JP2021523908A - 連鎖球菌毒素性ショック症候群 - Google Patents

Abstract

【課題】本明細書では、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質（その断片、多様体、または誘導体を含む）、あるいは前記Ｍタンパク質に結合するかそれに対して産生された抗体と、必要に応じて、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質（その断片、多様体、または誘導体を含む）、あるいは前記スーパー抗原タンパク質に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片とを投与することによって、対象で連鎖球菌毒素性ショック症候群に対して免疫を付与する、治療する、または予防する方法を提供する。【選択図】図１３

Description

本発明は、Ａ群連鎖球菌によって引き起こされる疾患の予防および治療に関する。より詳細には、本発明は、Ａ群連鎖球菌に関連する毒素性ショック症候群を治療または予防するための抗体または抗体断片に関する。

Ａ群連鎖球菌（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ＧＡＳ）感染症は、社会の全区域で非常に蔓延しており、６億件を超える連鎖球菌咽頭炎の発生症例、および１億６千万件を超える連鎖球菌膿皮症の有病症例があると推定される。症例のうちの大多数は良性であり、抗生物質および基本的な健康管理によってうまく治療することができる。しかし、連鎖球菌疾患は、喉や皮膚を通り抜けて進行し、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）などの侵襲性ＧＡＳ（「ｉＧＡＳ」）疾患を引き起こす可能性がある。さらに、感染症を治療しなければ、リウマチ性心臓疾患や糸球体腎炎など、その後の連鎖球菌続発症を引き起こす可能性がある。ｉＧＡＳ疾患および連鎖球菌続発症は、アボリジニおよびトレス海峡諸島民の集団の間、さらには世界中の社会的に不利な集団の間で特に蔓延している。

世界で、これらの病気は年間５０万人を超える命が失われる原因となっている。控えめな見積もりで、現在、ＧＡＳは世界で（ＨＩＶ、結核、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）に次いで）４番目に多い感染症関連死の原因と位置付けられている。これらの数は「氷山の一角」と考えられており、現在、先進国でも発展途上国でもｉＧＡＳ疾患が流行している。

ＳＴＳＳは主に、ヒトＭＨＣ（主要組織適合性複合体）ＩＩ分子（ペプチド結合溝の外側）およびＴ細胞受容体可変鎖に非特異的に結合するスーパー抗原毒素によって引き起こされ、ポリクローナルＴ細胞の活性化をもたらす（多くの場合、２０％を超えるＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される）。これは、低血圧および（肝臓、腎臓、凝固系および呼吸器系を含む）多臓器不全の原因として提案された因果関係である、Ｔｈ１サイトカインストームをもたらす。

マウスモデルでは、Ｔ細胞がスーパー抗原による死亡に必要であることが示されている。ブドウ球菌スーパー抗原（ＳＥＢ）を使用したモデルでは、抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）前治療が毒素性ショックの致死性を阻害できることも示された［２］。ＳＴＳＳは、高所得の国でも非常に高い（５０％を超える可能性がある）死亡率を有している。この病気は、どのような連鎖球菌感染後にも発生する可能性があるが、最も一般的には皮膚の感染後に発生する。これは通常、壊死性筋膜炎、筋炎、または深部の皮下出血に関連している。水痘、蜂巣炎、および直接的な皮膚穿刺が重要な補助要因になり得る。

スーパー抗原（ＳＡｇ）は、すべての病原性ＧＡＳおよび黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株によって分泌される低分子量の細胞外タンパク質である。ＧＡＳには１１種の血清学的に異なるスーパー抗原がある。１１種のうち９種は、バクテリオファージに存在する遺伝子に位置する。それらは初代Ｔ細胞を活性化することができ、抗原処理を必要としない。スーパー抗原は、ヒトＭＨＣＩＩβ鎖と高い親和性結合、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）β鎖と相対的に低い親和性結合を示す。マウスＭＨＣに対するスーパー抗原の親和性は、ヒトＭＨＣに対してよりも数桁の規模で低い［３］ため、健常なマウスはスーパー抗原による疾患を研究するのに適したモデルではない。ＧＡＳに存在し得る１１種のスーパー抗原のうち、ＳＴＴＳのほとんどの症例は、連鎖球菌発熱性外毒素（Ｓｐｅ）ＡまたはＳｐｅＣのいずれかによって引き起こされる［４］。

ＳＴＳＳを予防するためのワクチンを開発する取り組みはわずかである。ある研究集団は、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＣに対する類毒素を開発し、ウサギへのワクチン接種によって、毒素を中和し、ミニ浸透圧ポンプを介して投与された天然毒素からウサギを防御する抗体を導くことができることを示している。ウサギは、連鎖球菌感染症にさらされていなかった［４、５］。このワクチン手法には、連鎖球菌疾患の一側面のみから防御するために複数の類毒素をワクチン接種する必要があるという弱点がある。

ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）形質転換マウスをモデルとして用いて、黄色ブドウ球菌由来のスーパー抗原の既知の非毒性断片を使用して候補ワクチンが開発されている［３］。これらのマウスは、その生物ではなく組換えスーパー抗原で攻撃された。

ＳＴＳＳを治療する手段として、受動免疫療法が検討されている。免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）は、ＳＴＳＳの致死率を有意に低下させることが分かっている［６］。この研究では歴史的対照（過去の試験成績を比較の対象とすること）を使用したが、これより最近の６７人の患者を対象としたスウェーデンの前向き対照研究では、死亡率は、抗生物質のみで治療された４４人の患者のうち２２人（５０％）であったのに対し、ＩＶＩＧと抗生物質で治療された群では２３人中３人（１３％）であった（Ｐ＜０．０１）［７］。ただし、臨床的利益のためには、ＩＶＩＧで４０を超えるスーパー抗原抗体価が必要であると推定されている。これは、ＩＶＩＧに見られる特異的抗体の量に近いため、ＩＶＩＧの複数回投与が推奨される。ＩＶＩＧはコストが高く、バッチ間のばらつきがあり［８］、供給が難しいことから、代わりの補助療法の必要性が強調されている。

意外なことに、本発明者らは、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質断片またはその多様体に結合する抗体または抗体断片が、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原断片またはその多様体に結合する抗体または抗体断片との併用または単独使用で、意外にも連鎖球菌毒素性ショック症候群などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対して有効であることを発見した。

したがって、包括的な形態で、本発明は、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含む侵襲性ＧＡＳ（ｉＧＡＳ）疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対する受動免疫付与、治療、または予防のための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合する抗体または抗体断片、ならびに必要に応じて、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合する抗体または抗体断片の使用に関する。

別の包括的な形態で、本発明は、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含む侵襲性ＧＡＳ（ｉＧＡＳ）疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対するワクチン接種または免疫付与、治療または予防のための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、その多様体、または誘導体、ならびに必要に応じて、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体の使用に関する。

本発明の一側面は、哺乳動物に連鎖球菌毒素性ショック症候群に対する受動免疫を付与する方法であって、前記哺乳動物にＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与することによって、前記哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群に対する受動免疫を前記哺乳動物に付与する工程を含む、方法を提供する。

上記側面の特定の一態様では、前記方法は、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を前記哺乳動物に投与する工程をさらに含む。

本発明の別の側面は、哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群を治療または予防する方法であって、前記哺乳動物にＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与することによって、前記哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群を治療または予防する工程を含む、方法を提供する。

上記側面の特定の一態様では、前記方法は、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を前記哺乳動物に投与する工程をさらに含む。

本発明のさらなる側面は、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を含む、哺乳動物への投与に適した組成物を提供する。

本側面の一態様では、前記組成物は、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片をさらに含む。

上記側面について、前記抗体または抗体断片は、好適にはモノクローナル抗体または抗体断片である。上記側面の特定の一態様では、前記モノクローナル抗体または抗体断片は、組み換えヒト化モノクローナル抗体またはその断片である。

関連の側面では、本発明は、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体と、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体とを含む、哺乳動物への投与に適した組成物に属する。

本発明のさらなる関連の側面は、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生されたモノクローナル抗体またはその断片；ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を提供する。

好ましくは、前記モノクローナル抗体または断片は、組換えヒト化モノクローナル抗体またはその断片である。

この側面はさらに、前記組換えヒト化モノクローナル抗体またはその断片をコードする単離核酸、前記単離核酸を含む遺伝子構築物、ならびに／あるいは前記遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。

上記側面の特定の態様では、前記Ｍタンパク質断片は、前記Ｍタンパク質の保存領域であるかそれを含む。一態様では、前記Ｍタンパク質断片は、ｐ１４５ペプチドであるか、それを含むか、それに含まれる。

特定の一態様では、前記Ｍタンパク質断片は、Ｊ８ペプチド、その断片、多様体、または誘導体であるか、それに含まれるか、それを含む。

別の特定の態様では、前記断片は、ｐ１７ペプチド、その断片、多様体、または誘導体であるか、それに含まれるか、それを含む。

上記側面の別の特定の態様では、前記スーパー抗原は、連鎖球菌発熱性外毒素（Ｓｐｅ）ＡまたはＳｐｅＣである。
好適には、上記側面によれば、前記哺乳動物はヒトである。

本明細書で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、ここでは単数または複数の構成要素または特徴を指すか包含するように使用されており、「１つの」または「単一の」構成要素または特徴を意味または定義すると解釈されるべきではない。

特に文脈から求められない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語または類似の用語は非排他的に含むことを意味するよう意図されており、したがって、列挙された構成要素または特徴の一覧は、記載または列挙された構成要素のみを含むのではなく、列挙または記載されていない他の構成要素または特徴を含んでもよい。

アミノ酸配列に関する「本質的にからなる（consisting essentially of）」という用語は、記載されたアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にさらに１個、２個、または３個のアミノ酸を有することを意味される。

図１：（Ａ〜Ｂ）ＨＬＡ−Ｂ６マウスにおけるGAS SN1の感染力。無感作のＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウス（ｎ＝１０／群）を経皮的にGAS SN1に感染させた。感染後６日目にマウスを選別し、皮膚の細菌負荷を評価した（Ａ）。感染後３日目、４日目、５日目、および６日目に血液試料を蒔くことで、全身感染の存在を評価した（Ｂ）（＊＊＊はｐ＜０．００１を示す）。（Ｃ〜Ｄ）ＳＮ１感染マウスの血清のウェスタンブロット分析。ＳＮ１に感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ）、ならびにＳＮ１およびＮＳ３３（スーパー抗原を発現しないＣ群連鎖球菌）に感染させたＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウス（Ｄ）から採取した血清試料を分析して、それらの血清中のＳｐｅＣの存在を検出した。試料を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜を一次抗体であるウサギ抗ＳｐｅＣ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰで検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて発色させた。ＳＮ１感染マウスの血清試料における約２６ＫＤａのバンドは、陽性対照試料中のｒＳｐｅＣに対応する。

図２：（Ａ）マウスモデルにおけるＳｐｅＣの分裂促進活性。ＳＮ１のＳｐｅＣに応答した脾細胞の増殖。ＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの脾細胞を、SN1 GAS感染マウスのＳｐｅＣを含む滅菌濾過済み血清またはｒＳｐｅＣのいずれかを用いてインビトロで刺激した。対照として、スーパー抗原陰性ＧＡＳ株（ＮＳ３３）およびＣｏｎＡに感染したマウスの滅菌濾過済み血清も含めた。脾細胞の増殖を７２時間後に評価した。データを刺激指数（ＳＩ）で表す。応答の特異性を、血清およびｒＳｐｅＣに応答した脾細胞の増殖を阻害する抗ｒＳｐｅＣ抗体を添加することによって確認した。（Ｂ〜Ｃ）脾細胞増殖後のサイトカイン応答特性。ＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの脾細胞におけるサイトカイン応答を、様々な刺激物質と共にインキュベートした７２時間後に測定した。培養上清中のＴＮＦ（Ｂ）およびＩＦＮ−γ（Ｃ）の濃度をＣＢＡキットで測定した。応答の特異性を、抗ｒＳｐｅＣ抗体を添加することによって確認した。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間の有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ＳＩは、抗原の存在下での１分間のカウント／抗原の非存在下での１分間のカウントと定義された。

図３：（Ａ）GAS SN1感染に対するＪ８−ＤＴの防御効果。ＨＬＡ−Ｂ６マウスにＪ８−ＤＴまたはＰＢＳを０日目、２１日目、および２８日目に接種した。免疫付与の２週間後、マウスを経皮的にGAS SN1に感染させた。感染後６日目にマウスを選別し、皮膚の細菌負荷（ＣＦＵ／病変）、血液の細菌負荷（ｃｆｕ／ｍＬ）、および脾臓の細菌負荷（ＣＦＵ／脾臓）を示す。（Ｂ）血清中の毒素を検出するウェスタンブロット分析。ＳＮ１感染後６日目に採取した接種および対照コホートの貯蔵血清試料を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜をウサギ抗SpeC IgGで調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰで検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて発色させた。ＰＢＳマウスの血清試料における２６ＫＤａのバンドは、陽性対照試料中のｒＳｐｅＣに対応する。（Ｃ〜Ｄ）接種を受けた感染マウスの血清によって誘導された増殖の評価。２人の異なる個体のＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、ＳＮ１に感染した接種（Ｊ８−ＤＴ＋ＳＮ１）または非接種対照（ＰＢＳ＋ＳＮ１）マウスの事前に最適化された濃度の血清で刺激した。ＰＨＡおよびｒＳｐｅＣを刺激に関する対照として使用した。応答の特異性を、様々な量のｒＳｐｅＣ抗血清を添加することによって評価した。無感作血清の存在下でのＰＢＭＣを中和の特異性に関する対照として使用した。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）である。２人の個体の代表的なデータを示す。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図４：（Ａ〜Ｃ）ｒＳｐｅＣ抗血清によるｒＳｐｅＣの中和。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、様々な量のｒＳｐｅＣ抗血清の存在下または血清の非存在下で、異なる濃度のｒＳｐｅＣで刺激した。ＰＨＡを対照として使用した。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。刺激指数（ＳＩ）は、抗原の存在下での１分間のカウント／抗原の非存在下での１分間のカウントと定義された。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図５：（Ａ）Ｊ８−ＤＴ抗血清と共にインキュベートしたＧＡＳを用いた攻撃試験。GAS 2031（ｅｍｍ１）株を、Ｊ８−ＤＴ抗血清の１：５０希釈液と共に４℃で１時間回転させながらインキュベートした。洗浄後、接種菌液をＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した。４８時間後、マウスを選別し、血液を採取した。個々のマウスの細菌負荷を示す。（Ｂ）ｒＳｐｅＣ抗血清によるＳｐｅＣのインビボでの中和。ＳＮ１に感染したＢＡＬＢ／ｃマウスに、感染後５日目に抗ｒＳｐｅＣまたは無感作血清を腹腔内投与した。インビボでのＳｐｅＣ中和を評価するために、抗血清投与の前（０時間）と、次いで投与の６時間後および２４時間後に血清試料を採取した。様々な時点でのマウス血清中のＳｐｅＣの存在を示す。（Ｃ）皮膚の細菌負荷に対するｒＳｐｅＣ抗血清治療の効果。ＳＮ１に感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスに、感染後５日目に抗ｒＳｐｅＣまたは無感作血清を腹腔内投与した。治療の２４時間後、マウスを選別し、細菌負荷を評価した。治療を受けたマウスと未治療のマウスの皮膚の細菌負荷を示す。ノンパラメトリックな独立性検定であるマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計分析を行い、２つの群を比較した。＊＊はｐ＜０．０１を示す。

図６６-１：（Ａ〜Ｂ）マウス皮膚感染モデルにおけるヒト分離株の病原性。ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホートを、皮膚感染経路を介してGAS SN1またはGAS NS33株に感染させた。攻撃の３日後、６日後、または９日後にマウスを選別し、皮膚生検（Ａ）および脾臓（Ｂ）試料を採取して細菌負荷を決定した。結果を箱ひげ図で示す。箱内の線は中央値を示し、箱の両端は上下の四分位数を示し、ひげは最小値から最大値を示す。 図６-２：（Ｃ）６日目に採取した個々のマウス血清試料でのＳｐｅＣ検出。記載のとおり、ＳＮ１／ＮＳ３３感染後６日目の個々のマウスの血清試料におけるＳｐｅＣの存在についても評価した。代表的な画像を示す。「＊」は陽性の脾臓培養物を有していたマウスを示す。ノンパラメトリックな独立性検定であるマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計分析を行い、２つの群を各時点で比較した。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図７：（Ａ）マウスモデルにおけるＳｐｅＣの分裂促進活性。ＳＮ１のＳｐｅＣに応答した脾細胞の増殖。ＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの脾細胞を、SN1 GASに感染したマウスのＳｐｅＣを含む滅菌濾過済み血清またはｒＳｐｅＣのいずれかでインビトロで刺激した。対照として、スーパー抗原陰性ＧＡＳ株（ＮＳ３３）およびＣｏｎＡに感染したマウスの滅菌濾過済み血清も含めた。脾細胞の増殖を７２時間後に評価した。データを刺激指数（ＳＩ）で表す。応答の特異性を、血清およびｒＳｐｅＣに応答した脾細胞の増殖を阻害する抗ｒＳｐｅＣ抗体を添加することによって確認した。（Ｂ〜Ｃ）脾細胞増殖後のサイトカイン応答特性。ＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの脾細胞におけるサイトカイン応答を、様々な刺激物質と共にインキュベートした７２時間後に測定した。培養上清中のＴＮＦ（Ｂ）およびＩＦＮ−γ（Ｃ）の濃度をＣＢＡキット（BD Biosciences）で測定した。応答の特異性を、抗ｒＳｐｅＣ抗体を添加することによって確認した。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間で有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ＳＩは、抗原の存在下での１分間のカウント／抗原の非存在下での１分間のカウントと定義された。（Ｄ〜Ｆ）GAS SN1またはGAS NS33に感染したマウスの血清による刺激に応答した、ヒトＰＢＭＣの増殖。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、GAS SN1またはGAS NS33の感染後の様々な時点で採取した血清の存在下で培養した。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。

図８：（Ａ〜Ｂ）ＨＬＡ−Ｂ６マウスにおけるGAS SN1のインビボでの感染力。無感作のＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウス（ｎ＝１０／群）をＧＡＳ感染の腹腔内経路でGAS SN1に感染させた。マウスは、１０⁶、１０⁷、または１０⁸ＣＦＵのＳＮ１を受けた。感染の２４時間後、マウスの臨床症状を成績にして疾患の重症度を評価した。ＨＬＡ−Ｂ６マウスとＢ６マウスの両方の臨床成績を示す。（Ｂ）成績評価の後、マウスを選別し、血液および脾臓の細菌負荷を評価した。結果を箱ひげ図で示す。箱内の線は中央値を示し、箱の両端は上下の四分位数を示し、ひげは最小値から最大値を示す。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、対照群と試験群との間で有意性を計算した。（Ｃ）ＳＮ１に感染したＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの血清のウェスタンブロット分析。ＳＮ１感染マウスから採取した血清試料を分析して、それらの血清中の毒素を検出した。試料を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜を一次抗体であるウサギ抗SpeC IgGで調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰで検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて発色させた。ｒＳｐｅＣタンパク質も陽性対照として泳動した。（Ｄ〜Ｆ）ＳＮ１の腹腔内感染後のＨＬＡ−Ｂ６マウスの血清サイトカイン応答特性。ＳＮ１感染マウスを感染の２４時間後に選別した。ＣＢＡキットを使用して、最高用量（１×１０⁸ＣＦＵ）のＳＮ１を受けたコホートから採取した血液試料で血中サイトカイン濃度を測定した。ＴＮＦ、ＩＦＮ−Υ、およびＩＬ−２応答を示す。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間で有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ＳＩは、抗原の存在下での１分間のカウント／抗原の非存在下での１分間のカウントと定義された。

図９-１：（Ａ〜Ｂ）ＨＬＡ−Ｂ６マウスにおけるGAS SN1の感染力。無感作のＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウス（ｎ＝１０／群）を経皮的にGAS SN1またはGAS NS33に感染させた。感染後６日目にマウスを選別し、皮膚の細菌負荷を評価した（Ａ）。感染後３日目、４日目、５日目、および６日目に血液試料を蒔くことによって、全身感染の存在を評価した（Ｂ）。結果を箱ひげ図で示す。箱内の線は中央値を示し、箱の両端は上下の四分位数を示し、ひげは最小値から最大値を示す。（Ｃ）ＳＮ１またはＮＳ３３感染マウスの血清のウェスタンブロット分析。ＳＮ１またはＮＳ３３に感染させたＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスから採取した血清試料を分析して、それらの血清中のＳｐｅＣの存在を検出した。試料を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜を一次抗体であるウサギ抗SpeC IgGで調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰで検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて発色させた。ＳＮ１感染したマウスの血清試料における２６ＫＤａのバンドは、陽性対照試料中のｒＳｐｅＣに対応する。 図９-２：（Ｄ〜Ｆ）皮膚感染後のＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの血清におけるサイトカイン応答。ＳＮ１またはＮＳ３３に感染させた６日後、ＨＬＡ−Ｂ６およびＢ６マウスの血清におけるサイトカイン応答を測定した。ＴＮＦ（Ｃ）、ＩＦＮ−Υ（Ｄ）、およびＩＬ−２の濃度をＣＢＡキットで測定した。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間で有意性を計算した。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図１０-１：（Ａ）GAS SN1感染に対するＪ８−ＤＴの防御効果。ＨＬＡ−Ｂ６マウスにＪ８−ＤＴまたはＰＢＳを０日目、２１日目、および２８日目に接種した。免疫付与の２週間後、マウスを経皮的にGAS SN1に感染させた。感染後６日目にマウスを選別し、皮膚の細菌負荷（ＣＦＵ／病変）、血中の細菌負荷（ｃｆｕ／ｍＬ）、および脾臓の細菌負荷（ＣＦＵ／脾臓）を示す。（Ｂ）血清中の毒素を検出するウェスタンブロット分析。ＳＮ１感染後６日目に採取した接種および対照コホートの貯蔵血清試料を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜をウサギ抗SpeC IgGで調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰで検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて発色させた。ＰＢＳマウスの血清試料における２６ＫＤａのバンドは、陽性対照試料中のｒＳｐｅＣに対応する。 図１０-２：（Ｃ〜Ｄ）皮膚感染後のＨＬＡ−Ｂ６マウスの血清におけるサイトカイン応答。ＳＮ１による感染の６日後、接種および対照ＨＬＡ−Ｂ６マウスの血清におけるサイトカイン応答を測定した。ＩＬ−４およびＩＬ−１０（Ｃ）、ならびにＴＮＦおよびＩＦＮ−Υ（Ｄ）の濃度をＣＢＡキットで測定した。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間で有意性を計算した。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。（Ｅ〜Ｇ）接種を受けた／対照の感染マウスの血清によって誘導された増殖の評価。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、接種を受けたＳＮ１感染マウス（Ｊ８−ＤＴ＋ＳＮ１）または接種を受けていないＳＮ１感染マウス（ＰＢＳ＋ＳＮ１）の事前に最適化された濃度の血清で刺激した。ＰＨＡおよびｒＳｐｅＣを刺激に関する対照として使用した。応答の特異性を、様々な量のｒＳｐｅＣ抗血清を添加することによって評価した。無感作血清の存在下でのＰＢＭＣを中和の特異性に関する対照として使用した。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。２人の個体の代表的なデータを示す。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図１１-１：接種を受けた血清および対照血清による刺激後のＰＢＭＣのサイトカイン応答。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、接種を受けたＳＮ１感染マウスまたは対照のＳＮ１感染マウスの事前に最適化された濃度の血清で刺激した。最適濃度のｒＳｐｅＣおよびＰＨＡを刺激に関する陽性対照として使用した。接種を受けたＳＮ１感染血清または対照のＳＮ１感染血清またはｒＳｐｅＣを含む選択されたウェルに、事前に最適化された量（２０μＬ）のｒＳｐｅＣ抗血清を添加することによって、ｒＳｐｅＣ抗血清の阻害効果を評価した。培地のみのウェルを陰性対照として使用した。インビトロでの培養の７２時間後、サイトカイン応答をＣＢＡキットで測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。ノンパラメトリックな独立性検定であるマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計分析を行い、２つの群を比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。 図１１-２：接種を受けた血清および対照血清による刺激後のＰＢＭＣのサイトカイン応答。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、接種を受けたＳＮ１感染マウスまたは対照のＳＮ１感染マウスの事前に最適化された濃度の血清で刺激した。最適濃度のｒＳｐｅＣおよびＰＨＡを刺激に関する陽性対照として使用した。接種を受けたＳＮ１感染血清または対照のＳＮ１感染血清またはｒＳｐｅＣを含む選択されたウェルに、事前に最適化された量（２０μＬ）のｒＳｐｅＣ抗血清を添加することによって、ｒＳｐｅＣ抗血清の阻害効果を評価した。培地のみのウェルを陰性対照として使用した。インビトロでの培養の７２時間後、サイトカイン応答をＣＢＡキットで測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。ノンパラメトリックな独立性検定であるマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計分析を行い、２つの群を比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。 図１１-３：接種を受けた血清および対照血清による刺激後のＰＢＭＣのサイトカイン応答。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、接種を受けたＳＮ１感染マウスまたは対照のＳＮ１感染マウスの事前に最適化された濃度の血清で刺激した。最適濃度のｒＳｐｅＣおよびＰＨＡを刺激に関する陽性対照として使用した。接種を受けたＳＮ１感染血清または対照のＳＮ１感染血清またはｒＳｐｅＣを含む選択されたウェルに、事前に最適化された量（２０μＬ）のｒＳｐｅＣ抗血清を添加することによって、ｒＳｐｅＣ抗血清の阻害効果を評価した。培地のみのウェルを陰性対照として使用した。インビトロでの培養の７２時間後、サイトカイン応答をＣＢＡキットで測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。ノンパラメトリックな独立性検定であるマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計分析を行い、２つの群を比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

図１２：（Ａ）ｒＳｐｅＣ抗血清によるＳｐｅＣのインビボでの中和。ＨＬＡ−Ｂ６マウスを経皮的にGAS SN1に感染させた。感染後５日目にマウスに抗ｒＳｐｅＣまたは無感作血清を腹腔内投与した。インビボでのＳｐｅＣ中和を評価するために、抗血清投与の前（０時間）と、次いで投与の６時間後および２４時間後に血清試料を採取した。様々な時点での治療および未治療ＨＬＡ−Ｂ６マウス血清中のＳｐｅＣの存在を示す。（Ｂ）ｒＳｐｅＣ抗血清の治療可能性。ｒＳｐｅＣ抗血清の治療可能性を評価するために、血清投与の６時間後および２４時間後、指定数のマウスを選別した。治療を受けたマウスと未治療のマウスの皮膚および血液の細菌負荷を示す。結果を箱ひげ図で示す。箱内の線は中央値を示し、箱の両端は上下の四分位数を示し、ひげは最小値から最大値を示す。ＮＳ（有意差なし）はｐ＞０．０５を示す。

図１３-１：併用免疫療法の治療可能性。（Ａ）感染のタイムラインおよび治療手順（Ｂ）ＨＬＡ−Ｂ６マウスの４つのコホート（ｎ＝３〜５／群）を、事前に最適化された用量のGAS SN1で腹腔内感染させた。感染の１８時間後のマウスの臨床症状を成績評価し、抗Ｊ８−ＤＴ、抗ｒＳｐｅＣ、抗Ｊ８−ＤＴと抗ｒＳｐｅＣの組み合わせ、または無感作血清を２００μＬ静脈内投与した。治療の２４時間後（感染の４２時間後）にマウスの臨床成績を評価した後、選別した。細菌の定量化のために血液および脾臓の試料を採取、処理し、蒔いた。マウスの血液および脾臓の細菌負荷を示す。（Ｃ）治療の前後にすべてのマウスの臨床症状を成績評価して疾患の重症度を評価した。抗血清治療前（０時間）および後（２４時間）のすべてのコホートの臨床成績を示す。 図１３-２：（Ｄ〜Ｇ）インビボでのＳｐｅＣ中和を評価するために、抗血清投与の前（０時間）と、次いで投与の２４時間後にすべてのコホートから血清試料を採取した。Ｊ８−ＤＴ抗血清（Ｄ）、ｒＳｐｅＣ抗血清（Ｅ）、Ｊ８−ＤＴ＋ｒＳｐｅＣ抗血清（Ｆ）、またはＰＢＳ抗血清（Ｇ）で治療したＨＬＡ−Ｂマウスの血清における治療前後のＳｐｅＣの存在を示す。マン・ホイットニーの検定を行い、各群を対照ＰＢＳ治療群と比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、ＮＳはｐ＞０．０５を示す。

図１４：（Ａ）Ａ群連鎖球菌抗原に応答した脾細胞の増殖と抗血清による阻害。（Ａ）ＳＮ１に感染した血清に応答した増殖と抗血清によるその阻害の評価。Ｊ８−ＤＴ、ｒＳｐｅＣ、Ｊ８−ＤＴ＋ｒＳｐｅＣ、またはＰＢＳ抗血清の存在下または非存在下で、SN1 GAS感染マウスのＳｐｅＣを含む血清に応答した脾細胞の増殖を評価した。（Ｂ）ｒＳｐｅＣ、ｒＭ１、またはｒＳｐｅＣ＋ｒＭ１で刺激した脾細胞も対照として含めた。阻害剤としてＪ８−ＤＴ、ｒＳｐｅＣ、またはＪ８−ＤＴ＋ｒＳｐｅＣ抗血清を用いた。脾細胞の増殖を７２時間後に評価した。データを刺激指数（ＳＩ）で表す。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、ＮＳはｐ＞０．０５を示す。

図１５-１：SigmaのGenElute細菌ｇＤＮＡ抽出キットを用いて、一晩培養した定常期培養液からゲノムＤＮＡを抽出した。Nanodrop1000を用いてｇＤＮＡを認定し、次いで２μｇのｇＤＮＡをスーパー抗原の増幅に使用した。次に、画像の凡例に従ってゲルを通過させた。 図１５-２：SigmaのGenElute細菌ｇＤＮＡ抽出キットを用いて、一晩培養した定常期培養液からゲノムＤＮＡを抽出した。Nanodrop1000を用いてｇＤＮＡを認定し、次いで２μｇのｇＤＮＡをスーパー抗原の増幅に使用した。次に、画像の凡例に従ってゲルを通過させた。

図１６：マウス血液中のＧＡＳヒト分離株のインビトロでの増殖。ＧＡＳ分離株を１％ネオペプトンを含むＴＨＢで一晩増殖させた。各分離株を１０^-6まで段階希釈し、ヘパリン処理した新鮮なマウス血液と１：３の比率でインキュベートした。３７℃で３時間インキュベートした後、マウスの血液中の細菌増殖を測定し、開始培養液のＣＦＵカウントと比較した。ＣＦＵの２０倍を超える増加を示す分離株を、マウスモデルで全身の連鎖球菌感染症を引き起こす可能性が高い分離株として定義した。示されているデータは各分離株の平均±ＳＥＭである。

図１７：GAS NS1またはGAS NS33に感染したマウスの血清による刺激に応答したヒトＰＢＭＣの増殖応答。３人の異なる個体のＰＢＭＣを、異なる容量のGAS SN1またはGAS NS33感染マウスから採取した血清で刺激した。ＰＨＡを対照として使用した。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。データは、実験を２回繰り返し、各実験につき３回反復測定した平均値±ＳＥＭである。テューキーの事後検定法を用いた一元配置分散分析を利用して、様々な群の間で有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

本発明は、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合する抗体または抗体断片が、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合する抗体または抗体断片との併用または単独使用で意外にも連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含む侵襲性ＧＡＳ疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対して有効であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。

したがって、包括的な形態で、本発明は、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含む侵襲性ＧＡＳ疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対する受動免疫付与、治療、または予防のための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片、ならびに必要に応じて、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片の使用に関する。

別の包括的な形態で、本発明は、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含む侵襲性ＧＡＳ（ｉＧＡＳ）疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態に対するワクチン接種または免疫付与、治療または予防のための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに必要に応じて、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体の使用に関する。

本明細書で用いられる場合、「Ａ群連鎖球菌（group A streptococcus, Group A Streptococci, Group A Streptococcal, Group A Strep）」という用語および「ＧＡＳ」という略語は、ランスフィールドの血清型Ａの連鎖球菌のうち化膿連鎖球菌種のグラム陽性β溶結菌を指す。ＧＡＳの重要な病原性因子はＭタンパク質であり、これは強い抗食作用性をもち、血清中のＨ因子に結合し、Ｃ３転換酵素を破壊し、Ｃ３ｂによるオプソニン作用を防ぐ。これらには、Graham et al., 2002, PNAS USA 99 13855に記載されているＣｏｖＲ／ＳまたはＣｏｖＲＳ変異体などの毒性のある「変異体」も含まれるが、これらに限定されない。

Ａ群連鎖球菌によって引き起こされる疾患、障害、および状態としては、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、咽頭炎（「連鎖球菌性咽頭炎」）などの咽頭感染、菌血症、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）などの侵襲性ＧＡＳ疾患、壊死性筋膜炎、急性リウマチ熱、および急性糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、前記疾患または状態は、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）であるか、それを含む。

「タンパク質」という用語はアミノ酸重合体を意味する。アミノ酸は、当技術分野でよく理解されているように、天然または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であってもよい。

「タンパク質」という用語は、一般に５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質を表すのに使用される「ペプチド」と、一般に５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質を表すのに使用される「ポリペプチド」を包含する。

「断片」は、タンパク質（Ｍタンパク質、ｐ１４５、ｐ１７、Ｊ８、またはＪ１４、あるいはスーパー抗原、またはこれらに対して産生されたか、これらを対象とする抗体など）のセグメント、ドメイン、部分、または領域であり、タンパク質のアミノ酸配列の１００％未満を構成する。認識されているように、断片は、単一の断片であってもよいし、単独でまたは他の断片と共に反復されていてもよい。

一般に、断片は、全長タンパク質のうちの最大で５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、または１６００個のアミノ酸を含む、本質的にそれらからなる、あるいはそれらからなってもよい。

好適には、断片は「免疫原性」であり、すなわち、哺乳動物に投与されると抗体反応を誘発することができる。

本明細書で一般的に使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子複合体のタンパク質産物であるか、それに由来し、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥなどのアイソタイプ、ならびにＩｇＧ₁、ＩｇＧ_2aなどのサブタイプを含むが、これらに限定されない。抗体および抗体断片は、ポリクローナルまたはモノクローナル、天然または組換え型であってもよい。抗体断片は、Ｆｃ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２断片を含み、かつ／または単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を包含してもよい。このようなｓｃＦｖを、たとえば、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号、またはWinterおよびMilsteinによる記事（1991年、Nature 349: 293）にそれぞれ記載されている方法に従って調製してもよい。抗体はさらに、複数のｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、三重特異性抗体、および／または四重特異性抗体などの多価組換え抗体断片、さらには二量体化によって活性化されたデミボディ（demibody）（たとえば、国際公開第2007/062466号）も含み得る。たとえば、このような抗体を、Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 6444またはKipriyanov, 2009 Methods Mol Biol 562 177に記載されている方法に従って調製してもよい。抗体の作製、精製、および使用に利用可能な周知の手順は、たとえば、Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994)の第２章、およびHarlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されている。

ポリクローナル抗体を作製する方法は当業者に周知である。使用可能な模範の手順は、たとえばColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（上記）、およびHarlow & Lane, 1988（上記）に記載されている。特定の態様では、ポリクローナル抗体は、Ａ群連鎖球菌に曝露されたか感染した個体のヒト血清から入手または精製されてもよい。あるいは、ポリクローナル抗体は、精製、化学合成、または組換えＭタンパク質、スーパー抗原、あるいはその免疫原性断片または多様体に対してウマなどの産生種で産生された後、投与前に精製されてもよい。

モノクローナル抗体は、たとえば、KohlerおよびMilsteinによる記事（1975年、Nature 256, 495）に最初に記載された標準の方法を用いて、あるいは、たとえばColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（上記）に記載された、それより新しいその改良方法によって、本発明の単離されたタンパク質、断片、多様体、または誘導体のうちの１つ以上を接種した産生種に由来の脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって、作製されてもよい。モノクローナル抗体またはその断片は、組換え型であってもよい。これは、モノクローナル抗体がヒト以外の哺乳動物の脾臓細胞によって最初に産生される場合に、そのモノクローナル抗体または断片を「ヒト化」するのに特に有利である可能性がある。

一態様では、前記抗体または抗体断片は、Ｍタンパク質、その断片または多様体に結合し、かつ／またはそれに対して産生される。

本明細書で使用される場合、「Ｍタンパク質断片」は、免疫原性であり、かつ／あるいは抗体または抗体断片が結合することができるＧＡＳのＭタンパク質の任意の断片である。典型的には、断片は、ＧＡＳのＭタンパク質のＣ反復領域のアミノ酸配列またはその断片であるか、それを含むか、あるいはそれに含まれる。非限定的な例としてはｐ１４５が挙げられ、これはアミノ酸配列LRRDLDASREAKKQVEKALE（配列番号１）を有する２０量体である。最小のｐ１４５エピトープ配列はSREAKKQVEKAL（配列番号５）である。

特定の態様では、Ｍタンパク質断片は、配列番号５の最小ｐ１４５断片、その多様体または誘導体であるか、それを含む。

この点に関して、ｐ１４５アミノ酸配列の断片は、ｐ１７、Ｊ１４、またはＪ８ペプチドに存在してもよい。したがって、特定の態様では、Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体は、ｐ１７ペプチド、Ｊ１４ペプチド、またはＪ８ペプチドからなるか、本質的にそれからなるか、それを含む。

本発明の前に行われた研究では、ｐ１４５ペプチドへの特定の修飾がＡ群連鎖球菌に対する免疫原性を大幅に改善する可能性がある。一態様では、ｐ１７ペプチドは、配列番号１の残基１３に対応するＮ残基と配列番号１の残基１７のＲアミノ酸とを含む修飾ｐ１４５ペプチドである。

好ましくは、ｐ１７は、配列番号５の残基６に対応するＮ残基と配列番号１の残基１０のＲアミノ酸とを含む修飾ｐ１４５最小エピトープを含む。

一態様では、ｐ１７ペプチドは、アミノ酸配列LRRDLDASREAKNQVERALE（配列番号２）を含む。

一態様では、ｐ１７ペプチドは、アミノ酸配列SREAKNQVERAL（配列番号６）を含む修飾ｐ１４５最小エピトープ断片を含む。

さらなるｐ１４５ペプチド多様体については、PCT/AU2018/050893号に概説されている。同文献は参照によって本明細書に組み込まれる。模範的なｐ１４５多様体を以下に示す。
p145 LRRDLDA SREAKKQVEKAL E（配列番号１）
p*1. LRRDLDA ENEAKKQVEKAL E（配列番号１３）
p*2. LRRDLDA EDEAKKQVEKAL E（配列番号１４）
p*3. LRRDLDA EREAKNQVEKAL E（配列番号１５）
p*4. LRRDLDA EREAKKQVERAL E（配列番号１６）
p*5. LRRDLDA EREAKKQVEMAL E（配列番号１７）
p*6. LRRDLDA VNEAKKQVEKAL E（配列番号１８）
p*7. LRRDLDA VDEAKKQVEKAL E（配列番号１９）
p*8. LRRDLDA VREAKNQVEKAL E（配列番号２０）
p*9. LRRDLDA VREAKKQVERAL E（配列番号２１）
p*10. LRRDLDA VREAKKQVEMAL E（配列番号２２）
p*11. LRRDLDA SNEAKNQVEKAL E（配列番号２３）
p*12. LRRDLDA SNEAKKQVERAL E（配列番号２４）
p*13. LRRDLDA SNEAKKQVEMAL E（配列番号２５）
p*14. LRRDLDA SDEAKNQVEKAL E（配列番号２６）
p*15. LRRDLDA SDEAKKQVERAL E（配列番号２７）
p*16. LRRDLDA SDEAKKQVEMAL E（配列番号２８）
p*17 LRRDLDA SREAKNQVERAL E（配列番号６）
p*18. LRRDLDA SREAKNQVEMAL E（配列番号２９）
本明細書で使用される場合、「Ｊ１４ペプチド」は、アミノ酸配列KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK（配列番号３）、その断片または多様体を含んでもよい。この配列は、ｐ１４５内に最小のＢおよびＴ細胞エピトープを有するペプチドである。このペプチドは、有害である可能性のあるＴ細胞自己エピトープを含まないが、オプソニン作用のあるＢ細胞エピトープを含むＧＡＳのＭタンパク質Ｃ領域ペプチドであると特定された。Ｊ１４は、Ｍタンパク質Ｃ領域（太字）の１４アミノ酸を含み、ペプチドの正しいらせん折り畳みと立体構造を維持するのに必要な酵母由来のＧＣＮ４配列に隣接している、キメラペプチドである。

本明細書で使用される場合、「Ｊ８ペプチド」は、ＧＡＳのＭタンパク質Ｃ領域ペプチドに少なくとも部分的に由来するかそれに対応するアミノ酸配列を含むペプチドである。Ｊ８ペプチドは、好適には立体構造Ｂ細胞エピトープを含み、有害である可能性のあるＴ細胞自己エピトープを含まない。好ましいＪ８ペプチドアミノ酸配列は、QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ（配列番号４）、その断片、または多様体である。太字で示された残基は、ＧＡＳのＭタンパク質の残基３４４〜３５５に対応する。この態様では、Ｊ８は、これに隣接してＪ８ペプチドの正しいらせん折り畳みと立体構造の維持に役立つGCN4 DNA結合タンパク質配列をさらに含むキメラペプチドである。

他の態様では、抗体または抗体断片は、ＧＡＳスーパー抗原に結合し、かつ／またはそれに対して産生される。

本明細書で使用される場合、「スーパー抗原」は、すべてまたは大部分の病原性ＧＡＳ株によって分泌される低分子量の細胞外タンパク質である。ＧＡＳには、ＳｐｅＡ、ＳｐｅＣ、ＳｐｅＧ、ＳｐｅＨ、ＳｐｅＩ、ＳｐｅＪ、ＳｐｅＫ、ＳｐｅＬ、ＳｐｅＭ、ＳＳＡ、およびＳＭＥＺと名付けられた１１種の血清学的に異なるスーパー抗原がある。連鎖球菌のスーパー抗原は、ヒトＭＨＣＩＩβ鎖とは高い親和性結合、ＴＣＲβ鎖とは相対的に低い親和性結合を示す。連鎖球菌のスーパー抗原タンパク質構造は、２つのドメインからなる保存された構造と、分子の中心にまたがる長くて溶媒露出性のαヘリックスの存在を示している。Ｎ末端ドメインは、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）折り畳み構造を有する混合型のβバレルである。大きい方のＣ末端ドメインはβ把持（β-grasp）折り畳み構造であり、ねじれ構造のβシートで構成されており、βシートは、ねじれた４本鎖逆平行シートに接して詰まっている中央のα４ヘリックスで覆われている。連鎖球菌のスーパー抗原は、熱および酸による変性に抵抗する非常に安定したタンパク質であり、これは、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインが緊密に詰まっていることによって実現される。構造は、Ｃ末端ドメインの上部にＮ末端の部分が伸びていることによってさらに安定する。特に、すべての連鎖球菌のスーパー抗原の中で最も保存されている部分は、α４ヘリックスとＮ末端のＯＢ折り畳みドメインの内側との間の境界をなす領域である。ＧＡＳに存在し得る１１種のスーパー抗原のうち、ほとんどの症例のＳＴＴＳは連鎖球菌発熱性外毒素（Ｓｐｅ）ＡまたはＳｐｅＣのいずれかによって引き起こされる。

本明細書で使用される場合、タンパク質「多様体」は、限定可能なアミノ酸配列関係を基準アミノ酸配列と共有する。基準アミノ酸配列は、前述のＭタンパク質、スーパー抗原、またはこれらの断片のアミノ酸配列であってもよい。「多様体」タンパク質は、基準アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が欠失しているか、異なるアミノ酸で置換されていてもよい。当技術分野でよく理解されているように、免疫原性断片および／またはタンパク質の活性を変化させることなく、いくつかのアミノ酸を置換または削除することができる（保存的置換）。好ましくは、タンパク質多様体は、基準アミノ酸配列と少なくとも７０％または７５％、好ましくは少なくとも８０％または８５％、あるいは、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

ｐ１７および／またはｐ１４５ペプチド多様体の非限定的な例は、米国特許出願公開第2009/0162369号に記載されている。同文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｊ８ペプチド多様体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C（配列番号７）
S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C（配列番号８）
S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C（配列番号９）
S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C （配列番号１０）。

他の多様体は、Cooper et al., 1997に記載されているような七連子（heptad）に基づいていてもよい。同文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

たとえば、あるエピトープがαヘリックスタンパク質立体構造内に存在することが分かっている場合、この立体構造に折り畳むようにモデルペプチドを合成することができる。発明者らは、ＧＣＮ４のロイシンジッパーの構造に基づき、αヘリックス撚り合わせコイルペプチドモデルを設計した（O’Shea et al., 1991）。最初の七連子は、配列MKQLEDK（配列番号１１）を含み、これは安定な撚り合わせコイルの七連子の反復モチーフ（ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ）ｎに見られる特徴のうちのいくつかを含んでいる（Cohen & Parry, 1990）。これらは、ａおよびｄ位置に大きな無極性残基、ｅおよびｇ位置に酸／塩基対（Ｇｌｕ／Ｌｙｓ）（通常は鎖間イオン相互作用に有利である）、およびｂ、ｃ、ｆ位置に極性基を含んでいる（Lupas et al. (1991)の予測と一致）。ＧＣＮ４ペプチドはさらに、ａ位置に共通のバリンを含んでいる。ａおよびｄ位置をＶおよびＬが占めている場合、撚り合わせコイル二量体が好ましいことも指摘されている（Harbury et al., 1994）。αヘリックス撚り合わせコイルを形成する可能性のある、ＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチド（VKQLEDK；配列番号１２）のこれらの共通する特徴から、モデルの七連子反復を導き出した。このペプチドをフレームワークペプチドとした。研究対象の立体構造エピトープの重複断片を、撚り合わせコイルペプチドモデルに埋め込むことでキメラペプチドを得た。らせんモデルペプチドとエピトープ配列の両方に同一の残基が見られた場合は常に、正しいらせん撚り合わせコイル立体構造（Cohen&Parry, 1990）を保証するように設計したアミノ酸置換をキメラペプチドに組み込んだ。典型的には以下の置換：ａ位置でＶからＩ、ｂ位置でＫからＲ、ｃ位置でＱからＮ、ｄ位置でＬからＡ、ｅ位置でＥからＱ、ｆ位置でＤからＥ、ｇ位置でＫからＲの置換を使用した。これらの置換残基はすべて、撚り合わせコイルタンパク質の各位置に共通して見られる（Lupas et al., 1991）。

それぞれのタンパク質および核酸の配列関係を説明するために本明細書で一般に使用される用語として、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」が挙げられる。各核酸／タンパク質はそれぞれ、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列のうちの１つ以上の部分と、（２）核酸／タンパク質間で異なる１つ以上の部分を含み得るため、配列比較は、典型的には「比較ウィンドウ」で配列を比較して配列が類似している局所領域を特定、比較することで行われる。「比較ウィンドウ」は、基準配列と比較される、通常６、９、または１２個の連続する残基の概念上の部分を指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列を最適に位置合わせするために、基準配列と比較して約２０％以下の付加または削除（すなわち空白）を含み得る。比較ウィンドウを位置合わせするための最適な配列の整列は、コンピュータ化されたアルゴリズム実行によって実施されてもよい（IntelligeneticsによるGeneworksプログラム; GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)（参照によって本明細書に組み込まれる）し、検査や選択された様々な方法のいずれかによって得られる最良の位置合わせ（すなわち、比較ウィンドウに対して最も高いパーセント相同性になる）によって実施されてもよい。たとえば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されているＢＬＡＳＴプログラムの類も参照してもよい。配列解析の詳細な記述は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)のユニット１９．３で見ることができる。

「配列同一性」という用語は、本明細書において最も広い意味で、標準のアルゴリズムを用いた適切な位置合わせを考慮し配列が比較ウィンドウ上で同一である程度を考慮した正確なヌクレオチドまたはアミノ酸の一致の数を包含するように使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で２つの最適に位置合わせした配列を比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が発生する位置の数を決定して一致する位置数を求め、一致する位置数を比較ウィンドウ内の全位置数（すなわちウィンドウの大きさ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことで計算される。たとえば、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム（Version 2.5 for windows; Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから利用可能）によって計算された「一致パーセンテージ」を意味すると理解されてもよい。

本明細書で使用される場合、「誘導体」は、たとえば、他の化学部分との結合または複合体形成によって、翻訳後修飾（たとえば、リン酸化、アセチル化など）、グリコシル化の修飾（たとえば、グリコシル化の付加、除去、または変更）、脂質化、および／または当技術分野で理解されるような付加アミノ酸配列を含ませることによって変化したタンパク質、その断片または多様体などの分子である。特定の一態様では、付加アミノ酸配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端に１個以上のリジン残基を含んでもよい。複数のリジン残基（たとえばポリリジン）は、リジン残基の直鎖配列であってもよいし、リジン残基の分岐鎖配列であってもよい。これらの付加リジン残基によって、ペプチドの溶解度の増加が促される可能性がある。別の特定の誘導体は、ペプチドをジフテリア毒素（ＤＴ）に結合させることによって得られる。Ｃ末端にシステイン残基を付加することでこれを促してもよい。

付加アミノ酸配列としては、融合タンパク質を形成する融合パートナーアミノ酸配列を挙げることができる。たとえば、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出および／または精製に役立つ可能性がある。非限定的な例としては、金属結合性（たとえばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、タンパク質Ａ、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（たとえばＧＦＰ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、および赤血球凝集素タグなどのエピトープタグなどが挙げられる。

他の付加アミノ酸配列は、ジフテリア類毒素（ＤＴ）またはその断片などの担体タンパク質、あるいは国際公開第2017/070735号に記載されているようなＣＲＭタンパク質断片の配列であってもよい。

本発明によって企図される他の誘導体としては、側鎖への修飾、ペプチドまたはタンパク質合成時の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに本発明の免疫原性タンパク質、その断片および多様体に立体構造制約を課す架橋剤および他の方法の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

これに関して、タンパク質の化学的修飾に関するさらに広範な方法については、当業者はCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2008)の第１５章を参照するとよい。

単離されたＭタンパク質、スーパー抗原タンパク質、断片および／または誘導体を当技術分野で公知の任意の手段で作製してもよく、その例としては化学合成、組換えＤＮＡ技術、およびペプチド断片を産生するためのタンパク質分解切断などが挙げられるが、これらに限定されない。

化学合成としては、固相合成と液相合成が挙げられる。このような方法は当技術分野で周知であるが、SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications)の第９章およびCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)の第１５章に示されているような化学合成技術の例を参照するとよい。これに関しては国際公開第99/02550号および第97/45444号も参照するとよい。

組換えタンパク質は、たとえばSambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)の特に第１６章および１７章、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)の特に第１０章および１６章、ならびにCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)の特に第１章、５章、および６章に記載の標準の手順を用いて当業者は好都合に調製可能である。典型的には、組換えタンパク質の調製は、タンパク質をコードする核酸の好適な宿主細胞での発現を含む。

本発明の特定の側面および態様は、ＳＴＳＳなどのＡ群連鎖球菌関連疾患または状態に対する受動免疫のために哺乳動物に投与するための、Ｍタンパク質、スーパー抗原タンパク質、断片、および／または誘導体に結合する、あるいはそれに対して産生された組換え抗体および抗体断片に関する。特定の態様では、組換え抗体および抗体断片は、前述のように、「ヒト化」されている。したがって、側面によっては本発明は、Ｍタンパク質、スーパー抗原タンパク質、断片、および／または誘導体に結合する、あるいはそれらに対して産生された組換え抗体および抗体断片をコードする１つ以上の単離核酸を提供する。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを示す。ＤＮＡはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、および自己触媒ＲＮＡを包含する。核酸はさらに、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体であってもよい。核酸は、ヌクレオチド（典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ塩基を包含する）を含むヌクレオチド配列を包含する。しかし、ヌクレオチド配列は、修飾プリン（たとえば、イノシン、メチルイノシン、およびメチルアデノシン）および修飾ピリミジン（たとえば、チオウリジンおよびメチルシトシン）など、他の塩基を含んでいてもよい。

好ましい形態では、Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体をコードする１つ以上の単離核酸、および好中球活性の回復または増強を促す物質は、遺伝子構築物の形態である。

好適には、遺伝子構築物は、当技術分野でよく理解されているように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌人工染色体の形態であるか、またはそれらの遺伝子成分を含む。遺伝子構築物はさらに、組換えＤＮＡ技術による操作のために、細菌または他の宿主細胞での単離核酸の維持および増殖に適したものであってもよい。

タンパク質発現の目的のために、遺伝子構築物は発現構築物である。好適には、発現構築物は発現ベクター内に、異種配列などの１つ以上の付加配列と作動可能に連結された前記１つ以上の核酸を含む。「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクターであってもよいし、宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。

「作動可能に連結された」という用語は、前記の付加ヌクレオチド配列が、好ましくは転写を開始、調節、または他の方法で制御するために、本発明の核酸に対して配置されていることを意味する。

調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現が必要とされる宿主細胞または組織に適切な配列である。多くの種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、様々な宿主細胞について当技術分野で公知である。

典型的には、前記の１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびに転写促進または活性化配列を挙げることができるが、これらに限定されない。当技術分野で公知の構成的または誘導性プロモーターが本発明によって企図されている。発現構築物はさらに、本発明の組換えタンパク質が前述のように融合タンパク質として発現されるように、融合パートナー（典型的には発現ベクターによって提供される）をコードする付加ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

好ましい形態では、遺伝子構築物は、本明細書に記載のＭタンパク質および／またはスーパー抗原をコードすることにより、ヒトなどの哺乳動物のＤＮＡワクチン接種に適している。これに関して、認識されているように、Ｍタンパク質およびスーパー抗原タンパク質は、ワクチン接種の目的で、同じまたは異なる遺伝子構築物上にコードされていてもよい。

好適には、遺伝子構築物は、当技術分野でよく理解されているように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌人工染色体の形態であるか、またはそれらの遺伝子成分を含む。遺伝子構築物はさらに、組換えＤＮＡ技術による操作のために、細菌または他の宿主細胞での単離核酸の維持および増殖に適したものであってもよい。

好適には、ＤＮＡワクチン接種は１つ以上のプラスミドＤＮＡ発現構築物によるものである。プラスミドは、典型的には、ウイルスプロモーター（ＳＶ４０、ＲＳＶ、またはＣＭＶプロモーターなど）を含む。ｍＲＮＡの安定性を改善することでタンパク質発現を増加させるために、イントロンＡを含んでいてもよい。プラスミドはさらに、マルチクローニング部位や、ウシ成長ホルモンまたはウサギベータグロブリンポリアデニル化配列などの強力なポリアデニル化／転写終結シグナルを含んでいてもよい。プラスミドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖによるエンベロープ発現の増加を伴って、または伴わずに、マソン・ファイザーサルウイルスのシス作用性転写配列（ＭＰＶ−ＣＴＥ）をさらに含んでいてもよい。発現を改善し得るさらなる修飾としては、ポリアデニル化および／または転写終結配列に転写促進配列、合成イントロン、アデノウイルス三連リーダー（ＴＰＬ）配列、および／または修飾を挿入することが挙げられる。ＤＮＡワクチンプラスミドの非限定的な例は、Invivogenから市販されているpVACである。

ＤＮＡワクチン学について記載されている有用な参照文献は、DNA Vaccines, Methods and Protocols, Second Edition (Volume 127 of Methods in Molecular Medicine series, Humana Press, 2006)である。

前述のように、本発明は、哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態を予防または治療する組成物、ワクチン、および／または方法を提供する。

本発明に関して、「Ａ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態」という用語は、Ａ群連鎖球菌による感染症によって起こる任意の臨床病態を意味し、その例としては、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、急性咽頭炎（「連鎖球菌性咽頭炎」）などの咽頭感染、菌血症、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）、壊死性筋膜炎、急性リウマチ熱、および急性糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。

ＳＴＳＳは主に、ヒトＭＨＣＩＩ分子（ペプチド結合溝の外側）およびＴ細胞受容体可変鎖に非特異的に結合するスーパー抗原毒素によって引き起こされ、ポリクローナルＴ細胞を活性化する（多くの場合、２０％を超えるＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される）。これは、低血圧および（肝臓、腎臓、凝固系および呼吸器系を含む）多臓器不全の原因となる提案された因果関係である、Ｔｈ１サイトカインストームをもたらす。

好適には、組成物および／または方法は、哺乳動物にＡ群連鎖球菌、より具体的にはＳＴＳＳに対する「受動免疫を付与する」。したがって、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片と、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片との組み合わせの投与は、その後のＡ群連鎖球菌による感染症に対する少なくとも部分的な受動免疫を付与、提供、または促進してもよく、あるいは、存在しているＡ群連鎖球菌感染症に対する少なくとも部分的な受動免疫を付与、提供、または促進してもよい。さらに、認識されているように、「受動免疫」は補体カスケードの要素の誘導、マクロファージおよび他の食細胞などの自然免疫系の要素の誘導、ならびに／あるいはサイトカイン、成長因子、ケモカイン、および／または他の炎症誘発性分子の誘導といった宿主哺乳動物の免疫応答の少なくともいくつかの要素の誘発を排除しない。

好適には、受動免疫は、哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を含むｉＧＡＳ疾患などのＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態を治療または予防する。

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、ＳＴＳＳなどのＡ群連鎖球菌による疾患、障害、または状態の症状または病理学的徴候を、その発症開始後に少なくとも部分的に改善、排除、または軽減する治療的介入を指す。治療は絶対的に哺乳動物に有益である必要はない。有益な効果は、当業者に公知の任意の方法または基準を用いて決定可能である。

本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、Ａ群連鎖球菌による感染またはそれに対する曝露の前、ならびに／あるいはＳＴＳＳなどのＡ群連鎖球菌による疾患、障害、または状態の症状または病理学的徴候の発症の前に、感染を予防かつ／あるいは症状または病理学的徴候を軽減するために開始される、一連の行動を指す。なお、このような予防は、絶対的に対象に有益である必要はない。「予防的」治療は、Ａ群連鎖球菌による疾患、障害または状態の徴候を示していない、あるいは初期の徴候のみを示している対象に対して、Ａ群連鎖球菌による疾患、障害、または状態の症状または病理学的徴候を発症するリスクを低減する目的で施される治療である。

特定の側面および態様では、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片、およびＡ群連鎖球菌スーパー抗原、断片または多様体に結合する抗体または抗体断片を哺乳動物に別々に投与してもよいし、併用して投与してもよい。

「別々に」という用語は、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、または多様体に結合する抗体または抗体断片、ならびにＡ群連鎖球菌スーパー抗原、断片または多様体に結合する抗体または抗体断片をそれぞれ含む別の単位として同時に投与される、あるいは各抗体または抗体断片の複合または相乗効果が保たれる形で時間的に間隔を空けて投与されることを意味する。

態様によっては、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片または多様体に結合する抗体または抗体断片、およびＡ群連鎖球菌スーパー抗原、断片または多様体に結合する抗体または抗体断片は、組成物の形態で投与されてもよい。好ましい形態では、組成物は、許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

「許容される担体、希釈剤または賦形剤」という用語は、全身投与で安全に使用可能な固体または液体の充填剤、希釈剤または被包物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な担体、希釈剤、および賦形剤を使用してもよい。これらを、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水、塩類（塩酸塩、臭化物、および硫酸塩を含む鉱酸塩や、酢酸塩、プロピオン酸塩、およびマロン酸塩などの有機酸塩）、水、ならびに発熱物質を含まない水を含む群から選択してもよい。

許容される担体、希釈剤、および賦形剤について記載されている有用な参照文献はRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)である。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。

好適には、本明細書に記載のＭタンパク質および／またはスーパー抗原タンパク質（その断片、多様体、および誘導体を含む）は免疫原性である。本発明に関して、本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、その免疫原性タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与した際にＡ群連鎖球菌またはその分子成分（Ｍタンパク質またはスーパー抗原など）に対する免疫応答を発生させるまたは誘発する、能力または可能性を示す。

「免疫応答を誘発する」という用語は、細胞免疫系、抗体、および／または天然の免疫系を含む免疫系の１つ以上の要素の産生または活性を発生させるまたは刺激することを意味する。好適には、免疫系の１つ以上の要素として、Ｂリンパ球、抗体、および好中球が挙げられる。

好ましくは、免疫応答を誘発する目的で、特定の免疫剤を、Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体（Ｊ８ペプチドなど）、ならびに／あるいはスーパー抗原タンパク質、断片、多様体、または誘導体（ＳｐｅＡおよびＳｐｅＣなど）と、あるいはこれらをコードする１つ以上の遺伝子構築物と、併用してもよい。

「免疫剤」という用語は、その範囲内に、当技術分野で周知の担体、送達剤、免疫刺激剤、および／または補助剤を含む。当技術分野で理解されているように、免疫刺激剤および補助剤は、組成物の免疫原性および／または有効性を増強する１種以上の物質を指す、あるいはそれらを含む。好適な免疫刺激剤および補助剤の非限定的な例としては、以下が挙げられる：スクアランおよびスクアレン（あるいは他の植物性または動物性油）；ブロック共重合体；Tween（登録商標）80やQuil（登録商標）Aなどの界面活性剤；DrakeolまたはMarcolなどの鉱油；ピーナツ油などの植物油；コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などのコリネバクテリウム由来の補助剤；プロピオニバクテリウム・アクネ（Propionibacterium acne）などのプロピオニバクテリウム由来の補助剤；ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）（Bacille Calmette and GuerinすなわちBCG）；百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原；破傷風類毒素；ジフテリア類毒素；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオールなどの界面活性物質；ピランなどのポリアミン；硫酸デキストラン；ポリＩＣカーボポール；ムラミルジペプチドおよび誘導体などのペプチド；ジメチルグリシン；タフトシン；油乳剤；リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバンなどの鉱物ゲル；インターロイキン２およびインターロイキン１２などのインターロイキン；インターロイキン１などのモノカイン；腫瘍壊死因子；γインターフェロンなどのインターフェロン；CpG DNAなどの免疫刺激性ＤＮＡ；サポニン−水酸化アルミニウムまたはQuil A−水酸化アルミニウムなどの組み合わせ；リポソーム；ISCOM（登録商標）およびISCOMATRIX（登録商標）補助剤；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドまたは他の誘導体などの合成糖ペプチド；アブリジン；リピドＡ誘導体；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥデキストラン単独またはリン酸アルミニウムとの併用；Carbopol' EMAなどのカルボキシポリメチレン；Neocryl A640などのアクリル系共重合体乳剤（たとえば、米国特許第5,047,238号）、Montanide ISA 720などの油中水型乳剤；ポリオウイルス、ワクシニア、または動物ポックスウイルスタンパク質；あるいはこれらの混合物。

免疫剤としては、サイログロブリンなどの担体；ヒト血清アルブミンなどのアルブミン；破傷風、ジフテリア、百日咳、緑膿菌（Pseudomonas）、大腸菌（E coli）、ブドウ球菌、および連鎖球菌由来の毒素、類毒素、または毒素の任意の変異型交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６；パルボウイルスＶＰ１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどを挙げることができる。あるいは、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用してもよい。たとえば、細菌毒素、類毒素、またはＣＲＭのＴ細胞エピトープを使用してもよい。これに関して、米国特許第5,785,973号を参照してもよい。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。

ワクチン組成物の作製には任意の好適な手順が企図されている。典型的な手順としては、たとえばNew Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)に記載されている手順が挙げられる。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。

任意の安全な投与経路を採用してもよく、その例としては、経口、直腸、非経口、舌下、口腔、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、局所、粘膜および経皮投与が挙げられるが、これらに限定されない。

剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、点鼻剤、坐剤、エアロゾル剤、経皮パッチ剤などが挙げられる。これらの剤形はさらに、この目的のために特別に設計された制御放出装置、あるいはこの方式で付加的に作用するように改良された他の形態の留置剤を注入または留置することを含んでもよい。アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびに特定のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）などの疎水性ポリマーで被覆することによって制御放出を達成してもよい。また、他の重合体母材、リポソーム、および／または微小球を用いて制御放出を達成してもよい。

組成物は、それぞれ本発明の１つ以上の治療剤の所定量を含むカプセル、小袋、機能性食品／飼料または錠剤などの個別の単位として提示されてもよく、散剤または顆粒剤として、あるいは水性の液体、非水性の液体、水中油型乳剤または油中水型液体乳剤中の溶液剤または懸濁剤として提示されてもよい。このような組成物を任意の製薬方法で調製してもよいが、いずれの方法も上記のような１つ以上の薬剤を、１つ以上の必要な成分を構成する担体と結びつける工程を含む。一般には、本発明の薬剤を液体担体または細かく分割した固体担体、あるいはその両方と均一かつ緊密に混合した後、必要に応じて生成物を所望の形態に成形することで組成物を調製する。

上記の組成物は、剤形に適合する方法で、有効量で投与可能である。本発明に関して、患者に投与される用量は、適切な期間にわたって患者に有益な応答をもたらすのに十分でなければならない。投与される薬剤の量は、医師の判断に依存する要因（治療を受ける対象の年齢、性別、体重、および全般的な健康状態）を含め、治療される対象に依存してもよい。

本明細書で一般に使用される場合、「患者」、「個体」、および「対象」という用語は、本明細書に開示されている治療または組成物を受ける任意の哺乳動物に関して使用される。したがって、本明細書に開示されている方法および組成物は、医学的および／または獣医学的用途を有し得る。好ましい形態では、哺乳動物はヒトである。

本発明を十分に理解し実用することができるように、以下の非限定的な実施例を示す。

（序論）

抗体に基づく受動免疫療法を検討すると、表面Ｍタンパク質（およびスーパー抗原）に対する抗体は、侵襲性疾患を発症する個体では有意に低く［９］、母集団中の抗体が低濃度であることが１９８０年代に始まった侵襲性疾患の流行の一因となった可能性がある［１０、１１］ことが認識された。しかし、侵襲性感染前の個体で抗体が低いか、あるいは抗体異化作用の結果として感染が始まった後に抗体が低くなるかを判断することはできない。発明者らは、この問題に直接対処する方法は、動物にワクチン接種して攻撃し、すなわち感染させて治療することができるＳＴＳＳモデルにあると考えた。発明者らは、Ｍタンパク質の高度に保存された部分に基づくＧＡＳワクチン（［１２］に概説）を開発した。抗原はＪ８として知られており、その配列はＭタンパク質のＣ３反復の１２個のアミノ酸を模倣している。ジフテリア類毒素に結合したＪ８（Ｊ８−ＤＴ）を接種すると、Ｍ型に関係なくインビトロでＧＡＳをオプソニン化する抗体を誘導し、腹腔内および皮膚の攻撃からマウスを防御することができる［１３−１６］。しかし、健常なマウスはスーパー抗原に感受性がない（マウスＭＨＣＩＩ分子のスーパー抗原に対する親和性が非常に低いため）ため、このワクチンがＳＴＳＳを予防するかどうかは不明である。本明細書に開示される研究は、感染前の予防措置としてのＪ８ＧＡＳワクチン、ならびに感染後の治療選択肢としてのＪ８に対する抗体とＳｐｅＡおよびＳｐｅＣに対する抗体を使用する受動免疫療法を試験するための好適なマウスモデルを提供する。
（材料および方法）

ＳＮ１〜ＳＮ４は、２０１５年にブリスベンでほぼ同時期にＳＴＳＳを発症した４人の成人の血液（×３）または創傷の拭き取り検体（×１）から採取した臨床ＧＡＳ分離株である。４人の患者のうち２人は疾患により死亡した。生物を発明者らの研究室で培養し、ＳＮ１を用いて予備データセットを開発した（下記）。組換えＳｐｅＣ（ｒＳｐｅＣ）をToxin Tech（米国）から商業的に購入し、インビトロ実験およびマウスでの抗ＳｐｅＣ抗体の産生に使用した。ＨＬＡ形質転換Ｂ６マウス（「ＨＬＡ−Ｂ６」）はＨＬＡ−ＤＲ３およびＨＬＡ−ＤＱ２を発現する［１７］。

生物はすべてｅｍｍ８９型であった。GenElute細菌ｇＤＮＡ抽出キット（Sigma）を用いて、一晩培養した定常期培養液からゲノムＤＮＡを抽出した。Nanodrop1000を用いてｇＤＮＡを認定し、２μｇのｇＤＮＡを用いてすべての既知のスーパー抗原遺伝子を増幅した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、ＳＮ１〜４がすべてＳｐｅＣ遺伝子を含むことがわかった。また、ＳｐｅＧおよびＳｍｅＺについては陽性であったが、Ｓｐｅｓ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、およびｓｓａについては陰性であった。
（結果）

発明者らはＨＬＡ−Ｂ６マウスがマウスに非適応のＧＡＳ株による皮膚感染後にｉＧＡＳ疾患を発症する可能性があることを見出した（図１Ａ〜Ｂ）。対照的に、ＧＡＳ株は、健常な非ヒト化マウスでｉＧＡＳ疾患を引き起こすことができるようになるまでには連続継代によって適応させる必要がある。このことは、スーパー抗原がＧＡＳに与える生存上の利点［１８］、およびスーパー抗原が刺激性であるためのヒトＭＨＣＩＩ分子の必要性に関連している可能性がある。したがって、ＨＬＡ−Ｂ６マウスはＳＴＴＳのモデル化に理想的であるはずである。しかし、ＳｐｅＣ分泌性ＧＡＳによる感染後、ＢＡＬＢ／ｃ（非ＨＬＡ形質転換）マウスは、感染後６日目に血清中にＳｐｅＣ毒素の存在を示した（図１Ｃ）。この毒素を含む血清を滅菌濾過し、インビトロおよびインビボ検定の試薬として使用した。ＨＬＡ−Ｂ６および野生型対照であるＣ５７／ＢＬ６（Ｂ６）マウスを、ＳＮ１、およびスーパー抗原を発現しないＣ群連鎖球菌（ＮＳ３３）に感染させた。感染したマウスから感染後６日目に採取した貯蔵血清試料を、４〜１５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルからタンパク質を転写した後、膜を一次抗体であるウサギ抗SpeC IgG（Toxin-Tech、米国）で調べ、続いてヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ（Sigma-Aldrich）で検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Sigma-Aldrich）を用いて発色させた。ｒＳｐｅＣタンパク質も陽性対照として泳動した。ＳＮ１感染マウスの血清でＳｐｅＣが検出されたのに対し、ＮＳ３３感染マウスの血清では毒素の存在は示されなかった（図１Ｄ）。

感染したＢＡＬＢ／ｃマウスのＳｐｅＣを含む血清またはｒＳｐｅＣを、Ｂ６またはＨＬＡ−Ｂ６マウスの脾細胞培養物に添加した。感染マウスの血清の存在下またはｒＳｐｅＣの存在下で、ＨＬＡ−Ｂ６脾臓細胞の有意な増殖が観察された（Ｂ６マウスの脾臓細胞では観察されなかった）が、Ｃ群連鎖球菌（ＮＳ３３）に感染したマウスの血清の存在下では観察されなかった（図２Ａ）。増殖は抗ｒＳｐｅＣ抗体によってほぼ完全に阻害され、ＳＮ１に存在する他のスーパー抗原が最小限の活性しか発揮しなかったことを示している（図２Ａ）。ＴＮＦおよびＩＦＮ−γの分泌を測定しても同様の反応が観察された（図２Ｂ〜Ｃ）。感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、またはｒＳｐｅＣを、３人の健常な成人ボランティアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にも添加した。ＳＮ１感染マウスの血清に対しては、すべてのドナーで用量反応的に（５μＬ／ウェルまで）リンパ球の有意な増殖が観察されたが、ＮＳ３３感染マウスの血清に対しては観察されなかった。２０μＬ／ウェルのＳＮ１血清では、リンパ球の増殖は分裂促進因子であるＰＨＡによって誘導されたものと同様であった。増殖は抗ｒＳｐｅＣ抗体によって阻害された。これらのデータは、ＳＮ１がＨＬＡヒト化マウスおよびヒトのリンパ球を非特異的に活性化することができるＳｐｅＣを発現することを示しており、ＳＴＳＳの既知の病原性と一致している。データはさらに、ＨＬＡ−Ｂ６マウスを使用してＳＴＳＳをモデル化できることを示唆している。

Ｊ８の接種によるマウスＳＴＳＳの予防。Ｊ８−ＤＴの接種がＳＴＳＳを予防するかどうかを判断するために、まず、皮膚で、ＳＮ１によって引き起こされるｉＧＡＳ疾患を予防するかを調べた。Ｊ８−ＤＴ／ミョウバンをＨＬＡ−Ｂ６マウスに筋肉内接種（３回）すると、皮膚、血液、脾臓の細菌負荷が１０，０００〜１０，０００，０００倍減少した（図３Ａ）。攻撃後６日目に採取した血清のウェスタンブロット分析は、対照（ＰＢＳ）マウスの血清ではＳｐｅＣを示したが、Ｊ８−ＤＴを接種したマウスの血清では示さなかった（図３Ｂ）。

次に、Ｊ８−ＤＴを接種したＳＮ１感染マウスの血清が健常なボランティアから採取したＰＢＭＣを活性化するかを試験した。接種を受けていないマウスの血清は、３人中３人で強い増殖を引き起こした（ＰＨＡによって誘導されたレベルの最大５０％）が、接種を受けたマウスの血清は、それよりも有意に低い増殖をもたらした。２人の個体の代表的なデータを示す（図３Ｃ〜Ｄ）。同様に、ｒＳｐｅＣに対する抗血清は、ＳＮ１感染マウスの血清によって引き起こされた増殖応答を有意に減少させた。しかし、さらに、Ｊ８−ＤＴを接種したＨＬＡ−Ｂ６マウスのマウス血清に抗ｒＳｐｅＣ抗血清（１０〜２０μＬ）を添加すると基底レベル以下の増殖につながることが観察された（ＳＩ：約１；Ｐ＜０．０５〜０．０１）。

受動免疫療法の開発。目的は、ＳｐｅＡ／Ｃに対する抗体とＪ８に対する抗体とからなる併用受動免疫療法を開発することである。発明者らの予備データは、ｒＳｐｅＣで免疫付与したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清が、毒素を０．０５μｇ/ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌで添加した場合にヒトＰＢＭＣに対するｒＳｐｅＣの分裂促進効果を完全に阻害できることを示している（図４）。抗血清は５μＬ／ウェルまでの濃度では有効であった。

本実施例では、ＳＴＳＳの発症を制限するＪ８抗血清の能力も示したが、健常なマウスのＪ８抗血清（主にＩｇＧ１）がレシピエント動物の細菌負荷を急速に減少させることができることを示した（図５Ａ）。しかし、発明者らのデータは、抗ＳｐｅＣ抗体と抗Ｊ８抗体との併用が、ＳｐｅＣとＭタンパク質の両方を中和し、さらには抗Ｊ８抗体を含むことによって血行路から細菌を除去するという点で、さらに優れていることを示している。また、発明者らは、感染の５日後にＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＳｐｅＣ抗血清を投与すると、投与後６時間以内にＳｐｅＣを中和できることも見出した（図５Ｂ）。しかし、この治療は皮膚の細菌負荷の減少にはつながらなかった（図５Ｃ）。
（提案されたさらなる研究）

発明者らは、ｉＧＡＳ疾患は、マウスに非適応のＧＡＳ株に感染した後にＨＬＡ−Ｂ６マウスで発症する可能性があり、ＨＬＡ−Ｂ６マウスのリンパ球はＳＴＳＳの病態と一致する形でSN1 GASのＳｐｅＣに応答することを示した。研究を発展させるために、発明者らが集めた中に含まれ、ゲノムスクリーニングからＳｐｅＣに陽性であることがわかっている他のＧＡＳ株（表１）もＨＬＡ−Ｂ６マウスのリンパ球を活性化するかを調べる。ウェスタンブロットにより、４つのさらなるＳｐｅＣ陽性ＧＡＳ株に感染したＨＬＡ−Ｂ６マウスの血清中のＳｐｅＣの存在を確認する。次に、非感染ＨＬＡ−Ｂ６マウス（ｎ＝５／ＧＡＳ分離株）の脾細胞を、ｒＳｐｅＣまたは様々なＳｐｅＣ陽性株に感染したマウスの血清と共に培養する。リンパ球の増殖と分泌されたＴＮＦおよびＩＦＮγを上記のとおり測定する。簡単に説明すると、無感作の脾細胞を、ＳｐｅＣ陽性ＧＡＳに感染したマウスの事前に最適化された濃度の血清で刺激する。増殖を７２時間後の［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定する。無細胞培養上清を、ＣＢＡキット（BD Biosciences）で様々なサイトカインについて試験する。健常なマウス血清（ＮＭＳ）およびスーパー抗原−NEG NS33（Ｃ群連鎖球菌）感染マウスの血清を陰性対照として使用する。実験を少なくとも２回繰り返す。また、ＧＡＳ臨床試料を採取し、利用できるようになれば試験する。

ＳｐｅＣはＧＡＳの２つの主要なスーパー抗原のうちの１つであり、もう１つはＳｐｅＡである。同様に、５つの異なるＳｐｅＡ陽性ＧＡＳ株（表１）および新たな試料（ＧＡＳ分離株およびＳＴＳＳ患者の血清）がＨＬＡ−Ｂ６マウスの脾臓細胞を活性化する能力を試験する。

ＳｐｅＡはHLA DR4およびＤＱ８に結合することが知られている［１８］が、ＤＲ３およびＤＱ２にも結合することから、発明者らが現在所有しているＨＬＡ−Ｂ６マウスがＳｐｅＡを有するＧＡＳを使用したＳＴＳＳ研究に適していることが示されている。ｒＳｐｅＡを陽性対照として使用する。米国のToxin TechからｒＳｐｅＡを購入する。

発明者らは以前に皮膚攻撃モデル［１４］を開発した。軽く擦った皮膚に連鎖球菌を局所接種することにより、このモデルはヒトの膿皮症を厳密に再現する。ＳＴＴＳのほとんどの症例が皮膚から始まることを考えると、これは理想的な攻撃モデルである。マウスを安楽死させ、均質化済み切除皮膚のコロニー数を推定することにより、細菌負荷を正確に定量化することができる。侵襲性の細菌負荷を、血液および均質化済み脾臓試料を蒔くことによって決定する。このモデルを使用して、Ｊ８−ＤＴ／ミョウバンを異なる株の健常なマウスに筋肉内接種する（３回）ことによって血清型に依存せずＧＡＳ膿皮症およびｉＧＡＳ疾患から防御できることを示した。

ＨＬＡ−Ｂ６マウスに、０、２１、および４２日目にＪ８−ＤＴ／ミョウバン（または対照としてＰＢＳ／ミョウバン）を接種する（筋肉内接種で３回）。接種の２週間後、マウスを５つの異なるＳｐｅＡ陽性株および５つの異なるＳｐｅＣ陽性ＧＡＳ株で経皮的に攻撃する。１５匹の規模の群を使用する。臨床疾患の徴候についてマウスを９日間観察する。皮膚、血液、および脾臓の細菌負荷を、攻撃後３、６、および９日目に指定数のマウス（ｎ＝５匹／群）を安楽死させることによって推定する。様々な時点で採取した血液から得た血清試料を用いて、ウェスタンブロットによってＳｐｅＡおよびＳｐｅＣの存在を決定する。（肝損傷の指標である）肝酵素濃度の上昇があるかを、既に記載されている方法で調査する［１９］。接種を受けたマウスおよび対照マウスの血清を滅菌濾過し、それらがＨＬＡ−Ｂ６マウスの脾臓細胞およびヒトＰＢＭＣによるリンパ球増殖およびサイトカイン分泌を刺激する能力について試験する。［³Ｈ］チミジン取り込み検定およびＣＢＡキットを利用して、増殖およびサイトカイン分泌をそれぞれ測定する。

したがって、ＳＴＳＳからの防御に関する読み出し情報は３つある。（ｉ）接種を受けた感染マウスの臨床的および血清学的分析、（ｉｉ）対照マウス血清と比較した、接種を受けたマウスの濾過済み血清とインキュベート後のインビトロでのＨＬＡ−Ｂ６マウス脾細胞の刺激の予防、（ｉｉｉ）対照マウス血清と比較した、接種を受けたマウスの濾過済み血清とインキュベート後の健常なヒトボランティアのＰＢＭＣの刺激の予防。

ＩＶＩＧはＳＴＳＳに関する生存率を有意に改善することが示されており、これは連鎖球菌のスーパー抗原に対する抗体の存在が原因であるとされている。さらに、スーパー抗原およびＭタンパク質に対する自然獲得抗体はＳＴＳＳに対する防御に関与することが示唆されている。

抗ＳｐｅＡ／Ｃ抗体と抗Ｊ８抗体との組み合わせを、ＨＬＡ−Ｂ６マウスをＳｐｅＡ陽性ＧＡＳおよびＳｐｅＣ陽性ＧＡＳに感染させた後の連鎖球菌の負荷、およびＳｐｅＡ／Ｃによるリンパ球刺激に対する防御について、試験する。まず、実験は抗生物質の併用療法を行わずに実施される。ＳｐｅＡ、ＳｐｅＣ、およびＪ８に対するモノクローナル抗体を作製する。モノクローナル抗体を作製するために、スーパー抗原タンパク質ＳｐｅＡおよびＳｐｅＣをToxin Technology Inc.（米国、フロリダ州）から商業的に入手する。発明者らの予備データは、抗Ｊ８抗血清（ＩｇＧ１アイソタイプ）がレシピエントマウスの細菌の生体負荷を４８時間以内にほぼ１０００分の１に減少させることができ（図５Ａ）、感染の６日後にＢＡＬＢ／ｃマウスに投与された抗ＳｐｅＣ抗血清が投与後６時間以内にＳｐｅＣを中和することができる（図５Ｂ）ことを示している。しかし、抗ＳｐｅＣ抗血清治療は皮膚の細菌負荷の減少にはつながらず、Ｊ８抗体のオプソニン活性の必要性を示唆している（図５Ｃ）。ＩｇＧ１モノクローナル抗体を、組換えスーパー抗原に対する抗血清およびＪ８に対する抗血清と共に試験する。活性を、感染したマウスの血清のウェスタンブロット分析（ＷＢ）で２６ｋＤａのスーパー抗原バンドがないこと（スーパー抗原のＭＡｂおよびＪ８のＭＡｂの場合）、および治療の２４時間後の細菌負荷の減少（Ｊ８のＭＡｂの場合）と定義する。ＳｐｅＡ／Ｃの有意な阻害または生体負荷の減少に必要な抗体の最適量を決定する。最も活性の高い阻害物質を、決定した最適用量の抗体を用いた併用免疫療法研究に進める。

ＨＬＡ−Ｂ６マウス（１０匹／群）をＳｐｅＡ陽性またはＳｐｅＣ陽性ＧＡＳに感染させる。次に、マウスに、抗Ｊ８抗体のみ、抗ＳｐｅＡ／Ｃ抗体のみ、両方の組み合わせ、または対照としてアイソタイプが一致するＭａｂ、のいずれかを静脈内経路で投与する。次に、マウスの臨床症状と毎日採取した血液を観察して、血中の細菌負荷とＳｐｅＡ／Ｃの有無を推定する。治療後の様々な時点で採取した血清を、ＨＬＡ−Ｂ６マウスおよびヒトボランティア（スーパー抗原の存在を示す）のリンパ球を活性化するかを試験するのに使用する。血清を肝酵素濃度の測定にも使用する。ＳＴＳＳは肝機能障害を引き起こし、血流低下と循環毒素による黄疸および高濃度のアミノトランスフェラーゼを引き起こす可能性がある。すべてのパラメータの有意な改善が２４時間以内に観察されることが期待される。有益な臨床的利益をもつ治療法を、続いて抗生物質療法（ペニシリン）［２０］を受ける別のマウスコホートに対して実施し、免疫療法が回復を早めることができるかを決定する。

上記の多くの試験を以下に概説する実施例２で実施した。
（要約）

ＳＴＳＳおよびｉＧＡＳ疾患の有病率は毎年増加しており、社会の全区域に波及しているが、取り残されている集団は流行の矢面に立たされている。ＳＴＳＳの現在の最良の治療選択肢はＩＶＩＧおよび抗生物質療法である。ＩＶＩＧは高価で品質にばらつきがあるが、抗生物質と組み合わせて連鎖球菌に特異的な抗体が治療に必要であるという十分な証拠を示している。発明者らの予備データは、Ｍタンパク質および特定の毒素に対する抗体が最良の治療法であるという強力な証拠を示す。Ｊ８に特異的な抗体は、ＧＡＳを中和することができ、Ｍタンパク質の保存領域を標的とすることですべての株に対して防御できるという明確な利点をもつ。ＳｐｅＣ毒素に特異的な抗体は毒素を中和することができ、もう１つの主要な毒素であるＳｐｅＡに対する抗体も同様であるという原理証明を示す。これらの２つの毒素はＳＴＳＳのほとんどの症例の原因である。生物を標的とする免疫応答（抗Ｊ８）と主要な毒素を中和する免疫応答（抗ＳｐｅＡ、抗ＳｐｅＣ）との組み合わせは、これまで試験または開発されていない革新的な段階であるが、さらに発展させて最終的に臨床に進める重要な能力と経験を我々がもっていることを示す。

（序論）

一見では軽症の連鎖球菌感染症が死亡率の高い重篤な侵襲性感染症に急速に悪化する可能性がある。侵襲性Ａ群連鎖球菌感染症（ＩＳＤ）について報告されている全体的な発生率は、先進国では１０万人あたり２〜４人で変動している。ただし、これらのデータのほとんどは、１９９６年〜２００７年に実施された複数の調査から収集したものである［１、２］。２００５年〜２０１２年の期間を対象とした米国の調査では、１０万人あたり３．８人の安定した割合が示された［３］。様々な国で発生率の周期的上昇が以前から説明されているが、最新の報告では、特に２０１３年（カナダ公衆衛生庁）から、カナダ全土の憂慮すべき持続的な発生率増加が示されている。アルバータ州では、率は２００３年の１０万人あたり４．２から２０１７年には１０万人あたり１０．２まで劇的に増加した［４］。若者や高齢者、特に発展途上国からも非常に高い割合が報告されている。たとえば、２００７年のフィジー先住民の発生率は、幼児では１０万人あたり約６０人、高齢者では１０万人あたり７５人であると報告されている［２］。正確な現在の世界の発生率は不明であるが、入手可能なデータは報告されたものよりも著しく高い率を示している。

症例の約２０％で、ＩＳＤは連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）を伴うが、これは多臓器不全を伴い、設備の整った施設でもその致死率は４０％を超える［５］。どのような連鎖球菌感染症の後にも発生する可能性があるが、最も一般的には皮膚の感染症後に発生し、通常は壊死性筋膜炎、筋炎、または深部の皮下出血に関連している。妊娠期および産褥期は、特に発展途上国では過度に危険な期間である［６］。

連鎖球菌の「スーパー抗原」（ＳＡｇ）は、ＳＴＳＳの病態形成に重要な役割を果たすと考えられている。これらの外毒素は、すべての病原性化膿連鎖球菌および黄色ブドウ球菌株によって分泌される［７］。１１個の連鎖球菌ＳＡｇ遺伝子のうち９個はバクテリオファージに存在する。ファージにコードされた連鎖球菌発熱性外毒素（Ｓｐｅ）ＡおよびＳｐｅＣは、ＳＴＳＳのほとんどの症例の原因である。ＳＡｇは、ヒトＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子（ペプチド結合溝の外側）およびＴ細胞受容体鎖の保存領域への非特異的結合に由来する重要な免疫学的効力をもち、ポリクローナルＴ細胞の活性化をもたらす（多くの場合、２５％を超えるＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される）。その結果生じるＴｈ１サイトカインストームは、ＳＴＳＳを定義する低血圧および多臓器不全の原因となる提案された因果関係である。これにより、ＳＡｇの類毒素がワクチン候補として提案されている［８、９］。しかし、ＳＴＳＳの病態形成は完全には理解されていない。連鎖球菌のその他の病原性因子（ＳＬＯ［１０］、ペプチドグリカン、リポテイコ酸［１１、１２］、およびＭタンパク質［１３］など）は炎症性サイトカインの強力な誘導物質であることがインビトロで示されており、これらまたは他の因子がＳＴＳＳに重要な役割を果たし、成功するワクチンおよび免疫療法の開発の鍵となる可能性がある。

「Ｊ８」は、Ｍタンパク質の高度に保存されたＣ３反復領域に基づくワクチン候補である。これは、抗体による好中球オプソニン食作用を介して、皮膚、粘膜、および腹腔内の連鎖球菌性敗血症からマウスを防御することができる［１４〜１６］。ジフテリア類毒素（ＤＴ）に結合すると、ヒト以外の霊長類［１７］およびヒト［１８］で免疫原性であり、現在、免疫原性および有効性を研究するためにさらに臨床試験が行われている。

本実施例では、ＨＬＡ−ＤＲ３−ＤＱ２形質転換マウスを使用してＳＴＳＳをモデル化し、Ｊ８の接種がＳＴＳＳ様疾患を予防できるか、ならびに確立済みのＳＴＳＳをＪ８特異性抗体およびＳｐｅＣ特異性抗体による受動免疫療法が治療できるかを調べた。データは、ＳＡｇとＭタンパク質の両方が病態形成に重要な役割を持つことを示しており、両方に対する抗体が協調して作用し、ＳＴＳＳで死亡した患者から単離したＡ群連鎖球菌生物の疾患の臨床徴候および関連する強力な分裂促進活性の両方を完全に無効にすることを示している。
（結果）
ＳＴＳＳのヒト化マウスモデルの確立

ＳＮ１は、２０１５年に、ＳＴＳＳを経験しこの疾患で死亡したブリスベンの患者の血液から単離された化膿性連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）のｅｍｍ８９株である。ゲノム解析により、調べた既知の１１個の連鎖球菌ＳＡｇ遺伝子すべてから、ＳＮ１が、ファージにコードされたＳｐｅＣ遺伝子と染色体にコードされたＳｍｅＺおよびＳｐｅＧ遺伝子とを発現することが明らかになった（図１５）。その生物はＳｐｅＡに対して陰性であった。別のＡ群連鎖球菌（ＮＳ３３）（足部潰瘍の患者から単離、Royal Darwin Hospitalより供給）はＳＡｇ遺伝子を発現しなかった。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを皮膚の乱切によってＳＮ１またはＮＳ３３に感染させた。これらのマウスは皮膚感染症を発症したが、全身感染症を発症せず、病気にはならなかった。しかし、ＳＮ１感染マウスから採取した血液試料は、ウェスタンブロット（ＷＢ）分析によって決定したところ、ＳｐｅＣ毒素に対して陽性であった。ＮＳ３３感染マウスの血液ではＳｐｅＣは検出されなかった（図６Ａ〜Ｃ）。

ＳＮ１に経皮感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、または大腸菌由来の組換えＳｐｅＣ（ｒｅｃＳｐｅＣ）タンパク質を、Ｂ６またはＨＬＡ形質転換Ｂ６脾細胞培養物に添加した。血清とｒｅｃＳｐｅＣの両方について、ＨＬＡ−Ｂ６マウスの脾臓細胞の有意な増殖が観察された（がＢ６マウスでは観察されなかった）（図７Ａ）。増殖は抗ｒｅｃＳｐｅＣ抗体によって完全には阻害されず、このことは、ＳＮ１に存在する他の分子がなんらかの分裂促進活性を発揮したことを示している（図７Ａ）。増殖応答は、ＳＴＳＳの病態形成に関与する２つの重要なサイトカインであるＴＮＦおよびＩＦＮ−γの産生に反映されていた（図７Ｂ〜Ｃ）。ＮＳ３３感染マウスの血清は、ＨＬＡ−Ｂ６またはＢ６マウスのいずれの脾細胞でも全く増殖を誘導しなかった。

これらの応答のヒトとの関連性を、感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清またはｒｅｃＳｐｅＣを３人の健常な成人ボランティアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加した場合で確認した。ＳＮ１感染マウスの血清に対して用量反応的に（５μｌ／ウェルまで）、すべてのドナーでリンパ球の有意な増殖が観察されたが、ＮＳ３３感染マウスの血清については観察されなかった（図１７）。また、ＳＮ１感染マウスの６日目の血清がヒトリンパ球の最大増殖を引き起こしたことも観察され（図７Ｄ〜Ｆ）、このことは、その時点での血清中のＳｐｅＣ毒素の存在と相関していた（図６Ｃ）。これらのデータは、ＳＮ１が、ＨＬＡ−Ｂ６マウスおよびヒトのリンパ球を非特異的に活性化する能力をもつＳｐｅＣを発現することを示しており、ＳＴＳＳの既知の病態形成と一致している。

次に、ＨＬＡ−Ｂ６におけるＳＮ１の臨床的毒性を評価した。マウスを様々な用量のＳＮ１（１０⁶、１０⁷、または１０⁸ＣＦＵ）で腹腔内感染させた。感染の２４時間後、ＳｐｅＣは１×１０⁶ＣＦＵ感染マウスの血清で検出された（図８Ａ）。この時点で、マウスは臨床症状を示し（図８Ｂ）、これらを（認可されている倫理委員会の手順に従って）安楽死させた。細菌負荷を血液と脾臓で評価した（図８Ｃ）。細菌負荷に直接関連する臨床スコアを伴う用量依存的な感染結果が観察された（図８Ｂ〜Ｃ）。感染マウスの血清で高濃度のＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２が検出された（図９Ｄ〜Ｆ）。

ＨＬＡ−Ｂ６マウスの皮膚感染もＳＴＳＳ様の病状を引き起こすかを調べた。１×１０⁶ＣＦＵによる感染後６日目に、ＨＬＡ−Ｂ６マウスはＢ６マウスに比べて有意に高い皮膚病変の細菌負荷を示した（図９Ａ）。これらのマウスも敗血症を発症したが、細菌負荷は腹腔内経路で感染したマウスよりもはるかに低かった（図９Ｂ）。ＨＬＡ−Ｂ６マウスとＢ６マウスの両方で、ＮＳ３３感染は敗血症を伴わない中程度の局所感染（１０³〜１０⁴ＣＦＵ／皮膚病変）につながった（図９Ａ〜Ｂ）。ＳｐｅＣはそれらの血液中で検出され（図９Ｃ）、それらの血液には高濃度のＴＮＦ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２も含まれていた。ＮＳ３３によるＨＬＡ−Ｂ６マウスの皮膚感染も、ＳＮ１またはＮＳ３３のいずれかによるＢ６マウスの皮膚感染も、サイトカイン誘導にはつながらなかった（図９Ｄ〜Ｆ）。
ＳＴＳＳのワクチン予防

ＨＬＡ−Ｂ６マウスがＳＮ１による表在性または全身性感染後にＳＴＳＳ様の病状を発症することを示したので、ジフテリア類毒素に結合したＪ８をミョウバンと共に投与する接種（Ｊ８−ＤＴ／ミョウバン）によってこれを防ぐことができるかを調べた。接種マウスは、ＳＮ１による皮膚攻撃感染後の皮膚、血液、および脾臓の細菌負荷の１,０００〜１００万倍の減少を示した（Ｐ値はそれぞれ＜０．０５、＜０．００１、および＜０．０１）（図１０Ａ）。ＳｐｅＣは、ＰＢＳを接種した対照マウスの血清では検出されたが、Ｊ８−ＤＴを接種したマウスの血清では検出されなかった（図１０Ｂ）。Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＴＮＦは対照マウスの血清でも検出されたが、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０は防御されたマウスの血清で検出された（図１０Ｃ、Ｄ）。

Ｊ８−ＤＴ接種・感染マウスおよび対照（ＰＢＳ接種／感染）マウスの濾過済み血清、またはｒｅｃＳｐｅＣを、３人の健常な個体から得たヒトＰＢＭＣの培養物に添加した。ＰＢＳ接種／感染マウスの血清は、すべての個体のＰＢＭＣで強力な増殖を引き起こした（ＰＨＡによって誘発されたレベルの最大５０％）。ｒｅｃＳｐｅＣ抗血清の添加によって用量依存的にＴ細胞活性化のレベルが８０〜９０％低下したため、これは主に、血清中に存在する細菌ＳｐｅＣが原因であった（図１０Ｅ〜Ｇ）。Ｊ８−ＤＴ接種／感染マウスの血清は、ＰＢＳ接種/感染マウスの血清に比べて有意に少ない細胞増殖を引き起こし（９０〜９５％減少）、これはｒｅｃＳｐｅＣ抗血清の添加によって基底濃度までさらに減少した（刺激指数：約１；ｐ＜０．０５〜０.０１）（図１０Ｅ〜Ｇ）。このことは、ＷＢの調査からは明らかではなかったがＪ８−ＤＴ接種／感染マウスの血清中にまだＳｐｅＣが残っていることを示していた（図１０Ｂ）。増殖データと一致して、Ｊ８−ＤＴ接種／感染マウス血清によるＰＢＭＣの炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７）の誘導は、ＰＢＳ接種／感染マウスの血清によるサイトカイン産生に比べて有意に減少していた（図１１）。ＰＢＳ接種／感染血清によって誘発された応答は、ｒｅｃＳｐｅＣによって誘発された応答と同等であった。したがって、これらのデータは、ＳＮ１感染後にインビトロで観察された、すべてのＴ細胞活性化およびサイトカイン応答の＞９０％に連鎖球菌ＳｐｅＣが関与していること、ならびに事前のＪ８−ＤＴ接種が血清中分裂促進因子の結果として起こるインビトロ応答の＞９０％を防ぐことができることを示している。Ｊ８−ＤＴの接種が攻撃後の細菌負荷を有意に減少させることができることを以前に示したが、図１０および１１のデータは、ＳＮ１のＭタンパク質に直接的な効果を持つ可能性がありＭタンパク質が持ち得る任意の分裂促進効果を阻害する可能性がある抗Ｊ８抗体に関する、これとは別の役割を排除しない。
ＳＴＳＳに対する免疫療法

ｒｅｃＳｐｅＣ抗血清の治療効果を評価するために、ＨＬＡ−Ｂ６マウスをＳＮ１に経皮感染させ、感染後５日目に抗血清（または無感作血清）で治療した。ＳｐｅＣは、治療前には感染マウスの血清中に存在していたが、６時間後に測定すると有意に減少し、２４時間後には存在しなかった。これは、対照マウスには６時間後および２４時間後に測定したときに存在していた（図１２Ａ）。抗ＳｐｅＣ抗血清による治療は、無感作血清を投与したマウスに比べて皮膚または血液中の細菌負荷を減少させなかった（図１２Ｃ）。

別のＨＬＡ−Ｂ６マウス群を１×１０⁶のＳＮ１細菌に腹腔内感染させた。これらのマウスはより早く病気になり、感染の１８時間後で、平均臨床スコアが１０のときに［１９］、マウスに２００μＬのＳｐｅＣ抗血清、２００μＬの抗Ｊ８抗血清、両方の組み合わせ、または２００μＬの無感作血清を静脈内投与した（図１３Ａ）。Ｊ８−ＤＴおよび／またはｒＳｐｅＣ抗血清を投与したすべてのマウスは２４時間以内に回復し、臨床スコアが有意に減少した（Ｐ＜０．０１〜Ｐ＜０．００１；図１３Ｂ）。しかし、血液および脾臓からの細菌排除が観察されたのは、抗Ｊ８抗体（単独でまたは抗ＳｐｅＣ抗体と組み合わせて）を投与したマウスのみであり（Ｐ＜０．０１；図１３Ｃ）、血中のＳｐｅＣの排除が観察された（ＷＢ検定を使用）のは抗ｒＳｐｅＣ抗体（単独でまたは抗Ｊ８抗体と組み合わせて）を投与したマウスのみであった（図１３Ｄ〜Ｇ）。
ＳＮ１由来のＭタンパク質は分裂促進効果を発揮し炎症誘発性応答に寄与する

Ｊ８−ＤＴおよびＳｐｅＣ特異的抗血清がインビボでＳＴＳＳ様の病状を治療する能力をインビトロ試験でさらに解明した。ＳＮ１感染マウスの血清のＨＬＡ−Ｂ６脾細胞に対する分裂促進効果は、抗ＳｐｅＣおよび抗Ｊ８−ＤＴ抗血清によって部分的に阻害されたが、両方の抗血清の組み合わせによって完全に阻害され（図１４Ｂ）、このことは、このモデルではＪ８特異抗体がＳＴＳＳの治療に二重の役割を果たすことを示している。それらは細菌を排除するだけでなく、ｅｍｍ８９のＭタンパク質の分裂促進効果を阻害する。これは、抗ＳｐｅＣ血清との相乗効果を持つ。可能性は低いが、ＳＮ１血清には、Ｊ８に交差反応するエピトープを含む他の分裂促進因子が含まれている可能性がある。そこで、抗Ｊ８抗体がｒｅｃＭ１の分裂促進効果を阻害するかどうかを調べた。図１４Ｃは、ｒｅｃＭ１およびＳｐｅＣの両方が分裂促進活性を有し（前述のとおり）、両方の効果が相加的であることを示している。さらに、抗Ｊ８−ＤＴ抗血清は、ｒｅｃＭ１の分裂促進効果を完全に阻害する。抗Ｊ８−ＤＴと抗ＳｐｅＣとの組み合わせは、Ｍ１＋ＳｐｅＣの組み合わせられた分裂促進活性を完全に阻害する。これらのデータは、まとめると、抗Ｊ８抗体が２つの異なるＭタンパク質の分裂促進活性を阻害できることを示している。データは、Ｊ８エピトープが分裂促進活性を持つことを示唆しているのではなく、単にＪ８に対する抗体がＭタンパク質を中和できることを示唆している。Ｍタンパク質の分裂促進決定因子がタンパク質のアミノ末端の半分に位置することを示唆している研究者もいる。
（考察）

ここで提示したデータは、ＨＬＡヒト化マウスモデルにおいて、ＳＴＳＳ様疾患をワクチン接種によって予防すること、および確立済みの疾患をＪ８に対する抗体とＳｐｅＣに対する抗体とを含む特異的免疫療法によって迅速に治療することが可能であることを示している。Ｊ８に対する抗体は二重の効果を持つ。すなわち、それらは細菌を排除するだけでなく、Ｍタンパク質の分裂促進効果を直接阻害する。一方、ＳｐｅＣに対する抗体はそのタンパク質の活性を阻害する。総合的に、効果は相乗的で、ＳＴＳＳ様疾患を完全に解決することができる。

ＳＴＳＳを予防するためのワクチンを開発する取り組みはわずかである。ある研究集団は、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＣに対する類毒素を開発し、ウサギへのワクチン接種によって、毒素を中和し、ミニ浸透圧ポンプを介して投与された天然毒素からウサギを防御する抗体を導くことができることを示している。ウサギは、連鎖球菌感染症にさらされていなかった［８、９］。このワクチン手法は有望であるが、連鎖球菌疾患の一側面のみから防御するために複数の類毒素をワクチン接種する必要があるという弱点がある。発明者らのデータは、この手法が細菌性敗血症を軽減しないことを示唆している。ＨＬＡ形質転換マウスは特定のＨＬＡ型がよりＳＴＴＳにかかりやすいことを示すのに使用されている［２０］が、連鎖球菌ＳＴＳＳに対するワクチンまたは治療法の開発をモデル化するためには使用されていない。しかし、それらは黄色ブドウ球菌のスーパー抗原の既知の非毒性断片を用いて候補ワクチンを開発するのに使用されている［２１］。これらのマウスを、その生物ではなく組換えＳＡｇで攻撃した。

発明者らは、Ｍタンパク質の高度に保存された部分に基づく候補Ａ群連鎖球菌ワクチン（［２２］に概説）を開発した。抗原はＪ８として知られており、その配列はＭタンパク質のＣ３反復の１２個のアミノ酸を模倣している。ジフテリア類毒素に結合したＪ８（Ｊ８−ＤＴ）を接種すると、Ｍ型に関係なくインビトロでＡ群連鎖球菌をオプソニン化する抗体を誘導し、攻撃後の細菌負荷を軽減することで腹腔内、皮膚、および粘膜の攻撃からマウスを防御することができる［１４、１６、２３〜２５］。ＨＬＡヒト化マウスでは試験されていなかったが、このようなワクチンによる防御はＳＴＳＳに対する防御に発展することが想定されていた。しかし、ＳＡｇはその疾患において中心的役割を果たすと考えられているため細菌負荷はいくらか減少するとしても、抗Ｊ８抗体による受動免疫療法が確立済みの疾患を解決するとは想定されず、また、Ｊ８に対する抗体が血清中ＳＡｇ濃度に影響するという示唆はなかった。２００μＬのＪ８免疫血清が（単独でまたは抗ＳｐｅＣ抗血清との併用で）血液および脾臓のすべての細菌負荷を実質的に排除し、さらには臨床スコアを解決することができたことは意外であった。発明者らのデータは、ＳＴＳＳの病態形成にＳｐｅＣまたはＳＡｇが重要な役割を持つことと相反していない。というのも特に抗ＳｐｅＣ抗体も臨床徴候を迅速に解決することができるからである。しかし、データは、疾患の発症にはＳＡｇだけでは不十分であることを立証している。

ＳＡｇに加え、連鎖球菌Ｍタンパク質も重症の連鎖球菌感染症につながる炎症誘発性応答に関与していることが報告されている［２６〜２９］。ＴＬＲ２によって単球を刺激することにより、Ｍタンパク質は大量の炎症誘発性サイトカインを産生することができる。好中球由来のヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）と相乗的に作用することにより、Ｍタンパク質は血管漏出を誘導し、重症の連鎖球菌感染症に見られる病態生理学的結果の一因となる［３０］。Ｍ１、Ｍ３、およびＭ５などのいくつかのＭタンパク質は、一貫してＩＳＤおよびＳＴＳＳの発生と関連している［３１〜３３］。Ｍ１およびＭ５などの特定の血清型のＭタンパク質のＢ反復領域も、スーパー抗原として作用して炎症反応の一因となる可能性がある［３４］。特定の連鎖球菌血清型（異なる表面Ｍタンパク質を持つ株を区別する）がＩＳＤと関連していると報告されているが、この関連は、当時の母集団中の最も一般的な血清型を反映しているにすぎないと考えられている［２］。しかし、Ｍタンパク質は自然免疫と獲得免疫の両方を下方制御することができ、ＩＳＤの病態形成の一因である可能性がある。
Ａ群連鎖球菌ｅｍｍ８９およびＳｐｅＣのＩＳＤとの関連は、最近の多くの報告、さらには日本（ｅｍｍ８９がＳＴＳＳ症例で２番目に優勢な遺伝子型であった）で指摘されている［３５］。

表面Ｍタンパク質（およびＳＡｇ）に対する抗体は、侵襲性疾患を発症する個体では有意に低い［３６］ことが知られており、母集団中の抗体が低濃度であることが１９８０年代に始まったＩＳＤの流行の一因となった可能性があることが示唆されていた［３７、３８］。しかし、感染前の個体で抗体が低いか、あるいは抗体異化作用の結果として感染が始まった後に抗体が低くなるかを判断することはできない。この問題に直接対処する方法は、動物にワクチン接種して攻撃し、すなわち感染させて治療することができるＳＴＳＳモデルを使用することである。

発明者らは、毒素の存在は全身感染とは無関係であることを見出した。検出可能な菌血症を伴わない表在性皮膚感染後のマウスの血液中でＳｐｅＣが検出された。これらのマウスは疾患の病理学的徴候を示した。これは、臨床疾患のいくつかの症例で観察されている［３９］。発明者らは、表在性皮膚感染後、感染後６日目の感染血清中で毒素が検出されたことに注目した。このことは、感染の初期段階で毒素がゆっくりと放出されることを示唆していた。この所見は、感染後７日目に高濃度のＳｐｅＡの発現が認められたテフロン組織容器モデル［４０］と一致している。腹腔内（ＩＰ）感染後のＳＴＳＳの急性発症は非常に明白であり、感染後２４時間以内に感染マウスの血液中で毒素が検出され、高い臨床スコアが得られた。対照的に、表在性皮膚感染症は、進行性の感染症の発症を示していた。

発明者らは、マウスとヒトの両方で、ＳＡｇの分裂促進活性に関連する典型的な病理を実証した。感染マウスの血清中のＳｐｅＣの量は、ＨＬＡ−Ｂ６マウスの脾細胞をＣｏｎＡまたはｒＳｐｅＣによって引き起こされるレベルに匹敵するレベル（高くはなくても）に刺激する可能性があった。ＳＮ１感染血清によって引き起こされた増殖は、ｒＳｐｅＣのみによって引き起こされた増殖よりも高かった。したがって、このことはＳＮ１感染血清に存在する他のなんらかの分裂促進因子の関与を示唆している。

感染マウスの血清に抗ＳｐｅＣ抗血清を添加すると、増殖応答を有意に阻害することができ、したがって、増殖が主にＳｐｅＣによるものであることが確認された。しかし、治療群で残存する増殖が観察されたことから、他のＳＡｇまたはＭタンパク質などＡ群連鎖球菌のその他の病原性因子が関与していることが示された。

発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ６マウスのワクチン接種がＳＴＳＳ予防に有効であることに注目した。特に、防御のメカニズムには、分泌されたＳｐｅＣの特異的な中和ではなく、Ａ群連鎖球菌の排除が含まれていた。Ｊ８−ＤＴのワクチン接種は局所および全身の細菌負荷を有意に減少させ（＞９０％）、それによってＳＴＳＳ関連の病状からマウスを防御した。さらに、ワクチン接種を受けた感染マウスの血清は健常な個体のＰＢＭＣの最小限の増殖を引き起こすことも示された。発明者らは、この効果は、血清中にＳｐｅＣだけでなくＡ群連鎖球菌感染症の結果として通常は存在して全体的な疾患の結果に関与する他の因子も存在しないことに起因する可能性があると考えている。

受動免疫療法はＳＴＳＳを治療する手段として有望である。免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）は、ＳＴＳＳの致死率を有意に低下させることが分かっている［４１］。この研究は歴史的対照を使用したが、これより最近の６７人の患者を対象としたスウェーデンの前向き対照研究では、死亡率は、抗生物質のみで治療された４４人の患者のうち２２人（５０％）であったのに対し、ＩＶＩＧと抗生物質で治療された群では２３人中３人（１３％）であった（Ｐ＜０．０１）［４２］。ただし、臨床的利益のためには、ＩＶＩＧで４０を超えるスーパー抗原抗体価が必要であると推定されている。

これは、ＩＶＩＧに見られる特異的抗体の量に近いため、ＩＶＩＧの複数回投与が推奨される。ＩＶＩＧはコストが高く、バッチ間でばらつきがあり［４３］、供給が難しいことから、代わりの補助療法の必要性が強調されている。Ａ群連鎖球菌のすべての株による感染を予防したワクチン、あるいは診断の時点で抗生物質と共に、または抗生物質なしで行われた特異性抗体免疫療法は、はるかに大きな有用性を持つと考えられる。発明者らは、ｒＳｐｅＣ抗血清の投与は毒素を中和することはできるが、ＳＮ１感染ＨＬＡ−Ｂ６マウスの細菌負荷を減少させることはできないことを見出した。この所見により、個体を治療するためには系からの完全な毒素排除が保証されるまで抗ｒＳｐｅＣ血清を複数回投与する必要があるという事実が強調された。しかし、その個体が生きたＡ群連鎖球菌を有している限り、毒素および関連する病状に関する懸念は排除されない。

発明者らは、毒素中和だけでなく系からのＡ群連鎖球菌の排除につながる併用免疫療法がより良い代替法であるかもしれないと仮定した。Ａ群連鎖球菌の排除によって、毒素中和のための継続的な治療の必要性が低減されるだけでなく、ＳＴＳＳの病状の原因となる他の病原性因子の可能性が排除される。過去の報告と一致して、発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ６モデルではＡ群連鎖球菌のＳＡｇがＳＴＳＳの病態生理学の唯一の決定因子ではない可能性があり、Ｍタンパク質など他のＡ群連鎖球菌病原性因子が重要な役割を果たす可能性があることを実証している。Ａ群連鎖球菌ｅｍｍ８９分離株を利用することにより、ＳＡｇであるＳｐｅＣとＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質とが連携して作用し、感染後に見られる臨床疾患の原因となることを示すことができた。Ｊ８−ＤＴ抗血清によるインビボでのＭタンパク質の中和は、フィブリノーゲンとの相互作用、およびその後の好中球のＢ２インテグリンによる認識を防ぐ。最終結果として、ＳＴＳＳの重要な事象である血管漏出の原因因子の活性化および放出はない。インビトロでのＭタンパク質の中和は、サイトカイン誘導およびそれ以降の炎症反応の欠如を含む異なるメカニズムに従っていた可能性がある。

本明細書全体を通して、目的は、本発明をいずれかの一態様または特定の特徴の集合に限定することなく、本発明の好ましい態様について説明することである。本発明の広い精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載かつ例示された態様に様々な変更および修正を加えてもよい。

本明細書で参照するすべてのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、および科学技術文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (25)

1. 哺乳動物のＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態、好ましくは連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）などの侵襲性Ａ群連鎖球菌疾患（ｉＧＡＳ）に対する受動免疫付与、治療、または予防に使用するための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するか、それに対して産生された抗体または抗体断片、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片。
2. 哺乳動物のＡ群連鎖球菌関連疾患、障害、または状態、好ましくは連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）などの侵襲性Ａ群連鎖球菌疾患（ｉＧＡＳ）に対する免疫付与、治療、または予防に使用するための、Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体。
3. 哺乳動物に連鎖球菌毒素性ショック症候群に対する受動免疫を付与する方法であって、前記哺乳動物にＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与することによって、前記哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群に対する受動免疫を前記哺乳動物に付与する工程を含む、方法。
4. Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群を治療または予防する方法であって、前記哺乳動物にＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与することによって、前記哺乳動物の連鎖球菌毒素性ショック症候群を治療または予防する工程を含む、方法。
6. Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体、ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を投与する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片を含む、哺乳動物への投与に適した組成物。
8. Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された抗体または抗体断片をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
9. Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体と、Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体とを含む、哺乳動物への投与に適した組成物。
10. 前記Ｍタンパク質断片は、前記Ｍタンパク質の保存領域であるかそれを含む、請求項１または２に記載の使用、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法、あるいは請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記Ｍタンパク質断片は、ｐ１４５ペプチドであるか、それを含むか、それに含まれる、請求項１０に記載の使用、方法、または組成物。
12. 前記Ｍタンパク質断片は、Ｊ８ペプチド、その断片、多様体、または誘導体であるか、それを含むか、それに含まれる、請求項１１に記載の使用、方法、または組成物。
13. 前記Ｍタンパク質断片は、ｐ１７ペプチド、その断片、多様体、または誘導体であるか、それを含むか、それに含まれる、請求項１１に記載の使用、方法、または組成物。
14. 前記スーパー抗原は、連鎖球菌発熱性外毒素（Ｓｐｅ）ＡまたはＳｐｅＣである、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用、方法、または組成物。
15. Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された前記抗体または抗体断片；ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された前記抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体または抗体断片である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用、方法、または組成物。
16. Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された前記抗体または抗体断片；ならびに／あるいはＡ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された前記抗体または抗体断片は、ヒト化モノクローナル抗体または抗体断片である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用、方法、または組成物。
17. 前記哺乳動物はヒトである、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用、方法、または組成物。
18. Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生されたモノクローナル抗体またはその断片。
19. Ａ群連鎖球菌スーパー抗原タンパク質、その断片、多様体、または誘導体に結合するかそれに対して産生された、モノクローナル抗体またはその断片；あるいは抗体または抗体断片。
20. 組み換え抗体または抗体断片である、請求項１８または請求項１９に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
21. ヒト化されている、請求項２０に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
22. 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組み換えモノクローナル抗体またはその断片をコードする単離核酸。
23. 請求項２２に記載の単離核酸を含む遺伝子構築物。
24. 請求項２３に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
25. （ｉ）請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片；（ｉｉ）請求項２２に記載の単離核酸；（ｉｉｉ）請求項２３に記載の遺伝子構築物；ならびに／あるいは（ｉｖ）請求項２４に記載の宿主細胞を含む、組成物。

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