CN1267450C - 新型人肿瘤坏死因子突变蛋白及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类新的低毒的人肿瘤坏死因子突变蛋白及其制法，编码该突变蛋白的编码序列，含有编码序列的表达载体和转化的宿主细胞，以及含有该新型人肿瘤坏死因子突变蛋白的药物组合物。该新型人肿瘤坏死因子TNFα具有Arg32Trp/Leu157Phe突变。该新型突变蛋白的毒性有显著下降，而对人肿瘤细胞的杀伤效价却相当于或优于野生型蛋白。

Description

新型人肿瘤坏死因子突变蛋白及其制法和用途

本发明涉及基因工程、蛋白工程和疾病治疗领域，更具体地，涉及新的低毒的人肿瘤坏死因子突变蛋白及其制法，编码该突变蛋白的编码序列，含有编码序列的表达载体和转化的宿主细胞，以及含有该新型人肿瘤坏死因子突变蛋白的药物组合物。

人肿瘤坏死因子TNFα主要是由巨噬一单核细胞群产生的，可为卡介苗、内毒素等诱导产生；某些肿瘤细胞如人前髓白血病细胞HL-60在佛波醇酯诱导下，向巨噬细胞方向分化，也可产生TNFα.1984年，Pennica等(Pennica D，et al，Nature 1984；312：724)首先克隆了人TNFα基因cDNA，并推导出人TNFα分子由157个氨基酸组成，其中69和101位的两个半胱氨酸在TNFα的活性状态下形成一个二硫键，其分子量约为17KD。与此同时，M.Ikehara等(Ikehara M.et al，Proc Natl Ac ad Sci U.S.A.，1984；81：5956；Ikehara M.et al，Chem Pharm Bull，1988；36(1)：291)也克隆了人TNFα基因cDNA。

国内外应用重组人TNFα临床试用的结果表明，该因子对多种恶性肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，许多患者经过治疗后肿瘤缩小甚至消失，病人病情缓解，生活质量改善，生存期延长，显示出重组人TNFα良好的抗肿瘤作用效果。但在实际应用过程中，亦发现重组人TNFα具有十分明显的毒副反应如发热、寒战、低血压、体重下降等，故而限制了重组人TNFα的临床推广应用。

对人肿瘤坏死因子(hTNF-α)的研究表明，其最显著的特征是可以在体外或体内特异性杀伤多种肿瘤细胞而对正常组织细胞无明显毒副作用(WiedenmannB.，Reichardt P.，Rath U.et al.，“Phase-I trial of intravenous continuous infusion oftumor necrosis factor in advanced metastatic carcinomas”，J.CancerRes.Clin.Oncol.，1989，115(2)：189-192；Hersh E.M.，Metch B.S.，Muggia F.M.et al.，“Phase II studies of recombinant human tumor necrosis factor alpha in patients withmalignant disease：A summary of southwest oncology group experience”，J.Immunother.，1991，10(6)：426-431.).但由于在实际应用中，hTNF-α的毒副作用较大，因而限制了它的临床使用(Old L.J.，Tumor Necrosis Factor：Structure，Mechanismof Action，Role in Disease and Therapy，1990，1-30，Karger，Pasel.)。

为此，众多研究人员都试图通过蛋白质工程的方法进行基因改造，以期得到高效、低毒的新型人肿瘤坏死因子。

Yamagishi等提出维持hTNF-α活力所必需的4个区域：I、30-32位氨基酸；II、82-89位氨基酸；III、115-117位氨基酸；IV、141-146位氨基酸(Yamagishi J.，Kawashima H.，Matsuo N.，et al.，Mutational analysis of structure-activityrelationships in human tumor necrosis factor-alpha，Protein Engng，1990，3(8)：713-719.)。

此外，南京大学白晨等发现68-73位这一区域缺失可降低hTNF-α的生物学活性和可溶性(Cen B.，Jin W.，Wu H.et al.，Glycine68 to histidine73 has an importantrole in the function of human tumor necrosis factor alpha，Biochem Mol Biolint.，1997，43(1)：47-52.)。

据报导，30位天冬酰胺变为异亮氨酸后活力严重丧失(Yamagishi J.等人，1990，同上)。32位精氨酸变为缬氨酸后活力仅存一半，而变为色氨酸后活力较野生型下降两个数量级(Van Ostade X.，Taverniev J.，Prange T.et al.，Localization ofthe active site of human tumor necrosis factor(hTNF)by mutational analysis，EMBOJ.，1991，10(4)：827-836.).Van Ostade等人的研究还发现，84位丙氨酸置换为其它氨基酸后活力下降严重，当变为缬氨酸后活力完全丧失；而86位氨基酸改变也对活力影响很大。此外，hTNF-α的C端氨基酸置换对活力影响较大，尤其当157位亮氨酸变为苯丙氨酸后活力较野生型升高5倍(Van Ostade X.，1991，同上)。

除此之外，将2位精氨酸变为赖氨酸后可使活性提高两倍(高长寿，毛申兰，俞璎等，一种新型高效、低毒的人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达，生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：49-55)。

hTNF-α的两种受体R55、R75主要介导不同的生物学功能，R55主要介导细胞毒活性，而R75主要介导体内毒性(Louis A.，Tartaglia L.A.，David V.et al.，Two TNF Receptors，Immun.Today，1992，13(5)：151-153；Kamijo R.，TakedaK.，Nagumo M.et al.，Induction of differentiation of human monoblastic andmyeloblastic leukemin cell lines by TNF mutants，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，160(2)：820-827.)。1993年Van Ostade等人首次在《Nature》上报导，将29位亮氨酸变为丝氨酸、32位精氨酸变为色氨酸后，对小鼠成纤维瘤细胞的杀伤活性明显下降，而与R55受体的亲和力和野生型相差不多，和R75受体的亲和力也有所下降(Loetscher H.，Steinmetz M.，LesslauerW.，Tumor necrosis factor：receptors and inhibitors，Cancer Cells，1991，3(2)：221-226)。自此，从与受体相互作用的角度出发研究hTNF-α突变蛋白的报导越来越多。

Van Ostade等人报导将29位、32位分别置换成另外8个氨基酸后，与R55、R75的结合力均下降(Van Ostade X.，Vandenabeele P.，Everaerdt B.et al.，Human TNFmutants with selective activity on the R55 receptor，Nature，1993，361(2)：166-169.)。而当86位丝氨酸变为苏氨酸，它与R55受体的结合和野生型一致，但与R75的结合却下降许多。143位天冬氨酸分别变为酪氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺后，与R55的亲和力比与R75的亲和力下降更加严重(Van Ostade X.，VandenabeeleP.，Tavernier J.et al.Human tumor necrosis factor mutants with preferential binding toand activity on either the R55 or R75 rceptor，Eur J Biochem，1994，220(3)：771-779.；Loetscher H.，Stueber D.，Banner D.et al.，Human tumor necrosis factor alpha(TNFalpha)mutants with exclusive specificity for the 55-Kda or 75-Kda receptors，JBiol.Chem.，1993，268：26350-26357.)。146位谷氨酸变为精氨酸后与R75受体几乎不结合而与R55受体的结合能力比野生型下降一半。

综上所述，虽然已经对人肿瘤坏死因子TNFα结构及其在各种突变情况进行了广泛的研究，但是，本领域仍需要开发新型的低毒和/或高效的人肿瘤坏死因子TNFα以用于临床。

本发明的目的就是克服已有技术中的上述缺点，提供一种在低毒和/或高效的人肿瘤坏死因子TNFα，从而促进其在临床上的应用。

在本发明的第一个方面，提供了一种低毒和/或高效的人肿瘤坏死因子突变蛋白，该蛋白含有Arg32Trp/Leu157Phe突变，较佳地，该突变蛋白还可含有Arg2Lys/Asn30Ser突变；最佳地，该突变蛋白具有SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二个方面，提供了编码该新型人肿瘤坏死因子突变蛋白的DNA序列。

在本发明的第三个方面，提供了含有上述DNA序列的载体和相应的被转化的宿主细胞。

在本发明的第四个方面，提供了一种生产上述的人肿瘤坏死因子突变蛋白的方法，该方法包括步骤：

(a)将编码人肿瘤坏死因子TNFα突变蛋白的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成人肿瘤坏死因子突变蛋白表达载体，其中该人肿瘤坏死因子突变蛋白含有Arg32Trp/Leu157Phe突变，较佳地，该突变蛋白还可含有Arg2Lys/Asn30Ser突变；最佳地，该突变蛋白具有SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列；

(b)将步骤(a)中的表达载体转化人宿主细胞；

(c)在适合表达该人肿瘤坏死因子突变蛋白的条件下进行培养，从而表达出该人肿瘤坏死因子突变蛋白；

(d)分离纯化出该人肿瘤坏死因子突变蛋白。

在本发明的第五个方面，提供该新型人肿瘤坏死因子突变蛋白的用途以及含有该新型人肿瘤坏死因子突变蛋白的药物组合物，该组合物含有有效量的本发明的人肿瘤坏死因子突变蛋白以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在本发明中，“肿瘤坏死因子TNFα”通常意指人肿瘤坏死因子TNFα，但是也可指那么来源于鼠、猪、马或牛的肿瘤坏死因子TNFα。较佳地，是人肿瘤坏死因子TNFα。此外，肿瘤坏死因子TNFα可以是具有天然野生型序列的TNFα，也可以是具有突变序列(相对野生型序列而言)的衍生型或重组的TNFα，只要该突变序列不包括Arg32Trp/Leu157Phe突变。天然的野生型的人肿瘤坏死因子TNFα的氨基酸序列示于SEQ ID No.3中

在本文中，“Arg32Trp/Leu157Phe”表示，相对于天然的野生型序列而言，第32位的精氨酸(Arg)被突变为色氨酸(Trp)，而第157位的亮氨酸(Leu)被突变为(Phe)。然而，应理解，“Arg32Trp/Leu157Phe”等同于“32Trp/157Phe”，即无论第32位是否精氨酸和/或第157位是否是亮氨酸，只要突变后分别为色氨酸和苯丙氨酸，都可用“Arg32Trp/Leu157Phe”或“32Trp/157Phe”表示。对于第2和30位突变的描述与此类推。

本发明的新型突变蛋白可以这样进行制备：根据已公开的人肿瘤坏死因子的序列来合成引物，通过PCR法扩增出人肿瘤坏死因子的编码序列。例如，根据李昌本等，中国科学(B辑)，1991，6：497中所述的方法，构建天然hTNFα基因。也可以人工合成人TNFα的编码序列。此外，可以对编码序列进行碱基替换，以利于高表达(例如为了在大肠杆菌中表达，可以用编码相同氨基酸的大肠杆菌优选密码子替换天然密码子)。然后，以人肿瘤坏死因子的DNA序列，按本发明中指出的突变形式进行遗传修饰，进行遗传修饰的技术是本领域中已知的，例如可参见“Mutagenesis：a Practical Approach”，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，其中例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。

在获得了定点突变后的编码本发明新突变蛋白的DNA序列之后，将其连人合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的突变蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新突变蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌。

本发明人经过多年研究，将2Lys、30Ser、32Trp、157Phe等各种突变形式及其组合引入人肿瘤坏死因子中，并以hTNF-β与其受体相互作用的空间模型为基础，利用SGI蛋白质图象工作站建立了hTNF-α与其受体(R55和R75受体)相互结合的模型并进行了广泛而深入的研究。在本发明之前的研究表明，将32位精氨酸突变为色氨酸后，会导致人肿瘤坏死因子TNFα杀伤活性的显著下降(Van Ostade，X.，1991，同上)。然而，本发明人意外发现，即将人肿瘤坏死因子hTNF-α的32位精氨酸和157位亮氨酸同时分别突变为32位色氨酸和157位苯丙氨酸后(换言之，即引人Arg32Trp/Leu157Phe突变)，可使人肿瘤坏死因子TNFα的毒性大幅下降，同时人肿瘤坏死因子TNFα的对人肿瘤细胞的杀伤活性并不下降。

导致毒性下降的确切机理还不十分清楚。根据本发明的发明人对TNF结构和功能的相互关系的详细分析，很可能是因为hTNF-α的32位精氨酸→色氨酸后，它与两种受体相互作用的结果与野生型相比，保留了与R55的结合而与R75的结合下降。具体而言，hTNF-α主要以三体形式与受体相结合，每个受体结合在两个TNF分子之间的凹槽内。C端157位变为Phe由于其疏水性增加使TNF三体形式稳定，从而提高其生物学活性。

此外，本发明的发明人根据hTNF-α三体的空间结构研究发现，30位天冬酰胺虽然不参与与两种受体的结合，但30位天冬酰胺变为丝氨酸后可使hTNF-α三体结合更紧密，从而增加三体的稳定性。因此，为了进一步改良人肿瘤坏死因子TNFα，可以再引入Asn30Ser突变。此外，研究表明，hTNF-αN端碱性氨基酸增加可提高其活性(其具体机制尚无法解释)，例如将2位精氨酸变为赖氨酸后可使活性提高两倍。

在本发明中，本发明人利用Over-Lap PCR的方法构建了新型人肿瘤坏死因子TNFα的突变蛋白。根据对突变蛋白性质进行了测定，发现它们能高效杀伤人肿瘤细胞且急性毒性实验的LD50比野生型下降许多。

本发明的新型突变蛋白，有利于人们进一步弄清TNF的作用机理，以及用基因工程方法对TNF分子进行修饰改造，定位出具有独特活性的功能区。此外，由于本发明新型突变蛋白提高了TNF的抗肿瘤活性和降低了毒副作用，因此无疑将会为TNF的抗肿瘤临床治疗提供广阔前景。

此外，在本发明的新型人TNFα突变蛋白基础上，通过在其他位点上的进一步诱变，还产生活性更高和/或毒性更低的人肿瘤坏死因子突变蛋白。

在本发明的一个实施例中，对人TNFα第32位和157位进行了突变，从而形成了具有Arg32Trp/Leu157Phe突变的突变蛋白，该突变蛋白被命名为MTNF1(简称为M1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一个实施例中，还对人TNFα的第2和32位进行了突变，从而形成了具有Arg2Lys/Asn30Ser/Arg32Trp/Leu157Phe突变的突变蛋白，该突变蛋白被命名为MTNF2(简称为M2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的药物组合物包括有效量的一种或几种本发明的新型TNFα突变蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

该药物组合物可根据待治疗的疾病并以对病人有益的剂量(取决于体重和其他考虑因素)进行施用，这可以由医务人员确定。

在所附的附图中，

图1显示了本发明新型人肿瘤坏死因子突变蛋白M1和M2表达质粒的构建示意图。

图2是Over-Lap PCR产物的1.5％琼脂糖电泳图。其中，泳道1，突变基因M1；泳道2，突变基因M2；泳道3，分子量标记(pGEM7Zf(+)DNA/HaeIII)。

图3是各突变蛋白基因表达质粒的EcoRI/BamHI酶切鉴定图谱。其中泳道1，分子量标记物(pGEM7Zf(+)DNA/HaeIII)；泳道2，表达质粒pSB-MTNF1的EcoRI+BamHI酶切结果；泳道3，表达质粒pSB-MTNF2的EcoRI+BamHI酶切结果；泳道4，表达载体pSB-92的EcoRI+BamHI酶切结果。

图4显示了各突变蛋白基因表达质粒在大肠杆菌中的高效表达后的相应的Western-Blot结果。其中泳道1，突变基因M1诱导表达4小时；泳道2，突变基因M2诱导表达4小时；泳道3，野生型基因hTNF-α诱导表达4小时；泳道4，蛋白分子量标准；泳道5，野生型基因hTNF-α的蛋白印渍结果；泳道6，突变基因M2的蛋白印渍结果；泳道7，突变基因M1的蛋白印渍结果。

图5是纯化后各突变蛋白的SDS-PAGE结果。其中，泳道1，M1；泳道2，M2；泳道3，hTNF-α；泳道4，蛋白分子量标准。

图6显示了质粒PSB-92的全序列。

图7是天然人TNFα的氨基酸序列图。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

一.材料：

表达载体pSB-92：全序列见图6。

表达质粒pSB-TR：含有人TNFα基因的表达载体pSB92。

pSB-TK：含有突变的人TNFα基因的表达载体pSB92，其中，2位的精氨酸突变为赖氨酸(高长寿，毛申兰，俞璎等，一种新型高效、低毒的人肿瘤坏死因子突变蛋白在大肠杆菌中的高效表达，生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：49-55)

pUC-19质粒购自华美生物工程公司。

大肠杆菌YK537(supE44hsdRhsdMrecAlpho48LeuB6thilacYrpsL20galK2ara-14xyl-5mtl-1)及JM109(recAlsupE44endAlhsdR17gyrA96relAlthiΔ(1acproAB)F′[traD36proAB⁺lacI^qlaeZ ΔMl5])购自中国科学院菌种保藏中心。

各种限制性内切酶、T₄DNA连接酶和Taq DNA聚合酶分别购自BiorhingerMannheim公司和Promega公司。

DNA测序仪为美国ABI自动测序仪测定。

Hep-2等各种人肿瘤细胞株由第二军医大学焦炳华教授惠赠。

鼠抗hTNF-α抗血清购自第四军医大学免疫实验室。

二、方法

(1)表达产物的生物学活性测定

用0.25％的胰酶消化处于对数生长期的L929细胞，调整细胞浓度至2-2.5×10⁵/ml，加入96孔培养板中；每孔100ul孵育18小时，加入系列稀释的TNF样品，继续孵育18小时，稀释用液为含放线菌素D 2ug/ml(放线菌素D为Sigma公司产品)，5％NCS的RPMI1640，每个稀释度作3个重复孔，同时设空白对照，细胞对照，放线菌素D对照，样品效价定为造成50％细胞存活的对应稀释倍数。

(2)Western Blot

将诱导后的表达产物经SDS-PAGE分离，再电转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的PBS(pH7.2)37℃封闭1小时，加鼠抗hTNF-α杂交瘤腹水(1∶1000稀释)室温反应2小时，用PBS洗3次，加羊抗鼠IgG-HRP(1∶1000稀释)反应1小时后，加人底物二氨基联苯胺，显色。

(3)hTNF-α突变蛋白对人肿瘤细胞杀伤作用的测定

用0.25％的胰酶消化处于对数生长期的人肿瘤细胞，调整细胞浓度至4×10⁵/ml，加入96孔培养板中，每孔100ul，37℃培养箱中孵育24小时，用含30-50ug/ml的放线菌素酮、5％NCS的RPMI1640培养基稀释TNF样品，然后加入铺好的细胞板中，37℃培养箱放置24小时，结晶紫染色，在595nm波长用酶标仪测OD值，以样品稀释倍数为横坐标，OD值为纵坐标作出肿瘤细胞的纯活曲线，同时设空白对照，细胞对照，放D对照，样品对人肿瘤细胞杀伤效价定为造成50％细胞存活的对应稀释倍数。

(4)hTNF-α突变蛋白LD50的测定

每组随机取昆明种小鼠6只，雌雄各半，体重18-22g(由天津药物研究院动物室提供，动物合格证：津实动设施准第001号)，静脉一次推注不同剂量的蛋白样品，0.4ml/20g体重，以Bliss法求每个样品的LD50。

实施例1

构建表达载体pSB-TR(含天然hTNF-α基因)、pSB-TK(含hTNF-DK2基因)

根据天然人TNFα的氨基酸序列，人工合成SEQ ID NO：4所示的编码序列，然后。然后将该人TNFα基因hTNF-TR克隆人表达载体pSB-92(全序列见图6)的EcoRI和BamHI位点之间，获得表达质粒pSB-TR，即含有编码天然人TNFα的编码序列SEQ ID NO：4的表达载体pSB92。

再根据根据高长寿等，“一种新型高效、低毒的人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达”，生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：49-55中所述的方法，将天然人TNFα的第2位的精氨酸密码子突变为赖氨酸密码子，获得SEQ ID NO：5所示的编码序列hTNF-TK。将hTNF-TK基因克隆人表达载体pSB-92(全序列见图6)的EcoRI和BamHI位点之间，获得质粒pSB-TK，即含有Arg2Lys突变的人TNFα基因的表达载体pSB92。

实施例2

构建表达hTNF-α突变蛋白M1和M2的表达载体和工程菌

在实施例1中已构建的表达质粒pSB-TR(含天然hTNF-α基因)、pSB-TK含hTNF-DK2基因)基础上，构建表达hTNF-α突变蛋白M1和M2的表达载体。

(1)设计并合成如下引物：

1号：为载体pSB-92的一段序列(上游引物)

5′-GATACGAAACGAAGCATTGGTTAA-3′

2号：将32位精氨酸变为色氨酸(Over-Lap PCR下游引物)

5′-AGAGCGTTAGCCCAACGGTTC-3′

3号：将32位精氨酸变为色氨酸(Over-Lap PCR上游引物)

5′-GAACCGTTGGGCTAACGCTCA-3′

4号：将30位天冬酰胺变为丝氨酸，32位精氨酸变为色氨酸(Over-Lap PCR下游引物)

5′-A GCGTTAGCCCAACGGGACAGCCATTG-3′

5号：将30位天冬酰胺变为丝氨酸，32位精氨酸变为色氨酸(Over-Lap PCR上游引物)

5′-CAATGGCTGTCCCGTTGGGCTAACGCT-3′

6号：将157位亮氨酸变为苯丙氨酸(下游引物)

5′-TCAACTTAGCGATAATACCGAA-3′

(2)常规PCR

在100ul反应体系中加入模板100ng，两个引物各50pmol，经95℃变性5分钟进人循环，循环的温度为94℃40秒，52℃50秒72℃1分钟，共35个循环，然后72℃10分钟。

(3)Over-Lap PCR

参见图1，以pSB-TR为模板，将引物1号和Over-lap PCR下游引物2号的扩增片段Ia以及和Over-lap PCR上游引物3号和6号的扩增片段Ib混匀后，94℃变性5分钟然后自然冷却至30℃，加入Taq酶和dNTPs37℃30分钟，再加入引物1号、6号进行上述常规PCR扩增，得到480bp大小的扩增片段I。

参见图1，以pSB-TK为模板，将引物1号和Over-lap PCR下游引物4号的扩增片段IIa以及和Over-lap PCR上游引物5号和6号的扩增片段IIb混匀后，重复上述过程即得480bp大小的扩增片段II。

(4)突变基因表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达：

参见图1，将约480bp大小的PCR产物(扩增片段I或II)经EcoRI和BamHI双酶切后插入经同样酶切的pSB-92表达载体中，转化大肠杆菌YK537。筛选含插入片段的转化子，从而得到了突变基因的表达质粒pSB-MTNF1和pSB-MTNF2(图1)。各表达质粒经EcoRI和BamHI酶切后均能切出480bp大小的片段(图3)，将该片段插入Puc-19中抽提双链DNA，在美国ABI公司的自动测序仪上进行测序，其结果与预期的一致(结果未示)。

从转化的、分别含有表达质粒pSB-MTNF1和pSB-MTNF2的大肠杆菌YK537中，分别分离出表达质粒pSB-MTNF1和pSB-MTNF2，再分别转化大肠杆菌BL21，从而得到转化的工程菌。其中用表达质粒pSB-MTNF2转化的大肠杆菌BL21而得到的工程菌被命名为大肠杆菌BL21/pSB-T4；其中用表达质粒pSB-MTNF1转化的大肠杆菌BL21而得到的工程菌被命名为大肠杆菌BL21/pSB-T2。

表达人肿瘤坏死因子TNFα的突变蛋白M2的大肠杆菌BL21/pSB-T4于1999年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC(中国，武汉)，保藏号为CCTCC M99004。

实施例3

hTNF-α突变蛋白表达质粒在大肠杆菌中的高效表达和蛋白印渍法检测

在表达时，挑取单菌落在LB培养液中30℃过夜培养后，按1∶50比例接人2×YT中，30℃剧烈振荡培养2小时，42℃诱导候继续培养4小时，收集菌体。

将收集的菌体破碎后，菌体裂解液经SDS-PAGE后，通过电印渍转移到硝酸纤维素膜上，后与鼠抗hTNF-α单抗腹水和二抗羊抗鼠IgG-HRP反应后，加入底物二氨基联苯胺，结果各突变蛋白均能与抗野生型单抗结合，和野生型TNF在同一位置显色(图4)。

从被表达质粒pSB-MTNF1和pSB-MTNF2转化的大肠杆菌YK537，挑取单克隆生长到对数生长期时经温度诱导，诱导表达后表达菌体进行15％SDS-PAGE，经考马斯亮兰染色后，均出现一条17KD大小的条带(图4)，经激光灰度扫描各突变蛋白表达量均占菌体总蛋白的50％以上，和野生型相比，各突变蛋白在大肠杆菌中同样得到了高效表达。

实施例4

人TNFα突变蛋白M1和M2表达产物的分离纯化

诱导表达后的菌体经超声破碎后，根据如下纯化方法进行纯化：取超声破碎后的离心上清40-60％的硫酸铵组分经DEAE-Sepharose FF，收集TNF峰，经CM-Sepharose FF进一步纯化，收集TNF峰经硫酸铵沉淀透析除盐后，经Sephacryl-100得到TNF纯品(图5)，经激光灰度扫描纯度在95％以上。

实施例5

人TNFα突变蛋白M1和M2的活性和毒性测定

A、对小鼠成纤维细胞瘤细胞L929的活性

以野生型hTNF-α作对照对其活性进行了测定，其活性分别是：野生型hTNF-α为8.1×10⁶U/mg，MutTNF-1的活性7.94×10²U/mg，MutTNF-2的活性为4.0×10¹U/mg，结果显示突变蛋白M1对小鼠成纤维细胞瘤细胞L929的活性下降了4个数量级，突变蛋白M2的活性几乎完全丧失，说明通过30位Asn→Ser，32位Arg→Tyr的改造使各突变蛋白对L929细胞的杀伤活性严重下降。

B、hTNF-α突变蛋白对各种人肿瘤细胞杀伤作用的测定

分别将人肿瘤细胞：喉癌Hep-2细胞、肝癌HepG-2细胞、胃癌MGC细胞、卵巢癌3AO细胞铺板，然后加入系列稀释的突变蛋白样品(纯度95％以上)，同时以纯化的野生型样品作对照，测得样品对各种人肿瘤细胞的杀伤活性(表1)。由表中得知各突变蛋白虽然对小鼠成纤维瘤细胞L929的活性严重下降，但对几株人肿瘤细胞的杀伤却和野生型差不多，其中M1对肝癌HepG-2细胞的活性比野生型hTNF-α还要高6倍，说明hTNF-α对小鼠肿瘤细胞的结果与对人肿瘤细胞的结果是不平行的，也就是说对L929细胞的生物学活性并不能代表杀伤人肿瘤细胞的结果。

表1.各突变蛋白对四株人肿瘤细胞杀伤活性的测定

样品	Hep-2(U/mg)	HepG-2(U/mg)	MGC(U/mg)	3AO(U/mg)	L929(U/mg)
						hTNF-α	1.64×106	4.31×105	3.49×106	1.19×106	8.10×106
M1	2.26×106	2.53×106	2.96×106	2.26×106	7.94×102
						M2	1.13×106	5.95×105	7.89×105	1.04×106	4.00×101

C、hTNF-α突变蛋白LD50的测定

小鼠静脉一次推注不同剂量的突变蛋白M1、M2，同时以野生型hTNF-α作对照，以Bliss法求得各突变蛋白的LD50值(表2)，突变蛋白M2由于受样品浓度限制无法求得LD50值，但根据预实验结果可知对小鼠30％致死剂量为107mg/kg。结果显示突变蛋白M1的LD50比野生型下降了300倍而M2对小鼠30％致死剂量则比野生型的LD50下降了700倍，至于小鼠在注射MTNF-1后出现的性别死亡差异还有待于进一步研究。

            表2.各突变蛋白LD50值的测定

样品	LD50值(ug/kg)	小鼠死亡情况
			野生型hTNF-α	153.9	发生在静脉注射后24小时内
M1	45440	发生在给药后第二天，且各组雌鼠死亡率高于雄鼠
			M2	＞107000	发生在给药后第二天

结果讨论

本发明的TNFα突变蛋白能高效杀伤人肿瘤细胞且急性毒性实验的LD50比野生型下降许多，但对鼠成纤维瘤细胞L929的生物学活性几乎丧失。具体而言，突变蛋白M1在增加了157位氨基酸突变后对L929活性比野生型下降四个数量级，但对人喉癌细胞Hep-2的活性与单32位突变蛋白一致均与野生型相差不多；突变蛋白M2在增加N端2位、30位突变后对L929活性较野生型下降五个数量级但依然保持了对肿瘤细胞的杀伤活性。最出人意料的是，突变蛋白M1、M2的LD50结果显示它们具有极低的毒性，其中M2的毒性比M1还要低。

这一实验结果与以往报导的蛋白质工程改造TNF突变蛋白的结果有所不同。国际上规定以小鼠成纤维瘤细胞L929为细胞模型测定hTNF-α的生物学活性，在测得M1和M2这两种hTNF-α突变蛋白的活性时，发现它们对L929细胞的结果与对人肿瘤细胞的结果是不平行的。这说明单以鼠L929细胞测定hTNF-α的生物学活性有一定的局限性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                   序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：中国科学院上海生物工程研究中心

(ii)发明名称：新型人肿瘤坏死因子突变蛋白及其制法和用途

(iii)序列数目：5

(2)SEQ ID NO.1的信息

 (i)序列特征：

  (A)长度：157氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：多肽

 (ix)序列描述：SEQ ID NO.1：

    Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 16

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala 33

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val 50

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln 67

Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 84

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys 101

Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile 118

Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 135

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe 152

Gly Ile Ile Ala Phe                                                  157

(2)SEQ ID NO.2的信息

 (i)序列特征：

  (A)长度：157氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：多肽

 (ix)序列描述：SEQ ID NO.2：

    Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 16

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ser Arg Trp Ala 33

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val 50

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln 67

Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 84

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys 101

Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile l18

Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 135

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe l52

Gly Ile Ile Ala Phe                                                 l57

(2)SEQ ID NO.3的信息

 (i)序列特征：

  (A)长度：157氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：多肽

 (ix)序列描述：SEQ ID NO.3：

    Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 16

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala 33

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val 50

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln 67

Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 84

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys 101

Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile 118

Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 135

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe 152

Gly Ile Ile Ala Leu                                                 157

(2)SEQ ID NO.4的信息

 (i)序列特征：

  (A)长度：471bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：核苷酸

 (ix)序列描述：SEQ ID NO.4：

    GTA AGA TCT AGC TCT CGC ACT CCA TCT GAC AAA CCA GTT GCT CAT GTT 48

GTT GCT AAC CCA CAG GCT GAA GGT CAG CTG CAA TGG CTG AAC CGT CGT GCT 99

AAC GCT CTG CTG GCT AAC GGT GTT GAA CTG CGT GAC AAC CAG CTT GTG GTA 150

CCG TCT GAA GGT CTG TAC CTG ATC TAC TCC CAG GTT CTT TTC AAA GGT CAG 201

GGT TGC CCA TCT ACA CAC GTT CTG CTT ACC CAC ACT ATC TCT CGT ATT GCT 252

GTT TCC TAC CAG ACT AAA GTT AAC CTG CTG TCT GCG ATC AAA TCT CCG TGC 303

CAG CGT GAA ACC CCA GAA GGT GCT GAA GCT AAA CCA TGG TAT GAA CCG ATT 354

TAC CTT GGT GGT GTT TTC CAA CTG GAG AAG GGT GAC CGT CTG TCT GCT GAA 405

ATC AAC CGT CCA GAC TAC CTT GAC TTC GCT GAA TCT GGT CAG GTA TAC TTC 456

GGT ATT ATC GCT CTG                                                 471

(2)SEQ ID NO.5的信息

 (i)序列特征：

  (A)长度：471bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：核苷酸

 (ix)序列描述：SEQ ID NO.5：

    GTA AAA TCT AGC TCT CGC ACT CCA TCT GAC AAA CCA GTT GCT CAT GTT 48

GTT GCT AAC CCA CAG GCT GAA GGT CAG CTG CAA TGG CTG AAC CGT CGT GCT 99

AAC GCT CTG CTG GCT AAC GGT GTT GAA CTG CGT GAC AAC CAG CTT GTG GTA 150

CCG TCT GAA GGT CTG TAC CTG ATC TAC TCC CAG GTT CTT TTC AAA GGT CAG 201

GGT TGC CCA TCT ACA CAC GTT CTG CTT ACC CAC ACT ATC TCT CGT ATT GCT 252

GTT TCC TAC CAG ACT AAA GTT AAC CTG CTG TCT GCG ATC AAA TCT CCG TGC 303

CAG CGT GAA ACC CCA GAA GGT GCT GAA GCT AAA CCA TGG TAT GAA CCG ATT 354

TAC CTT GGT GGT GTT TTC CAA CTG GAG AAG GGT GAC CGT CTG TCT GCT GAA 405

ATC AAC CGT CCA GAC TAC CTT GAC TTC GCT GAA TCT GGT CAG GTA TAC TTC 456

GGT ATT ATC GCT CTG                                                 471

Claims (10)

1.一种人肿瘤坏死因子突变蛋白，其特征在于，它含有Arg32Trp/Leu157Phe突变。

2.如权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白，其特征在于，它还含有Arg2Lys/Asn30Ser突变。

3.如权利要求1或2所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列。

4.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

5.一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白。

6.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的DNA序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的表达载体所转化。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌BL21/pSB-T4CCTCC No.M99004。

9.一种生产权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a)将编码权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成人肿瘤坏死因子突变蛋白表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转化入宿主细胞；

(c)在适合表达该人肿瘤坏死因子突变蛋白的条件下进行培养，从而表达出该人肿瘤坏死因子突变蛋白；

(d)分离纯化出该人肿瘤坏死因子突变蛋白。

10.如权利要求1所述的人肿瘤坏死因子突变蛋白的用途，其特征在于，它被用于制备治疗肿瘤的药物组合物。

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