CN1150458A

CN1150458A - 用于刺激造血的通式为gm-csf-l-epo或epo-l-gm-csf的杂合分子

Info

Publication number: CN1150458A
Application number: CN95193278A
Authority: CN
Inventors: 安东尼奥·米尔; 丽塔·德桑蒂斯; 克里斯蒂娜·卡斯隆尼; 安娜玛丽娅·科斯卡里拉
Original assignee: Menarini Ricerche SpA
Current assignee: Menarini Ricerche SpA
Priority date: 1994-05-27
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 1997-05-21
Also published as: WO1995033057A1; ITFI940106A0; US5916773A; JPH10500579A; AU2616895A; CA2191306A1; EP0760858A1; ITFI940106A1

Abstract

本文描述了用于刺激造血的通式为GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF的杂合分子，包括借助于具有不同长度的氨基酸的接头L融合在一起的GM-CSF和EPO分子，GM-CSF和EPO分子或者是整个分子或者是其片段。所述杂合分子与等摩尔量的未连接的GM-CSF和EPO分子的混合物相比，具有较高的红细胞分化的作用特异性。此外，本发明描述了编码刺激造血的所述杂合分子的DNA序列；含有编码杂合分子和在宿主细胞中指导其合成的基因的质粒载体；所述的杂合分子在制备药物组合物中的应用以及用于刺激造血的所述药物组合物。

Description

用于刺激造血的通式为GM-CSF-L-EPO 或EPO-L-GM-CSF的杂合分子

发明领域

本发明涉及用于刺激造血的杂合造血因子。特别是，涉及通式为GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF的杂合分子，该分子含有借助于具有不同长度的氨基酸的一个连接头融合的整个GM-CSF和EPO分子或其片段。所述杂合分子与不连接的GM-CSF和EPO分子的等摩尔混合物相比其对红细胞样细胞分化的作用有更高的特异性。

技术领域的状态

造血是一个从多潜力干细胞库起始的多步骤的细胞增殖和分化过程。这些细胞在回答不同的刺激时可以增殖和分化为造血祖代。

一组蛋白质称为生长因子或菌落刺激因子(CSFs)或控制干细胞和祖代细胞生存，增殖和分化的细胞因子。此外，它们影响成熟终末细胞的几种功能活性。

简而言之，对于未成熟细胞，CSFs确保耐力库(staminal pool)的自我更新并且激活造血分化的第一阶段，在中期，当细胞增殖与成熟细胞的特性的逐渐获得有关，它们大大地加强正在分化细胞的数目；在末期它们控制成熟细胞的循环和活化。对于许多CSFs，其靶细胞是已知的。白细胞介素3(IL3)作用于多潜力(CFU-GEMM)，骨髓(CFU-GM)，红细胞样(BFU-E)和巨核细胞(CFU-MK)祖代，而GM-CSF显示对早期祖代有作用。促红细胞生成素(EPO)，G-CSF，白细胞介素5(IL5)和M-CSF分别对红细胞样(CFU-E)，粒细胞(CFU-G)，嗜酸性(CFU-Eo)和单核细胞(CFU-M)谱系的末期祖代有特异性。根据其在临床上的应用潜力证实这些分子的重要性。

特别是，对于由化疗或放射性治疗诱导的贫血，再生障碍或骨髓发育不全的病例以及对于慢性肾衰竭的血液透析病人可以使用导致血细胞增加的EPO给药。

当生物体绝对需要产生粒细胞，例如患有爱滋病或者在瘤形成或移植期间进行的抗未成熟细胞的治疗时可以用GM-CSF给药，其作用由一些初步的临床研究证明。在单细胞水平时几种生长因子的相互作用有增效或拮抗附助效果。例如，几种贫血对GM-CFS和IL3与EPO的结合物有很好的应答反应(Clark S.C.，Kamen R.，1987，Science，236：1229)。

由于现存有效的血液不足于满足输血的需要并且由于类似于爱滋病、乙和丙型肝炎等的血接触的危险性愈来愈高，对生产重组造血因子或有造血活性的新分子，证明在工业上有利润。

专利申请W092/06116公开了含有一个早期因子和一个晚期因子的重组造血杂合生长因子。其中公开了早期因子是IL-3和GM-CSF，而公开的晚期因子是EPO，G-CSF，IL5和M-CSF。所说的专利申请仅描述了杂合生长因子IL3：EPO，EPO：IL3和IL3：G-CSF，其中每一种杂合因子的两种成分可以直接或借助于一个接头融合在一起。

虽然所说专利申请也提到了GM-CSF分子(附图7)，但是没有对所说分子与EPO的结合物的行为和用途进行描述和说明。

专利申请W092-06116的作者确信早期因子(IL3)反馈调节晚期因子(EPO)的受体的表达并且因此导致晚期因子受体减少。另一方面，Testa U.，etal，(Blood，81，1442-1456，1993)发现该早期因子正向刺激晚期因子受体的表达。因此可以得出结论至今还未明白由早期/晚期因子诱导的作用。此外，所说专利申请的作者已经公开了有关杂合因子IL3：EPO或者EPO：IL3的生物学活性的资料(克隆形成试验；表IV)，结果显示所说杂合分子刺激骨髓细胞的BFU-E和CFU-E菌落的形成。由于它们没有报道诱导CFU-GM菌落的资料，因而不可能预见或者讨论所说杂合分子对红细胞样分化的作用特异性。而且，所说表IV没有表示IL3：EPO或者EPO：LL3杂合因子对产生红细胞样细胞(BFU-E和CFU-E细胞)的作用之间和由IL3+EPO混合物显示的作用之间的实质性差异。

此外，在该申请中报道的克隆形成试验是用未纯化的骨髓祖代细胞(它们是分泌内源性生长因子；Peschle C.et al.，1993，Stem Cell，11，356-370)完成的，因此由于存在污染物或者二代细胞影响观察结果是可能的。

总之，对于所说的申请，我们可以认为在W092/06116中公开的资料目前几乎是不能解释的。

发明概述

本发明的作者令人惊奇地发现通式为GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF的新杂合分子与等摩尔量的未连接的GM-CSF和EPO分子相比其对红细胞样分化的作用特异性更高，该分子含有借助于具有不同长度的氨基酸的一个连接头融合的整个GM-CSF和EPO分子或其片段。根据现有技术的状态确保或预见该结果是不可能的。

此外，本发明涉及编码所说融合分子的核苷酸序列，涉及含有所说核苷酸序列的表达载体以及含有所说载体的宿主细胞。

本发明还涉及所说融合分子在制备药物组合物中的应用，涉及用于刺激造血的药物组合物。

附图和序列的简述

附图1显示涉及杂合分子GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO，GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO，EPO-L3-GM-CSF的结构图，其中L1和L3是有16个氨基酸序列的接头，而L2是有8个氨基酸的接头。标记(Δ1-4)EPO表示EPO分子失去了起始的4个氨基酸。

附图2显示编码融合杂合蛋白GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO的杂合基因的结构。

附图3显示借助于用NaeI限制性核酸内切酶消化DNA将接头L1(16aa)降解为L2(8aa)。

附图4显示编码融合杂合蛋白EPO-L3-GM-CSF的杂合基因结构。

附图5显示一个矩形图，其中横坐标报道的是以ng/ml表示的加入到培养物中的生长因子的浓度，而纵坐标报道的是由两种生长因子GM-CSF和EPO(标准物)的混合物或由杂合分子L1和L2诱导的红细胞样(BFU-E)和粒细胞-巨噬细胞(GM-CSF)菌落的数目。

SEQ ID NO： 1报道105个碱基的寡核苷酸的序列。

SEQ ID NO： 2报道编码接头L1的48个碱基的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 3报道接头L1和16个氨基酸的序列。

SEQ ID NO： 4报道杂合分子GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 5报道编码接头L2的24个碱基的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 6报道接头L2的8个氨基酸序列。

SEQ ID NO： 7报道杂合分子GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 8报道编码接头L3的48个碱基的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 9报道接头L3的16个氨基酸的序列。

SEQ ID NO： 10报道36个碱基的寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 11报道57个碱基的寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO： 12报道杂合分子EPO-L3-GM-CSF的核苷酸序列。

发明详细描述

根据本发明，作者借助于将编码GM-CSF，接头和EPO的基因片段融合并且在宿主细胞中表达而获得许多杂合分子。宿主细胞选自于细菌，酵母，昆虫，植物或哺乳动物细胞组。使用CHO细胞是优选的。

本发明的杂合分子由通式GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF表示，其中所说的杂合分子由借助于具有不同长度的氨基酸的一个连接头L融合的整个GM-CSF(127个氨基酸)和EPO(166个氨基酸)分子或其片段所组成。

编码本发明蛋白质的杂合基因的结构如下所述。

I)编码含有N-末端的GM-CSF，一个接头和C-末端的EPO的融合蛋白的DNA序列，该序列从5′-3′含有下列成分：

a)GM-CSF的cDNA的5′末转译区；

b)GM-CSF编码序列；

c)编码接头肽的寡核苷酸；

d)EPO编码序列；

e)EPO的未转译区。

II)编码含有N-末端的EPO，一个接头和C-末端的GM-CSF的融合蛋白的DNA序列，该序列从5′-3′含有下列成分：

a)EPO的cDNA的5′末转译区；

b)EPO编码序列；

c)编码接头肽的寡核苷酸；

d)GM-CSF编码序列；

e)GM-CSF的未转译区。

根据本发明的一个优选实施例，获得的杂合分子如下：

GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO(也称为MEN 11301)，GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO(也称为MEN 11300)，EPO-L3-GM-CSF(也称为MEN11303)，其中L1和L3是指长度为16氨基酸的一接头，而L2是指长度为8个氨基酸的接头。标记(Δ1-4)EPO是指EPO分子失去了起始的4个氨基酸，并且也表示为5-166个氨基酸(5-166aa)的EPO。上述分子的结构显示于附图1。

根据该实施例，将上述杂合基因克隆到专利申请PCT/EP94/03488的表达载体中并且转染到CHO细胞中。通过用纯化的人干细胞进行克隆形成试验对在CHO细胞中表达的重组杂合分子的功能进行研究。获得的功能资料显示由转染子释放到培养基中的三种杂合分子诱导红细胞的分化。令人惊奇的是，在用本发明的杂合分子处理的培养基中红细胞菌落与粒细胞-巨噬细胞菌落数目的比例高于用两种因子GM-CSF和EPO的混合物处理的培养基中相应细胞数目的比例，这表明与该混合物相比，融合到单个多肽链上的该分子选择性诱导红细胞分化的功能增强(表1)。

下面的实施例中描述了本发明的一些特定的实施方案。

实施例1

编码融合蛋白GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO的杂合基因的构建

编码含有N-末端的GM-CSF，一个接头L1和C-末端的EPO的融合蛋白的杂合基因按如下所述获得。

A)插入到pG EM 7Z(5′Sm aI-3′E coRI)(Promega Biotec.Madison，WI，USA)中的EPO cDNA克隆到pG EM 4Z载体(Promega Biotec.Madison，WI，USA)的K pnI-EcoRI位点。用K pnI选择性切割是指其去除该蛋白质起始的17个氨基酸；然后通过与接头序列(较好的是如B中定义的)融合恢复+5至+17的氨基酸。

B)以克隆到pG EM 7Z(5′E coRI-3′HindIII)中的GM-CSF的cDNA作为模板和以对应于pG EM 7Z载体(Promega Biotec.Madison，WI，USA)的T7启动子的寡核苷酸作为5′引物和以105个碱基的寡核苷酸作为3′引物，进行PCR反应而获得用于构建融合蛋白的GM-CSF的cDNA部分，所述3′引物的序列报道于SEQ ID NO：1中，它含有与GM-CSF的3′编码区(不包括终止密码子)互补的18个碱基，编码一个分子接头(其序列是由Huston等人，(PNAS，1988，USA，85：5879-5883)描述的接头的修改形式)的48个碱基(基序列报道于SEQ ID NO：2和附图3中)和编码EPO的+5至+17位的氨基酸的39个碱基。

在X baI-K pnI处切割PCR产物。该消化是指去除3′的编码EPO的+16和+17位氨基酸的最后6个核苷酸，它们已经存在于克隆于pG EM 4Z-EPO中的EPO序列中，将经过消化的扩增产物克隆于上述的pG EM 4Z-EPO的相同位点，得到EPO的+5至+15位的氨基酸。用SalI/BglII消化pG EM 4Z-GM-CSF-L1-EPO并且将片段克隆于pG EM 11Z(PromegaBiotec.)的SalI和Bam HI位点，因此最后克隆于载体pM CMV β SV1DHFR(已经描述于专利申请PCT/EP94/03488)的X baI位点(附图2)。

用Sanger(SEQUENASE Version 2.0DNA测序盒，UNITED STATESBIOCHEMICAL)的方法测定编码杂合分子GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO的核苷酸序列报道于SEQ ID NO：4中。成熟的杂合蛋白GM-L1-(Δ1-4)EPO的氨基酸序列含有：

a)GM-CSF的127个氨基酸；

b)具有序列Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser(SEQ ID NO：3和附图3)的16个氨基酸的接头肽；

c)EPO的162个氨基酸。

实施例2

编码融合蛋白GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO的杂合基因的构建

编码含有N-末端的GM-CSF，接头L2(24个碱基，报道于SEQ IDNO：5和附图3)和C-末端的EPO的融合蛋白的杂合基因按如下所述获得。

A)用NaeI酶消化pGEM4Z-GM-CSF-L1-EPO构建体。该酶在接头L1中有两个限制性位点。用NaeI酶消化去除了(编码)位于GM-CSF和EPO之间的氨基酸序列为Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ IDNO：6和附图3)的接头L1的24个碱基。

从pG EM 4Z将GM-CSF-L2-(Δl-4)EPO转移到pMCMVβSV1DHFR的亚克隆步骤类似于对于GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO所描述的步骤(附图2)。

用Sanger(SEQ UEN A SE Version 2.0 DNA测序盒，UNITED STATESBIOCHEMIC AL)的方法测定的编码杂合分子GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO的核苷酸序列报道于SEQ ID NO：7中。成熟的杂合蛋白GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO的氨基酸序列含有：

a)GM-CSF的127个氨基酸；

b)具有序列Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO：6)的8个氨基酸的接头肽；

c)EPO的162个氨基酸。

实施例3

编码融合蛋白EPO-L3-GM-CSF的杂合基因的构建

编码含有N-末端的EPO，接头L3(16个氨基酸的序列，报道于SEQ IDNO：9)和C-末端的GM-CSF的融合蛋白的cDNA按如下所述获得。

A)以用EcoRI限制性酶消化后的pG EM 7Z-EPO用作为模板，以对应于SP6启动子(Promega，Biotec.Madison，WI，USA)的寡核苷酸用作为5′引物并且以36个碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO：10)用作为3′引物进行EPO cDNA的扩增，在用作为3′引物的寡核苷酸中12个碱基互补于模板的3′(去除终止密码子)和编码接头L3的5′部分的24个碱基；

B)以用E coR I限制性酶消化后的pG EM 7Z-GM-CSF用作为模板，以SP6用作为3′引物并且以57个碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO：11)用作为5′引物进行GM-CSF cDNA的扩增，在用作为5′引物的寡核苷酸中42个碱基编码接头L3的3′部分和15个碱基互补于编码成熟蛋白的起始5个氨基酸的序列。

接头L3的整个核苷酸序列报道于SEQ ID NO：8中。两种PCRs产物分别用SacI/AvaI和AvaI/B am HI酶消化后克隆于pG EM 4Z的SacI/B am HI的位点。在pG EM 4Z-EPO-L3-GM-CSF的C1aI/BspHI处消化并且在用KLENOW聚合酶(BOEHRINGER MA NHEIM)填平后使之具有平齐末端，将该片段克隆于pMCMVβSV1DHFR的SmaI位点(附图4)。

用Sanger(如上所述)的方法测定的编码杂合分子EPO-L3-GM-CSF的核苷酸序列报道于SEQ ID NO：12中。

成熟的杂合蛋白EpO-L3-GM-CSF的氨基酸序列含有：

a)EPO的166个氨基酸；

b)具有序列Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyAla Gly Ser(SEQID NO：9)的16个氨基酸的接头肽；

c)GM-CSF的127个氨基酸。

产生重组杂合分子GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO，GM-CSF-L2(Δ1-4)EPO，EPO-L3-GM-CSF的细胞系的制备

用于表达重组杂合分子的哺乳动物细胞是CHO dhfr-(CHODUKXB1)(U rlaub G.，Chaisin L.A.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.77：4216)。

利用由GIBCOBRL(Felgner P.L.，Holm M.，1989，Focus，11-2：21)生产的LIPOFECTIN转染该细胞。在转染之后选出的克隆在浓度逐渐增加的氨甲喋呤(SIFG M A)中进行扩增循环。

表达水平的测定

采用两个ELISA试验：i)EPO ELISA(BOEHRINGER MANNHEIM)；ii)GM-CSF ELISA(AM ER SH AM)在限制性培养基中分析融合蛋白。

生物学特性

采用本领域内已知的方法(Valtieri M.，et al.，1989，Blood，74：460)通过用人干细胞进行菌落形成试验对在限制性培养基中产生的杂合蛋白的生物学活性进行评估。

结果显示在人干细胞培养物中连接为杂合多肽单链的GM-CSF和EPO因子与用等摩尔量的未连接两种因子的混合物相比能诱导较高的红细胞菌落数和较低的粒细胞--巨噬细胞菌落(附图5)。这些资料显示与未连接的相同分子相比该杂合分子对红细胞分化具有较高作用特异性。

表1显示在用杂合分子处理的培养物比用等摩尔量的两种未连接因子(分别从Genetic Institute和Amgen得到的GM-CSF和EPO标准物)处理的培养物产生的红细胞和粒细胞-巨噬细胞菌落数目的比例更高。这一结果不依赖于所分析的浓度(表1)。

本发明的另一个特征是提供了用于生产本发明杂合蛋白的方法，包括按照本领域已知的方法在合适的条件下培养上述的宿主细胞，以便表达DNA序列并且从培养物中回收蛋白质。

本发明的另一个特征是一种药物组合物，包括与药物学上合适的载体或赋形剂结合的本发明的杂合蛋白。

此外，本发明还涉及本发明的杂合蛋白在制备用于刺激红细胞生成的药物组合物中的应用。

表1

BFU-E/CFU-GM量(ng/ml) GM-CSF+EPO L1^* L2^** L3^***0.14 1.4 3.0 2.25 1.41.4 4.6 9.0 6.7 5.07.0 7.2 10.0 11.6 8.0^* GM-CSF-L1-(Δ1-4)EPO^**GM-CSF-L2-(Δ1-4)EPO^***EPO-L3-GM-CSF

序列表

1、一般情报：

(i)申请人：

(A)名称：MENARINI RICERCHE SUD SpA

(B)街：Via Tito Speri10

(C)城市：Pomezia(RM)

(D)州名：RM

(E)国家：意大利

(F)邮编(ZIP)：00040

(G)电话：06-911841

(H)电传：06-91601408

(ii)发明名称：用于刺激造血的通式GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF的杂合离子

(iii)序列数：12

(iv)计算机可读方式：

(A)介质类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0 version#1.25(EPO)

2、SEQ ID NO.1情报：

(i)序列特征：

(A)长度：105个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO1：

ACCCTCGGTC AGGTCCTCCG GCCGCCTCCT CCAAGGCCTC CTCGGCCGAG CCCCCCGCCG 60

CCGAGTGAGT AGACACTGTC GGCTCAGGAC CTCTCCATGG AGAAC 1052、SEQ ID NO.2情报：(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 2：GCCGGCGGAG GAGGTTCCGG AGGAGCCGGC TCGGGGGGCG GCGGCTCA 482、SEQ ID NO.3情报：(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 3：

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 152、SEQ ID NO.4情报：(i)序列特征：

(A)长度：969个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 4：ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT GCTCTTGGGC ACTGTGGCCT GCAGCATCTC TGCACCCGCC 60CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGG GAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG 120CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGA ATGAAACAGT AGAAGTCATC 180TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGA GCTGTACAAG 240CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT GGCCAGCCAC 300TACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGCA TATCACCTTT 360GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG 420CCAGTCCAGG AGGCCGGCGG AGGAGGTTCC GGAGGAGCCG GCTCGGGGGG CGGCGGCTCA 480CTCATCTGTG ACAGCCGAGT CCTGGAGAGG TACCTCTTGG AGGCCAAGGA GGCCGAGAAT 540ATCACGACGG GCTGTGCTGA ACACTGCAGC TTGAATGAGA ATATCACTGT CCCAGACACC 600AAAGTTAATT TCTATGCCTG GAAGAGGATG GAGGTCGGGC AGCAGGCCGT AGAAGTCTGG 660CAGGGCCTGG CCCTGCTGTC GGAAGCTGTC CTGCGGGGCC AGGCCCTGTT GGTCAACTCT 720TCCCAGCCGT GGGAGCCCCT GCAGCTGCAT GTGGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC 780CTCACCACTC TGCTTCGGGC TCTGGGAGCC CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATGCG 840GCCTCAGCTG CTCCACTCCG AACAATCACT GCTGACACTT TCCGCAAACT CTTCCGAGTC 900TACTCCAATT TCCTCCGGGG AAAGCTGAAG CTGTACACAG GGGAGGCCTG CAGGACAGGG 960GACAGATGA 9692、SEQID NO.5情报：(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 5：GCCGGCTCGG GGGGCGGCGG CTCA 242、SEQ ID NO.6情报：(i)序列特性：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 6：

Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 52、SEQ ID NO.7情报：(i)序列特征：

(A)长度：945个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：CDNA(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 7：ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT GCTCTTGGGC ACTGTGGCCT GCAGCATCTC TGCACCCGCC 60CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGG GAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG 120CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGA ATGAAACAGT AGAAGTCATC 180TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGA GCTGTACAAG 240CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT GGCCAGCCAC 300TACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAC TATCACCTTT 360GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG 420CCAGTCCAGG AGGCCGGCTC GGGGGGCGGC GGCTCACTCA TCTGTGACAG CCGAGTCCTG 480GAGAGGTACC TCTTGGAGGC CAAGGAGGCC GAGAATATCA CGACGGGCTG TGCTGAACAC 540TGCAGCTTGA ATGAGAATAT CACTGTCCCA GACACCAAAG TTAATTTCTA TGCCTGGAAG 600AGGATGGAGG TCGGGCAGCA GGCCGTAGAA GTCTGGCAGG GCCTGGCCCT GCTGTCGGAA 660GCTGTCCGTC GGGGCCAGGC CCTGTTGGTC AACTCTTCCC AGCCGTGGGA GCCCCTGCAG 720CTGCATGTGG ATAAAGCCGT CAGTGGCCTT CGCAGCCTCA CCACTCTGCT TCGGGCTCTG 780GGAGCCCAGA AGGAAGCCAT CTCCCCTCCA GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA 840ATCACTGCTG ACACTTTCCG CAAACTCTTC CGAGTCTACT CCAATTTCCT CCGGGGAAAG 900CTGAAGCTGT ACACAGGGGA GGCCTGCAGG ACAGGGGACA GATGA 9452、SEQ ID NO.8情报：(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 8：GCCGGCGGAG GAGGCTCGGG AGGAGGAGGT TCCGGAGGAG CCGGCTCA 482、SEQ ID NO.9情报：(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 9：

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser

1 5 10 152、SEQ ID NO.10情报：(i)序列特性：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 10：TCCTCCCGAG CCTCCTCCGC CGGCTCTGTC CCCTGT 362、SEQ ID NO.11的情报：(i)序列特性：

(A)长度：57个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合性：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 11：GGAGGAGGCT CGGGAGGAGG AGGTTCCGGA GGAGCCGGCT CAGCACCCGC CCGCTCG 572、SEQ ID NO.12情报：(i)序列特性：

(A)长度：1011个碱基对

(B)类型：核酸

(C)绞合型：单股

(D)拓朴结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(xi)序列描述：SEQ ID NO 12：ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCTGGCTG TGGCTTCTCC TGTCCCTGCT GTCGCTCCCT 60CTGGGCCTCC CAGTCCTGGG CGCCCCACCA CGCCTCATCT CTGACAGCCG AGTCCTGGAG 120AGGTACCTCT TGGAGGCCAA GGAGGCCGAG AATATCACGA CGGGCTGTGC TGAACACTGC 180AGCTTGAATG AGAATATCAC TGTCCCAGAC ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG 240ATGGAGGTCG GGCACAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT 300GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC CCTGCAGCTG 360CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC AGCCTCACCA CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA 420GCCCAGAAGG AAGCCATCTC CCCTCCAGAT GCGGCCTCAG CTGCTCCACT CCGAACAATC 480ACTGCTGACA CTTTCCGCAA ACTCTTCCGA GTCTACTCCA ATTTCCTCCG GGGAAAGCTG 540AAGCTGTACA CAGGGGAGGC CTGCAGGACA GGGGACAGAG CCGGCGGAGG AGGCTCGGGA 600GGAGGAGGTT CCGGAGGAGC CGGCTCAGCA CCCGCCCGCT CGCCCAGCCC CAGCACGCAG 660CCCTGGGAGC ATGTGAATGC CATCCAGGAG GCCCGGCGTC TCCTGAACCT GAGTAGAGAC 720ACTGCTGCTG AGATGAATGA AACAGTAGAA GTCATCTCAG AAATGTTTGA CCTCCAGGAG 780CCGACCTGCC TACAGACCCG CCTGGAGCTG TACAAGCAGG GCCTGCGGGG CAGCCTCACC 840AAGCTCAAGG GCCCCTTGAC CATGATGGCC AGCCACTACA AGCAGCACTG CCCTCCAACC 900CCGGAAACTT CCTGTGCAAC CCAGACTATC ACCTTTGAAA GTTTCAAAGA GAACCTGAAG 960GACTTTCTGC TTGTCATCCC CTTTGACTGC TGGGAGCCAG TCCAGGAGTG A 1011

Claims

1、用于刺激造血的杂合蛋白，它具有通式GM-CSF-L-EPO或EPO-L-GM-CSF，其中L是具有不同长度氨基酸的接头，并且其中GM-CSF和EPO分子是整个分子或其片段。

2、根据权利要求1所述的杂合蛋白，从5′-3′含下列成分：

a)GM-CSF的1-127氨基酸；

b)一个接头；

c)EPO的5-166氨基酸。

3、根据权利要求1所述的杂合蛋白，从5′-3′含有下列成分：

a)EPO的5-166氨基酸；

b)一个接头；

c)GM-CSF的1-127氨基酸。

4、根据权利要求2-3所述的杂合蛋白，其中所述接头是16个氨基酸的序列。

5、根据权利要求4所述的杂合蛋白，其中所述接头是SEQ ID NO：3的序列或SEQ ID NO：9的序列。

6、根据权利要求2-3所述的杂合蛋白，其中所述接头是8个氨基酸的序列。

7、根据权利要求6所述的杂合蛋白，其中所述接头是SEQ ID NO：6的序列。

8、编码权利要求1所述的杂合蛋白的DNA序列。

9、根据权利要求8所述的DNA序列，从5′-3′含有下列成分：

a)GM-CSF的cDNA的5′未转译区；

b)GM-CSF编码序列；

c)寡核苷酸；

d)EPO编码序列；

e)EPO的3′未转译区。

10、根据权利要求8所述的DNA序列，从5′-3′含有下列成分：

a)EPO的cDNA的5′未转译区；

b)EPO编码序列；

c)寡核苷酸；

d)GM-CSF编码序列；

e)GM-CSF的3′未转译区。

11、根据权利要求9-10所述的DNA序列，其中所述的寡核苷酸是48核苷酸一个序列。

12、根据权利要求11所述的DNA序列，其中所述的寡核苷酸是具有SEQ ID NO：2的序列。

13、根据权利要求11所述的DNA序列，其中所述的寡核苷酸是具有SEQ ID NO：8的序列。

14、根据权利要求9-10所述的DNA序列，其中所述的寡核苷酸是24核苷酸一个序列。

15、根据权利要求14所述的DNA序列，其中所述的寡核苷酸是具有SEQ ID NO：5的序列。

16、一种重组表达载体，含有权利要求8所述的DNA序列。

17、用权利要求16的载体遗传修饰的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是一种细菌，一种酵母，一种昆虫，一种植物或一种哺乳动物细胞。

18、用于生产权利要求1的杂合蛋白的方法，包括在合适的条件下培养权利要求17的宿主细胞，以便表达DNA序列并且从培养物中回收蛋白质。

19、一种药物组合物，包括与药物学上合适的载体或赋形剂结合的权利要求1的杂合蛋白。

20、权利要求1的杂合蛋白的应用，用于制备刺激造血的一种药物组合物。