KR100615836B1 - 연쇄상구균 독소 ｃ의 돌연변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편, 백신 및 약제학적 조성물, 및 백신 및 약제학적 조성물의 이용 방법에 관한 것이다. 바람직한 SPE-C 독소는 1개 이상의 아미노산 변화를 가지며 야생형 SPE-C 독소와 비교하여 실질적으로 비-치사성이다. 돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성으로 부터 동물을 보호하는데 있어서 유용한 백신 조성물을 형성할 수 있다.
SPE-C 독소, 돌연변이체, 아미노산 치환, 백신, 면역
Description
β-용혈성 그룹 A 연쇄상구균(streptococci)(GAS)로서 공지되어 있는 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)은 인두염 및 농가진과 같은 경미한 감염을 일으킬 수 있는 사람의 병원체이다. 감염후 자가면역 합병증, 즉 류마티스열 및 급성 사구체신염이 발생할 수 있다. GAS는 또한 성홍열 및 연쇄상구균성 독성 쇼크 증후군 (STSS)과 같은 심한 급성 질환을 일으킨다. 심각한 GAS 감염증은 금세기 초부터 미국 및 전세계를 통하여 커다란 문제가 되고 있다. 40년대 중반에, 감염자 수와 이들의 심화도는 아직도 완전히 밝혀지지 않은 이유로 꾸준하게 감소되었다. 그러나, 보다 최근에, GAS에 의해 발병되는 심각한 질병이 미국내에서 매년 10 내지 20,000건의 STSS가 보고될 정도로 부활되었다. 이들 환자의 50 내지 60%에 이르는 다수가 괴사성 근막염과 근염을 앓게 되고; 30 내지 60%가 사망하게되며 생존자중 절반이 사지를 절단하게된다.
1986년과 1987년에 2개의 보고서가 록키산 주변에 국한된 심각한 GAS 감염증 발발에 대해 기재한 바 있다. 이들 보고서에 이어 지난 수년간 유사한 임상 징후를 나타내는 질병을 기술하는 수개의 다른 보고서가 있었다. 상기 질환에 대해 기재된 증상은 독성 쇼크 증상 (TSS)에 대해 기술된 것과 매우 유사하였으며, 1992년에 과학자 위원회는 상기 임상적 징후에 대해 STSS라는 공식명을 부여하였으며, 이의 진단 기준을 정하였다. STSS는 다음 증상으로 정의된다:
1. 저혈압 및 쇼크;
2. 그룹 A 연쇄상구균의 단리;
3. 다음 증상 중 2 이상: 38.5 ℃ 이상의 고열, 성홍열 피진, 구토 및 설사, 간 및 신장 기능장애, 성인성 호흡 곤란 증후군, 범발성 혈관내 응고병증, 괴사성 근막염 및/또는 근염, 균혈증.
STSS 환자로부터의 연쇄상구균 단리물은 주로 M1형과 M3형이고, M18형과 비-유형 유기체가 나머지 대부분을 이루고 있다. STSS와 관련된 M1, 3, 18, 및 비-유형 유기체중 대부분은 A형 발열성 외독소를 만들고 (대략 75%) 단리물의 나머지는 C형 발열성 외독소 (SPE-C)를 만든다. 또한, SPE-C를 토끼 동물 모델에게 투여하고 사람에게 접종시 STSS의 증상이 나타날 수 있다. STSS와 관련된 SPE-C외에 류마티스열 및 적상 건선 환자로부터의 그룹 A 연쇄상구균 단리물이 SPE-C를 만든다는 것이 연구로 밝혀졌다.
SPE-C는 분자량이 24,000 달톤에 달하는 단일 펩타이드이다. SPE-C에 대한 유전자인 speC가 성공적으로 클로닝되어 대장균(Escherichia coli)에서 발현되었다. SPE-C는 열을 유발시키고 내독소의 최대 100,000배 까지 숙주 감수성을 증가시킬 수 있는 능력을 토대로 발열성 독소로 지칭되는, 연쇄상구균 및 포도상구균(staphylococci)에 의해 생산되는 대계열 중의 외독소 일원이다.
최근에는 이들 독소가 항원 특이성과는 상관없이, T 세포 수용체의 β쇄의 가변부의 조성에 의존하는 방식으로, T 임파구의 대량 증식을 유발시킬 수 있는 이들의 능력때문에 초항원(superantigen)으로 지칭되고 있다. 이들 독소는 또한 IFN-γ, IL-1, TNF-α 및 TNF-β의 대량 방출을 자극한다. 상기 계열의 다른 일원에는 연쇄상구균성 발열성 외독소 A형 및 B형, 포도상구균성 독성 쇼크 증상 독소 1, 포도상구균성 장독소 A, B, Cn, D, E, G 및 H, 및 비-그룹 A 연쇄상구균성 발열성 외독소가 있다. 이들 독소는 유사한 생화학적 특성, 생물학적 활성 및 다양한 정도의 서열 유사성을 갖는다.
STSS의 가장 심각한 증후는 저혈압과 쇼크로, 이에 의해 사망에 이르게된다. 혈관내에서 간질 공간으로 유체가 누출되어 최종적으로 저혈압을 일으키는것으로 일반적으로 판단되고있으며, 이는 유체 대체 요법이 상기한 STSS의 토끼 모델에서 쇼크를 방지하는데 있어 성공적이었다는 관찰에 의해 지지된다. SPE-C는 숙주에서 여러가지 방법으로 상기 병변을 유발시킬 수 있다고 가정되고 있다.
SPE-C는 간 쿠퍼 세포 (Kuppfer cells)의 활성을 약화시킴으로써, 내인성 플로라(flora) 기원의 내독소가 간에서 정화되는 것을 차단시키는 것으로 밝혀졌다. 이는, 순환하는 내독소의 현저한 증가를 일으켜서, 지질다당류 결합 단백질 (LBP)과의 결합 및 CD14 시그날 전달을 통하여 대식세포를 활성화시키고 이어서 TNF-α 및 다른 사이토카인을 방출시키는 것으로 보인다. 상기 질병에 있어서의 내독소의 역할은, SPE-C의 치사 효과가 동물에 폴리믹신 B를 투여하거나 병원균이 없는 래비트를 사용함으로써 적어도 부분적으로 중화될 수 있다는 발견에 의해 지지된다.
쇼크의 다른 유도 양상은 모세관 내피 세포에 대한 상기 독소의 직접적인 활성일 수 있다. 상기 가설은 포도상구균성 발열성 독소 TSST-1이 사람의 제대 정맥 세포에 직접 결합하고 단리된 돼지 대동맥 내피 세포에 대해 세포독성을 띤다는 발견으로부터 유래한다.
상기 독소의 다른 작용 양상은 이의 초항원성으로, 이는 상기 독소가 숙주 T 임파구와 상호작용하여 숙주 T 임파구를 최대 50% 까지 활성화시킨다. 이러한 대량의 T 세포 자극으로 순환하는 사이토카인 TNF-β 및 IFN-γ의 수준이 비정상적으로 높아지며, 이들 TNF-β 및 IFN-γ는 대식세포에 대해 TNF-α 및 IL-1의 방출을 유도시키는 직접적인 효과를 갖는다. 이들 사이토카인은, T 세포 부재하에서 MHC II형 결합 및 시그날 전달을 통해 SPE-C에 의해 대식세포로부터 직접적으로 유도될 수 있다. TNF-α 및 -β 수준의 상승은 그램 네가티브 유도된 쇼크에서 전형적으로 발견되는 몇가지 효과, 그 중에서도 내피 세포 및 모세관 누출에 대한 손상을 일으킨다. 그러나, SPE-A 처리된 토끼에, IL-2 및 T 세포 증식의 상향 조절을 차단하는 사이클로스포린 A를 투여해도 쇼크로부터 동물을 보호하지 못하는데, 이는 모세관 누출을 일으키는데 있어서 추가의 메카니즘이 더욱 중요할 수 있음을 제시하는 것이다.
따라서, 상이한 생물학적 활성에 관여하는 SPE-C 분자에 대한 부위를 결정할 필요가 있다. 독성 및 유사분열성과 같은 생물학적 활성이 변화된 SPE-C 변이체를 개발할 필요가 있다. 연쇄상구균성 독성 쇼크 증후군을 예방하거나 완화시키기 위한 백신에 유용한 조성물을 개발할 필요가 있다. 또한, 연쇄상구균성 독성 쇼크 증후군 및 다른 질환의 치료에 유용한 치료제를 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 돌연변이 SPE-C 독소 및 이의 단편, 백신 및 약제학적 조성물, 및 백신 및 약제학적 조성물의 사용 방법을 포함한다.
돌연변이 SPE-C 독소는 1개 이상의 아미노산 변화를 가지며 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교하여 실질적으로 비치사성이다. 백신 조성물의 경우, 돌연변이 독소는 또한 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나에 대한 보호 면역 반응을 자극한다. 백신 조성물용 돌연변이 독소는 야생형 SPE-C와 비교시 내독소 쇼크의 향상에서의 감소 및 T 세포 유사분열유발성에서의 감소를 갖도록 임의로 추가로 선택된다. 약제학적 조성물의 경우, 돌연변이 독소가 실질적으로 비치사성인 반면, 야생형 SPE-C 독소에 필적할만한 T 세포 유사분열유발성을 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 야생형 SPE-C 독소의 단편 및 SPE-C 독소의 돌연변이체를 포함한다. 야생형 SPE-C로부터 유래된 단편 및 펩타이드는 돌연변이 SPE-C 독소이다. 단편은 함께 연결된 분자의 상이한 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 단편은 야생형 SPE-C 독소와 비교시 실질적으로 비치사성이다. 돌연변이 독소의 경우, 단편은 야생형 SPE-C 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상의 아미노산 변화를 갖는다. 단편은 또한 백신 및 약제학적 조성물에 있어서 유용하다.
본 발명은 또한 발현 카셋, 벡터 및 형질전환된 세포를 포함한다. 발현 카셋은 숙주 세포에서 작용성인 프로모터에 작동가능하게 연결된, 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열 또는 이의 단편을 포함한다. DNA 카셋을 벡터에 삽입하는 것이 바람직하다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 벡터는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA를 발생시키기 위한 주형 DNA를 제공하는데 유용하다. DNA 카셋 및 벡터는 또한 백신 조성물에 있어서 유용하다. 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 핵산 또는 이의 단편은 포유동물 세포에서의 발현을 위하여 직접 운반될 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포내에서 작용성인 프로모터가 바람직하다. 세포로 직접 운반된 핵산은, 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나에 대해 보호 면역 반응이 발생될 수 있도록, 각각의 세포내에서 돌연변이 SPE-C 독소의 발현을 제공할 수 있다.
추가의 백신 조성물은 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 암호화하는 발현 카셋을 포함하는 안정하게 형질전환된 세포 또는 바이러스성 벡터를 포함한다. 백시니아(vaccinia)와 같은 바이러스성 벡터를 사용하여 사람을 면역화시켜, 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나에 대한 보호성 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 형질전환된 세포는 황색포도상구균(S. aureus), 대장균(E. coli), 또는 살모넬라(Salmonella) 종과 같은 미생물이 바람직하다. 형질전환된 미생물은 이들의 표면상에 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 포함하거나 돌연변이 독소를 분비할 수 있다. 형질전환된 미생물은 생 백신, 약독화된 백신 또는 열에 의해 사멸된 백신으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 백신 및 약제학적 조성물의 사용 방법을 포함한다. 백신은 동물에게 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나에 대한 보호 면역 반응을 발생시키기에 유효한 양으로 투여한다. 바람직하게는, 백신 조성물을 사람에게 투여하여 STSS의 발병에 대해 보호하는 것이다. 약제학적 조성물은 T 세포 증식의 자극 방법에 사용된다.
돌연변이 SPE-C 독소 및/또는 이의 단편 및 다른 백신 조성물은 수동 면역 혈청을 생성시키는데 유용할 수 있다. 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편, DNA 발현 카셋 또는 벡터, 또는 형질전환된 미생물을 사용하여 동물을 면역화시켜, 야생형 SPE-C의 생물학적 활성중 적어도 하나에 대한 중화 항체를 생성시킬 수 있다. 중화 항체는 돌연변이 SPE-C 독소 및/또는 이의 단편 및 야생형 SPE-C 독소와 면역반응한다. 수동 면역 혈청을 연쇄상구균성 감염증 및 STSS의 증상을 나타내는 동물에게 투여할 수 있다.
도 1은 speC의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 번호는 ATG 개시 코돈을 기준으로 붙인다. 가능한 프로모터 (-10, -35) 및 샤인-달가노 (SD) 서열이 표시되어 있다. 뉴클레오티드 서열 아래에 추론되는 아미노산 서열을 제시하였다. 잔기 27 다음의 별표는 시그날 펩타이드와 성숙 단백질 사이의 절단 부위를 표시한다. 해독 종결 코돈의 밑줄친 3' 뉴클레오티드는 팔린드롬(palindrome) 서열이다.
도 2는 SPE-C의 리본 구조의 정면도를 나타낸다.
도 3은 SPE-C의 리본 구조의 배면도를 나타낸다.
도 4는 복합체중에서 주요 조직적합성 복합체 II형과 접촉하는 위치를 나타내기 위하여 배향시킨 SPE-C의 리본 구조의 정면도를 나타낸다.
도 5는 복합체중에서 T세포 수용체와 접촉하는 위치를 나타내기 위하여 배향시킨 SPE-C의 리본 다이아그램의 정면도를 나타낸다.
도 6은 복합체중 간 신장 관형 세포 수용체와 상기 수용체가 접촉하는 홈판을 형성하는 중앙 α 나선의 잔기를 나타내기 위하여 배향시킨 SPE-C의 리본 구조의 배면도를 나타낸다.
도 7은 단일 돌연변이 Y15A 및 N38A의 유사분열 활성을 나타낸다.
도 8은 단일 돌연변이 Y17A의 유사분열 활성을 나타낸다.
도 9는 이중 돌연변이 Y15A/N38A 및 Y17A/N38A의 유사분열 활성을 나타낸다.
도 10은 실시예 6에서 치환된 잔기를 나타내는 SPE-C의 리본 구조의 정면도 및 배면도를 나타낸다.
본 발명은 돌연변이 SPE-C 독소 및 이의 단편, 돌연변이 SPE-C 독소 및 이의 단편을 포함하는 백신 및 약제학적 조성물, 돌연변이 SPE-C 독소 및 이의 단편의 제조 방법, 및 SPE-C 독소 및 이의 단편의 사용 방법에 관한 것이다.
돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교하여 아미노산이 1개 이상 변화되고 생물학적 기능에 있어서 하나 이상 변화된 단백질이다. 바람직하게는, 돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소와 비교시 동일한 투여량에서 실질적으로 비치사성이다. 돌연변이 SPE-C 독소는 부위-지시된 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발, 통상의 돌연변이유발, 시험관내 돌연변이유발, 자발적 돌연변이유발 및 화학적 합성법을 포함한, 여러가지 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 돌연변이 SPE-C 독소는 1) 아미노산이 하나 이상 변화되고; 2) 분자의 생물학적 기능이 하나 이상 변화되도록, 바람직하게는 전신적 치사성이 감소되거나 제거되도록 선택하는 것이 바람직하다. 돌연변이 독소는 STSS의 예방 또는 완화와 같은 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 하나 이상에 대한 보호용 백신 조성물 및 STSS 증상의 동물을 치료하는 방법에 있어서 유용하다.
A. 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편, 백신 및 약제학적 조성물
본 발명은, 야생형 SPE-C와 실질적으로 대응하며 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질과 비교시, 아미노산이 1개 이상 변화되고 생물학적 활성이 하나 이상 변화된 돌연변이 SPE-C 독소를 포함한다.
야생형 SPE-C 독소는 유전자 speC에 의해 암호화된다. 야생형 SPE-C 독소는 정제된 단백질을 SDS PAGE에 의해 측정한 바에 의하면 분자량이 24,000 달톤이다. 야생형 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열 및 야생형 SPE-C 독소에 대해 예측되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다. 야생형 SPE-A 독소를 암호화하는 DNA 서열이 대장균 및 황색포도상구균에서 클로닝되었다. 본원에서 아미노산 번호 표시는 도 1의 서열을 참고로하며, 여기서 위치 28의 아스파르테이트가 제1 아미노산으로 표시된다. 앞 부분의 27개의 아미노산은 성숙 단백질중에 존재하지않는 리더 서열을 나타낸다.
야생형 SPE-C 독소는 수가지 생물학적 활성을 갖는다. 이들 생물학적 활성은 1) 열; 2) STSS; 3) STSS의 발병 또는 내독소 쇼크의 증가로 인한 전신적 치사성; 4) 내독소 쇼크 증가; 5) 모세관 누출 및 저혈압 유발; 6) IFNγ, IL-1, TNF-α 및 TNF-β와 같은 사이토카인 방출 유도; 7) 돼지의 대동맥 내피 세포에의 결합; 8) MHC II형 분자와의 결합; 9) T-세포 수용체와의 결합; 및 10) T-세포 유사분열유발성 (초항원성)을 포함한다. 이들 활성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 검정되어 특징화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 야생형 SPE-C 독소의 정의에는 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성과 동일한 활성을 갖는 야생형 SPE-C 독소의 변이체, 예를 들면 대립유전자 변이체가 포함된다. 이들 SPE-C 독소는 상이한 아미노산을 가질 수 있거나 이들의 유전자가 도 1에 나타낸 것과 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만, 상이한 생물학적 활성을 갖지는 않는다. 아미노산 서열에서의 변화는 표현형으로는 표현되지 않는다. 바람직하게는, 이들 독소 분자는 전신적 치사성을 가지며 도 1에 나타낸 야생형 SPE-C 독소와 동일한 정도로 내독소 쇼크를 증가시킨다. 바람직하게는, 이들 독소가 문헌 [Altschul, S.F., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)]에 기술된 바에 따르면 SS2 정렬 알고리듬(SS2 Alignment Algorithm)을 사용하여 측정한 바에 따르면 도 1에 나타낸 야생형 SPE-C 독소 아미노산 서열과 60 내지 99% 이상의 상동성을 갖는다.
돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교시 아미노산에서 1개 이상 변화된 독소이다. 변화는 아미노산 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 아미노산 서열에 있어서 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 6개의 변화가 있을 수 있다. 돌연변이 SPE-C 독소가 전신적 치사성 또는 독성을 갖는 야생형 SPE-C 독소로 복귀되는 것이 최소화되도록, 아미노산 서열에서 1개 이상 변화되는 것이 바람직하다. 백신에서 유용한 돌연변이 SPE-C 독소의 경우, 독소의 아미노산 서열에서의 변화로 인해 야생형 SPE-C 독소를 중화시킬 수 있는 항체 반응을 자극시킬 수 있는 독소의 능력이 변화되지 않는 것이 바람직하다. 백신에서 유용한 돌연변이 SPE-C 독소의 경우, 돌연변이 독소가, 예를 들면 공급원 [Toxin Technologies; Boca Raton, Fla 또는 Dr. Schlievert (University of Minnesota, Minneapolis, MN)]으로부터 제공된 SPE-C 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체에 의해 인지되고, 단백분해 프로필이 야생형 SPE-C과 비교하여 변화되지 않는 것이 특히 바람직하다.
아미노산 서열에서의 변화는 야생형 SPE-C 독소의 선택된 아미노산 잔기 1개 이상에서 부위-특이적 변화일 수 있다. 부위-특이적 변화는 상기한 분자의 특정 도메인 내의 잔기 또는 시스테인 잔기가 존재하는 위치의 잔기를 확인함으로써 선택한다. 임의로, 특정 위치에서의 부위-특이적 변화는, 1차 서열 상동성 또는 3-D 입체형태를 비교함으로써, 위치 또는 도메인내에서의 아미노산이 다른 상동성 분자내의 등가의 잔기와 동일하거나 유사한 특성을 갖는지 측정하여 추가로 선택할 수 있다. 상동성 분자는, 상기한 Altschul 등의 SS2 정렬 알고리듬 또는 공급원(BioSym, San Diego, CA)으로 부터 제공된 상동성 모델링 프로그램, 예를 들면 Insight/Homology을 사용한, 1차 서열 상동성 비교에 의해 확인될 수 있는 것 중 하나이다. 상동성 분자는 동일하거나 보존적으로 변화된 아미노산이 현저한 수, 전형적으로 30 내지 99%를 나타내거나 유사한 3차원 구조, 야생형 SPE-C 독소와 비교시, 전형적으로 보존된 영역에 대한 RMS 오차가 < 2 Å인 것이다.
특정 부위에서 아미노산 서열에서의 변화는 랜덤하게 이루어질 수 있거나 특이적 변화가 선택될 수 있다. 일단 특정 부위가 선택되면, 이의 아미노산 번호 표기법에 의해서 및 도 1에 나타낸 바와 같은 야생형 SPE-C중의 부위에서 발견되는 아미노산에 의해 언급된다. 본원에서의 아미노산 번호 표시는 도 1의 서열을 참고로하며, 여기서 28번 위치의 아스파르테이트가 제1 아미노산으로서 계수된다. 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질중 특정 부위에서 확인되는 것에 대응하는 등가의 아미노산은 참고 서열에 따라 또는 이들이 단편인지에 따라 상이한 아미노산 번호를 가질 수 있다. 또한 등가의 잔기는, 1차 아미노산 구조의 비교에 의하거나 도 1에 나타낸 바와 같은 모델화된 구조를 비교하거나 또는 상동성 분자의 공지된 결정 구조를 비교함으로써, 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질의 아미노산과 등가인 것으로 확인될 수 있는 상동성 분자에서 발견되는 것이다. 본 발명은 아미노산 번호 표시와는 상관없이 동일하거나 유사한 위치에서 등가의 아미노산에 대한 변화를 포함한다.
특정 치환이 특정 부위의 아미노산에 대해 선택되는 경우, 그 위치에서 치환될 아미노산은 야생형 SPE-C중 그 위치에서의 아미노산과 비교하여 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 구조적 변화를 포함하도록 선택된다. 상기 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 구조적 변화를 일으키는 치환으로는, 1) 일정 유형의 전하로부터 다른 유형으로의 변화; 2) 전하로부터 비전하로의 변화; 3) 시스테인 잔기 및 디설파이드 결합 형성에서의 변화; 4) 소수성 잔기에서 친수성 잔기로 또는 친수성 잔기에서 소수성 잔기로의 변화; 5) 아미노산 크기에서의 변화; 6) 입체형태적으로 제한적인 아미노산 또는 유사체로의 변화; 및 7) 비-천연 아미노산 또는 유사체로의 변화가 있다. 선택된 특정 치환은 또한 선택된 부위의 위치에 따라 결정될 수 있다. 예를들면, N-말단 알파 나선중 아미노산은 히드록실기를 갖고 있어 노출된 아미드 질소와 상호작용하거나, 음으로 하전되어 α 나선의 N-말단에 존재하는 부분적인 양성 전하와 상호작용하는 것이 바람직하다.
돌연변이 독소는 또한 특정 부위(들)에 대해 표적화된 랜덤 돌연변이를 포함할 수 있다. 부위가 일단 선택되면, 문헌[Alyar et al., Biotechniques 14:366 (1993) 또는 Ho et al. Gene 77:51-54 (1984)]에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 상기 부위에서 치환된 다른 19개의 각 아미노산을 갖는 돌연변이체를 발생시킬 수 있다. 또한, 시험관내 돌연변이를 이용하여 문헌[Anthony-Cahill et al., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989)]에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 다른 19개의 아미노산 또는 비-천연 아미노산 또는 유사체중의 하나를 각각 특정 위치에서 치환시킬 수 있다.
돌연변이 독소는 또한 특이적으로 선택되지 않는 분자중 1개 이상의 부위에서 변화되고, 특이적으로 선택된 것은 아니나 다른 19개의 아미노산 또는 비-천연 아미노산 중 하나일 수 있는 아미노산에서 변화된 독소를 포함한다.
특정 부위에서의 치환은 또한 비제한적으로, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 호모시스테인, 2-아미노아디프산, 2-아미노피밀산, 오르니틴, 호모아르기닌, N-메틸리신, 디메틸 리신, 트리메틸 리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 히드록시리신, 치환된 페닐알라닌, 노르류신, 노르발린, (-발린 및 할로겐화된 티로신과 같은 비-천연 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 부위에서의 치환은 또한 비제한적으로, 에스테르, 에테르 및 포스포릴 및 붕소 결합을 포함하는 비-펩타이드 화학을 사용하는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
돌연변이 독소는 여러가지 방법으로 발생시킬 수 있다. 그러한 방법으로는 자발적 돌연변이, 시험관내 돌연변이유발 및 화학적 합성에 의한 부위-특이적 돌연변이유발, EMS 또는 이황화나트륨과 같은 화학물질을 사용하는 돌연변이유발 방법, 또는 UV 조사법 등이 있다. 돌연변이유발 방법은 다음 문헌으로부터 알 수 있다: Sambrook et al., A Guide to Molecular Cloning, Cold Spring Harvard, New York (1989). 부위-특이적 돌연변이유발에 대해 특히 바람직한 방법은 문헌[Perrin and Gilliland, 1990. Nucleic Acid Res. 18:7433]에 기술된 바와 같이 3개의 프라이머로 비대칭 PCR을 이용하는 것이다.
4개의 포도상구균 초항원 (TSST-1, SEA, SEB, 및 SEC-3) 및 SPE-C의 3차원 구조를 중첩시킴으로써, 이들 단백질이 16개의 구조적으로 보존된 아미노산 (표 1)을 공유한다는 것이 증명되었다. 이들 16개의 구조적으로 보존된 아미노산 잔기를 기준점으로 사용함으로써, 2 Å 이하의 RMS (Root Mean Square: 제곱근 평균) 차를 갖는 이들 5개의 단백질의 구조를 중첩시킬 수 있는데, 이는 최소의 아미노산 서열 보존성을 갖는 단백질에 있어 중요하다. 16개의 구조적으로 보존된 아미노산을 토대로 하는 상기 중첩은 SPE-C의 구조와 포도상구균 초항원을 상세하게 비교할 수 있도록 한다.
포도상구균 초항원 SEB와 II형 주요 조직적합성 복합체 (MHC-II)와의 복합체의 결정 구조는 MHC-II와 접촉하는 SEB상의 아미노산을 나타내며 표 2에 열거된 잔기를 포함한다. SPE-C 구조의 중첩은 이들 2개의 펩타이드의 복합체중 MHC-II와 접촉하는 SPE-C 부분의 위치를 나타낸다. 이들 위치를 도 4에 공 모양으로 나타내었다.
특히, 도 4와 관련하여, 이들은 B-서브유니트 5의 β-배럴 4의 스트랜드 3상의 위치 1 및 2를 포함한다. 위치 1은 스트랜드 3의 4형 회전부(turn) 또는 돌출부(bulge)를 지나서 존재하는 아미노산 1 잔기 및 스트랜드 3과 루프 6의 접합부로부터 약 3개의 잔기의 위치이다. 위치 1을 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Thr-33이 차지할 수 있다. 위치 2는 스트랜드 3과 루프 6의 접합부에 밀접한 스트랜드 3의 아미노산을 나타내며, 다른것은 상기 스트랜드상에 유지된다. 위치 2를 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 His-35가 차지할 수 있다. 위치 7은 스트랜드 3과 루프 6의 접합부에 가장 가까운 아미노산을 나타낸다. 루프 6은 "1형" 또는 "2형" 회전부이다. 위치 7은 소수성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Leu-36일 수 있다. 또한 B-서브유니트 5의 β-배럴 4는 잔기 Asn-38을 포함한다.
위치 8은 루프 6중에 있다. 위치 8을 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asn-38이 차지할 수 있다. 위치 10, 11 및 14는 스트랜드 12상에 있다. 위치 10은 루프 13과의 접합부와 가장 가까운 스트랜드 12상의 아미노산이다. 위치 10은 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Arg-44일 수 있다. 위치 11은 스트랜드 12의 대략 중간에 있으며 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Lys-42가 차지할 수 있다. 위치 14는 스트랜드 12와 루프 6의 접합부에 있으나 스트랜드 12 상에 있지 않다. 위치 14를 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Thr-40이 차지할 수 있다. 위치 15는 루프 6상에 있다. 위치 15를 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asp-39가 차지할 수 있다.
위치 17 내지 20은 스트랜드 21상에 있다. 위치 19 및 20은 인접해 있다. 위치 17 내지 19는 상호간의 위치에 대해 충분한 공간을 갖고 분리되어 있다. 위치 17은 스트랜드 21과 루프 13의 접합부로부터 약 1개의 아미노산이다. 위치 17을 소수성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Ile-50이 차지할 수 있다. 위치 18은 스트랜드 21의 대략 중간점에 있으며 중성 또는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 아미노산 Ser-52가 차지할 수 있다. 위치 19는 스트랜드 21과 루프 22의 접합부로부터 약 2개의 아미노산이다. 위치 19를 중성 또는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Met-54가 차지할 수 있다. 위치 20은 스트랜드 21과 루프 22의 접합부에 인접한 스트랜드 21중에 있다. 위치 20을 중성 또는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Ser-55가 차지할 수 있다. 위치 23은 회전부의 알파 나선 24상에 있으며 나선 24와 루프 25의 접합부와 종결부를 이룬다. 위치 23은 위치 20과 대면하고 나선 24의 표면상에 있다. 위치 23은 중성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Ala-186이 차지할 수 있다.
포도상구균 초항원 SEC-3와 T 세포 수용체와의 복합체의 결정 구조는 T 세포 수용체와 접촉하는 SEC-3상의 아미노산을 나타내며, 표 3에 열거한 잔기를 포함한다. SPE-C 구조의 중첩은 이들 2개의 단백질의 복합체중의 T 세포 수용체와 접촉하는 SPE-C의 아미노산의 위치를 나타낸다. 이들 위치를 도 5에 공모양으로 나타내었다.
특히, 도 5와 관련하여, 이들은 루프 13과 스트랜드 21의 접합부에 있는 위치 26을 포함한다. 위치 26을 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-49가 차지할 수 있다. 위치 27은 스트랜드 28상의, 스트랜드 28과 루프 29의 접합부로부터 대략 3개의 아미노산 정도의 거리에 있다. 위치 27은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-85가 차지할 수 있다. 위치 30은 루프 29상의, 스트랜드 28과 32 사이의 대략 등거리에 있다. 위치 30은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 His-81이 차지할 수 있다. 위치 31은 루프 29와 스트랜드 32의 접합부에 있다. 위치 31은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asn-79가 차지할 수 있다. 위치 33 내지 36은 스트랜드 32상에 있다. 위치 33은 스트랜드 32와 루프 31의 접합부에 인접한 아미노산이다. 위치 33을 소수성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Leu-78이 차지할 수 있다. 위치 34는 위치 33으로부터의 아미노산중 하나이다. 위치 34를 소수성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Ile-77이 차지할 수 있다. 위치 35를 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-76이 차지할 수 있다. 위치 36은 소수성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Phe-75가 차지할 수 있다.
위치 38은 비규칙적 알파 나선 24상의 잔기로 루프 39와의 접합부에 가장 가까운 상기 알파 나선의 회전부상에 있다. 위치 38은 스트랜드 40과 가장 가까운 회전부상에 있다. 위치 38을 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asp-183이 차지할 수 있다. 위치 41은 루프 39상의, 루프 39와 알파 나선 24의 접합부로부터 대략 1개의 아미노산이다. 위치 41의 아미노산상의 측쇄는 중앙의 알파 나선 42쪽으로 배향된다. 위치 41을 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Arg-181이 차지할 수 있다.
루프 43은 위치 44, 45, 46 및 47을 포함한다. 위치 44 내지 47은 용매에 가장 많이 노출되는 루프 43의 부분상의 인접한 위치이다. 위치 44를 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Glu-178이 차지할 수 있다. 위치 45를 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-153이 차지할 수 있다. 위치 46은 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asp-148이 차지할 수 있다. 위치 47은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-147이 차지할 수 있다.
위치 48 내지 50은 N-말단 알파 나선 51상에 있다. 위치 48 및 49는 루프 52와의 접합부에 가장 가까운 알파 나선 51의 회전부상에 있다. 위치 48은 중성 또는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Ser-11이 차지할 수 있다. 위치 49는 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asp-12가 차지할 수 있다. 위치 48 및 49는 인접하는 아미노산 위치를 나타낸다. 위치 50은 루프 53과의 접합부에 인접한 알파 나선 51의 회전부에 있다. 위치 50은 용매에 가장 많이 노출되는 회전부의 부분상에 있다. 위치 50은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-15가 차지할 수 있다. N-말단 알파 나선 51은 또한 잔기 Tyr-17을 포함한다.
SPE-C는 SPE-C의 "배면"상의 홈에 있는 잔기를 포함하는 부위에서 간 신장 관형 세포 수용체에 결합한다. 위치 54 내지 60은 간 신장 관형 세포 수용체와의 상호작용의 일부인 B 서브유니트 5와 A 서브유니트 61 사이의 SPE-C상의 홈의 표면을 구획한다. 위치 54 내지 59는 중앙 알파 나선 42상에 있다. 위치 60은 루프 16과 중앙 알파 나선 42의 접합부에 인접한 루프 16상에 있다. 위치 54는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asn-143이 차지할 수 있다. 위치 55는 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Asp-142가 차지할 수 있다. 위치 56은 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Tyr-139가 차지할 수 있다. 위치 57은 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Lys-138이 차지할 수 있다. 위치 58은 양으로 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Lys-135가 차지할 수 있다. 위치 59는 하전된 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Glu-131이 차지할 수 있다. 위치 60은 중성 또는 극성 아미노산, 바람직하게는 SPE-C의 Thr-128이 차지할 수 있다.
표 2는 II형 MHC와 SEB 단백질 복합체의 결정 구조에 있어서 II형 MHC와 상호작용하는 SEB의 잔기를 열거한 것이다. SEB:MHC-II 복합체의 구조와 SEC-3, SEA 및 TSST-1의 구조와의 중첩은 MHC-II와 상호작용하는 열거된 SEB 잔기에 대응하는 이들 단백질상의 아미노산을 나타낸다. 바람직한 SPE-C 돌연변이체는, MHC-II와 상호작용하는 SEB, SEC-3, SEA 또는 TSST-1중의 잔기에 대응하는 SPE-C 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는다. 이들 바람직한 SPE-C 잔기는 표 2에 열거된 SPE-A 잔기를 포함한다. 상이한 단백질로부터의 대응하는 잔기를 상기 표의 동일 열상에 열거하였다.
표 3은 T-세포 수용체와 SEC-3 단백질 복합체의 결정 구조에 있어서 T-세포 수용체와 상호작용하는 SEC-3의 잔기를 열거한 것이다. SEC-3:T-세포 수용체 복합체의 구조와 SEB, SEA 및 TSST-1의 구조의 중첩은 T-세포 수용체와 상호작용하는 SEC 잔기에 대응하는 이들 단백질상의 아미노산을 나타낸다. 바람직한 SPE-C 돌연변이체는 T-세포 수용체와 상호작용하는 SEB, SEC-3, SEA 또는 TSST-1중의 잔기에 대응하는 SPE-C 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는다. 이들 바람직한 SPE-C 잔기로는 표 3에 열거된 SPE-A 잔기가 있다. 상이한 단백질로부터의 대응하는 잔기를 상기 표의 동일 열상에 열거하였다.
SPE-C의 바람직한 돌연변이체는 T-세포 수용체, MHC-II 또는 간 신장 관형 세포 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기중 1개 이상에 대해서 또는 위치중 1개 이상에서 아미노산 치환을 갖는다. 이들 아미노산 치환은 상호작용을 중단시키도록 상기한 바와 같이 선택할 수 있다.
| TSST-1 | SEA | SEB | SEC-3 | SPE-C |
| TYR 13 | TYR 30 | TYR 28 | TYR 28 | TYR 17 |
| ASP 27 | ASP 45 | ASP 42 | ASP 42 | (THR 33) |
| LYS 58 | LYS 81 | LYS 78 | LYS 78 | (ARG 65) |
| VAL 62 | VAL 85 | VAL 82 | VAL 82 | VAL 69 |
| ASP 63 | ASP 86 | ASP 83 | ASP 83 | ASP 70 |
| GLY 87 | GLY 110 | GLY 117 | GLY 114 | GLY 89 |
| THR 89 | THR 112 | THR 119 | THR 116 | THR 91 |
| LYS 121 | LYS 147 | LYS 152 | LYS 151 | LYS 124 |
| LYS 122 | LYS 148 | LYS 153 | LYS 152 | (ASP 125) |
| LEU 129 | LEU 155 | LEU 160 | LEU 159 | (ILE 132) |
| ASP 130 | ASP 156 | ASP 161 | ASP 160 | ASP 133 |
| ARG 134 | ARG 160 | ARG 162 | ARG 161 | ARG 137 |
| LEU 137 | LEU 163 | LEU 168 | LEU 167 | LEU 140 |
| LEU 143 | LEU 169 | LEU 171 | LEU 170 | (ILE 146) |
| TYR 144 | TYR 170 | TYR 172 | TYR 171 | TYR 147 |
| GLY 152 | GLY 182 | GLY 185 | GLY 184 | GLY 156 |
| ASP 167 | ASP 197 | ASP 199 | ASP 199 | ASP 171 |
| ILE 189 | ILE 226 | ILE 230 | ILE 230 | ILE 204 |
| TSST-1 | SEC-3 | SEA | SEB | SPE-C |
| ASN 5 | GLY 19 | THR 21 | GLY 19 | ASN 8 |
| THR 20 | ALA 22 | LEV 20 | SER 11 | |
| ASP 8 | ASN 23 | ASN 25 | ASN 23 | ASP 12 |
| ASP 11 | TYR 26 | GLN 28 | VAL 26 | TYR 15 |
| ASN 60 | TYR 49 | |||
| LYS 70 | TYR 90 | GLY 93 | TYR 90 | ILE 77 |
| VAL 91 | TYR 94 | TYR 91 | LEU 78 | |
| GLY 102 | ASN 79 | |||
| LYS 103 | ||||
| VAL 104 | ||||
| SER 106 | LYS 103 | |||
| ARG 145 | PHE 176 | ASN 171 | TYR 175 | ASP 148 |
| GLN 210 | SER 206 | GLN 210 | ARG 181 |
야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교하여 아미노산 변화를 1개 이상 갖는 돌연변이 SPE-C 독소를 일단 발생시킨 다음, 돌연변이 SPE-C 독소를 비치사성에 대해 선별한다. 상기 선별 단계로부터 선택된 돌연변이 SPE-C가, 야생형 SPE-C 독소와 동일한 투여량 또는 이 이상의 투여량으로 미니삼투압 펌프 (실시예 4에 기재)를 사용하여 투여시 토끼에서 실질적으로 비치사성인 것이 바람직하다. 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편은, 야생형 독소와 동일한 투여량으로 토끼에게 투여시 토끼의 약 10 내지 20% 이하가 사망하게될 경우 실질적으로 비치사성이다. 비치사성 돌연변이 독소는 백신 및 약제학적 조성물중에 유용하다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 전신적 치사성에 영향을 주는 일부 아미노산 잔기 또는 도메인은 다른 생물학적 활성, 특히 T 세포 유사분열유발성으로부터 분리가능한 것으로 생각된다.
백신 조성물에 유용한 돌연변이 독소의 경우, 야생형 SPE-C 독소 활성을 중화시키는 항체 반응을 자극할 수 있는 돌연변이 SPE-C 독소를 선별하는 것이 또한 바람직하다. 야생형 SPE-C 독소 활성을 중화시키는 항체 반응을 자극할 수 있는 돌연변이 독소를 선택하는 방법은 돌연변이 독소가 공급원[Toxin Technologies, Boca Raton, Fla 또는 Dr. Schlievert]로부터 입수가능한 것과 같은 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체와 면역반응하는지에 대해 측정한다. 돌연변이 SPE-C 독소가 야생형 SPE-C 독소에 대한 항체와 면역반응하는지에 대한 측정 방법으로는 ELISA, 웨스턴 블롯, 이중 면역확산 검정법 등이 있다.
또한, 임의로, 돌연변이 독소의 단백분해 프로필이 야생형 SPE-C 독소와 동일한지에 대해 측정하기 위하여 돌연변이 독소를 선별할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 발생된 돌연변이체가 야생형 SPE-C 독소와 비교시 돌연변이 독소의 전체적인 3차원 구조가 실질적으로 변화되지 않는 것이 바람직하다. 전체적인 입체 구조에서 변화되었는지에 대한 조사 방법중 하나는 야생형 SPE-C 독소에 대한 항체의 면역반응성을 조사하고/하거나 돌연변이 SPE-C 독소의 단백분해 프로필을 조사하는 것이다. 단백분해 프로필은 트립신, 키모트립신, 파파인, 펩신, 서브틸리신 및 V8 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 도 3에 나타낸 서열을 갖는 야생형 SPE-C의 단백분해 프로필은 공지되어 있다. 야생형 SPE-C와 유사한 프로필을 갖는 돌연변이체를 선택한다.
임의로, 돌연변이 독소를 또한 생물학적 활성에서 다른 변화를 갖는지에 대해 선별하여 선택할 수 있다. 상기한 바와 같이, 야생형 SPE-C 독소와 관련된 수개의 생물학적 활성이 있다. 그러한 생물학적 활성으로는 1) 열; 2) STSS; 4) 내독소 쇼크의 증가; 5) 모세관 누출 및 저혈압; 6) IFN 감마, IL-1, TNF-α 및 TNF-β와 같은 사이토카인의 방출 유도; 7) 내피 세포에 대한 결합; 8) MHC II형 분자에 대한 결합; 9) T-세포 수용체에 대한 결합; 및 10) T-세포 유사분열유발성 (초항원성)이 있다. 이들 생물학적 활성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
백신 조성물에 유용한 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편의 경우, 이들이 실질적으로 비독성이며 야생형 SPE-C에 대한 중화 항체와 면역반응성인 것이 바람직하다. 중화 항체로는 동물에서 시험시 야생형 독소의 치사성을 억제하는 것들을 포함한다. 임의로, 돌연변이 SPE-C 독소는 상기한 바와 같이 야생형 SPE-C 독소의 다른 생물학적 활성중 하나 이상에서 변화를 가질 수 있다.
임의로, 백신 조성물용으로 바람직한 돌연변이 독소를 내독소 쇼크의 강화성 결여에 대해 추가로 선별하여 선택한다. 내독소 쇼크의 강화성 결여를 조사하는 바람직한 검정법이 실시예 3에 기술되어 있다. 토끼는 시험전에 입증가능한 세균 또는 바이러스 감염이 없는 것이 바람직하다. 내독소 쇼크의 증가를 강화시키는 능력이 결여되어 있거나 실질적으로 없다는 것은, 동일한 투여량에서 야생형 SPE-C 활성과 비교한 바, 돌연변이 SPE-C 독소를 내독소와 함께 투여시 쇼크를 발생시키는 동물이 약 25% 미만인 것으로 밝혀졌다. 좀더 바람직하게는, 어떤 동물도 쇼크를 발생시키지 않는다.
임의로, 백신 조성물에 대해 바람직한 돌연변이체를 또한 T 세포 유사분열유발성에서의 변화에 대해 선별하고 선택한다. T-세포 유사분열유발성에서의 변화는, 실시예 3에 기술된 바와 같이 토끼 임파구를 사용하여 표준 3H 티미딘 검정법으로 T-세포 증식을 측정하거나; IFN 감마 또는 TNF-β와 같은 사이토카인의 생산 수준을 측정하거나; T 세포 반응의 Vβ형을 측정하거나; 또는 상기 분자와 MHC II형 수용체와의 상호작용을 측정하여 검출할 수 있다. T-세포 유사분열유발성에서의 감소를 검출하는데 바람직한 방법은 돌연변이 독소의 존재 및 부재하에서 토끼 임파구의 T-세포 증식을 측정하는 것이다. 야생형 SPE-C 독소에 대한 T 세포의 반응은 항원에 대한 정상적인 시험관내 반응 이상으로 크게 증가된다. T 세포 유사분열유발성에서의 실질적인 감소는, 돌연변이 SPE-C 독소가 항원 또는 네가티브 대조군을 사용한 자극보다 더 크게 T 세포 증식 반응을 자극하지 않을 경우에 나타난다. 바람직하게는, 돌연변이 SPE-C 독소에 대한 T 세포 증식 반응이, 야생형 SPE-C 독소와 동일한 투여량으로 토끼 임파구를 사용하여 측정하는 경우, 배경치의 2배 이상을 넘지 않도록 감소됨이 관측되었다.
임의로, 백신 조성물내에서 유용한 돌연변이 SPE-C 독소를, 내피 세포에서 모세관 누출의 감소에 대해 추가로 선별하고 선택한다. 바람직한 방법은 문헌[Lee et al., J. Infect, Dis, 164:711 (1991)]에 기술된 바와 같이 돼지 대동맥 내피세포를 사용하는 것이다. 돌연변이 SPE-C의 존재하에서 모세관 누출의 감소는 방사선 표지된 화합물의 방출에서의 감소량을 측정하거나 방사선 표지된 화합물의 운송에서의 변화량을 측정함으로써 결정할 수 있다. 방사선 표지된 화합물의 방출량 또는 운송량이 야생형 독소의 활성과 비교시 배경치의 2배 이상을 넘지않도록 감소되는 경우, 모세관 누출의 감소가 관측되었다.
백신 조성물에 유용한 특히 바람직한 돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소 활성을 갖는 단백질과 비교하여 생물학적으로 불활성적이다. 생물학적으로 불활성이란, 돌연변이 독소가 전신성 치사성이 거의 없거나 전혀 없으며, 내독소 쇼크의 증가가 거의 없거나 전혀 없고 T 세포 유사분열유발성이 거의 없거나 전혀 없음을 의미한다. 바람직하게는, 백신 조성물에 대해 선택된 돌연변이 SPE-C 독소는 이들 생물학적 활성이 실질적으로 결여되어 있다. 즉, 이들은 네가티브 대조군과 같이 반응하거나 배경치의 2배 이상을 넘지 않게 반응을 자극한다.
다른 생물학적 활성에서의 변화는 다음과 같이 검출할 수 있다. MHC II형 분자로의 결합은 문헌[Jardetzky, Nature 368:711 (1994)]에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 발열에서의 변화는 돌연변이 SPE-C 독소 투여후 시간 경과에 따라 온도를 모니터함으로써 검출할 수 있다. 돌연변이 SPE-C 독소의 존재하에서 사이토카인 생산 수준에서의 변화는, 상업적으로 이용가능하며 현재 면역학 프로토콜에 의해 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 측정할 수 있다 (Ed. Coligan, Kruisbeck, Margulies, Shevach, 및 Stroker. National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc.).
백신 조성물에 대해 특히 바람직한 돌연변이체는 야생형 SPE-C 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와 면역반응하며 비독성이고, 임의로 내독소 쇼크의 강화가 감소되고 T-세포 유사분열유발성이 감소된 돌연변이 SPE-C 독소이다.
유리하게는, 아미노산 서열에서의 1개 이상의 변화를 갖는, 치료 방법에서 유용한 돌연변이 SPE-C 독소를 발생시킬 수 있다. 독성 또는 치사성을 갖는 분자로의 복귀 변화가 최소화되도록 1개 이상의 위치에서 변화를 갖는 것이 바람직하다. 백신 조성물의 경우, 다중 변화를 갖는 돌연변이 독소가 야생형 SPE-C에 대한 보호 면역 반응을 발생시키고/시키거나 야생형 SPE-C에 대한 중화 폴리클로날 항체와 면역반응할 수 있는 것이 바람직하다. 약제학적 조성물의 경우, 다중 변화를 갖는 돌연변이가 실질적으로 비치사성인 반면, T 세포에 대한 유사분열유발성을 유지하는 것이 바람직하다. 약 2 내지 6개의 변화를 갖는 것이 특히 바람직하다. 삼중 돌연변이체가 또한 본원에서 고려된다.
SPE-C의 돌연변이 독소는 백신 조성물을 형성시키는데 유용하다. 백신 조성물용으로 바람직한 돌연변이체는 1개 이상의 아미노산 변화를 가지며 전신적으로 비독성이고, 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체와 면역반응한다.
돌연변이 독소를 생리학적으로 허용되는 담체와 결합시킨다. 생리학적으로 허용되는 희석제로는 생리식염수, 및 인산염 완충 염수와 같은 중성 pH의 완충 염수가 있다. 다른 유형의 생리학적 담체로는 리포좀 또는 중합체 등이 있다. 임의로, 돌연변이 독소를 프로인트 불완전 애쥬번트, 프로인트 완전 애쥬번트, 명반(alum), 모노포스포릴 지질 A, 명반(alum) 포스페이트 또는 히드록사이드, QS-21 등과 같은 애쥬번트와 결합시킬 수 있다. 임의로, 돌연변이 독소 또는 이의 단편을 인터류킨, 인터페론 등과 같은 면역조절제와 결합시킬 수 있다. 수 많은 백신 제형이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 동물에서 보호 면역 반응을 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 하나 이상에 대해 자극하기에 유효한 양으로 백신 제형에 가한다. 보호 면역 반응의 발생은 항체, 바람직하게는 야생형 SPE-C 독소를 중화시키는 항체의 발생에 의해 측정할 수 있다. 야생형 SPE-C 독소의 중화는 동물에서 야생형 SPE-C로 인한 치사율의 억제에 의해 측정할 수 있다. 또한, 보호 면역 반응은 내독소 쇼크 또는 STSS의 증가 징후의 완화 또는 제거와 같은 야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 하나 이상에서의 감소량을 측정함으로써 검출할 수 있다. 보호 면역 반응을 형성할 수 있는 돌연변이 독소의 양은 체중 ㎏당 약 0.1 ㎍ 내지 100 ㎎, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍/체중 ㎏이다. 야생형 SPE-C 독소 약 25 ㎍/체중 ㎏이 토끼에서 보호 면역성을 유도시키는데 효과적이다.
백신 조성물을 토끼, 설치류, 말 및 사람과 같은 동물에게 투여한다. 바람직한 동물은 사람이다.
돌연변이 SPE-C 독소는 또한 약제학적 조성물을 형성하는데 있어서 유용하 다. 약제학적 조성물은 T-세포 증식의 자극이 바람직할 수 있는 치료 상황에서 유용하다. 바람직한 돌연변이 SPE-C 독소는 야생형 SPE-C 독소에 필적할만한 T-세포 유사분열유발성을 유지하면서도 비치사성인 것이다.
돌연변이 SPE-C 독소와 생리식염수, 인산염 완충 염수와 같은 중성 pH의 완충 염수와 같은 생리학적으로 허용되는 담체를 배합하여 약제학적 조성물을 형성시킨다. 돌연변이 SPE-C 독소는 동일한 투여량으로 야생형 SPE-C 독소에 필적할만한 T-세포 증식을 자극하기에 유효한 양으로 배합시킨다. T-세포 반응성의 증가는, 토끼 임파구를 사용한 표준 3H 티미딘 검정법을 사용할 뿐만 아니라 형광물질 활성화 T-세포 분류기 또는 ELISPOT와 같은 검정법을 사용하여 생체내 T-세포군을 측정하여 측정할 수 있다. 유효량의 범위는 체중 ㎏당 100 ng 내지 100 ㎎, 더욱 바람직하게는 1 ㎍ 내지 1 ㎎/체중 ㎏이다. 예를들면, 이들 돌연변이 SPE-C 독소는 단독으로 또는 인터류킨 또는 인터페론 요법과 함께 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 SPE-C 독소의 단편 및 돌연변이 SPE-C 독소의 단편을 포함한다. 백신 조성물의 경우, 단편은 보호 면역 반응을 자극하기에 충분히 큰 것이 바람직하다. B 세포 에피토프에 대한 최소 크기는 약 4 내지 7개의 아미노산이며 T 세포 에피토프의 경우 약 8 내지 12개의 아미노산이다. 야생형 SPE-C의 전체 크기는 리더 서열을 포함하여 약 235개의 아미노산이다. 단편은 약 4 내지 200개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 50개의 아미노산인 펩타이드이다.
단편은 단일 펩타이드일 수 있거나 상이한 위치에서 함께 연결된 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 단편은 도 1에 확인된 바와 같으며 본 명세서에 기술된 바와 같은 도메인을 1개 이상 포함한다. 돌연변이 SPE-C 독소로부터의 단편은, 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교시, 아미노산 서열에서 1개 이상의 변화, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 변화를 갖는 것이 또한 바람직하다.
바람직하게는, 단편이 실질적으로 전신적 비치사성이다. 상기한 바와 같이 야생형 SPE-C 독소 활성을 갖는 단백질과 동일하거나 더 많은 투여량에서 미니삼투 펌프 모델을 사용하여 토끼에서 독성이 거의 없거나 전혀 없는 단편을 선별하여 선택한다. 야생형 SPE-C 독소의 투여량에 필적하는 투여량을 공급하는 경우, 사람에 있어서 단편이 비독성인 것이 또한 바람직하다.
백신 조성물의 경우, 단편이 중앙 α 나선 및/또는 N-말단 α 나선으로부터의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 백신 조성물의 경우, 단편이 야생형 SPE-C 독소 활성을 갖는 단백질에 대한 중화 항체 반응을 자극하는 것이 바람직하다. 단편은 야생형 SPE-C 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와의 면역반응성에 대해 선별하여 선택할 수 있다. 또한 단편을 사용하여 동물을 면역시키고 형성된 항체를 야생형 SPE-C 독소의 중화에 대해 시험할 수 있다.
백신 조성물의 경우, 특히 바람직한 단편을, 생물학적으로 불활성인지에 대해 선택하여 선별한다. 생물학적으로 불활성이란, 단편이 전신적으로 비치사성이며, 내독소 쇼크의 증가가 거의 없거나 전혀 없으며, T 세포 자극을 거의 유도하지 않거나 전혀 유도하지 않는 것을 의미한다. 임의로, 돼지 내피 세포상에서 모세관 누출 효과를 감소시키는지에 대해 단편을 선별하여 선택할 수 있다.
백신 조성물용으로 선별되어 선택된 단편을 백신 제형중에 배합시켜 상기한 바와 같이 이용할 수 있다. 임의로, 단편을 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌, 파상풍 독소 등과 같은 담체 분자에 부착시킬 수 있다.
약제학적 조성물의 경우, 단편이 N-말단 도메인 B β 스트랜드의 아미노산 잔기만 또는 중앙 α 나선과 함께 포함하는 것이 바람직하다.
약제학적 조성물의 경우, 단편을 전신적인 비치사성에 대해, 임의로는 상기한 바와 같은 내독소 쇼크의 증가가 거의 없거나 전혀 없는지에 대해 선별하고 선택하는 것이 바람직하다. 단편이 야생형 SPE-C 독소와 유사한 T-세포 유사분열유발성을 보유하는 것이 바람직하다. 돌연변이 독소 SPE-C의 단편은 상기한 바와 같이 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
돌연변이 SPE-C 독소의 단편은 PCR, 제한 효소 분해 및/또는 결합, 시험관내 돌연변이유발 및 화학적 합성법을 사용하여 제조할 수 있다. 더 작은 단편의 경우 화학적 합성법이 바람직할 수 있다.
돌연변이 SPE-C 독소의 단편은 돌연변이 SPE-C 독소에 대해 기술된 바와 동일한 조성물 및 방법으로 이용할 수 있다.
B. 돌연변이 SPE-C 독소의 사용 방법, 백신 조성물 또는 약제학적 조성물
돌연변이 SPE-C 독소 및/또는 이의 단편은, 야생형 SPE-C 독소의 효과로 부터동물을 보호하는 방법, STSS를 앓고 있는 동물을 완화 또는 치료하는 방법, 향상된 T-세포 증식과 반응성을 유도하는 방법, 및 적상 건선, 류마티스성 열, 또는 침습성 연쇄상구균성 감염증 증상의 치료 및 완화 방법에 있어서 유용하다.
야생형 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 하나 이상에 대한 동물의 보호 방법은 백신 조성물을 동물에게 투여하여 SPE-C 독소의 생물학적 활성중 하나 이상에 대한 보호 면역 반응을 확립시키는 단계를 포함한다. 보호 면역 반응이 STSS의 치사성 또는 증상에 대한 중화 및 보호인 것이 바람직하다. 백신 조성물은 바람직하게는 아미노산 변화가 1개 이상이고, 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체와 면역반응하며, 비치사성인 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 포함한다.
백신 조성물은 피하내, 근육내, 정맥내, 피내, 경구, 비강내, 안내, 복강내 등을 포함한 여러가지 방법으로 동물에게 투여할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육내 투여이다.
백신 조성물은 토끼, 설치류, 말 및 사람을 포함한 여러가지 동물에게 투여할 수 있다. 바람직한 동물은 사람이다.
백신 조성물은 야생형 SPE-C의 생물학적 활성중 하나 이상에 대한 보호 면역성이 확립될 때 까지 단일 또는 다중 투여로 투여할 수 있다. 보호 면역성은 표준 방법을 사용하여 야생형 SPE-C에 대한 중화 항체의 존재를 측정함으로써 검출할 수 있다. 유효량을 투여하여 실질적인 독성을 일으키지 않으면서 보호 면역성을 확립시킨다.
돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편은 또한 돌연변이 SPE-C 독소 및 야생형 SPE-C 독소와 면역반응하는 중화 항체를 발생시키는데 유용하다. 이들 항체를 수동 면역 혈청으로 사용하여 STSS 증상을 갖는 환자에 있어서 증상을 치료 또는 완화시킬 수 있다. 상기한 바와 같은 백신 조성물은 말 또는 사람과 같은 동물에게 야생형 SPE-C에 대한 중화 항체 반응이 발생될 때 까지 투여할 수 있다. 이후 이들 중화 항체를 수확하여 정제하고 이를 이용하여 STSS 증상을 나타내는 환자를 치료할 수 있다. 야생형 SPE-C 독소에 대한 중화 항체는 또한 야생형 SPE-C를 사용하여 형성시킬 수 있다. 그러나, 야생형 SPE-C는 토끼에서 야생형 SPE-C의 LD50의 1/50 내지 1/100과 같이 독성을 유도하는 양보다 훨씬 더 낮은 투여량으로 투여하여야 한다.
중화 항체를 열, 저혈압, 그룹 A 연쇄상구균성 감염증, 근염, 근막염 및 간 손상과 같은 STSS 증상을 나타내는 환자에게 SPE-C 독소의 효과를 중화시키는데 유효한 양으로 투여한다. 중화 항체는 정맥내, 근육내, 피내, 피하내 등으로 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 정맥내이거나 국부 감염증의 경우, 변연절제술에 의한 조직 손상 부위에 국소적으로 투여한다. 중화 항체를 항생제 치료제와 함께 투여하는 것이 또한 바람직하다. 중화 항체는 쇼크 또는 조직 손상에서의 감소가 단일 또는 다중 투여로 수득될 때 까지 투여할 수 있다. 전형적으로 투여되는 중화 항체의 바람직한 양은 약 1 ㎎ 내지 1000 ㎎/체중 ㎏, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 200 ㎎/㎏이다.
C. 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 발현 카셋 및 이러한 DNA 발현 카셋의 제조 방법
본 발명은 또한 돌연변이 SPE-C 독소 및/또는 이의 단편의 발현에 있어서 유용한 DNA 서열 및 발현 카셋을 포함한다. 발현 카셋은 아미노산이 1개 이상 변화되고, 숙주 세포에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 야생형 SPE-C 독소에 실질적으로 대응하는 단백질과 비교하여 생물학적 기능이 하나 이상 변화된 돌연변이 SPE-C 독소 및/또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 발현 카셋을 형질전환 벡터중에 삽입시키고 돌연변이 SPE-C 독소를 형질전환된 세포내에서 생산한다. 이후 돌연변이 독소를 숙주 세포 또는 숙주 세포 상등액으로부터 정제할 수 있다. 형질전환된 숙주 세포는 또한 백신 조성물로서 유용하다.
또한 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편은, 부위 특이적 또는 랜덤 돌연변이유발에 대해 기술된 바와 유사한 방법으로 자발적 돌연변이체를 선별 및 선택하여 형성시킬 수 있다. 돌연변이 SPE-C 독소는 시험관내 돌연변이유발을 이용하여 제조하거나 일정한 방법으로 생산된 단편으로부터 반합성적으로 제조할 수 있다. 마지막으로, 돌연변이 SPE-C 독소는 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.
돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편의 생산 방법은, 상기와 같은 발현 카셋을 포함하는 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키고 상기와 같은 돌연변이 SPE-C 독소 또는 단편이 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 조건하에서 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함한다.
돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열
아미노산 서열에서 1개 이상의 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 돌연변이 DNA 서열은 선택된 변화의 유형에 따라 각종 방법으로 형성될 수 있다. 주형 DNA로서 야생형 SPE-C 독소 기능에 실질적으로 대응하는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 사용하여 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열을 제조한다. 야생형 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열은 도 1에 제시하였다.
특정 위치(들)에서 특이적으로 변화(들)을 만들기 위해서는 위에서 언급한 페린(Perrin) 등의 방법에 따라서 PCR을 이용하는 것이 바람직하다. 특정 위치에 대해 변화를 표적화하기 위해서, 아미노산 변화를 암호화하는 변화된 뉴클레오티드를 포함하는 내부 프라이머를 5' 및 3' 플랭킹 프라이머를 또한 포함하는 혼합물에 포함시킨다. 5' 플랭킹 프라이머는 야생형 SPE-C에 대한 암호화 서열의 해독 개시 부위의 상류(upstream) DNA 영역과 상동성이거나 이에 하이브리드화된다. 바람직하게는, 5' 플랭킹 영역이 speA 프로모터 및 조절 영역의 상류이다. 예를들면, 5' 플랭킹 프라이머는 해독 개시 부위 상류의 약 760개 염기 영역에 상동성이거나 이에 하이브리드화될 수 있다. 하류(downstream) 플랭킹 프라이머는 야생형 SPE-C에 대한 암호화 서열의 종결 코돈 하류의 DNA 영역에 대해 상동성이거나 이에 하이브리드화된다. 하류 플랭킹 프라이머가 전사 및 해독 종결 시그날을 제공하는 것이 바람직하다. 예를들면, 3' 플랭킹 프라이머는 SPE-C의 암호화 서열에 대한 종결 코돈 하류의 200개 염기쌍 영역에 하이브리드화되거나 이에 상동성일 수 있다. 상류 및 하류 플랭킹 프라이머는 매회 PCR 반응에 존재하여 생성된 PCR 생성물이 speC 프로모터 및 상류 조절 영역 및 전사 및 해독 종결 시그날을 포함하도록한다. 다른 상류 및 하류 프라이머는 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 작제될 수 있다. 천연 speC 프로모터 및 상류 조절 영역이 PCR 생성물중에 포함되는 것이 바람직하지만, 절대적으로 필수적인 것은 아니다.
내부 프라이머는 야생형 SPE-C를 암호화하는 DNA 서열을 이용하여 특정 위치에서 변화가 생기도록 디자인할 수 있다. 특정 위치에서 특정 아미노산 치환을 암호화하도록 프라이머를 디자인할 수 있다. 문헌[Rennell et al., J. Mol. Biol. 22:67(1991)]에 기술된 바와 같이 특정 부위에서 랜덤한 치환이 생기도록 프라이머를 디자인할 수 있다. 특정 부위에서 아미노산이 결실되도록 프라이머를 디자인할 수 있다. 또한 특정 위치에서 추가의 아미노산에 대한 암호화 서열이 첨가되도록 프라이머를 디자인할 수 있다.
프라이머의 길이는 바람직하게는 약 15 내지 50개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 자동화된 합성법으로 프라이머를 제조하는 것이 바람직하다. 5' 및 3' 플랭킹 프라이머는 야생형 SPE-C 독소에 대한 암호화 서열을 암호화하는 플랭킹 DNA 서열에 하이브리드화시키는 것이 바람직하다. 이들 플랭킹 프라이머는 상기 플랭킹 DNA 서열과 100% 상동성이거나 상보적인 약 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 내부 프라이머는 이들이 상기 위치에서 변화를 암호화하기 때문에 당해 위치에서 아미노산을 암호화하는 DNA 서열에 대해 100% 상보적인 것은 아니다. 내부 프라이머는 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 프라이머내에서 약 1 내지 4개의 뉴클레오티드가 야생형 SPE-C 서열과 불일치(mismatch)될 수 있다. 또한 플랭킹 프라이머와 내부 프라이머는 둘다 바람직하게는 프라이머 말단 부근에 제한 부위 및 클램프 부위를 암호화하는 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하이브리드화 조건은 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 기술된 바와 같은 공지된 원리에 따라서 프라이머에 존재하는 불일치의 수를 고려하여 변형시킬 수 있다.
1개 이상의 부위에서의 변화가 요구되는 경우 1개 이상의 내부 프라이머를 이용할 수 있다. 1개 이상의 위치에서의 부위-특이적 변화를 발생시키기 위한 PCR 방법이 문헌[Aiyar et al.(상기 언급)]에 기술되어 있다. 다른 방법은 실시예 5에 기술되어 있다.
방법중 하나에서, 특정 부위에서 1개의 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열을 제조한 후 이를 주형으로 사용하여 제2 부위에서 변화를 갖는 돌연변이 DNA 서열을 제조한다. 1회전 PCR에서, 제1 내부 프라이머를 사용하여 제1 변화를 갖는 돌연변이 DNA 서열을 제조한다. 제1 변화를 갖는 돌연변이 DNA 서열을 주형 DNA로 사용하고, 상이한 부위에서의 변화를 암호화하는 제2 내부 프라이머를 사용하여 아미노산 서열중 2곳의 위치에서 변화를 갖는 돌연변이 독소를 암호화하는 DNA 서열을 형성시킨다. PCR 방법을 이용하여 약 2 내지 6개의 변화를 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 제조할 수 있다.
바람직한 PCR 방법은 위에서 언급된 문헌(Perrin et al.)에 기재된 바와 같다. 간략화하면, PCR 반응 조건은 다음과 같다: PCR은 10 mM Tris-HCl (pH=8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각 dNTP 200 μM, 주형 플라스미드 DNA 2 ng, 플랭킹 프라이머 100 피코몰, 내부 프라이머 5 피코몰, 및 Ampli Taq DNA 폴리머라제 (Perkin Elmer Cetus) 2.5 단위를 함유하는 반응 혼합물 100 ㎕에서 수행한다. 두번째 증폭 단계에서는, 반응 혼합물의 조성은 상기와 같지만 플랭킹 프라이머와 메가프라이머가 등 몰 농도 (각각 5 피코몰)이며 주형이 1 ㎍인 점이 상이하다. PCR은 94 ℃에서 1분간의 변성, 37℃ 또는 44℃에서 2분간의 아닐링(anealing) 및 72 ℃에서 3분간의 신장 사이클을 30회 동안 수행한다.
PCR 생성물을 단리한 다음 셔틀 벡터[예를 들어, 문헌(Murray et al, J. Immunology 152:87 (1994))에 기술된 바와 같으며 공급원(Dr. Schlievert. University of Minnesota. Mpls. MN.)으로부터 입수가능한 pMIN 164]내로 클로닝시킨다. 상기 벡터는 암피실린 내성을 갖는 대장균 플라스미드 pBR328와 에리트로마이신 내성을 부여하는 포도상구균 플라스미드 pE194의 키메라이다. 이러한 결합된 플라스미드 혼합물을 대장균내에서 공급원(Toxin Technologies, Boca Raton, Fla 또는 Dr. Schlievert)로부터 제공된 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체를 사용하여 독소 생산에 대해 선별한다. 돌연변이 SPE-C 독소를 문헌[Hsiao et al., Nucleic Acid Res. 19:2787 (1991)]의 방법으로 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재 및 다른 돌연변이의 부재를 확인한다.
유전 암호의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 수 많은 DNA 서열이 아미노산에서 동일한 변화를 암호화할 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 인지되어 있다. 본 발명은 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖지만 아미노산 서열에서 동일한 변화를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
특정 부위에서의 랜덤 돌연변이유발의 경우, 다른 19개의 아미노산 또는 비-천연 아미노산 또는 유사체 각각이 특정 부위에서 치환되도록 일련의 프라이머를 디자인한다. PCR을 상기한 바와 유사한 방법으로 또는 위에서 언급한 레넬 (Rennell) 등에 의해 기술된 방법으로 수행한다. PCR 생성물을 서브클로닝한 다음, 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체와의 면역반응성으로 독소 생산을 모니터할 수 있다. 아미노산 서열내 변화의 존재는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열의 서열분석에 의해 증명될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이 독소를 비치사성에 대해 선별하고 선택한다.
또한 다른 돌연변이유발 방법을 사용하여 야생형 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열에 랜덤 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 본문에서 사용되는 바와 같은 랜덤 돌연변이 또는 랜덤 돌연변이유발은 돌연변이가 선택된 부위에 있지 않고/않거나 선택된 변화가 아닌 것을 의미한다. 야생형 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 세균성 숙주 세포는 화학적 돌연변이유발 및 UV 조사와 같은 다른 표준 방법에 의해 돌연변이가 유발될 수 있다. 이러한 방법으로 발생된 돌연변이체는 야생형 SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체를 사용하여 독소 생산에 대해 선별할 수 있다. 그러나, 생물학적 활성이, 하나 이상 변화되고 바람직하게는 비치사성인 돌연변이체 독소를 확인하기 위해서는 추가의 선별이 필수적이다. 또한 자발적으로 발생되는 돌연변이체를 생물학적 활성에서의 하나 이상의 변화를 기준으로 야생형 SPE-C로부터 선별할 수 있다. 또한 랜덤 돌연변이유발을 문헌[Anthony-Cahill et al., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989)]에 기술된 바와 같은 시험관내 돌연변이유발을 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 화학적 합성법을 사용하여 돌연변이 SPE-C 독소를 형성시킬 수 있다. 단백질을 화학적으로 합성하는 방법이 문헌[Wallace, FASEB J. 7:505 (1993)]에 기술되어 있다. 단백질의 일부를 합성한 다음 효소 또는 직접적인 화학적 축합법을 이용하여 서로 연결시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들이 비-천연 아미노산을 목적하는 위치에 삽입시키기 위하여 화학적 합성법을 사용하는 것이 특히 유용하다. 또한, 돌연변이 SPE-C 독소의 단편을 제조할 경우 화학적 합성법이 특히 유용하다.
본원에 기술된 방법은 어느것이나 돌연변이 SPE-C 독소의 단편을 형성시키는데 있어서 유용하다. 또한, 제한 효소 분해법 및/또는 결합법을 사용하여 단편을 용이하게 제조할 수 있다. 단편의 바람직한 제조 방법은 20개 이하의 아미노산 단편의 경우 직접적인 화학적 합성법에 의하거나 더 큰 단편의 경우 유전자 클로닝에 의하는 것이다.
부위-특이적이거나 랜덤한 돌연변이 독소를 암호화하는 DNA 서열을, 야생형 SPE-C 독소와 생물학적 활성에 있어서 다른 변화에 대해 추가로 선별할 수 있다. 하나 이상의 생물학적 활성에서의 변화에 대한 선별법은 상기되어 있다. 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 선택된 DNA 서열을 일단 생물학적 활성에서의 하나 이상의 변화에 대해 선택한 다음, 이들을 이용하여 발현 카셋을 형성시킨다.
발현 카셋의 형성은, 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열을 숙주 세포내에서 돌연변이 SPE-C 독소의 발현을 제공하는 프로모터와 결합시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 PCR을 사용하여 생산된 돌연변이 SPE-C 독소의 경우, 천연 speC 프로모터가 존재하며 숙주 세포내에서의 발현을 제공한다.
임의로, DNA 서열을 상이한 프로모터와 결합시켜 특정 유형의 숙주 세포에서 발현을 제공하거나 숙주 세포에서의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 프로모터가 SPE-C에 대한 항체에 의해 검출될 수 있도록 돌연변이 SPE-C 독소의 발현 수준을 제공하는 것이 바람직하다. 원핵 세포에서 이용될 수 있는 다른 프로모터로는 PLAC, PTAC, T7 등이 있다.
일단, 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열을 발현 카셋을 형성시키기에 적합한 프로모터와 결합시킨 다음, 발현 카셋을 적합한 형질전환 벡터중으로 서브클로닝시킨다. 적합한 형질전환 벡터는 1개 이상의 선택성 마커 유전자를 포함하며 바람직하게는 증폭된 대장균 및 그램 포지티브 미생물일 수 있는 셔틀 벡터이다. 적합한 셔틀 벡터의 예로는 pMIN 164 및 pCE 104가 있다. 다른 타입의 벡터로는 바쿨로바이러스(baculorirus) 벡터, SV40, 백시니아(vaccinia)와 같은 폭스바이러스(poxvirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)와 같은 바이러스성 벡터가 있다. 바람직한 벡터는 대장균 및 황색포도상구균에서 증폭될 수 있는 셔틀 벡터인 pMIN 164 벡터이다.
돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 발현 카셋을 포함하는 형질전환 벡터를 일단 형성시킨 다음, 돌연변이 SPE-C 독소의 발현을 제공하는 적합한 숙주 세포중으로 도입시킨다. 적합한 숙주 세포는 돌연변이 독소를 높은 수준으로 발현시키면서 내독소 및 M-단백질과 같은 다른 바람직하지 못한 분자로 오염될 가능성을 최소화시키는 세포이다. 적합한 숙주 세포로는 포유동물 세포, 황색포도상구균, 대장균 및 살모넬라 종과 같은 세균 세포, 효모 세포 및 곤충 세포가 있다. 형질전환 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 원형질체 형질전환, 리포좀 매개된 형질전환, 인산칼슘 침전법 및 전기천공이 있다. 바람직한 방법은 원형질체 형질전환이다.
형질전환된 세포는 백신 조성물내에서 이용될 수 있는 다량의 돌연변이 SPE-C 독소를 생산하는데 유용하다. 형질전환된 미생물은 생백신, 약독화된 백신 또는 열-사멸된 백신에 이용될 수 있다. 형질전환된 미생물은 야생형 SPE-C에 대한 보호 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 돌연변이 독소 SPE-C를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이 SPE-C 독소가 분비된다. 미생물은 사람에게 비병원성인 것이 바람직하며 독성 형태로의 복귀가 최소화되도록 다중 아미노산 변화를 갖는 돌연변이 독소를 포함한다. 미생물은 공지된 원리에 따라서 생백신 또는 열-사멸된 백신으로 투여한다. 생백신용으로 바람직한 미생물은 살모넬라 종과 같은 형질전환된 세포이다.
숙주 세포에서 작용성인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 돌연변이 SPE-C 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 발현 카셋을 포함하는 바이러스성 벡터를 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 백신 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터가 포유동물 세포내에서 작용성이다. 적합한 바이러스성 벡터의 예로는 백시니아 바이러스와 같은 폭스 바이러스, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스 등이 있다. 백시니아 바이러스 벡터를 사용하여 야생형 SPE-C 독소의 하나 이상의 생물학적 활성에 대해 사람을 면역화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서 작용성인 프로모터에 작동가능한게 연결되어 있는 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 프로모터는 포유동물 숙주 세포에서 작용성인 것이 바람직하다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 개체 자신의 세포내에서 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 발현시키기 위하여 백신 조성물을 숙주 세포 또는 개체로 운반한다. 개체중에서 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편의 핵산 서열을 발현시키면 야생형 SPE-C 독소에 대한 보호 면역 반응이 제공된다. 임의로, 발현 카셋을 벡터중으로 삽입시킬 수 있다. 핵산 분자는 직접적으로 또는 바이러스성 벡터로 투여할 수 있다. 백신 조성물은 또한 임의로 백신을 세포내로 운반하는 리포좀 등과 같은 운반제를 포함할 수 있다. 백신 조성물은 또한 임의로 애쥬번트 또는 다른 면역조절 화합물, 및 핵산이 세포내로 들어가는 것을 향상시키는 추가의 화합물을 포함할 수 있다. 백신 조성물은 정맥내, 복강내 투여, 또는 점막 표면과의 접촉과 같은 비경구적 경로를 포함한 여러가지 경로로 투여할 수 있다.
돌연변이 SPE-C 독소의 대규모 성장 및 생산용 조건은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 미생물원으로부터 돌연변이 SPE-C 독소의 정제 방법은 다음과 같다. pMIN164내의 돌연변이 또는 야생형 speC를 포함하는 황색포도상구균을 통기시키면서 37 ℃에서 정지상이 될 때까지, 에리트로마이신 5 ㎍/㎖를 함유하는 투석가능한 육즙 배지 (beef heart medium)중에서 성장시킨다. 배양물을 4배 용적의 에탄올로 침전시키고 발열물질-비함유 물중에 단백질을 재용해시킨다. 조 제제를 3.5 내지 10 및 4 내지 6의 pH 구배에서 연속적인 평판 등전점 포커싱 (flat bed isoelectric focusing) 분리시킨다. 항체 반응성에 의해 독소에 대해 포지티브한 분획을 발열물질-비함유 물에 대해 철저히 투석시키고 각각의 분취량을 15% (중량/용적) 겔중에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 순도에 대해 시험한다. SPE-C에 대한 폴리클로날 중화 항체는 공급원(Toxin Technologies, Boca Raton, Fla 또는 Dr. Schlievert)로부터 입수가능하다. 컬럼 크로마토그라피 또는 HPLC를 포함한 다른 정제 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 더욱 용이하게 이해될 것이며, 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 대표하는 것이지만 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1
SPE-C 야생형의 클로닝 및 발현
대장균중에서 speC의 클로닝 및 발현:
유전자 단리를 위한 독소 검출의 필요성을 방지하기 위하여, SPE-C 유전자에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드를 합성하여 이를 사용하여 연쇄상구균의 게놈 라이브러리를 선별한다. 균주 T18P로부터의 정제된 연쇄상구균 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Sau 3A로 부분적으로 분해시키고 0.7% 아가로스 겔상에서 분리시킨다. 4 내지 8 kb 범위의 단편을 겔로부터 용출시키고, BAM H1으로 선형화하고 탈인산화하여 자가-결합을 방지시킨 벡터 플라스미드 pBR328에 결합시킨다. 이후 결합된 DNA를 사용하여 암피실린 내성에 대해 수용능(competent) 대장균 RR1을 형질전환시킨다. 형질전환체를 암피실린을 함유하는 LB 아가상에 피복시킨 니트로셀룰로오스 필터상에서 성장시킨다. 레플리카 필터를 제조하고, 대략 1500개의 재조합 콜로니를 방사선표지된 합성 올리고뉴클레오티드로의 콜로니 하이브리드화에 의해 speC 유전자의 존재에 대해 선별한다. 2계열의 혼합된 서열 올리고뉴클레오티드가 헥사펩타이드 서열, Asp-Ser-Lys-Lys-Asp-Ile로부터 유도되는데, 이 서열은 성숙한 SPE-C 단백질의 아미노 종결부의 처음 6개의 아미노산에 대응한다 (도 1). 올리고뉴크레오티드를 2개 계열으로 나눠 프로브의 중복을 조절하고 이에 의해 비특이적 하이브리드화를 최소화한다. 2개의 콜로니가 올리고뉴클레오티드 A계열과 하이브리드화되는 것으로 밝혀졌다. B계열에 하이브리드화되는 콜로니는 발견되지 않았다. 오크터로니(Ouchterlony) 면역확산법으로 SPE-C 항혈청을 사용한 침전에 의해 SPE-C 발현에 대해 상기 하이브리드화 클론을 검정한다. 선택된 클론중 하나로부터의 용해물은 정제된 SPE-C와 동일한 침전 라인을 형성한다. speC를 함유하는 재조합 플라스미드를 pUMN 501로 명명한다. RR1pUMN 501로부터의 배양물 상등액은 검출가능한 양의 SPE-C를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌는데, 이는 대장균이 독소를 분비할 수 없음을 제시하는 것이다.
서브클로닝:
pUMN 501내의 삽입물은 대략 4.0 kb이며 Sau 3A 부위로 경계를 이룬다 (도 2). XbaI로 분해시키면 2.4 및 1.6 kb 단편이 수득되는데, 이들중 어느것도 pUC13에 결합시켜 대장균 JM101중으로 형질전환시킬 경우 (각각, pUMN 512 및 pUMN 511) speC 발현을 유도하지 않는다. 더 큰 Sau 3A-Sal I 단편 (3.3 kb)은 대장균 JM101에서 speC를 발현시킨다 (pUMN 513). 상기 유전자는 플라스미드 프로모터에 대해 어느 방향으로도 발현되는데, 이는 천연 연쇄상구균 프로모터가 삽입물내에 존재하며 대장균에서 작용성임을 제시하는 것이다. 3.3 kb의 Sau 3A-Sal I 단편을 M13 박테리오파아지중으로 클로닝시키고 문헌[Dale et al. Plasmid 13:31-40 (1985)]의 공정을 이용하여 speC 유전자를 추가 편재시켜 결실 서브클론을 제조한다. M13 서브클론으로부터 단리되고 pUC13에 결합시킨 1.7 kb의 단편(pUMN 521)은 대장균에서 speC를 발현시킬 수 있다.
실시예 2
대장균-유래된 SPE-C의 생화학적 특징
UMN 501에 의해 암호화되는 SPE-C를 에탄올 침전법에 이어 3.5 내지 10의 pH 구배에서의 예비 등전점 포커싱에 의해 대장균 RR1의 추출물로부터 부분적으로 정제한다. 대장균-유래된 독소는 연쇄상구균-유래 독소와 대략 동일한 위치 (6.5 및 7.2)로 이동한다. 대장균 및 연쇄상구균-유래 SPE-C는 SDS-PAGE에서 동일한 분자량 24000을 갖는다. 추가의 단백질이 상기 대장균 제제중에 존재하지만, 24000 mw 단백질만이 SPE-C 특이성 항혈청을 사용한 면역블롯 기술에 의한 시험시 반응한다.
실시예 3
대장균-유래된 SPE-C의 생물학적 특징
대장균 및 연쇄상구균-유래된 SPE-C를 임파구 유사분열유발성에 대해 비교한다. 토끼 비세포 (2x105 세포)를 화농성연쇄상구균(S. pyogenes) 또는 대장균(pUMN 501)으로부터의 SPE-C 약 0.01㎍에 노출시킨다. 3일후, 배양물을 1μCi [3H]-티미딘으로 펄스시켜 24시간 동안 배양하고, 이후 세포내 DNA중으로 혼입된 방사선표지물을 정량한다. 독소 제제 둘 모두 유사한 유사분열유발성 반응을 유도한다. SPE-C 항혈청과 배양하면, 클로닝된 독소 및 연쇄상구균-유래된 독소 둘 모두의 유사분열유발성 반응이 현저히 감소된다.
연쇄상구균 및 대장균-유래된 SPE-C를 또한 토끼에서 발열성 및 치사성 내독소 쇼크의 증가에 대해 비교하였다. 연쇄상구균 및 대장균-유래된 SPE-C는 대등하게 발열성이었으며; 두 제제의 경우 4시간 후 온도가 평균 1.0 ℃ 상승하였다. 열반응은 내독소의 특징인 이상(biphasic)이기 보다는 단상(monophasic)이었다. 이는 열이 내독소 오염으로 인한 것이 아니라 SPE-C로 인한 것임을 제시하는 것이다. 대장균 및 연쇄상구균-유래 SPE-C 처리된 동물은 모두 내독소 쇼크에 대한 감수성이 증가된 것으로 나타났다. PBS와 내독소만을 투여받은 대조군 토끼는 모두 생존하였다.
이들 연구로 SPE-C가 대장균내에서 생물학적 활성 형으로 발현되며, SPE-C로 인한 활성은 함께 정제된 연쇄상구균 오염물질로 인한 것이 아니라는 것이 확인되었다.
실시예 4
재조합적으로 제조된 SPE-C (wt)의 토끼의 투여 및 면역화
재조합적으로 제조된 SPE-C를 토끼에게 7일간에 걸쳐 200 ㎍/0.2 ㎖의 총 투여량을 투여한다. 결과는 SPE-C로 처리된 동물이 STSS 기준을 나타내어, 거의 모든 동물이 7일 경과시 사망하였다(데이타는 나타나있지 않음). 토끼에서 STSS의 증상으로는 체중 감소, 설사, 반상 안면(mottled fale), 열, 적색 결막 및 점막, 및 맑은 갈색뇨가 있다. 예측된 바와 같이, 대조군 비-독소 처리된 동물은 건강하게 살아 남았다. 두가지 주요 다른점이 관찰되었다: 1) 예측되는 바와 같이 유액 대체가 동물에게 완전한 보호를 제공하며, 2) 독소 처리된 동물중 어느것에서도 괴사성 근염 및 근막염이 발생되지 않았는데, 이는 SPE-C 이외의 다른 인자 또는 SPE-C에 부가한 다른 인자가 연조직 손상에 요구됨을 나타내는 것이다. STSS의 임상적 양태의 발생은 SPE-C의 투여와 상관있다.
실시예 5
PCR을 사용한 SPE-C의 이중 또는 삼중 돌연변이체의 제조
이중 또는 삼중 돌연변이 SPE-C 독소 또는 이의 단편을 제조하는데 사용되는 수 많은 방법이 있다.
아미노산 서열에 있어서 2개 이상의 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C 독소는 상기한 바와 같은 PCR을 사용하여 제조한다. 제1 PCR 반응에서, 선택된 부위에서의 제1 변화를 암호화하는 제1 내부 프라이머를 5' 및 3' 플랭킹 프라이머와 결합하여 제1 PCR 생성물을 형성시킨다. 제1 PCR 생성물은 아미노산 서열에 있어서 1개의 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C를 암호화하는 DNA 서열이다. 이어서 이러한 제1 PCR 생성물을 주형 DNA로 사용하여, 야생형 SPE-C 활성을 갖는 단백질과 비교하여 아미노산 서열에 있어서 2개의 변화를 갖는 제2 PCR 생성물을 제조한다. 제1 PCR 생성물은 제2 부위에서의 아미노산의 변화를 암호화하는 제2 내부 프라이머와 결합된 주형 DNA이다. 제2 내부 프라이머를 또한 5' 및 3' 플랭킹 프라이머와 결합하여 제2 PCR 생성물을 형성시킨다. 제2 PCR 생성물은 아미노산 서열에 있어서 2개 부위에서 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열이다. 이러한 제2 PCR 생성물을 제3의 반응에서 주형으로 사용하여 아미노산 서열의 3개의 부위에서 변화를 갖는 돌연변이 SPE-C 독소를 암호화하는 DNA 서열 생성물을 형성시킨다. 이러한 방법을 이용하여 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 변화를 갖는 돌연변이 독소를 암호화하는 DNA 서열을 제조한다.
1개 이상의 변화를 암호화하는 DNA 서열을 제조하기 위한 또 다른 방법은 아미노산 서열에 있어서 변화(들)을 암호화하는 DNA 서열의 단편을 자동화된 합성법에 의해 제조하는 것이다. 이후 이러한 단편을 수개의 독특한 제한 부위를 사용하여 야생형 SPE-C 암호화 서열중으로 서브클로닝시킨다. 제한 부위는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 야생형 SPE-C 독소의 DNA 서열로부터 용이하게 결정된다. 문헌[Revi et al. Nucleic Acid Res. 16:1030 (1988)]에 기재된 바와 같은 3개 단편 결합법으로 클로닝을 단일 단계로 수행한다.
실시예 6
SPE-C의 단일 및 이중 돌연변이체의 평가
SPE-C의 단일 아미노산 돌연변이체 3개를 제조한다: a) 15번 위치에서 티로신이 알라닌으로 변화된 Y15A, b) 17번 위치에서 티로신이 알라닌으로 변화된 Y17A, c) 38번 위치에서 아스파라긴이 알라닌으로 변화된 N38A. SPE-C의 이중 아미노산 돌연변이체 2개를 제조한다: a) Y15A/N38A, b) Y17A/N38A. 돌연변이체는 모두 퀴크 변화법(Quik Change method; Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 주형으로서 플라스미드 pUMN521을 함유하는 speC로 작제하였다. pUMN521은 pUC13 (Goshom et al)중에 SPE C 유전자(speC)를 함유한다.
단일 아미노산 돌연변이 단백질을 대장균 내에서 100㎖ 배양물로 생산한다. 암피실린 50 ㎍/㎖의 존재하에서 중식한 후, 대장균 배양물을 -20 ℃ 에탄올 400 ㎖로 처리하여 세포를 용해시키고 SPE C 돌연변이 단백질을 침전시킨다. 대장균내의 pUMN521을 포지티브 대조군으로 사용하기 위하여 비교가능하게 처리한다. 침전물을 수거하여 1 ㎖로 만든다. 독소 농도는 25 ㎍/㎖인 것으로 평가되었다.
pUMN521로부터의 야생형 SPE C 및 3개의 단일 아미노산 돌연변이체를 0.25 내지 2.5x10-5 또는 2.5x10-6의 독소 투여량 범위에 걸쳐서 토끼 비세포 증식을 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, Y15A 및 N38A 돌연변이체는 야생형의 유사분열유발성의 대략 1/2이었다. Y17A 돌연변이체는 본질적으로 유사분열을 유발하지 않았다(도 8).
이중 돌연변이체 Y15A/N38A 및 Y17A/N38A를 또한 야생형 독소와 비교하여 토끼 비세포를 자극하는 능력에 대해 시험하였다(도 9). 상기 돌연변이체 둘 모두는 필적한 양의 야생형 독소에 의해 관찰된 것의 1/4 토끼 비세포만을 자극하였다.
이중 돌연변이체 둘다 내독소 쇼크를 향상시키는 능력에 대해 시험하였다. 3마리 토끼/그룹에게 돌연변이체 또는 야생형 독소 5 ㎍/㎏을 정맥내로 챌린지(challenge)하였다. 4시간후, 동일한 동물에게 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 내독소 10 ㎍/㎏ (1/50 LD50)을 챌린지하였다. 48시간에 걸쳐 사망을 기록하였다 (표 4). 나타낸 바와 같이, 이중 돌연변이체중 어느것도 토끼에서 사망을 일으키지 않았다.
| 처리 단백질 | 사망수/시험된 토끼 총수 |
| SPE C 야생형 | 3/3 |
| Y15A/N38A | 0/3 |
| Y17A/N38A | 0/3 |
각주: 표 4에 보고된 연구에 있어서, 모든 토끼에 5 ㎍/㎏ 단백질을 정맥내로 챌린지한 다음 4시간 경과후 내독소 (10 ㎍/㎏)를 정맥내 챌린지하였다.
표 4에서 사용된 토끼의 챌린지 1주 경과후, 동물을 마취시켜 전체적인 조직 손상에 대해 조사하였다. 간, 비장, 신장, 폐 및 심장을 포함한 모든 기관이 정상인 것으로 나타났다. 이는 이중 돌연변이체의 독성 결여와 일치하는 것이다.
3마리 토끼/그룹을 또한 프로인트(Freund) 불완전 애쥬번트중에 유화시킨 SPE C 이중 돌연변이체 25 ㎍을 2주 마다 투여하여 면역시킨다. 이후 동물을 5일간 방치 한다. 혈액 0.5㎖를 각 동물로부터 수거하여 Y15A/N38A 및 Y17A/N38A 혈청 수집용으로 수거한다. 이들 수거물로부터의 혈청을, 정제된 연쇄상구균 유래된 야생형 SPE A에 대한 항체에 대해 퍼옥시다제계 ELISA (Hudson and Hay 참고문헌)를 사용하여 수거된 면역전 혈청과 비교한다. 표 5에 ELISA 결과를 요약하였다.
| 시험된 샘플 | ELISA 역가 | |
| Y15A/N38A | 면역전 | <10* |
| 면역 | 80 | |
| Y17A/N38A | 면역전 | <10 |
| 면역 | 80 |
*항체에 대해 시험될 혈청을 1:10에서 시작하여 2배 희석시켰다. 항체의 역가는 490㎚에서의 흡광도 0.1 이상을 제공하는 최종 희석액의 역수이다.
이후 면역화시킨 동물에게 야생형 SPE C 5 ㎍/㎏을 챌린지한 다음, 4시간후 치사성에 대한 면역화능에 대한 시험으로서 살모넬라 티피뮤리움 내독소 10 ㎍/㎏을 챌린지하였다. 표 6은 동물이 챌린지로부터 보호되므로, SPE C에 대해 면역되었음을 나타낸다.
| 토끼 그룹 | 사망수/시험된 총수 |
| 비면역 | 2/2 |
| Y15A/N38A | 0/3 |
| Y17A/N38A | 0/3 |
SPE C의 추가의 단일 아미노산 변이체를 또한 제조하였다. 이들은 독성에 필요할 수 있는 3개의 주요한 도메인중의 잔기를 포함한다. 이들은 T 세포 수용체 결합 도메인, II형 MHC 결합 도메인, 및 중앙 대각선의 알파 나선의 배면을 따라있는 잔기를 포함한다. 변화된 잔기와 T 세포 유사분열유발성에 대한 돌연변이의 효과가 표 7에 열거되어 있다.
| 돌연변이체 | 생물학적 활성 | |
| 유사분열유발성a | 치사성b | |
| D12A | 시험하지 않았음 | 0/2 |
| H35A | 야생형의 100% | 시험하지 않았음 |
| N38D | 시험하지 않았음 | 0/2 |
| K135D | 야생형의 50% | 시험하지 않았음 |
| K138D | 야생형의 62% | 시험하지 않았음 |
| Y139A | 야생형의 54% | 시험하지 않았음 |
| D142N | 야생형의 52% | 시험하지 않았음 |
a 0.1 ㎍/웰 투여량에서의 비교
b 사망한 토끼의 수/내독소에 대한 감응성 향상으로 인해 주사된 전체수; 야생형 SPE-C를 투여한 동물 2/2가 사망하였다.
본 발명은 다양한 특이적이고 바람직한 양태 및 기술에 관하여 기술되었다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범주내에서 유지되면서 수많은 변화 및 개량이 이루어질 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서에서의 모든 공보 및 특허원은 본 발명이 속한 기술 분야에 있어서 통상의 기술 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허원은 각각의 공보 또는 특허원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 표시되는 바와 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로 인용된다.
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> single, linear, Genomic DNA
<220>
<221> CDS
<222> (154)..(858)
<400> 1
caaccttgac tatttaaatg gaactgccac tcctaaaaac taaaatataa atacatttat 60
aaaatttcta aataaacaga aatctgattt ttaactactt actgctattt catgtattct 120
cgtacgagta atacatttaa ttaaggagaa aaa atg aaa aag att aac 168
Met Lys Lys Ile Asn
1 5
atc atc aaa ata gtt ttc ata att aca gtc ata ctg att tct act tat 216
Ile Ile Lys Ile Val Phe Ile Ile Thr Val Ile Leu Ile Ser Thr Tyr
10 15 20
ttc acc tat cat caa agt gac tct aag aaa gac att tcg aat gtt aaa 264
Phe Thr Tyr His Gln Ser Asp Ser Lys Lys Asp Ile Ser Asn Val Lys
25 30 35
agt gat tta ctt tat gca tac act ata act cct tat gat tat aaa gat 312
Ser Asp Leu Leu Tyr Ala Tyr Thr Ile Thr Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp
40 45 50
tgc agg gta aat ttt tca acg aca cac aca tta aac att gat act caa 360
Cys Arg Val Asn Phe Ser Thr Thr His Thr Leu Asn Ile Asp Thr Gln
55 60 65
aaa tat aga ggg aaa gac tat tat att agt tcc gaa atg tct tat gag 408
Lys Tyr Arg Gly Lys Asp Tyr Tyr Ile Ser Ser Glu Met Ser Tyr Glu
70 75 80 85
gcc tct caa aaa ttt aaa cga gat gat cat gta gat gtt ttt gga tta 456
Ala Ser Gln Lys Phe Lys Arg Asp Asp His Val Asp Val Phe Gly Leu
90 95 100
ttt tat att ctt aat tct cac acc ggt gag tac atc tat gga gga att 504
Phe Tyr Ile Leu Asn Ser His Thr Gly Glu Tyr Ile Tyr Gly Gly Ile
105 110 115
acg cct gct caa aat aat aaa gta aat cat aaa tta ttg gga aat cta 552
Thr Pro Ala Gln Asn Asn Lys Val Asn His Lys Leu Leu Gly Asn Leu
120 125 130
ttt att tcg gga gaa tct caa cag aac tta aat aac aag att att cta 600
Phe Ile Ser Gly Glu Ser Gln Gln Asn Leu Asn Asn Lys Ile Ile Leu
135 140 145
gaa aag gat atc gta act ttc cag gaa att gac ttt aaa atc aga aaa 648
Glu Lys Asp Ile Val Thr Phe Gln Glu Ile Asp Phe Lys Ile Arg Lys
150 155 160 165
tac ctt atg gat aat tat aaa att tat gac gct act tct cct tat gta 696
Tyr Leu Met Asp Asn Tyr Lys Ile Tyr Asp Ala Thr Ser Pro Tyr Val
170 175 180
agc ggc aga atc gaa att ggc aca aaa gat ggg aaa cat gag caa ata 744
Ser Gly Arg Ile Glu Ile Gly Thr Lys Asp Gly Lys His Glu Gln Ile
185 190 195
gac tta ttt gac tca cca aat gaa ggg act aga tca gat att ttt gca 792
Asp Leu Phe Asp Ser Pro Asn Glu Gly Thr Arg Ser Asp Ile Phe Ala
200 205 210
aaa tat aaa gat aat aga att atc aat atg aag aac ttt agt cat ttc 840
Lys Tyr Lys Asp Asn Arg Ile Ile Asn Met Lys Asn Phe Ser His Phe
215 220 225
gat att tat ctt gaa aaa ta attcatcata cacaaaaaac cgcccagaat 890
Asp Ile Tyr Leu Glu Lys
230 235
aatctgagcg gttttgtctt atctcggagc tttacctcct aattta 936
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> single, linear, internal
<400> 2
Met Lys Lys Ile Asn Ile Ile Lys Ile Val Phe Ile Ile Thr Val Ile
1 5 10 15
Leu Ile Ser Thr Tyr Phe Thr Tyr His Gln Ser Asp Ser Lys Lys Asp
20 25 30
Ile Ser Asn Val Lys Ser Asp Leu Leu Tyr Ala Tyr Thr Ile Thr Pro
35 40 45
Tyr Asp Tyr Lys Asp Cys Arg Val Asn Phe Ser Thr Thr His Thr Leu
50 55 60
Asn Ile Asp Thr Gln Lys Tyr Arg Gly Lys Asp Tyr Tyr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Glu Met Ser Tyr Glu Ala Ser Gln Lys Phe Lys Arg Asp Asp His Val
85 90 95
Asp Val Phe Gly Leu Phe Tyr Ile Leu Asn Ser His Thr Gly Glu Tyr
100 105 110
Ile Tyr Gly Gly Ile Thr Pro Ala Gln Asn Asn Lys Val Asn His Lys
115 120 125
Leu Leu Gly Asn Leu Phe Ile Ser Gly Glu Ser Gln Gln Asn Leu Asn
130 135 140
Asn Lys Ile Ile Leu Glu Lys Asp Ile Val Thr Phe Gln Glu Ile Asp
145 150 155 160
Phe Lys Ile Arg Lys Tyr Leu Met Asp Asn Tyr Lys Ile Tyr Asp Ala
165 170 175
Thr Ser Pro Tyr Val Ser Gly Arg Ile Glu Ile Gly Thr Lys Asp Gly
180 185 190
Lys His Glu Gln Ile Asp Leu Phe Asp Ser Pro Asn Glu Gly Thr Arg
195 200 205
Ser Asp Ile Phe Ala Lys Tyr Lys Asp Asn Arg Ile Ile Asn Met Lys
210 215 220
Asn Phe Ser His Phe Asp Ile Tyr Leu Glu Lys
225 230 235
Claims (16)
- 아스파르트산-12의 알라닌으로의 치환; 티로신-15의 알라닌으로의 치환; 티로신-17의 알라닌으로의 치환; 히스티딘-35의 알라닌으로의 치환; 아스파라긴-38의 아스파르트산으로의 치환; 리신-135의 아스파르트산으로의 치환; 리신-138의 아스파르트산으로의 치환; 티로신-139의 알라닌으로의 치환; 및 아스파르트산-142의 아스파라긴으로의 치환(여기서, 아미노산의 번호표시는 도 1의 서열에서 28번 위치의 아스파르테이트를 제1 아미노산으로 환산한 서열을 기준으로 한다)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 삭제
- 제1항에 있어서, 티로신-15 및 아스파라긴-38이 치환된 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 삭제
- 제1항에 있어서, 티로신-17 및 아스파라긴-38이 치환된 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 삭제
- 제1항, 제3항 및 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 독소가 비-치사성인 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 제1항, 제3항 및 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 독소가 비-치사성 및 항원성인 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 제1항, 제3항 및 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 독소가 비-치사성이지만 야생형 SPE-C 독소의 유사분열유발성과 동일하거나 이보다 약한 유사분열유발성을 유지하는 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 제1항, 제3항 및 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 독소가 내독소 쇼크를 증가시키지 않는 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C).
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 돌연변이 연쇄상구균 발열성 외독소 C형(SPE-C)을 암호화하는 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드.
- 제13항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 안정적으로 형질전환된 숙주 세포.
- 삭제
- 삭제
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