CN1684978A - 糖基化的人粒细胞集落刺激因子(g－csf)同种型 - Google Patents

糖基化的人粒细胞集落刺激因子(g－csf)同种型 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有修饰过的氨基酸序列的人G－CSF同种型，它在一个或多个特定氨基酸位置处包括糖基化序列Asn－X－Ser/Thr(N－X－S/T)，编码所述人G－CSF同种型的基因，以及携带所述基因的表达载体，用所述表达载体转化或转染过的真核细胞。另外，本发明披露了制备糖基化的人G－CSF同种型的方法，包括以下步骤：培养转化体或转染体，并且从培养上清液或细胞裂解物中分离糖基化的人G－CSF同种型；通过所述方法制备的人G－CSF同种型；以及包括所述人G－CSF同种型的药物组合物。

Description

糖基化的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)同种型
技术领域
本发明总体上涉及人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的同种型。更具体地讲，本发明涉及具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，它在本发明的一个或多个特殊的氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此改善了人G-CSF的体内稳定性。本发明还涉及它们的糖基化形式。
背景技术
集落刺激因子(CSFs)是调节造血祖细胞的增殖和分化以及成熟的血细胞的功能的细胞因子。在CFSs中，人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)被认为是人嗜中性粒细胞产生的主要刺激剂。
G-CSF是在单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞中生产的糖蛋白。纯化的G-CSF能刺激由骨髓祖细胞形成嗜中性粒细胞集落，诱导终极分化(Nicola等，JBC，Vol.258，No.14：9017-23，1983)，并且抑制白细胞的自我复制和增殖(Metcalf和Nicola，Leukemia Research，Vol.9，1：35-50，1985)。人G-CSF(hG-CSF)最初是从人鳞状癌细胞系CHU-2(Nomura等，EMBO J.，Vol.5，No.5：871-76，1986)中纯化的，然后，又从人膀胱癌细胞系5637(Welte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1526-30，1985；和Strife等，Blood，Vol.69，No.5：1508-1523，1987)中纯化出来了，其中，检测到了所述细胞系促进人粒细胞集落形成的活性。纯化的hG-CSF被鉴定的分子量为18,000-19,000Da，pI值为6.1(根据糖基化程度，pI值在5.5-6.1之间波动(Nomura等，EMBO J.，Vol.5，No.5：871-76，1986)。
通过G-CSF刺激产生的嗜中性粒细胞的直径为10-20μm，占白细胞的70％以上，并且，在保护动物免受细菌感染方面发挥重要作用。不过，由于它的半衰期比巨噬细胞和单核细胞短，嗜中性粒细胞必须由骨髓中的多能干细胞连续生产。
从人膀胱癌5637细胞中分离的hG-CSF最初被称为多能集落刺激因子或GM-CSF，这基于的是以下发现：除了嗜中性粒细胞之外，它还能刺激红细胞、巨核细胞和巨噬细胞的生成(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1526-30，1985；Platzer等，J.Exp Med，162：1788-1801，1985；and Nicola等，Nature，314：625-28，1985)，并且影响多能祖细胞，例如，诱导人髓细胞性白血病细胞系HL-60和鼠粒-单核细胞性白血病细胞系WEHI-3B(D+)增殖。不过，在排除骨髓细胞和淋巴细胞的研究中，发现分离的蛋白能强烈刺激嗜中性粒细胞集落形成，并因此被命名为G-CSF(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1526-30，1985；Metcalf，Science，229：16-22，1985；Metcalf，Blood，Vol.67，No.2：257-67，1986；Metcalf，Proc.R.Soc.Lond.B.，230：389-423，1987；和Sachs，Science，238：1374-79，1987)。用分离的hG-CSF处理源于人骨髓细胞的缺乏贴壁细胞和T-淋巴细胞的造血集落形成祖细胞混合物，7天之后观察到了嗜中性粒细胞集落形成(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1526-30，1985；和Platzer等，J.，Exp.Med.，162：1788-1801，1985)。另外，分离的hG-CSF能刺激WEHI-3B(D+)细胞的分化。
鼠G-CSF(mG-CSF)具有类似于hG-CSF的生物学活性。就是说，在CFU-GM测定中，mG-CSF能产生嗜中性粒细胞集落，并且诱导WEHI-3B(D+)细胞的终极分化。另外，hG-CSF不仅在人骨髓细胞中起作用，而且还在鼠骨髓细胞中起作用。相反，mG-CSF能对人和鼠骨髓细胞起作用。
在施用G-CSF的动物中，G-CSF的体内作用受它的给药量的调控，并且，在终止G-CSF治疗时，嗜中性粒细胞的血液水平保持在正常水平上。不过，缺乏G-CSF受体的血细胞的血液含量，即红细胞、单核细胞和淋巴细胞没有改变。
在骨髓细胞和脾细胞中，G-CSF受体是骨髓前体细胞分化成嗜中性粒细胞所必需的。另外，成熟的嗜中性粒细胞携带G-CSF受体这一事实表明，G-CSF激活了所述成熟细胞。每个细胞的受体数量在50-500个之间。半数最大刺激所需要的G-CSF的浓度为大约10pM，而对于G-CSF受体结合来说，G-CSF的平衡解离常数(Kd)大约为60-80pM。这一事实表明，由G-CSF诱导的增殖在存在低水平G-CSF受体的情况下也发生。
除了成熟的嗜中性粒细胞之外，G-CSF能影响嗜中性粒细胞祖细胞。就是说，G-CSF能增强成熟的嗜中性粒细胞的存活(Begley等，Blood，Vol.68，No.1：162-66，1986)，并且不会诱导急性原始粒细胞性白血病细胞分化成成熟细胞，导致嗜中性粒细胞的特异活化(Lopez等，J.Immunol.Vol 131 No6：2983-2988，1983；和Platzer等，J.Exp.Med.，162：1788-1801，1985)。
另外，对用5-氟尿嘧啶和环磷酰胺处理已诱导了嗜中性白血球减少症的动物服用G-CSF时，发现嗜中性粒细胞的增殖显著增强。在基于这一发现的临床实验中，在将G-CSF对接受化疗的恶性肿瘤患者给药(Bronchud等，Br.J.Cancer，56：809-13，1987；Gabrilove等，New England J.Med.，Vol.318，No.22：1414-22，1988；和Morstyn等，Lancet，March26：667-71，1988)，以及对经放射性同位素或环磷酰胺处理之后进行骨髓细胞移植的患者给药(Kodo等，Lancet，July2：38-39，1988)时，患者仅仅感到略微有点疼，G-CSF很少导致副作用，并且在这两种情况下，G-CSF都能诱导嗜中性粒细胞增加。以上结果表明，服用G-CSF，有利于保护接受化疗或骨髓移植的患者免于在嗜中性粒细胞水平恢复到正常水平被延迟的情况下发生的细菌或真菌感染。这些成功的临床实验使得能够将G-CSF应用于多种患有嗜中性白血球减少症的患者。
通过重组DNA技术鉴定了G-CSF的分子和遗传学特征(Clark和Kamen，Science，236：1229-37，1987)，并且使用重组G-CSF在体内和体外对G-CSF的功能进行了多种研究。人G-CSF是从cDNA文库中克隆的，该文库是使用从CHU-2细胞和人膀胱癌5637细胞制备的mRNA构建的(Nagata等，Nature，319：415-18，1986；Nagata等，EMBO J.，Vol.5，No.3：575-81，1986；和Souza等，Science，232：61-65，1986)。在本研究中，分离了人G-CSF的两种不同的cDNAs。对这两种cDNAs的核苷酸序列分析表明，它们分别编码由207和204个氨基酸组成的多肽，并且它们的翻译产物在N-末端具有30个氨基酸的前序列(分泌前导序列)，由所述cDNAs编码的两种多肽在35号位置处不同，其中，缺失/插入了三个氨基酸(Val-Ser-Glu)。因此，成熟的G-CSF蛋白由174个氨基酸(MW 18，671Da)或177个氨基酸(MW 18，987Da)组成。
具有174个氨基酸的G-CSF活性比具有177个氨基酸的G-CSF的活性强20倍以上。不过，仍然不清楚这两种不同的形式是否在人体中表达。人G-CSF不具备N-糖基化序列(Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T))，但是在Thr-133号位置处具有O-糖基化位点。当在大肠杆菌(Souza等，Science，232：61-65，1986；Delvin等，Gene，65：13-22，1988)和动物细胞(Tsuchiya等，EMBO J.，Vol.6，No.3：611-16，1987)中生产由人G-CSF的cDNA制备的重组人G-CSF时，发现在大肠杆菌中生产的重组人G-CSF的活性与天然形式以及在动物细胞中表达的形式的活性相同。以上结果表明，对于G-CSF活性来说，糖基化是不重要的。人G-CSF与GM-CSF、白介素-3和M-CSF没有氨基酸序列同源性，并且具有由5个半胱氨酸残基中的4个形成的两个二硫键(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74)。
由于它们的体内稳定性低，被用作药物的大部分具有生理学活性的蛋白需要过量或频繁地给患者施用，以便保持能够提供令人满意的治疗效果的合适浓度。这种给药方式导致了患者的疼痛和不便。因此，有必要开发具有改善了的体内稳定性、并因此解决了现有技术的上述问题的、具有生理学活性的蛋白质。
为了改善具有生理学活性的蛋白质的体内稳定性，可以将干扰素-α和聚乙二醇缀合，正如在国际专利公开号WO9848840中所披露的；并且可以将人生长激素微胶囊化，正如在美国专利号6,399,103中所披露的。不过，上述方法的缺陷在于，在微生物中生产并且纯化目标蛋白之后，需要进行额外。另外，可能在不希望的位置处形成交联。而且，所述生产过程不能确保最终产品的均一性。
另一种方法使用糖基化。在真核细胞中生产的细胞表面蛋白和分泌蛋白通过糖基化受到修饰。除了它们的生理学特性之外，已知糖基化修饰能影响蛋白质的体内稳定性和功能。
发明内容的公开
因此，本发明的目的是制备具有改善了的体内稳定性并且能够通过采用重组DNA技术在细胞系中生产糖基化状态下的人G-CSF而方便地生产的人G-CSF。
在本发明的一方面，提供了具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，它在下面的一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在本发明的另一方面，提供了编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因，它在上述一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本发明的另一方面，提供了携带编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因的表达载体，它在上述一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本发明的另一方面，提供了用携带编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因的表达载体转化或转染的宿主细胞，所述氨基酸序列在上述一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本发明的另一方面，提供了制备糖基化的人G-CSF同种型的方法，包括以下步骤：培养被携带编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因的表达载体转化或转染过的真核宿主细胞，所述氨基酸序列在上述一个或多个氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，和从所述培养上清液或培养裂解液中分离所述氨基酸序列糖基化的人G-CSF同种型。
在本发明的另一方面，提供了通过对具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型进行糖基化而制备的糖基化人G-CSF同种型，所述氨基酸序列在上述一个或多个氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本发明的另一方面，提供了包括通过对具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型进行糖基化而制备的糖基化的人G-CSF同种型的药物组合物，所述氨基酸序列在上述一个或多个氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，和药用可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供了在PCR中被用作引物以便在人G-CSF上产生糖基化位点的合成的寡聚脱氧核苷酸。
附图的简要说明
通过以下详细说明，并结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述以及其他目的、特征和其他优点，其中：
图1表示天然人G-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列，其中，核苷酸序列上方的箭头或直线表示在人G-CSF蛋白的三级结构中包含螺旋结构的区域，箭头的方向表示所述螺旋沿氨基酸序列的方向，并且，天然成熟的人G-CSF在第133位苏氨酸残基处具有O-连接的糖基化位点，能在人或任何真核细胞中发挥作用；
图2表示本发明的人G-CSF蛋白的被修饰的氨基酸位置，其中，前序列位于N-末端；
图3表示用天冬酰胺修饰天然人G-CSF的第51位甘氨酸残基的过程；
图4表示用天冬酰胺修饰天然人G-CSF第94位甘氨酸残基的过程；
图5表示用天冬酰胺修饰天然人G-CSF的第51和94位甘氨酸残基二者的过程；
图6表示分别用天冬酰胺和丝氨酸修饰天然人G-CSF的第133位苏氨酸和第135位甘氨酸残基的过程；
图7表示分别用天冬酰胺、天冬酰胺和丝氨酸修饰天然人G-CSF的Gly-51，Thr-133和Gly-135的过程；
图8表示人G-CSF同种型的Western印迹结果的照片(泳道1：野生型人G-CSF；泳道2：G51N同种型；泳道3：G51N/G94N同种型；泳道4：G94N同种型；泳道5：G51N/T133NG135S同种型；泳道6：T133NG135S同种型；和泳道7：分子量大小标记)，其中，将抗人G-CSF的山羊多克隆抗体用作一抗，并且用HRP缀合的小鼠抗山羊多克隆抗体用作二抗；和
图9表示在大鼠中人G-CSF同种型的血液含量随时间变化的曲线图。
本发明的最佳实施方式
本文所使用的术语“人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的同种型”表示在天然人G-CSF蛋白的一个或多个氨基酸位置处具有一个或多个氨基酸修饰、同时保持了天然的生物学活性的类似物或突变体。
在本文中所使用的表示氨基酸的单个大写字母，按照国际生物化学联合会规定的标准缩略语表示以下氨基酸：
A：丙氨酸；B：天冬酰胺或天冬氨酸；C：半胱氨酸；
D：天冬氨酸；E：谷氨酸；F：苯丙氨酸；
G：甘氨酸；H：组氨酸；I：异亮氨酸；K：赖氨酸；L：亮氨酸；
M：甲硫氨酸；N：天冬酰胺；P：脯氨酸；Q：谷氨酰胺；
R：精氨酸；S：丝氨酸；T：苏氨酸；V：缬氨酸；
W：色氨酸；Y：酪氨酸；和Z：谷氨酰胺或谷氨酸。
本文所使用的短语“(氨基酸的一个大写字母)(氨基酸位置)(另一个氨基酸的一个大写字母)”，表示在指定的人G-CSF的氨基酸位置处，前一个氨基酸被后一个氨基酸所取代。例如，G51N表示天然人G-CSF的第51位的甘氨酸残基被天冬酰胺所取代。
在本发明中用于导入糖基化基序的引物被命名为“(氨基酸的一个大写字母)(氨基酸位置)(另一个氨基酸的一个大写字母)1或2”，其中，1表示互补于双链核苷酸的5′→3′-方向的单链模板的引物，而2表示互补于所述双链核苷酸的3′→5′-方向的单链模板的引物。
通过添加一个或多个寡糖部分，修饰在真核宿主细胞中生产的分泌蛋白。这种修饰被称为糖基化，已知它能显著影响蛋白的生理学特性，并且对蛋白的稳定性，分泌和细胞内定位来说是重要的。正确的糖基化可能是某些蛋白的生物学活性所必需的。实际上，当源于真核细胞的基因在缺乏负责蛋白糖基化的细胞内过程的细菌中表达时，未糖基化的翻译产物通常具活性降低。
糖基化发生在多肽主链的特殊位置上。存在两种类型的糖基化。O-连接的糖基化将寡糖链连接在蛋白质中丝氨酸和/或苏氨酸的羟基(-OH)上。N-连接的糖基化始于寡糖链与天冬酰胺残基的酰胺基团(-NH)的连接。具体地讲，N-型糖基化发生在以下特殊氨基酸序列中：Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)(X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)。N-连接的寡糖具有不同于O-连接的寡糖的结构，并且，存在于N-连接的类型中的糖基化残基同样不同于O-连接的类型。例如，在O-连接的寡糖上，N-乙酰半乳糖胺总是与丝氨酸或苏氨酸连接，而在N-连接的寡糖上，N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺连接。另外，O-连接的寡糖通常含有4个或4个以下糖残基。相反，N-连接的寡糖包含5个或5个以上残基，本质上包括N-乙酰葡糖胺和甘露糖。
本发明涉及具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，它在本发明的一个或多个特殊的氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此改善了天然人G-CSF蛋白的体内稳定性。在本发明中，确定了人G-CSF的糖基化可通过在除了螺旋结构形成区内位置外的任何氨基酸位置处插入糖基化序列而诱导。
一方面，本发明包括具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，它在下面的一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在优选方面，本发明包括具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，它在下面的一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列  Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L9 9(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在更优选的方面，本发明包括人G-CSF同种型，它具有以下修饰：甘氨酸-51被修饰成天冬酰胺，甘氨酸-94被修饰成天冬酰胺，或苏氨酸-133和甘氨酸-135分别被修饰成天冬酰胺和丝氨酸，或具有所有上述修饰。
在本发明中，为了获得人G-CSF的额外的糖基化，对编码人G-CSF的DNA序列在一个或多个核苷酸处进行修饰，并且将突变的DNA导入能够在其中进行蛋白糖基化和表达的真核细胞。因此，人G-CSF的额外糖基化可通过修饰它的相应的DNA序列，以便在其中导入Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)而实现。
一方面，本发明包括编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因，所述氨基酸序列在下述一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在优选方面，本发明包括编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因，所述氨基酸序列在下述一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在优选方面，本发明包括编码人G-CSF同种型的基因，它具有以下修饰：甘氨酸-51被修饰成天冬酰胺，甘氨酸-94被修饰成天冬酰胺，或苏氨酸-133和甘氨酸-135分别被修饰成天冬酰胺和丝氨酸，或具有所有上述修饰。
在本发明的一个方面，编码人G-CSF的基因是从表达人G-CSF的真核细胞中获得的。可以通过本领域公知方法克隆和分离所述基因。
按照上述方法获得的人G-CSF基因可以在一个或多个选择的密码子处进行修饰。本文所使用的术语“修饰”表示用不同的密码子取代人G-CSF-编码基因上的一个或多个密码子，因此导致人G-CSF的氨基酸序列改变。更具体地讲，术语“修饰”表示人G-CSF的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸所取代，从而将糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)导入人G-CSF的氨基酸序列，并因此可以进行额外的N-连接的糖基化。例如，在实施例3中，当第51位甘氨酸残基被天冬酰胺取代时，由于第53位残基是丝氨酸，就形成了糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。因此，可以进行人G-CSF的额外的N-连接糖基化。另外，当第94位甘氨酸残基被天冬酰胺取代时，由于第96位氨基酸残基是丝氨酸，就形成了Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)序列，因此可以进行人G-CSF的额外的N-连接糖基化。另外，当第133位苏氨酸和第135位甘氨酸残基分别被天冬酰胺和丝氨酸取代时，形成了Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此，可以进行人G-CSF的额外的N-连接糖基化。
在本发明的一个方面，合成了包括编码人G-CSF中所需氨基酸修饰的密码子的寡核苷酸。通常，用于本发明的寡核苷酸由大约25个核苷酸组成。可以采用更短的寡核苷酸，不过，最佳的寡核苷酸在被修饰密码子的左侧和右侧区域均包括与模板互补的12-15个核苷酸。所述寡核苷酸可以有效地与模板DNA杂交。在实施例3表1中列举了本发明中用于生产额外的糖基化位点的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以通过本领域公知技术合成。
在本发明的一个方面，提供了编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的DNA序列。用人G-CSF cDNA作模板，并且用编码修饰的寡核苷酸作引物进行PCR。引物与它们的互补的单链DNA杂交，这种单链DNA是通过加热期间双链DNA模板变性产生的。DNA聚合酶沿5′→3′方向以与模板互补的方式将核苷酸一个一个地添加到编码修饰的引物的3′-OH上。新合成的链包含编码所述修饰的引物，因此得到了编码所需要的修饰的基因。在PCR的延伸步骤中，将新合成的链用作模板DNA，导致了编码所述修饰的基因的扩增。例如，在实施例3中，为了将第51位甘氨酸残基改变成天冬酰胺，用天然G-CSF DNA作模板，使用引物组CSF5和G51N2，或G51N1和CSF3进行PCR。结果获得了两种DNA片段，它们在第51位甘氨酸残基处携带编码天冬酰胺的密码子。用这两种DNA片段作模板，用引物对CSF5和CSF3进行第二PCR，得到了编码G-CSF-G51N的修饰过的基因，该G-CSF-G51N因用天冬酰胺修饰了第51位氨基酸残基而可以被额外的糖基化。
在本发明的另一方面，提供了具有两个或两个以上氨基酸修饰的人G-CSF同种型。具有两个或两个以上氨基酸修饰的突变体可以通过多种方法制备。当要修饰的两个或两个以上氨基酸在多肽上彼此相隔很近时，所有需要的修饰可以由一个寡核苷酸编码，因此能同时实现。因此，可以通过与制备具有一个核苷酸修饰的突变的人G-CSF基因相同的方法，制备具有两个或两个以上氨基酸修饰的突变的人G-CSF蛋白，所不同的是，其中将包括两个或两个以上氨基酸修饰的寡核苷酸用作引物。不过，在要修饰的两个或两个以上氨基酸间隔较远的情况下(若要修饰的两个氨基酸之间存在10个以上氨基酸)，所有需要的修饰不能够由一个寡核苷酸编码。
相反地，要使用不同的方法。一种方法是制备用于每一种氨基酸修饰的独立的寡核苷酸。当所述寡核苷酸与单链模板DNA同时退火，则新合成的二级单链DNA将编码所有需要的氨基酸修饰。本发明中用于生产人G-CSF同种型的另一种方法包括两种诱变实验。在所述一级突变中，用天然DNA作模板，使包括一种需要的氨基酸修饰的一种寡核苷酸与所述模板退火，由此产生了杂双螺旋DNA。在二级诱变中，将所述杂双螺旋DNA用作模板，所述模板业已携带了至少一种修饰。当一种具有额外氨基酸修饰的寡核苷酸与所述模板退火时，所得到的DNA编码这两种修饰，并且可用作第三次诱变的模板。就是说，修饰两个或两个以上核苷酸的方法，就是将修饰一个核苷酸的方法重复若干次。例如，在实施例3中，为了将天然人G-CSF上的第51位甘氨酸修饰成天冬酰胺，并且将第94位甘氨酸修饰成天冬酰胺，首先修饰第94位氨基酸，并且，将所得到的DNA用作模板，修饰第51位氨基酸。结果产生了具有这两种修饰的突变的人G-CSF基因。
可以通过本领域公知的标准方法合成本发明的编码人G-CSF同种型的DNA序列，例如，使用自动DNA合成仪(Biosearch，AppliedBiosystemTM)。
本发明的糖基化的人G-CSF同种型通常是通过以下步骤制备的：(a)将编码人G-CSF同种型的DNA序列插入携带一种或多种表达控制序列的载体内，使得所述DNA序列可操作地与所述表达控制序列连接，并因此受所述表达控制序列的控制；(b)用所得到的重组表达载体转化或转染宿主细胞；和(c)在合适的培养基中，并且在适合表达所述人G-CSF同种型DNA序列的条件下培养所述转化体或转染体，并且分离糖基化的人G-CSF同种型。
在这一方面，本发明提供了被这种携带编码人G-CSF同种型的DNA序列的重组表达载体转化或转染了的宿主细胞。
当然，可以理解的是，所有载体和表达控制序列在表达本发明的核苷酸序列方面并不会相同地发挥功能。类似地，所有类型的宿主细胞在相同的表达系统中也不会相同地发挥功能。不过，在本发明的范围内，在不进行过多的实验的情况下，本领域普通技术人员可以选择合适的载体、表达控制序列和宿主细胞。例如，在选择载体时，应当考虑宿主，因为载体必须在该宿主中复制。另外，所述载体的拷贝数，控制所述拷贝数的能力，以及由所述载体编码的任何蛋白的表达，如抗生素标记，都应当考虑。在选择表达控制序列时，还应当考虑多种因素。这些因素包括所述序列的相对强度，它的可控制性，以及它与本发明核苷酸序列的相容性，特别是在潜在的二级结构方面。另外，宿主的选择应该考虑到它们与所选择载体的兼容性，由所述核苷酸序列编码的产物的毒性，它们的分泌特征，它们正确地折叠所述多肽的能力，它们的发酵或培养要求，以及纯化由所述核苷酸序列编码的产物的方便性。
本文所使用的术语“载体”表示被用作能够将外源基因稳定地携带到宿主细胞中的媒介物的DNA分子。为了能够使用，载体应当是能够复制的，具有将它自身导入宿主细胞的系统，并且具有选择标记。另外，本文所使用的术语“重组表达载体”表示携带可操作地与它连接的要在宿主细胞中表达的外源基因的环状DNA分子。在导入宿主细胞时，重组表达质粒具有与宿主染色体DNA无关地复制的能力，以高拷贝数拷贝它自身，并且产生异源DNA。正如本领域所普通公知的，为了提高转染基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应当可操作地与能够在被选作表达系统的宿主细胞中起作用的转录和翻译调控序列连接。优选的是，所述表达调控序列和外源基因可以携带在包括细菌选择标记和复制起点的同一表达载体上。在真核细胞被用作表达系统时，所述表达载体还应当包括可用于所述真核宿主细胞的表达标记。
为了表达本发明的编码人G-CSF同种型的DNA序列，可以采用各种表达载体。由于所述人G-CSF同种型应当被糖基化，应当优选使用适合真核宿主细胞的表达载体。可用于真核宿主细胞的表达载体包括源于例如SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列。具体地讲，所述载体的例子包括pCDNA3.1(+)/Hyg(Invitrogen，Carlsbad，Calif.，USA)和pCI-neo(Stratagen，La Jolla，Calif.，USA)。可用于酵母的表达载体包括2μ质粒以及它的同种型，POT1载体(美国专利号4,931,373)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL 941，pBluebac 4.5和pMelbac(Invitrogen)。
术语“表达控制序列”表示本发明多肽表达所需要或有用的核苷酸序列。对编码所述多肽的核苷酸序列来说，每一种控制序列可以是天然的或外源的。所述表达控制序列的非限定性例子包括前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，增强子或上游活化序列，信号肽序列，和转录终止子。所述表达控制序列包括至少一个启动子序列。
为了表达本发明的核苷酸序列，可以将多种表达控制序列中的任意一种插入用于本发明的表达载体。适用于指导哺乳动物细胞中蛋白表达的表达控制序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子，人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，和人泛素C(UbC)启动子。另外，为了提高在哺乳动物细胞中的表达水平，可以将合成内含子插入编码所述多肽的核苷酸序列的5′-非翻译区。适合指导昆虫细胞中蛋白表达的表达控制序列的例子包括多角体蛋白启动子，P10启动子，杆状病毒39K延迟早期基因启动子和SV40聚腺苷酸化序列。适合在酵母中指导蛋白表达的表达控制序列的例子包括酵母α-配合系统启动子，酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子和ADH2-4c启动子。适合指导真菌细胞中蛋白表达的表达控制序列的例子包括ADH3启动子和终止子。
用于本发明的载体的另一有用的成分是信号肽序列。信号肽序列通常位于编码蛋白的基因的5′区，并因此是在与所述蛋白的N-末端连接的状态下翻译的。例如，所述信号肽的存在或缺乏取决于用于生产要表达的多肽的表达宿主细胞(无论它是细胞内的或细胞外的多肽)，以及它是否需要获得分泌。如果多肽要从表达它的细胞中分泌时，在所述多肽上就存在信号肽。如果存在所述信号肽的话，它应当能够由被选择用于表达所述多肽的细胞识别。信号肽可以与所述多肽同源(通常与所需要的多肽结合)或异源(源于不同的多肽)，并且可以与宿主细胞同源或异源。
当核苷酸序列以功能性关系与另一种核苷酸序列排列在一起时，这种排列被定义为“可操作地连接”。所述核苷酸序列可以是基因和控制序列，它们是以在合适的分子(例如，转录活化蛋白)与所述控制序列结合时能诱导基因表达的方式连接的。例如，当前序列或分泌前导序列能促进成熟蛋白分泌时，它被称作“可操作地与所述蛋白连接”。当启动子能调控编码序列的转录时，它就是可操作地与该编码序列连接的。当核糖体结合位点存在于允许编码序列翻译的位置上时，它就是与所述编码序列可操作地连接的。通常，术语“可操作地连接”表示连接的核苷酸序列是彼此接触的。对于分泌前导序列来说，该术语表示它与编码序列接触，并且存在于该编码序列的前导框内。不过，增强子不必与编码序列接触。核苷酸序列的连接可以通过在方便的限制酶识别位点相连接来实现。在缺少限制酶识别位点的情况下，可以使用寡核苷酸接头或衔接子，它们可通过常规方法合成。
包括上述成分(即表达控制序列)以及编码所述人G-CSF同种型的基因的合适的载体可以通过常规重组DNA技术制备。为了制备需要的载体，用合适的限制酶消化分离的DNA片段，并且以独特的顺序和方向连接。
DNA分子可以用特异性的限制酶在缓冲溶液中消化。通常，用存在于20μl缓冲溶液中的大约1-2单位限制酶消化大约0.2-1μg质粒DNA或DNA片段。合适的缓冲液、DNA浓度以及温育时间和温度由生产限制酶的公司规定。通常，合适的温育是在37℃下进行大约1-2小时，不过，某些限制酶需要更高的温度。在温育之后，通过用苯酚和氯仿的混合物提取，除去酶和其他杂质，并且通过用乙醇沉淀，从含水层中回收DNA。在这里，为了生产有功能的载体，消化的DNA片段的一端应当与另一个消化的DNA片段的一端互补。
应当通过电泳根据大小分离消化的DNA片段，并且选择。DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺基质电泳。基质可依据要分离的DNA片段的大小而确定。在电泳之后，通过电洗脱，或者在使用低熔点琼脂糖时通过简单地熔化琼脂糖，从所述基质中提取DNA。
要连接的DNA片段应当以相同的摩尔比添加到反应溶液中。所述反应溶液包括ATP，连接酶缓冲液和每0.5μg DNA 10个单位的T4连接酶。为了将DNA片段与载体相连接，首先应当通过用合适的限制酶消化而将所述载体线性化。线性化的载体应当用碱性磷酸酶或牛肠道碱性磷酸酶处理。这种碱性磷酸酶处理防止了所述线性化载体的自我连接。然后，用制备的重组表达载体转化或转染宿主细胞。
通常，可以使用外源DNA导入效率高、并且具有导入基因的高表达水平的宿主细胞。具体地讲，作为宿主细胞，可以使用真核细胞，它能够使本发明的人G-CSF同种型糖基化。合适的酵母宿主细胞的例子包括酵母属和汉逊酵母属菌株。合适的真菌宿主细胞的例子包括木霉属，镰孢属和曲霉菌。合适的昆虫细胞的例子包括鳞翅目细胞系，如Sf9或Sf21。合适的哺乳动物细胞的例子包括CHO细胞系，COS细胞系，如COS1或COS7，动物细胞系，如BHK细胞系或小鼠细胞，以及组织培养的植物细胞和人类细胞。
可以通过在基础实验指南中披露的方法将多核苷酸导入宿主细胞(例如，Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986)；和Sambrook，J.，等(1989)″Molecular Cloning″ALaboratory Manual 2nd edition)。例如，用于将多核苷酸导入宿主细胞的优选方法包括磷酸钙转染，DAEA-葡聚糖介导的转染，缩并(transvection)，显微注射，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，摩擦加载(scrape loading)，弹道导入，和感染。
在本发明的生产方法中，在适合用本领域已知的方法生产多肽的营养培养基中培养所述宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养法培养所述细胞，在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵，这种培养是在合适的培养基中并且在能够表达和/或分离所述多肽的条件下进行。所述培养在含有碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域公知的方法进行。合适的培养基为本领域普通技术人员所公知，并且可以通过商业渠道购买或者可以按照公开的配方配制。如果所述多肽被分泌到营养培养基中，就可以直接从该培养基中回收所述多肽。如果所述多肽未被分泌，就可以从细胞裂解液中回收。
所生产的多肽可以通过本领域公知的方法回收。例如，可以通过常规方法从所述营养培养基中回收所述多肽，包括，但不局限于离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发或沉淀。所述多肽可以通过本领域公知的多种方法纯化，包括，但不局限于层析(例如，离子交换，亲和力，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳，溶解度差异(例如硫酸铵沉淀法)，SDS-PAGE，或提取)。
本发明提供了糖基化的人G-CSF同种型，它具有通过上述方法获得的额外的糖基化。在本发明中，短语“具有额外糖基化的糖基化人G-CSF同种型”可以被定义为这样一种表达产物，其因将被修饰成能够插入一个或多个糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)的人G-CSF基因导入真核宿主细胞、然后在所述宿主细胞中表达所述基因而自发糖基化。就是说，它表示通过将糖残基与人G-CSF同种型上的额外糖基化位点Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)的酰胺基团(-NH)共价结合而形成的异源分子。
另外，本发明提供了包括具有额外糖基化的糖基化人G-CSF同种型和药用可接受载体的药物组合物。用于治疗性使用的所述糖基化人G-CSF同种型的治疗制剂可以通过将具有所需纯度的所述糖基化人G-CSF同种型与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，并且将该混合物制备成具有冷冻干燥块的含水制剂而制备(Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Olso，A.，ED.，(1980))。用于肠胃外给药的药物制剂可以通过将本文所披露的糖基化人G-CSF同种型与药用可接受载体混合，并且将该混合物制成可以给药的形式(溶液，悬浮液或乳液)而制备。
所述药用可接受载体，赋形剂或稳定剂在它们的剂量和浓度下，应当是对受体无毒的，并且与所述药物组合物中的其他成分相容。例如，所述药物组合物不应当包含已知对所述多肽有害的氧化剂或其他材料。
合适的载体包括磷酸，柠檬酸以及其他缓冲液，如有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸，低分子量多肽，血清白蛋白，明胶和蛋白，如免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他多糖，如葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合因子，如EDTA；金属离子，如锌，钴或铜；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如Tween，pluronic或聚乙二醇(PEG)。
在用于治疗目的时，所述糖基化的人G-CSF同种型应当是无菌的。无菌化可以通过无菌过滤膜过滤而方便地实现。
所述糖基化的人G-CSF同种型的药物组合物通常应当储存在具有无菌入口的容器中，例如，用于静脉注射的袋或小瓶，它具有皮下注射用的针头能够穿透的筛子。含水的或冷冻干燥的本发明的药物组合物可以保存在单一剂量或多剂量容器中，如密封的小瓶或安培瓶。为了获得冷冻干燥形式，将5ml过滤的1％(w/v)人G-CSF同种型溶液放入10-ml的小瓶中，然后冷冻干燥。可以通过使用注射用抑菌性水溶解(重建)所述冷冻干燥的人G-CSF同种型而制备可注射的溶液。
包括肠胃外给药在内，所述糖基化的人G-CSF同种型可以通过合适的技术直接对动物给药，并且可以局部或系统地进行给药。例如，可以根据认识到或预计会出现人G-CSF的副作用的患者的医学病史确定特定的给药途径。肠胃外给药包括皮下，肌内，静脉内，动脉内和腹膜内注射。最优选的是，给药可以通过连续注射(例如微型泵，如渗透压泵)或使用注射器通过静脉内或皮下途径实现。
本发明的糖基化人G-CSF同种型应当以“治疗有效的”剂量对患者给药，即相对于给药所针对的症状而言足以获得理想的治疗效果的剂量。所述糖基化的人G-CSF同种型的药物组合物应当与优选的医学操作一致地制备和给药，并要考虑要治疗的具体状态，患者个体的临床状况(特别是在仅给予人G-CSF时出现的副作用)，所述糖基化的人G-CSF同种型的投递位置，给药方法，给药方案，以及本领域技术人员所公知的其他要求。可以通过考虑上述因素，确定所述糖基化的人G-CSF同种型的治疗有效剂量。本发明的人G-CSF同种型的每日使用剂量通常为大约1μg-100mg，优选0.01mg-1mg。
将结合附图通过以下实施例对本发明进行更详细的说明。不过，提供以下实施例仅仅是为了说明本发明，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：人G-CSF基因的制备
从携带能够在动物细胞中表达的人G-CSF基因的细菌菌株中获得人G-CSF基因，该基因业已保存在我们的实验室中。在图1中示出了人G-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列。
实施例2：选择人G-CSF中待修饰的位置
使用Boone’s结构分析结果(J.Biol.Chem.，vol.5，8770，(1992))，在人G-CSF上选择要进行额外糖基化的位点。首先，排除了在人G-CSF的氨基酸序列上具有螺旋结构的区域(图1)。然后，考虑Thr-133作为O-连接的糖基化位点在人G-CSF的三级结构中的空间位置，选择容易修饰成N-连接的糖基化基序的区域。
实施例3：人G-CSF同种型的制备
通过用合成的寡聚脱氧核苷酸作引物进行PCR，制备了具有一个或多个氨基酸修饰、并因此携带额外的糖基化位点的编码修饰过的人G-CSF蛋白的基因。在下面的表1中列举了所使用的合成寡聚脱氧核苷酸。
如图2所示，为了将额外的糖基化位点导入人G-CSF，选择出了G51，G94，T133和G135。用天冬酰胺分别修饰第51位甘氨酸和第94位甘氨酸残基。用天冬酰胺和丝氨酸分别修饰133号苏氨酸和135号甘氨酸残基。在图2中标出了用于所述修饰的合成的寡聚脱氧核苷酸。箭头方向表示每一种寡聚脱氧核苷酸的5′→3′方向。
为了促进表达的人G-CSF蛋白的纯化，将额外的氨基酸序列(HisEK)插在成熟的人G-CSF的前序列和N-末端之间。插入的氨基酸序列为M-G-G-S-H-H-H-H-H-H-G-D-D-D-D-K。该插入使得能够通过金属亲和层析分离表达的人G-CSF同种型。用肠激酶处理通过金属亲和层析获得的分离的蛋白，并且再次进行金属亲和层析，由此得到了高纯度的人G-CSF同种型蛋白。
按以下方法将HisEK序列导入人G-CSF。使用引物对CSF5和CSF1通过PCR扩增所述前序列，用限制酶NcoI消化。首先使用引物对HisEK2和CSF3通过PCR扩增成熟的人G-CSF的编码序列，然后用HisEK1和CSF3引物对扩增产物进行二次扩增。用NcoI消化得到的PCR产物，并且用T4 DNA连接酶连接到经NcoI-消化过的前序列上。然后，将连接产物用作模板，用CSF5和CSF3引物进行PCR。用HindIII和BamHI消化扩增的DNA产物，并且使用T4 DNA连接酶插入用相同的限制酶消化过的pcDNA3.1-Hygro(+)载体上，由此产生了表达载体。
表1
用作生产额外糖基化位点的引物的合成寡聚脱氧核苷酸
引物名称 引物序列   SEQ IDNOs
HisEK：1  5’-ATG GGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGG-3’   1
HisEK：2  5’-CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGG GAC GAT GAC GAT AAG-3’   2
CSF：1  5’-ACC CCC CAT GGC TTC CTG CAC TGT CCA GTG-3’   3
CSF：2  5’-GGG GAC GAT GAC GAT AAG ACC CCC CTG GGC CCT GCC-3’   4
G51N1  5′-GAG GAG CTG GTG CTG CTC AAC CAC TCT CTG GGC ATC CCC-3′   5
G51N2  5′-GGG GAT GCC CAG AGA GTG GTT GAG CAG CAC CAG CTC CTC-3′   6
G94N1  5′-CTC CTG CAG GCC CTG GAA AAC ATC TCC CCC GAG TTG GGTCCC-3′ 7
G94N2  5′-GGG ACC CAA CTC GGG GGA GAT GTT TTC CAG GGC CTG CAGGAG-3′ 8
T133NG135S：1  5’-CCT GCC CTG CAG CCC AAC CAG AGC GCC ATG CCG GCC TTC-3’   9
T133NG135S：2  5’-GAA GGC CGG CAT GGC GCT CTG GTT GGG CTG CAG GGC AGG-3’   10
CSF5  5′-TCC CAA GCT TAT GGC TGG ACC TGC CAC CCA G-3′   11
CSF3  5′-TGG GAT CCT CAG GGC TGG GCA AGG TGG CGT AG-3′   12
(1)制备具有G51N修饰的人G-CSF同种型(图3)
使用引物对CSF5和G51N2以及另一引物对G51N1和CSF3，通过PCR扩增在实施例1中制备的人G-CSF基因。纯化所得到的片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA变性。将变性的DNA片段作模板，用引物对CSF5和CSF3进行PCR，以便生产突变的人G-CSF基因，它具有以下修饰：51号甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺。如图3所示，结果获得了两种DNA片段，所述片段携带有相当于将51号氨基酸位置处的甘氨酸修饰成天冬酰胺的密码子。在将这两种DNA片段添加到PCR反应混合物中之后，用引物对CSF5和CSF3进行二次PCR，生产出了修饰过的G-CSF-G51N基因，它的51号氨基酸位置被修饰成天冬酰胺，它可以进行额外的糖基化。
(2)制备具有G94N修饰的人G-CSF同种型(图4)
使用引物对CSF5和G94N2和另一引物对G94N1和CSF3，通过PCR扩增在实施例1中制备的人G-CSF基因。纯化得到的DNA片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA变性。用变性的DNA片段作模板，用引物对CSF5和CSF3进行PCR，以便生产突变的人G-CSF基因，它具有以下修饰：94号甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺。如图4所示，结果获得了具有对应于将94号氨基酸位置处的甘氨酸修饰成天冬酰胺的密码子的两种DNA片段。将这两种DNA片段添加到PCR反应混合物中，用引物对CSF5和CSF3进行二次PCR，得到了94号氨基酸残基被修饰成天冬酰胺的修饰过的G-CSF-G94N基因，它可以进行额外的糖基化。
(3)制备具有G51N和G94N修饰的人G-CSF同种型(图5)
使用修饰过的G-CSF-G94N基因，按照与制备修饰过的G-CSF-G51N基因相同的方法，制备具有G51N和G94N修饰的人G-CSF同种型。如图5所示，首先按照与图4所示相同的方法修饰94号氨基酸残基。然后，用所得到的DNA片段作模板，按照图3所示相同的方法修饰51号氨基酸残基。结果产生了具有G51N和G94N修饰的修饰过的人G-CSF基因。
(4)制备具有T133N和G135S修饰的人G-CSF同种型(图6)
按照与制备修饰过的G-CSF-G51N基因相同的方法，使用引物对CSF5和T133NG135S：2和另一引物对T133NG135S：1和CSF3通过PCR扩增人G-CSF基因。
纯化所得到的DNA片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA变性。用变性的DNA片段作模板，用引物对CSF5和CSF3进行PCR，以便生产具有133号苏氨酸残基和135号甘氨酸残基分别被天冬酰胺和丝氨酸修饰的修饰过的人G-CSF基因，其中O-连接的糖基化位点被改变成N-连接的糖基化位点。结果生产出了修饰过的G-CSF-T133NG135S基因。
(5)制备具有G51N，T133N和G135S中所有修饰的人G-CSF同种型(图7)
使用修饰过的G-CSF-T133NG135S基因，按照与制备修饰过的G-CSF-G51N基因相同的方法，制备具有G51N，T133N和G135S中所有修饰的修饰过的人G-CSF基因。
实施例4：在CHO细胞中表达人G-CSF同种型
在60-mm培养皿中培养CHO细胞(DG44)，并且生长到40-80％的铺满度，就是说，达到1-4×105个细胞的密度。将3μl由BM公司生产的Superfectin试剂与97μl的培养基(α-MEM，无血清和抗生素)充分混合，然后将制备的用于表达人G-CSF同种型的表达载体DNA(＞0.1μg/μl，大约2μg)和含有小鼠DHFR基因的pLTRdhfr26载体(ATCC37295，0.2μg)添加到该混合物中。在室温下培养5-10分钟，将该反应混合物添加到制备的细胞中。一天之后，用含有透析过的10％FBS、并且含有200μg/ml潮霉素的α-MEM培养所述细胞，并且继续培养大约7-10天时间。从含有潮霉素(200μg/ml)的培养基中筛选被人G-CSF同种型稳定转染了的细胞。培养每一种选择的细胞系，并且使用Quantikine人G-CSF免疫测定试剂盒(Catalog No.DCS50，R&D systems)评估人G-CSF同种型的表达。结果发现在所述细胞系中产生了人G-CSF同种型。
实施例5：纯化表达的人G-CSF同种型
按以下方法纯化在CHO细胞中表达的人G-CSF同种型。用Millipore’s Centriprep(Mw Cut 10,000)浓缩培养上清液。使用Invitrogen’s ProBond Purification System，通过金属亲和层析从所述浓缩物中纯化表达的人G-CSF同种型，并且通过Western印迹分析，结果如图8所示。
例6：在大鼠中进行的药物动力学测定
为了研究人G-CSF同种型在体内是否具有长的半衰期，在Sprague-Dawley大鼠对象中进行了药物动力学测定。以100μg/kg体重的剂量通过静脉内途径施用人G-CSF同种型，其中，每一组包括四只大鼠。以3 0分钟为间隔进行放血，并且用Quantikine人G-CSF免疫测定试剂盒(R&D systems)测定人G-CSF同种型的血液水平。结果如图9所示。正如图9所示的，发现与天然G-CSF相比，某些人G-CSF同种型具有改善了的体内稳定性。
工业实用性
正如本文前面所披露的，本发明的糖基化的人G-CSF同种型具有改进了的体内稳定性。因此，与常规使用的人G-CSF同种型相比，所述人G-CSF同种型能够以较小的剂量和较少的次数在临床上使用。
                                  序列表
<110>CJ Corporation
<120>糖基化的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)同种型
<150>KR 10-2002-0052364
<151>2002-08-31
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggg                                        33
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
catcatcatc atcatcatgg ggacgatgac gataag                                     36
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
accccccatg gcttcctgca ctgtccagtg                                            30
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ggggacgatg acgataagac ccccctgggc cctgcc                                  36
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gaggagctgg tgctgctcaa ccactctctg ggcatcccc                               39
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
ggggatgccc agagagtggt tgagcagcac cagctcctc                               39
<210>7
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
ctcctgcagg ccctggaaaa catctccccc gagttgggtc cc                           42
<210>8
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
gggacccaac tcgggggaga tgttttccag ggcctgcagg ag                           42
<210>9
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
cctgccctgc agcccaacca gagcgccatg ccggccttc                               39
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
gaaggccggc atggcgctct ggttgggctg cagggcagg                               39
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
tcccaagctt atggctggac ctgccaccca g                                       31
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
tgggatcctc agggctgggc aaggtggcgt ag                                      32

Claims (6)

1.一种具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型，其中所述氨基酸序列在下面的一个或多个氨基酸位置处包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L9 9)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
2.如权利要求1的人G-CSF同种型，其中所述人G-CSF同种型分别具有以下修饰：第51位甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺，第94位甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺，或第133位苏氨酸和第135位甘氨酸残基分别被修饰成天冬酰胺和丝氨酸，或具有所有这些修饰。
3.一种编码具有修饰过的氨基酸序列的人G-CSF同种型的基因，其中所述氨基酸序列在下面的一个或多个氨基酸位置处包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)：
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
4.如权利要求1的基因，其中所述人G-CSF同种型具有以下修饰：第51位甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺，第94位甘氨酸残基被修饰成天冬酰胺，或第133位苏氨酸和第135位甘氨酸残基分别被修饰成天冬酰胺和丝氨酸，或具有所有上述修饰。
5.一种制备糖基化的人G-CSF同种型的方法，包括以下步骤：
培养被携带权利要求3或4的编码人G-CSF同种型的基因的表达载体转化或转染了的真核宿主细胞；和
从所述培养上清液或细胞裂解物中分离所述糖基化的人G-CSF同种型。
6.一种药物组合物，其中包含通过对权利要求1或2的人G-CSF同种型进行额外糖基化而制备的糖基化的人G-CSF同种型，和药用可接受载体。
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