CN1148449C - 链球菌毒素c突变体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SPE-C毒素突变体或其片段、疫苗和药物组合物，以及疫苗和药物组合物的使用方法。较佳的SPE-C毒素与野生型SPE-C毒素相比至少有一个氨基酸变化，而且是基本不致死的。该SPE-C毒素突变体可制成用于保护动物抵抗野生型SPE-C生物活性的疫苗组合物。

Description

链球菌毒素C突变体及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，更具体地涉及链球菌毒素C突变体及其使用方法。

背景技术

化脓链球菌也称为β-溶血性A族链球菌(GAS)，它是一种人病原，它可引起轻度感染，如咽炎和脓疱病。感染后可发生自身免疫并发症，即风湿热和急性肾小球性肾炎。GAS还引起严重的急性病，如猩红热和链球菌中毒性休克综合征(STSS)。在本世纪初，在美国和全世界，严重的GAS感染是一个很大的问题。在四十年代中期，病例数及其严重程度稳定下降，其原因还未完全明白。然而，最近，再次出现了GAS引起的严重疾病，在美国每年可能有10-20000件STSS病例。这些患者中多达50-60％将患坏死性筋膜炎和肌炎；30-60％的人将死亡，而幸存者有多达一半的人将截肢。

在1986和1987年，两份报道描述了在洛基山区域爆发了严重的GAS感染。在其后的几年里，其它一些报道描述了一种具有类似临床表现的疾病。对该疾病描述的症状与中毒性休克综合征(TSS)所描述的症状非常相似，在1992年，科学家委员会将这一临床表现正式命名为STSS，并设定了其诊断的标准。STSS定义为下列表现：

1.低血压和休克；

2.分离到A族链球菌；

3.具有以下症状的两种或多种：发烧38.5℃或更高、猩红热皮疹、呕吐和腹泻、肝肾功能紊乱、成年人呼吸窘迫综合征、弥漫性血管内凝血、坏死性筋膜炎和/或肌炎、细菌血症。

从STSS患者所得链球菌分离物主要是M1和M3型，其余主要是M18型和不能分类的细菌。与STSS相关的主要的M1、3、18和不可分类细菌产生了致热原外毒素A型(约有75％)，而分离物的其余细菌产生致热原外毒素C型(SPE-C)。而且，家兔动物模型以及在偶然性人接种时给予SPE-C可重新产生STSS症状。除了STSS与SPE-C有关外，研究还显示，从风湿热和滴状牛皮癣获得的A族链球菌分离物也产生SPE-C。

SPE-C是一个单肽，其分子量等于24000道尔顿。SPE-C的基因speC已经在大肠杆菌中成功地克隆和表达(Goshorn，S.G.等人，Mol.Gen.Genet.212：66-70(1988))。SPE-C是链球菌和葡萄球菌产生的外毒素大家族中的一个成员，根据其诱导发热并使宿主对内毒素易感性提高达100000倍的能力，它被称为致热原性外毒素。

最近这些毒素已经被称为超抗原，因为它们能以依赖于T细胞受体β链可变部分成分的方式诱导T淋巴细胞大量增殖(而不管T细胞的抗原特异性)。这些毒素还刺激IFN-γ、IL-1、TNF-α和TNF-β的大量释放。这一家族的其它成员是链球菌致热原性外毒素A型和B型、葡萄球菌中毒性休克综合征毒素1、葡萄球菌肠毒素A、B、Cn、D、E、G和H，以及非A族链球菌致热原性外毒素。这些毒素有相似的生物化学性能、生物活性和各种程度的序列相似性。

STSS最严重的表现是低血压和休克，这些表现将导致死亡。通常认为，体液从血管内渗漏到组织间隙是低血压的最终原因，在上述STSS家兔模型中体液替换治疗成功防止休克的观察结果支持了这一观点。已经假设，SPE-C可能以几种方式作用于宿主来诱导该病理变化。

已经表明，SPE-C通过危害肝枯否(Kuppfer)细胞来阻断肝脏清除内源菌群的内毒素。这看来引起了循环内毒素显著增加，内毒素通过结合脂多糖结合蛋白(LBP)和CD14信号导致激活巨噬细胞，随后释放出TNF-α和其它细胞因子。给予动物多粘菌素B或是用无病原家兔至少可部分中和SPE-C的致死作用，这些发现对内毒素在疾病中的作用提供了支持。

诱导休克的另一种方式可能是该毒素对于毛细血管内皮细胞有直接活性。这是从葡萄球菌致热原性毒素TSST-1直接结合人脐带静脉细胞并对分离的猪的主动脉内皮细胞有细胞毒性的这些发现所作出的假设。

该毒素的另一种作用方式包括其超抗原性，即毒素与高达50％的宿主T淋巴细胞反应并将其激活。这一T细胞大量刺激导致产生异常高水平的循环细胞因子TNF-β和IFN-γ，它们对巨噬细胞有直接作用诱导释放了TNF-α和IL-1。这些细胞因子也可在没有T细胞存在下由SPE-C通过MHC II类结合和发放信号诱导巨噬细胞直接释放出来。TNF-α和-β水平的升高引起了通常在革兰阴性菌诱导的休克中所见的几种作用，其中有对内皮细胞的损伤和毛细血管渗漏。然而，给予SPE-A处理过的家兔环孢菌素A(它阻断IL-2的上调和T细胞增殖)不能保护动物免受休克，这提示在引起毛细血管渗漏中还有其它更重要的作用机理。

因此，需要确定SPE-C分子上担负不同生物活性的部位。需要发展生物活性(如毒性和促细胞有丝分裂性)改变的SPE-C变体。需要发展用于预防或改善链球菌中毒性休克综合征的疫苗用组分。还需要开发出治疗链球菌中毒性休克综合征和其它疾病的治疗剂。

发明内容

本发明包括SPE-C毒素突变体及其片段，疫苗和药物组合物，以及该疫苗和药物组合物的使用方法。

SPE-C毒素突变体至少有一个氨基酸变化，与基本上对应的野生型SPE-C毒素的蛋白相比，它基本上不致死。用于疫苗组合物时，毒素突变体也刺激了针对野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性的保护性免疫应答。疫苗组合物用的毒素突变体还进一步被任意选择成其内毒素休克增强作用和T细胞促有丝分裂性均比野生型SPE-C有所减弱。用于药物组合物时，较佳的毒素突变体基本上不致死，同时保持了与野生型SPE-C毒素相当的T细胞促有丝分裂性。

本发明还包括野生型SPE-C毒素和SPE-C毒素突变体的片段。从野生型SPE-C获得的片段和肽是SPE-C毒素突变体。这些片段可包括不同的结构域或联合在一起的分子区域。与野生型SPE-C毒素相比，此种片段基本上是不致死的。对于毒素突变体，片段至少有一个氨基酸与野生型SPE-C氨基酸序列不同。片段也可用于疫苗和药物组合物。

本发明还包括表达盒、载体和转化的细胞。表达盒包括编码SPE-C毒素突变体或其片段的DNA序列，该序列与在宿主细胞中起作用的启动子操作性相连。DNA盒宜插入载体中。载体包括质粒或病毒。载体可用来提供模板DNA以产生编码SPE-C毒素突变体的DNA。DNA盒和载体也可用于疫苗组合物。编码SPE-C毒素突变体或其片段的核酸可直接递送入哺乳动物细胞中进行表达。启动子宜为在哺乳动物细胞中起作用的启动子。直接传递给细胞的核酸可在个体中表达SPE-毒素突变体，从而产生了针对野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性的保护性免疫应答反应。

其它疫苗组分包括稳定转化的细胞或病毒载体，它们包含了编码SPE-C毒素突变体或其片段的表达盒。病毒载体如牛痘可用来对人免疫接种，以产生抗野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性的保护性免疫应答反应。转化的细胞宜为微生物如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或沙门氏菌属。转化的微生物可在其表面上有SPE-C毒素突变体或其片段，或能分泌毒素突变体。转化的微生物可作为减毒活疫苗或热灭活疫苗来给予。

本发明还包括疫苗和药物组合物的使用方法。给予动物的疫苗量可有效地产生针对野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性的保护性免疫应答反应。较佳的是将疫苗组合物给予人体，并提供保护防止STSS发作。药物组合物也用于刺激T细胞增殖的方法中。

SPE-C毒素突变体和/或其片段以及其它疫苗组合物可用来产生被动免疫血清。SPE-C毒素突变体或其片段、DNA表达盒或载体、或转化的微生物可用来对动物免疫接种，以产生中和野生型SPE-C至少一种生物活性的中和抗体。中和抗体能与SPE-C毒素突变体和/或其片段以及野生型SPE-C毒素发生免疫反应。被动免疫血清可给予有链球菌A感染和STSS症状的动物。

具体而言，本发明提供了一种分离的链球菌毒素C突变体，它包含在天冬氨酸-12、酪氨酸-15、酪氨酸-17、组氨酸-35、天冬酰胺-38上的1至3个氨基酸取代。在较佳的实施方案中，它包括天冬氨酸-12取代成丙氨酸，酪氨酸-15取代成丙氨酸，酪氨酸-17取代成丙氨酸，组氨酸-35取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成天冬氨酸。在另一较佳实施方案中，链球菌毒素C突变体包括酪氨酸-15和天冬酰胺-38的取代，更佳的是取代是酪氨酸-15取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成丙氨酸。在另一较佳实施方案中，链球菌毒素C突变体包括酪氨酸-17的取代和天冬酰胺-38的取代，更佳的是取代是酪氨酸-17取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成丙氨酸。本发明的分离的链球菌毒素C突变体是不致死的，更佳的是该毒素是不致死且有抗原性，还要佳的是该毒素是不致死的，但保留了与野生型链球菌毒素C相当的促有丝分裂性。本发明的链球菌毒素C突变体不增强内毒素休克作用。

本发明另一方面提供了编码上述分离的链球菌毒素C突变体的DNA序列。

本发明还有一个方面提供了一种稳定转化的宿主细胞，该细胞包含上述DNA序列。

本发明另一方面涉及上述分离的链球菌毒素C突变体在制备用于给动物接种以抵抗野生型链球菌毒素C的至少一种生物活性的药物中的用途。

本发明另一方面涉及上述分离的链球菌毒素C突变体在制备用于给动物接种以抵抗毒性休克的药物中的用途。

附图说明

图1显示了speC的核苷酸序列。编号参照ATG起始密码子。图中标出了可能的启动子(-10，-35)和Shine-Dalgarno(SD)序列。在核苷酸序列下给出了推导出的氨基酸序列。残基27后的星号表示信号肽和成熟蛋白间的断裂位点。翻译终止密码子的重叠核苷酸3′是回文序列。

图2是SPE-C带状结构的前视图。

图3是SPE-C带状结构的后视图。

图4是SPE-C带状结构的前视图，其取向显示接触复合体中主要组织相容性II类复合体的位置。

图5是SPE-C带状结构的前视图，其取向显示接触复合体中T细胞受体的位置。

图6是SPE-C带状结构的后视图，其取向显示中心α螺旋的残基形成了在与肝肾小管细胞受体形成的复合体中与该受体接触的沟槽底部。

图7显示了单突变体Y15A和N38A的促有丝分裂活性。

图8显示了单突变体Y17A的促有丝分裂活性。

图9显示了双重突变体Y15A/N38A和Y17A/N38A的促有丝分裂活性。

图10显示了实施例6中所示残基被取代的SPE-C带状结构的前视图和后视图。

具体实施方式

本发明涉及SPE-C毒素突变体及其片段、包含SPE-C毒素突变体或其片段的疫苗和药物组合物、制备SPE-C毒素突变体及其片段的方法，以及SPE-C毒素及其片段的使用方法。

SPE-C毒素突变体是至少有一个氨基酸变化的蛋白，与基本上对应的野生型SPE-C毒素的蛋白相比，其生物功能至少有一个变化。较佳的，在相同剂量下与野生型SPE-C毒素相比，SPE-C毒素突变体基本上不致死。SPE-C毒素突变体可用各种方法生产，这些方法包括定点诱变、随机诱变、常规诱变、体外诱变、自发诱变和化学合成。SPE-C毒素突变体宜选择成：1)确保氨基酸中至少有一个变化；和2)分子生物功能至少有一个变化，较佳的是全身致死率减少或消除。毒素突变体可用于疫苗组合物，以抵抗SPE-C毒素的至少一种生物活性(如防止或改善STSS)，并可用于治疗具有STSS症状动物的方法。

A.SPE-C毒素突变体或其片段、疫苗和药物组合物

本发明包括SPE-C毒素突变体，它具有至少一个氨基酸变化，与基本上对应的野生型SPE-C并有野生型SPE-C相同生物活性的蛋白相比，其生物活性上至少有一个变化。

野生型SPE-C毒素由基因genC编码。纯化蛋白经SDSPAGE测定后，野生型SPE-C毒素的分子量为24000道尔顿。图1示出了编码野生型SPE-C毒素的DNA序列以及预计的野生型SPE-C毒素的氨基酸序列。编码野生型SPE-C毒素的DNA序列可以克隆到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中。本申请中的氨基酸编号以图1序列中28位天冬氨酸为第一个氨基酸。前27个氨基酸代表不存在于成熟蛋白中的前导序列。

野生型SPE-C毒素有几种生物活性。这些生物活性包括：1)发热；2)STSS；3)由于STSS发展或内毒素休克增强而引起的全身性致死；4)增强的内毒素休克；5)诱导毛细血管渗漏和低血压；6)诱导细胞因子(如IFNγ、IL-1、TNF-α和TNF-β)的释放；7)与猪主动脉内皮细胞结合；8)与MHC II类分子结合；9)与T细胞受体结合；和10)T细胞促有丝分裂性(超抗原性)。这些活性可用本领域技术人员已知的方法来试验和性质鉴定。

本文所用的定义“野生型SPE-C毒素”包括生物活性与野生型SPE-C毒素相同的野生型SPE-C毒素变体，如等位基因变体。这些SPE-C毒素内的氨基酸或其基因内的核苷酸可能与图1所示的不同，但是却没有不同的生物活性。氨基酸序列的改变在表型上是沉默的。较佳的，这些毒素分子的全身致死性和增强内毒素休克的程度与图1所示野生型SPE-C毒素相同。较佳的，这些毒素与图1所示野生型SPE-C毒素氨基酸序列有至少60-99％的同源性(经Altschul，S.F.，Bull.Math.Bio.48：603(1986)所述的SS2序列对比算法测得)。有这些性质的蛋白基本上对应于野生型SPE-C。

SPE-C毒素突变体是一种与基本上对应的野生型SPE-C毒素蛋白相比至少有一个氨基酸变化的毒素。该变化包括氨基酸取代、缺失或加入。在氨基酸序列中可以有一个以上的变化，较佳的有1至6个变化。较佳的是，氨基酸序列中宜有一个以上的变化，以最大程度地减少SPE-C毒素突变体回复到具有全身致死性或毒性的野生型SPE-C毒素的可能。对于疫苗中所用的SPE-C毒素突变体，较佳的是，毒素氨基酸序列的改变不会改变毒素刺激产生中和野生型SPE-C毒素的抗体应答的能力。对于疫苗所用的SPE-C毒素突变体，尤其佳的是毒素突变体可被针对SPE-C毒素的多克隆中和抗体(如来自Toxin Technologies in Boca Raton，Fla.或Dr.Schlivert(University of Minnesota，Minneapolis，MN))识别，且与野生型SPE-C相比，其蛋白水解图谱没有改变。

氨基酸序列的改变可以是野生型SPE-C毒素的一个或多个选定氨基酸残基上的位点特异性改变。通过鉴定分子特定结构域中的残基(如所述的)或半胱氨酸残基所处位置，可选择位点特异性变化。还可通过比较一级序列同源性或三维构象来确定某位置或结构域中的氨基酸与其它同源分子中等价残基是否相同或有相似性质，以进一步任意选择特定位置处的位点特异性变化。同源分子是指可通过用上述Altschul等的SS2序列对比算法、或同源性模型程序(如BioSym，SanDiego，CA的Insight/Homology程序)比较一级序列的同源性来鉴定的分子。同源分子是指，当与野生型SPE-C毒素比较时，显示出明显数量的氨基酸(通常为30-99％)相同或保守性变化，或有相似的三维结构(通常保守区域的RMS误差小于2埃)的分子。

可在特定位点处的随机改变氨基酸序列，或可选择特异性变化。一旦选择了特异性位点，就用其氨基酸编号和图1所示野生型SPE-C中该位点处的氨基酸表示。在本申请中，氨基酸编号根据图1所示28位的天冬氨酸计为第一个氨基酸来进行。与基本上对应的野生型SPE-C毒素蛋白中特定位点所鉴定的那些氨基酸对应的等价氨基酸，可以有不同的氨基酸编号，这取决于参照序列或者它们是否是片段。通过比较一级氨基酸结构、或与图1所示模型结构比较、或与同源分子的已知晶体结构比较，在同源分子中也可发现等价残基，它们可被鉴定成与基本对应的野生型SPE-C毒素蛋白中的氨基酸等价。本发明意图是覆盖了相同或相似位置处的等价氨基酸变化，不论其氨基酸编号是否相同。

如果选择对特异性位点处的氨基酸作特异性取代，则在该位置作取代的氨基酸应包括一个可影响生物活性(与野生型SPE-C该位置处的氨基酸相比)的结构变化。取代可以是保守性的或非保守性的。导致结构变化影响生物活性的取代包括：1)从一种类型电荷变成另一种；2)从带电荷变成不带电荷；3)半胱氨酸残基的变化和形成二硫键；4)疏水性残基变成亲水性残基，或亲水性残基变成疏水性残基；5)氨基酸大小改变；6)变成构象上限制性氨基酸或类似物；和7)变成非天然存在的氨基酸或类似物。所选特异性取代还可取决于所选位点的位置。例如，N端α螺旋中的氨基酸宜有与外露的酰胺氮原子作用的羟基，或者它们带有能与N端α螺旋中的部分正电荷相互作用的负电荷。

毒素突变体还可包括能靶向特异性位点的随机突变。一旦选出位点，就可用例如Aiyar等，Biotechniques 14：366(1993)或He等，Gene 77：51-54(1984)中所述的方法产生在该位点由其它19种氨基酸的每一种取代的突变体。利用Anthony-Cahill等Trends Biochem.Sci.14：400(1989)所述的方法，也可通过体外诱变在特定位置用其它19种氨基酸的每一种或非天然存在的氨基酸或类似物来取代。

毒素突变体还包括在非特异性选定分子的一个或多个位点处有变化的毒素，以及在氨基酸中有变化的毒素，该氨基酸不是特异性选定的，但可以是其它19种氨基酸的任一种或非天然存在的氨基酸。

特异性位点处的取代还可包括(但不局限于)非天然存在的氨基酸的取代，该氨基酸例如是3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、同型半胱氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、鸟氨酸、同型精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、羟基赖氨酸、取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸(-缬氨酸和卤代的酪氨酸。特异性位点处的取代还可包括采用非肽类化学物质的类似物，其包括(但不局限于)酯、醚和磷酸基和硼键。

毒素突变体可用各种方法来产生。那些方法包括定点诱变、采用化学物质(如EMS、亚硫酸氢钠或UV照射)诱变、自发突变、体外诱变和化学合成。诱变方法可在Sambrook等，A Guide to Molecular Cloning，Cold Spring Harvard，NewYork(1989)中找到。定点诱变的特别佳的方法是用三个引物的不对称PCR，如Perrin和Gilliland，1990.Nucleic Acid Res.18：7433所述。

重叠四个葡萄球菌超抗原(TSST-1、SEA、SEB和SEC-3)以及SPE-C的三维结构表明这些蛋白共享16个结构上保守的氨基酸(表1)。用这16个结构上保守的氨基酸残基作为参照点，能使这5个蛋白结构重叠的RMS(均方根)差小于等于2埃，这对于有最小氨基酸序列保守的蛋白是明显的。这种根据16个结构上保守的氨基酸进行的重叠使得能够详细比较SPE-C与葡萄球菌超抗原的结构。

葡萄球菌超抗原SEB和II类主要组织相容性复合体(MHC-II)的复合物晶体结构表明，SEB上的氨基酸与MHC-II接触，它们包括列在表2中的那些残基。SPE-C结构的重叠表示了在这两种蛋白的复合物中接触MHC-II的SPE-C部分的位置。这些位置如图4中小球所示。

具体参看图4，它们包括B亚基5β-折叠桶4链3上的位置1和2。位置1是通过链3中“4”型转角或凸起部的氨基酸1残基的位置，其距链3和环6的接头约3个残基。位置1可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Thr-33。位置2当其维持在链上时，代表链3中最接近链3和环6接头的氨基酸。位置2可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的His-35。位置7代表最接近链3和环6接头的氨基酸。环6是“1型”或“2型”转折。位置7可以是疏水性氨基酸，较佳的是SPE-C的Leu-36。B-亚基5的β-折叠桶4也包括残基Asn-38。

位置8在环6中。位置8可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asn-37。位置10、11和14在链12上。位置10是链12上最接近与环13接头的氨基酸。位置10可以是带电荷氨基酸，较佳的是SPE-C的Arg-44。位置11大约在链12的中部，其可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Lys-42。位置14在链12和环6的接头处，但在链12上。位置14可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Thr-40。位置15在环6上。位置15可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asp-39。

位置17-20在链21上。位置19和20毗邻。位置17-19间隔开的空间足以在各自之间容纳一个位置。位置17距链21和环13的接头约1个氨基酸。位置17可被疏水性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Ile-50。位置18大约在链21的中点，其可被中性或极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的氨基酸Ser-52。位置19距链21和环22接头约两个氨基酸。位置19可被中性或极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Met-54。位置20在链21上，毗邻链21和环22的接头。位置20可被中性或极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Ser-55。位置23在α螺旋24的转角内，终止于螺旋24与环25的接头处。位置23在螺旋24面向位置20的一侧。位置23可被中性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Ala-186。

葡萄球菌超抗原SEC-3与T细胞受体的复合物的晶体结构显示了SEC-3上与T细胞受体接触的氨基酸，其包括表3中列出的残基。SPE-C结构的重叠表明了SEC-3上与这两种蛋白的复合物中T细胞受体接触的氨基酸。这些位置在图5中显示为球状。

具体参照图5，它们包括在环13和链21接头处的位置26。位置26可被极性氨基酸占据，较佳的是SEP-C的Tyr-49。位置27在链28上，距离链28和环29的接头处约3个氨基酸。位置27可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-85。位置30在环29上，与链28和32的距离大约相等。位置30可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的His-81。位置31在环29和链32的接头处。位置31可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asn-79。位置33至36在链32上。位置33的氨基酸与链32和环31的接头毗邻。位置33可被疏水性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Leu-78。位置34距离位置33一个氨基酸。位置34可被疏水性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Ile-77。位置35可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-76。位置36可被疏水性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Phe-75。

位置38是不规则α螺旋24上最接近该α螺旋与环39的接头处转角上的氨基酸残基。位置38在最接近链40的转角部分上。位置38可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asp-183。位置41在环39上，距离环39与α螺旋24的接头约一个氨基酸。位置41上氨基酸的一个侧链朝向中央α螺旋42。位置41可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Arg-181。

环43包括位置44、45、46和47。位置44至47是环43上最暴露在溶剂部分的毗邻位置。位置44可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Glu-178。位置45可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-153。位置46可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asp-148。位置47可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-147。

位置48至50在N端α螺旋51上。位置48和49在α螺旋51与环52的接头最接近的转角上。位置48可被中性或极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Ser-11。位置49可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asp-12。位置48和49代表毗邻的氨基酸位置。位置50在α螺旋51毗邻与环53接头的转角上。位置50在该转角最暴露于溶剂的转角部分上。位置50可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-15。N端α螺旋51还包括残基Tyr-17。

SPE-C与肝肾小管细胞受体结合的位点包括SPE-C“背侧”沟槽上的残基。位置54至60确定了SPE-C上B亚基5和A亚基61之间的沟槽表面，该部分与肝肾小管细胞受体相互作用。位置54至59在中央α螺旋42上。位置60在环16上，与环16和中央α螺旋42的接头毗邻。位置54可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asn-143。位置55可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Asp-142。位置56可被极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Tyr-139。位置57可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Lys-138。位置58可被带正电氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Lys-135。位置59可被带电荷氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Glu-131。位置60可被中性或极性氨基酸占据，较佳的是SPE-C的Thr-128。

表2列出了SEB中与这两个蛋白的复合物晶体结构中的II类MHC相互作用的残基。将SEC-3、SEA和TSST-1的结构与SEB：MHC-II复合物的结构重叠，其结果表明了这些蛋白中对应于所列的与MHC-II相互作用的氨基酸残基。较佳的SPE-C突变体在SPE-C残基上有氨基酸取代，这些残基对应于SEB、SEC-3、SEA或TSST-1中与MHC-II相互作用的残基。这些较佳的SPE-C残基包括表2所列出的SPE-C残基。该表的列中列出了不同蛋白的对应残基。

表3列出了与这两个蛋白复合物晶体结构中T细胞受体作用的SEC-3残基。将SEB、SEA和TSST-1的结构与SEB-3：T细胞受体复合体的结构重叠，其结果表明了这些蛋白中对应于与T细胞受体相互作用的SEC的氨基酸残基。较佳的SPE-C突变体在SPE-C残基上有氨基酸取代，这些残基对应于SEB、SEC-3、SEA或TSST-1中与T细胞受体相互作用的残基。这些较佳的SPE-C残基包括表3所列出的SPE-C残基。该表的列中列出了不同蛋白的对应残基。

较佳的SPE-C突变体在与T细胞受体、MHC-II或肝肾小管细胞受体作用的至少一个位置或至少一个氨基酸残基上有氨基酸取代。这些氨基酸取代可如上所述进行选择以破坏相互作用。

                     表1

                PTSAG保守的残基

TSST-1    SEA       SEB       SEC-3    SPE-C

TYR13     TYR30     TYR28     TYR28    TYR17

ASP27     ASP45     ASP42     ASP42    (THR33)

LYS58     LYS81     LYS78     LYS78    (ARG65)

VAL62     VAL85     VAL82     VAL82    VAL69

ASP63     ASP86     ASP83     ASP83    ASP70

GLY87     GLY110    GLY117    GLY114   GLY89

THR89     THR112    THR119    THR116   THR91

LYS121    LYS147    LYS152    LYS151   LYS124

LYS122    LYS148    LYS153    LYS152   (ASP125)

LEU129    LEU155    LEU160    LEU159   (ILE132)

ASP130    ASP156    ASP161    ASP160   ASP133

ARG134    ARG160    ARG162    ARG161   ARG137

LEU137    LEU163    LEU168    LEU167   LEU140

LEU143    LEU169    LEU171    LEU170   (ILE146)

TYR144    TYR170    TYR172    TYR171   TYR147

GLY152    GLY182    GLY185    GLY184   GLY156

ASP167    ASP197    ASP199    ASP199   ASP171

ILE189    ILE226    ILE230    ILE230   ILE204

                   表2

         涉及II类MHC相互作用的残基

SEB      TSST-1   SEA      SEC-3    SPE-C

Gln43    Asn28    Gln46    Lys43    His34

Phe44    Ser29    Phe47    Phe44    His35

Leu45             Leu48    Leu45    Leu36

Tyr46    Leu30    Gln49    Ala46    Asn37

Phe47    Gly31    His50    His47

Gln92    Lys71    Gln95    Asn92    Leu78

Tyr94    Gln73    Ala97    Tyr94    Ser80

Ser96             Gly99    Ser96

Met215   Asn175   Arg211   Met215   Ala186

                     表3

           涉及TCR相互作用的残基

TSST-1    SEC-3     SEA       SEB      SPE-C

ASN5      GLY19     THR21     GLY19    ASN8

          THR20     ALA22     LEV20    SER11

ASP8      ASN 23    ASN25     ASN23    ASP12

ASP11     TYR26     GLN28     VAL26    TYR15

ASN60     TYR49

LYS70     TYR90     GLY93     TYR90    ILE77

VAL91     TYR94     TYR91     LEU78

          GLY102                       ASN79

          LYS103

          VAL104

          SER106    LYS103

ARG145    PHE176    ASN171    TYR175   ASP148

          GLN210    SER206    GLN210   ARG181

一旦产生了一个SPE-C毒素突变体，该突变体与基本对应的野生型SPE-C毒素蛋白相比至少有一个氨基酸变化，则筛选非致死性的SPE-C毒素突变体。较佳的是，当用微型渗透泵(如实施例4所述)以相同或高于野生型SPE-C毒素的剂量给药时，从该筛选中选出的SPE-C毒素突变体在家兔中是基本上不致死的。如果以相同于野生型毒素的剂量给药时，少于大约10-20％的家兔死亡，则称SPE-C毒素突变体或其片段是基本上不致死的。不致死的毒素突变体可用于疫苗和药物组合物。尽管不意味着限制本发明，据信影响全身致死性的一些氨基酸残基或结构域可与其它生物活性(尤其是T细胞促有丝分裂性)分开。

对于可用于疫苗组合物的毒素突变体，还要佳的是选出那些可刺激产生能中和野生型SPE-C毒素活性的抗体应答的SPE-C毒素突变体。选择能刺激中和野生型SPE-C毒素活性的抗体应答的毒素突变体的方法是，测定毒素突变体是否能与野生型SPE-C的多克隆中和抗体(如可从Toxin Technologies，Boca Raton，Fla.或Dr.Schlievert获得)免疫反应。测定SPE-C毒素突变体是否与野生型SPE-C毒素抗体免疫反应的方法包括ELISA、Western印迹法、双重免疫扩散试验等。

还可任选地筛选毒素突变体以确定毒素突变体的蛋白水解图谱是否与野生型SPE-C毒素相同。在一些情况下，较佳的是，与野生型SPE-C毒素相比，产生的突变体在整体三维构象上没有显著改变。检查整体构象是否改变的一种方式是观察与野生型SPE-C毒素抗体的免疫反应性和/或测定SPE-毒素突变体的蛋白水解图谱。该蛋白水解图谱可用酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和V8蛋白酶以本领域技术人员已知的方法来测定。具有图3所示序列的野生型SPE-C的蛋白水解图谱是已知的。选出曲线与该野生型SPE-C相似的突变体。

任选地，还可筛选和选出生物活性有其它变化的毒素突变体。如上所述，野生型SPE-C毒素有几种生物活性。这些生物活性包括：1)发热；2)STSS；4)增强的内毒素休克；5)毛细血管渗漏和低血压；6)诱导细胞因子(如IFNγ、IL-1、TNF-α和TNF-β)的释放；7)与内皮细胞结合；8)与MHC II类分子结合；9)与T细胞受体结合；和10)T细胞促有丝分裂性(超抗原性)。这些生物活性可用本领域技术人员已知的方法来测定。

对于用于疫苗组合物的SPE-C毒素突变体或其片段，较佳的是它们基本上没有毒性，并能与野生型SPE-C的中和抗体免疫反应。中和抗体包括在动物中测试时抑制野生型毒素致死性的那些抗体。任选地，SPE-C毒素突变体在前述野生型SPE-C毒素生物其它活性方面还可有一种或多种变化。

任选地，还可对较佳的疫苗组合物用毒素突变体作进一步筛选，选出不增强内毒素休克的突变体。检查不增强内毒素休克的较佳的试验在实施例3中有所描述。在测试前，家兔最好没有可证明的细菌或病毒感染。当将SPE-C毒素突变体与内毒素共同给药时，与相同剂量的野生型SPE-C活性相比，少于大约25％的动物发生休克时，则表明不增强内毒素休克或基本上不增强内毒素休克。更佳的是，没有动物发生休克。

任选地，还可对较佳的疫苗组合物用突变体进行进一步筛选，选出T细胞促有丝分裂性改变的突变体。通过下列方法可测定T细胞促有丝分裂性的变化：测定家兔淋巴细胞的标准3H胸苷试验中T细胞增殖(如实施例3所述)；测定细胞因子(如IFNγ或TNF-β)的产生水平；测定Vβ型T细胞反应；或测定分子与II类MHC受体的相互作用。检测T细胞促有丝分裂性减少的较佳方法是在毒素突变体存在和不存在下测定家兔淋巴细胞的T细胞增殖。T细胞对野生型SPE-C毒素的反应大大超过对抗原的正常体外反应。当SPE-C毒素突变体刺激的T细胞增殖反应不高于抗原或阴性对照刺激的反应，则可视为T细胞促有丝分裂性有显著降低。较佳的，当用家兔淋巴细胞以相同于野生型SPE-C毒素的剂量进行测定时，见到对SPE-C毒素突变体的T细胞增殖反应降低至不超过背景的两倍。

任选地，还可对用于疫苗组合物用的SPE-C毒素突变体进行进一步筛选，选出内皮细胞中毛细血管渗漏减少的突变体。较佳的方法是如Lee等J.Infect.Dis.164：711(1991)所述的采用猪主动脉内皮细胞。通过测定放射性标记过的化合物的释放减少或放射性标记过的化合物转运的变化，就可在SPE-C毒素突变体存在下确定毛细血管渗漏的减少。与野生型毒素活性相比，当放射性标记过的化合物释放或转运减少至低于背景的两倍时，则视为毛细血管渗漏减少。

尤其佳的疫苗组合物用SPE-C毒素突变体在与具有野生型SPE-C毒素活性的蛋白相比时没有生物活性。没有生物活性是指毒素突变体有很少或没有全身致死性、内毒素休克增强和T细胞促有丝分裂性。较佳的是，选用作疫苗组合物的SPE-C毒素突变体基本上没有这些生物活性，即，它们象阴性对照那样反应或它们刺激出的反应不超过背景的两倍。

其它生物活性变化可如下测得。用Jardetzky，Nature 368：711(1994)所述的方法可检测与II类MHC分子的结合。给予SPE-C毒素突变体后监测温度随时间的变化来检测发热的改变。采用商业上可获得的方法可测定在SPE-C毒素突变体的存在下细胞因子产生水平的变化，这些方法在目前的免疫技术文献中有所描述(Ed.Coligan，Kruisbeck，Margulies，Shevach，和Stroker.National Institutes of Health，John Wiley和Sons，Inc.)。

尤其佳的疫苗组合物用突变体是与野生型SPE-C毒素的多克隆中和抗体起免疫反应、无毒的SPE-C毒素突变体，其还可任选地具有减少的内毒素休克能力和减少的T细胞促有丝分裂性。

有利的是，用于治疗方法的SPE-C毒素突变体可制成其氨基酸序列中有一个以上的变化。希望在一个以上的位置有变化，以使回复成具有毒性或致死性分子的可能性最小。对于疫苗组合物，希望具有多个变化的突变体仍能产生抗野生型SPE-C的保护性免疫应答和/或与野生型SPE-C的多克隆中和抗体起免疫反应。对于药物组合物，较佳的是，具有多个变化的突变体基本上是不致死的，并同时维持了T细胞的促细胞有丝分裂性。尤其佳的是具有大约2至6处变化。本申请中还可考虑三重突变体。

SPE-C毒素突变体可用来制成疫苗组合物。较佳的疫苗组合物突变体至少有一个氨基酸变化，没有全身毒性，能与野生型SPE-C的多克隆中和抗体起免疫反应。

使毒素突变体与生理上可接受的载体联合。生理上可接受的稀释剂包括生理盐溶液和在中性pH下的缓冲盐溶液，如磷酸缓冲溶液。其它类型的生理性载体包括脂质体或聚合物等。

任选地，突变体毒素可以与佐剂(如Freund′s不完全佐剂、Freund′s完全佐剂、明矾、单磷酰类脂A、磷酸铝或氢氧化铝、QS-21等)联合。任选地，毒素突变体或其片段可以与免疫调节剂如白细胞介素、干扰素等结合。许多疫苗配方是本领域技术人员已知的。

在疫苗配方中加入有效量的SPE-C毒素突变体或其片段，以在动物体内刺激出针对野生型SPE-C毒素至少一种生物活性的保护性免疫应答。保护性免疫应答的产生可通过抗体(较佳的是中和野生型SPE-C毒素的抗体)的产生来测定。野生型SPE-C毒素的中和可用包括抑制野生型SPE-C在动物体内致死性的方法来测定。此外，通过测定至少一种野生型SPE-C毒素生物活性的减少(如内毒素休克增强的症状或STSS的改善或消除)，可测知有无保护性免疫反应。可形成保护性免疫应答的毒素突变体的量约为每千克体重0.1微克至100毫克，更佳的每千克体重约为1微克至100微克。约25微克/千克体重的野生型SPE-C毒素用量可有效地诱导家兔中的保护性免疫力。

疫苗组合物可给予动物如家兔、啮齿类动物、马和人。较佳的动物是人。

SPE-C毒素突变体还可制成药物组合物。药物组合物可用于需要刺激T细胞增殖的治疗场合。较佳的SPE-C毒素突变体是不致死但维持了与野生型SPE-C毒素相当的T细胞促有丝分裂性的那些突变体。

药物组合物可通过组合SPE-C毒素突变体和生理上可接受的载体(如生理盐溶液、中性pH缓冲盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液)来制得。SPE-C毒素突变体组合物时的用量应有效刺激出与相同剂量野生型SPE-C毒素相当的T细胞增殖。通过家兔淋巴细胞的标准3H胸苷试验、和荧光激活T细胞分选仪测定体内T细胞种群或用诸如ELISPOT的试验，可测定T细胞应答性的增强。有效量的范围为每千克体重100钠克至100毫克，更佳的每千克体重1微克至1毫克。例如，这些SPE-C毒素突变体可单独使用或与白细胞介素或干扰素治疗结合。

本发明还包括SPE-C毒素片段和SPE-C毒素突变体的片段。对于疫苗组合物，这些片段宜足够大以刺激产生保护性免疫应答。B细胞表位的大小最小为约4-7个氨基酸，对于T细胞表位，最小约为8-12个氨基酸。野生型SPE-C总共有大约235个氨基酸，包括前导序列在内。这些片段是约有4至200个氨基酸的肽，更佳的约有10-50个氨基酸。

片段可以是单个肽，或包括不同位置连接在一起的肽。较佳的，片段包括图1中指出的和如本文所述的一个或多个结构域。另外，当与基本上对应的野生型SPE-C毒素蛋白比较时，较佳的SPE-C毒素突变体片段的氨基酸序列中有至少一个变化，更佳的，氨基酸序列中有1至6个变化。

较佳的，这些片段基本上没有全身致死性。对片段进行筛选，选出在剂量相同或高于具有野生型SPE-C毒素活性的蛋白时、用微型渗透泵模型在家兔中有很少或没有毒性的突变体(如上所述)。当给予相当于野生型SPE-C毒素的剂量时，在人体内没有毒性的片段也是较佳的。

对于疫苗组合物，较佳的是片段包括了中央α螺旋和/或N端α螺旋的残基。对于疫苗组合物，较佳的是片段刺激产生了抗具有野生型SPE-C毒素活性的蛋白的中和抗体反应。可对片段进行筛选，选出与野生型SPE-C毒素多克隆中和抗体起免疫反应的片段。片段还可用来对动物免疫接种，形成的抗体经测试应能中和野生型SPE-C毒素。

对于疫苗组合物，还可筛选出尤其佳的没有生物活性的片段。没有生物活性是指该片段没有全身致死性、引起的内毒素休克增强很少或没有、以及引起的T细胞刺激很少或没有。任选地，可对片段进行筛选，选出对猪内皮细胞有毛细血管渗漏作用减少的片段。

筛选和选择用于疫苗组合物的片段可以结合入疫苗组合物中并如上所述那样使用。任选地，片段可以与载体分子(如牛血清白蛋白、人血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素等)结合。

对于药物组合物，该片段宜包括单独的N-端B结构域β链中的氨基酸残基或与中央α螺旋组合的残基。

对于药物组合物，宜对这些片段筛选，选出没有全身致死性，以及任选地内毒素休克增强很少或没有(如上所述)的片段。片段宜保留类似于野生型SPE-C毒素的T细胞促有丝分裂性。SPE-C毒素突变体的片段可如上所述那样制成药物组合物。

SPE-C毒素突变体的片段可用PCR、限制性酶消化和/或连接、体内诱变和化学合成来制得。对于较小的片段来说，化学合成也许是理想的。

SPE-C毒素突变体片段可用于关于SPE-C毒素突变体所描述的相同的组合物和方法中。

B.SPE-C毒素突变体、疫苗组合物或药物组合物的使用方法

SPE-C毒素突变体和/或其片段可用来保护动物抵抗野生型SPE-C毒素的作用、改善或治疗患STSS的动物、诱导增强的T细胞增殖和应答、治疗或改善滴状牛皮癣、风湿热或侵袭性链球菌感染的症状的发放中。

一种保护动物抗野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性的方法，该方法涉及向动物给予疫苗组合物以建立抗SPE-C毒素的至少一种生物活性的保护性免疫应答的步骤。保护性免疫应答宜为中和与保护以抗致死性或STSS症状。疫苗组合物宜包括具有至少一个氨基酸变化的SPE-C毒素突变体或其片段，该突变体或其片段可与野生型SPE-C的多克隆中和抗体起免疫反应，并且不致死。

疫苗组合物可以各种方式给予动物，包括皮下、肌内、静脉内、经皮、口服、鼻内、眼内、腹膜内等方式。较佳的给药途径是肌内给予。

疫苗组合物可给予各种动物，包括家兔、啮齿类动物、马和人。较佳的动物是人。

疫苗组合物可单剂量或多剂量给药直至建立起抗野生型SPE-C的至少一种生物活性的保护性免疫力。保护性免疫力可通过用标准方法测定野生型SPE-C的中和抗体的存在来检测。给予有效量，以建立起保护性免疫力而不产生显著的毒性。

SPE-C毒素突变体或其片段也可用来产生与SPE-C毒素突变体和野生型SPE毒素发生免疫反应的中和抗体。这些抗体可用作被动免疫血清来治疗或改善患有STSS症状的患者体内的症状。上述疫苗组合物可给予动物(如马或人)，直至产生抗野生型SPE-C的中和抗体。然后可收获这些中和抗体、纯化，并用来治疗具有STSS症状的患者。抗野生型SPE-C毒素的中和抗体还可用野生型SPE-C制成。然而，给予野生型SPE-C的剂量必须大大低于诱导出毒性的剂量，例如为野生型SPE-C在家兔中的LD50的1/50至1/100。

向表现出STSS症状(例如发热、低血压、A族链球菌感染、肌炎、筋膜炎和肝脏损伤)的患者给予有效量的中和抗体，以中和SPE-C毒素的作用。中和抗体可通过静脉内、肌内、经皮、皮下等方式给药。较佳的途径是静脉内给药，或对于局部化感染是在组织损伤部位局部进行清创。中和抗体也宜与抗生素治疗结合给药。中和抗体可单剂量或多剂量给予直至使休克或组织损伤减少。通常给予的中和抗体较佳的量约为1至1000毫克/千克(体重)，更佳的约为50-200毫克/千克体重。

C.编码SPE-C毒素突变体的DNA表达盒和该DNA表达盒的制备方法

本发明还包括用于表达SPE-C毒素突变体和/或其片段的DNA序列和表达盒。表达盒包括编码SPE-C毒素突变体或其片段的DNA序列和与其操作性相连的在宿主细胞中起作用的启动子，其中所述突变体或其片段与基本对应野生型SPE-C毒素的蛋白相比至少有一个氨基酸变化和至少一种生物功能变化。将表达盒插入转化载体中并在转化细胞中生产SPE-C毒素突变体。然后可从宿主细胞或宿主细胞上清液中纯化获得毒素突变体。转化的宿主细胞也可用作疫苗组合物。

SPE-C毒素突变体或其片段也可通过类似定点或随机诱变的方式筛选和选择自发突变体来制得。SPE-C毒素突变体可用体外诱变或从某步骤产生的片段半合成法来制得。最后，SPE-C毒素突变体可用化学合成方法来制得。

生产SPE-C毒素突变体或其片段的方法包括，用包括该表达盒的载体转化或转染宿主细胞，在允许宿主细胞表达该SPE-C毒素突变体或其片段的条件下培养宿主细胞。

编码SPE-C毒素突变体的DNA序列

根据所选的变化类型，可用各种方法来制得编码氨基酸序列至少有一个变化的SPE-C毒素突变体的突变型DNA序列。将编码基本对应野生型SPE-C毒素功能的蛋白的DNA序列作为模板DNA来制得编码SPE-C毒素突变体的DNA序列。编码野生型SPE-C毒素的DNA序列如图1所示。

为了作特定变化或在一个或数个特定位置变化，较佳的是根据Perrin等(前述)的方法采用PCR。为了使变化靶向特定的位置，混合物中包括了编码该氨基酸变化的改变的核苷酸的内部引物以及5′和3′侧接引物。5′侧接引物与野生型SPE-C编码序列翻译起始位点上游DNA区域同源或杂交。较佳的，5′侧接区域在speA启动子和调节区域的上游。例如，5′侧接引物可以与翻译起始位点上游约760碱基处的区域同源或杂交。下游侧接引物与野生型SPE-C编码序列终止密码子下游的DNA区域同源或杂交。下游侧接引物宜提供转录和翻译终止信号。例如，3′侧接引物可以与SPE-C编码序列终止密码子下游200碱基对的区域杂交或同源。每次PCR反应中均存在上游和下游侧接引物，以确保所得PCR产物包括speC启动子和上游调节区、转录和翻译终止信号。本领域技术人员也很容易构建出其它上游和下游引物。天然的speC启动子和上游调节区不必包括在PCR产物内，尽管这是较佳的。

内部引物可设计成用编码野生型SPE-C的DNA序列可在某特定位置产生变化。引物可被设计成使某特定位置编码一个特定的氨基酸取代。引物可设计成使得在特定位点产生随机取代，如Rennell等，J.Mol.biol.22：67(1991)中所述。引物可被设计成在特定位点处产生氨基酸缺失。引物还可被设计成使特定位点中加入一个额外氨基酸的编码序列。

引物宜为约15至50个核苷酸长，更佳的约15至30个核苷酸长。引物宜用自动化合成制得。5′和3′侧接引物宜与编码野生型SPE-C毒素编码序列的侧接DNA序列杂交。这些侧接引物宜包括约10个与侧接DNA序列100％同源或互补的核苷酸。内部引物并不与编码该位置氨基酸的DNA序列100％互补，因为它们编码了该位置的变化。内部引物在约15至30个核苷酸长的引物内可以有与野生型SPE-C序列不同的1至4个不匹配。此二侧接引物和内部引物还包括编码限制性位点和夹子位点的其它核苷酸，最好靠近引物的末端。根据已知的原理(如Sambrook等，Molecular Clonging-A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中所述的)，可结合考虑引物中的不匹配数目来改变杂交条件。

如果希望在多个位点上变化，则可采用多个内部引物。在Aiyar等(上述)中描述了在多个位点上产生位点特异性变化的PCR方法。另一种方法在实施例5中有所描述。

在一种方法中，获得在一个特定位点有一个变化的编码SPE-C毒素突变体的DNA序列，然后将其作为模板，以产生在第二个位点有改变的突变型DNA序列。在PCR的第一轮中，采用第一内部引物来产生具有第一个变化的突变型DNA序列。然后将具有第一个变化的突变型DNA序列作为模板DNA，用编码不同位点有变化的第二内部引物，形成编码氨基酸序列中两个位置有改变的突变型毒素的DNA序列。可用PRC方法来产生编码氨基酸中有大约2至6个变化的DNA序列。

Perrin等(上述)描述了一种较佳的PCR方法。简言之，PCR反应条件是：PCR在100微升反应混合物中进行，该混合物含有10mM Tris-HCl(pH＝8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、dNTP各200μM、2ng模板质粒DNA、100微微摩尔侧接引物、5微微摩尔内部引物、2.5单位Ampli Taq DNA聚合酶(PerkinElmer Cetus)。在第二次扩增步骤中，反应混合物的组成如上所述，只是采用了等摩尔浓度(5微微摩尔)的侧接引物和兆引物(megaprimer)和1μg模板。PCR进行30次循环，每次循环为94℃变性1分钟、37℃或44℃退火2分钟和72℃延长3分钟。

分离出PCR产物，然后克隆到穿梭载体(如Murray等J.Immunology152：87(1994)的方法中构建的pMIN 164，可从Dr.Schlievert，University ofMinnesota，Mpls，MN获得)中。该载体是携带氨苄青霉素抗性的大肠杆菌质粒pBR328与赋予红霉素抗性的葡萄球菌质粒pE194的嵌合体。用抗野生型SPE-C的多克隆中和抗体(Toxin Technologies，Boca Raton，Fla或来自Dr.Schlievert)在大肠杆菌中筛选生产毒素的连接的质粒混合物。用Hsiao等，Nucleic Acid Res.19：2787(1991)的方法对SPE-C毒素突变体进行测序，以确认所需突变的存在和其它突变的不存在。

本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，许多DNA序列可编码氨基酸中的相同变化。本发明包括具有不同核苷酸序列但编码氨基酸序列中相同变化的DNA序列。

为了在其特定位点产生随机诱变，可设计一系列引物，使得该特定位点被取代成其它19种氨基酸的一种或非天然存在的氨基酸或类似物。以上述相似方式或Rennell等(同上)描述的方法进行PCR。亚克隆PCR产物，然后通过与抗野生型SEP-C多克隆中和抗体的免疫反应性来监测毒素的产生。通过对编码SPE-C毒素突变体的DNA序列进行测序，可以确认氨基酸序列中存在的变化。较佳的，筛选这些毒素突变体，选出了非致死性突变体。

可用其它诱变方法以在编码野生型SPE-C毒素的DNA序列中产生随机突变。文中所用的随机突变或随机诱变指并非在所选定位点的突变和/或并非是选定的改变。包括编码野生型SPE-C毒素的DNA序列的细菌宿主细胞可用其它各种标准方法(如化学诱变和UV辐射)来诱变。这种方式产生的突变体可用抗野生型SPE-C多克隆中和抗体来筛选有无毒素产生。然而，还需进一步筛选以鉴定毒素突变体在生物活性上是否至少有一种变化，较佳的是非致死性变化。还可筛选自发产生的突变体中是否有野生型SPE-C生物活性的至少一种变化的突变体。

采用如Anthony-Cahill等，Trends Biochem.Sci.14：1400(1989)中所述的体外诱变，也可进行随机诱变。

此外，SPE-C毒素突变体可通过化学合成来制得。从化学上合成蛋白的方法在Wallace，FASEB J.7：505(1993)中有所描述。可合成部分蛋白，然后用酶连接在一起，或直接化学缩合。采用化学合成尤其适用于本领域技术人员在所需位置插人非天然存在的氨基酸。此外，化学合成尤其适用于制备SPE-C毒素突变体的片段。

本文所述的任何方法均可用来形成SPE-C毒素突变体的片段。另外，片段也很容易通过限制性酶消化和/或连接来产生。产生片段的较佳的方法是通过直接化学合成(对于20个氨基酸或更少的片段来说)或通过基因克隆(对于较大片段来说)。

编码突变型毒素的DNA序列无论是定点突变还是随机突变，均可作进一步筛选，以选出与野生型SPE-C毒素生物活性不同的其它变化。这种筛选至少一种生物活性变化的筛选方法如上所述。一旦选出的DNA序列编码的SPE-C毒素突变体在生物活性上至少有一种变化，它们就可用来形成表达盒。

表达盒的形成涉及使编码SPE-C毒素突变体的DNA序列与提供SPE-C毒素突变体在宿主细胞中表达的启动子结合。对于用本文所述的PCR方法产生的那些SPE-C毒素突变体来说，存在天然的speC启动子可提供在宿主细胞中表达。

任选地，DNA序列可以与不同的启动子结合以在特定类型的宿主细胞中表达或增强在宿主细胞中的表达水平。较佳的，启动子所提供的SPE-C毒素突变体表达水平可被抗SPE-C的抗体检测到。在原核细胞中可用的其它启动子包括PLAC、PTAC、T7等。

一旦将编码SPE-C毒素突变体的DNA序列与合适的启动子结合成表达盒，就将该表达盒亚克隆到合适的转化载体中。合适的转化载体包括至少一种可检测的标记物基因，它最好是能在大肠杆菌和革兰阳性微生物中扩增的穿梭载体。合适的穿梭载体例子包括pMIN164和pCE104。其它类型的载体包括病毒载体如杆状病毒载体，SV40，痘病毒如牛痘、腺病毒和巨细胞病毒。较佳的载体是pMIN164载体，一种可在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中扩增的穿梭载体。

一旦形成了携带编码SPE-C毒素突变体表达盒的转化载体，就将其引人供表达SPE-C毒素突变体的合适宿主细胞中。合适的宿主细胞是那些能高水平表达突变型毒素并使其它不需要的分子(如内毒素和M蛋白)污染可能性最少的细胞。合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌属、酵母细胞以及昆虫细胞。

转化方法是本领域技术人员已知的，其包括原生质体转化、脂质体介导的转化、磷酸钙沉淀和电穿孔。较佳的方法是原生质体转化。

转化细胞可用来大量产生可用于疫苗组合物的突变型SEP-C毒素。转化的微生物可用于减毒活疫苗或热灭活疫苗。转化的微生物包括突变型SEP-C毒素，其用量足以刺激产生抗野生型SPE-C的保护性免疫应答。SPE-C毒素突变体宜是分泌的。该微生物最好是对人是不致病的，其包括的突变型毒素具有多个氨基酸变化，以使回复成毒性形式的可能性最小。根据已知的原理，微生物可作为活的或热灭活的疫苗来给药。作为活疫苗的较佳的微生物是转化的细胞如沙门氏菌属细菌。

病毒载体也可用于如上所述的疫苗组合物中，该载体包括的表达盒的DNA序列编码了SPE-C毒素突变体或其片段，其与在宿主细胞中起作用的启动子操作性相连。较佳的，启动子可在哺乳动物细胞中起作用。合适的病毒载体例子包括痘病毒如牛痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒等。牛痘病毒载体可用来对人免疫接种以抵抗野生型SPE-C毒素的至少一种生物活性。

本发明还包括一种疫苗组合物，该组合物包含编码SPE-C毒素突变体或其片段的核酸序列，该核酸序列与在宿主细胞中起作用的启动子操作性相连。启动子宜在哺乳动物宿主细胞中起作用。核酸序列可以是DNA或RNA。将疫苗组合物递送到宿主细胞或个体中，使SPE-C毒素突变体或其片段在个体自己的细胞中表达。SPE-C毒素突变体或其片段的核酸序列在个体中表达提供了抗野生型SPE-C毒素的保护性免疫应答。任选地，可将表达盒插入载体中。核酸分子可直接给药或在病毒载体中给药。疫苗组合物还可任选地包括将疫苗递送到细胞内的递送剂，如脂质体等。疫苗组合物还可任选地包括佐剂或其它免疫调节性化合物，以及增强细胞吸收核酸的附加化合物。疫苗组合物可通过各种途径给药，包括肠胃外途径如静脉内、腹膜内或与粘膜表面接触。

大规模生长和生产SPE-C毒素突变体的条件是本领域技术人员已知的。从微生物来源纯化SPE-C毒素突变体的方法如下。使在pMIN164中携带的野生型speC或突变体的金黄色葡萄球菌在37℃、通气下在可透析牛心培养基(含5微克/毫升红霉素)中生长至静止阶段。用四倍体积乙醇使培养物沉淀，将蛋白重新溶解在无热原水中。使粗制品在3.5至10和4至6的pH梯度中进行连续平台等电点聚焦分离。用无热原水对经抗体反应性试验具有毒性的阳性级分进行充分透析，通过15％(重量/体积)胶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来测试每一等份的纯度。抗SPE-C的多克隆中和抗体购自Toxin Technologies，Boca Raton，Fla或Dr.Schlievert。可采用其它纯化方法，包括柱层析或HPLC。

通过下列实施例可更好地了解本发明，它们代表了较佳的实例，但不应被理解成限制了本发明的范围。

                              实施例1

                     SPE-C野生型的克隆和表达

speC在大肠杆菌中的克隆和表达

为了避免基因分离需要作的毒素检测，须合成SPE-C基因的特异性寡核苷酸，用其来筛选葡萄球菌基因组文库。限制性内切核酸酶Sau 3A部分消化从T18P菌株纯化获得的链球菌DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶上洗脱下4-8kb的片段并连接入载体质粒pBR328中，该质粒已用BAMHI线性化并去磷酸化以防自身连接。然后用连接的DNA转化有氨苄青霉素抗性的感受态大肠杆菌RR1细胞。使转化体在铺盖在含氨苄青霉素LB琼脂上的硝基纤维素滤膜上生长。制备复制滤膜，通过与放射性标记过的合成的寡核苷酸进行菌落杂交，筛选大约1500个重组菌落中存在的speC基因。从六肽序列Asp-Ser-Lys-Lys-Asp-Ile(该序列对应于成熟SPE-C蛋白氨基端的前六个氨基酸(图1))衍生获得混合序列寡核苷酸的两个家族。将寡核苷酸分成两个家族，以控制探针的丰余性，并从而使非特异性杂交的可能性最小。发现两个菌落与寡核苷酸家族A杂交。没有发现菌落与家族B杂交。通过在Ouchterlony免疫扩散试验中用SPE-C抗血清的沉淀来测定杂交菌落的SPE-C表达情况。所选的一个菌落的裂解液形成了与纯化SPE-C相同的沉淀蛋白线。含有speC的重组质粒命名为pUMN501。发现RR1 pUMN501的培养上清液不含可检测量的SPE-C，这表明大肠杆菌不能分泌毒素。

亚克隆

pUMN501中的插入物约为4.0kb，边界由Sau 3A位点定界(图2)。用XbaI消化，产生2.4和1.6kb的片段，两者在连接pUC13并转化到大肠杆菌JM101(分别为pUMN512和pUMN511)中后均不能引导speC表达。较大的Sau 3A-SalI片段(3.3kb)在大肠杆菌JM101 pUMN 513中表达出speC。基因不论位于质粒启动子任一方向上均能表达，这说明插入物中有天然的链球菌启动子并可在大肠杆菌中起作用。将3.3kb Sau 3A-SalI片段克隆入M13噬菌体中，采用Dale等Plasmid13：31-40(1985)的步骤产生缺失亚克隆，以进一步定位speC基因。从M13亚克隆分离出并连接pUC13(pUMN521)的1.7kb片段能在大肠杆菌中表达speC。

                        实施例2

        大肠杆菌中获得的SPE-C的生物化学性质鉴定

通过乙醇沉淀和随后的3.5-10pH梯度制备性等电点聚焦，从大肠杆菌RR1抽提物中部分纯化出UMN501编码的SPE-C。大肠杆菌中获得的毒素迁移至与链球菌所得毒素大约相同的位置(6.5和7.2之间)。大肠杆菌和链球菌所得SPE-C在SDS-PAGE中有24000的相同分子量。尽管大肠杆菌制备物中还存在其它蛋白，但是用SPE-C特异性抗血清以免疫印迹技术测试时，只有分子量为24000的蛋白发生反应。

                          实施例3

              大肠杆菌所得SPE-C的生物性质鉴定

比较大肠杆菌和链球菌所得SPE-C的淋巴细胞促细胞有丝分裂性。使家兔脾细胞(2×10⁵细胞)接触大约0.01μg的化脓链球菌或大肠杆菌(pUMN501)的SPE-C下。3天后，培养物中加入1uCi[³H]胸苷并培育24小时，然后测定放射性标记掺入细胞DNA的情况。两种毒素制备物均诱导出相似的促分裂反应。用SPE-C抗血清培育显著减少了克隆和链球菌获得毒素的促分裂反应。

还比较了链球菌和大肠杆菌获得的SPE-C在家兔中的致热性和致死性内毒素休克的增强作用。链球菌和大肠杆菌获得的SPE-C致热原性相等；4小时后两个制备物平均升温为1.0℃。发热反应是单相的，而不象内毒素性质那样是双相的。这提示发热是由SPE-C引起的，而不是由于内毒素污染。大肠杆菌和链球菌获得的SPE-C处理过的动物均表现出对内毒素休克的易感性增强。而所有仅接受PBS和内毒素处理的对照家兔均存活下来。

这些研究确认了SPE-C在大肠杆菌中以生物活性形式表达，且其活性是由SPE-C引起而不是由同时纯化的链球菌污染物所引起。

                           实施例4

       用重组产生的SPE-C(野生型)对家兔给药和免疫接种

将重组产生的SPE-C给予家兔，7天内总共给予0.2毫升内的200μg。结果表明，用SPE-C处理过的动物产生STSS症状，几乎所有动物均在7天内死亡(数据未显示)。家兔STSS症状包括失去体重、腹泻、脸部出现花斑、发热、结膜和粘膜变红、尿液变澄清棕色。如所预计的那样，未用毒素处理过的对照动物保持健康。主要作了以下其它两项观察：1)如预计的那样，体液替换完全保护了动物；和2)没有一只经毒素处理过的动物发生坏死性筋膜炎和/或肌炎，这表明软组织损伤还需要SPE-C以外的因素。STSS临床特征的发生与SPE-C给药相关。

                         实施例5

              用PCR制备双重或三重SPE-C突变体

采用了许多方法来产生双重或三重突变型SPE-C毒素或其片段。

如上所述，用PCR法制得氨基酸序列中有两个以上改变的SPE-C毒素突变体。在第一次PCR反应中，使编码选定位点有第一变化的第一内部引物与5′和3′侧接引物联合形成第一PCR产物。该第一PCR产物是编码在氨基酸序列中有一个变化的SPE-C毒素突变体的DNA序列。然后，该第一PCR产物作为模板DNA，产生了第二PCR产物，与具有野生型SPE-C活性的蛋白相比，该产物的氨基酸序列中有两个变化。第一PCR产物作为模板DNA与编码第二位点处氨基酸变化的第二内部引物结合。第二内部引物也与5′和3′侧接引物结合，形成第二PCR产物。该第二PCR产物是编码氨基酸序列中具有两个位点变化的SPE-C毒素突变体的DNA序列。然后用该第二PCR产物用作第三反应中的模板，以形成一个产物DNA序列，它编码氨基酸序列中三个位点有变化的SPE-C毒素突变体。该方法用来产生编码氨基酸序列中具有多个变化的突变型毒素的DNA序列。

另一种制备编码多个变化的DNA序列的方法是通过自动化合成来制得编码氨基酸序列中变化的DNA序列片段。然后用几种独特的限制性位点将片段亚克隆到野生型SPE-C编码序列中。限制性位点对于本领域技术人员来说是已知的，且很容易从野生型SPE-C毒素的DNA序列来确定。用Revi等，Nucleic Acid Res.16：1030(1988)中所述的三片段连接方法，在一个步骤中实现克隆。

                           实施例6

              SPE-C单突变体和双突变体的评价

制得三个SPE-C的单氨基酸突变体：a)Y15A，15位的酪氨酸变成丙氨酸；b)Y17A，17位的酪氨酸变成丙氨酸；c)N38A，38位的天冬酰胺变成丙氨酸。还制备了两个SPE-C的双重氨基酸突变体：a)Y15A/N38A，b)Y17A/N38A。所有突变体均用Quik Change方法(Stratagene，La Jolla，CA)构建，以含speC的质粒pUMN521作为模板。pUMN521的pUC13中含有SPE-C基因(Goshom等)。

单氨基酸突变体蛋白在100毫升培养基中的大肠杆菌中产生。在50μg/ml氨苄青霉素的存在下生长后，用400毫升-20℃乙醇处理大肠杆菌培养物来裂解细胞，并使SPE C突变体蛋白沉淀。同样处理大肠杆菌中的pUMN521作为阳性对照。收集沉淀并还原到1毫升。估计毒素浓度为25μg/ml。

在毒素剂量范围为0.25至2.5×10^-5或2.5×10^-6下，评价pUMN521的野生型SPE C和三个单氨基酸突变体诱导家兔脾细胞增殖能力。如图7所示，Y15A和N38A突变体的促细胞有丝分裂性约为野生型的一半。Y17A突变体基本上没有促细胞有丝分裂性(图8)。

另外还测试了双重突变体Y15A/N38A和Y17A/N38A刺激兔脾细胞与野生型毒素作比较(图9)。两种突变体刺激的家兔脾细胞只相当于野生型毒素的1/4。

还测试了两种双重突变体增强内毒素休克的能力。用5μg/kg突变体或野生型毒素静脉内攻击家兔(三个一组)。4小时后，用10μg/kg鼠伤寒沙门氏菌内毒素(1/50LD₅₀)攻击同一动物。记录48小时内死亡情况(表4)。如表所示，两个双重突变体均不会引起家兔致死。

表4：SPE C双重氨基酸突变体增强家兔对内毒素休克易感性的能力

     处理蛋白                     死亡数目/总共测试的家兔

     SPE C野生型                         3/3

     Y15A/N38A                           0/3

     Y17A/N38A                           0/3

注意：在表4报道的研究中，所有家兔均用5μg/kg蛋白进行静脉内攻击，然后4小时后用内毒素(10μg/kg)攻击。

表4所用家兔的攻击后一周，处死动物，检查总体组织损伤。所有器官，包括肝、脾、肾、肺和心脏看来正常。这与双重突变体缺少毒性一致。

还用25μg剂量的乳化在Freund′s不完全佐剂中的SPE C双重突变体对家兔(三只一组)进行一周两次免疫接种。然后使动物休息5天。从每个动物中收集0.5毫升血液，并合并Y15A/N38A和Y17A/N38A血清收集物。用过氧化物酶为基的ELISA法(Hudson和Hay文献)比较这些合并血清与免疫前合并血清中抗纯化的链球菌所得野生型SPEC的抗体。表5归纳了ELISA的结果。

表5：用SPEC的Y15A/N38A和Y17A/N38A突变体免疫接种家兔的ELISA抗体滴度^*

                     测试样品                  ELISA滴度：

Y15A/N38A            免疫前                    ＜10^*

                     免疫后                    80

Y17A/N38A            免疫前                    ＜10

                     免疫后                    80

^*测试抗体的血清作2倍系列稀释，从1:10开始。抗体滴度是490nm下吸光度人于等于0.1的最高一次稀释度的相反数。

然后用5μg/kg野生型SPE C攻击免疫接种过的动物，4小时后用10μg/kg鼠伤寒沙门氏菌内毒素测试免疫接种抵抗致死性的能力。表6表明动物可免受攻击，因此对SPE C有免疫力。

表6：用野生型SPE C和内毒素击Y15A/N38A和Y17A/N38A免疫动物

         家免组                     死亡数目/总的测试数

         未免疫                            2/2

         Y15A/N38A免疫                     0/3

         Y17A/N38A免疫                     0/3

还制备了SPE C的其它单氨基酸突变体。这些突变残基包括毒性所需的三个主要结构域中的残基。它们包括T细胞受体结合区域、II类MHC结合区域和沿中央对角线α螺旋背侧的残基。表7中列出了变化的残基和突变对T细胞促有丝分裂性的效果。

表7：SPE C变体对T淋巴细胞促细胞有丝分裂性和致死性的效果

突变体                          生物活性

                 促细胞有丝分裂性^a     致死性^b

D12A             未测试                  0/2

H35A             100％野生型             未测试

N38D             未测试                  0/2

K135D            野生型的50％            未测试

K138D            野生型的62％            未测试

Y139A            野生型的54％            未测试

D142N            野生型的52％            未测试

^a在0.1μg/孔剂量下比较

^b家兔死亡(由于对内毒素易感性的增强)数目/注射总数；2/2，接受野生型SPEC的动物死亡。

本发明已经根据各种具体和较佳的实例和技术方案进行了描述。然而，应当理解在本发明精神和范围内还可作许多变化和改动。

本说明书中的所有出版物和专利申请均表示了本发明所属领域普通技术人员的水平。所有出版物和专利申请均以相同程度纳入本文作参考，正如每一出版物或专利申请单独和具体作为参考那样。

Claims (14)

1.一种分离的链球菌毒素C突变体，它包含在天冬氨酸-12、酪氨酸-15、酪氨酸-17、组氨酸-35、天冬酰胺-38上的1至3个氨基酸取代。

2.根据权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体，它包括天冬氨酸-12取代成丙氨酸，酪氨酸-15取代成丙氨酸，酪氨酸-17取代成丙氨酸，组氨酸-35取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成天冬氨酸。

3.根据权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体，它包括酪氨酸-15和天冬酰胺-38的取代。

4.根据权利要求3所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中取代是酪氨酸-15取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成丙氨酸。

5.根据权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体，它包括酪氨酸-17的取代和天冬酰胺-38的取代。

6.根据权利要求5所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中取代是酪氨酸-17取代成丙氨酸，天冬酰胺-38取代成丙氨酸。

7.根据权利要求1-6任一项所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中该毒素是不致死的。

8.根据权利要求1-6任一项所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中该毒素是不致死且有抗原性。

9.根据权利要求1-6任一项所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中毒素是不致死的，但保留了与野生型链球菌毒素C相当的促有丝分裂性。

10.根据权利要求1-6任一项所述的分离的链球菌毒素C突变体，其中毒素不增强内毒素休克作用。

11.一种编码权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体的DNA序列。

12.一种稳定转化的宿主细胞，该细胞包含权利要求11所述的DNA序列。

13.权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体在制备用于给动物接种以抵抗野生型链球菌毒素C的至少一种生物活性的药物中的用途。

14.权利要求1所述的分离的链球菌毒素C突变体在制备用于给动物接种以抵抗毒性休克的药物中的用途。

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