KR20180100412A - 면역강화제에 의해 증진되는 초항원 매개된 암 면역요법 - Google Patents

면역강화제에 의해 증진되는 초항원 매개된 암 면역요법 Download PDF

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KR20180100412A
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애서 네이션
미할 샤하르
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네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

본 발명은 초항원을 면역강화제 (예를 들어, PD-1 억제제)와 조합하여 사용함으로써 대상체에서 표적화된 암 면역요법의 효력을 증진시키기 위한 방법 또는 조성물을 제공한다.

Description

면역강화제에 의해 증진되는 초항원 매개된 암 면역요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 1월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/276,955의 이익 및 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 초항원 매개된 암 면역요법의 효력을 증진시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로 암 세포가 대상체의 면역계를 피하는 것을 방지하는 면역강화제를 사용한 초항원 매개된 암 면역요법에 관한 것이다.
미국 암 학회에 따르면, 미국에서 1백만명 초과의 사람들이 매년 암으로 진단된다. 암은 한번은 천연 제어 메카니즘에 따랐지만 비제어된 방식으로 계속 증식하는 암성 세포로 전환된 세포의 비제어된 증식으로부터 유발되는 질환이다. 최근 수년간, 대상체의 면역계가 암 세포를 찾아 이를 파괴하도록 활용하려 시도한 수많은 면역요법이 개발되었다. 이러한 면역요법은, 예를 들어 신체에 의해 만들어진 천연 분자를 사용하여 암과 싸우기 위해 신체의 자연 방어를 부스팅하도록 설계된 것, 또는 대안적으로, 면역계 기능을 개선시키거나, 더 잘 표적화하거나 또는 회복시키도록 설계된 재조합 분자의 투여를 통한 것을 포함한다. 특정 면역요법은 일반적인 면역계 증진제인 것으로 공지된 화합물, 예컨대 시토카인, 예를 들어 IL-2 및 인터페론의 투여를 포함한다. 지금까지 개발된 다양한 면역요법이 효능을 나타냈지만, 이들은 예를 들어 오프-타겟 활성, 시토카인 폭풍에 대한 잠재력을 포함한 투여되는 활성제에 대한 알레르기 반응, 활성제에 결합하여 이를 중화시키는 항체의 자극에 의해 유발된 효력의 상실, 혈액 세포 수의 감소 및 피로를 포함한 부작용과 연관될 수 있다.
다른 면역요법은 암에 대한 면역 반응을 증진시키는, 면역 체크포인트 억제제로서 지칭되는 분자를 이용한다. 이러한 체크포인트 억제제는 면역 억제 체크포인트를 차단하는 암 세포의 능력을 억제하는 기능을 하여 항암 요법의 효력의 증진을 가져온다. 제1-세대 면역 체크포인트 억제제인 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®; 브리스톨-마이어스 스큅)은 2011년에 미국 식품 의약품국에 의해 승인되었고, ADCC-매개된 조절 T-세포 (Treg) 세포독성을 유발할 수 있는 IgG1 모노클로날 항체이다. 수년에 걸쳐, 면역요법 및 화학요법의 조합인 면역화학요법은 특정 암의 치료에서 중요하게 되었다. 예를 들어, 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®; 로슈)은 CD20-발현 세포를 고갈시키고 R-CHOP로 공지된 리툭시맙 (R), 시클로포스파미드 (C), 히드록시다우노루비신 (H), 온코빈 (O) 및 프레드니손 (P)을 사용하는 B-세포 림프종, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료의 표준 성분이 된 CD-20-특이적 모노클로날 항체이다.
최근에, PD-1과 PD-L1 사이의 억제 신호를 방지하는 PD-1 억제제, 예컨대 니볼루맙 및 펨브롤리주맙이 승인되었다. 이들 약물이 일부 환자에서 지속적인 반응을 강화시켰지만, 단독요법으로서의 이들 약물의 반응률은 21%의 범위로 낮았고, 완전 반응률은 여러 연구에서 약 1%였다.
환자 결과를 개선시키기 위해 다양한 암 요법을 조합하려는 노력이 진행 중이고 일부 조합은 효능에 있어서 이익을 나타냈지만, 약물을 조합하는 것이 심각한 부작용을 강화시킬 수 있으므로 안전성은 주요 관심사가 되었다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체를 단독으로 받은 환자와 비교하여 항-CTLA-4 및 항-PD1 항체를 조합으로 받은 환자의 상당수에서 등급 3 또는 4의 약물-관련 유해 사건이 보고되었다. 따라서, 면역요법 및 종양학 분야에서 이루어진 상당한 개발에도 불구하고, 암을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 면역요법에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
최근 수년간, 대상체의 면역계가 암 세포를 찾아 이를 파괴하도록 활용하려 시도한 수많은 면역요법이 개발되었다. 인간 면역계가 암 세포를 제거하기 위한 잠재력을 가지고 있지만, 특정 암 세포는 숙주의 면역계를 "끄거나", "하향 조절하거나", 또는 다르게는 피하는 능력을 발달시켜 암성 세포가 검사되지 않은 채 계속 성장 및 증식하게 한다.
본 발명은 대상체에서의 암에 대한 표적화된 면역 반응이, (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극할 수 있거나, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제할 수 있거나, (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제할 수 있거나, 또는 (d) 상기 중 2개 이상의 조합을 제공할 수 있는 면역강화제와 초항원-기반 요법을 조합함으로써 유의하게 증진될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.
한 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 (i) 대상체 내 암성 세포에 의해 우선적으로 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 접합체인 초항원 접합체의 유효량, 및 (ii) (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 (즉, 비-인간 IgG1-매개된 면역 반응 경로를 통해) T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 적어도 1개 이상에 효과적인 면역강화제 (예를 들어, 체크포인트 경로 억제제)의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 강화시켜 암을 치료하는 것을 포함한다. 초항원-기반 요법은 T-세포로부터 인터페론 γ의 분비를 상향조절할 수 있으며, 이는 차례로 PD-L1 발현을 상향조절할 수 있다. 그러나, 지금까지, 이러한 부정적 영향이 증가된 항원성의 긍정적 효과를 상쇄하는 PD-1 억제제에 의해 완화될 수 있었는지는 공지되지 않았다. 본 발명에 이르러 초항원 접합체-기반 요법이 PD1 억제제의 반응률에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있거나 또는 다르게는 임상 결과에 영향을 미칠 수 있는 것으로 발견되었다.
특정 실시양태에서, 초항원 접합체는 면역강화제 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 추가로, 초항원 접합체 및 면역강화제는 효력 및/또는 선택적으로 치료 효과를 증진시키는 1종 이상의 추가의 작용제와 함께 또는 순차적으로 공-투여될 수 있다. 이러한 작용제는, 예를 들어 코르티코스테로이드, 추가의 면역 조정제, 및 투여된 초항원 접합체에 대한 환자의 가능한 면역반응성을 감소시키도록 설계된 그러한 화합물을 포함한다. 예를 들어, 투여된 초항원에 대한 면역반응성은, 예를 들어 대상체에서 항-초항원 항체의 생산을 감소시키는 항-CD20 항체 및/또는 항-CD19 항체와의 공-투여를 통해 감소될 수 있다.
특정 실시양태에서, 초항원 접합체에 존재하는 초항원은 T-세포, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 표면 상의 T-세포 수용체에 결합한다. 초항원은 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 B, 그의 면역학적 반응성 변이체, 또는 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 B 또는 그의 면역학적 변이체의 면역학적 반응성 단편을 포함할 수 있다. 접합체의 표적화 모이어티는 바람직하게는 암 세포 상에서 발현된 항원에 결합하여 초항원이 암 세포에 결합하도록 한다. 표적화 모이어티는 암성 세포에 의해 발현된 1종 이상의 상이한 항원, 예를 들어 1종 이상의 세포 표면 항원에 우선적으로 결합함으로써 암성 세포에 접합체를 표적화하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 항원은, 예를 들어 암 세포 뿐만 아니라 특정 암 줄기 세포 상에 존재하는 5T4 종양태아성 암 항원이다. 다양한 표적화 모이어티가 최초 항원을 발현하는 암성 세포에 초항원을 표적화하는데 사용될 수 있지만, 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체, 예를 들어 항-5T4 항체이다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 5T4에 결합하는 Fab 단편이다. 특정 실시양태에서, 접합체 내의 초항원은 서열식별번호: 7의 아미노산 226-458 (또한 서열식별번호: 8의 잔기 226-458), 또는 그의 면역학적 반응성 변이체, 또는 상기 각각의 면역학적 반응성 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역강화제는 체크포인트 경로 억제제이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역강화제는 암성 세포의 표면 상에서 발현되는 프로그램화된 세포 사멸-리간드 (PD-L), 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2의 발현 또는 그의 활성을 감소시킨다. PD-L은 T-세포 상에서 발현되는 프로그램화된 세포 사멸-1 수용체 (PD-1)에 결합하는 리간드이다. 특정 암 세포는 PD-L을 발현하여 PD-1 체크포인트 경로를 통해 T-세포의 활성화 또는 활성을 감소시킴으로써 대상체의 면역계를 피한다. 특정 실시양태에서, 면역강화제는 PD-L, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2가 T-세포의 표면 상에서 발현된 PD-1에 결합하는 것을 방지하는 항-PD-1 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 이소형보다 훨씬 더 낮은 항체-의존성 세포-매개된 독성 (ADCC)을 유도하는 인간 IgG4 이뮤노글로불린 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 한다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 PD-1 억제제는 (i) 항-PD-1 항체, 예를 들어 MK-3475 (머크 & 캄파니), 피딜리주맙 (큐어테크), AMP-224 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 AMP-514 (아스트라제네카/메드이뮨), 및 (ii) 항-PD-L1 항체, 예를 들어 MPDL3280A (제넨테크/로슈), MEDI-4736 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 MSB0010718C (이엠디 세로노/머크 카게아)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다른 잠재적인 면역강화제, 예컨대 4-1BB (CD137) 효능제 (예를 들어, 완전 인간 IgG4 항-CD137 항체 우렐루맙/BMS-663513), LAG3 억제제 (예를 들어, 인간화 IgG4 항-LAG3 항체 LAG525, 노파르티스); IDO 억제제 (예를 들어, 소분자 INCB024360, 인사이트 코포레이션), TGFβ 억제제 (예를 들어, 소분자 갈루니세르팁, 일라이 릴리) 및 T-세포 및/또는 종양 세포 상에서 발견되며 ADCC를 통하지 않고 효능제/길항제 상호작용에 기초한 제약 개입을 받아들이는 다른 수용체 또는 리간드가 사용될 수 있다.
방법은 다양한 암, 예를 들어 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 대상체 내 암성 세포에 의해 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 접합체인 초항원 접합체의 유효량, (ii) 대상체에서 하기 (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 (즉, 비-인간 IgG1-매개된 면역 반응 경로를 통해) T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 적어도 1개 이상에 효과적인 면역강화제의 유효량, 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 접합체의 초항원 성분은 T-세포의 세포 표면 상에서 발현된 T-세포 수용체에 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 초항원은 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 B, 그의 면역학적 반응성 변이체, 또는 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 B 또는 그의 변이체의 면역학적 반응성 단편을 포함한다. 접합체 내의 표적화 모이어티는 암성 세포에서 발현된 1종 이상의 항원에 접합체를 표적화할 수 있는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 접합체에 의해 표적화되는 최초 항원은 세포 표면 항원, 예를 들어 5T4 종양태아성 암 항원이다. 다양한 표적화 모이어티가 암성 세포에서 발현된 항원에 접합체를 표적화하는데 사용될 수 있지만, 한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체, 예를 들어 항-5T4 항체이다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 5T4 항원에 결합하는 Fab 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체 내의 초항원은 서열식별번호: 7의 서열의 아미노산 잔기 226-458 (또한 서열식별번호: 8의 잔기 226-458) 또는 그의 면역학적 반응성 변이체, 또는 상기 각각의 면역학적 반응성 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역강화제는 암성 세포에서 발현된 PD-L (예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2)이 T-세포 상에서 발현된 PD-1 수용체에 결합하는 것을 방지하여 T-세포의 활성화 및/또는 활성을 감소시킨다. 예를 들어, 면역강화제는 PD-1 체크포인트 경로 억제제, 예를 들어 항-PD-1 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 바람직하게는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 이소형보다 훨씬 더 낮은 ADCC를 유도하는 인간 이뮤노글로불린 IgG4 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 특색은 하기 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 기재된다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특색 및 이점은 첨부 도면에 예시된 바와 같은, 하기 바람직한 실시양태의 기재로부터 분명해질 것이다. 참조된 바와 같이 요소는 상응하는 도면에서의 공통 특색을 확인시켜 준다. 도면은 반드시 스케일링될 필요는 없고, 대신 본 발명의 원리를 예시하는데 중점을 두며, 여기서
도 1은 초항원 접합체 및 면역강화제를 사용하는 본 발명의 예시적인 치료 방법의 개략적 표현이다;
도 2는 특정 야생형 및 변형된 초항원에서의 상동 A-E 영역을 보여주는 서열 정렬이다;
도 3은 예시적인 초항원 접합체에 상응하는 아미노산 서열이다;
도 4는 비소세포 폐 (NSCLC) 세포주인 HCC827의 생존율에 대한 아니아라(ANYARA)® 및 키트루다(KEYTRUDA)® 단독 또는 조합의 효과를 예시하는 막대 차트이다. T-세포와 공동-배양된 HCC827 세포의 생존율은 아니아라® (0.1μg/ml) 및/또는 키트루다® (0.2μg/ml) 또는 배지 단독 (대조군)을 사용한 처리의 48시간 후에 측정하였다. n=3-6; 평균 ± SD * p < 0.05, ** p < 0.02; *** p< 0.005 (양측 스튜던트 t 검정에 의해 결정됨);
도 5는 NSCLC 세포주인 HCC827의 생존율에 대한 아니아라® 및 키트루다® 단독 또는 조합의 효과를 예시하는 막대 차트이다. T-세포와 공동-배양된 HCC827 세포의 생존율은 아니아라® (10μg/ml) 및/또는 키트루다® (0.2μg/ml) 또는 배지 단독 (대조군)을 사용한 처리의 48시간 후에 측정하였다. n=3-6; 평균 ± SD. * p = 0.005, ** p < 0.005; *** p < 0.0005 (양측 스튜던트 t 검정에 의해 결정됨); 및
도 6은 B16-EpCAM 마우스 흑색종 모델에서 폐 종양 부담에 대한 C215Fab-SEA 및 항-PD-1 mAb 단독 또는 조합의 효과를 예시하는 막대 차트이다. 마우스에 B16-EpCAM 흑색종 세포를 정맥내로 접종하고, C215Fab-SEA (0.5μg/마우스) 및/또는 항-PD-1 mAb (200μg/마우스)로 처리하였다. 대조군에 PBS를 주사하였다. 제21일에, 마우스를 희생시키고, 폐를 제거하고, 종양의 수를 계수하였다. n=7-8마리 마우스/군; 평균 ± SEM. * p = 0.05, ** p < 0.001 (ANOVA에 의해 결정됨).
본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체에서의 암에 대한 표적화된 면역 반응이, (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극할 수 있거나, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제할 수 있거나, (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제할 수 있거나, 또는 (d) 상기 중 2개 이상의 조합을 제공할 수 있는 면역강화제와 초항원-기반 요법을 조합함으로써 유의하게 증진될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 면역강화제 (예를 들어, PD-1 억제제)와 함께 종양-표적화된 초항원 (TTS; 면역요법의 형태)을 투여하는 것은 초항원 및 면역강화제가 함께 조합되었을 때 그 둘 다에 대한 증진된 항암 효과를 유발하여 (즉, 작용제가 상승작용적으로 작용함), 각각의 작용제가 단독으로 투여되었을 때 상가적 효과보다 더 큰 효과를 가져올 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 (i) 대상체 내 암성 세포에 의해 우선적으로 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 접합체인 초항원 접합체의 유효량, 및 (ii) (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 (즉, 비-인간 IgG1-매개된 면역 반응 경로를 통해) T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 적어도 1개 이상에 효과적인 면역강화제 (예를 들어, 체크포인트 경로 억제제)의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 강화시켜 암을 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 대상체 내 암성 세포에 의해 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 접합체인 초항원 접합체의 유효량, (ii) 대상체에서 (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 (즉, 비-인간 IgG1-매개된 면역 반응 경로를 통해) T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 적어도 1개 이상에 효과적인 면역강화제의 유효량, 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 다음과 같이 정의된다.
본원에 사용된 단수 형태의 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다. 예를 들어, "초항원 및 면역강화제를 사용한 치료"와 같은 기재는 다음을 사용한 치료를 의미할 수 있다: 1종의 초항원 및 1종의 면역강화제; 1종 초과의 초항원 및 1종의 면역강화제; 1종의 초항원 및 1종 초과의 면역강화제; 또는 1종 초과의 초항원 및 1종 초과의 면역강화제.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 최적화되거나, 조작되거나 또는 화학적으로 접합된 무손상 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 완전 인간 항체, 반합성 항체 또는 완전 합성 항체를 포함한 파지 디스플레이 항체)을 포함한, 무손상 항체 (예를 들어, 무손상 모노클로날 항체) 또는 항체의 항원-결합 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 최적화된 항체의 예는 친화도-성숙 항체이다. 조작된 항체의 예는 Fc 최적화된 항체, 면역원성을 감소시키도록 조작된 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 쇄 항체 (예를 들어, scFv), 미니바디 및 디아바디를 포함한다. 독소 모이어티에 접합된 항체는 화학적으로 접합된 항체의 예이다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 의미하는 것으로 이해된다. 암의 예는 흑색종, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암 (예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종 및 폐 편평세포 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포성암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 골암, 뇌암, 망막모세포종, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 뿐만 아니라 두경부암, 검 또는 설암을 포함한다. 암은 암 또는 암성 세포를 포함하고, 예를 들어 암은 복수의 개별 암 또는 암성 세포, 예를 들어 백혈병, 또는 복수의 연관된 암 또는 암성 세포를 포함하는 종양을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역원"은 면역 반응을 유발 (촉발, 유도 또는 야기)하는 분자이다. 이 면역 반응은 항체 생산, 특정 세포, 예컨대, 예를 들어 특정 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 면역원은 많은 유형의 물질, 예컨대, 비제한적으로 유기체로부터의 분자, 예컨대, 예를 들어 단백질, 단백질의 서브유닛, 사멸 또는 불활성화된 전세포 또는 용해물, 합성 분자, 및 폭넓게 다양한 생물학적 및 비생물학적 둘 다의 다른 작용제로부터 유래될 수 있다. 실질적으로 모든 단백질을 포함한, 본질적으로 임의의 거대분자 (자연 발생 거대분자 또는 재조합 DNA 접근법을 통해 생산된 거대분자를 포함함)가 면역원으로서 역할을 할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 유발 (촉발, 유도 또는 야기)하는 면역원의 능력에 관한 것이다. 상이한 분자는 상이한 정도의 면역원성을 가질 수 있고, 또 다른 분자와 비교하여 더 큰 면역원성을 갖는 분자는, 예를 들어 더 낮은 면역원성을 갖는 작용제보다 더 큰 면역 반응을 유발 (촉발, 유도 또는 야기)할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "항원"은 항체, 특정 면역학적-적격 세포, 또는 둘 다에 의해 인식되는 분자를 지칭한다. 항원은 많은 유형의 물질, 예컨대, 비제한적으로 유기체로부터의 분자, 예컨대, 예를 들어 단백질, 단백질의 서브유닛, 핵산, 지질, 사멸 또는 불활성화된 전세포 또는 용해물, 합성 분자, 및 폭넓게 다양한 생물학적 및 비생물학적 둘 다의 다른 작용제로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원성"은 항체, 특정 면역학적-적격 세포, 또는 둘 다에 의해 인식되는 항원의 능력에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 조직적합성의 중요한 결정기인, 항원 제시에 수반되는 진화론적으로 관련된 세포 표면 단백질을 다수가 코딩하는 유전자의 특정 클러스터를 지칭한다. 부류 I MHC 또는 MHC-I은 주로 CD8+ T 림프구 (CD8+ T-세포)에 대한 항원 제시에서 기능한다. 부류 II MHC 또는 MHC-II는 주로 CD4+ T 림프구 (CD4+ T-세포)에 대한 항원 제시에서 기능한다.
본원에 사용된 용어 "유래된", 예를 들어 "로부터 유래된"은, 예를 들어 생물학적 숙주, 예컨대 박테리아, 바이러스 및 진핵 세포 및 유기체로부터 유래된 야생형 분자, 및 예를 들어 화학적 수단에 의해 변형되거나 재조합 발현 시스템에서 생산된 변형된 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "혈청반응성인", "혈청반응" 또는 "혈청반응성"은 포유동물, 예컨대, 비제한적으로 인간의 혈청에서 항체와 반응하는 작용제, 예컨대 분자의 능력을 의미하는 것으로 이해된다. 이것은 항체가 작용제를 불활성화 또는 중화시키는지 여부에 상관없이, 예를 들어 분자에 특이적인 항체 및 분자에 결합하는 비특이적 항체를 포함한 모든 유형의 항체와의 반응을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 상이한 작용제는 서로에 대해 상이한 혈청반응성을 가질 수 있으며, 여기서 또 다른 작용제보다 더 낮은 혈청반응성을 갖는 작용제는, 예를 들어 더 적은 항체와 반응하고/거나 더 높은 혈청반응성을 갖는 작용제보다 항체에 대해 더 낮은 친화도 및/또는 결합력을 가질 것이다. 이것은 또한 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간에서 항체 면역 반응을 도출하는 작용제의 능력을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가용성 T-세포 수용체" 또는 "가용성 TCR"은, 수용체 쇄의 막횡단 영역이 결실 또는 돌연변이되어 수용체가 세포에 의해 발현될 때 막 내로 삽입, 횡단하지 않거나 또는 다르게는 그와 회합하지 않는 경우를 제외하고, 전장 (예를 들어, 막 결합된) 수용체의 쇄를 포함하는 "가용성" T-세포 수용체를 의미하는 것으로 이해된다. 가용성 T-세포 수용체는 야생형 수용체의 도메인의 단지 세포외 도메인 또는 세포외 단편만을 포함할 수 있다 (예를 들어, 막횡단 및 세포질 도메인이 결여되어 있음).
본원에 사용된 용어 "초항원"은 MHC 부류 II 분자 및 T-세포 수용체의 Vβ 도메인에 결합하여, 특정한 Vβ 유전자 절편을 발현하는 T-세포를 활성화시킴으로써, T-세포의 하위세트를 자극하는 분자의 부류를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 용어는 야생형, 자연 발생 초항원, 예를 들어 특정 박테리아로부터 단리된 것 또는 그로부터의 비변형 유전자로부터 발현된 것, 뿐만 아니라 변형된 초항원을 포함하며, 여기서 예를 들어 초항원을 코딩하는 DNA 서열은, 예를 들어 표적화 모이어티를 갖는 융합 단백질을 생산하고/거나 초항원의 특정 특성, 예컨대, 비제한적으로 그의 MHC 부류 II 결합 (예를 들어, 친화도를 감소시키기 위함) 및/또는 그의 혈청반응성, 및/또는 그의 면역원성, 및/또는 항원성 (예를 들어, 그의 혈청반응성을 감소시키기 위함)을 변경하기 위해, 예를 들어 유전자 조작에 의해 변형되었다. 정의는 본원 또는 하기 미국 특허 및 특허 출원에 기재된 야생형 및 변형된 초항원 및 그의 임의의 면역학적 반응성 변이체 및/또는 단편을 포함한다: 미국 특허 번호 5,858,363, 6,197,299, 6,514,498, 6,713,284, 6,692,746, 6,632,640, 6,632,441, 6,447,777, 6,399,332, 6,340,461, 6,338,845, 6,251,385, 6,221,351, 6,180,097, 6,126,945, 6,042,837, 6,713,284, 6,632,640, 6,632,441, 5,859,207, 5,728,388, 5,545,716, 5,519,114, 6,926,694, 7,125,554, 7,226,595, 7,226,601, 7,094,603, 7,087,235, 6,835,818, 7,198,398, 6,774,218, 6,913,755, 6,969,616, 및 6,713,284, 미국 특허 출원 번호 2003/0157113, 2003/0124142, 2002/0177551, 2002/0141981, 2002/0115190, 2002/0051765, 및 2001/0046501, 및 PCT 국제 공개 번호 WO/03/094846.
본원에 사용된 용어 "표적화 모이어티"는 세포 분자, 예를 들어 세포 표면 분자, 바람직하게는 질환 특이적 분자, 예컨대 암 (또는 암성) 세포 상에서 우선적으로 발현된 항원에 결합할 수 있는 임의의 구조, 분자 또는 모이어티를 지칭한다. 예시적인 표적화 모이어티는 항체 (그의 항원 결합 단편을 포함함) 등, 가용성 T-세포 수용체, 인터류킨, 호르몬 및 성장 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양-표적화된 초항원" 또는 "TTS" 또는 "암-표적화된 초항원"은 1종 이상의 표적화 모이어티와 공유 연결된 (직접적으로 또는 간접적으로) 1종 이상의 초항원을 포함하는 분자를 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "T-세포 수용체"는 T-세포에 특이적인 수용체를 의미하는 것으로 이해되고, 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 용어의 이해를 포함한다. 용어는 또한, 예를 들어 불변 CD3 쇄와의 복합체로서 세포 막에서 발현된 고도 가변 α 또는 β 쇄의 디술피드-연결된 이종이량체를 포함하는 수용체, 및 T-세포의 하위세트 상에서 CD3과의 복합체로서 세포 막에서 발현된 가변 γ 및 δ 쇄로 구성된 수용체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 질환 또는 상태를 치료하는데 있어서 적어도 일부 효과를 나타내는 활성제, 예를 들어 제약 활성제 또는 제약 조성물의 양을 의미하는 것으로 이해된다. 치유적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용된 제약 활성제(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 전반적 건강에 따라 다르다. 이들 용어는 상승작용적 상황, 예컨대 단일 작용제 단독, 예컨대 초항원 접합체 또는 면역강화제 (예를 들어, 항-PD-1 항체)는 약하게 작용하거나 전혀 작용하지 않을 수 있지만, 예를 들어, 비제한적으로 순차적 투여를 통해 서로 조합되었을 때 2종 이상의 작용제는 상승작용적 결과를 나타내도록 작용하는 것인 본 발명에 기재된 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 포유동물, 예를 들어 인간에서의 질환의 치료를 의미하는 것으로 이해된다. 이것은 다음을 포함한다: (a) 질환을 억제하는 것, 즉, 그의 발달을 저지하는 것; 및 (b) 질환을 경감시키는 것, 즉, 질환 상태의 퇴행을 유발하는 것; 및 (c) 질환을 치유하는 것. 치유적 치료와 관련하여 사용된 용어 "방지하다" 또는 "차단하다"는 주어진 행위, 작용, 활동 또는 사건을 완전히 방지 또는 차단하거나, 또는 완전히는 아니지만 방지 또는 차단하는 (예를 들어, 부분적으로 방지 또는 차단하는) 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "암의 성장을 억제하다"는 시험관내 또는 생체내에서 암 또는 암성 세포의 성장 속도를 측정가능하게 저속화, 정지 또는 역전시키는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 세포 성장 속도의 결정에 적합한 검정을 사용하여 결정된 바와 같이, 성장 속도는 20%, 30%, 50% 또는 70% 또는 그 초과로 저속화된다. 전형적으로, 성장 속도의 역전은 신생물성 세포에서 세포 사멸의 괴사 또는 아폽토시스 메카니즘을 개시 또는 가속화시켜, 신생물의 수축을 유발함으로써 달성된다.
본원에 사용된 용어 "변이체", "변이체들", "변형된", "변경된", "돌연변이된" 등은 참조 단백질, 펩티드 또는 다른 화합물과 상이한 단백질 또는 펩티드 및/또는 다른 작용제 및/또는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 의미에서의 변이체는 하기 및 다른 곳에 보다 상세하게 기재된다. 예를 들어, 변이체의 핵산 서열 내 변화는 침묵성일 수 있으며, 예를 들어 이들은 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 변경하지 않을 수 있다. 변경이 이러한 유형의 침묵 변화에 제한되는 경우에 변이체는 참조 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩할 것이다. 변이체의 핵산 서열 내 변화는 참조 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드의 아미노산 서열을 변경할 수 있다. 이러한 핵산 변화는 하기에 논의된 바와 같이, 참조 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드에 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및/또는 말단절단을 유발할 수 있다. 일반적으로, 참조 및 변이체의 아미노산 서열은 전반적으로 유사하고 많은 영역에 있어서 동일하므로, 상기 서열에서의 차이는 제한적이다. 변이체 및 참조 단백질 또는 펩티드는 1개 이상의 치환, 부가, 결실, 융합 및/또는 말단절단 (이는 임의의 조합으로 존재할 수 있음)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 변이체는 또한 말단 또는 내부 결실에 의한 것과 같이 참조 서열보다 더 짧음으로써 참조 단백질 또는 펩티드 서열과 상이한 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 또 다른 변이체는 또한 참조 단백질 또는 펩티드와 본질적으로 동일한 기능 또는 활성을 유지하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 변이체는 또한 다음일 수 있다: (i) 아미노산 잔기 중 1개 이상이 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되는 것일 수 있거나 아닐 수 있는 것인 변이체, 또는 (ii) 아미노산 잔기 중 1개 이상이 치환기를 포함하는 것인 변이체, 또는 (iii) 성숙 단백질 또는 펩티드가 또 다른 화합물, 예컨대 단백질 또는 펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것인 변이체, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙 단백질 또는 펩티드, 예컨대 리더 또는 분비 서열, 또는 성숙 단백질 또는 펩티드의 정제에 사용되는 서열에 융합된 것인 변이체. 변이체는 돌연변이유발 기술, 및/또는 핵산, 아미노산, 세포 또는 유기체에 적용된 것들을 포함한 변경 메카니즘, 예컨대 화학적 변경, 융합, 보조물 등에 의해 제조될 수 있고/거나 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "순차적 투여" 및 관련 용어는 적어도 1종의 면역강화제와 함께 적어도 1종의 초항원을 투여하는 것을 지칭하고, 이들 작용제의 시차를 둔 용량 (즉, 시간상-시차를 둠) 및 투여량에서의 변화를 포함한다. 이것은 하나의 작용제가 또 다른 작용제의 투여 전에 투여되거나, 그와 중첩되거나 (부분적으로 또는 총체적으로), 또는 그 후에 투여되는 것을 포함한다. 이 용어는 일반적으로 적어도 1종의 초항원 및 적어도 1종의 면역강화제의 상승작용적 조합을 달성하기 위해 최상의 투여 계획을 고려한다. 이러한 투여 전략 (예를 들어, 순차적 투여)에 의해, 본 발명자들은 조합된 초항원 및 면역강화제 투여의 상승작용적 효과를 달성할 수 있을 수 있다. 추가로, 용어 "순차적 투여" 및 관련 용어는 또한 적어도 1종의 초항원, 1종의 면역강화제 및 보다 많은 임의적인 추가의 화합물, 예컨대, 예를 들어 코르티코스테로이드, 면역 조정제, 및 대상체에게 투여되는 초항원 접합체에 대한 잠재적 면역반응성을 감소시키도록 설계된 또 다른 작용제의 투여를 포함한다.
본원에 사용된, 투여와 관련된 용어 "전신" 및 "전신으로"는 작용제가 단지 신체의 국재화된 부분, 예컨대, 비제한적으로 종양 내 보다는 전신과 연관된 적어도 1개의 계, 예컨대, 비제한적으로 순환계, 면역계 및 림프계에 노출되도록 하는 작용제의 투여를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어 전신 요법 또는 전신으로 투여되는 작용제는, 요법 또는 작용제에 단지 표적 조직 보다는 반대로 전신과 연관된 적어도 1개의 계가 노출되는 것인 요법 또는 작용제이다.
본원에 사용된 용어 "비경구 투여"는 화합물이 장을 통한 흡수를 수반하지 않고 대상체 내로 흡수되는 투여의 임의의 형태를 포함한다. 본 발명에 사용되는 예시적인 비경구 투여는 근육내, 정맥내, 복강내 또는 관절내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "약"이 정량적 값 앞에 사용된 경우에, 본 발명은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 특정 정량적 값 그 자체를 또한 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약"은, 달리 나타내거나 암시되지 않는 한, 공칭 값으로부터의 ±10% 편차를 지칭한다.
본 명세서의 다양한 곳에서, 값은 군 또는 범위로 개시된다. 구체적으로 그 기재는 이러한 군 및 범위의 구성원의 각각의 및 모든 개별 하위조합을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 0 내지 40 범위의 정수는 구체적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40을 개별적으로 개시하는 것으로 의도되고, 1 내지 20 범위의 정수는 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20을 개별적으로 개시하는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 조성물 및 키트가 특정 성분을 갖거나, 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것으로 기재되는 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것으로 기재되는 경우, 추가적으로, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 본 발명의 조성물 및 키트가 존재하고, 언급된 공정 및 방법 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.
추가로, 본원에서 명백하든 암시적이든 간에, 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않는 한, 본원에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특색은 다양한 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말해서, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 정확한 출원이 기록되고 그려질 수 있도록 하는 방식으로 기재 및 도시되었지만, 실시양태는 본 발명의 교시 및 본 발명(들)으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합 또는 분리될 수 있는 것으로 의도되고 인지될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재 및 도시된 모든 특색은 본원에 기재 및 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용가능할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
II. 초항원 접합체
A. 초항원
초항원은, 예를 들어 피코몰 농도에서 T 림프구를 활성화시킬 수 있는 박테리아 단백질, 바이러스 단백질 및 인간-조작된 단백질이다. 초항원은 또한 T 림프구의 많은 하위세트 (T-세포)를 활성화시킬 수 있다. 초항원은 프로세싱되지 않으면서 주요 조직적합성 복합체 I (MHCI)에 결합할 수 있고, 특히 통상적인 펩티드-결합 부위에서의 대부분의 다형성을 피하면서 MHC 부류 II 분자 상의 항원-결합 홈 밖의 보존된 영역에 결합할 수 있다. 초항원은 또한 T-세포 수용체의 초가변 루프에 결합하는 것보다는 오히려 T-세포 수용체 (TCR)의 Vβ 쇄에 결합할 수 있다. 박테리아 초항원의 예는 스타필로코쿠스 장독소 (SE), 스트렙토코쿠스 피오게네스 외독소 (SPE), 스타필로코쿠스 아우레우스 독성 쇼크-증후군 독소 (TSST-1), 스트렙토코쿠스 유사분열촉진 외독소 (SME), 스트렙토코쿠스 초항원 (SSA), 스타필로코쿠스 장독소 A (SEA), 스타필로코쿠스 장독소 A (SEB), 및 스타필로코쿠스 장독소 E (SEE)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
많은 초항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 단리 및 클로닝되었고, 이들 또는 변형된 (재조작된) 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 초항원이 항암 요법에 사용되었다 (하기 논의된 아니아라® 참조). 이들 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 초항원은 야생형 초항원, 변형된 초항원, 또는 표적화 모이어티와 접합 또는 융합된 야생형 또는 변형된 초항원일 수 있다. 초항원은 포유동물, 예컨대 인간에게 직접적으로, 예를 들어 주사에 의해 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어 신체 밖 초항원에 대한 환자 혈액의 노출에 의해, 또는 예를 들어 치료될 포유동물 내부에 초항원을 코딩하는 유전자를 배치하고 (예를 들어, 유전자를 함유하고 이를 발현할 수 있는 세포를 통한 것과 같은 공지된 유전자 요법 방법 및 벡터를 통해) 포유동물 내에서 유전자를 발현하는 것을 통해 전달될 수 있다.
초항원의 예 및 포유동물에게의 그의 투여는 하기 미국 특허 및 특허 출원에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,858,363, 6,197,299, 6,514,498, 6,713,284, 6,692,746, 6,632,640, 6,632,441, 6,447,777, 6,399,332, 6,340,461, 6,338,845, 6,251,385, 6,221,351, 6,180,097, 6,126,945, 6,042,837, 6,713,284, 6,632,640, 6,632,441, 5,859,207, 5,728,388, 5,545,716, 5,519,114, 6,926,694, 7,125,554, 7,226,595, 7,226,601, 7,094,603, 7,087,235, 6,835,818, 7,198,398, 6,774,218, 6,913,755, 6,969,616, 및 6,713,284, 미국 특허 출원 번호 2003/0157113, 2003/0124142, 2002/0177551, 2002/0141981, 2002/0115190, 및 2002/0051765, 및 PCT 국제 공개 번호 WO/03/094846.
B. 변형된 초항원
본 발명의 범주 내에서, 초항원은 T 림프구를 자극하는 초항원의 능력을 유지하거나 증진시키는 변형을 포함한 다양한 방식으로 조작될 수 있고, 예를 들어 초항원의 다른 측면, 예컨대, 예를 들어 그의 혈청반응성 또는 면역원성을 변경할 수 있다. 변형된 초항원은 초항원 활성 (즉, T 림프구의 하위세트를 활성화시키는 능력)을 갖는 합성 분자를 포함한다.
초항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해, 그의 생물학적 유용성 또는 활성, 즉 종양 세포의 세포독성을 유발하기 위한 T-세포 반응 유도의 인지가능한 상실 없이, 다양한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, MHC 부류 II 분자에 대한 초항원의 친화도는 초항원의 세포독성에 대해 최소 영향을 미치면서 감소될 수 있다. 이것은, 예를 들어 초항원이 MHC 부류 II 항원에 결합하는 그의 야생형 능력을 유지하는 경우에 달리 발생할 수 있는 독성을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다 (이러한 경우에서와 같이, 부류 II 발현 세포, 예컨대 면역계 세포도 또한 초항원에 대한 반응에 의해 영향을 받을 수 있음).
합성 초항원을 제조하는 기술을 포함한, 초항원 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드)을 변형시키는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 PCR 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 부위-특이적 돌연변이유발을 포함한다 (미국 특허 번호 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377; 및 5,789,166 참조).
일부 실시양태에서, 초항원은 그의 혈청반응성이 참조 야생형 초항원과 비교하여 감소되지만 T-세포를 활성화시키는 그의 능력은 야생형에 비해 유지 또는 증진되도록 변형될 수 있다. 이러한 변형된 초항원을 제조하기 위한 하나의 기술은 한 초항원으로부터의 특정 영역 내 특정 아미노산을 또 다른 것으로 치환시키는 것을 포함한다. 이것은 SEA, SEE 및 SED를 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 초항원이 특정 기능에 연관된 특정 영역 내 서열 상동성을 공유하기 때문에 가능하다 (Marrack and Kappler (1990) Science 248(4959): 1066; 또한 상이한 야생형과 조작된 초항원 사이의 상동성 영역을 보여주는 도 2 참조). 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 목적하는 T-세포 활성화-유도 반응을 갖지만 목적하지 않은 높은 혈청반응성은 갖지 않는 초항원은, 생성된 초항원이 그의 T-세포 활성화 능력을 유지하지만 감소된 혈청반응성을 갖도록 변형된다.
인간의 혈청은 정상적으로 초항원에 대해 다양한 역가의 항체를 함유하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 이해된다. 스타필로코쿠스 초항원의 경우, 예를 들어 상대 역가는 TSST-1>SEB>SEC-1>SE3>SEC2>SEA>SED>SEE이다. 그 결과, 예를 들어 SEE (스타필로코쿠스 장독소 E)의 혈청반응성은, 예를 들어 SEA (스타필로코쿠스 장독소 A)의 것보다 더 낮다. 이 데이터에 기초하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 높은 역가 초항원, 예컨대, 예를 들어 SEB (스타필로코쿠스 장독소 B) 대신에 낮은 역가 초항원, 예컨대, 예를 들어 SEE를 투여하는 것을 선호할 수 있다. 그러나, 또한 발견된 바와 같이, 상이한 초항원은 서로에 대해 상이한 T-세포 활성화 특성을 갖고, 야생형 초항원의 경우, 최상의 T-세포 활성화 초항원은 종종 또한 바람직하지 않게 높은 혈청반응성을 갖는다.
이들 상대 역가는 때때로 혈청반응성으로 인한 잠재적 문제, 예컨대 중화 항체로 인한 문제에 상응한다. 따라서, 낮은 역가 초항원, 예컨대 SEA 또는 SEE의 사용은 비경구로 투여된 초항원의 혈청반응성을 감소시키거나 피하는데 도움이 될 수 있다. 낮은 역가 초항원은, 예를 들어 일반 집단에서 전형적인 항-초항원 항체에 의해 측정된 바와 같은 낮은 혈청반응성을 갖는다. 일부 경우에 그것은 또한 낮은 면역원성을 가질 수 있다. 이러한 낮은 역가 초항원은 본원에 기재된 바와 같이 그의 낮은 역가를 유지하기 위해 변형될 수 있다.
초항원을 변형시키기 위한 접근법은 목적하는 T-세포 활성화 특성 및 감소된 혈청반응성 둘 다 및 일부 경우에 또한 감소된 면역원성을 갖는 초항원을 생성시키는데 사용될 수 있다. 초항원 사이의 특정 상동성 영역이 혈청반응성과 관련된다는 것을 고려하여, 목적하는 T-세포 활성화 및 목적하는 혈청반응성 및/또는 면역원성을 갖는 재조합 초항원을 조작하는 것이 가능하다. 추가로, 초항원 또는 스타필로코쿠스 장독소의 단백질 서열 및 면역학적 교차-반응성은 2개의 관련된 군으로 나누어진다. 한 군은 SEA, SEE 및 SED로 이루어진다. 제2 군은 SPEA, SEC 및 SEB이다. 따라서, 스타필로코쿠스 장독소에 대해 지시된 높은 역가 또는 내인성 항체와의 교차-반응성을 감소 또는 제거하기 위해 낮은 역가 초항원을 선택하는 것이 가능하다.
혈청반응성에서 역할을 하는 것으로 여겨지는 초항원 내의 영역은, 예를 들어 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27을 포함하는 영역 A; 아미노산 잔기 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 49를 포함하는 영역 B; 아미노산 잔기 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 및 84를 포함하는 영역 C; 아미노산 잔기 187, 188, 189 및 190을 포함하는 영역 D; 및 아미노산 잔기 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 및 227을 포함하는 영역 E를 포함한다 (미국 특허 번호 7,125,554, 및 본원 도 2 참조). 따라서, 이들 영역이, 예를 들어 아미노산 치환을 사용하여 돌연변이되어, 변경된 혈청반응성을 갖는 초항원을 생산할 수 있는 것으로 고려된다.
상기 열거된 초항원에 대한 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 임의의 서열 데이터 뱅크, 예를 들어 프로테인 데이터 뱅크 및/또는 진뱅크로부터 수득될 수 있다. 예시적인 진뱅크 수탁 번호는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: SEE는 P12993이고; SEA는 P013163이고; SEB는 P01552이고; SEC1은 P01553이고; SED는 P20723이고; SEH는 AAA19777임.
본 발명의 특정 실시양태에서, 야생형 SEE 서열 (서열식별번호: 1) 또는 야생형 SEA 서열 (서열식별번호: 2)은 확인된 영역 A-E (도 2 참조) 중 어느 것에서의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되도록 변형될 수 있다. 이러한 치환은, 예를 들어 K79, K81, K83 및 D227 또는 K79, K81, K83, K84 및 D227, 또는 예를 들어 K79E, K81E, K83S 및 D227S 또는 K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227A를 포함한다. 특정 실시양태에서, 초항원은 SEA/E-120 (서열식별번호: 3; 또한 미국 특허 번호 7,125,554 참조) 또는 SEAD227A (서열식별번호: 4; 또한 미국 특허 번호 7,226,601 참조)이다.
1. 변형된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
자연 발생 또는 참조 초항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 등가물은 별개의 서열을 함유하지만 동시에 자연 발생 또는 참조 초항원을 코딩하는 능력은 유지하도록 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이것은 유전자 코드의 축중성, 즉 동일한 아미노산을 코딩하는 다중 코돈의 존재로 인해 달성될 수 있다. 한 예에서, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 방해하지 않으면서 그 폴리뉴클레오티드 내로 제한 효소 인식 서열을 도입하는 것이 가능하다. 다른 폴리뉴클레오티드 서열은, 상이하지만 참조 초항원에 대해 적어도 1개의 생물학적 특성 또는 활성에 있어서 기능상 실질적으로 등가 (예를 들어, 생물학적 특성 또는 활성, 예를 들어 제한 없이 종양 세포의 세포독성을 유발하는 T-세포 반응을 유도하는 능력의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%)인 초항원을 코딩할 수 있다.
또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드는, 그것이 보다 유의한 변화를 함유할 수 있기는 하지만, 참조 초항원에 대해 기능상 등가인 초항원일 수 있다 (그리고 이를 코딩할 수 있다). 특정 아미노산은, 예를 들어 항체의 항원-결합 영역, 기질 분자, 수용체 상의 결합 부위 등과 같은 구조와의 상호작용 결합 능력의 인지가능한 상실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산을 대체할 수 있다. 추가로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 생물학적 활성을 파괴하지 않을 수 있으며, 따라서 생성된 구조 변화는 종종 단백질이 그의 설계된 기능을 수행하는 능력에 영향을 미치는 것이 아니다. 따라서 본 발명의 목적을 여전히 충족시키면서 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 고려된다.
아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 그의 소수성, 친수성, 전하 및/또는 크기 등을 이용하도록 설계될 수 있다. 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 형상 및/또는 유형의 분석에 의해, 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘이 모두 양으로 하전된 잔기이고/거나; 알라닌, 글리신 및/또는 세린이 모두 유사한 크기이고/거나; 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신이 모두 일반적으로 유사한 형상을 갖는 것으로 밝혀져있다. 따라서, 이들 고려사항에 기초하여, 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘; 알라닌, 글리신 및/또는 세린; 및/또는 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신은 본원에서 생물학적 기능적 등가물로서 정의된다. 추가로, 비-자연 발생 아미노산을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 다른 자연 발생 및 비-자연 발생 아미노산으로 아미노산 치환을 만들기 위한 접근법은 미국 특허 번호 7,763,253에 기재되어 있다.
기능적 등가물의 관점에서, "생물학적 기능적 등가" 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드의 정의에 내포된 것은 허용되는 수준의 등가 생물학적 활성을 갖는 분자를 유지하면서 분자의 정의된 부분 내에서 이루어질 수 있는 제한된 수의 변화가 존재한다는 개념인 것으로 이해된다. 따라서 생물학적 기능적 등가물은 선택된 아미노산 (또는 코돈)이 생물학적 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 치환될 수 있는 그러한 단백질 (및 폴리뉴클레오티드)인 것으로 간주된다. 기능적 활성은 종양 세포의 세포독성을 유발하는 T-세포 반응의 유도를 포함한다.
추가로, 변형된 초항원은, 상이하지만 이 경우 관련된 폴리펩티드를 사용한 키메라 분자의 생성을 수반하는 "도메인 스와핑"을 통해 다양한 단백질의 상동 영역을 치환시킴으로써 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 분자의 기능적 관련 영역을 확인하기 위해 다양한 초항원 단백질을 비교함으로써 (예를 들어, 도 2 참조), 초항원 기능에 대한 이들 영역의 중요성을 결정하기 위해 이들 분자의 관련 도메인을 스와핑시키는 것이 가능하다. 이들 분자는, 이들 "키메라"가 가능하게는 동일한 기능을 제공하면서 천연 분자와 구별될 수 있다는 점에서 추가의 가치를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 초항원은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 및 서열식별번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 초항원의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 초항원은 임의로 참조 초항원의 생물학적 활성 또는 특성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%를 유지한다.
특정 실시양태에서, 초항원은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 및 서열식별번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택된 초항원을 코딩하는 핵산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 초항원은 임의로 참조 초항원의 생물학적 활성 또는 특성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%를 유지한다.
서열 동일성은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 알고리즘을 사용하는 BLAST (베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴) 분석 (Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402 (참조로 포함됨))은 서열 유사성 검색을 위해 조정된다. 서열 데이터베이스 검색에 있어서의 기초적 문제의 논의를 위해 문헌 [Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129] (전체가 참조로 포함됨)을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 히스토그램, 설명, 정렬, 예상 (즉, 데이터베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의성 역치), 컷오프, 매트릭스 및 필터에 대한 검색 파라미터는 디폴트 설정으로 되어 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 사용되는 디폴트 점수화 매트릭스는 블로섬62 매트릭스이다 (Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919 (전체가 참조로 포함됨)). 4개의 blastn 파라미터는 하기와 같이 조정될 수 있다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10 (갭 연장 페널티); wink=1 (질문에 따라 모든 wink.sup.th 위치에 워드 히트를 생성함); 및 gapw=16 (갭이 있는 정렬이 생성되는 윈도우 폭을 설정함). 등가 Blastp 파라미터 설정은 Q=9; R=2; wink=1 및 gapw=32일 수 있다. 검색은 또한 NCBI (국립 생물 정보 센터) BLAST 어드밴스드 옵션 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어: -G, 갭 개방 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 5/ 단백질의 경우 11; -E, 갭 연장 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 2/ 단백질의 경우 1; -q, 뉴클레오티드 미스매치에 대한 페널티 [정수]: 디폴트 = -3; -r, 뉴클레오티드 매치에 대한 보상 [정수]: 디폴트 = 1; -e, 예상 값 [실제]: 디폴트 = 10; -W, 워드크기 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 11/ 메가블라스트의 경우 28/ 단백질의 경우 3; -y, 블라스트 연장에 대한 드롭오프 (X) (비트 단위): 디폴트 = blastn의 경우 20/ 기타의 경우 7; -X, 갭이 있는 정렬에 대한 X 드롭오프 값 (비트 단위): 디폴트 = 모든 프로그램의 경우 15, blastn에는 적용가능하지 않음; 및 -Z, 갭이 있는 정렬에 대한 최종 X 드롭오프 값 (비트 단위): blastn의 경우 50, 기타의 경우 25). 쌍별 단백질 정렬에 대해 클러스탈W가 또한 사용될 수 있다 (디폴트 파라미터는, 예를 들어 블로섬62 매트릭스 및 갭 개방 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.1을 포함할 수 있음). GCG 패키지 버전 10.0에 이용가능한 서열 사이의 베스트핏 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 페널티) 및 LEN=3 (갭 연장 페널티)을 사용하고, 단백질 비교에서의 등가 설정은 GAP=8 및 LEN=2이다.
C. 표적화된 초항원
특이성을 증가시키기 위해, 초항원은 바람직하게는, 암 세포에 의해 우선적으로 발현된 항원, 예를 들어 세포 표면 항원, 예컨대 5T4에 결합하는 표적화된 초항원 접합체를 생성하기 위해 표적화 모이어티에 접합된다. 표적화 모이어티는 초항원을 암성 세포, 예를 들어 암성 세포의 표면에 결합시키는데 사용될 수 있는 비히클이다. 표적화된 초항원 접합체는 다수의 T 림프구를 활성화시키는 능력을 유지하여야 한다. 예를 들어, 표적화된 초항원 접합체는 다수의 T-세포를 활성화시키고 이들을 표적화 모이어티에 결합된 종양-연관 항원을 함유하는 조직으로 지시하여야 한다. 이러한 상황에서, 특이적 표적 세포가 우선적으로 사멸되어, 신체의 나머지는 비교적 무사하게 된다. 비-특이적 항암제, 예컨대 세포증식억제성 화학요법 약물은 비특이적이고 치료될 종양과 연관되지 않은 다수의 세포를 사멸시키기 때문에, 상기 유형의 요법이 바람직하다. 예를 들어, 표적화된 초항원 접합체를 사용한 연구는 종양 조직 내로의 세포독성 T 림프구 (CTL) 침윤에 의한 염증이 표적화된 초항원의 최초 주사에 반응하여 급속히 증가한다는 것을 제시하였다 (Dohlsten et al. (1995) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 92:9791-9795). 종양 내로의 CTL 침윤에 의한 이러한 염증은 표적화된 초항원의 항종양 치료의 주요 이펙터 중 하나이다.
종양-표적화된 초항원은 암에 대한 면역요법을 나타내고 초항원에 접합된 표적화 모이어티를 함유하는 치료 융합 단백질이다 (Dohlsten et al. (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88:9287-9291; Dohlsten et al. (1994) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 91:8945-8949).
표적화 모이어티는 원칙적으로 세포 분자, 예를 들어 세포 표면 분자 및 바람직하게는 질환 특이적 분자에 결합할 수 있는 임의의 구조일 수 있다. 표적화 모이어티가 지시되는 표적화된 분자 (예를 들어, 항원)는 통상적으로 (a) 초항원이 결합하는 Vβ 쇄 에피토프 및 (b) 초항원이 결합하는 MHC 부류 II 에피토프와는 상이하다. 표적화 모이어티는 항체 (그의 항원 결합 단편을 포함함), 가용성 T-세포 수용체, 성장 인자, 인터류킨 (예를 들어, 인터류킨-2), 호르몬 등으로부터 선택될 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체 (예를 들어, Fab, F(ab)2, Fv, 단일 쇄 항체 등)이다. 항체는 전형적으로 임의의 관심 세포 표면 항원에 대해 생성될 수 있기 때문에 이들은 매우 다양하고 유용한 세포-특이적 표적화 모이어티이다. 모노클로날 항체는 세포 표면 수용체, 종양-연관 항원, 및 백혈구 계통-특이적 마커, 예컨대 CD 항원에 대해 생성되었다. 항체 가변 영역 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 하이브리도마 세포로부터 용이하게 단리될 수 있다. 표적화 모이어티를 생산하는데 사용될 수 있는 예시적인 종양-연관 항원은 gp100, 멜란-A/MART, MAGE-A, MAGE (흑색종 항원 E), MAGE-3, MAGE-4, MAGEA3, 티로시나제, TRP2, NY-ESO-1, CEA (암배아성 항원), PSA, p53, 맘마글로빈-A, 서바이빈, Muc1 (뮤신1)/DF3, 메탈로판스티물린-1 (MPS-1), 시토크롬 P450 이소형 1B1, 90K/Mac-2 결합 단백질, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1/CAMEL, TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, 시클린 B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX-2, SSX-1, SSX-4, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HDAC5, MBD2, TRIP4, NY--CO-45, KNSL6, HIP1R, Seb4D, KIAA1416, IMP1, 90K/Mac-2 결합 단백질, MDM2, NY/ESO, 및 LMNA를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 암-표적화 항체는 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-5T4 항체, 항-Ep-CAM 항체, 항-Her-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-CEA 항체, 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 항체, 및 항-IGF-1R 항체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 초항원은 면역학적 반응성 항체 단편, 예컨대 C215Fab, 5T4Fab (WO8907947 참조) 또는 C242Fab (WO9301303 참조)에 접합될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 사용될 수 있는 종양 표적화된 초항원의 예는 C215Fab-SEA (서열식별번호: 5), 5T4Fab-SEAD227A (서열식별번호: 6) 및 5T4Fab-SEA/E-120 (서열식별번호: 7, 도 3 참조)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 바람직한 접합체는 항-5T4 항체의 Fab 단편 및 SEA/E-120 초항원의 융합 단백질인, 나프투모맙 에스타페나톡스/아니아라®로 공지된 초항원 접합체이다. 아니아라®는 조작된 스타필로코쿠스 장독소 초항원 (SEA/E-120) 및 뮤린 IgG1/κ 항체 C242의 불변 영역 서열에 융합된 변형된 5T4 가변 영역 서열을 포함하는 표적화 5T4 Fab를 누적으로 포함하는 2개의 단백질 쇄를 포함한다. 제1 단백질 쇄는 서열식별번호: 7의 잔기 1 내지 458 (또한 서열식별번호: 8 참조)을 포함하고, 서열식별번호: 7의 잔기 1 내지 222에 상응하는 키메라 5T4 Fab 중쇄, 및 서열식별번호: 7의 잔기 223-225에 상응하는 GGP 트리펩티드 링커를 통해 공유 연결된, 서열식별번호: 7의 잔기 226 내지 458에 상응하는 SEA/E-120 초항원을 포함한다. 제2 쇄는 서열식별번호: 7의 잔기 459 내지 672 (또한 서열식별번호: 9 참조)를 포함하고, 키메라 5T4 Fab 경쇄를 포함한다. 2개의 단백질 쇄는 Fab 중쇄와 경쇄 사이의 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지된다. 서열식별번호: 7의 잔기 1-458은 서열식별번호: 8의 잔기 1-458에 상응하고, 서열식별번호: 7의 잔기 459-672는 서열식별번호: 9의 잔기 1-214에 상응한다. 아니아라®는 Fab 중쇄와 Fab 경쇄 사이의 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지된 서열식별번호: 8 및 9의 단백질을 포함한다. 아니아라®는 약 10 pM의 농도에서 암 세포의 T-세포 매개된 사멸을 유도하고, 접합체의 초항원 성분은 인간 항체 및 MHC 부류 II에 대한 낮은 결합을 갖도록 조작되었다.
표적화 모이어티를 기반으로 하는 다른 항체는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 하기에 보다 상세하게 논의된 기술을 사용하여 설계, 변형, 발현 및 정제될 수 있는 것으로 고려된다.
표적화 모이어티의 또 다른 유형은 가용성 T-세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 가용성 TCR의 일부 형태는 단지 세포외 도메인만을 함유하거나 또는 세포외 및 세포질 도메인을 함유할 수 있다. TCR의 다른 변형은 또한, TCR이 미국 공개 출원 번호 미국 2002/119149, 미국 2002/0142389, 미국 2003/0144474, 및 미국 2003/0175212, 및 국제 공개 번호 WO2003020763; WO9960120 및 WO9960119에 기재된 바와 같이 막 결합된 것이 아니도록 막횡단 도메인이 결실 및/또는 변경된 가용성 TCR을 생산하기 위해 고려될 수 있다.
표적화 모이어티는 재조합 기술을 사용하거나 또는 초항원에 표적화 모이어티를 화학적으로 연결시킴으로써 초항원에 접합될 수 있다.
1. 재조합 링커 (융합 단백질)
표적화 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커를 함유하는 아미노산을 통해) 연결된 초항원을 코딩하는 유전자는 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성 및 발현될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 변형된 초항원의 아미노 말단은 표적화 모이어티의 카르복시 말단에 연결될 수 있거나 또는 그 반대의 경우이다. 표적화 모이어티로서 역할을 할 수 있는 항체 또는 항체 단편의 경우, 경쇄 또는 중쇄가 융합 단백질을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편의 경우, 변형된 초항원의 아미노 말단은 항체 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 초항원은 초항원에 VH 및 VL 도메인을 연결함으로써 Fab 단편에 연결될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 링커가 초항원 및 표적화 모이어티를 함께 연결하는데 사용될 수 있다. 링커가 사용되는 경우에, 링커는 바람직하게는 친수성 아미노산 잔기, 예컨대 Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His 및 Arg를 함유한다. 바람직한 링커는 1-10개의 아미노산 잔기, 보다 특히 3-7개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 가교이다. 예시적인 링커는 트리펩티드 - GlyGlyPro -이다. 이들 접근법은 아니아라® 초항원 접합체의 설계 및 제조에서 성공적으로 사용되었다.
2. 화학적 연결
또한 초항원이 화학적 연결을 통해 표적화 모이어티에 연결될 수 있는 것으로 고려된다. 표적화 모이어티에 대한 초항원의 화학적 연결은 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 요구할 수 있다. 펩티드 링커는 바람직하게는 친수성이고, 아미드, 티오에테르, 디술피드 등으로부터 선택된 1종 이상의 반응성 모이어티를 나타낸다 (미국 특허 번호 5,858,363, 6,197,299 및 6,514,498 참조). 또한 화학적 연결이 동종- 또는 이종이관능성 가교 시약을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 표적화 모이어티에 대한 초항원의 화학적 연결은 종종 화합물 내 많은 위치에 존재하는 관능기 (예를 들어, 1급 아미노 기 또는 카르복시 기)를 이용한다.
D. 초항원 및 초항원 접합체의 발현
재조합 DNA 기술이 사용되는 경우에, 초항원 또는 초항원-표적화 모이어티 접합체는 표준 발현 벡터 및 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 일반적으로 초항원을 코딩하는 핵산 서열을 함유하도록 유전자 조작된 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입 (예를 들어, 형질감염)되어 초항원을 생산한다 (예를 들어, 문헌 [Dohlsten et al. (1994), Forsberg et al. (1997) J. BIOL. CHEM. 272:12430-12436, Erlandsson et al. (2003) J. MOL. BIOL. 333:893-905 및 WO2003002143] 참조).
숙주 세포는, 예를 들어 형질전환 또는 형질감염 기술에 의해, 핵산 서열을 혼입시키고 초항원을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 숙주 세포 내로의 핵산 서열의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 미세주사, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩, 탄도적 도입, 감염 또는 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Davis et al. (1986) BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY and Sambrook, et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재되어 있다.
적절한 숙주 세포의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예컨대 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 이. 콜라이, 스트렙토미세스 및 바실루스 서브틸리스 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포 및 아스페르길루스 세포; 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 및 보우스 흑색종 세포를 포함한다.
초항원을 위한 생산 시스템의 예는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,962,694에서 발견된다.
E. 단백질 정제
초항원 및/또는 초항원-표적화 모이어티 접합체는 바람직하게는 사용 전에 정제되며, 이는 다양한 정제 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있다. 초항원 또는 초항원-표적화 모이어티 접합체를 다른 단백질로부터 분리하면, 부분적 또는 완전한 정제 (또는 균질성 수준으로의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 관심 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 포커싱이다. 본원에 사용된 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 관심 거대분자 (예를 들어, 단백질)는 그의 원래 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 일반적으로, 용어 "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분획화에 적용되었으며 실질적으로 그의 생물학적 활성을 유지하는 거대분자를 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"은 관심 거대분자가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예컨대 조성물의 내용물의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 초과를 구성하는 조성물을 지칭한다.
예를 들어 활성 분획의 비활성을 결정하고, SDS-PAGE 분석, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 임의의 다른 분획화 기술에 의해 분획 내에 주어진 단백질의 양을 평가하는 것을 포함하는, 단백질의 정제의 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 단백질 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술은, 예를 들어 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용하거나 또는 열 변성에 의한 침전에 이어서 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온 교환, 겔 여과, 역상, 히드록시아파타이트, 친화성 크로마토그래피; 등전 포커싱; 겔 전기영동; 및 상기 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나 또는 특정 단계가 생략될 수 있고, 그 경우에도 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조를 위한 적합한 방법이 얻어지는 것으로 고려된다.
III. 면역강화제
면역강화제의 효능은 치료될 대상체에게 초항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 초항원 접합체와 함께 면역강화제를 투여함으로써 증진될 수 있는 것으로 고려된다. 예시적인 면역강화제는, 예를 들어 (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극할 수 있고, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제할 수 있고, (c) 비-인간 IgG1-매개된 면역 반응 경로, 예를 들어 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제할 수 있고, (d) (a) 및 (b)의 조합, (e) (a) 및 (c)의 조합, (f) (b) 및 (c)의 조합, 및 (g) (a), (b) 및 (c)의 조합일 수 있다.
특정 실시양태에서 면역강화제는 체크포인트 경로 억제제이다. 수많은 T-세포 체크포인트 억제제 경로, 예를 들어 PD-1 면역 체크포인트 경로 및 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 면역 체크포인트 경로가 지금까지 확인되었다.
순드스튜트 등 (Sundstedt et al. (2012) J. IMMUNOTHER. 35:344-35)은 마우스 B16 흑색종 모델에서의 종양 표적화된 초항원 (TTS)과 항-CTLA4 IgG1 항체와의 조합이 개별 성분보다 더 활성이었다는 것을 제시하였다. 그 연구에서, 초항원이 CD4+ 및 CD8+ T-세포 둘 다의 침윤을 유발하였지만, 다수의 조절 T-세포 (Treg)가 또한 종양 미세환경에 축적되었다. 이들 억제성 조절 세포의 상향조절은 TTS 요법의 직접적 결과인 것으로 여겨지며, 이는 그의 유효성을 제한할 수 있다. 저자는 TTS에 의한 CTLA-4의 극도의 상향조절이 항-CTLA-4 항체의 효과가 주로 Treg 집단에 대해 작용하도록 할 가능성이 있다는 것을 주목하였다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, CTLA-4 IgG1 항체가 TTS와 조합되어 사용되는 경우에 그의 항암 활성에 중요한 Treg 집단에 대해 세포독성인 것으로 고려된다. 대조적으로, 본 발명의 특정 실시양태는 Treg를 고갈시키는 것으로 공지되지 않은 항체, 예를 들어 비-CTLA-4 체크포인트에 지시된 IgG4 항체 (예를 들어, 항-PD-1 IgG4 억제제)를 사용하고, 따라서 상승작용적 효과가 다른 작용 메카니즘에 의해 매개되는 신규 조합을 나타낸다.
PD-1은 과다활성 면역 반응을 방지하기 위해 적절한 시간에 T-세포 활성을 억제하거나 또는 달리 조정하는 면역계 체크포인트로서 역할을 하는, T-세포의 표면 상에 존재하는 수용체이다. 그러나, 암 세포는 T-세포 활성을 차단하거나 또는 조정하기 위해 T-세포의 표면 상의 PD-1과 상호작용하는 리간드, 예를 들어 PD-L1, PD-L2 등을 발현함으로써 이 체크포인트를 이용할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 암은 T-세포 매개된 면역 반응을 피할 수 있다.
CTLA-4 경로에서, T-세포 상의 CTLA-4와 (암 세포 보다는 오히려) 항원 제시 세포의 표면 상의 그의 리간드 (예를 들어, CD80, 또한 B7-1로 공지됨, 및 CD86)와의 상호작용은 T-세포 억제를 유도한다. 그 결과, T-세포 활성화 또는 활성을 억제하는 리간드 (예를 들어, CD80 또는 CD86)는 암 세포 보다는 오히려 항원 제시 세포 (면역계에서의 주요 세포 유형)에 의해 제공된다. CTLA-4 및 PD-1 결합 둘 다가 T-세포에 대해 유사한 부정적 영향을 미치지만, 하향조절의 시기, 담당 신호전달 메카니즘, 및 이들 2종의 면역 체크포인트에 의한 면역 억제의 해부학적 위치는 상이하다 (American Journal of Clinical Oncology. Volume 39, Number 1, February 2016)). T-세포 활성화의 초기 프라이밍 상에 국한되는 CTLA-4와는 달리, PD-1은 훨씬 더 이후에 이펙터 상 동안 기능한다 (Keir et al. (2008) ANNU. REV IMMUNOL., 26:677-704). 따라서, PD-1 체크포인트 경로를 통해 매개된 T-세포 억제는 CTLA-4 체크포인트 경로를 통해 매개된 T-세포 억제와 매우 상이하다.
특정 실시양태에서, 면역강화제는 암성 세포에 의해 발현된 항원이 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것을 (완전히 또는 부분적으로) 방지한다. 한 실시양태에서, 이러한 면역강화제는 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제이다. 이러한 면역강화제의 예는, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-L2 항체를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서 초항원 접합체는 (1) PD-1 리간드가 T-세포 상의 그의 동족 PD-1에 결합하는 것을 방지하기 위해 PD-1 리간드 (예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2)에 결합하는 분자 (예를 들어, 항체 또는 소분자), 및/또는 (2) 관심 암 세포에 의해 발현된 PD-리간드의 결합을 방지하기 위해 T-세포 상의 PD-1에 결합하는 분자 (예를 들어, 항체 또는 소분자)를 포함할 수 있는, PD-1-기반 면역강화제와 함께 투여된다.
추가로, 특정 실시양태에서, 면역강화제는 암성 세포에 의해 발현된 항원이 인간 IgG4 (비-인간 IgG1) 매개된 면역 반응 경로를 통해, 예를 들어 ADCC 경로를 통하지 않고 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 억제하는 것을 (완전히 또는 부분적으로) 방지한다. 초항원 접합체 및 면역강화제에 의해 강화된 면역 반응이 일부 ADCC 활성을 포함할 수 있지만, 면역 반응의 주요 성분(들)은 ADCC 활성을 수반하지 않는 것으로 고려된다. 대조적으로, 현재 면역요법에 사용되는 항체의 일부, 예컨대 이필리무맙 (항-CTLA-4 IgG1 모노클로날 항체)은 이펙터 세포 상의 Fc 수용체를 통해 그의 Fc 도메인을 통한 신호전달을 통한 ADCC를 통해 표적화 세포를 사멸시킬 수 있다. 이필리무맙은, 많은 다른 치료 항체와 같이, 인간 IgG1 이뮤노글로불린으로서 설계되었고, 이필리무맙이 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용을 차단하지만, 그의 작용 메카니즘은 세포 표면 CTLA-4의 높은 수준을 발현하는 종양-침윤 조절 T-세포의 ADCC 고갈을 포함하는 것으로 여겨진다. (Mahoney et al. (2015) NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY 14: 561-584.) CTLA-4가 T-세포 활성화를 음성 제어하도록 작용하는 T-세포 (조절 T-세포)의 하위세트 상에서 고도로 발현되는 것을 고려하면, 항-CTLA-4 IgG1 항체가 투여되는 경우에, 조절 T-세포의 수는 ADCC를 통해 감소된다.
특정 실시양태에서, 작용 방식이 T-세포 집단을 유의하게 고갈시키지 않으면서 (예를 들어, T-세포 집단이 확장하는 것을 허용하면서) 주로 암 세포와 T-세포 사이의 억제 신호를 차단하는 것인 면역강화제를 사용하는 것이 바람직하다. 이를 달성하기 위해, 인간 IgG4 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 하는 항체, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-L2 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 IgG4 이소형이 특정 상황에서 바람직한데, 이 항체 이소형이 인간 IgG1 이소형과 비교하여 ADCC 활성을 거의 또는 전혀 불러오지 않기 때문이다 (상기 문헌 [Mahoney et al. (2015)]). 따라서, 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2는 인간 IgG4 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 한다. 그 결과, 상이한 이소형, 예를 들어 IgG1 이소형을 갖는 항체, 특히 그 항체가 상이한 항원, 예를 들어 CTLA-4에 대해 지시된 것이라면, 예컨대 항-CTLA-4 인간 IgG1 이뮤노글로불린이라면, 그의 활성에 기초하여 인간 IgG4 이소형을 갖는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-L2 항체의 잠재적 치료 활성을 추정하는 것은 가능하지 않다. 추가로, CTLA-4 및 PD-1은 독립적, 비-중복 작용 메카니즘을 갖는 2종의 T-세포-억제 수용체를 나타낸다. T-세포 활성화를 차단하는 그의 공유된 능력에도 불구하고, 2종의 단백질은 고유한 구조를 갖고, 암 세포에 대한 매우 상이한 면역 반응에 영향을 미친다.
예시적인 PD-1/PD-L1 기반 면역강화제는 미국 특허 번호 8,728,474, 8,952,136 및 9,073,994, 및 EP 특허 번호 1537878B1에 기재되어 있고, 항-PD-1 항체를 포함한다. 예시적인 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니) 및 아테졸리주맙 (이전에 MPDL3280A), MEDI4736, 아벨루맙, 및 PDR001을 포함한다.
단백질 기반 면역강화제는, 예를 들어 본원 상기에 기재된 바와 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 설계, 발현 및 정제될 수 있다. 항-PD-1 항체는 미국 특허 번호 8,728,474, 8,952,136, 및 9,073,994에 기재된 바와 같이 설계, 발현, 정제, 제제화 및 투여될 수 있다.
다른 면역강화제 (예를 들어, 항체, 및 다양한 소분자)는 하기 리간드 중 1종 이상을 수반하는 신호전달 경로를 표적화할 수 있다: B7-H3 (특히 전립선, 신세포, 비소세포 폐, 췌장, 위, 난소, 결장직장 세포에서 발견됨); B7-H4 (특히 유방, 신세포, 난소, 췌장, 흑색종 세포에서 발견됨); HHLA2 (특히 유방, 폐, 갑상선, 흑색종, 췌장, 난소, 간, 방광, 결장, 전립선, 신장 세포에서 발견됨); 갈렉틴 (특히 비소세포 폐, 결장직장 및 위 세포에서 발견됨); CD30 (특히 호지킨 림프종, 대세포 림프종 세포에서 발견됨); CD70 (특히 비-호지킨 림프종, 신세포에서 발견됨); ICOSL (특히 교모세포종, 흑색종 세포에서 발견됨); 및 CD155 (특히 신장, 전립선, 췌장 교모세포종 세포에서 발견됨). 유사하게, 사용될 수 있는 다른 잠재적 면역강화제는, 예를 들어 4-1BB (CD137) 효능제 (예를 들어, 완전 인간 IgG4 항-CD137 항체 우렐루맙/BMS-663513), LAG3 억제제 (예를 들어, 인간화 IgG4 항-LAG3 항체 LAG525, 노파르티스); IDO 억제제 (예를 들어, 소분자 INCB024360, 인사이트 코포레이션), TGFβ 억제제 (예를 들어, 소분자 갈루니세르팁, 일라이 릴리) 및 T-세포 및/또는 종양 세포 상에서 발견되며 ADCC를 통하지 않고 효능제/길항제 상호작용에 기초한 제약 개입을 받아들이는 다른 수용체 또는 리간드를 포함할 수 있다.
A. 항체 생산
항체를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 분자는 관심 항체의 CDR 및 가변 영역의 서열, 예를 들어 미국 특허 번호 8,952,136에 제공된 항체 서열 및 미국 특허 번호 9,073,994에 기재된 하이브리도마 기탁물을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 합성 DNA 분자는 목적하는 항체를 코딩하는 통상적인 유전자 발현 구축물을 생산하기 위해, 예를 들어 불변 영역 코딩 서열 및 발현 제어 서열을 포함한 다른 적절한 뉴클레오티드 서열에 라이게이션될 수 있다. 정의된 유전자 구축물의 생산은 관련 기술분야의 상용 기술 내에 있다. 대안적으로, 본원에 제공된 서열은 통상적인 혼성화 기술 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해, 서열이 본원에 제공된 서열 정보에 기초하거나 또는 하이브리도마 세포에서 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 관한 선행 기술 서열 정보에 기초한 것인 합성 핵산 프로브를 사용하여, 하이브리도마로부터 클로닝될 수 있다.
본원에 개시된 항체를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내로 혼입 (라이게이션)될 수 있으며, 이는 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예시적인 숙주 세포는 달리 IgG 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 골수종 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포가 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 발현하도록 허용하는 조건 하에서 성장될 수 있다.
특정 발현 및 정제 조건은 사용된 발현 시스템에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 유전자가 이. 콜라이에서 발현되는 경우에, 그것은 먼저 적합한 박테리아 프로모터, 예를 들어 Trp 또는 Tac, 및 원핵 신호 서열로부터의 하류에 조작된 유전자를 배치함으로써 발현 벡터 내로 클로닝된다. 발현된 분비된 단백질은 굴절반사소체 또는 봉입체에 축적되고, 프렌치 프레스 또는 초음파처리에 의한 세포의 파괴 후에 수거될 수 있다. 이어서 굴절반사소체는 가용화되고, 단백질은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 재폴? 및 절단된다.
본원에 개시된 항체를 코딩하는 DNA 구축물이 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 발현되는 경우에, 그것은 먼저 적합한 진핵 프로모터, 분비 신호, IgG 인핸서 및 다양한 인트론을 함유하는 발현 벡터 내로 삽입된다. 이 발현 벡터는 불변 영역의 모두 또는 일부를 코딩하는 서열을 임의로 함유하여, 중쇄 및/또는 경쇄의 전체 또는 일부가 발현되는 것을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 단일 발현 벡터는 발현될 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 함유한다.
유전자 구축물은 통상적인 기술을 사용하여 진핵 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는, 각각이 또 다른 기능 (예를 들어, 세포독성)을 갖는 모이어티에 부착될 수 있는, VL 또는 VH 단편, VL-VH 이종이량체, VH-VL 또는 VL-VH 단일 쇄 폴리펩티드, 완전한 이뮤노글로불린 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 부분을 발현한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 중쇄 (예를 들어, 중쇄 가변 영역) 또는 경쇄 (예를 들어, 경쇄 가변 영역)의 전체 또는 일부를 발현하는 폴리펩티드를 발현하는 단일 벡터로 형질감염된다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (b) 전체 이뮤노글로불린 중쇄 및 전체 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 단일 벡터로 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 1종 초과의 발현 벡터 (예를 들어, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 하나의 발현 벡터, 및 경쇄 또는 경쇄 가변 영역의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 또 다른 발현 벡터)로 형질감염된다.
이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 성장시키는 것 (배양하는 것)을 포함할 수 있다. 이어서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 친화성 태그, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 히스티딘 태그를 사용하여 정제될 수 있다.
표적 단백질, 예를 들어 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 방법은 (a) 완전한 또는 부분적 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 발현 벡터, 및 완전한 또는 부분적 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 별개의 발현 벡터; 또는 (b) 두 쇄 (예를 들어, 완전한 또는 부분적 쇄)를 코딩하는 단일 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 두 쇄의 발현을 허용하는 조건 하에서 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 무손상 항체 (또는 항원-결합 단편)는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 친화성 태그, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 히스티딘 태그를 사용하여 수거 및 정제될 수 있다. 단일 발현 벡터 또는 2종의 별개의 발현 벡터로부터 중쇄 및 경쇄를 발현하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술 내에 있다.
B. 항체 변형
항체 및 항체 단편의 항원성을 감소 또는 제거하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항체가 인간에게 투여되는 경우에, 항체는 바람직하게는 인간에서 항원성을 감소 또는 제거하기 위해 "인간화"된다. 바람직하게는, 인간화 항체는 그가 유래된 비-인간화 마우스 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원에 대한 친화도를 갖는다.
하나의 인간화 접근법에서, 마우스 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 이뮤노글로불린 불변 영역으로 대체된 키메라 단백질이 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI. 81:6851-6855, Neuberger et al. (1984) NATURE 312:604-608; 미국 특허 번호 6,893,625 (Robinson); 5,500,362 (Robinson); 및 4,816,567 (Cabilly)]을 참조한다.
CDR 그라프팅으로 공지된 접근법에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 또 다른 종으로부터의 프레임워크 내로 그라프팅된다. 예를 들어, 뮤린 CDR은 인간 FR 내로 그라프팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-ErbB3 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 인간 FR 또는 컨센서스 인간 FR 상으로 그라프팅된다. 컨센서스 인간 FR을 생성하기 위해, 여러 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR이 정렬되어 컨센서스 아미노산 서열이 확인된다. CDR 그라프팅은 문헌 [미국 특허 번호 7,022,500 (Queen); 6,982,321 (Winter); 6,180,370 (Queen); 6,054,297 (Carter); 5,693,762 (Queen); 5,859,205 (Adair); 5,693,761 (Queen); 5,565,332 (Hoogenboom); 5,585,089 (Queen); 5,530,101 (Queen); Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; and Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94]에 기재되어 있다.
"슈퍼휴머니제이션(SUPERHUMANIZATION)™"로 불리는 접근법에서, 인간 CDR 서열은 인간화될 마우스 항체의 CDR에 대한 인간 CDR의 구조적 유사성에 기초하여, 인간 배선 유전자로부터 선택된다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 6,881,557 (Foote); 및 Tan et al. (2002) J. IMMUNOL. 169:1119-1125]을 참조한다.
면역원성을 감소시키기 위한 다른 방법은 "재성형", "과다키메라화" 및 "베니어링/재표면화"를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Vaswami et al. (1998) ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81:105; Roguska et al. (1996) PROT. ENGINEER 9:895-904; and U.S. Patent No. 6,072,035 (Hardman)]을 참조한다. 베니어링/재표면화 접근법에서, 뮤린 항체 내 표면 접근가능한 아미노산 잔기는 인간 항체 내 동일한 위치에서 보다 빈번하게 발견되는 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 이러한 항체 재표면화의 유형은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,639,641 (Pedersen)에 기재되어 있다.
마우스 항체를 인간에서의 의학적 용도에 적합한 형태로 전환시키기 위한 또 다른 접근법은 액티브MAB(ACTIVMAB)™ 기술 (백시넥스, 인크., 뉴욕 로체스터)로 공지되어 있으며, 이는 포유동물 세포에서 항체를 발현하기 위해 백시니아 바이러스-기반 벡터를 수반한다. IgG 중쇄 및 경쇄의 조합 다양성의 높은 수준이 생성되는 것으로 언급된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,706,477 (Zauderer); 6,800,442 (Zauderer); 및 6,872,518 (Zauderer)을 참조한다.
마우스 항체를 인간에서 사용하기에 적합한 형태로 전환시키기 위한 또 다른 접근법은 칼로바이오스 파마슈티칼스, 인크. (캘리포니아주 팔로 알토)에 의해 상업적으로 실시되는 기술이다. 이 기술은 항체 선택을 위한 "에피토프 초점" 라이브러리를 생산하기 위해 독점적 인간 "수용자" 라이브러리의 사용을 수반한다.
마우스 항체를 인간에서의 의학적 용도에 적합한 형태로 변형시키기 위한 또 다른 접근법은 조마 (미국) 엘엘씨에 의해 상업적으로 실시되는 휴먼 엔지니어링(HUMAN ENGINEERING)™ 기술이다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 93/11794 및 미국 특허 번호 5,766,886; 5,770,196; 5,821,123; 및 5,869,619를 참조한다.
임의의 상기 접근법을 포함한 임의의 적합한 접근법은 본원에 개시된 초항원 접합체의 결합 모이어티 성분을 포함하는 항체의 인간 면역원성을 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다중특이적 항체는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 관심 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 문헌 [Milstein et al., NATURE 305:537-539 (1983), WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991), WO 94/04690, Suresh et al. (1986) METHODS IN ENZYMOLOGY 121:210, WO96/27011, Brennan et al. (1985) SCIENCE 229: 81, Shalaby et al. (1992) J. EXP. MED. 175: 217-225, Kostelny et al. (1992) J. IMMUNOL. 148(5):1547-1553, Hollinger et al. (1993) PNAS, 90:6444-6448, Gruber et al. (1994) J. IMMUNOL. 152:5368, Wu et al. (2007) NAT. BIOTECHNOL. 25(11): 1290-1297, 미국 특허 공개 번호 2007/0071675, 및 Bostrom et al., SCIENCE 323:1640-1644 (2009)]에 기재된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체 및 디아바디)으로서 제조될 수 있다.
IV. 제제 및 제약 조성물
초항원 접합체 및 면역강화제는 대상체에게 함께, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여되어 암을 치료할 수 있으며, 예를 들어 암 세포의 성장 속도를 늦추거나, 전이의 발생률 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하거나, 암의 진행을, 예를 들어 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 방지 또는 억제할 수 있다. 대안적으로, 초항원 접합체 및 면역강화제는 대상체에게 함께, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여되어 암을 치료할 수 있으며, 예를 들어 암을 갖는 대상체의 수명을, 예를 들어 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 1년, 5년 또는 10년 증가시킬 수 있다.
초항원 접합체 및 면역강화제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 개별적으로 또는 함께 제제화될 수 있다. 예를 들어, 치료 용도를 위해, 초항원 접합체 및/또는 면역강화제는 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 본원에 사용된, "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 부합하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 상용성의 면에서 "허용되"어야 하고 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 제약상 허용되는 담체는 제약 투여와 상용성인 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 개시된 초항원 및/또는 면역강화제를 함유하는 제약 조성물은 단일 투여 형태 또는 상이한 투여 형태로 제공될 수 있다. 제약 조성물 또는 조성물들은 그의 의도된 투여 경로에 상용성이도록 제제화되어야한다. 투여 경로의 예는 정맥내 (IV), 근육내, 피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막 및 직장 투여이다. 대안적으로, 작용제는 종종 데포 또는 지속 방출 제제로, 전신보다는 오히려 국부로, 예를 들어 작용 부위 내로 직접 작용제 또는 작용제들의 주사를 통해 투여될 수 있다.
유용한 제제는 제약 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조한다. 비경구 투여에 적합한 제제 성분은 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함한다.
정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아수, 크레모포르 ELTM (바스프, 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 미생물에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된 것이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우에, 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 필터 멸균이 수행될 수 있다.
본 발명의 조합된 초항원 접합체 및 면역강화제는 단독으로 또는 다른 화합물, 예컨대 담체 또는 다른 치료 화합물과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 유효량의 1종 이상의 초항원 접합체 및 1종 이상의 면역강화제, 예를 들어 항-PD-1 항체를 포함하고, 또한 제약상 허용되는 담체 중에 용해 또는 분산된 추가의 작용제를 함유할 수 있다. 어구 "제약" 또는 "약리학상 허용되는"은 포유동물, 예컨대, 예를 들어 인간에게 투여되는 경우에 유해, 알레르기 또는 다른 불리한 반응을 생성하지 않는 물질, 예를 들어 조성물을 지칭한다. 적어도 1종의 초항원 접합체 및 면역강화제를 함유하는 제약 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어, 및 본원에 참조로 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 추가로, 인간 투여를 위해, 제제는 생물학적 표준에 대한 FDA 사무국에서 요구하는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족하여야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 종양-표적화된 초항원을 면역강화제와 조합하여 포함한다. 이러한 조합은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 임의의 종양-표적화된 초항원 및/또는 면역강화제를 포함한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 종양-표적화된 초항원은 표적화 모이어티에 접합된, 스타필로코쿠스 장독소 (SE), 스트렙토코쿠스 피오게네스 외독소 (SPE), 스타필로코쿠스 아우레우스 독성 쇼크-증후군 독소 (TSST-1), 스트렙토코쿠스 유사분열촉진 외독소 (SME), 스트렙토코쿠스 초항원 (SSA), 스타필로코쿠스 장독소 A (SEA), 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB), 및 스타필로코쿠스 장독소 E (SEE)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 박테리아 초항원을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 표적화 모이어티에 접합된, 하기 프로테인 데이터 뱅크 및/또는 진뱅크 수탁 번호 (SEE는 P12993임; SEA는 P013163임; SEB는 P01552임; SEC1은 P01553임; SED는 P20723임; 및 SEH는 AAA19777임을 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 갖는 초항원을 포함하는 종양-표적화된 초항원 뿐만 아니라 그의 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 초항원 접합체는 야생형 또는 조작된 초항원 서열, 예컨대 야생형 SEE 서열 (서열식별번호: 1) 또는 야생형 SEA 서열 (서열식별번호: 2)을 포함하며, 이들은 확인된 영역 A-E (도 2 참조) 중 어느 것에서의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체에 혼입된 초항원은 SEA/E-120 (서열식별번호: 3) 또는 SEAD227A (서열식별번호: 4)이다.
초항원에 접합될 표적화 모이어티의 구체적 예는, 예를 들어 세포 분자에 결합할 수 있는 임의의 분자 및 바람직하게는 질환 특이적 분자, 예컨대 암 세포 특이적 분자를 포함한다. 표적화 모이어티는 항체 (항원 결합 단편을 포함함), 가용성 T-세포 수용체, 성장 인자, 인터류킨, 호르몬 등으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 암 표적화 항체는 항-CD19, 항-CD20 항체, 항-5T4 항체, 항-Ep-CAM 항체, 항-Her-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-CEA 항체, 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 항체, 및 항-IGF-1R 항체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 초항원은 면역학적 반응성 항체 단편, 예컨대 C215Fab, 5T4Fab (WO8907947 참조) 또는 C242Fab (WO9301303 참조)에 접합될 수 있다.
이러한 종양-표적화된 초항원의 예는 C215Fab-SEA (서열식별번호: 5), 5T4Fab-SEAD227A (서열식별번호: 6) 및 5T4Fab-SEA/E-120 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 초항원 접합체는 나프투모맙 에스타페나톡스/아니아라®로 관련 기술분야에 공지된 5T4 Fab-SEA/E-120이며, 이는 함께 항-5T4 항체의 Fab 단편을 정의하는 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 서열 중 하나는 SEA/E-120 초항원, 즉 서열식별번호: 8 (SEA/E-120에 3개의 아미노산 링커에 의해 커플링된 5T4 Fab의 키메라 VH 쇄) 및 서열식별번호: 9 (5T4 Fab의 키메라 VL 쇄)를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 나프투모맙 에스타페나톡스/아니아라®로 관련 기술분야에 공지된 종양-표적화된 초항원 5T4Fab-SEA/E-120을, PD-1 억제제, 예컨대 항-PD-1 항체, 예를 들어 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니), MK-3475 (머크 & 캄파니), 피딜리주맙 (큐어테크), AMP-224 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 AMP-514 (아스트라제네카/메드이뮨) 또는 항-PD-L1 항체, 예컨대 MPDL3280A (제넨테크/로슈), MEDI-4736 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 MSB0010718C (이엠디 세로노/머크 카게아)와 조합하여 포함한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 조성물은 표적화된 초항원 나프투모맙 에스타페나톡스 (아니아라®)를, 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니), 아테졸리주맙 (이전에 MPDL3280A), MEDI4736, 아벨루맙, 및 PDR001을 포함한 1종 이상의 항-PD-1 항체와 조합하여 포함한다.
초항원 접합체 및 면역강화제를 함유하는 제제 또는 투여 형태는 이들이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다.
담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 염수 용액, 지질, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등 또는 그의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 1종 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위한 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물의 작용의 방지는 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 보존제, 예컨대 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 예를 들어 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 추론가능한 임의의 범위를 차지할 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 상기 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다. 이러한 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 사용된다.
활성제는 암 세포의 성장 또는 증식을 감소, 저하, 억제 또는 달리 제거하거나, 아폽토시스를 유도하거나, 암 또는 종양의 혈관신생을 억제하거나, 전이를 억제하거나, 또는 세포 내 세포독성을 유도하기에 효과적인 양 또는 양들로 투여된다. 암의 치유적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용된 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 전반적 건강에 따라 다르다. 이들 용어는 상승작용적 상황, 예컨대 단일 작용제 단독, 예컨대 초항원 접합체 또는 면역강화제, 예컨대 항-PD-1 항체는 약하게 작용하거나 전혀 작용하지 않을 수 있지만, 예를 들어 비제한적으로 순차적 투여를 통해 서로 조합되는 경우에, 2종 이상의 작용제가 작용하여 상승작용적 결과를 가져오는 것인 본 발명에 제시 및 기재된 상황을 포함한다.
특정 비제한적 예에서, 초항원 접합체의 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 초과, 및 그 안에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수들로부터 추론가능한 범위의 비제한적 예는, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중의 범위이다. 다른 예시적인 투여량 범위인, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 1000 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 75 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 40 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 30 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 20 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 15 마이크로그램/kg/체중, 약 1 마이크로그램/kg/체중 내지 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 1000 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 75 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 40 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 30 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 20 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 15 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 1000 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 75 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 40 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 30 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 20 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중 내지 약 15 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 1000 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 75 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 40 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 30 마이크로그램/kg/체중, 약 15 마이크로그램/kg/체중 내지 약 20 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 1000 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 75 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 40 마이크로그램/kg/체중, 약 20 마이크로그램/kg/체중 내지 약 30 마이크로그램/kg/체중 등의 범위가 상기 기재된 수들에 기초하여 투여될 수 있다.
예를 들어 비제한적으로 초항원 접합체의 투여에 대한 특정 실시양태에서, 투여되는 초항원 접합체의 유효량 또는 용량은 0.01 내지 500 μg/kg 대상체 체중, 예를 들어 0.1-500 μg/kg 대상체 체중, 및 예를 들어 1-100 μg/kg 대상체 체중의 범위의 양이다.
초항원 접합체와 조합되어 투여되는 면역강화제의 유효량 또는 용량은 적어도 상가적이지만 바람직하게는 상승작용적인 항종양 효과를 유발하고 면역계의 증진 또는 T-세포 활성화를 방해 또는 억제하지 않는 용량인 것으로 고려된다. 면역강화제가 초항원 접합체와 동시에 투여되는 경우에, 이때 면역강화제는 초항원 접합체의 작용 메카니즘을 방해하지 않도록 하는 저용량으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 면역강화제, 예를 들어 항-PD-1 항체의 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 펨브롤리주맙 (키트루다®)은 정맥내 주입으로서 2 mg/kg으로 주기적으로 투여될 수 있다. 투여되는 면역강화제의 양은 치료될 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적 건강, 초항원 접합체 및 면역강화제의 생체내 효력, 제약 제제, 및 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 것이다.
V. 치료 요법 및 적응증
치료 요법은 또한 달라질 수 있고, 종종 종양 유형, 종양 위치, 질환 진행, 및 환자의 건강 및 연령에 좌우된다. 특정 유형의 종양은 보다 공격성인 치료 프로토콜을 요구할 수 있지만, 그러나 동시에, 환자는 보다 공격성인 치료 요법을 용인할 수 없을 수 있다. 임상의는 종종 관련 기술분야 내의 통상의 기술 및 치료 제제의 공지된 효능 및 독성 (존재하는 경우)에 기초하여 이러한 결정을 내리는데 가장 적합할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법은 그를 필요로 하는 환자, 즉 암 환자에게 종양-표적화된 초항원을 면역강화제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 이러한 조합 치료는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 임의의 종양-표적화된 초항원 및/또는 면역강화제의 투여를 포함한다. 본 발명의 구체적 실시양태에서, 종양-표적화된 초항원은 표적화 모이어티에 접합된, 스타필로코쿠스 장독소 (SE), 스트렙토코쿠스 피오게네스 외독소 (SPE), 스타필로코쿠스 아우레우스 독성 쇼크-증후군 독소 (TSST-1), 스트렙토코쿠스 유사분열촉진 외독소 (SME), 스트렙토코쿠스 초항원 (SSA), 스타필로코쿠스 장독소 A (SEA), 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB) 및 스타필로코쿠스 장독소 E (SEE)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 박테리아 초항원을 포함한다.
특정 실시양태에서, 초항원 접합체는 야생형 또는 조작된 초항원 서열, 예컨대 야생형 SEE 서열 (서열식별번호: 1) 또는 야생형 SEA 서열 (서열식별번호: 2)을 포함하며, 이들은 확인된 영역 A-E (도 2 참조) 중 어느 것에서의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체에 혼입된 초항원은 SEA/E-120 (서열식별번호: 3) 또는 SEAD227A (서열식별번호: 4)이다.
초항원에 접합될 표적화 모이어티의 구체적 예는, 예를 들어 세포 분자에 결합할 수 있는 임의의 분자 및 바람직하게는 질환 특이적 분자, 예컨대 암 세포 특이적 분자를 포함한다. 표적화 모이어티는 항체 (항원 결합 단편을 포함함), 가용성 T-세포 수용체, 성장 인자, 인터류킨, 호르몬 등으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 암 표적화 항체는 항-CD19, 항-CD20 항체, 항-5T4 항체, 항-Ep-CAM 항체, 항-Her-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-CEA 항체, 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 항체, 및 항-IGF-1R 항체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 초항원은 면역학적 반응성 항체 단편, 예컨대 C215Fab, 5T4Fab (WO8907947 참조) 또는 C242Fab (WO9301303 참조)에 접합될 수 있다.
이러한 종양-표적화된 초항원의 예는 C215Fab-SEA (서열식별번호: 5), 5T4Fab-SEAD227A (서열식별번호: 6) 및 5T4Fab-SEA/E-120 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 초항원 접합체는 나프투모맙 에스타페나톡스/아니아라®로 관련 기술분야에 공지된 5T4 Fab-SEA/E-120이며, 이는 함께 항-5T4 항체의 Fab 단편을 정의하는 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 서열 중 하나는 SEA/E-120 초항원, 즉 서열식별번호: 8 (SEA/E-120에 3개의 아미노산 링커에 의해 커플링된 5T4 Fab의 키메라 VH 쇄) 및 서열식별번호: 9 (5T4 Fab의 키메라 VL 쇄)를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 나프투모맙 에스타페나톡스/아니아라®로 관련 기술분야에 공지된 종양-표적화된 초항원 5T4Fab-SEA/E-120을, PD-1 억제제, 예컨대 항-PD-1 항체, 예를 들어 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니), MK-3475 (머크 & 캄파니), 피딜리주맙 (큐어테크), AMP-224 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 AMP-514 (아스트라제네카/메드이뮨) 또는 항-PD-L1 항체, 예컨대 MPDL3280A (제넨테크/로슈), MEDI-4736 (아스트라제네카/메드이뮨) 및 MSB0010718C (이엠디 세로노/머크 카게아)와 조합하여 포함한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 조성물은 표적화된 초항원 나프투모맙 에스타페나톡스 (아니아라®)를, 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니), 아테졸리주맙 (이전에 MPDL3280A), MEDI4736, 아벨루맙, 및 PDR001을 포함한 1종 이상의 항-PD-1 항체와 조합하여 포함한다.
추가로, 초항원 접합체 및 면역강화제는 효력 및/또는 선택적으로 치료 효과를 증진시키는 1종 이상의 추가의 작용제와 함께 또는 순차적으로 공-투여될 수 있다. 이러한 작용제는, 예를 들어 코르티코스테로이드, 추가의 면역 조정제, 및 투여된 초항원 접합체에 대한 환자의 가능한 면역반응성을 감소시키도록 설계된 그러한 화합물을 포함한다. 예를 들어, 투여된 초항원에 대한 면역반응성은, 예를 들어 대상체에서 항-초항원 항체의 생산을 감소시키는 항-CD20 항체 및/또는 항-CD19 항체와의 공-투여를 통해 감소될 수 있다.
바람직하게는, 치료될 환자는 적절한 골수 기능 (말초 절대 과립구 수 >2,000개/mm3 및 혈소판 수 100,000개/mm3으로 정의됨), 적절한 간 기능 (빌리루빈<1.5 mg/dl) 및 적절한 신기능 (크레아티닌<1.5 mg/dl)을 가질 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 요법은 신생물 또는 종양 세포를 초항원 접합체 및 면역강화제와 동시에 접촉시키는 것을 수반할 수 있다. 이것은 세포를 단일 조성물 또는 둘 다의 작용제를 포함하는 약리학적 제제와 접촉시킴으로써, 또는 세포를, 하나의 조성물은 초항원 접합체를 포함하고 다른 것은 면역강화제를 포함하는 것인 2종의 별개의 조성물 또는 제제와 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
대안적으로, 초항원 접합체는 분, 일 내지 주 범위의 간격으로 면역강화제에 선행하거나 또는 그 이후에 이어질 수 있다. 다른 면역강화제 및 초항원 접합체가 세포에 개별적으로 적용되는 실시양태에서, 본 발명자들은 초항원 접합체 및 면역강화제가 여전히 세포에 대해 유리하게는 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 각각의 전달 시간 사이에 상당한 기간이 지나지 않게 보장하여야 한다. 이러한 경우에, 본 발명자들은 세포를 두 양식과 서로 약 12-72시간 이내에 접촉시킬 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 일부 상황에서는, 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과하도록 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
초항원 접합체가 "A"이고 면역강화제가 "B"인, 다음의 다양한 조합이 사용될 수 있다: A/B/A, B/A/B, B/B/A, A/A/B, A/B/B, B/A/A, A/B/B/B, B/A/B/B, B/B/B/A, B/B/A/B, A/A/B/B, A/B/A/B, A/B/B/A, B/B/A/A, B/A/B/A, B/A/A/B, A/A/A/B, B/A/A/A, A/B/A/A 및 A/A/B/A.
추가로 본 발명은 외과적 개입과 조합되어 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 외과적 개입의 경우에, 본 발명은 수술전에, 예를 들어 수술불가능한 종양 대상체가 절제를 받도록 하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 수술 시에 및/또는 그 후에, 잔류 또는 전이성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 절제된 종양 층에 종양-표적화된 초항원 및/또는 면역강화제를 포함하는 제제가 주사 또는 관류될 수 있다. 관류는 절제후, 예를 들어 카테터를 수술 부위에 이식된 채로 남겨둠으로써 계속될 수 있다. 주기적 수술후 치료가 또한 고려된다. 본 발명의 요법과 수술과의 임의의 조합은 본 발명의 범주 내에 있다.
연속 투여가 또한 적용될 수 있으며, 적절한 경우에, 예를 들어 여기서 종양이 절제되고 종양 층이 잔류 미세 질환을 제거하기 위해 치료된다. 시린지 또는 소작을 통한 전달이 바람직하다. 이러한 연속 관류는 치료 개시 후 약 1-2시간, 내지 약 2-6시간, 내지 약 6-12시간, 내지 약 12-24시간, 내지 약 1-2일, 내지 약 1-2주 또는 그 초과의 기간 동안 일어날 수 있다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료 조성물의 용량은 단일 또는 다중 주사에 의해 주어진 것과 등가일 것이며, 관류가 수행되는 동안의 기간에 걸쳐 조정된다. 추가로 사지 관류가, 특히 흑색종 및 육종의 치료에 있어서 본 발명의 치료 조성물을 투여하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
원발성 종양 또는 절제후 종양 층에 대한 전형적 치료 과정은 다중 용량을 수반할 수 있다. 전형적 원발성 종양 치료는 2-주 기간에 걸쳐 6회 용량 적용을 수반할 수 있다. 2-주 요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과로 반복될 수 있다. 치료 과정 동안, 계획된 투여를 완료할 필요성이 재평가될 수 있다.
초항원 접합체를 사용한 면역요법은 종종 T 림프구의 신속한 (시간 내) 및 강력한 폴리클로날 활성화를 유발한다. 초항원 접합체 치료 주기는 4 내지 5회 매일 정맥내 초항원 접합체 약물 주사를 포함할 수 있다. 이러한 치료 주기는, 예를 들어 4 내지 6주 간격으로 주어질 수 있다. 종양 내로의 CTL 침윤에 의한 염증은 항종양 치료 초항원의 주요 이펙터 중 하나이다. CTL의 대량 활성화 및 분화의 단기간 후에, T-세포 반응은 다시 기준선 수준으로 신속하게 (4-5일 이내에) 감소한다. 따라서, 세포증식억제성 약물이 초항원 치료를 방해할 수 있는 림프구 증식의 기간은 짧고 잘-정의되어 있다. 이러한 그럴듯한 활성에 대한 특유의 시간 프레임은 단지 본 발명의 초항원/면역강화제 요법으로 인한 것이며, 이로써 신규 통합된 고용량 세포증식억제제/면역요법 치료가 가능하게 된다.
원발성 또는 전이성 흑색종, 선암종, 편평 세포 암종, 선편평상피 세포 암종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 다발성 골수종, 신경모세포종, NPC, 방광암, 자궁경부암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 암은 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 것으로 고려된다.
더욱이, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 암은 치료될 신체 위치 및/또는 계에 기초할 수 있으며, 예를 들어, 비제한적으로 골 (예를 들어, 유잉 패밀리의 종양, 골육종); 뇌 (예를 들어, 성인 뇌 종양, (예를 들어, 성인 뇌 종양, 뇌간 신경교종 (소아기), 소뇌 성상세포종 (소아기), 뇌 성상세포종/악성 신경교종 (소아기), 상의세포종 (소아기). 수모세포종 (소아기), 천막상 원시 신경외배엽 종양 및 송과체모세포종 (소아기), 시각 경로 및 시상하부 신경교종 (소아기) 및 소아기 뇌 종양 (기타)); 유방 (예를 들어, 여성 또는 남성 유방암); 소화기/위장 (예를 들어, 항문암, 담관암 (간외), 카르시노이드 종양 (위장), 결장암, 식도암, 담낭암, 간암 (성인 원발성), 간암 (소아기), 췌장암, 소장암, 위 (위) 암); 내분비 (예를 들어, 부신피질 암종, 카르시노이드 종양 (위장), 도세포 암종 (내분비 췌장), 부갑상선암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 갑상선암); 눈 (예를 들어, 흑색종 (안내), 망막모세포종); 비뇨생식기 (예를 들어, 방광암, 신장 (신세포) 암, 음경암, 전립선암, 신우 및 요관 암 (이행 세포), 고환암, 요도암, 윌름스 종양 및 다른 소아기 신장 종양); 배세포 (예를 들어, 두개외 배세포 종양 (소아기), 생식선외 배세포 종양, 난소 배세포 종양, 고환암); 부인과 (예를 들어, 자궁경부암, 자궁내막암, 임신성 영양막 종양, 난소 상피암, 난소 배세포 종양, 난소 저 악성 잠재 종양, 자궁 육종, 질암, 외음부암); 두경부 (예를 들어, 하인두암, 후두암, 구순 및 구강암, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, 비인두암, 구인두암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선암, 타액선암); 폐 (예를 들어, 비소세포 폐암, 소세포 폐암); 림프종 (예를 들어, AIDS-관련 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종 (성인), 호지킨 림프종 (소아기), 임신 동안의 호지킨 림프종, 균상 식육종, 비-호지킨 림프종 (성인), 비-호지킨 림프종 (소아기), 임신 동안의 비-호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 세자리 증후군, T-세포 림프종 (피부), 발덴스트롬 마크로불린혈증); 근골격 (예를 들어, 유잉 패밀리의 종양, 골육종/골의 악성 섬유 조직구종, 횡문근육종 (소아기), 연부 조직 육종 (성인), 연부 조직 육종 (소아기), 자궁 육종); 신경계 (예를 들어, 성인 뇌 종양, 소아기 뇌 종양 (예를 들어, 뇌간 신경교종, 소뇌 성상세포종, 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양 및 송과체모세포종, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 다른 뇌 종양), 신경모세포종, 뇌하수체 종양 원발성 중추 신경계 림프종); 호흡기/흉부 (예를 들어, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종, 흉선종 및 흉선 암종); 및 피부 (예를 들어, 피부 T-세포 림프종, 카포시 육종, 흑색종, 및 피부암)가 있다.
방법은 다양한 암, 예를 들어 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
추가로, 암은 종양 세포로 구성된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 흑색종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 전립선암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 신암 세포, 난소암 세포, 림프암 세포, 피부암 세포, 뇌암 세포, 골암 세포 또는 연부 조직 암 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 고형 종양의 예는 육종 및 암종, 예컨대, 비제한적으로 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아성 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함한다.
VI. 키트
추가로, 본 발명은, 예를 들어 초항원 접합체를 함유하는 제1 용기 및 면역강화제, 예컨대 항-PD-1 항체를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 또한 추가의 작용제, 예컨대, 예를 들어 코르티코스테로이드 또는 또 다른 지질 조정제를 함유할 수 있다. 용기 수단은 그 자체가 시린지, 피펫, 및/또는 다른 이러한 유사 장치일 수 있으며, 이로부터 제제는 신체의 특정 영역에 적용되고/거나, 동물 내로 주사되고/거나, 키트의 다른 성분과 함께 적용 및/또는 혼합될 수 있다.
키트는 적합하게 분취된 초항원 접합체 및/또는 면역강화제, 및 임의로, 지질 및/또는 본 발명의 추가의 작용제 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 중에 또는 동결건조 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 성분이 1종 및/또는 그 초과의 액체 용액 중에 제공되는 경우에, 액체 용액은 멸균 수용액이다.
본 발명의 실시는 상기 예로부터 보다 완전히 이해될 것이며, 이는 단지 예시적 목적을 위해 본원에 제공되며 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: NSCLC 종양 세포주에 대한 아니아라® 및 항-PD-1 억제제의 조합 요법
본 실시예는 HCC827 비소세포 폐 (NSCLC) 종양 세포주에 대한, 종양 표적화된 초항원인 아니아라® 및 항-PD-1 항체인 키트루다®의 조합의 항암 효과를 시험하는 시험관내 연구를 기재한다.
건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 10 ng/ml의 스타필로코쿠스 장독소 A (SEA)와 함께 4일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, T-세포를 단리하고, 추가 1일 동안 IL-2와 함께 인큐베이션하였다. 웰당 1x104개 HCC827 세포를 0.2μg/ml 농도의 키트루다® 및 T-세포와 함께 1시간 동안 96-웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 이펙터:표적 비 (T-세포:HCC827 세포)는 8:1이었다. 키트루다®와 함께 또는 그 없이 1시간 인큐베이션한 후에, 상이한 농도 (0, 0.1μg/ml, 및 10μg/ml)의 아니아라®를 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가 48시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 종료 시에 현탁된 T-세포 및 종양 세포를 포함하는 배양물 상청액을 제거하고, 부착된 종양 세포를 배양 배지로 1회 세척하였다. 잔류 HCC827의 생존율을 CCK8 키트 (셀 카운팅 키트-8, 시그마 알드리치)로 제조업체의 프로토콜에 따라 시험하였다. 대조군의 생존율을 100%에 대해 정규화하였다. 암 세포의 생존율 (%) = (처리군의 OD 값/대조군의 OD 값) x 100.
도 4 및 도 5에 제시된 바와 같이, 아니아라®와 키트루다®와의 조합은 HCC827 세포 생존율에 대한 가장 강한 효과를 나타냈다. 두 농도에서의 단독 아니아라®가 HCC827 세포의 생존율을 감소시켰지만, 그것은 아니아라®와 키트루다®와의 조합과 비교하여 훨씬 덜 효과적이었다. 0.2 μg/ml의 시험 농도에서의 키트루다®는 암 세포의 생존율에 대해 효과를 나타내지 않았다. 보다 낮은 0.1 μg/ml의 농도에서의 아니아라®는 HCC827 세포의 생존율을 60 ± 9.4%로 감소시켰으며 (p < 0.05 vs. 대조군) 반면에 아니아라®와 키트루다®와의 조합은 세포의 생존율을 33 ± 4.9%로 감소시켰다 (p < 0.005 vs. 대조군; p < 0.05 vs. 아니아라®) (도 4). 보다 높은 농도 (10 μg/ml)에서의 아니아라®는 암 세포의 생존율을 40 ± 6.6%로 감소시키면서 (p < 0.005 vs. 대조군), 보다 낮은 농도에서보다 더 강한 효과를 나타냈지만, 또한 이 농도에서 아니아라®와 키트루다®와의 조합은 유의하게 더 효과적이었고, 세포의 생존율을 14 ± 4.2%로 감소시켰다 (p < 0.0005 vs. 대조군; p = 0.005 vs. 아니아라®) (도 5).
종합하면, 이들 결과는 면역강화제 항-PD-1 (키트루다®)과 종양 표적화된 초항원 (아니아라®)과의 상승작용적 효과를 입증하고, 면역강화제와 함께 암 표적화된 초항원의 투여가 단독으로 투여될 때의 각각의 작용제의 상가적 효과보다 더 큰 증진된 항암 효과를 유발할 수 있다는 개념을 지지한다.
실시예 2: B16 흑색종 마우스 모델에서 종양 표적화된 초항원 및 뮤린 항-PD-1 억제제의 조합 요법
본 실시예는 생체내 뮤린 B16-EpCAM 흑색종 모델에 대한 종양 표적화된 초항원인 C215Fab-SEA 및 뮤린 항-PD-1 항체의 효과를 시험하는 연구를 기재한다. 종양 표적화된 초항원 및 항-PD-1의 조합 요법을, C215 항체에 의해 인식되는 인간 결장 암종 항원 EpCAM으로 형질감염된 낮은 면역원성 B16 흑색종을 사용하는 동계 종양 모델에서 시험하였다. 종양 표적화된 초항원 C215Fab-SEA는 종양-반응성 mAb (C215Fab) 및 박테리아 초항원 스타필로코쿠스 장독소 A (SEA)를 포함하는 융합 단백질이다. 생체내 뮤린 실험을 용이하게 하기 위해 C215Fab-SEA를 아니아라® 대신에 사용하였다.
연구를 위해, C57Bl/6 마우스에 꼬리 정맥 내로 1.75x105개의 B16-EpCAM 흑색종 세포를 정맥내로 (IV) 접종하여 폐 종양을 유도하였다. 마우스를 제5일 내지 제8일에, C215Fab-SEA (0.5 μg/마우스)의 매일 IV 주사 및/또는 항-PD-1 mAb (200 μg/마우스)의 1주 2회 복강내 (IP) 주사로 처리하였다. 대조군을 조합 요법 군과 동일한 투여 방식 및 요법으로 PBS로 처리하였다. 제21일에 마우스를 사멸시키고, 폐를 분리하였다. 적어도 24시간 동안 보우인 용액 중에서 고정시킨 후에, 폐 종양의 수를 계수하였다.
연구의 결과는 도 6에 제시된다. 예상된 바와 같이, B16 흑색종은 낮은 면역원성 종양이기 때문에, 항-PD-1 mAb 단독요법은 폐 종양의 수에 대해 효과를 나타내지 않았다. C215Fab-SEA 단독은 제21일에 B16 폐 종양의 수를, 대조군 처리된 마우스에서의 217.1±15.9개 (평균 ± SEM) 종양으로부터 98.8±16.4개로 대략 50% 감소시켰다. C215Fab-SEA 및 항-PD-1 mAb 조합은 종양의 수를 대략 80% 감소시켰으며, 단독요법과 비교하여 유의한 감소 (p<0.05)이다.
이들 결과는 낮은 면역원성 종양의 치료를 위해 종양 표적화된 초항원을 면역강화제와 함께 조합하는 것의 잠재력을 추가로 입증한다.
참조로 포함
본원에 참조된 각각의 특허 및 과학 문헌의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않는 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 기재보다는 오히려 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지고, 청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 그에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NeoTX Ltd. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE POTENCY OF SUPERANTIGEN MEDIATED CANCER IMMUNOTHERAPY <130> NTX-001PC <150> US62/276,955 <151> 2016-01-10 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Staphylococcus sp <400> 1 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Arg Asn Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu 35 40 45 Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr 50 55 60 Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110 Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn 115 120 125 Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys 130 135 140 Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu 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Protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (460)..(679) <223> Light Chain <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Tyr Ile Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Glu Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Tyr Asp Glu Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro 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Claims (28)

  1. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 (i) 대상체 내 암성 세포에 의해 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 초항원 접합체의 유효량 및 (ii) 하기 활성 (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 1개 이상이 가능한 면역강화제의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 강화시켜 암을 치료하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 초항원이 면역강화제 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 초항원이 T-세포의 표면 상의 T-세포 수용체에 결합하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원이 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 그의 면역학적 변이체 및/또는 단편을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 최초 항원이 세포 표면 항원인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포 표면 항원이 5T4 암 항원인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티가 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 항-5T4 항체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항-5T4 항체가 5T4 암 항원에 결합하는 Fab 단편을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원이 서열식별번호: 7의 아미노산 잔기 226 내지 458 또는 그의 면역학적 반응성 변이체 및/또는 단편을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로그램화된 세포 사멸-리간드 (PD-L)가 암성 세포의 표면 상에서 발현되며, T-세포에 의해 발현된 프로그램화된 세포 사멸-1 단백질 (PD-1)에 결합하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역강화제가, PD-L이 T-세포의 표면 상에서 발현된 PD-1에 결합하는 것을 방지하는 항-PD-1 항체인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 항-PD-1 항체가 인간 IgG4 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항-PD-1 항체가 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  16. 대상체 내 암성 세포에 의해 발현된 최초 항원에 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 초항원을 포함하는 초항원 접합체의 유효량, 대상체에서 하기 활성 (a) T-세포 신호전달 활성화를 자극하는 것, (b) 암성 세포와 T-세포 사이의 T-세포 억제 신호전달을 억제하는 것, 및/또는 (c) 인간 IgG4 이뮤노글로불린-매개된 경로를 통해 T-세포 확장, 활성화 및/또는 활성을 유도하는 억제 신호전달을 억제하는 것 중 1개 이상이 가능한 면역강화제의 유효량, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 초항원이 T-세포의 세포 표면 상에서 발현된 T-세포 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 초항원이 스타필로코쿠스 장독소 A 또는 그의 면역학적 변이체 및/또는 단편을 포함하는 것인 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 최초 항원이 세포 표면 항원인 조성물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 5T4 암 항원인 조성물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티가 항체인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 항체가 항-5T4 항체인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 항체가 5T4 항원에 결합하는 Fab 단편을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원이 서열식별번호: 7의 아미노산 잔기 226 내지 458 또는 그의 면역학적 반응성 변이체 및/또는 단편을 포함하는 것인 조성물.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역강화제가, 암성 세포에서 발현된 PD-L이 T-세포에 의해 발현된 PD-1에 결합하는 것을 방지하는 것인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 면역강화제가 항-PD-1 항체인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 항체가 인간 IgG4 이소형을 갖거나 또는 그를 기반으로 하는 것인 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 항-PD-1 항체가 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
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