JP2002513278A

JP2002513278A - 変異体レンサ球菌毒素ｃおよび使用法

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Publication number: JP2002513278A
Application number: JP52576698A
Authority: JP
Inventors: シュリーバート，パトリック・エム; オーレンドーフ，ダグラス; ミッチェル，デイビッド・ティ; ガー，パメラ・ジェイ
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2002-05-08
Also published as: AU7625698A; BR9713679A; DE69735439D1; PT946730E; ATE319830T1; DK0946730T3; WO1998024910A2; KR100615836B1; US6835818B2; CA2273824A1; EP0946730B1; CA2273824C; AU734597B2; WO1998024910A3; ES2260804T3; US20020039585A1; CN1240001A; KR20000069337A; EP0946730A2; DE69735439T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、ワクチン、医薬組成物、およびワクチンまたは医薬組成物の使用法を含む。好ましい変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、少なくとも１個のアミノ酸の変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に比較すると実質的に非致死性である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の生物活性に対して動物を保護するのに有用なワクチン組成物を形成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】変異体レンサ球菌毒素Ｃおよび使用法発明の背景化膿レンサ球菌は、β溶血菌Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）ともいわれ、咽頭炎や膿痂疹などの緩和な感染を起こすヒトの病原菌である。感染後自己免疫合併症、例えばリウマチ熱や急性糸球体腎炎が生じることがある。ＧＡＳはまた、しょう紅熱やレンサ球菌毒性ショック症候（ＳＴＳＳ）などの重い急性疾患を起こす。重篤のＧＡＳ感染症は、今世紀の初め米国および諸外国で大きい問題であった。４０年代の中頃に本症の数および重篤度が顕著に低下したが、その原因については完全にわかっていない。しかし最近、ＧＡＳによる重い疾患の復活がみられ、米国では毎年１−２万のＳＴＳＳが生じている。これらの患者の５０−６０％は壊死性の筋膜炎および筋炎である。３０−６０％が死亡し、生存者の半分が手足に外科手術を受ける。１９８６年および１９８７年に、ロッキー山脈地帯での重いＧＡＳ感染の発生が報告されている。その後数年間に同様の臨床症状を示す疾患についていくつかの報告がある。この疾患について記載された症候は毒性ショック症候（ＴＳＳ）と非常に似ている。１９９２年に関係委員会がこの臨床症状にＳＴＳＳと正式に名づけ、その診断基準を設定した。ＳＴＳＳは下記の存在により定義される：１．低血圧およびショック２．Ａ群レンサ球菌の単離３．２以上の次の症状：３８.５℃以上の発熱、しょう紅熱発疹、嘔吐および下痢、肝臓および腎臓の機能障害、成人性呼吸困難症、びまん性脈管内凝固、壊死性の筋膜炎および／または筋炎、菌血症。ＳＴＳＳ患者から単離されたレンサ球菌はＭ１型とＭ３型が多く、残りはＭ１８型と不定型である。ＳＴＳＳのＭ１、３、１８および不定型の大部分が病原性外毒素Ａ（約７５％）をつくり、単離体の残りは病原性外毒素Ｃ（ＳＰＥ−Ｃ）である。さらに、ＳＰＥ−Ｃをウサギに投与、また誤ってヒトに接種したところ、ＳＴＳＳの症候が生じた。ＳＴＳＳに関連のＳＰＥ−Ｃの研究において、リウマチ熱および滴状乾癬からレンサ球菌Ａ群が単離されている。ＳＰＥ−Ｃは分子量が２４,０００ダルトンの単一のペプチドである。ＳＰＥ −Ｃの遺伝子、speＣは単離されて、大腸菌で発現されている。ＳＰＥ−Ｃはレンサ球菌およびブドウ球菌が生産する外毒素の大きいファミリー１員であって、発熱をもたらし、内毒素に対する宿主の感受性を１０万倍高める能力からして病原性毒素とされている。最近、これらの毒素は、その抗原特異性にもかかわらず、Ｔリンパ球の広範な増殖を起こすこと、およびＴ細胞受容体のβ鎖可変部の組成に依存的であることから、スーパー抗原とされている。これらの毒素はまた、ＩＮＦ-γ、ＩＬ-１、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-βの広範な放出を促進する。このファミリーの他のものは、化膿レンサ球菌内毒素ＡおよびＢ型、レンサ球菌毒性ショック症候毒素１、レンサ球菌腸毒素Ａ、Ｂ、Ｃｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈおよび化膿レンサ球菌外毒素Ａ非群である。これらの毒素は、類似の生物的性質や活性、様々な程度の配列同一性を有する。ＳＴＳＳの最も重篤な症状は、低血圧とショックであり、死につながる。脈管内から間質性部への液体の漏出が低血圧の最終的な原因であると一般に考えられており、上記のウサギのＳＴＳＳショックが液体置換療法で防止できることから支持される。ＳＰＥ−Ｃが種々の状態で宿主に作用してこの病因を起こすのではないかと思われている。肝のクッパー細胞の活性を弱めることにより、内因性菌相源の内毒素が肝で浄化されるのをＳＰＥ−Ｃが阻害することが知られている。これは循環する内毒素の顕著な増加を起こすようであり、リポポリサッカライド結合タンパク質（ＬＢＰ）との結合およびＣＤ１４の情報伝達によりマクロファージを活性化しＴＮＦ −αなどのサイトカインの放出をもたらす。疾患における内毒素の役割は、ＳＰＥ−Ｃの致死作用がポリミキシンＢの動物への投与または病原体のないウサギの使用により少なくとも部分的に中和されることで支持される。ショック誘発の別の道程は、毛管内皮細胞の対する毒素の直接的活性であろう。この仮定は、化膿レンサ球菌毒素ＴＳＳＴ-１がヒト臍帯静脈細胞に直接結合し、単離ブタ内皮細胞に細胞毒性的であることから導き出される。毒素作用の他の様相はそのスーパー抗原性であり、毒素が宿主のＴリンパ球と相互作用して、それを５０％以上活性化する。この広範なＴ細胞刺激は循環サイトカイン、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−１の異常な上昇をもたらす。このサイトカインはマクロファージに直接作用してＴＮＦ-αおよびＩＬ-１の放出を促す。これらのサイトカインはまた、Ｔ細胞の不存在でＭＨＣクラスII結合および情報伝達を介してＳＰＥ−Ｃによりマクロファージから直接的に誘発され得る。ＴＮＦ -αおよび-βのレベル上昇は、内皮細胞および毛管漏出に損害となるグラムネガティブ誘発ショックに典型的にみられるいくつかの作用を起こす。しかし、ＳＰＥ−Ａ処置ウサギへのシクロスポリンの投与は、ＩＬ-２およびＴ細胞増殖の過調節を阻害し、ショックから動物を保護しなかった。このことは毛管漏出の原因について他のメカニズムが重要であるかも知れないことを示唆している。このように、種々の生物活性を担うＳＰＥ−Ｃ分子上の部位を決定する必要がある。毒性や分裂原性などの生物活性に変化を有するＳＰＥ−Ｃの変種をつくる必要がある。レンサ球菌毒性ショック症候を防止または軽減するためのワクチンに有用な組成物を開発する必要がある。さらに、レンサ球菌毒性ショック症候および他の疾患の処置に有用な治療薬を開発する必要がある。発明の概要本発明は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、ワクチン、医薬組成物、およびワクチンまたは医薬組成物の使用法を含む。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、少なくとも１個のアミノ酸の変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質に比較すると実質的に非致死性である。ワクチン組成物について、変異体毒素は野生型ＳＰＥ−Ｃの少なくとも１つの生物活性に対する保護免疫応答も刺激する。ワクチン組成物の変異体毒素は、野生型ＳＰＥ−Ｃに比べると、内毒素ショックの高まりの低下やＴ細胞の分裂原性の低下を有するように、任意にさらに選択される。医薬組成物については、変異体毒素が野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に匹敵する分裂原性を保持して実質的に非致死性であることが好ましい。本発明はまた、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片およびＳＰＥ−Ｃ毒素の変異体を含む。野生型ＳＰＥ−Ｃから誘導される断片およびペプチドは変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素である。断片は、一緒にされた分子の異なるドメインあるいは領域を含むことができる。断片は野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に比較すると実質的に非致死的である。変異体毒素について断片は野生型ＳＰＥ−Ｃのアミノ酸配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸変化を有する。断片はワクチンおよび医薬組成物にも有用である。本発明はまた、発現カセット、ベクター、形質転換細胞を含む。ＤＮＡカセットは、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片をコードするＤＮＡ配列であって、これは宿主細胞の機能的プロモーターに操作可能的に結合している。ＤＮＡカセットは好ましくはベクターに挿入される。ベクターはプラスミドおよびウイルスを含む。ベクターは、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡをつくるための鋳型ＤＮＡを提供するのに、有用である。ＤＮＡカセットおよびベクターはワクチン組成物にも有用である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素あるいはその断片をコードする核酸は、哺乳類の細胞における発現のために直接運搬されることがある。プロモーターは、好ましくは哺乳類細胞での機能的プロモーターである。細胞に直接運ばれた核酸は個体の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素を発現することができ、保護免疫応答が野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して生じる。他のワクチン組成物には、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片をコードする発現カセットを含有する安定な形質転換細胞またはウイルスベクターが含まれる。痘疹などのウイルスベクターはヒトを免疫するのに用いることができ、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも１つの生物活性に対する保護免疫応答を生じる。形質転換細胞は、好ましくは、S．aureus，E．coli、Salmonella種などの微生物である。形質転換微生物は変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素あるいはその断片を表面に含有するか、変異体毒素を分泌し得るものである。形質転換微生物は、生ワクチや弱毒化ワクチン、熱殺ワクチンとして投与することができる。本発明はまた、ワクチンおよび医薬組成物を使用する方法を含む。ワクチンは、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも１つの生物活性に対する保護免疫応答を生じるのに効果的な量で動物に投与される。好ましくは、ワクチン組成物はヒトに投与されて、ＳＴＳＳが起きるのに対して防衛する。医薬組成物はＴ細胞増殖刺激法で用いられる。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素および/またはその断片および他のワクチン組成物は受動免疫血清をつくるのに、有用である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、ＤＮＡ発現カセット、ベクター、形質転換微生物は、動物を免疫し、野生型ＳＰＥ− Ｃの少なくとも１つ生物活性に対する抗体を中和するのに用いられる。中和抗体は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素と免疫反応する。受動免疫血清は、レンサ球菌感染およびＳＴＳＳの症状を有する動物に投与される。図面の簡単な説明図１は、speＣのヌクレオチド配列を示す。番号付けはＡＴＧ開始コドンを基にする。可能性あるプロモーター（−１０、−３５）およびシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列を表示する。演繹アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に記した。残基２７後の米印は信号ペプチドと成熟タンパク質との間の開裂部位を表す。翻訳停止コドン上部の線のヌクレオチド３’はバリンドローム配列である。図２は、ＳＰＥ−Ｃのリボン構造の正面図を示す。図３は、ＳＰＥ−Ｃのリボン構造の背面図を示す。図４は、ＳＰＥ−Ｃのリボン構造の正面図を示し、複合体中の主要組織適合性複合体に接触する部位を示すように方向付けされている。図５は、ＳＰＥ−Ｃのリボンダイアグラムの正面図を示し、複合体中のＴ細胞受容体に接触する部位を示すように方向付けされている。図６は、ＳＰＥ−Ｃのリボン構造の背面図を示し、複合体中の肝腎管状細胞受容体に接触する大溝面をこの受容体とともに形成する中心αヘリックスの残基を示すように方向付けされている。図７は、単一変異体Ｙ１５ＡおよびＮ３８Ａの分裂原性活性を示す。図８は、単一変異体Ｙ１７Ａの分裂原性活性を示す。図９は、二重変異体Ｙ１５Ａ／Ｎ３８ＡおよびＹ１７Ａ／Ｎ３８Ａの分裂原性活性を示す。図１０は、ＳＰＥ−Ｃのリボン構造の正面図および背面図であり、実施例６で置換された残基を示す。発明の詳細な説明本発明は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素あるいはその断片を含有するワクチンや医薬組成物、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素あるいはその断片を製造する方法、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素あるいはその断片を使用する方法に関する。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、少なくとも１個のアミノ酸の変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質に比較すると生物機能に少なくとも１つの変化を有する。好ましくは、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に比較すると同量で非致死的である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、部位指向変異生成法、ランダム変異生成法、定式変異生成法、インビトロ変異生成法、自発的変異生成法、化学合成法などの種々の方法を用いてつくられる。変異体ＳＰＥ −Ｃ毒素は、１）アミノ酸の少なくとも１つの変化を確保し、２）分子の少なくとも１つの生物機能の変化、好ましくは全身的致死性の低下あるいは消失を有するように、好ましくは選択される。変異体毒素は、ＳＴＳＳの予防または改善などのＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して保護をなすワクチン組成物およびＳＴＳＳ症候を有する動物の処置方法において有用である。Ａ．変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、その断片、ワクチンおよび医薬組成物本発明は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、かつ野生型ＳＰＥ−Ｃに実質的に対応し、それ同じ生物活性をもつタンパク質に比して、生物活性に少なくとも１つの変化を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素を含む。遺伝子speＣが野生型ＳＰＥ−Ｃをコードする。野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素は、精製タンパク質のＳＤＳＰＡＧＥにより測定すると、分子量が２４,０００ダルトンである。野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列および野生型ＳＰＥ −Ｃ毒素の推定アミノ酸配列を図１に示す。野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列はE．coliおよびS．aureusでクローンされた。本願でのアミノ酸番号は、図１の配列を基にして部位２８のアスパラギン酸を第１アミノ酸としてつけられた。最初の２７個のアミノ酸は成熟タンパク質には存在しないリーダー配列を表す。野生型ＳＰＥ−Ｃはいくつかの生物活性を有する。それには、１）発熱、２）ＳＴＳＳ、３）ＳＴＳＳの発展または内毒素ショックの上昇による全身的致死性、４）内毒素の上昇、５）毛管漏出および低血圧の誘発、６）ＩＦＮｇ、ＩＬ-１、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-βなどのサイトカインの放出誘発、８）ＭＨＣクラス11分子との結合、９）Ｔ細胞受容体との結合、１０）Ｔ細胞分裂原性（スーパー抗原性）を含む生物活性がある。これらの方法は、当業者に既知の方法で検定され、特徴付けられる。本明細書で用いられるように、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の定義には、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同じ生物活性を有する野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の変種が含まれる。これらのＳＰＥ−Ｃ毒素は、相違するアミノ酸を有し、その遺伝子は図１に示すヌクレオチド配列と異なるが、生物活性が相違しない。アミノ酸の変化は表現型としては表に出ない。好ましくは、これらの毒素分子は、全身的に致死性であり、図１に示す野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同程度に内毒素ショックを高める。好ましくは、これらの毒素は、Alschul，S．F.，Bull．Math．Bio．48：603（1986）に記載のＳＳ２平衡整列算法で測定ずると、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素アミノ酸配列と６０−９９％の相同性を有する。これらの特性を有するタンパク質は野生型ＳＰＥ −Ｃに実質的に対応する。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質に比べてアミノ酸に少なくとも１つの変化を有する毒素である。この変化は、アミノ酸の置換、欠失あるいは付加である。これはアミノ酸配列における少なくとも１つ、好ましくは１−６の変化である。全身的致死性すなわち毒性を有する野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素への変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の復帰を最小限にする１以上の変化があるのが好ましい。ワクチンに有用な変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素については、毒素のアミノ酸配列における変化が野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素を中和できる抗体応答を促進する毒素活性に変化を及ぼさないことが望ましい。ワクチンに有用な変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素については、Boca Raton、フロリダのToxin TechnologiesすなわちDr．Schlievert(ミネソタ大学、ミネアポィス、ミネソタ)法でＳＰＥ−Ｃ毒素に対する抗体を中和するポリクローナルが変異体毒素を認識すること、およびタンパク質分解能が野生型ＳＰＥ−Ｃに比べて変化しないことが特に好ましい。アミノ酸配列の変化は、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素の１以上の選択されたアミノ酸残基における部位特異的変化である。部位特異的変化は、上記したように分子の特定のドメインまたはシステイン残基の存在する部位で残基を同定することにより選択される。特定の部位における部位特異的変化は、部位またはドメイン内でのアミノ酸が１次配列相同性すなわち３−Ｄコンホメーションに比較して他の相同的分子の均等残基と同一または類似の性質を有するかどうかを調べることによりさらに選択される。相同的分子は、前出のAlschulらのＳＳ２平衡整列算法またはBioSyn社（サンジエゴ、カリフォルニア）のInsight/Homologyを用いて一次配列相同性を比較することにより同定し得るものである。相同的分子は、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に比較すると、かなりの数の、典型的には３０−９９％の同一または同類変化のアミノ酸を表示し、類似の３次元構造、典型的には＜２オングストロームの保存領域についてのＲＭＳ誤差を有するものである。特定部位のアミノ酸配列の変化は、無作為になされるか、あるいは特異的変化が選択される。特異的部位が選択されると、図１に示す野生型ＳＰＥ−Ｃの部位でのアミノ酸数番号つけおよびアミノ酸が適用される。本明細書でのアミノ酸番号は最初のアミノ酸として数えた部位２８のアスパラギン酸を持つ図１の配列を適用する。野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質における特定部位で同定されたアミノ酸に対応する均等のアミノ酸は、関連配列に依存する相違のアミノ酸数を有し、あるいは断片である。均等の残基はまた、１次アミノ酸構造の比較、図１に示すモデル化構造との比較、相同的分子の既知結晶構造との比較のいずれかにより野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質中のアミノ酸に均等であると同定され得る相同的分子中の残基である。同一または類似の部位での均等アミノ酸での変化は、そのアミノ酸の番号つけにかかわらず、本発明の範囲に含まれるものである。特異的部位におけるアミノ酸について特異的置換が選択されると、その部位で置換されるべきアミノ酸は、野生型ＳＰＥ−Ｃにおけるその部位でのアミノ酸に比較して生物活性に影響を与え得る構造的変化を含んで選択される。この置換は同類的あるいは非同類的である。生物活性に影響を与え得る構造的変化をもたらす置換には、１）ある型の電荷から他の型の電荷への変化、２）電荷から非電荷への変化、３）システイン残基およびジスルフィド結合形成の変化、４）疎水性基から親水性基または親水性基から疎水性基への変化、５）アミノ酸の大きさの変化、６）コンホメーション的制限性アミノ酸または類似体への変化、７）非天然的におきるアミノ酸または類似体への変化が含まれる。選択された特異的置換は選択された部位の位置に依存し得る。例えば、N末αヘリックスのアミノ酸はヒドロキシル基を有し、アミド窒素と相互反応すること、およびこのアミノ酸が負に電荷されてαヘリックスのN末に存在する部分的正電荷と相互反応することが好ましい。変異体毒素は、単数または複数の部位を標的とするランダム変異をも含む。部位が一旦選択されると、Aiyar et al.，Biotechniques 14：366（1993）またはH o et al.，Gene 77：51-54(1984)に記載のような方法を用いて、その部位で１９の他のアミノ酸の各々を有して変異を生じせしめることができる。インビトロ変異生成法も、Anthony-CzhＩＬ１et al.，Trends Biochem．Sci．14：400（1989 ）に記載のような方法を用いて、特定部位で他の１９のアミノ酸または非天然生成のアミノ酸または類似体の１つを置換するの利用することができる。変異体毒素はまた、非特異的に選択された分子の１以上の部位での変化を有する毒素、かつ非特異的に選択されるが、他の１９アミノ酸すなわち非天然生成アミノ酸のいずれかの１つであり得るアミノ酸の変化を有する毒素を含む。特異的部位での置換は、制限するわけでないが、３−ヒドロキシプロリン、４ −ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、２−アミノアジピン酸、２−アミノピミリン酸、オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ−メチルリシン、ジメチルリシン、トリメチルリシン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−アミノ酪酸、ヒドロキシリシン、置換フェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、（−バリン、ハロゲン化チロシンなどの非天然生成アミノ酸での置換を含む。特異的部位での置換はまた、エーテル、エステル、リン結合、ホウ素結合などの非ペプチド化学を用いた類似体の使用を含む。変異体毒素は種々の方法を用いてつくることができる。その方法には、部位特異的変異生成法、ＥＳＭやビ硫化ナトリウムなどの化学物あるいはＵＶ照射を用いた変異生成法、自発的変異生成法、インビトロ変異生成法、化学的合成法が含まれる。変異生成法は、Sambrook et al.，A Guide to Molecular Cloning，Col d Spring Harvard，New York(1989)に記載されている。部位特異的変異生成法に特に好ましい方法は、Perrin and Gilliland，1990，Nucleic Acid Res．18 ：7433に記載の、３プライマーでの非対称性ＰＣＲの使用である。４種のレンサ球菌スーパー抗原（ＴＳＴＴ，ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ−３）およびＳＰＥ−Ｃの３次元的構造のスーパー位置付けによると、これらのタンパク質は１６の構造的保存アミノ酸を共有していた（表１）。これらの１６の構造的保存アミノ酸残基を参照点とすると、２オングストローム以下のＲＭＳ（ルート平均平方）相違のあるこれらの５タンパク質の構造のスーパー位置付けがなされ、これは最小アミノ酸配列保存を有するタンパク質にとって重要である。１６構造的保存アミノ酸上のこのスーパー位置付けによって、ＳＰＥ−Ｃの構造とレンサ球菌スーパー抗原との詳細な比較が可能となる。レンサ球菌スーパー抗原ＳＥＢとクラスII主要組織適合性複合体（ＭＭＣ−II ）との複合体の結晶構造は、表２に掲載したものを含み、ＭＨＣ−IIに接触するＳＥＢ上のアミノ酸を表す。ＳＰＥ−Ｃ構造のスーパー位置付けによって、これら２種のタンパク質複合体においてＭＨＣ−IIに接触し、残基に接触し、領域に接触するＳＰＥ−Ｃのアミノ酸部位が表示される。これらの部位はボールとして図４に示される。特に、図４は、Ｂサブユニット５のβ−バレル４の鎖３上の部位１および２を含む。部位１は鎖３の型４曲がり点または膨らみを越えたアミノ酸１の位置であり、鎖３とループ６の接合部から約３残基である。部位１は、極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｈｒ−３３で占められ得る。部位２は鎖３とループ６の接合部に最も近い鎖３上にアミノ酸を提示し、鎖上に保持する。部位２は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＨｉｓ−３５で占められ得る。部位７は鎖３とループ６の接合部に最も近い鎖３上にアミノ酸を提示する。ループ６は“型１” または“型２”の曲がり点である。部位７は疎水性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ −ＣのＬｅｕ−３６によって占められ得る。Ｂサブユニット５のβバレルも残基Ａｓｎ−３８を含む。部位８はループ６中にある。部位８は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｎ−３７で占めることができる。部位１０、１１、１４は鎖１２上にある。部位１０はループ１３との接合部に最も近い鎖１２上のアミノ酸である。部位１０は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｒｇ−４４である。部位１１は鎖１２のほぼ中間にあり、電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＬｙｓ−４２で占められ得る。部位１４は鎖１２とループ１２との接合部にあるが、鎖１２上にある。部位１４は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｈｒ−４０で占められ得る。部位１５はループ６上にある。部位１５電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｐ−３９で占められ得る。部位１７−２０は鎖２１上にある。部位１９と２０は隣接している。部位１７ −１９はお互い間の１つの部位にとっての十分な空間で隔てられている。部位１７は鎖２１とループ１３との接合部からの約１つのアミノ酸である。部位１７は疎水性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＩｌｅ−５０で占められ得る。部位１８は鎖２１のほぼ中間にあって、中性または極性のアミノ酸、好ましくはＳＰＥ −ＣのＳｅｒ−５２で占められ得る。部位１９は鎖２１とループ２２との接合部から約２つのアミノ酸である。部位１９は中性または極性のアミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＭｅｔ−５４で占められ得る。部位２０は鎖２１とループ２２との接合部に隣接の鎖２１中にある。部位２０は中性または極性のアミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＳｅｒ−５５にある。部位２３は曲がり点のαヘリックス２４上にあり、このヘリックスはループ２５との接合部で終わっている。部位２３は部位２０に面しているヘリックス２４の面上にある。部位２３は中性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｌａ−１８６で占められ得る。レンサ球菌スーパー抗原ＳＥＣ−３とＴ細胞受容体との複合体の結晶構造は、Ｔ細胞受容体と接触するＳＥＣ３上のアミノ酸を示し、表３に記載した残基を含む。ＳＰＥ−Ｃ構造のスーパー位置によると、ＳＰＥ−Ｃのアミノ酸部位はこれら２つのタンパク質の複合体でＴ細胞受容体に接触している。これらの部位はボールで図５に示される。特に、図５に示すように、これらはループ１３と鎖２１との接合部にある部位２６を含む。部位２６は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｒｙ−４９で占められ得る。部位２７は鎖２８上にあり、鎖２８とループ２９との接合部から３アミノ酸離れている。部位２７は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｙｒ−８５で占められ得る。部位３０は鎖２８と３２とのほぼ等距離にあるループ２９上にある。部位３０は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＨｉｓ−８１で占められ得る。部位３１はループ２９と鎖３２との接合部にある。部位３１は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｎ−７９で占められ得る。部位３３ −３６は鎖３２上にある。部位３３は鎖３２とループ３１との接合部に隣接のアミノ酸である。部位３３は疎水性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＬｅｕ−７８で占められ得る。部位３４は部位３３から１アミノ酸である。部位３４は疎水性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＩｌｅ−７７で占められ得る。部位３５は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｒｙ−７６で占められ得る。部位３６は疎水性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＰｈｅ−７５で占められ得る。部位３８は不規則αヘリックス２４上の残基で、このヘリックスのループ３９との接合部のに最も近い曲がり点にある。部位３８は鎖４０の最も近い曲がり点の部分にある。部位３８は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｐ−１８３で占められ得る。部位４１はループ３９とαヘリックス２４との接合部からほぼ１アミノ酸のループ３９上にある。部位４１のアミノ酸上の側鎖は中心αヘリックス４２に向いている。部位４１は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｒｇ−１８１で占められ得る。ループ４３は部位４４、４５、４６、４７を含む。部位４４−４７は溶媒に最もさらされるループ４３の部分上の隣接部位である。部位４４は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＧｌｕ−１７８で占められ得る。部位４５は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｒｙ−１５３で占められ得る。部位４６は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｐ−１４８で占められ得る。部位４７は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｙｒ−１４７で占められ得る。部位４８−５０はＮ末αヘリックス５１上にある。部位４８および４９はループ５２との接合部に最も近いαヘリックス５１の曲がり点にある。部位４８は極性または中性のアミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＳｅｒ−１１で占められ得る。部位４９は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｐ−１２で占められ得る。部位４８および４９は隣接のアミノ酸位置を提示する。部位５０はループ５３との接合部に隣接するαヘリックス５１の曲がり点にある。部位５０は最も溶媒にさらされる曲がり点にある。部位５０は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ− ＣのＴｙｒ−１５で占められ得る。Ｎ末αヘリックス５１はまたＴｙｒ−１７残基を含む。ＳＰＥ−Ｃはその“背面”上の大溝上の残基を含む部位の肝腎管状受容体と結合する。部位５４−６０は、肝腎管状受容体との相互作用の部分であるＢサブユニット５とＡサブユニット６１と間のＳＰＥ−Ｃの大溝の表面を確定する。部位５４−５９は中心αヘリックス４２上にある。部位６０はループ１６と中心αヘリックス４２との接合部に隣接するループ１６上にある。部位５４は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｎ−１４３で占められ得る。部位５５は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＡｓｐ−１４２占められ得る。部位５６は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｙｒ−１３９で占められ得る。部位５７は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＬｙｓ−１３８で占められ得る。部位５８は正電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＬｙｓ−１３５で占められ得る。部位５９は電荷アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＧｌｕ−１３１で占められ得る。部位６０は極性アミノ酸、好ましくはＳＰＥ−ＣのＴｈｒ−１２８で占められ得る。表２は、クラスIIＭＨＣと作用するＳＥＢ残基を掲載したもので、これら２種のタンパク質の複合体の結品構造中に存在する。ＳＥＣ−３、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ −１構造とＳＥＢ：ＭＨＣ−II構造との複合体のスーパー位置付けは、これらのタンパク質上のアミノ酸がＭＨＣ−IIと相互作用するＳＥＢ残基に対応していることを示す。好ましいＳＰＥ−Ｃ変異体は、ＭＨＣ−IIと相互作用するＳＥＢ、ＳＥＣ−３、ＳＥＡあるいはＴＳＳＴ−１中の残基に対応するＳＰＥ−Ｃ残基でのアミノ酸置換を有する。これらの好ましいＳＰＥ−Ｃ残基は表２に掲載されたＳＰＥ−Ｃ残基を含む。相違するタンパク質からの対応残基は表の横列に沿って掲げた。表３は、Ｔ細胞受容体と作用するＳＥＣ−３残基を掲載したもので、これら２種のタンパク質の複合体の結晶構造中に存在する。ＳＥＢ−３、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ−１構造とＳＥＢ−３：Ｔ細胞受容体との複合体のスーパー位置付けは、これらのタンパク質上のアミノ酸がＴ細胞受容体と相互作用するＳＥＣ残基に対応していることを示す。好ましいＳＰＥ−Ｃ変異体には、Ｔ細胞受容体と相互作用するＳＥＢ、ＳＥＣ−３、ＳＥＡあるいはＴＳＳＴ−１中の残基に対応するＳＰＥ −Ｃ残基が置換されているものがある。これらの好ましいＳＰＥ−Ｃ残基は表３に掲載されたＳＰＥ−Ｃ残基を含む。相違するタンパク質からの対応残基は表の横列に沿って掲げた。ＳＰＥ−Ｃの好ましい変異体は、少なくとも１つの部位でアミノ酸置換を有し、あるいはＴ細胞受容体、ＭＨＣ−II、肝中性管状細胞受容体と相互作用するアミノ酸残基の少なくとも１つに置換を有する。これらのアミノ酸置換は、相互作用を破壊するために、上記したように選ぶことができる。表１ＰＴＳＡＧ保存残基表２クラスIIＭＨＣ相互作用に関与する残基表３ TCR 相互作用に関与する残基野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて少なくとも一個のアミノ酸変異を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素を産生したら、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素を非致死性に関してスクリーニングする。このスクリーニングで選択された変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素が、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同じかまたは多い投与量で、ミニ浸透圧ポンプ(実施例４に記載)を使用して投与した時、ウサギで実質的に致死性でないことが好ましい。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片は、ウサギに野性型毒素と同じ投与量で投与した場合、約１０−２０％より少ないウサギが死亡し、実質的に致死性ではない。非致死性変異体毒素は、ワクチンおよび医薬組成物に有用である。本発明を限定ずる意図はないが、全身的致死性に作用するあるアミノ酸残基またはドメインを、他の生物活性、特に、Ｔ細胞分裂原性から分離可能であると考えられる。ワクチン組成物に有用な変異体毒素については、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素活性を中和する抗体応答を刺激できるものに関して、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をスクリーニングすることが更に好ましい。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素活性を中和する抗体応答を刺激できる変異体毒素の選択法は、Toxin Technologies，Boca Raton，Fla.またはDr．Schlievertから入手可能なような野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体と変異体毒素が免疫応答するか否かを決定することある。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素が野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対する抗体と免疫応答するか否かの決定は、ELISA、ウェスタン・ブロット、２重免疫拡散アッセイ等を含む。所望により、変異体毒素のタンパク質分解プロフィールが、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同じであるかを決定するために、変異体毒素をスクリーニングできる。ある場合、産生された変異が、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と比較して変異体毒素の全体的コンホメーションを実質的に変えないことが好ましい。全体的コンホメーションに変化があるか否かを試験する方法の一つは、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対する抗体との免疫応答性の考察および／または変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素のタンパク質分解プロフィールの試験である。タンパク質分解プロフィールは、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、サブチリシンおよびＶ８プロテアーゼのような酵素を、当業者に既知の方法で使用して決定できる。図３に示す配列を有する野性型ＳＰＥ−Ｃのタンパク質分解プロフィールは既知である。野性型ＳＰＥ −Ｃと同じプロフィールを有する変異体を選択する。所望により、生物活性の他の変化を有する変異体毒素を、スクリーニングおよび選択もできる。先に記載のように、野性型ＳＰＥ−Ｃに付随するいくつかの生物活性がある。これらの生物活性は：１)発熱；２)ＳＴＳＳ；４)内毒素ショックの増強；５)毛細血管漏出および低血圧；６)ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１、ＴＮＦ −αおよびＴＮＦ−βのようなサイトカインの放出の誘導；7)内皮細胞への結合；８)ＭＨＣクラスII分子への結合；９)Ｔ細胞受容体への結合：およびＴ細胞分裂原性(超抗原性)を含む。これらの生物活性は、当業者に既知の方法を使用して測定できる。ワクチン組成物で有用な変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片に関して、それらは実質的に非毒性であり、野性型ＳＰＥ−Ｃに対する中和抗体と免疫応答性であることが好ましい。中和抗体は、動物で試験したとき、野性型毒素の致死性を阻害するものを含む。所望により、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、先に記載のように、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の１以上の生物活性が変化し得る。所望により、好ましいワクチン組成物用の変異体毒素は、更に、内毒素ショックの増強の欠失に関してスクリーニングおよび選択する。内毒素ショックの増強の欠失の試験のための好ましいアッセイは、実施例３に記載する。ウサギは、好ましくは、試験前に、細菌またはウイルスの明白な感染をしていない。内毒素ショックの強化の欠失または実質的に増強がないことは、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素を内毒素と共投与した場合、同じ投与量の野性型約ＳＰＥ−Ｃ活性と比較して、２５％より少ない動物が、ショックを発症するときに見られる。より好ましくは、動物はショックを発症しない。所望により、好ましいワクチン組成物用の変異体毒素は、また更に、Ｔ細胞分裂原性の変化に関してスクリーニングおよび選択する。Ｔ細胞分裂原性における変化は、実施例３に記載のように、ウサギリンパ球を使用した標準３Ｈチミジンアッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を測定することにより；ＴＦＮ−γまたはＴＮＦ −βのようなサイトカインの製造レベルの測定により；またはＴ細胞応答のＶβ タイプの測定により、または本分子とＭＨＣクラスII受容体の相互作用の決定により検出できる。Ｔ細胞分裂原性の減少の検出に好ましい方法は、変異体毒素存在下および非存在下でのウサギリンパ球のＴ細胞増殖の測定である。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対するＴ細胞の応答は、通常のインビトロの抗原に対する応答を遥かに超える。Ｔ細胞分裂原性の実質的な減少は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素がＴ細胞増殖応答を抗原またはネガティブ・コントロールによる刺激を超えて刺激しないときに見られる。好ましくは、ウサギリンパ球を使用して、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同じ投与量で、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素に対するＴ細胞増殖応答が、バックグラウンドの２倍を超えないと見なす。所望により、ワクチン組成物に有用な変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、更に、内皮細胞への毛細血管漏出の減少に関してスクリーニングおよび選択する。好ましい方法は、Lee et al.，J．Infect．Dis．164:711(1991)に記載のように、ブタ大動脈内皮細胞を使用する。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の存在下での毛細血管漏出の減少は、放射活性標識化合物の放出の減少の測定または放射活性標識化合物の輸送の変化により決定できる。毛細血管漏出の減少は、放射活性標識化合物の放出または輸送が、野性型毒素の活性と比較した場合、バックグラウンドの約２倍より少なくまで減少しているときに見られる。ワクチン組成物に有用な特に好ましい変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、野性型ＳＰＥ −Ｃ毒素活性を有するタンパク質と比較して、生物学的に活性ではない。非生物学的活性とは、変異体毒素が全身的に致死性をほとんど有しないか、全く有せず、内毒素ショック増強をほとんどしないか、全くせず、そしてＴ細胞分裂原性を僅かに有するか有しないことを意味する。好ましくは、ワクチン用に選択した変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、実質的にこれらの生物活性を欠失する、即ち、それらはネガティブ・コントロールと同じように応答するか、バックグラウンドの２倍を超えて応答を刺激しない。他の生物活性の変化は、下記のように検出できる。ＭＨＣクラスII分子への結合は、Jardetzky，Nature 368:711(1994)に記載のような方法を使用して検出できる。発熱に関する変化は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素投与後の経時的な対応追跡により検出できる。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の存在下でのサイトカイン産生レベルの変化は、商品として入手可能な、そして免疫学の現在のプロトコールに記載のような方法を使用して測定できる。（Ed．Coligan，Kruisbeck，Margulies， Shevach and Storker．National Institues of Health，John Wiley and Sons， Inc.）ワクチン組成物用の特に好ましい変異体は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対するポリクローナル中和抗体と免疫反応し、非毒性であり、所望により内毒素ショックの増強の減少およびＴ細胞分裂原性の減少を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素である。有利には、治療法に有用な変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、アミノ酸配列に一個以上の変化を有するように製造できる。毒性または致死性を有する分子への復帰変異の機会を最少とするために、一個以上の部位で変化していることが望ましい。ワクチン組成物に関して、複数の変化を有する変異体毒素が、野性型ＳＰＥ−Ｃに対する保護免疫応答を生ずることができる、および／または野性型ＳＰＥ−Ｃに対する中和ポリクローナル抗体と免疫応答できることも望ましい。医薬組成物に関して、複数の変化を有する変異体が、Ｔ細胞の分裂原性を有していても、実質的に非致死性であることが好ましい。約２から６個の変化を有することが好ましい。３重変異体がまた本発明で考慮される。ＳＰＥ−Ｃの変異体毒素は、ワクチン組成物の形成に有用である。ワクチン組成物用の好ましい変異体は、少なくとも１個のアミノ酸変化を有し、全身性に非致死性であり、そして野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体と免疫応答する。変異体毒素は、生理学的に許容される担体と組み合わせる。生理学的に許容される希釈剤は、生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水のような中性ｐＨの緩衝塩溶液を含む。生理学的担体の他のタイプは、リポソームまたはポリマー等を含む。所望により、変異体毒素をフロイントの不完全アジュバント、フロイントの完全アジュバント、ミョウバン、モノホスホリルリピッドＡ、リン酸ミョウバンまたは水酸化ミョウバン、QS-21等のようなアジュバントと組合せることができる。所望により、変異体毒素またはその断片を、インターロイキン、インターフェロン等の免疫調節剤と組み合わせることができる。多くのワクチン製剤が当業者に既知である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片をワクチン製剤中に、動物での保護免疫応答を野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の生物活性の少なくとも一つまで刺激するのに有効な量で添加する。保護免疫応答の誘発は、抗体の発生、好ましくは野性型ＳＰＥ −Ｃ毒素を中和する抗体の発生により測定できる。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の中和は、動物における野性型ＳＰＥ−Ｃにより引き起こされる致死性の阻害などによって測定できる。加えて、保護免疫応答は、内毒素ショックまたはＳＴＳＳの増強の症状の改善または消失のような野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも一つの生物活性の減少により測定できる。保護免疫応答を形成できる変異体毒素の量は、約０.１μｇから１００mg／体重kg、より好ましくは約１μgから約１００μg／k g体重である。約２５μg／体重kgの野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素がウサギでの保護免疫の誘発に有効である。ワクチン組成物は、ウサギ、齧歯類、ウマおよびヒトのような動物に投与できる。好ましい動物はヒトである。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は医薬組成物の形成にも有用である。医薬組成物は、Ｔ細胞増殖の刺激が望ましい治療状況で有用である。好ましい変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同等なＴ細胞分裂原性を維持するが、非致死性である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素と、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水のような中性ｐＨの緩衝塩溶液のような生理学的に許容される担体と組み合わせて形成する。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、同じ投与量の野性型ＳＰＥ−Ｃと同等なＴ細胞増殖刺激に有効な量で組み合わせる。Ｔ細胞応答は、ウサギリンパ球での標準３Ｈチミジンアッセイを使用して、および蛍光活性化Ｔ細胞選別機またはELISPOTのようなアッセイを使用したインビボのＴ細胞集団の測定により調べられる。有効な量の範囲は、１００ngから１００mg／体重kg、より好ましくは１μgから１mg／体重k gである。例えば、これらの変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、単独でまたはインターロイキンまたはインターフェロン治療と組み合わせて使用できる。本発明はまたＳＰＥ−Ｃ毒素および変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片も含む。ワクチン組成物に関して、断片は、好ましくは免疫応答を刺激するのに十分大きい。Ｂ細胞エピトープの最少サイズは約４−７アミノ酸およびＴ細胞エピトープに関しては約８−１２アミノ酸である。野性型ＳＰＥ−Ｃの全サイズは、そのリーダー配列を含んで約２３５アミノ酸である。断片は、約４から２００アミノ酸、より好ましくは約１０−５０アミノ酸のペプチドである。断片は、単一ペプチド、または互いに結合した異なる位置由来のペプチドを含み得る。好ましくは、断片は図１に示すような、および本明細書に記載のような一個またはそれ以上のドメインを含む。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素由来の断片は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質と比較したとき、アミノ酸配列に少なくとも１個のそしてより好ましくはアミノ酸配列に１−６個の変化を有することが好ましい。好ましくは、断片は実質的に全身性に非致死性である。断片を、先に記載のように、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒性活性を有するタンパク質と同じかそれより多い量で、ミニ浸透圧ポンプモデルを使用して、ウサギでの毒性がわずかであるか、毒性がないことをスクリーニングおよび選択する。断片は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同程度の投与量で投与したとき、ヒトで非毒性であることも好ましい。ワクチン組成物に関して、断片が中心αヘリックスおよび／またはＮ−末端α ヘリックス由来の残基を含むことが好ましい。ワクチン組成物に関して、断片が野性型ＳＰＥ−Ｃ毒性活性を有するタンパク質に応答する中和抗体を刺激することが好ましい。断片は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対するポリクローナル中和抗体との免疫応答性に関してスクリーニングおよび選択できる。断片はまた動物の免疫化に使用でき、形成された抗体は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の中和に関して試験する。ワクチン組成物に関して、特に好ましい断片は、更に、非生物活性であることを選択およびスクリーニングする。非生物活性とは、断片が全身的に非致死性でなく、内毒素ショックをほとんど誘発しないか、全く誘発せず、Ｔ細胞刺激をほとんど誘発しないか、全く誘発しないことを意味する。所望により、断片は、ブタ内皮細胞で毛細血管漏出作用の減少に関してスクリーニングおよび選択できる。ワクチン組成物に関してスクリーニングおよび選択した断片は、ワクチン製剤として合わせられ、先に記載のように使用される。所望により、断片はウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、破傷風毒素等のような担体分子に結合できる。医薬組成物に関して、断片はＮ−末端ドメインＢβ鎖単独の、または中心αヘリックスと合わせたアミノ酸残基を含むことが好ましい。医薬組成物に関して、断片を、全身的に非致死性、および所望により前記のように内毒素ショックの促進がほとんど無いか、全く無いことに関してスクリーニングおよび選択することが好ましい。断片が野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と同程度のＴ細胞分裂原性を保持することが好ましい。変異体毒素ＳＰＥ−Ｃの断片は、前記の医薬組成物を形成できる。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片は、ＰＣＲ、制限酵素消化および／または連結反応、インビトロ変異誘発および化学合成を使用して製造できる。小さい断片は、化学合成が望ましいことがある。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素に関して記載の同じ組成物および方法で使用できる。Ｂ．変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素、ワクチン組成物または医薬組成物の使用法変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素および／またはその断片は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の作用に対する動物の保護、増強されたＴ細胞増殖および応答を含むＳＴＳＳの動物の改善および処置、および滴状乾癬、リウマチ熱または侵襲性レンサ球菌乾癬の処置または改善の方法に有用である。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも一つの生物活性に対して動物を保護する方法は、ワクチン組成物を動物に投与し、ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも一つの生物活性に対する保護免疫反応を確立する段階を含む。保護免疫応答が、ＳＴＳＳの致死性または症状を中和および保護することが好ましい。ワクチン組成物は、好ましくは、少なくとも１個のアミノ酸変化を有し、野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体と免疫応答し、非致死性である変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片を含む。ワクチン組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経口、経鼻、眼内、腹膜内等を含む種々の方法で動物に投与できる。投与の好ましい経路は、筋肉内である。ワクチン組成物は、ウサギ、齧歯類、ウマおよびヒトを含む種々の動物に投与できる。好ましい動物はヒトである。ワクチン組成物は、１回または複数回投与で、野性型ＳＰＥ−Ｃの少なくとも一つの生物活性に対する保護免疫性が確立されるまで投与できる。保護免疫性は、標準法を使用した野性型ＳＰＥ−Ｃに対する中和抗体の存在の測定により検出できる。実質的な毒性をもたらすこと無く、保護免疫性を確立する有効量を投与する。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片は、また変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素および野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素と免疫応答する中和抗体の産生にも有効である。これらの抗体は、ＳＴＳＳの症状を発症している患者の症状を処置または改善する受動免疫血清として使用できる。上記のワクチン組成物は、ウマまたはヒトのような動物に、野性型ＳＰＥ−Ｃに対する中和抗体が生じるまで投与できる。これらの中和抗体を、次いで、回収し、精製し、そしてＳＴＳＳの症状を発症している患者の処置に使用する。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対する中和抗体は、また、野性型ＳＰＥ−Ｃを使用しても形成できる。しかしながら、野性型ＳＰＥ−Ｃは、ウサギで野性型ＳＰＥ−ＣのＬＤ₅₀の１／５０から１／１００のように毒性を誘発するよりかなり低い投与量で投与すべきである。中和抗体を、発熱、低血圧、Ａ群レンサ球菌感染、筋炎、筋膜炎および肝臓傷害のような症状を発症する患者に、ＳＰＥ−Ｃ毒素の作用を中和するのに有効な量投与する。中和抗体は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下等で投与できる。好ましい経路は、静脈内であり、または局所感染に関しては、組織傷害の部位に局所的に創面切除による。中和抗体を抗体治療と組み合わせて投与することも好ましい。中和抗体は、ショック症状、または組織傷害の軽減が、１回または複数回投与量で得られるまで投与できる。典型的に投与する中和抗体の好ましい量は、約１ mgから１０００mg／kg、より好ましくは約５０−２００mg／体重kgである。Ｃ．変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ発現カセットおよびこのようなＤＮＡ発現カセットの製造法本発明はまた、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素および／またはその断片の発現に有用なＤＮＡ配列および発現カセットも含む。発現カセットは、宿主細胞のプロモーター機能に操作可能に結合した野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変化および少なくとも一つの生理的機能の変化を有する、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素および／またはその断片をコードするＤＮＡ配列を含む。発現カセットは、形質転換ベクター内に包含され、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素が形質転換細胞で産生される。次いで、変異体毒素を宿主細胞または宿主細胞上清から精製できる。形質転換宿主細胞はまたワクチン組成物としても有用である。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片は、また部位特異的または無作為変異誘発に関して記載のものと同様の方法で、自然発生変異に関してスクリーニングおよび選択できる。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、インビトロ変異誘発を使用して、または任意の方法で製造された断片から半合成的に製造できる。最後に、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、化学合成を使用して製造できる。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片を製造する方法は、宿主細胞の、このような発現カセットを含むベクターでの形質転換またはトランスフェクトおよび該宿主細胞の、このような変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素または断片の宿主細胞による発現を可能にする条件下での培養を含む。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードする変異ＤＮＡ配列は、選択した変化のタイプに依存して、種々の方法で形成できる、少なくとも一つの変化をアミノ酸配列に含む。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列を産生するために使用する鋳型ＤＮＡとして機能する。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列は図１に示す。特異的な位置(複数も有る)での特異的な変化(複数も有る)を成すために、前掲のPerrin et al.の方法に従ったＰＣＲを行うのが好ましい。特定の場所の変化を標的とするために、アミノ酸変化をコードする置換ヌクレオチドを含む内部プライマーを、５'および３'フランキングプライマーをまた含む混合物に包含させる。５'フランキングプライマーは野性型ＳＰＥ−Ｃのコード配列の翻訳開始部位の上流のＤＮＡ領域と相同であるか、またはこれとハイブリダイズする。好ましくは、５'フランキング領域はspeAプロモーターおよび調節領域の上流である。例えば、５'フランキングプライマーは、翻訳開始部位の約７６０塩基上流の領域と相同であるか、またはハイブリダイズできる。下流フランキングプライマーは、野性型ＳＰＥ−Ｃのコード配列の停止コドンの下流のＤＮＡの領域と相同性であるか、またはこれとハイブリダイズする。下流フランキングプライマーが転写および翻訳停止シグナルを備えるのが好ましい。例えば、３'フランキングプライマーは、ＳＰＥ−Ｃのコード配列に対して、停止コドンの２００塩基対下流の領域とハイブリダイズできるか、またはそれと相同性であり得る。上流および下流フランキングプライマーは、全ＰＣＲ反応に存在し、得られるＰＣＲ産物が speCプロモーターおよび上流調節領域ならびに転写および翻訳停止シグナルを含むことを確実とする。他の上流および下流プライマーは、当業者が容易に構築できる。天然speCプロモーターおよび上流調節領域がＰＣＲ産物に含まれていることは、好ましいが必須ではない。内部プライマーは、野性型ＳＰＥ−ＣをコードするＤＮＡ配列を使用して、特異的位置に変化を生じるように設計できる。プライマーは、特異的位置の特異的アミノ酸置換をコードするように設計できる。プライマーは、Rennell et al.， J．Mol．Biol．22:67(1991)に記載のように、特定の部位で無作為置換をもたらすように設計できる。プライマーは、特定部位のアミノ酸欠失をもたらすように設計できる。プライマーはまた特定の位置の付加的アミノ酸のコード配列を付加するためにも設計できる。プライマーは、好ましくは約１５から５０ヌクレオチド長、より好ましくは１５から３０ヌクレオチド長である。プライマーは、好ましくは自動合成する。５ 'および３'フランキングプライマーは、好ましくは野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素のコード配列をコードするフランキングＤＮＡ配列とハイブリダイズする。これらのフランキングプライマーは、好ましくはフランキングＤＮＡ配列に１００％相同性または相補的な約１０ヌクレオチドを含む。内部プライマーは、該部位での変化をコードするため、該位置のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列と１００％は相補的ではない。内部プライマーは、約１５から３０ヌクレオチド長の野性型ＳＰＥ −Ｃ配列から、約１から４ミスマッチを有することができる。フランキングプライマーおよび内部プライマーの両方とも、好ましくはプライマーの末端付近に、制限部位およびクランプ部位をコードする付加的ヌクレオチドも含む。ハイブリダイゼーション条件は、プライマーに存在するミスマッチの数を考慮して、Samb rook et al．Molecular Cloning-A laboratory manual，Cold Spring Harbor La boratory Press，(1989)に記載の既知の原則に従って、変えることができる。一個以上の部位での変化が望まれる場合、１個以上の内部プライマーを使用できる。１個以上の位置での部位特異的変化を産生するためのＰＣＲ法は、前掲の Aiyar et al.に記載されている。他の方法は実施例５に記載される。一つの方法において、特定部位の１個の変化を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列を、次いで、第２の部位での変化を有する変異ＤＮＡ配列を産生するための鋳型として使用する。ＰＣＲの第１回目において、第１の内部プライマーを使用して第１の変化を有する変異ＤＮＡを産生する。第１の変化を有する変異ＤＮＡ配列を、次いで鋳型ＤＮＡとして使用して、異なる部位での変化をコードする第２の内部プライマーを使用して、二つの位置でアミノ酸配列の変化を有する変異体毒素をコードするＤＮＡ配列を形成する。ＰＣＲ法を使用して、約２から６個の変化を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を産生する。好ましいＰＣＲ法は、前掲のPerrin et al．により記載されている。簡単に、ＰＣＲ反応条件は：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ＝８.３)、５０ｍＭＫＣ１、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、各２００μＭのｄＮＴＰ、２ng鋳型プラスミドＤＮＡ、１００pmoleフランキングプライマー、５pmole内部プライマーおよび２.５単位のAmpli Taq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含む１００μl反応混合物中でＰＣＲを行うものである。第２の増幅段階において、反応混合物の組成物は、フランキングプライマーおよびメガプライマーの当モル(各５pmole)および鋳型１μg以外、上記の通りである。ＰＣＲを、９４℃×１分の３０サイクルの変性、３７℃または４４℃×２分のアニーリングおよび７２℃で３分の伸長で行う。ＰＣＲ産物を単離し、次いでシャトルベクター(例えば、Murray et al.，J．I mmunology 152:87(1994)の方法で構築し、Dr．Schlievert，University of Minn esota，Mpls，MNから入手可能なpMIN 164)にクローン化する。ベクターは、アンピシリン耐性を担持するE．coliプラスミドpBR322とエリスロマイシン耐性を付与するスタフィロコッカルプラスミドpE194とのキメラである。連結したプラスミド混合物は、Toxin Technologies，Boca Raton，FlaまたはDr． Schliebertからの野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体を使用して、毒素産生に関してE．coliでスクリーニングする。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、H siao et al.，Nucleic Acid Res．19:2787(1991)の方法により配列決定し、所望の変異の存在および他の変異の非存在を確認する。当業者は、遺伝子コードの縮重のために、多くのＤＮＡ配列がアミノ酸の同じ変化をコードできることを理解する。本発明は、異なるヌクレオチド配列を有するが、アミノ酸配列内の同じ変化をコードするＤＮＡ配列を含む。特定部位の無作為変異誘発に関して、特定部位で他の１９アミノ酸のいずれかの置換または非天然由来アミノ酸またはアナログをもたらすように、一連のプライマーを設計する。ＰＣＲは、上記と同様の方法で、または前掲のRennell et a l.に記載の方法で行う。ＰＣＲ産物をサブクローンし、次いで毒素産生を野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体との免疫応答性により追跡できる。アミノ酸配列における変化の存在は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列の配列決定により証明できる。好ましくは、変異体毒素を非致死性に関してスクリーニングおよび選択する。変異誘発の他の方法は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列における無作為変異の産生にも用いることができる。本明細書で使用する無作為変異または無作為変異誘発とは、変異が選択部位でないこと、および／または選択した変化でないことを意味する。野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列を含む細菌宿主細胞は、化学変異誘発およびＵＶ照射のような他の標準法により変異誘発できる。本方法で発生した変異体を、野性型ＳＰＥ−Ｃに対するポリクローナル中和抗体を使用して、毒素産生に関してスクリーニングできる。しかしながら、生物活性に少なくとも一つの変化を有する、好ましくは致死性でない変異体毒素の同定が必要である。自然発生する変異体もまた、野性型ＳＰＥ−Ｃの生物活性の少なくとも一つの変化に関してスクリーニングできる。無作為変異誘発は、Anthony-Cahill et al.，Trends Biochem．Sic．14:400(1 989)に記載のようなインビトロ変異誘発を使用して行うことができる。加えて、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、化学合成を使用して形成できる。化学的にタンパク質を合成する方法は、Wallace，FASEB J．7:505(1993)に記載されている。タンパク質の部分を合成でき、次いで酵素を使用して結合させるか、直接的な化学縮合を行うことができる。化学合成の使用は、当業者が所望の位置に非天然由来アミノ酸を所望の位置に挿入するのに特に有用である。加えて、化学合成は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片の製造に特に有用である。本明細書に記載の任意の方法が、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の断片の形成に有用である。加えて、断片は、制限酵素消化および／または連結反応を使用して、容易に産生できる。断片を産生するのに好ましい方法は、２０個またはそれより少ないアミノ酸の断片については直接化学合成によって、またはより大きな断片については、遺伝子クローニングによって行われる。変異体毒素をコードするＤＮＡ配列は、部位特異的であれ無作為であれ、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素由来の生物活性の他の変化について更にスクリーニングできる。少なくとも一つの生物活性における変化のスクリーニング法は、先に記載の通りである。一度選択したら変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列を、少なくとも一つの生物活性の変化について選択し、それらを発現カセットの形成に使用する。発現カセットの形成は、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列と、宿主細胞内で変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の発現を提供するプロモーターを合わせることを含む。本明細書に記載の、ＰＣＲを使用して製造したこれらの変異体ＳＰＥ− Ｃ毒素に関して、天然speCプロモーターが存在し、宿主細胞内の発現を提供する。所望により、異なるプロモーターとＤＮＡ配列を組み合わせると、宿主細胞の具体的なタイプでの発現を提供するか、宿主細胞内の発現レベルを促進することができる。好ましくは、プロモーターは、ＳＰＥ−Ｃに対する抗体で検出できるように、変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の発現レベルを提供する。原核細胞内で使用できる他のプロモーターは、PLAC、PTAC、T7等を含む。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡを適当なプロモーターと組み合わせ、発現カセットを形成させたら、発現カセットを適当な形質転換ベクター中にサブクローン化する。適当な形質転換ベクターは、少なくとも一つの選択可能なマーカー遺伝子を含み、好ましくはE．coliおよび他のグラム陽性微生物で増殖できるシャトルベクターである。適当なシャトルベクターの例は、pMIN164および pCE104である。他のタイプのベクターは、バキュロウイルスベクター、SV40、ワクシニア、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスのようなポックスウイルスのようなウイルスベクターを含む。好ましいベクターは、E．coliおよびS．au reus中で増殖できるシャトルベクターのpMIN164ベクターである。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードする発現カセットを担持する形質転換ベクターを形成したら、これは変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の発現のために提供される適当な宿主内に挿入される。適当な宿主細胞は、変異体毒素の高レベルの発現を提供するが、内毒素およびＭ−プロテインのような他の望ましくな分子での汚染の可能性を最小にする細胞である。適当な宿主細胞は、哺乳類細胞、S．aureus、E．coli 、Salmonella spp.のような細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞である。形質転換法は当業者に既知であり、原形質形質転換、リポソーム介在形質転換、リン酸カルシウム沈殿形質転換およびエレクトロポレーションを含む。好ましい方法は、原形質形質転換である。形質転換細胞は、ワクチン組成物として使用できる変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の大量の製造に有用である。形質転換微生物は、生、弱毒、または加熱死滅ワクチンに使用できる。形質転換微生物は、野性型ＳＰＥ−Ｃに対する保護免疫応答を刺激するのに十分な量で変異体毒素ＳＰＥ−Ｃを含む。好ましくは、変異体ＳＰＥ −Ｃ毒素は分泌される。微生物は好ましくはヒトに病原性でなく、毒性形への復帰を最少とするために、複数個のアミノ酸変化を有する変異体毒素を含む。微生物は、生または加熱死滅ワクチンのいずれかで、既知の原則に従って投与する。生ワクチンに好ましい微生物は、Sapmonella spp.のような形質転換細胞である。宿主細胞内で機能的なプロモーターに操作可能に結合した変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットは、また本明細書で記載のワクチン組成物に使用できる。好ましくは、プロモーターは哺乳類細胞中で機能的である。適当なウイルスベクターの例は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス等のようなボックスウイルスを含む。ワクシニアウイルスベクターは、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素の少なくとも一つの生物活性に対するヒトの免疫化に使用できる。本発明は、宿主細胞内で機能的なプロモーターに操作可能に結合した変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片をコードする核酸配列を含むワクチン組成物も含む。プロモーターは、好ましくは哺乳類宿主細胞内で機能的である。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ワクチン組成物は、個体自身の細胞内での変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片の発現のために、宿主細胞または個体に送達される。変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片の個体内での核酸配列の発現は、野性型ＳＰＥ−Ｃ毒素に対する保護免疫応答を提供する。所望により、発現カセットはベクター内に包含される。核酸分子は、直接またはウイルスベクターに投与し得る。ワクチン組成物は、所望により、リポソーム等の細胞内にワクチンを送達するための送達剤も含む。ワクチン組成物は、また所望によりアジュバントまたは他の免疫調節化合物、および核酸の細胞内取り込みを促進する付加的化合物も含み得る。ワクチン組成物は、静脈内、腹腔内のような非経口経路を含む種々の経路または筋肉表面への接触により投与できる。ＳＰＥ−Ｃ毒素の大規模生育および製造の条件は、当業者に既知である。微生物源由来の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の精製法は下記の通りである。変異または野性型speCをpMIN164内に担持するS．aureusを３７℃で、エリスロマイシン５μg／m lを含む透析可能ウシ心臓培地中の固定相に通気しながら、生育させる。培養物を５容量のエタノールで沈殿させ、タンパク質を発熱物質非含有水に再溶解する。粗調製物を、３.５から１０および４から６のｐＨ勾配の連続平床等電点電気泳動に付す。抗体反応性により毒素に関して陽性のフラクションを発熱物質非含有水に対して完全に透析し、各アリコートを１５％(重量／容量)ゲル中のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度を試験する。ＳＰＥ−Ｃへのポリクローナル中和抗体は、Toxin Technologies，Boca Raton，FraまたはDr．Schlievert から入手可能である。カラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣを含む他の精製法が使用できる。本発明は、以下の実施例により、更に理解されよう。これらの実施例は、好ましい態様を代表するが、本発明の範囲を限定するために構築されたものではない。実施例１ＳＰＥ−Ｃ野性型のクローニングおよび発現 E ．coli中のspeCのクローニングおよび発現遺伝子単離のための毒素検出の必要性を除くために、ＳＰＥ−Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを合成し、レンサ球菌遺伝子ライブラリーのスクリーニングに使用した。株T18P由来の精製レンサ球菌ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分的に消化し、０.７％アガロースゲルで分離した。４−８キロベース範囲の断片をゲルから溶出させ、BAMH1で直線化し、自己ライゲーションを防止するために脱ホスホリル化させたベクタープラスミドpBR328にライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを次いでコンピテントE．coli RR1細胞を形質転換するのに使用し、アンピシリン耐性とした。形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天に重ねたニトロセルロースフィルター上で生育させた。レプリカフィルターを調製し、約１５００組換えコロニーを、放射標識合成オリゴヌクレオチドに対するコロニーハイブリダイゼーションにより、speC遺伝子の存在に関してスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの混合配列の二つのファミリーは、成熟ＳＰＥ− Ｃタンパク質(図１)の最初の６アミノ酸に対応するヘキサペプチド配列であるAs p-Ser-Lys-Lys-Asp-Ileに由来した。本オリゴヌクレオチドを二つのファミリーに分け、プローブ過剰を制御し、それにより非特異的ハイブリダイゼーションを最少とした。ファミリーＢにハイブリダイズするコロニーは見られなかった。ハイブリダイズしたクローンを、Ouchterlony免疫拡散試験でＳＰＥ−Ｃ抗血清との沈降により、ＳＰＥ−Ｃ発現に関してアッセイした。選択したコロニーの一つ由来の融解物は、精製ＳＰＥ−Ｃと同一の沈降線を形成した。PRlpUMN501由来の培養上清液は、検出可能な量のＳＰＥ−Ｃを含有せず、E．coliが毒素を分泌できないことを示した。サブクローニング pUMN501中の挿入物は、約４.０キロベースであり、sau3A部位に隣接していた( 図２)。XbaIでの消化は２.４および１.６キロベース断片を産生したが、そのいずれも、pUC13にライゲートし、E．coli JM101(それぞれpUCMN512およびpUMN511 )に形質転換したとき、speC発現を指示しなかった。大きなSau3A-SalI断片(３. ３キロベース)は、E．coli JM101(pUMN513)でspeCを発現した。遺伝子は、プラスミドプロモーターに関連してどちらの配向でも発現され、天然レンサ球菌プロモーターが挿入物中に存在し、E．coli中で機能性であることを示した。 speC遺伝子は、更に、３.３キロベースSau3A-SalI断片のM13バクテリオファージへのクローニングにより配置され、Dale et al．Plasmid 13:31-40(1985)の方法を使用して、欠失サブクローンを産生した。M13から単離し、pUC13にライゲートした１.７キロベース断片は(pUMN521)、E．coli中でspeCを発現できた。実施例２ E ．coli由来ＳＰＥ−Ｃの生化学的特徴付 UMN501によりコードされるＳＰＥ−Ｃを、エタノール沈殿、続くｐＨ３.５− １０の勾配の分取等電点電気泳動によりE．coli RRlの抽出物から部分的に精製した。E．coli由来毒素は、レンサ球菌由来毒素とほぼ同じ位置まで移動した(６ .５から７.２)。E．coliおよびレンサ球菌由来ＳＰＥ−ＣはSDS-PAGEで同じ分子量２４０００を有した。E．coli調製物には付加的なタンパク質が存在するが、ＳＰＥ−Ｃ特異的抗血清を使用した免疫ブロット法で試験したとき、２４０００ mwタンバク質のみが反応した。実施例３ E ．coli由来ＳＰＥ−Ｃの生物学的特徴付 E．coliおよびレンサ球菌由来ＳＰＥ−Ｃを、リンパ球分裂原性に関して比較した。ウサギ脾臓細胞(２×10⁵細胞)を約０.０１μgのS．pyogenesまたはE．col i(pUMN501)由来のＳＰＥ−Ｃに曝した。３日後、培養物を１μCi[³H]−チミジンでパルスし、２４時間インキュベートし、その後放射標識の細胞性ＤＮＡへの取りこみを定量した。両方の毒素調製物は、同様の有糸分裂促進応答を誘発した。ＳＰＥ−Ｃ抗血清とのインキュベーションは、両方のクローン化およびレンサ球菌由来毒素の有糸分裂促進応答を有意に減少させた。レンサ球菌およびE．coli由来ＳＰＥ−Ｃをまた、ウサギにおいて発熱性および致死性内毒素ショックの増強に関しても比較した。レンサ球菌およびE．coli 由来ＳＰＥ−Ｃは同様に発熱性であった；両方の調製物の平均体温上昇は、４時間後に１℃であった。発熱反応は、内毒素の特徴である二相性よりむしろ一相性であった。これは、発熱がＳＰＥ−Ｃに起因し、内毒素汚染によるものではないことを示す。両方のE．coliおよびレンサ球菌由来ＳＰＥ−Ｃ処置動物は、内毒素ショックの増加した感受性を示した。ＰＢＳおよび内毒素のみを投与されたウサギは全て生存した。これらの研究は、E．coli内でＳＰＥ−Ｃが生理学的に活性な形で発現され、ＳＰＥ−Ｃに起因するその作用が共精製したレンサ球菌汚染物によるものではないことを確認する。実施例４組換え製造ｓｐＥ−Ｃ(wt)のウサギへの投与および免疫化組換え製造したＳＰＥ−Ｃを、ウサギに７日間にわたり全量２００μg／in０. ２mlで投与した。結果は、ＳＰＥ−Ｃで処置した動物が、ＳＴＳＳの徴候を発症し、ほとんど全ての動物が７日間中に死亡した(データは示していない)。ウサギのＳＴＳＳの症状は、体重減少、下痢、顔の斑点、発熱、赤い結膜および粘膜よび透明な茶色の尿を含む。予期されるように、対照非毒素処理動物は健康なままであった。他の二つの大きな観察が成された：１)予期されるように、補液は動物に完全防御を提供する、そして２)毒素処理動物は壊死筋膜炎および筋炎を発症せず、ＳＰＥ−Ｃ以外の、またはＳＰＥ−Ｃに加えて、他の因子が軽い組織傷害に必要であることを示す。ＳＴＳＳの臨床的特徴の発症は、ＳＰＥ−Ｃの投与と相関する。実施例５ PCR を使用したＳＰＥ−Ｃの２重または３重変異の製造変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素またはその断片に２重または３重変異を産生するのに使用する多くの方法がある。アミノ酸配列に二個またはそれ以上の変化を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素は、先に記載のようにＰＣＲを使用して調製する。第１のＰＣＲ反応において、選択部位の第１の変化をコードする第１の内部プライマーを５'および３'フランキングプライマーと合わせて、第１のＰＣＲ産物を形成させた。第１のＰＣＲ産物は、アミノ酸配列に一個の変化を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列であった。この第１のＰＣＲ産物は、次いで、鋳型ＤＮＡとして働き、野性型ＳＰＥ−Ｃ活性を有するタンパク質と匹敵する、アミノ酸内に二つの変化を有する第２のＰＣＲ産物を産生した。第１のＰＣＲ産物は、第２の部位のアミノ酸の変化をコードする第２の内部プライマーと組み合わせた鋳型ＤＮＡであった。第２の内部プライマーをまた５'および３'フランキングプライマーと合わせ、第２のＰＣＲ産物を形成させた。第２のＰＣＲ産物は、アミノ酸配列の二箇所に変化を有する変化ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列であった。この第２のＰＣＲ産物を次いで第３の反応の鋳型として使用し、アミノ酸配列の第３の部位に変化を有する変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードする産物ＤＮＡ配列を形成させた。本方法は、アミノ酸配列に一個以上の変化を有する変異体毒素をコードするＤＮＡ配列の産生に使用される。一個以上の変化を有するＤＮＡ配列の製造の別法は、自動合成によるアミノ酸配列に一個またはそれ以上の変化を有するＤＮＡ配列の断片の製造である。次いで、断片を、数個の独特な制限部位を使用して、野性型ＳＰＥ−Ｃコード配列にサブクローン化する。制限部位は当業者に既知であり、野性型ＳＰＥ−ＣのＤＮＡ配列から容易に決定される。クローニングは、Revi et al．Nucleic Acid Res ．16:1030(1988)に記載のような３断片ライゲーション法の１段階で行う。実施例６ＳＰＥ−Ｃの１および２変異体の評価３種のＳＰＥ−Ｃの１アミノ酸変異体を製造した：ａ)１５位のチロシンがアラニンに代わったY15A、ｂ)１７位のチロシンがアラニンに代わったY17A、ｃ)３８位のアスパラギンがアラニンに代わったN38A。２種のＳＰＥ−Ｃの２アミノ酸変異体も製造した：ａ)Y15A/N38A、ｂ)Y17A/N38A。全変異体は、Quik Change法( Stratagene，La Jolla，CA)と、speC含有プラスミドpUMN521を鋳型として使用して構築した。pUMN521は、pUC13にＳＰＥ−Ｃ遺伝子(speC)を含む(Goshorn et al .)。１アミノ酸変異タンパク質は、１００ml培養のEshcerichia coli中に製造した。５０μg／mlアンピシリンの存在下での生育後、E．coli培養を４００mlの−２０℃エタノールで処理して細胞を融解させ、ＳＰＥ−Ｃ変異タンパク質を沈殿させた。E．coli中のpUMN521を、陽性対照として使用するために同等に処理した。毒素含量は２５μg／mlと概算された。 pUMN521由来の野性型ＳＰＥ−Ｃおよび３種の１アミノ酸変異体を、０.２５から２.５×１０^-5または２.５×１０^-6の範囲の毒素投与量で、ウサギ脾臓細胞増殖の誘導能を評価した。図７に示されるように、Y15AおよびN38A変異体は、野性型の約半分の細胞分裂誘導であった。Y17Aは本質的に非細胞分裂誘導であった (図８)。２重変異体Y15A/N38AおよびY17A/N38Aもまた、野性型毒素と比較したウサギ脾臓細胞を刺激する能力を試験した(図９)。両方の変異体は、同等量の野性型毒素で見られるよりも４分の１しかウサギ脾臓細胞を刺激しなかった。両方の２重変異体は内毒素ショック増強に関しても試験した。ウサギ３匹／群で皮内に変異体または野性型毒素５μg／kgで攻撃した。４時間後、同じ動物を１０μg／kgのSalmonella typhimurium内毒素(１／５０ＬＤ₅₀)で攻撃した。死亡を４８時間に渡り記録した(表４)。示されるように、２重変異体はウサギで致死性の原因とならなかった。表４：内毒素ショックへのウサギの感受性の増強におけるＳＰＥ−Ｃの２重アミノ酸変異体の能力注：表４に記載の実験において、全ウサギは５μg／kgタンパク質で、次いで４時間後に内毒素(１０μg／kg)で攻撃した。表４で使用したウサギの攻撃１週間後に、動物を死亡させ、全体的な組織傷害を試験した。肝臓、脾臓、腎臓、肺および心臓を含む全臓器は正常に見える。これは、２重変異体の毒性の欠失と一致する。ウサギ３匹／群をまた、２週間、フロイントの不完全アジュバントに乳化させた２５μｇのＳＰＥ−Ｃ２重変体で免疫化した。動物を次いで５日間安静にさせた。血液０.５mlを各動物から採血し、Y15A/N38AおよびY17A/N38A血清の収集物としてプールした。これらのプール由来の血清を、ペルオキシダーゼ基本ELISA( Hudson and Hay引用文献)で、精製レンサ球菌由来野性型SPE-Aに対する抗体に関して免疫前プール血清と比較した。表５はELISAの結果を要約する。表５：ＳＰＥ−ＣのY15A/N38AおよびY17A/N38A変異体に対して免疫化したウサギのELISA抗体力価＊＊抗体に対して試験する血清は、最初の１：１０希釈を２倍に希釈した。抗体の力価は、４９０nmで０.１またはそれより大きい吸光度となる最後の希釈の逆数である。免疫化動物を５μg／kgの野性型ＳＰＥ−Ｃで、続いて４時間後に１０μg／kg のSalmonella typhimurium内毒素で攻撃し、致死性に対する免疫化の能力を試験した。表６は、動物が攻撃から保護され、従って、ＳＰＥ−Ｃに免疫性であることを示す。表６：Y15A/N38AおよびY17A/N38A免疫化動物の野性型ＳＰＥ−Ｃおよび内毒素での攻撃更なるＳＰＥ−Ｃの１アミノ酸変異体も製造した。これらは毒性に必要であり得る３つの主要ドメインの残基を含む。これらはＴ細胞受容体結合ドメイン、クラスII ＭＨＣ結合ドメインおよび中心対角線アルファヘリックスの後方と相同な残基を含む。残基の変化および変異のＴ細胞有糸分裂促進における作用を表７に記載する。表７：Ｔリンパ球細胞分裂および致死性におけるＳＰＥ−Ｃの変異の作用ａ０.１μg／ウェル投与量で比較。ｂ内毒素に対する感受性の増強のために死んだウサギの数／注射総数；野性型ＳＰＥ−Ｃを投与した２／２動物が死亡した。本発明は、種々の具体的で好ましい態様および方法について記載している。しかしながら、多くの変法および修飾が、本発明の精神および範囲内で成し得ることは理解されよう。本明細書に引用の全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の技術者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物および特許出願に、個々に示すのと同じ程度に、本明細書に出典明示により包含させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ミッチェル，デイビッド・ティアメリカ合衆国55127ミネソタ州バドネイス・ハイツ、センタービル・ロード4217番 (72)発明者ガー，パメラ・ジェイアメリカ合衆国55125ミネソタ州ウッドベリー、ホースシュー・レイン2728番

Claims

【特許請求の範囲】１．変異体が少なくとも１つのアミノ酸の変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に実質的に対応するタンパク質に比べて実質的に非致死的である、変異体ＳＰＥ− Ｃまたはその断片。２．変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素が１−６のアミノ酸置換を含み、少なくとも１つの置換アミノ酸が、Ｂサブユニットのβバレル、Ｎ末αヘリックス、対角αヘリックスまたはサブユニットＡとサブユニットＢとの間の表面溝に位置する、請求項１の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。３．変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素が１−６のアミノ酸置換を含み、少なくとも１つの置換アミノ酸がアスバラギン−１２、チロシン−１５、チロシン−１７、ヒスチジン−３５、アスパラギン−３８、リシン１３５、リシン１３８、チロシン−１３９、アスパラギン酸−１４２である、請求項１の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。４．少なくとも１つのアミノ酸置換がアスパラギン−１２のアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、セリン、トレオニンへの置換、チロシン−１５のフェニルアラニン、アラニン、グリシン、セリン、トレオニンへの置換、チロシン−１７のフェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニンへの置換、ヒスチジン−３５のフェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニンへの置換、アスパラギン−３８のアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンへの置換、リシン１３５のグルタミン酸またはアスパラギン酸への置換、リシン１３８のグルタミン酸またはアスパラギン酸への置換、チロシン−１３９のフェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニンへの置換、アスパラギン酸−１４２のアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニンへの置換を含む、請求項３の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。５．少なくとも１つのアミノ酸置換がアスパラギン−１２のアラニンへの置換、トレオニン−１５のアラニンへの置換、トレオニン−１７のアラニンへの置換、ヒスチジン−３５のアラニンへの置換、アスパラギン−３８のアスパラギン酸への置換、リシン１３５のアスバラギン酸への置換、リシン１３８のアスパラギン酸への置換、トレオニン−１３９のアラニンへの置換、アスパラギン酸−１４２のアスパラギンへの置換を含む、請求項４の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。６．少なくとも１つのアミノ酸置換がトレオニン−１５およびアスパラギン−３８の置換を含む、請求項３の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。７．置換がトレオニン−１５のアラニンへの置換およびアスパラギン−３８のアラニンへの置換である、請求項６の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。８．少なくとも１つのアミノ酸置換がトレオニン−１７およびアスパラギン−３８の置換を含む、請求項３の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。９．置換がチロシン−１７のアラニンへの置換およびアスパラギン−３８のアラニンへの置換である、請求項８の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。１０．変異体が少なくとも１つの下記特性：変異体がＴ細胞分裂原生を低下さす、変異体が内毒素ショックを実質的に高めない、変異体が致死性でない、変異体が致死性でなく、野生型ＳＰＥ−Ｃ毒素に匹敵する分裂原性を保持することを有する、請求項１の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素。１１．少なくとも１つの請求項１の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素の有効量を含む、野生型ＳＰＥ−Ｃの少なくとも１つの生物活性に対して動物を保護するワクチン。１２．請求項１のＳＰＥ−Ｃ毒素と薬理学的に許容される担体との混合物を含む医薬組成物。１３．請求項１の変異体ＳＰＥ−Ｃ毒素をコードするＤＮＡ配列。１４．請求項１３のＤＮＡを含む安定な形質転換宿主細胞。１５．請求項１１のワクチンを動物に投与することを含む、野生型ＳＰＥ−Ｃの少なくとも１つの生物活性に対して動物を保護する方法。１６．請求項１１のワクチンを動物に投与することを含む、毒性ショックに関連する症状を軽減する方法。