CN1149290C - 一种新的人溶菌酶基因、其编码的多肽及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的溶菌酶基因家族的成员LYC3。本发明提供了该新溶菌酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽，以及利用重组技术生产所述的新的人溶菌酶的方法。本发明还提供了这种新人溶菌酶的应用。

Description

一种新的人溶菌酶基因、其编码的多肽及制备方法

发明领域

本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。更具体地说，本发明的多肽被推断鉴定为溶菌酶家族的一个新成员。

背景技术

溶菌酶广泛存在于生物体的各个部分中，包括各种组织、器官和血清，鸡蛋清中的含量尤为丰富，它主要由特定的腺体上皮细胞或是某些白细胞分泌产生。

溶菌酶最早见诸报导是在1922年由Fleming等发表的论文。自那以后，溶菌酶被从各个不同的角度进行了广泛的研究，例如它晶体结构、蛋白催化结构域、催化动力学、免疫学、分子进化学等方面已发表了大量的文献。溶菌酶已成为研究最广泛、最深入的蛋白质之一。但是，关于溶菌酶基因的研究还开展的很不够。迄今为止只有少数物种的溶菌酶基因已被克隆：如大肠杆菌T4溶菌酶、沙门氏菌P22噬菌体溶菌酶、杆菌φ噬菌体熔菌酶、鸡溶菌酶等等(1983 J.Mol.Biol.165，229-248；1985  Virology 143，280-289.；1987  Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，955-958.； Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5759-5763)，人中有关溶菌酶基因克隆方面的报道也已有相关文献公布(1988  Gene 66，223-234.)。

溶菌酶的主要作用是通过裂解细菌细胞壁的NAM(N-乙酰胞壁酸)和NAG(N-乙酰葡萄糖酸)间的β(1-4)糖苷键而达到裂解细胞的效果。生物体中溶菌酶作为一种非特异性的免疫分子具有抗细菌感染作用，在肠道内及一些依靠细菌生存的软体动物中还被作为一种消化酶起作用。溶菌酶还有抑制肿瘤生长的功能。正是由于溶菌酶具有上述功能，所以它无论在工业上还是在医学上都有重要的应用价值。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码溶菌酶基因家族的一个新成员，本发明的溶菌酶被命名为LYC3。

本发明的另一个目的是提供一种新的溶菌酶蛋白家族成员，该酶被命名为LYC3。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人溶菌酶的方法。

本发明还涉及这种人溶菌酶基因序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人LYC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：3中从核苷酸81-521位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：3中从核苷酸81-521位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：4所示的序列或SEQ ID NO：4中19-146位氨基酸序列。更佳地，该序列是SEQ ID NO：3中81-521位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的LYC3蛋白多肽，它包括：具有SEQ IDNO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中19-146位氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：4序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有LYC3蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有LYC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成LYC3蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：3中从核苷酸81-521位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成LYC3蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达LYC3蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有LYC3蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为583个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于81-521位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“LYC3蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有LYC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：3中81-521位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：3序列的编码框81-521位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：3中81-521位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQID NO：3中从核苷酸81-521位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO：3中从核苷酸81-521位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。此外，该术语还包括了仅编码去除了信号肽后的成熟蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：3中从135-521位的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人LYC3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“LYC3蛋白多肽”指具有LYC3蛋白活性的SEQ ID NO：4序列或SEQ ID NO：4中19-146位氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与人溶菌酶相同功能的、SEQ ID NO：4序列或SEQ ID NO：4中19-146位氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括LYC3蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与LYC3 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗LYC3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含LYC3多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了LYC3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有LYC3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供LYC3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LYC3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括LYC3多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内LYC3的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有LYC3多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码LYC3的核酸分子。

本发明还包括检测LYC3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于LYC3多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对LYC3 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于LYC3基因产物或片段。较佳地，指那些能与LYC3基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制LYC3蛋白的分子，也包括那些并不影响LYC3蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的LYC3基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的LYC3基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达LYC3或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断LYC3功能的抗体以及不影响LYC3功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用LYC3基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与LYC3基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人LYC3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与LYC3发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人LYC3蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人LYC3蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人LYC3蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为544个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于106-252位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A1：5′-AGAGTGGTGGTGGCTCCACTCTG-3′和反向引物B1：5′-TGCTGTGCATGGTTCCGTCCATC-3′进行PCR，获得544bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO：3的全长cDNA序列。

根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与不同来源的溶菌酶显示了显著的同源性，因此，这表明它是溶菌酶家族的一个新成员，并且具有溶菌酶家族蛋白的一些重要功能。

溶菌酶可以通过裂解细菌细胞壁的NAM(N-乙酰胞壁酸)和NAG(N-乙酰葡萄糖酸)间的β(1-4)糖苷键而达到裂解细胞的效果。生物体中溶菌酶作为一种非特异性的免疫分子具有抗细菌感染作用，在肠道内及一些依靠细菌生存的软体动物中还被作为一种消化酶起作用。溶菌酶还有抑制肿瘤生长的功能。1955年，Caselli和Shumacher(1955  Boll Ocul 34：513-533.)就报导了在由劳氏肉瘤病毒引起的鸡的角膜肿瘤形成中，溶菌酶介导了对这一过程的70％的抑制作用。许多其它的实验也说明溶菌酶参与了肿瘤的扩散及与肿瘤细胞的磷酸基和糖脂类分子的相互作用。溶菌酶对人类肿瘤的抑制作用也已见诸报导并取得专利(1980  Jpn Kokai Tokkyo Koho 33，409.；1980  Jpn Kokai Tokkyo Koho 33，408)。至于溶菌酶对肿瘤抑制的机制，有两种可能性，一是溶菌酶直接活化了生物体的免疫功能，二是它间接增强了生物的免疫能力(1989  Anticancer Reserch 9，583-592)。

附图简述

图1为本发明的人LYC3与其他溶菌酶的蛋白比较图。其中图1A是人LYC3与Trachypithecus francoisi的溶菌酶C(gi|1790947)的氨基酸序列的同源比较图；图1B是人LYC3与ring-necked pheasant(注：一种雉)的溶菌酶C(sp|p00702)的氨基酸序列的同源比较图。相同的氨基酸在两个序列之间用“：”标出，相似的氨基酸用“.”标出。相似的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。

图2显示了本发明LYC3的溶菌活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1

LYC3的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物-A1：5′-AGAGTGGTGGTGGCTCCACTCTG-3′(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-TGCTGTGCATGGTTCCGTCCATC-3′(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、69℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断为544bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插人片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共544bp，详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于81-521位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出LYC3的氨基酸序列，共146个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：4。

实施例2

同源比较

用LYC3的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们溶菌酶家族成员显示了较高的同源性，如用PCGENE软件分析，它与Trachypithecus francoisi的溶菌酶C(gi|1790947)在蛋白水平上显示了51.4％的同一性和64.4％的相似性(图1A)；又如，它与ring-necked pheasant(注：一种雉)的溶菌酶C(sp|p00702)在蛋白水平上显示了46.6％的同一性和59.2％的相似性(图1B)。

特别是在LYC3的氨基酸序列中存在由19个氨基酸组成的被认为是溶菌酶和α乳清蛋白的特征性序列—CX₃CX₂(L/M/F)X₃(D/E/N)(L/I)X₅C[注：该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(L/M/H)”表示从这3个氨基酸中任选一个氨基酸](溶菌酶和α乳清蛋白是在进化上密切相关的两类蛋白(Eur.J.Biochem.182：111-118))。在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是：CRMYCSDLLNPNLKDTVIC(SEQ ID NO：4中93-111位)。这更确定了本发明的LYC3也属于溶菌酶家族，并且具有溶菌酶家族的相关功能。

本发明的人LYC3蛋白有18个氨基酸的信号肽(即SEQ ID NO：4中1-18位)，去除了信号肽后的成熟人LYC3蛋白具有SEQ ID NO：4中19-146位的氨基酸序列。

溶菌酶可以通过裂解细菌细胞壁的NAM(N-乙酰胞壁酸)和NAG(N-乙酰葡萄糖酸)间的β(1-4)糖苷键而达到裂解细胞的效果。生物体中溶菌酶作为一种非特异性的免疫分子具有抗细菌感染作用，在肠道内及一些依靠细菌生存的软体动物中还被作为一种消化酶起作用。

溶菌酶无论在工业上还是在医学上都有重要的用途。

首先在工业上(主要是食品工业)，溶菌酶可以作为食品的保鲜剂或添加剂使用。在这方面，日本人已做了大量应用并拥有许多专利。比如他们已将溶菌酶用作新鲜水果蔬菜、豆奶、海洋食品和肉类，葡萄酒等的保鲜剂。溶菌酶还可以用作婴儿食品的添加剂以使其更接近人乳的成份(1988 Crit Rev Food Sci Nutr26(4)：359-395)。

药用方面，溶菌酶可以用来治疗病毒和细菌感染。如EDTA-tris-溶菌酶溶液对于治疗大肠菌感染引起的假单孢菌属膀胱炎有效。人和动物血清中溶菌酶的水平可以作为是否受到感染的一种标志。Zajaczkowska-Bialowas、Murai等研究了唾液溶菌酶活性和口腔疾病间的关系。他们的研究显示，溶菌酶对慢性牙周炎的症状具有明显的缓解作用。另外，还发现溶菌酶与某些抗生素具有协同作用，例如溶菌酶在单独使用的时候，即便用量较大对S.aureus的溶菌作用也很小，但在阿莫西林存在的情况下其溶菌作用增强并与溶菌酶的量成正比(1988  Crit Rev Food Sci Nutr 26(4)：359-395)。

溶菌酶还有抑制肿瘤生长的功能。1955年，Caselli和Shumacher(1955  Boll Ocul 34：513-533.)就报导了在由劳氏肉瘤病毒引起的鸡的角膜肿瘤形成中，溶菌酶介导了对这一过程的70％的抑制作用。许多其它的实验也说明溶菌酶与抑制肿瘤的扩散有关(1988 Clin Expl Mctastasis 6：245-253；1998 Folia Oncol 10，supplA：219-224；1988 Eur J Cancer Clin Oncol24：1737-1743)。溶菌酶还被发现能与肿瘤细胞的磷酸基和糖脂类分子的相互作用(1988  Crit Rev Food Sci Nutr 26(4)：359-395)。溶菌酶对人类肿瘤的抑制作用也已见诸报导，Laterza就用溶菌酶成功的治疗了一例手术和放疗后发生转移的小肠网状肉瘤病例(《Atti del II SimposiumInternazionale sul Lisozima》，Milano.7-8-9 1961.VolI，sez V，pp49-50)；Battaglia等在用溶菌酶治疗胃癌、前列腺癌、子宫癌、乳房癌的探索中发现，溶菌酶虽不能使肿瘤体积减小，但具有明显的减轻疼痛和辅助恢复的作用(《Atti del IISimposium Internazionale sul Lisozima di Fleming》， Milano.3-4-51964.Vol I，sezIV，pp69-76)；在日本，溶菌酶在治疗癌症方面的应用已取得专利(1980  Jpn Kokai Tokkyo Koho 33，409.；1980  Jpn Kokai Tokkyo Koho 33，408)；另外，A.Vacca.等在1985年报道了在化学免疫疗法中使用口服溶菌酶作为免疫调节剂治疗多种骨髓瘤(multiple myeloma)的尝试，他们的实验显示在接受大剂量溶菌酶治疗的患者中50％的人免疫能力较之对照组增强了(Chemiother IV n.2：147-155，1985)。至于溶菌酶对肿瘤抑制的机制，有两种可能性，一是溶菌酶直接活化了生物体的免疫功能，二是它间接增强了生物的免疫能力(1989  Anticancer Reserch 9，583-592)。

实施例3

LYC3在大肠杆菌中的表达

编码LYC3的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

5′寡核苷酸引物序列为

5′-TCTCGGATCCATGTTGTTGGCCCTGGTCT-3′(SEQ ID NO：5)，

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的LYC3编码序列的19个核苷酸；

3寡核苷酸引物序列为

5-CCTTGTCGACCTAGAAGTCACAGCCATCC-3(SEQ ID NO：6)，

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和LYC3的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI和SalI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用HindIII酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明LYC3的cDNA插入片段已正确装入载体。

过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的LYC3。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱LYC3。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为16KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：4的序列一致。

实施例4

LYC3在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码LYC3的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-TCTCAAGCTTATGTTGTTGGCCCTGGTCT-3′(SEQ ID NO：7)，

该引物含有HindIII限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的LYC3编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5-CCTTGGATCCCTAGAAGTCACAGCCATCC-3(SEQ ID NO：8)

该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和LYC3的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明LYC3的cDNA插入片段已正确装入载体。

质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为15KDa。

同时，还设计了去除信号肽的5′寡核苷酸引物：5′-TCTCAAGCTTAAGCTCTACG GTCGTTG-3′(SEQ ID NO：9)。以SEQ ID NO：9和8为引物，重复上述的实施例4步骤，同样获得了分子量为15kDa的表达蛋白，即去除了信号肽的LYC3蛋白。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：4的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3或实施例4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀LYC3基因翻译产物的能力加以评估。

实施例6

LYC3的溶菌作用

按类似于实施例3的方法，设计末端分别带有EcoRI和XhoI位点的引物来扩增LYC3基因。然后，用EcoRI和XhoI双酶切LYC3扩增产物，再克隆入pPIC9K载体(Invitrogen)。接着，用SalI酶切该载体，按厂商建议的条件电转化巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。根据能否在缺乏His的培养基上生长而筛选出整合有LYC3基因的酵母。

以整合有LYC3基因的巴斯德毕赤氏酵母培养上清液为样品，并作1∶1，1∶5，1∶10，1∶20∶1∶30，1∶50的一系列稀释。同时以未整合LYC3的酵母培养上清液为对照。取100微升样本或对照，37℃预热2min，分别加入37℃预热的底物(0.5M pH6.5磷酸缓冲液悬浮的艳红标记溶性微球菌(Micrococcus lysodeikticus))在37℃反应20min，加入乳化剂400微升停止反应，4000rpm离心5分钟，取上清，肉眼观察样品与对照，样品明显红于对照。反应液在721型分光光度计上于540nm波长处比色，以对照为空白管，样品吸光度大于对照。参见图2，图中上方为市售的Sigma的溶菌酶产品(从左至右分别是浓度分别为10^-2、5×10^-3、2×10^-3、10^-4、5×10^-4、和10^-4mg的溶菌酶和对照)，下方为本发明的LYC3蛋白的培养上清液(从左至右分别是稀释度为1∶1，1∶5，1∶10，1∶20∶1∶30，1∶50的LYC3上清液和对照)。红颜色越深，表示有越多的细菌被溶解。图2表明，LYC3有溶菌作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                序列表

(2)SEQ ID NO：1的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：23碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

AGAGTGGTGG TGGCTCCACT CTG               23

(2)SEQ ID NO：2的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：23碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：2

TGCTGTGCAT GGTTCCGTCC ATC               23

(2)SEQ ID NO：3的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：544bp

      (B)类型：核酸

      (C)链性：双链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：cDNA

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：3

 1  AGAGTGGTGG TGGCTCCACT CTGCCGCCGC ATAGAAGCCA GGAGCAGGGC TCTCAGAAGG

61  CGGTGGTGCC AGCTGGGATC ATGTTGTTGG CCCTGGTCTG TCTGCTCAGC TGCCTGCTAC

121 CCTCCAGTGA GGCCAAGCTC TACGGTCGTT GTGAACTGGC CAGAGTGCTA CATGACTTCG

181 GGCTGGACGG ATACCGGGGA TACAGCCTGG CTGACTGGGT CTGCCTTGCT TATTTCACAA

241 GCGGTTTCAA CGCAGCTGCT TTGGACTACG AGGCTGATGG GAGCACCAAC AACGGGATCT

301 TCCAGATCAA CAGCCGGAGG TGGTGCAGCA ACCTCACCCC GAACGTCCCC AACGTGTGCC

361 GGATGTACTG CTCAGATTTG TTGAATCCTA ATCTCAAGGA TACCGTTATC TGTGCCATGA

421 AGATAACCCA AGAGCCTCAG GGTCTGGGTT ACTGGGAGGC CTGGAGGCAT CACTGCCAGG

481 GAAAAGACCT CACTGAATGG GTGGATGGCT GTGACTTCTA GGATGGACGG AACCATGCAC

541 AGCA

(2)SEQ ID NO：4的信息：

   (i)序列特征：

     (A)长度：146个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：多肽

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：4

  1 Met Leu Leu Ala Leu Val Cys Leu Leu Ser Cys Leu Leu Pro Ser

 16 Ser Glu Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Cys Glu Leu Ala Arg Val Leu

 31 His Asp Phe Gly Leu Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Ala Asp

 46 Trp Val Cys Leu Ala Tyr Phe Thr Ser Gly Phe Asn Ala Ala Ala

 61 Leu Asp Tyr Glu Ala Asp Gly Ser Thr Asn Asn Gly Ile Phe Gln

 76 Ile Asn Ser Arg Arg Trp Cys Ser Asn Leu Thr Pro Asn Val Pro

 91 Asn Val Cys Arg Met Tyr Cys Ser Asp Leu Leu Asn Pro Asn Leu

106 Lys Asp Thr Val Ile Cys Ala Met Lys Ile Thr Gln Glu Pro Gln

121 Gly Leu Gly Tyr Trp Glu Ala Trp Arg His His Cys Gln Gly Lys

136 Asp Leu Thr Glu Trp Val Asp Gly Cys Asp Phe

(2)SEQ ID NO：5的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：29碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

     (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

TCTCGGATCC ATGTTGTTGG CCCTGGTCT               29

(2)SEQ ID NO：6的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：29碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CCTTGTCGAC CTAGAAGTCA CAGCCATCC               29

(2)SEQ ID NO：7的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：29碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TCTCAAGCTT ATGTTGTTGG CCCTGGTCT               29

(2)SEQ ID NO：8的信息

   (i)序列特征

      (A)长度：29碱基

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

CCTTGGATCC CTAGAAGTCA CAGCCATCC                 29

(2)SEQ ID NO：9的信息

  (i)序列特征

     (A)长度：27碱基

     (B)类型：核酸

     (C)链性：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

TCTCAAGCTT AAGCTCTACG GTCGTTG                   27

Claims (13)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人LYC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的多肽选自：

(a)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有溶菌功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码—多肽，该多肽具有SEQ ID NO：4所示的序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO：3中从第81至521位的核苷酸序列。

4.一种分离的LYC3蛋白多肽，其特征在于，它选自：

(a)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有溶菌功能的由(a)衍生的多肽。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：4序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生LYC3蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码LYC3蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成LYC3蛋白表达载体，所述的核苷酸序列编码一多肽，所述多肽含有SEQ ID NO：4氨基酸序列或SEQ ID NO：4中第19至146位氨基酸序列；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成表达LYC3蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达LYC3蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出LYC3蛋白。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO：3中从第81至521位的核苷酸序列。

12.一种能与权利要求4所述的LYC3蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

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