和大小：像正常大肠杆菌K-12菌株一样，是单杆菌或双杆菌，0.5-1.0×2-5μm，不显示多态性。

2）运动性：可运动。

3）鞭毛：具周生鞭毛。

4）革兰氏染色：阴性。

5）孢子形成：无。

6）耐酸性：不耐酸

b）在不同培养基中的生长状态

1）肉汤琼脂平皿培养：菌落小，扁平，环状，半透明并有光泽。

2）肉汤琼脂斜面培养：菌落中等大小，扁平，半透明并稍有光泽。

3）肉汤液体培养：生长中等，生成均一悬液。

4）肉汤明胶穿刺培养：生长成均一的弥散状态，没有导致明胶液化。

5）石蕊乳：不被凝结或胨化，PH值也未改变。

c）生理学特性

1）硝酸盐还原：阳性

2）反硝化作用：阴性

3）MR试验：阳性

4）VP试验：阴性

5）吲哚产生：阳性

6）硫化氢产生：阴性

7）淀粉水解：阴性

8）柠檬酸利用：阴性

9）无机氮源利用：

ⅰ）硝酸钠：阳性

ⅱ）硫酸胺：阳性

10）生色性：没发现有水溶性色素产生

11）尿素酶：阴性

12）氧化酶：阴性

13）过氧化氢酶：阴性

14）生长条件：

ⅰ）PH：4.5-10.0

ⅱ）温度：18-47℃

15）在氧中的行为：专性厌氧

16）O-F试验：阳性

17）利用不同糖类产酸及产氧能力：见表1

表1

糖    产酸能力    产氧能力

L-阿拉伯糖    +    +

D-木糖    -    -

D-葡萄糖    +    +

D-甘露糖    +    +

D-果糖    +    +

D-半乳糖    -    -

麦芽糖    -    -

蔗糖    -    -

乳糖    +    +

海藻糖    +    +

D-山梨醇    +    +

D-甘露醇    -    -

肌醇    -    -

甘油    +    +

淀粉    -    -

这个菌株（大肠杆菌C-4）于1985年2月16日被贮存在国际贸易和工业部工业科技署的发酵研究所（FRI），贮存号为FERMP-8101;该保藏物已被转成能布达佩斯条约的保藏菌株即以FERMBP-966保存在FRI;并以IFO-14421保藏在大阪发酵研究所（IFO），贮存在中国的CGMCC，贮存号为CGMCC0085。贮存号86年1月28日。

大肠杆菌294是已知菌株（《美国科学院学报》，73卷，4474页，1976年），已贮存在IFO，贮存号为IFO-14171。

W3110和C600也是已知菌株;它们在1982年第15版的美国ATCC菌株目录第一卷，贮存号分别为ATCC27325和ATCC27324。

1968年《自然》杂志，217卷，1110页，叙述了DH1菌株。

用表达质粒转化宿主大肠杆菌细胞，生产能够制造IL-2的大肠杆菌细胞时，可用《分子生物学杂志》，53卷，159页，1970年;《酶学方法》，68卷，253页，1979年;及《基因》，3卷，279页，1978年所叙述的方法进行转化。

将能够制造出IL-2的大肠杆菌接种到PH4.8-6.0的培养基上，再在该PH范围内培养细菌。较好的PH范围为5.0到5.8，PH5.5时生长最好。

然而，当细菌充分生长后，培养基中的PH会偏移出上述范围而成为更酸的情况。

在培养基制备和灭菌的前、后，可用无机酸或碱来调节PH值。在大肠杆菌培养生长期间，要始终调节PH使其保持在一个特定的范围。由于在细菌培养过程中PH经常要降低，因此，必须加入诸 如氨水、氢氧化钠和碳酸钠等无机碱来调节PH，如果需要也可加入硫酸等无机酸，这些物质中，氨水是优先选用的，因为它也是培养基中氮的来源。

经常用的培养基是补充了葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M-9培养基和M-03培养基。（培养基组分见表2）。然而，不光可用这两种培养基，任何培养基，只要细菌可在其上能产生IL-2，均可应用。对连接有诸如色氨酸启动子等启动子的重组体，可加入诸如3-β-吲哚基丙烯酸等试剂来增加启动子的效率。细菌培养期间，如果需要，也可加入葡萄糖和酪蛋白氨基酸等物质。为优先繁殖重组的大肠杆菌细胞，可根据它们质粒中所含基因的类型，使用它们对其具有抗性的药剂（如：四环素等）。

表2    可用培养基的例子

成分    改良M-9培养基    M-03培养基

葡萄糖    10克/升    10克/升

NaHPO    6克/升    -

KHPO    3克/升    3克/升

NaCl    0.5克/升    0.5克/升

NHCl    1克/升    1克/升

MgSO·7HO    0.34克/升    0.34克/升

酪蛋白氨基酸    10克/升    10克/升

培养温度通常为15到45℃。按下列方式变温可得到较高的产率：保持大约37℃直到生长中期，再降低温度至20～30℃。

通常用搅动来使培养物通气。培养基中以保持氧气约含5%（v/v），或更高的饱和氧浓度为宜，因为这将增加IL-2的产量。若在细菌培养期间，用纯氧结合通气，可能更为有效。

上述方法生产IL-2的量，可用依赖IL-2的细胞系来测定。人所共知，人IL-2促进大鼠和小鼠依赖IL-2细胞的增殖，也促进人依赖IL-2细胞的增殖（见《Immunological    Review》，51卷，257页，1980年）。因此，可用人、大鼠、或小鼠的依赖IL-2的细胞系（《免疫学杂志》，130卷，981-988页，1983年）。

经过相当长的时期，可将小鼠依赖IL-2的细胞系制成特别稳定的亚培养物，从它们可得到具有高度重复性的资料。

在本说明书中，用依赖IL-2的小鼠细胞测定产生IL-2的量。根据该方法，以依赖IL-2的小鼠细胞摄取放射性同位素胸腺嘧啶核苷的多少，作为一种数量的指示（《生化生物物理研究通讯》，109卷，363页，1982年）。

根据不同条件，本发明可用不同方法萃取培养细胞产生的IL-2。例如：1）通过常规方法收集培养的细菌细胞，将其悬在含有盐酸胍的一种蛋白变性剂的缓冲液中，冰冷条件下，搅动悬液，将其离心，得到含IL-2的上清液。2）将收集的培养细胞悬在缓冲液中，用超声波使细胞破裂，用溶菌酶和/或冻融处理后，将所得悬液离心，得到含IL-2的上清液。

可结合使用常规的分离和纯化法从上述上清液中分离IL-2并使之纯化，所用的各种方法如下：基于溶解性的方法，如：盐析和有机溶剂沉淀;主要基于分子量不同的方法，如;透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;基于所带电荷不同的方法，如：离子交换层析;基于特异亲和性，例如：亲和层析;基于疏水性的不同，如：逆相高压液相色谱;基于等电点不同的方法，如：等电点电泳。由于人IL-2蛋白是高度疏水的，疏水性色谱，特别是用逆向型柱，在纯化该蛋白时是明显有效的。

上述纯化的IL-2蛋白可使能够识别并摧毁肿瘤抗原的抗原特异性的杀伤T细胞在体外优先增殖;上述纯化的IL-2蛋白也可使那些能摧毁无抗原敏感性肿瘤的天然杀伤细胞在体外增殖。此外，当这些杀伤T细胞被转移到活体内时，本发明生产的人IL-2就不可避免同时被接种到体内，从而改善了这些细胞的抗肿瘤能力。基于这种原因，上述的IL-2蛋白可用于防止癌变，治疗肿瘤和免疫缺陷性疾病。它可用于诸如：小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪、马、羊、牛和人等温血动物。

当上述IL-2蛋白作防治肿瘤药物时，可以用已知药物载体稀释后口服或以针剂形式肠道外注射，或制成胶囊。此外，它可单独使用或与如前所述增殖的杀伤R细胞或天然杀伤细胞结合使用。

此外，当以上述方式应用时，上述IL-2蛋白与已知天然的人IL-2生物活性特别相似;由于它从IL-2受体上解离常数非常小，因此，即使很低的用量，效果也是令人满意的。

图1表示人IL-2的氨基酸顺序（X表示蛋氨酸或氢）。

图2表示人IL-2基因DNA顺序的一个例子。

下面将用优选的实施例和参考例详述本发明。

下面例子中所述的代表性转化体已登记在国际贸易和工业部的工业科技署的发酵研究所（FRI）和大阪发酵研究所（IFO），贮存号示于下表。

贮存机构    FRI    IFO    CGMCC

转化体    （贮存日期）

大肠杆菌    FERM    IFO-14422    CGMCC0086

C-4/PTF4    BP-967

（1958年2月16日）    （1976年1月28日）

大肠杆菌    FERM    IFO-14299    已知菌株

DH1/PTF4    BP-628

（1984年4月6日）

例1

含人IL-2结构基团的表达质粒pTF4是从大肠杆菌DH1/pTF4（FERM    BP-628）分离出来的（见公开的欧洲专利№.145390），是用Birnboim，H.C.等人的方法（见《核酸研究》，7卷，1513页，1979年）。根据Cohen，S.N.等人的方法用所述质粒转化大肠杆菌PR13（见《美国科学院学报》，69卷，2110页，1972年）。在一个200毫升的锥形瓶中加入50毫升（PH7.0）含1%Bacto-trypfon（Difco    Laboratories    USA），0.5%细菌-酵母膏（Difco），0.5%氯化钠和5毫克/ 升盐酸四环素的培养基，将所得的转化细胞接种到培养基上，然后将其在37℃下培养过夜。再将每个培养液分别接种到内装30毫升培养基的200毫升锥形瓶中，培养基为含1毫克/升盐酸维生素B的改良M-9培养基，将其在37℃培养4小时，再在30℃培养4小时，最后在25℃培养10小时，选择IL-2产率明显高的菌株，即是大肠杆菌C-4/pTF4。

再将所得的大肠杆菌C-4/pTF4细胞接种到一个装有50毫升（PH7.0）培养基的250毫升锥形瓶中，内含1%Bacto-trypton（Difco产品），0.5%细菌-酵母膏（Difco产品），0.5%氯化钠，5毫克/升盐酸四环素，在37℃培养过夜，得到初始培养液。在8个5升容积的发酵罐中分别注入2.5升含1毫克/升维生素B的M-03的培养基;灭菌后，用氨水或5N硫酸将8个罐的培养基的PH分别调至7.5，7.0，6.5，6.0，5.5，5.0，4.8和4.5。用125毫升初始培养液接种到每个发酵罐中，在37℃中培养，以2.5升/分通气和每分钟1300的转速搅动，用氨水或5N硫酸不断调整使各发酵罐保持特定PH值。培养期间当葡萄糖含量降至0.5%时，加入1%葡萄糖和1%酪蛋白氨基酸，继续培养;结果示在表3。PH在4.6-6.0之间的IL-2产率比之在PH7.0（通常采用的PH值）时增加2-5倍。

表3培养时PH对IL-2产率的影响

（在37℃培养）

PH    IL-2产率＊

4.5    15

4.8    240

5.0    400

5.5    520

6.0    330

6.5    150

7.0    100

7.5    50

＊产率表示的是以PH7.0产率为100时的比率。

例2

用与例1相同的方式制备8个不同PH的培养基，将例1得到的初始培养液接种到该培养基上，然后在通气和摇动条件下，以变温培养24小时。即先在37℃下培养;当培养物达到500Klett单位时，降温至30℃;当达到1000Klett单位时降低温度至25℃，连续培养到24小时为止。所得结果示在表4。PH在4.8-6.0之间IL-2产率比在PH7.0，37℃下恒温培养时的IL-2产率增加3-7.5 倍。

表4    培养时PH对IL-2产率的影响

（变温培养）

PH    IL-2产率＊

4.5    10

4.8    300

5.0    530

5.5    750

6.0    510

6.5    180

7.0    130

7.5    60

＊产率表示的是PH7.0，37℃下产率为100时的比率。

例3

用整合有人IL-2结构基因的pTF4作为表达质粒，按照例1的方法，转化大肠杆菌菌株294，DH1，W3110和C600。将得到的转化体接种到与例1相同的初始培养基中，在37℃培养过夜。分别将2.5升含1毫克/升盐酸维生素B的M-9培养基注入8个容积为5升的发酵罐中，将4个发酵罐中培养基的PH调至5.5，剩余4个调至6.5。每罐均用125毫升的初始转化体培养液接种，在例

2的同样条件下培养，结果示在表5。

表5    PH对不同转化体中IL-2产率的影响。

转化体（大肠杆菌）    PH6.5    PH5.5

294/PTF4    100    200

DH1/PTF4    100    260

W3110/PTF4    100    310

C600/PTF4    100    280

在所有转化体中，PH5.5时的IL-2产率均比PH6.5时增加2倍以上。

例4

如例1制备8个不同PH的培养基，在与例2相同的温度条件下，用每种培养基连续培养24小时，培养期间用5N    NaOH水溶液或5N硫酸保持特定PH值恒定不变。结果示在表6。PH4.8-6.0时IL-2的产率比PH7.0时增加5-7倍。

表6    PH对IL-2产率的影响

（PH用NaOH调节，保持恒定）

PH    IL-2产率＊

4.5    20

4.8    275

5.0    560

5.5    725

6.0    530

6.5    210

7.0    100

7.5    35

＊产率是以PH7.0为100时的比率。

例5

将例2中得到的每种培养液（PH5.5或7.0）离心，收集细菌细胞，然后在-80℃冷冻。取每种冷冻细胞12克，将其均匀地悬浮在100毫升内含7M盐酸胍和0.1M    Tris-HCl（PH7.0）的萃取液中，在4℃摇动1小时。然后将得到的每种溶胞液以28000xg离心20分钟，得到上清液。将每个上清液用0.01M    Tris-HCl缓冲液（PH8.5）透析，然后以19000xg离心10分钟，得到透析上

清液。再将其过一个用0.01M    Tris-HCl缓冲液（PH8.5）平衡的DE52柱（DEAE纤维素为英国Whatman公司产品），柱料将蛋白吸附;然后用一个线性NaCl浓度梯度（0-0.15M    NaCl，1升）洗脱IL-2。用一个YM-5膜（来自Amicon    Co.，USA）将每个活性部分浓缩到大约5毫升，然后在一个用0.1M    Tris-HCl（PH8.0）-1M    NaCl缓冲液平衡的Sephacryl    S-200（瑞典，Pharmacia公司产品）柱（500毫升容积）上，凝胶过滤。用一个超微孔RPSC柱（Altex    Co.，USA产品）吸附上述浓缩液，再将其进高压液相色谱柱，用三氟乙酸-乙腈系统洗脱。

要维持下列条件：

柱：超微孔RPSC（4.6×75mm）

柱温：30℃

洗脱液A：0.1%三氟乙酸-99.9%水

洗脱液B：0.1%三氟乙酸-99.9%乙腈

洗脱程序：0-25分钟用68%A+32%B

25-35分钟用55%A+45%B

35-45分钟用45%A+55%B

45-48分钟用30%A+70%B

48分钟后用100%B

洗脱速率：0.8毫升/分

观测波长：230纳米

将洗脱大约39分钟得到的一个活性部分收集，冷冻干燥，得到白色粉末状的人IL-2蛋白。

从在PH7.0培养的细菌得到IL-2蛋白5.2毫克，而在PH5.5培养时，得到12.7毫克。两种情况蛋白纯度均为99%（用密度计测定）。两种情况下得到的蛋白，化学性质没有差别。

参考例

用例1得到的大肠杆菌C-4/pTF4，根据Bouanchaud等人的方法用溴化乙锭去除质粒，得到大肠杆菌C-4菌株（《普通微生物学杂志》，54卷，417页，1968年）。

Claims (8)

1、在培养基中培养能制造白细胞介素-2的大肠杆菌转化体生产白细胞介素-2的方法，其特征在于将这含有DNA上游启动子的大肠杆菌K-12菌株的转化体接种到pH4.8-6.0的培养基中，在通气条件下保持在此pH范围内使细菌生长。

2、根据权利要求1所述的方法，其中的大肠杆菌转化体含有为下面氨基酸顺序的白细胞介素-2的编码DNA：

1

X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

                          20

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met

40

Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu

                            60

Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe

    80

His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val

                                100

Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met

Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

        120

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser

        133

Thr Leu Thr

3、根据权利要求1的方法，其中的启动子是一个色氨酸启动子或多个色氨酸启动子。

4、根据权利要求1的方法，其中的pH值为5.0到5.8。

5、根据权利要求1的方法，其中培养基的pH值是用无机碱作为碱性物质调节的。

6、根据权利要求5的方法，其中的无机碱是氨水。

7、根据权利要求1的方法，其中的培养基为加葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M-9培养基（即改良的M-9培养基）。

8、根据权利要求1的方法，其中培养开始是在大约37℃下进行的，到生长中期将温度降至20到30℃。