CN1082091C - 重组人肿瘤坏死因子及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-NC)，它与天然TNF相比，在氨基端1-7位氨基酸残基缺失，第8、9、10位氨基酸被置换，羧基末端Ala和Leu至少一个被置换，抗肿瘤疗效高、毒副作用小。本发明提供了制备方法，可供工业化生产。
Description
本发明涉及生物制品，具体是涉及一种新型重组肿瘤坏死因子及制备方法。
恶性肿瘤是危害人类生命的重要疾病之一。抗肿瘤药物的研究现已扩展到细胞因子，1978年开始，应用天然人肿瘤坏死因子(本文简称TNF)进行临床抗肿瘤试验，证实其具有直接杀伤肿瘤细胞、破坏肿瘤组织的作用。但是，它的毒副作用很大，尤其是静脉给药时，可引起发热、寒颤、呼吸困难、低血压等不良反应。因此限制了TNF的使用剂量，抗肿瘤作用亦难以发挥。
本发明的目的在于研制抗肿瘤作用强，毒副作用低的新型TNF。
本发明提供了一种新型重组人肿瘤坏死因子(本文简称rhTNF-NC)。本发明的rhTNF-NC基因含：1个Ndel酶切位点和1个EcoRI酶切位点，在起始密码子(ATG)后紧接ArgLysArg的密码子(5′CGC AAA CGT3′)，其后是天然h TNF11以后的氨基酸编码序列对应的核苷酸序列，但156位和Ala和157位Leu的密码子(GCC)和(CTG)至少有一个改为Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn的密码子(CAG、TCG、GGG、ACG、TAC、AAC)中的一个，终止密码子为TGA。
经改造后所所得rhTNF-NC基因对应的氨基酸序列共151个氨基酸。与天然hTNF相比，天然hTNF氨基端第1-7位氨基酸残基缺失，第8、9、10位氨基酸置换为Arg、Lys、Arg，羧基末端Ala和Leu至少有一个置换为Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn中的一个。
本发明的rhTNF-NC抗肿瘤药效学及免疫试验结果如下：一、主要试验方法
1.体外试验：
用细胞毒法。按公式求出各浓度组的抑制率，通过各浓度的抑制率求直线回归方程，算出IC50值。
抑制率＝(1-受试孔OD值/对照组OD值)×100％
2.体内试验
2.1.皮下接种实体瘤试验。按公式计算肿瘤抑制率，每次实验均重复三次。
肿瘤抑制率％＝(1-试验组瘤重/对照组瘤重)×100％
2.2.腹水型肿瘤延长生命试验。按公式计算延长率，每次实验均重复三次。
生命延长率％＝(试验组动物平均生存天数/对照组动物平均生存天数)×100％
2.3.实体肿瘤瘤内给药的出血坏死试验：取生长旺盛的肉瘤S-180匀浆法制备成约1-2×107/ml细胞悬液，接肿于昆明种小鼠右腋下，次日随机分组，在接种后8天分别it及iv给药一次，给药后24小时解剖肿瘤，各组肿瘤标本的出血性坏死程度参照Carswell的标准判断。
2.4.实体瘤内给药试验：取生长旺盛的人体肝癌QGY匀浆法制备成约1-2×107/ml细胞悬液，接种于裸小鼠右腋皮下，待肿瘤接触后，次日随机分组并开始进行瘤内给药，给药结束后适当时间进行解剖，按前述公式计算肿瘤抑制率，每次实验均重复三次。
3.免疫试验方法
3.1.腹腔巨噬细胞(Mφ)吞噬功能试验
3.2.荷Lewis肺癌小鼠NK细胞活性测定
3.3.白细胞介素-I(IL-1)的检测
4.给药方法与试验对照
体内试验采用与临床相同的iv途径，以iv×5qod方案。
另一途径为ip×5qod方案。
个别肿瘤模型还以it×5qod方案。
空白对照：相应溶剂
阳性对照：腹水瘤采用丝裂霉素(MMC)，实体瘤采用环磷酰胺(CTX)，原型rhTNF。二、主要结果
表1 rhTNF-NCiv对C-26结肠癌的作用抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 40.13 40.08 42.86rhTNF-NC 3.284×17 32.63 32.63 29.90rhTNF-NC 6.568×106 25.17 25.17 13.95阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表2 rhTNF-NCip对C-26结肠癌的作用
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 37.29 35.06 36.79rhTNF-NC 3.284×107 30.03 29.15 30.43rhTNF-NC 6.568×106 14.19 17.34 18.73阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表3 rhTNF-NCiv对黑色素瘤B16肺转移的作用
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 49.54 54.82 51.08rhTNF-NC 3.284×107 31.63 34.53 38.27rhTNF-NC 6.568×106 10.98 22.75 20.96阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表4 rhTNF-NCip对黑色素瘤B16肺转移的作用
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 43.00 39.29 38.91rhTNF-NC 3.284×107 32.19 30.98 29.18rhTNF-NC 6.568×106 15.01 19.52 16.57阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0
表5 rhTNF-NC iv对荷S180肉瘤腹水型小鼠延长生命的作用延长率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 48.87 47.06 43.44rhTNF-NC 3.284×107 39.85 38.23 33.61rhTNF-NC 6.568×106 15.79 19.12 18.03阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0
表6 rhTNF-NC ip对荷S180肉瘤腹水型小鼠延长生命的作用
延长率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 54.26 53.97 55.74rhTNF-NC 3.284×107 40.31 43.65 37.87rhTNF-NC 6.568×106 29.48 31.75 33.62阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0
表7 rhTNF-NC iv对荷人体肠癌Lovo小鼠延长生命的作用
延长率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 32.87 36.95 32.94rhTNF-NC 3.284×107 22.38 28.14 24.72rhTNF-NC 6.568×106 18.88 16.60 12.45阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0
表8 rhTNF-NC ip对荷人体肠癌Lovo小鼠延长生命的作用
延长率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 44.26 43.87 47.00rhTNF-NC 3.284×107 31.15 35.48 34.93rhTNF-NC 6.568×106 18.03 23.65 19.97阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表9 rhTNF-NC与rhTNF it 对人体肝癌(QGY)
的作用比较
延长率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 79.09 83.55 79.95rhTNF-NC 3.284×107 68.03 71.85 70.34rhTNF-NC 6.568×106 52.38 55.04 57.69rhTNF 2.286×105 55.41 55.04 60.10阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表10 rhTNF-NC与rhTNF iv 对人体肝癌(QGY)
的作用比较
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 40.00 42.53 37.75rhTNF-NC 3.284×107 30.59 33.64 30.39rhTNF-NC 6.568×106 17.65 15.89 15.20rhTNF 2.286×105 21.57 18.22 19.12阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表11 rhTNF-NC与rhTNF ip对S180
实体瘤的作用比较
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 50.91 42.86 45.12rhTNF-NC 3.284×107 42.18 35.71 35.69rhTNF-NC 6.568×106 25.09 7.109 14.48rhTNF 2.286×105 28.36 13.21 19.53rhTNF 4.572×104 16.36 13.21 17.51rhTNF 9.144×103 12.36 8.9 21.55阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表12 rhTNF-NC与rhTNF iv对S180
实体瘤的作用比较
抑制率(％)组别 剂量(u/M2) (1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×108 57.97 50.07 52.51rhTNF-NC 3.284×107 42.42 42.85 45.15rhTNF-NC 6.568×106 20.06 14.28 23.08rhTNF 2.286×105 22.04 14.28 31.10rhTNF 4.572×104 13.49 10.71 17.06rhTNF 9.144×103 17.43 10.71 14.72阴性对照 相应溶剂 0.0 0.0 0.0表13 rhTNF-NC对昆明种小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的作用组别 剂量(u/M2) 吞噬指数(X±SD)
(1) (2)rhTNF-NC 3.284×107 0.913±0.146*** 0.574±0.108***rhTNF-NC 6.568×106 0.892±0.164*** 0.596±0.074***阴性对照 相应溶剂 0.437±0.122 0.258±0.061***P＜0.01表14 rhTNF-NC对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
CPM值(X±SD)组别 剂量(u/M2) (1) (2)rhTNF-NC 1.642×108 5166±680** 4735±1123*rhTNF-NC 3.284×107 4846±734** 4100±523**rhTNF-NC 6.568×106 4529±749** 3874±984**阴性对照 相应溶剂 6287±1670 5447±1361**P＜0.01，*P＜0.05表15 rhTNF-NC对体外培养腹腔巨噬细胞
诱生分泌IL-1的作用组别 剂量 最大反应百分率
(μg/ml) 1∶64 1∶32 1∶16 1∶8 1∶4rhTNF-NC 1 6.99 11.97 23.56 50.23 100
11.45 13.20 35.25 50.87 100rhTNF-NC 0.1 6.92 8.70 10.81 12.83 15.86
11.18 10.93 15.43 12.86 20.25LPS 6.20 8.60 7.0 7.58 7.83
9.90 15.61 11.77 13.86 10.26表16 rhTNF-NC对各种肿瘤细胞株的体外抑制作用细胞株 样品 IC50(pmol/ml)
(1) (2) (3)L929 rhTNF 0.442 0.382 0.46
rhTNF-NC 0.042 0.039 0.048CNE-2 rhTNF 1.868 1.648 1.548
rhTNFNC 0.192 0.159 0.162RCC94616 rhTNF 1.581 1.850 1.643
rhTNF-NC 0.166 0.190 0.139A59 rhTNF 2.325 1.652 1.766
rhTNF-NC 0.196 0.140 0.149三、试验结论：
1、新型重组人肿瘤坏死因子-NC(rhTNF-NC)体外试验对人体肿瘤细胞株；成纤维细胞系L929、鼻咽癌细胞CNE-2、肾透明细胞癌RCC94616以及肺癌细胞A59均有明显的抑制作用。
rhTNF-NC对各种细胞株的抑制效果明显高于原型rhTNF
2、体内抗肿瘤试验对小鼠结肠癌C-26、小鼠黑色素瘤B-16实验肺转移、人体肠癌Lovo、人体肝癌QGY、小鼠肉瘤S180腹水型及肉瘤S180实体，均显示出一定的抑瘤或延长生命的效果，尤其对QGY瘤内注射效果更为明显，实验重视性好，且有一定的量效关系与文献报道结果类同。
对S180肉瘤内iv或it一次注射结果显示其有一定的出血坏死作用。
3、rhTNF-NC与原型rhTNF比较(等毒剂量)对S180实体瘤进行了疗效比较试验，结果rhTNF各剂量组均未见明显的抑瘤作用；it也表明rhTNF-NC抑瘤作用比rhTNF强的多。
4、rhTNF-NC对昆明种小鼠腹腔巨噬细胞有明显提高吞噬活性；对荷Lewis肺癌小鼠的NK细胞活性也有较明显的提高。以及对体外培养腹腔巨噬细胞分泌IL-1具有明显的诱生作用。
本发明的rhTNF-NC的药理学研究结果如下：(一)对小鼠神经系统的影响
实验方法：采用1.25×107u/m2(小剂量组)和2.50×107u/m2(大剂量组)，分别相当于文献报道推荐临床剂量的20和40倍，生理盐水组0.1ml/10g，分别观察记录给药前、给药后10、20、30、60、90及120min的小鼠自发活动情况。记录给药前、给药后30、60、120及180min的小鼠爬杆活动状况，并连续给药一周后再观察记录一次。
结果表明：rhTNF-NC对小鼠神经系统无影响。(二)对大鼠心血管系统的影响
实验方法：采用6.25×106u/m2和1.25×107u/m2，分别相当于文献报道推荐临床剂量的10和20倍，生理盐水组0.2ml/100g。分别观察记录给药前、给药后10、20、30、60、90及120min的大鼠心率、心律、ECG之T波、QRS时间、ST段、收缩压、舒张压和平均动脉压。
结果表明：无论是给药组之间，给药组与生理盐水对照组之间，以及各组给药前后比较，均无显著差异(P＞0.05)。表明iv rhTNF-NC对循环系统无明显影响。(三)对大鼠呼吸系统的影响
实验方法：采用6.25×106u/m2和1.25×107u/m2，分别相当于文献报道推荐临床剂量的10和20倍，生理盐水组0.2ml/100g，分别观察记录给药前、给药后10、20、30、60、90及120min的大鼠呼吸频率、节律和深度。
结果表明：无论是给药组之间，给药组与生理盐水对照组之间、以及各组给药前后比较，均无显著差异(P＞0.05)。表明iv rhTNF-NC对呼吸系统无明显影响。
本发明的rhTNF-NC的毒理学研究结果如下；一、rhTNF-NC急性毒性试验
本实验观察了iv、im及ip rhTNF-NC对小鼠的急性毒性，得出了相应的LD50和MTD；观察了iv和ip rhTNF-NC对大鼠的急性毒性，得出了相应的LD50和MTD。小鼠iv LD50 7.77×108u/m2小鼠im MTD＞3.90×108u/m2小鼠ip MTD＞1.25×109u/m2大鼠iv LD50＞1.25×109u/m2大鼠ip MTD＞1.25×109u/m2实验结果：
体重和食量等8项生理指标无明显改变。二、rhTNF-NC iv对猴的长期毒性试验实验方法：
恒河猴随机分为正常对照组，原型rhTNF对照组rhTNF-NC小剂量组和大剂量组每组4只。大、小剂量组给药量分别为9.3×107U/m2和9.3×106U/m2，分别相当于文献报道推荐临床剂量的150倍和15倍。原型对照组剂量为6.2×107U/m2，相当于文献报道推荐临床剂量的100倍。iv连续给药30天，rhTNF对照组给药10天。停药后24h宰杀一半作病检，另一半继续观察15天后宰杀病检。
观察指标：
症状观察动物的体重、肛温、呼吸、心率、食量、呕吐、流涎、尿、粪便、步态、行为、精神、活动、呼唤反应、瞳孔大小、对光反射等共16项。体温、肛温、瞳孔、呼吸和心率给药前测2次，给药后每半月测1次，其余项目从给药前1周起每天观察1次。
ECG按标准操作规程，猴取自然站立位，描记肢体II导联。
血液学 用美国产CD-610型全自动血球计数仪测定。
血液生化 静脉取血，分离血清，用意大利产Unifast II型血动生化分析仪测定。
尿液分析 用广州东方化学应用研究所产的八联试纸测定。
以上ECG、血液学、血液生化和尿液分析，分别于给药前(d0)给药期间(d15、d30，原型组为d7，d10)及停药后(d45，原型组为d25)检测。d0间隔一周测2次取均值，余各测1次。
病理检查 末次给药后24hr iv戊巴比妥钠麻醉，用颈总动脉放血及气管切断法宰杀一半动物，另一半观察15天后同法宰杀病检。对心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、甲状腺、前列腺、睾丸及附睾、子宫及卵巢12个脏器称重，并分别计算各脏器的相对重量。组织光镜观察有：心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、甲状腺、肾上腺、胸腺、胰腺、肠系膜淋巴结、前列腺、膀胱、睾丸及附睾或卵巢及子宫、视神经、注射局部静脉等共24项。
骨髓检查于宰杀的同时在股骨取材，涂片，染色，镜检。
抗血清效价测定(ELISA法)于d15、d30、d45分别测rhTNF-NC抗血清效价，原型组于d10、d15和d25分别测rhTNF抗血清效价。实验结果：
临床症状 实验过程中，正常组猴进食正常，能吃完所有喂的食物，小剂量组也能基本吃完。但速度比正常组稍慢，大剂量组则食欲大减，仅能吃少量食物，原型对照则不吃或仅吃极少。此外，正常组猴生长良好，皮毛均匀有光泽，活泼好动，呼吸反应灵敏，瞳孔大小正常，对光反射良好，无呕吐、流涎。而给药组尤其是大剂量组和原型对照组除纳差外，活动明显减少，毛发疏松无光泽，原型对照组尤其甚，精神萎靡，佝背或倚笼坐卧。
血液学指标RBC、Hb、Hct、MCV、MCH、WBC及分类，凝血时间和血小板的变化与正常对照组相比，在停药时原型rhTNF对照组的RBC、Hb及Hct均显著低于正常对照组见表17。因此可认为rhTNF可导致猴贫血。此外大剂量组在d15时MCV和MCH均显著大于正常对照组，但仍在正常范围内。表17 rhTNF-NC iv猴长期毒性血液学变化
停药时组别 RBC Hb Hct正常 5.65±0.93 120±8 0.327±0.038小剂量 5.81±0.4 128±11 0.349±0.026大剂量 4.73±0.9 109±5 0.270±0.048原型 4.20±0.5* 107±6* 0.245±0.039* *P＜0.05
血液生化指标ALT、AST、ALP、TP、Alb、BUN、Crea、Tch、TBill及Glu的变化在给药组之间，给药组与对照组之间无统计学上的明显差异。但从人体上来看，原型对照组公5号和母11号动物在濒死前AST、BUN和Crea均非常显著地升高，显示了肝脏和肾脏受损见表18。
表18 rhTNF-NC iv猴长期毒性血液生化变化
停药时组别 AST BUN Crea正常 312±56 4.9±1.0 23±11小剂量 329±181 4.2±0.8 65±8大剂量 227±141 4.6±0.9 71±13原型5号 982 18.38 12611号 1050 12.43 101
上述试验中，rhTNF-NC iv猴，剂量分别为9.3×107U/m2和9.3×106U/m2，分别相当于推荐临床剂量的150倍和15倍(rhTNF-NC iv成人常用量为6.2×105U/m2)，连续30d，经生化指标共30项、病理检查共24项检测，未见严重的药物性毒性反应。与此相对照，rhTNF iv猴，剂量为6.2×107U/m2(相当于推荐临床剂量的100倍)见产生了较为明显的肝脏和肾脏毒性，引起红系降低，导致注射局部静脉炎及血栓形成等，并在给药后10天内出现了一半动物死亡，说明同等活性的rhTNF-NC比rhTNF的毒性低得多，其应用于临床将会有更大的安全性。
本发明的rhTNF-NC的特殊毒性试验：(一)致突变试验1、Ames试验
rhTNF-NC对鼠伤寒沙门氏菌四株标准测试菌株TA97、TA98、TA100和TA102的回复突变作用，结果表明，在0.1-500μg/皿(2×104-108μ/皿)剂量范围内，无论是否加入S9活化系统，rhTNF-NC均不引起四株测试菌株回复突变率增高，无致突变性。2、对CHL细胞染色体畸变试验
rhTNF-NC浓度为37.5、70.0、150.0和300.0μg/ml时分别与CHL细胞接触培养(包括加S9)，24和48h收获细胞，结果染色体畸变率在正常范围(1.5-5.5％)。3、小鼠骨髓细胞微核试验
rhTNF-NC 2.66、1.33、0.67、0.07μg/kg(1.744×106、0.872×106、0.436×106、0.436×105u/m2)四个剂量SC后12、24、36、48、72hr后取材，其它各组分别于给药后24hr取材制片，观察嗜多染色细胞的微核率，结果给药组微核细胞率为0.33-2.00，溶剂为1.50，无显著差异，阳性对照药环磷胺为36％。表明在本实验剂量下，rhTNF-NC对小鼠骨髓细胞微核率无明显影响。(二)对小鼠敏感期致畸试验
rhTNF-NC0.1、0.6、3.6μg/kg(0.65×105、0.39×106、2.34×106u/m2)三个剂量，相当于文献报道临床剂量的3、18和108倍，于小鼠妊娠第6-15天连续SC，每天一次，未发现明显的胚胎毒性及致畸胎作用，与溶剂对照组相比无显著差别。表明在此剂量范围内，rhTNF-NC对小鼠无胚胎毒性和致畸胎作用。
本发明的另一目的是提供了新型重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-NC)的制备方法，该方法包括以下步骤：1、工程菌培养和发酵工艺
在生长有生产菌种菌落的LB(Amp)平板上，挑取单菌落接种进5mlLB培养液中30℃培养12小时。取2ml转接入200mlLB培养液，30℃培养3小时至OD600 0.4左右，以1％比例转接入10L发酵罐中培养，发酵培养基为TH培养基。30℃培养3小时至OD6000.4左右，在15min内使培养温度升高至42℃继续培养2-5小时。发酵过程中PH控制在6.8-7.0之间，溶氧控制在30％以上；2、菌体回收
发酵结束后，将发酵液转入离心管，4℃，4000g离心15分钟，弃上清液，用冰冷的TSE溶液(0.1M Tris，0.2M NaCl，0.05MEDTA，pH7.2)洗涤菌体两次，得菌体50g左右。回收的菌体若不进行裂解，则冻于-20℃保存；3、菌体裂解
采用超声破碎法，每10克湿菌加TSE100ml，用300W功率进行超声，超声30秒，停30秒，共超声20分钟。然后将超声破碎液离心(4℃，12,000g，10分钟)，取菌体裂解液上清(约50ml)倒入干净的三角烧瓶内，用于进一步纯化；4、盐析与透析
用硫酸铵对菌体裂解液上清进行分级盐析。将装有500ml菌体裂解液上清的三角烧瓶置于冷柜中的磁力搅拌器上，缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅，至硫酸铵达40％饱和度，然后静置1小时。将上述盐析物离心(4℃，12,000g，15分钟)，上清倒人一干净的三角烧瓶内，边加边搅，至硫酸铵达60％饱和度。4℃，静置1小时。将盐析物离心(4℃，12,000g，15分钟)。弃掉上清，得沉淀约15g左右。沉淀用溶液I(19mM Tris.Cl，PH7.2)溶解(每克沉淀加入10ml溶液I)，然后装人4个2×15cm的透析袋中，对10倍体积溶液I透析72小时，每隔12小时换透析液一次；5、离子交换层析
将已经处理好的Pharmacia DEAE-Aepharose CL-6B装柱(5×15cm)，置冷柜中，用溶液I平衡12小时，流速为3.5ml/min。将透析好的样品上样于平衡好的DEAE-Aepharose CL-6B柱上，进行层析，流速为3.5ml/min。先用流动相I洗脱至洗脱曲线回基线，然后换用流动相II(20mM Tris-Cl，150mM NaCl，PH7.0-9.0)洗脱，可见两个洗脱峰，收集洗脱液峰II。样品收集完毕后，用流动相III(20mMTris-Cl，1000mM NaCl，PH7.0-9.0)清洗层析柱；6、分子筛层析
将处理好的Sephacryl S-200填料装柱(6.2×140cm)，置冰柜中，用溶液I平衡12小时，流速5ml/min。将经DEAE-SepharoseCL-6B柱层析洗脱样品进行超滤浓缩(超滤膜的截留分子量为10KD)至100ml左右。上样平衡好的Sephacryl S-200柱，进行层析。洗脱液为溶液I，流速5ml/min。收集洗脱峰II；7、制剂与冻干
将Sephacryl S-200柱层析样品峰留样待检，其余立即加人人白蛋白保护剂至最终含量1％。测定样品生物活性，根据活性测定结果，用磷酸缓冲液(20mM PB，PH7.0，0.48M NaCl)稀释到50万单位/0.5ml的浓度，补加入白蛋白，至最终含量1％。然后用0.22um孔径滤膜除菌，抽样进行生物活性测定、热原质试验和无菌试验。此三项检测合格者进行分装，每支安瓿分装0.5ml，内含不少于rhTNF-NC 50万单位。冷冻干燥后，熔封。
用本发明方法制备的rhTNF-NC的鉴别和测定结果如下：1、分子量测定
结果：测量的分子量在17.2-17.9KD之间。2、免疫印迹鉴定
实验方法：
(1)样品同时进行两块SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，一块做银染，另一块做免疫印迹检定。
(2)安装转移装置。切6张滤纸及1张硝酸纤维素膜，其大小与凝胶大小一致将硝酸纤维素膜漂于蒸馏水中，使之湿润并浸泡5分钟；将切好的滤纸浸泡于少量转移缓冲液(Tris，2.42g，甘氨酸11.2g，甲醇200ml，加水至1000ml)中。将其中3张滤纸置于石墨电极上，排除气泡，再将硝酸纤维素膜置于滤纸上，对齐，排除气泡，然后取下凝胶，用蒸馏水漂洗一下，平放于硝酸纤维素膜上，最后将另3张滤纸放于凝胶上，对齐，排除气泡。
(3)将另一块石墨电极置于滤纸上，接上电源，按0.65mA/cm2接通电流，电转移2小时。
(4)将硝酸纤维素膜装人杂交袋，加入5ml封阻液(用PBS配成的1％无脂速溶奶粉)，排气泡，封口，室温下温和振摇1小时。
结果：rhTNF-NC均与TNF抗血清起免疫反应。3、紫外光谱扫描
实验方法：
半成品原液用双蒸水稀释至280nm的吸收度值为0.5左右，进行紫外光谱扫描。扫描范围为200-300nm，扫描速度为750nm/min。使用仪器为Beckman DU-68型紫外分光光度计。
结果：rhTNF-NC特征吸收波长为279.0nm。4、肽图测定
实验方法：
(1)酶解条件：样品冻干后溶于PH8.5的0.1N NH4HCO3，加入TPCK-Trypsin(样品：酶＝20∶1w/w)，37℃保温20小时后进行HPLC分析。
(2)色谱分析条件
HP 1090 HPLC仪
柱：ABI RP-300(30×2.1mm I.D.)
0.1％TFA-0.08％TFA/ACN，梯度洗脱
(0-90min，0-70％B)，40℃，215nm检出
流速：0.2ml/min
结果：图谱一致5、N-末端氨基酸序列分析
实验方法：分析仪器使用BECKMAN LF3200蛋白/多肽氨基酸序列测定仪。按中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传学国家重点实验室蛋白/多肽氨基酸序列测定分析方法进行。
结果：N端20个氨基酸的序列为：
Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu6、等电点测定
结果：三批rhTNF-NC等电聚焦电泳图谱一致，主区带均在PH6.0-6.5之间。7、纯度测定
SDS-PAGE电泳纯度测定
结果：rhTNF-NC纯度在97％以上。
HPLC纯度测定
结果：rhTNF-NC纯度大于95％。
本发明的rhTNF-NC是新型重组的肿瘤坏死因子，至今未见文献报道。该产品的抗肿瘤疗效优于原型TNF，毒副作用小，无致畸、致突变作用。本发明的制备方法简便，宜于工业化生产。
实例一、PCR法合成rhTNF-NC基因
1、PCR模板
rhTNF-NC的基因通过PCR扩增得到。PCR的模板为天然人肿瘤坏死因子(hTNF)的cDNA。
2、PCR引物设计(1)PCR引物1(plus)5’GC CAT ATG CGC AAA CGT AAG CCT GTA GCC CATGTT GTA GCA AAC CCT CA3’(2)PCR引物2(minus)
5’CCGGAATTCTCACTGGGCAATGATCCCAAAGTA3’(3)PCR引物序列(黑体书写)与模板序列对比及基因突变理论结果
Met Arg Lys Arg
5’GCCATATG CGC AAA CGT
AAG CCT GTA GCCGTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCCVal Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val AlaCAT GTT GTA GCA AAC CCT CACAY GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGGHis Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln TrpCTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGLeu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val GluCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TACLeu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu TyrCTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCLeu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCCSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile AlaGTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAGVal Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile LysAGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAGSer Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala LysCCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGPro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln LeuGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GACGhu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro AspTAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATCTyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly IleIle Ala Leu ↓ATT GCC CTG TGATAA CGG GTC ACT CTTAAGGCC5 ’
CAG
Gln
3、PCR引物合成
PCR引物合成由中科院上海细胞生物学研究所DNA合成室进行，PAGE纯。
4、PCR扩增反应
PCR扩增在Perkin-Elmer 4800型扩增仪上进行。采用复旦大学提供的商品化FDDK-II DNA扩增试剂盒。循环温度为94℃中作用5分钟。PCR扩增结果见图1。
图1 PCR扩增产物的凝胶电泳结果
1. DNA Marker(φ×174 DNA+Hae III)
2.扩增产物实例二、rhTNF-NC基因DNA序列分析
PCR扩增片段经T4聚合酶削平后，再用EcoRI酶切，将该片段亚克隆至pUC118和pUC119质粒的Smal和EcoRI位点之间，构建成pUC118-hTNF-NC和pUC119-hTNF-NC，分别转化MV1184宿主菌，制备单链。两条单位链一条为rhTNT-NC的编码链，另一条为其互补链，分别测定这两条单链的序列。DNA序列测定由中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传学国家重点实验室BECKMAN生物技术示范实验室进行，结果见图2。结果表明，PCR合成的rhTNF-NC基因序列与理论设计完全一致。
图2.克隆的PCR扩增片段的序列测定
A编码链 B互补链实例三、表达质粒pJLA-hTNFNC的构建
1、表达载体
表达载体为pJLA503，大小4.9kb，含PRPL双启动子均受温度敏感的cI857基因产物所调控。具体结构见图3。
图3表达载体pJLA503的物理图谱
2、rhTNF-NC表达质粒的构建流程
用NdeI和EcoRI进行双酶切pUC118-hTNFNC质粒，切出rhTNF-NC的基因片段，用低融点琼脂糖法回收，插入用NdeI和EcoRI切开的pJLA503中，T4DNA连接酶连接，形成的rhTNF-NC表达质称为pJL-hTNFNC。
3、pJLA-hTNFNC的酶切鉴定
采用CaCl2方法制备宿主菌HB101的感受态，并用上述连接好的DNA进行转化。用碱裂解法抽pJLA-hTNFNC，然后用NdeI和EcoRI进行双酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可见两个条带，大小分别为0.5kb和4.9kb左右，见图4。
图4 pJLA-hTNFNC的酶切鉴定实例四、rhTNF-NC工程菌
1、rhTNF-NC工程菌的构建及表达鉴定
采用CaCl2方法制备主菌HMS174基因型为recAl hsdR rif的感受态，用pJLA-hTNFNC进行转化。通过筛选获得表达rhTNF-NC的工程菌株。具体制备步骤如下：
1)从于37℃培养16-20小时的HMS174新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的lL烧瓶中，于37℃摇振培养约3小时；
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的、用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃；
3)于4℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞；
4)倒出培养液，以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，放置于冰上30分钟；
5)于4℃以4000转/分离心10分钟，以收回细胞；
6)倒出培养液，用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞沉淀，即为HMS174感受态细胞；
7)取200μl感受态细胞悬液转移到无菌的微量离心管中，加入pJLA-hTNFNC质粒DNA(体积＜10μl，DNA＜50ng)，轻轻旋转混匀，在冰中放置30分钟；
8)将它放入42℃水溶90秒，不要摇动。快速将管放入冰浴中，使细胞冷却1-2分钟；
9)每管加入800μl 37℃的LB培养液，在37℃摇床上，温浴45分钟；
10)将适当体积的已转化的感受态细胞涂到LB琼脂平板上；
11)将平板倒置，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。
rhTNF-NC工程菌单菌落接种含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基(LB(Amp))中，在30℃生长过夜，次日，按2％比例转接人LB(Amp)培养中，30℃培养3小时，然后升温至42℃继续培养3小时，离心回收菌体，用菌体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，rhTNF-NC在宿主菌大肠杆菌HMS174菌种中的表达情况如图5。
图5 rhTNF-NC工程菌热诱导表达前后菌体的
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
1.标准分子量；2.rhTNF-NC工程菌诱导前；3.rhTNF-NC工程菌诱导后；4.未含表达质粒宿主菌诱导前；5.未含表达质粒宿主菌诱导后。
SDS-PAGE凝胶用薄层扫描，结果表明，rhTNF-NC在大肠杆菌HMS174菌株中高效表达，表达量为全菌总蛋白的32.3％。该工程菌(HMS174(pJLA-hTNFNC))的rhTNF-NC的表达水平较高，具有产业化开发价值。
Claims (4)
1、一种新型重组人肿瘤坏死因子rhTNF-NC，其特征在于它含有：1个Ndel酶切位点和1个EcoRI酶切位点，在起始密码子ATG后紧接ArgLysArg的密码子5′CGC AAA CGT3′，其后是天然hTNF11位以后的氨基酸编码序列对应的核苷酸序列，但156位和Ala和157位Leu的密码子GCC和CTG至少有一个改为Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn的密码子CAG、TCG、GGG、ACG、TAC、AAC中的一个，终止密码子为TGA。
2、根据权利要求1所述的一种新型重组人肿瘤坏死因子rhTNF-NC，其特征在于它所对应的氨基酸序列共有151个氨基酸，并且与原型人肿瘤坏死因子TNF相比，氨基端第1-7位氨基酸残基缺失，第8、9、10位氨基酸置换为Arg、Lys、Arg，羧基未端Ala和Leu至少有一个置换为Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn中的一个。
3、一种如权利要求1所述的一种新型重组人肿瘤坏死因子rhTNF-NC的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)工程菌培养和发酵工艺
在生长有生产菌种菌落的LB Amp平板上，挑取单菌落接种进5mlLB培养液中30℃培养12小时，取2ml转接入200mlLB培养液，30℃培养3小时至OD600 0.4左右，以1％比例转接入10L发酵罐中培养，发酵培养基为TH培养基，30℃培养3小时至OD600 0.4左右，在15min内使培养温度升高至42℃继续培养2-5小时，发酵过程中PH控制在6.8-7.0之间，溶氧控制在30％以上；(2)菌体回收
发酵结束后，将发酵液转入离心管，4℃，4000g离心15分钟，弃上清液，用冰冷的TSE溶液0.1M Tris，0.2M NaCl，0.05MEDTA，pH7.2洗涤菌体两次，得菌体50g左右，回收的菌体若不进行裂解，则冻于-20℃保存；(3)菌体裂解
采用超声破碎法，每10克湿菌加TSE100ml，用300W功率进行超声，超声30秒，停30秒，共超声20分钟，然后将超声破碎液离心4℃，12,000g，10分钟，取菌体裂解上清50ml倒入干净的三角烧瓶内，用于进一步纯化；(4)盐析与透析
用硫酸铵对菌体裂解液上清进行分级盐析，将装有500ml菌体裂解液上清的三角烧瓶置于冷柜中的磁力搅拌器上，缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅，至硫酸铵达40％饱和度，然后静置1小时，将上述盐析物离心4℃，12,000g，15分钟，上清倒入一干净的三角烧瓶内，边加边搅，至硫酸铵达60％饱和度，4℃，静置1小时，将盐析物离心4℃，12,000g，15分钟，弃掉上清，得沉淀约15g左右，沉淀用溶液I 19mM Tris.Cl，PH7.2溶解每克沉淀加入10ml溶液I，然后装入4个2×15cm的透析袋中，对10倍体积溶液I透析72小时，每隔12小时换透析液一次；(5)离子交换层析
将已经处理好的Pharmacia DEAE-Sepharose CL-6B装柱5×15cm，置冷柜中，用溶液I平衡12小时，流速为3.5ml/min，将透析好的样品上样于平衡好的DEAE-Aepharose CL-6B柱上，进行层析，流速为3.5ml/min，先用流动相I洗脱至洗脱曲线回基线，然后换用流动相II 20mM Tris-Cl，150mM NaCl，PH7.0-9.0洗脱，可见两个洗脱峰，收集洗脱液峰II，样品收集完毕后，用流动相III 20mM Tris-Cl，1000mM NaCl，PH7.0-9.0清洗层析柱；(6)分子筛层析
将处理好的Sephacryl S-200填料装柱6.2×140cm，置冰柜中，用溶液I平衡12小时，流速5ml/min，将经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析洗脱样品进行超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为10KD至100ml左右，上样平衡好的Sephacryl S-200柱，进行层析，洗脱液为溶液I，流速5ml/min。收集洗脱峰II；(7)制剂与冻干
将Sephacryl S-200柱层析样品峰留样待检，其余立即加入人白蛋白保护剂至最终含量1％，测定样品生物活性，根据活性测定结果，用磷酸缓冲液20mM PB、PH7.0、0.48M NaCl稀释到50万单位/0.5ml的浓度，补加入白蛋白，至最终含量1％，然后用0.22um孔径滤膜除菌，抽样进行生物活性测定、热原质试验和无菌试验。此三项检测合格者进行分装，每支安瓿分装0.5ml，内含不少于rhTNF-NC 50万单位，冷冻干燥后，熔封。
4、一种如权利要求3所述的一种新型重组人肿瘤坏死因子rhTNF-NC的制备方法，其特征在于其中所述的rhTNF-NC的工程菌的构建具体制备步骤如下：
1)从于37℃培养16-20小时的HMS174新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的lL烧瓶中，于37℃摇振培养约3小时；
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的、用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃；
3)于4℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞；
4)倒出培养液，以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，放置于冰上30分钟；
5)于4℃以4000转/分离心10分钟，以收回细胞；
6)倒出培养液，用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞沉淀，即为HMS174感受态细胞；
7)取200μl感受态细胞悬液转移到无菌的微量离心管中，加入pJLA-hTNFNC质粒DNA体积＜10μl，DNA＜50ng，轻轻旋转混匀，在冰中放置30分钟；
8)将它放入42℃水溶90秒，不要摇动，快速将管放入冰浴中，使细胞冷却1-2分钟；
9)每管加入800μl 37℃的LB培养液，在37℃摇床上，温浴45分钟；
10)将适当体积的已转化的感受态细胞涂到LB琼脂平板上；
11)将平板倒置，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |