CN1269805A - 生长激素和相关蛋白的衍生物 - Google Patents

Abstract

生长激素超基因家族包括超过20个结构相关的细胞因子和生长因子。本发明提供了制备这些蛋白质的位点特异性、生物活性结合物的一般方法。本方法涉及通过定点诱变将半胱氨酸残基引入蛋白质中的非必需区域或用半胱氨酸残基取代蛋白质中的非必需氨基酸,然后经引入的半胱氨酸残基将半胱氨酸反应性聚合物或其它类型的半胱氨酸反应性基团共价结合到蛋白质上。本文公开了在蛋白质中引入半胱氨酸残基或引入半胱氨酸取代的优选位点,以及由此制备的蛋白质和蛋白质衍生物。

Description

生长激素和相关蛋白的衍生物

发明领域

本发明涉及基因工程构建的治疗蛋白质。具体地说，所述工程蛋白质包括生长激素及其相关蛋白质。

技术背景

下列蛋白质由生长激素(GH)超基因家族的基因编码(Bazan(1990)；Mott和Campbell(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996))：生长激素、催乳素、胎盘催乳质、红细胞生成素(EPO)、血栓生成素(TPO)、白介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和cardiotrophin-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。预料将来通过基因克隆和测序将鉴定这一基因家族的其它成员。尽管GH超基因家族的成员通常具有有限的氨基酸或DNA同源性，但它们具有相似的二级结构和三级结构。所具有的结构特征使该基因家族的新成员得以容易鉴定。

部分患者和医疗保健人员对长效作用、“用户喜欢”的治疗方法的开发具有相当大的兴趣。蛋白质不像常规小分子药物，其生产花费高，不易被身体吸收。而且，如果口服蛋白质会被降解。因此，天然蛋白质必须通过注射给药。注射后，大多数蛋白质迅速从身体中清除，迫使需要频率通常为每日的注射。患者不喜欢注射，注射导致耐受性降低，并降低药效。某些蛋白质，例如当低频率给药(每周使用EPO三次)时，红细胞生成素(EPO)有效，因为它们被糖基化。然而，糖基化蛋白质需要应用昂贵的哺乳动物细胞表达系统制备。

注射蛋白质在体内的保留时间是有限的，保留时间的长短由例如蛋白质大小以及蛋白质是否含有共价修饰(例如糖基化)等因素决定。注射蛋白质的循环浓度在24小时内不断以几个数量级的幅度改变。蛋白质激动剂的浓度快速改变能够导致在刺激时和刺激后的其它时间对靶细胞产生巨大变化的下游结果。类似的问题困扰着蛋白质激动剂。这些波动可导致蛋白质治疗的效能降低，并增加不良副作用的几率。重组蛋白质从身体中快速清除显著增加了每位患者治疗需要的蛋白质量，从而显著增加了治疗花费。随着新的和现有的药物用于更多的疾病适应症，预期蛋白质药物的消耗量在未来几年内可能会显著增加。

因此，需要开发降低对病人和接受医疗保健者进行蛋白质治疗的费用的蛋白质给药技术。本发明提供了对这类问题的解决方案，即提供了延长蛋白质治疗药物在体内的循环半衰期，以使蛋白质不必频繁注射的方法。该解决方案也满足了对”用户满意”的蛋白质治疗的需要和愿望，即不需要频繁注射的蛋白质治疗。本发明通过提供生物活性的、引入半胱氨酸的生长激素超基因家族成员的变异体解决了上述和其它问题。本发明还提供了用半胱氨酸反应聚合物或其它类型的半胱氨酸反应基团化学修饰这些变异体以制备其衍生物，以及如此制备的分子。

发明概述

本发明提供了GH超基因家族成员的半胱氨酸变异体。这些变异体包括半胱氨酸残基取代所述蛋白质的非必需氨基酸得到的蛋白质。这些变异体优选包括半胱氨酸残基取代所述蛋白质的环区、α-螺旋末端、第一个两亲螺旋的近侧、最后一个两亲螺旋的远侧的氨基酸，或者将半胱氨酸残基加到所述蛋白质的N-末端或C-末端得到的蛋白质。取代的优选位点是N-或O-连接的糖基化位点。

本发明还提供了一种半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸位于GH超基因家族干扰素/干扰素-10样的A-B环、B-C环、C-D环或D-E环上。

本发明还提供了一种GH超基因家族成员的半胱氨酸变异体成员，其中半胱氨酸残基插入天然蛋白质的两个氨基酸之间。具体地说是半胱氨酸残基插入环区、α-螺旋末端、第一个两亲螺旋的近侧、或最后一个两亲螺旋的远侧。更具体地说是，半胱氨酸残基插入N-或O-相连的糖基化位点中的两个氨基酸之间、或紧邻N-连接或O-连接的糖基化位点中的一个氨基酸。

本发明还提供了更具体的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸引入的环区是GH超基因家族的干扰素/干扰素-10样的A-B环、B-C环、C-D环、或D-E环。

这种半胱氨酸取代或插入突变还可以包括将一种或多种其它氨基酸插入半胱氨酸取代物或插入物的氨基末端或羧基末端。

本发明还提供了通过将半胱氨酸变异体聚乙二醇化而进一步衍生的半胱氨酸变异体，以及由此制备的衍生化蛋白质。

如实施例的描述，还提供了GH超基因家族成员的具体的半胱氨酸变异体，包括例如，GH变异体。GH半胱氨酸变异体可以在A-B环的N-末端、B-C环、C-D环，A、B、C、D螺旋的前三个或后三个氨基酸，以及螺旋A的近侧和螺旋D的远侧的氨基酸上具有半胱氨酸取代的氨基酸或插入的半胱氨酸。

更具体地说，半胱氨酸可取代下列氨基酸：F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、K40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188、和G190。

按照本发明的半胱氨酸变异体的其它例子包括红细胞生成素变异体。红细胞生成素变异体包括那些取代的氨基酸位于A-B环、B-C环、C-D环、螺旋A的近侧氨基酸和螺旋D的远侧氨基酸，以及N-或C-末端氨基酸的变异体。更具体地说，EPO半胱氨酸变异体包括半胱氨酸取代下面指示的氨基酸得到的分子：丝氨酸-126、N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、R166和S85。

GH超基因家族的成员包括生长激素、催乳素、胎盘催乳素、红细胞生成素、血小板生成素、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亚基)、白介素-13、白介素-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、cardiotrophin-1和其它鉴定分类为该家族成员的蛋白质。这些蛋白质可以来源于任何包括人、宠物和家畜在内的任何动物品种。

在说明书以及本文阐述的“规则”基础上，对本发明的其它改变和修饰将对本领域技术人员是显而易见的。所有这些均被认为是本发明的一部分。

发明详述

本发明涉及半胱氨酸变异体，尤其是这种蛋白质与聚乙二醇(PEG)或其它类似物位点特异性结合的半胱氨酸变异体衍生物。PEG是一种无抗原性的惰性聚合物，它显著延长蛋白质在体内的循环时间。这使得蛋白质在较长时间内有效。PEG共价修饰蛋白质证明是一种延长蛋白质在体内的循环半衰期的有效方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。蛋白质共价连接PEG增加了蛋白质的有效大小，降低了其从体内清除的速率。商业提供的PEG有几种分子量大小，这使PEG修饰蛋白质的循环半衰期根据应用不同分子量大小的PEG，而适应不同的个体病症。PEG修饰的其它优点包括增加蛋白质的溶解性，增加蛋白质的体内稳定性，以及降低蛋白质的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。

PEG衍生蛋白质的优选方法是利用与半胱氨酸反应的PEG将PEG与半胱氨酸残基共价连接。商业提供了许多具有不同反应基团(例如马来酰亚胺，乙烯基磺酸)和PEG分子量大小不同(2-20 kDa)的高度特异性的与半胱氨酸反应的PEG(例如，来自Shearwater，Polymers，Inc.，Huntsville，AL)。在中性pH条件下，这些PEG试剂选择性连接“游离”半胱氨酸残基，即不含二硫键的半胱氨酸残基。这些结合对水解具有稳定性。半胱氨酸反应性PEG的应用使能开发确定结构的均一PEG-蛋白质结合物。

今年来在确定具有商业重要性的蛋白质治疗剂的结构和了解它们如何与其蛋白质靶体(例如细胞表面受体、蛋白酶等)相互作用方面已经取得了相当大的进展。这些结构信息可被用来使用半胱氨酸反应PEG设计PEG-蛋白质结合物。大多数蛋白质中的半胱氨酸残基参与形成二硫键，因此不能用于使用半胱氨酸反应PEG进行PEG衍生化。然而利用重组DNA技术在体外诱导突变，可以将其它的半胱氨酸残基导入蛋白质的任何位置。加入的半胱氨酸可以插入蛋白质的起始位置、蛋白质的末端位置、蛋白质序列中的两个氨基酸之间，或者优选取代蛋白质序列中的现有氨基酸。新加入的“游离”半胱氨酸可以作为利用半胱氨酸反应性PEG进行PEG分子特异性结合的位点。加入的半胱氨酸必须暴露在蛋白质表面，使该方法的PEG衍生化得以顺利实现。如果用于插入加入的半胱氨酸的位点在生物活性上是非必须的，那么PGE衍生化蛋白质将基本上表现野生型(正常)的体外生物活性。用半胱氨酸反应性PEG进行PEG衍生蛋白质的主要技术难题在于鉴定目标蛋白质中暴露于表面的、非必须区域，其中可以插入半胱氨酸残基或用半胱氨酸残基取代现有氨基酸而不丧失生物活性的。

几种加入半胱氨酸的人蛋白质变异体和这些蛋白质的PEG聚合物结合体已有描述。美国专利5,206,344描述了加入半胱氨酸的IL-2变异体。这些加入的半胱氨酸的变异体位于成熟IL-2多肽链氨基末端的前20个氨基酸。优选的半胱氨酸变异体位于成熟多肽链的第3号位置，在自然发生的蛋白质中对应O-糖基化的苏氨酸残基。在位置3用半胱氨酸取代苏氨酸产生能够用半胱氨酸反应PEG进行PEG衍生，并保留全部体外生物活性的IL-2变异体(Goodson和Katre，1990)。相比较而言，用赖氨酸反应PEG对天然IL-2进行PEG衍生化显示降低体外生物活性(Goodson和Katre，1990)。该专利没有报道在IL-2的其它位置进行半胱氨酸取代的效能。

美国专利5,166,322公开了加入半胱氨酸的IL-3变异体。这些变异定位在成熟蛋白质序列N-末端的前14个氨基酸范围内。该专利公开了该蛋白质在细菌中的表达以及用半胱氨酸反应PEG共价修饰蛋白质。其中没有提供加入半胱氨酸的变异体和IL-3的PEG-结合物是否具有生物活性的信息。也没有报道在该多肽链的其它位置加入半胱氨酸的变异体。

世界专利申请WO9412219和PCT申请US95/06540公开了胰岛素样生长因子I(IGF-I)的加入半胱氨酸的变异体。IGF-I与GH具有十分不同的结构，它不是GH超基因家族的成员(Mott和Campbell，1995)。描述了IGF-1蛋白中许多位置上的半胱氨酸取代。仅仅一些加入半胱氨酸的变异体具有生物活性。加入半胱氨酸的变异体的优选位点是成熟蛋白链中的氨基酸位置69。靠近蛋白质N-末端位置(残基1-3)的半胱氨酸取代产生具有降低生物活性和不适宜二硫键的IGF-1变异体。

世界专利申请WO9422466教导了胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白-1的两种加入半胱氨酸的变异体，它们具有与GH极不相同的结构，并且不是GH超基因家族的成员。其中公开的两种加入两个半胱氨酸的IGF结合蛋白质-I的变异体定位于成熟蛋白质链的98位和101位，在自然发生的蛋白质中对应磷酸化的丝氨酸残基。

美国专利申请07/822296指出肿瘤坏死因子结合蛋白的加入半胱氨酸的变异体，它是一种可溶性的、截短形式的肿瘤坏死因子细胞受体。肿瘤坏死因子结合蛋白与GH具有十分不同的结构，它不是GH超基因家族的成员。

IGF-I、IGF结合蛋白-I和肿瘤坏死因子结合蛋白的二级结构和三级结构与GH十分不同，这些蛋白质不是GH超基因家族的成员。因为如此，很难使用从IGF-I、IGF结合蛋白-I和肿瘤坏死因子结合蛋白的研究中得到的信息来制备GH超基因家族成员的加入半胱氨酸的变异体。关于IL-2和IL-3的研究开始在已知IL-2和IL-3的结构之前(McKay 1992；Bazan，1992)，以及明确这些蛋白质是GH超基因家族的成员之前。以前针对鉴定将半胱氨酸残基加入IL-2和IL-3的优选位点的实验是大量经验基础上的实验，并且这些实验的进行是在表明GH超基因家族的成员具有相似的二级结构和三级结构的实验之前。

基于目前可获得的GH超基因家族的成员的结构信息，本发明提供了确定推论的“规则”，即GH超基因家族成员的那些区域和氨基酸残基可以用于插入或取代半胱氨酸残基而不显著丧失生物学活性。与自然发生的蛋白质相反，这些加入半胱氨酸的GH超基因家族成员的变异体将拥有新的特征，例如用能在多肽链的明确位点被半胱氨酸反应聚合物或其它类型的半胱氨酸反应物质共价修饰的能力。共价修饰的蛋白质具有生物活性。

GH是GH超基因家族研究得最清楚的成员。GH是脑垂体分泌的一种22 kDa的蛋白质。GH刺激骨、软骨和肌肉代谢，它是儿童时期促进身体发育的人体主要激素。重组人GH(rhGH)用于治疗儿童由于GH缺乏和肾衰导致的矮小症。GH未糖基化，能够在细菌中以完全活性的形式产生。该蛋白质在体内具有短的半衰期，必须每日皮下注射给药以维持最大有效性(MacGillivray等，1996)。最近，重组人GH(rhGH)被批准用于治疗AIDS患者的恶病质，并处于用于治疗与其它疾病有关的恶病质。

业已熟知人GH的序列(参见，例如被本文引作参考的Martial等，1979；Goeddel等1979；SEQ ID NO：1)。GH在序列上与催乳素和胎盘泌乳质密切相关，这三种蛋白质在起源上被认为属于一个小的基因家族。在各动物品种之间GH的一级序列高度保守(Abdel-Meguid等，1987)，与广泛类型的蛋白质的交叉反应一致。已经通过X-射线晶体学解决了猪GH的三维折叠结构(Abdel-Meguid等，1987)。该蛋白质具有致密的球形结构，包括由环相连的四个两亲α-螺旋束。人GH具有类似的结构(de Vos等，1992)。四个α-螺旋区从蛋白质的N-末端起依次称为A-D。环区指它们连接的螺旋区，例如，A-B环连接螺旋束A和B。A-B和C-D环较长的，而B-C环较短。GH含有四个半胱氨酸残基，它们都参与形成二硫键。这些二硫键的排列分另是半胱氨酸53与半胱氨酸165相连，半胱氨酸182与半胱氨酸189相连。

与受体结合的GH的晶体结构显示，GH具有两个受体结合位点，结合两个受体分子(Cunningham等，1991；de Vos等，1992)。这两个受体结合位点称作位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基(C)-末端和部分螺旋A以及A-B环，而位点II包括螺旋A的氨基(N)-末端区和部分螺旋C。GH与其受体的结合是连续发生的，位点I总是首先结合。然后位点II开始结合第二个GH受体，导致受体产生二聚作用，并激活细胞间的信号传递途径，从而导致细胞对GH发生反应。位点II发生突变的GH突变蛋白质(在120号氨基酸位置由甘氨酸到精氨酸的突变)能够结合信号GH受体，但不能使GH受体产生二聚化；这种突变蛋白质在体外作为GH的拮抗剂，推测因占据GH受体位点而不能激活细胞间信号传递途径而起作用(Fuh等，1992)。

特定区域和氨基酸在GH受体结合和胞间信号传递的中的作用还通过以下技术进行了研究，例如诱变、单克隆抗体和蛋白酶消化。第一个诱变实验需要用密切相关蛋白质，即催乳素的相似区域取代GH的全部区域(Cunningham等，1989)。结果之一是用催乳素的B-C环取代GH的B-C环不影响杂交GH蛋白质与可溶性人GH受体的结合，意味着B-C环对于受体结合是非必需的。丙氨酸扫描突变(用丙氨酸取代各氨基酸)鉴定了对GH的生物活性十分关键的14个氨基酸(Cunningham和Wells，1989)。这些氨基酸定位于螺旋A、B、C和D，以及A-B环上，对应结构研究中鉴定的位点I和位点II。确定第41和172位氨基酸位置的两个赖氨酸残基，即K41和K172，是位点I受体结合位点的关键成分，这解释了当K172乙酰化后观察到生物活性降低(Teh和Chapman，1988)。对K168的修饰也显著降低GH受体结合和生物活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988)。还利用单克隆抗体研究了结合GH受体的GH区域(Cunningham等，1989)。制备了人GH的八个单克隆抗体，分析了它们中和GH活性和防止GH与其重组可溶性受体结合的能力。后一项研究得以在GH的三维结构中定位各单克隆抗体的假定结合位点。令人感兴趣的是单克隆抗体1和8不能从其结合受体中取代GH。这两种单克隆抗体的结合位点定位在B-C环(单克隆1)和A-B环的N-末端(单克隆8)。未研究特异性地与C-D环结合的单克隆。单克隆抗体研究意味着B-C环和A-B环的N-末端对于受体结合是非必需的。最后，用胰蛋白酶限制性切割GH被发现产生了一种保留全部活性的双链衍生物(Mills等，1980；Li，1982)。酶谱研究指出胰蛋白酶切割和/或删除对应C-D环的氨基酸134到149位置之间的氨基酸。这些研究表明C-D环不影响受体结合或GH生物活性。

已经通过X-射线衍射和NMR研究确定了一些细胞因子的结构，包括G-CSF(Hill等，1993)，GM-CSF(Diederichs等，1991；Walter等，1992)，IL-2(Bazan，1992；McKay，1992)，IL-4(Redfield等，1991；Powers等，1992)，和IL-5(Milburn等，1993)，尽管它们的一级序列缺乏显著的同源性，但显示与GH结构具有惊人的保守性。EPO经模型研究和诱变研究认为是该家族的成员(Boissel等，1993；Wen等，1994)。包括纤毛状神经生长因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血栓形成因子(TPO)、制瘤素M、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和α-、β-、ω-、τ-、γ-干扰素在内的其它大量细胞因子和生长因子属于该家族(Mott和Campbell综述，1995；Silvennoinen和Ihle，1996)。目前认为上面所有细胞因子和生长因子构成一个大的基因家族，其中GH是原型。

除了共有相似的二级结构和三级结构之外，该家族的成员还共有这样的特性，即它们必须与细胞表面受体寡聚，以激活胞间信号传递途径。某些GH家族成员，例如，GH和EPO，结合单一类型的受体，并导致它形成均二聚体。其它的家族成员，例如，IL-2、IL-4和IL-6结合多于一种类型的受体，另导致受体形成杂二聚体或更高级的聚集体(Davis等，1993；Paonessa等，1995；Mott和Campbell，1995)。诱变研究表明，象GH一样，其它细胞因子和生长因子含有多个受体结合位点，典型的为两个，连续地结合它们的同源受体(Mott和Campbell，1995；Matthews等，1996)。象GH一样，其它家族成员的重要受体结合位点主要在四个α-螺旋和A-B环上(Mott和Campbell综述，1995)。在家族成员中参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸各有不同(Mott和Campbell，1995)。大多数与GH超基因家族成员相互作用的细胞表面受体是结构上相关的，它们构成第二大的多基因家族(Bazan，1990；Mott和Campbell，1995；Silvennoinen和Ihle，1996)。

对GH超基因家族多种成员的诱变研究得出的一般性结论是，连接α-螺旋的环通常不参与受体结合。尤其是短的B-C环，在不是全部也是大多数的家族成员中，对受体结合是非必需的。因为这个原因，B-C环是在GH超基因家族成员中导入半胱氨酸取代的优选区域。A-B环、B-C环、C-D环(以及GH超基因家族的干扰素/IL-10样成员的D-E环)也是引入半胱氨酸突变的优选区域。螺旋A的近侧和最后一个螺旋的远侧的氨基酸可能也不涉及受体结合，因此也是引入半胱氨酸取代的优选区域。某些GH家族成员，例如EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO，IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β-干扰素含有N-连接和O-连接的糖。蛋白质中的糖基化位点几乎全部在环区中，而不在α-螺旋束中。因为环区通常不涉及受体结合，也因为它们是糖基共价结合的位点，因此它们是将半胱氨酸取代引入蛋白质的优选位点。蛋白质中含有N-连接和O-连接的糖基化位点的氨基酸是半胱氨酸取代的优选位点，因为这些氨基酸暴露于表面，天然蛋白质可以接受空间体积较大的糖基在这些位点上与蛋白质相连，并且这些糖基化位点一般定位在远离受体结合位点的区域。

未来将很可能发现GH基因家族的其它成员。GH超基因家族的新成员可以通过预测蛋白质序列的计算机-辅助二级结构和三级结构分析鉴定。GH超基因家族的成员将拥有四到五个两亲螺旋，它们由非螺旋氨基酸(环区)连接。这些蛋白质可以在N-末端含有一个疏水信号序列，以促进从细胞中分泌。这些后来发现的GH超基因家族的成员也包括在本发明范围内。

本发明提供了制备有生物活性的引入半胱氨酸的GH超基因家族成员变异体的“原则”。该“原则”可以应用于任何现有的和未来的GH超基因家族的成员。引入半胱氨酸的变异体将拥有与自然发生的蛋白质不同的新特征。其中最重要的是，引入半胱氨酸的变异体将拥有这样的特征，即可以用半胱氨酸反应聚合物或其它类型的半胱氨酸反应物质共价修饰它们，以制备具有改善的性质(例如增加的体内半衰期、增加的溶解性、和改善的体内效能)的生物活性蛋白质。

具体地说，本发明通过用半胱氨酸残基取代蛋白质中的非必需氨基酸，提供具有生物活性GH超基因家族成员的半胱氨酸变异体。半胱氨酸残基优选取代构成蛋白质环区氨基酸、靠近α-螺旋末端的氨基酸和第一两亲螺旋近侧或最后一个两亲螺旋远侧的氨基酸。引入半胱氨酸残基的另一个优选位点是在蛋白质的N-末端或C-末端。还可以在多肽链的已公开区域的两个氨基酸之间引入半胱氨酸。本发明指出蛋白质中N-和O-连接的糖基化位点是引入半胱氨酸取代的优选位点，可以取代构成该位点的氨基酸，或者在N-连接的位点上，引入半胱氨酸。糖基化位点可以是O-糖基化的丝氨酸残基或苏氨酸残基，或者是N-糖基化的天冬氨酸残基。N-连接的糖基化位点具有天冬氨酸-X-丝氨酸或苏氨酸(N-X-S/T)这样的一般结构，其中X可以是任何一个氨基酸。N-连接的糖基化位点中的天冬氨酸残基、X位置上的氨基酸和丝氨酸/苏氨酸残基是制备生物活性的引入半胱氨酸的这些蛋白质的变异体的优选位点。直接围绕或紧邻O-连接和N-连接的糖基化位点的氨基酸(糖基化位点两侧约10个残基范围内)是引入半胱氨酸取代的优选位点。

一般性地说，鉴定制备生物活性的引入半胱氨酸的蛋白质变异体的优选位点的某些“原则”可以应用于任何蛋白质，不只是属于GH超基因家族成员的蛋白质。具体地说，制备生物活性的蛋白质的半胱氨酸变异体(除了IL-2)的优选位点是O-连接的糖基化位点。直接围绕O-连接的糖基化位点的氨基酸(约在糖基化位点两侧10个残基内)也是优选位点。N-连接的糖基化位点，以及紧邻该糖基化位点两侧(约在N-X-S/T位点两侧10个残基内)的氨基酸残基也是制备引入半胱氨酸的蛋白质变异体的优选位点。可以用半胱氨酸取代而不明显丧失生物活性的氨基酸也是制备引入半胱氨酸的蛋白质变异体的优选位点。可以对目标蛋白质进行半胱氨酸扫描诱变，然后测定生物活性效果来鉴定所述非必需氨基酸。半胱氨酸扫描诱变需要在多肽链中加入半胱氨酸残基或用半胱氨酸残基取代多肽链中各个氨基酸，然后确定半胱氨酸取代对生物活性的影响。半胱氨酸扫描诱变类似于丙氨酸扫描诱变(Cunningham等，1992)，除了用半胱氨酸残基而不是丙氨酸残基单独取代目标氨基酸。

还设想了应用该“原则”制备引入半胱氨酸的变异体和蛋白质拮抗剂的结合物。在某些炎症状况，例如风湿性关节炎、哮喘、过敏症和伤口结疤的病理过程中涉及细胞因子和生长因子的过量产生。GH的过量产生被暗示为肢端肥大症的病因。某些生长因子和细胞因子，例如GH和IL-6可能涉及某些癌症的增殖。涉及炎症和癌症的一些生长因子和细胞因子是GH超基因家族的成员。开发这些分子的蛋白质拮抗剂以治疗这些疾病已引起相当大的兴趣。策略之一是遗传工程改造这些细胞因子和生长因子，是它们可以与受体结合，但不能寡聚受体。这已通过诱变处理分子上的第二受体结合位点(位点II)实现。得到的突变蛋白质能够结合并占据受体位点，但不能激活细胞间的信号传递途径。该策略已经成功地应用于GH以得到GH拮抗剂(Cunningham等，1992)。还在寻求类似策略以研制GH超基因家族其它成员的拮抗剂，例如IL-2(Zurawski等，1990；Zurawski和Zurawski，1992)，IL-4(Kruse等，1992)，IL-5(Tavernier等，1995)，GM-CSF(Hercus等，1994)和EPO(Matthews等，1996)。因为本文描述的在GH超基因家族成员中引入半胱氨酸残基的优选位点暴露在这些蛋白质中受体结合位点的外面，并因此从一些位点中区别出来用于制备蛋白质拮抗剂，所以本文描述的引入半胱氨酸的变异体可以用于生产长效的蛋白质拮抗剂。举例说明，Cunningham等(1992)通过将甘氨酸残基(氨基酸120)突变为精氨酸研制出一种体外GH拮抗剂。该甘氨酸残基是GH中第二受体结合位点的关键成分；当它被取代为精氨酸后，GH不能与受体二聚。在120位甘氨酸到精氨酸的突变可以导入编码本文设想的加入半胱氨酸的GH变异体的DNA序列中以产生能与半胱氨酸反应PEG或其它类型的半胱氨酸反应物质结合的加入半胱氨酸的GH拮抗剂。同样，使蛋白质从激动剂变成拮抗剂的其它蛋白质中的氨基酸改变可以被引入编码本文所述的加入半胱氨酸的蛋白质变异体的DNA序列中。正在花费相当大的努力鉴定使蛋白质从激动剂变为拮抗剂的氨基酸改变。Hercus等(1994)报道在成熟GM-CSF蛋白的21位用精氨酸或赖氨酸取代谷氨酸，可以使GM-CSF从激动剂变成拮抗剂。Tavernier等(1995)报道在成熟IL-5的13位用谷氨酰氨取代谷氨酸可以产生IL-5拮抗剂。

可以用类似于上述的实验策略制备来源于各种动物的GH超基因家族成员的引入半胱氨酸的变异体(激动剂和拮抗剂)。这可能因为人和动物的细胞因子和生长因子之间一级氨基酸序列和结构非常保守。因为这个原因，本文公开的制备GH超基因家族成员的引入半胱氨酸的生物活性变异体的“原则”将可以用于制备宠物(例如狗、猫、马)和商业动物(例如，牛、羊、猪)的GH超基因家族成员的引入半胱氨酸的生物活性变异体。这些引入半胱氨酸的变异体与半胱氨酸反应PEG结合将产生这些蛋白质的长效类型的蛋白质，它们将有利于宠物和商业农畜的市场。

Silvennoimem和Ihle(1996)提供了属于CH超基因家族成员的蛋白质(造血细胞因子)。Silvennoimem和Ihle(1996)还提供了关于这些蛋白质结构和表达的信息。本文描述的蛋白质的编码氨基酸的DNA序列，以及体外和体内生物法测定法在Aggarwal和Gutterman(1992；1996)，Aggarwal(1998)，以及Silvennoimem和Ihle(1996)中已有描述。这些蛋白质的各供应商例如R&DSystems，Inc.和Endogen，Inc.的目录也提供了这些蛋白质的生物分析法。

提供实施例论证如何应用这些“原则”制备引入半胱氨酸的GH超基因家族的GH、红细胞生成素、α-干扰素、β-干扰素、G-CSF、和其它成员的变异体。这些实施例不是限制性的，而仅是本发明具体实施方式的实例。

实施例1

引入半胱氨酸的GH变异体

本实施例公开了GH中某些生物活性非必需以及当这些氨基酸突变为半胱氨酸残基后，将不改变分子的正常二硫键结合模式和整体构型的氨基酸。这些氨基酸定位在成熟蛋白质的A-B环的N-末端(成熟蛋白质序列的34-52位的氨基酸；SEQ ID NO：1；Martial等1979；Goeddel等1979)，B-C环(成熟蛋白质序列的97-105位的氨基酸)，C-D环(成熟蛋白质序列的130-153位的氨基酸)。还鉴定了引入半胱氨酸残基的优选位点是A、B、C和D螺旋中的前三个或后三个氨基酸，以及螺旋A的近侧和螺旋D的远侧氨基酸。

可以应用聚合酶链式反应技术，从商购的从人脑垂体制备的单链cDNA(ClonTech，San Diego，CA)或用重叠的寡聚核苷酸装配的单链cDNA，扩增编码野生型GH的DNA序列。可以应用多种方法例如噬菌体技术(Kunkel等1987)、PCR诱变技术(Innis等1990；White1993)采用例如Stratagene出售的诱变试剂盒(″快速改变诱变”试剂盒，San Diego，CA)或Promega出售的诱变试剂盒(基因编辑器试剂盒，Madison WI)将特定突变引入GH基因。

半胱氨酸取代可被引入包括B-C环、C-D环和A-B环的N-末端在内的任何氨基酸，或者引入临近这些区域的α-螺旋区的前三个氨基酸，或者引入螺旋A近侧或螺旋D远侧的区域。引入半胱氨酸残基的优选位点是：F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、K40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188和G190。半胱氨酸残基还可以引入成熟蛋白质的起始部分，即F1氨基酸的近侧，或者成熟蛋白质的最后一个氨基酸之后，即在F191之后。如果需要，可容易地利用克隆的突变基因的体外DNA重组和/或特殊需要的突变的序列构建将两个或多个该突变组合到同一个蛋白质中。

1.人生长激素(GH)的基因克隆

应用聚合酶链式反应(PCR)技术以及引物BB1和BB2，从人脑垂体单链cDNA(商品由CLONTECH，Inc.，Palo Alto，CA提供)扩增人GH基因。BB1的序列是5′-GGGGG TCGAC CATAT GTTCC CAACC ATTCC CTTATCCAG-3′(SEQ ID NO：24)。BB2的序列为：5′-GGGGG ATCCT CACTAGAAGC CACAG CTGCC CTC-3′(SEQ ID NO：25)。引物BB1设计为编码成熟GH的第一个氨基酸即苯丙氨酸之前首先编码启动子即蛋氨酸，为了克隆的目的还设计有SalI和NdeI位点。反向引物BB2含有为克隆目的的BamHI位点。100微升PCR反应液含每种寡核苷酸引物各20 pmole，1 X PCR缓冲液(含MgCl₂的Perkin-Elmer缓冲液)，四种核苷酸dA、dC、dG和dT每种浓度各为200 mM，2 ng单链cDNA，2.5单位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，和2.5单位Pfu聚合酶(Stratagene，Inc.)。PCR反应条件为96℃3分钟，循环(95℃1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)35次，随后72℃10分钟。使用的热循环仪是Amplitron II热循环仪(Thermolyne)。用SalI和BamHI消化约600 bp的PCR产物，凝胶纯化，然后克隆到同样消化的质粒pUC19(商品由New England BioLabs，Beverly，MA提供)中。将连接混合物转化到E.coli菌株DH5α中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化体。几个克隆在LB培养基上连夜生长，用从Qiagen，Inc.(Valencia，CA)购买的小质粒DNA分离试剂盒分离质粒DNA。确定克隆LB6具有正确的DNA序列。

为了在E.coli中表达，用NdeI和EcoRI消化克隆LB6，消化成为约600bp的凝胶纯化片段，克隆到已经用同样的酶消化和磷酸酶化的质粒pCYB1(商品来源于New England BioLabs，Beverly，MA)上。连接混合物转化到E.coli DH5α中，在LB氨苄青霉素平板上筛选转化体。从几种转化体中分离并通过NdeI和EcoRI消化筛选质粒DNA。鉴定了一种正确的克隆，命名为：pCYB1：wtGH(pBBT120)。这种质粒被转化到E.coli菌株JM109或W3110中(可从New England BilLabs和美国典型培养物收藏中心获得)。

2.STII-GH的构建

野生型GH克隆LB6(pUC19：野生型GH)用作构建含E. coli STII信号序列(Picken等1983)的GH克隆的模版。由于其长度，在两个连续的PCR反应中加入STII序列。第一个反应使用正向引物BB12和反向引物BB10。BB10的序列为：5′-CGCGG ATCCG ATTAG AATCC ACAGC TCCCC TC-3′(SEQ ID NO：28)。BB12的序列为：5′-ATCTA TGTTC GTTTT CTCTATCGC T ACCAA CCTTA CGCAT TCCCA ACCAT TCCCT TATCC AG-3′(SEQ ID NO：30)。

如扩增野生型GH所述的方法进行PCR反应，除了使用约4 ng的质粒LB6作为模版，而不是单链cDNA作模版，PCR条件为：96℃3分钟，循环(95℃1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)30次，随后72℃10分钟。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.)对约630 bp的PCR产物进行凝胶纯化，用水稀释50倍，取2微升作为第二次PCR反应的模版。第二次PCR反应使用反向引物BB10和正向引物BB11。BB11的序列为：5′-CCCCCTCTAG ACATA TGAAG AAGAA CATCG CATTC CTGCT GGCAT CTATGTTCGT TTTCT CTATC G-3′(SEQ ID NO：29)。

引物BB11含有用于克隆的XbaI和NdeI位点。PCR条件如第一次反应所述。用XbaI和BamHI消化约660 bp的PCR产物，凝胶纯化，然后克隆到同样酶切的质粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen，Inc.Carlsbad，CA)中。确定克隆pCDNA3.1(+)∷stII-GH(5C)或“5C”具有正确的DNA序列。

用NdeI和BamHI酶切克隆“5C”，然后克隆到同样酶切的pBBT108(pUC19的衍生物，它缺失一个Pst I位点，该质粒下文将描述)中。用上述酶消化后鉴定具有正确插入体的克隆。这种克隆，命名为pBBT111，用NdeI和SalI消化，对含stII-GH融合基因的660 bp片段进行凝胶纯化，然后克隆到用同样酶消化和磷酸化的质粒表达载体pCYB1(New EnglandBioLabs)中。通过限制性核酸内切酶消化鉴定含stII-GH插入体的重组质粒。选择这样的一个分离体进行进一步研究，它被命名为pBBT114。该质粒转化到E.coli菌株JM109或W3110中(可从New England BilLabs和美国典型培养物收藏中心获得)。

3.ompA-GH的构建

使用野生型GH克隆LB6(pUC19：野生型GH)作为构建含E.coli ompA信号序列的GH克隆的模版(Movva等1980)。由于其长度，将ompA序列加入两个连续的PCR反应。第一个反应使用正向引物BB7：5′-GCAGTGGCAC TGGCT GGTTT CGCTA CCGTA GCGCA GGCCT TCCCA ACCATTCCCT TATCC AG-3′(SEQ ID NO：31)，和反向引物BB10：5′-CGCGGATCCG ATTAG AATCC ACAGC TCCCC TC-3′(SEQ ID NO：28)。

PCR反应如扩增野生型GH所述的那样，除了使用约4 ng的质粒LB6作为模版而不是单链cDNA，PCR条件为：96℃3分钟，循环(95℃1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)30次，随后72℃10分钟。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.)对约630 bp的PCR产物进行凝胶纯化，用水稀释50倍，取2微升用作第二次PCR反应的模版。第二次PCR反应使用反向引物BB10和正向引物BB6：5′-CCCCG TCGAC ACATA TGAAG AAGACAGCTA TCGCG ATTGC AGTGG CACTG GCTGG TTTC-3′(SEQ IDNO：32)。

PCR条件如第一次反应所述的条件。凝胶纯化约660 bp的PCR产物，用SalI和Bam H1消化，然后克隆到用SalI和Bam H1酶切过的pUC19(NewEngland BilLabs)中或用Xho I和Bam H1(单链Sal I和Xho I产物相容)酶切过的pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。对几种克隆测序后，发现所有pUC19克隆(8/8)在ompA序列区都含有错误。仅对一个pCDNA3.1(+)克隆测序后，发现它含有一个在ompA区模糊的序列。为了制备正确的ompA-GH融合基因，使两个测序后发现含有不同错误的、由方便的限制性酶位点分开的片段重组，并克隆到缺失PstI位点的pUC19衍生物(参见pBBT108，下文详述)中。得到的质粒，命名为pBBT112，携带ompA-GH融合基因，作为Nde I-BamH1片段被克隆到pBBT108的同样位点上。该质粒被命名为pBBT112，用于如下述的以PCR为基础的、GH的位点特异性诱变。

4.Pst-pUC19的构建

为了促进用于构建选择性半胱氨酸取代突变体和插入突变体的克隆GH基因的诱变，如下述构建了缺失一个Pst I位点的质粒pUC19(New EnglandBioLabs)衍生物。用Pst I消化pUC19质粒DNA，然后在75℃用PFU DNA聚合酶(Stratagene)处理，其中使用卖方提供的反应缓冲液，并加入200 uMdNTP。在该条件下，聚合酶将消化由Pst I消化形成的3′单链悬挂区，而不消化双链区。最终结果是构成Pst I识别位点中间四个碱基的4个单链碱基的缺失。得到的分子是双链，即“平头”末端。在这些酶反应后，用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.)凝胶纯化线状单体。纯化后的DNA用T4 DNA连接酶(New England BioLabs)按照供应商提供的方案处理，用Pst I消化，然后转化E.coli DH5α。筛选转化体，通过Pst I和Bam H1限制性消化进行分析。筛选出一种没有被Pst I酶切，但在Bam H1位点附近被酶切的转化体，并被命名为pBBT108。

5.GH突变蛋白质的构建

通常利用PCR草案：当前方法和应用(B.A.White编1993，HumanaPress，Inc.，Totowa，NJ)和PCR草案：方法和应用指南(Innis，M.A.等编，1990，Academic Press Inc San Diego，CA)中描述的定点PCR诱变构建GH突变蛋白质。典型的PCR引物寡核苷酸设计为参与GH编码序列的核苷酸改变，从而导致蛋白质内某一特定位置的氨基酸由半胱氨酸残基取代。这种诱导突变的寡核苷酸引物还可以设计为在GH编码序列的羧基末端或氨基末端插入一个半胱氨酸残基。在后一种情况下，如果有必要还可以将一种或多种附加氨基酸残基插入引入的半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。而且，如果需要，可以将寡核苷酸设计成为在GH编码序列的特定位置上插入半胱氨酸残基的插入突变。同样，可以将一种或多种附加氨基酸与半胱氨酸残基一起插入，这些氨基酸可以定位在半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。

半胱氨酸取代突变体T135C如下构建。诱导突变的反向寡核苷酸BB28(5′-CTGCT TGAAG ATCTG CCCAC ACCGG GGGCT GCCAT C-3′(SEQ ID NO：33))设计为将编码135位氨基酸残基的苏氨酸密码子ACT改变为编码半胱氨酸的密码子TGT，并设计跨越BglII位点附近。该寡核苷酸在PCR中用正向引物BB34(5′-GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT-3′(SEQID NO：34))一起使用，该引物退火成为ompA-GH融合基因的连接区，不诱导突变。在50μl反应液中进行PCR反应，反应液含1 X PCR缓冲液(Perkin-Elmer缓冲液，含1.5 mM MgCl₂)，四种核苷酸dA、dC、dG和dT每种浓度各为200 mM，每种寡核苷酸引物各0.5μM，5 pg pBBT112(上述的)作为模版，以及1.25单位Amplitac DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.125单位PFU DNA聚合酶(Stratagene)。在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene)中进行反应。应用的程序为：95℃3分钟，循环(95℃1分钟；45℃或50℃或55℃75秒；72℃1分钟)25次，随后6℃维持。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，确定得到期望大小(即约430 bp)的有意义产物的退火温度。通过应用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)和采用Bgl II和Pst I消化，将45℃的反应清除掉。得到的278 bp的BglII-Pst I片段，含有推测的T135C突变，经凝胶纯化，连接到已经用Bgl II和Pst I消化并经凝胶纯化的pBBT111(携带stII-GH融合基因的pUC19衍生物，同上述)中。先用Bgl II和Pst I消化筛选源于这种结合的转化体，随后对一个克隆测序，确定存在T135C突变，并且不存在任何其它可能由于PCR反应或由于寡核苷酸的合成潜在引入的突变。该测序后的克隆被发现具有正确的序列。

用上述T135C所述的方案构建取代突变体S132C，不同之处在于：使用诱导突变的反向寡核苷酸BB29 5′-CTGCT TGAAG ATCTG CCCAGTCCGG GGGCA GCCAT CTTC-3′(SEQ ID NO：35)，而不是BB28，用于克隆的PCR反应的退火温度为50℃。测序的两个克隆之一发现具有正确序列。

应用类似方案但使用不同的克隆方法构建取代突变体T148C。PCR中使用诱导突变的正向寡核苷酸BB30 5′GGGCA GATCT TCAAG CAGACCTACA GCAAG TTCGA CTGCA ACTCA CACAA C3′(SEQ ID NO：36)和不诱导突变的反向引物BB33 5′CGCGG TACCC CGGGA TCCGA TTAGAATCCA CAGCT3′(SEQ ID NO：37)，引物BB33退火成为大多数GH编码序列的3′末端，并跨越紧邻下游的Bam H1位点。如上述进行PCR反应，除了使用的退火温度为46℃、51℃和56℃。进行PCR和如上述的凝胶分析后，将46℃和51℃的反应物合并用于克隆。用Bam H1和Bgl II对它们进行消化，凝胶纯化，然后克隆到已经用Bam H1和Bgl II消化并按照供应商的方案用小牛肠道碱式磷酸酶(Promega)处理过的pBBT111中。通过Bam H1和Bgl II消化分析源于这种结合的转化体，鉴定188 bp的Bam H1-Bgl II突变PCR片段以适当方向克隆的克隆。因为Bam H1和Bgl II产生兼容性末端，这一步的克隆步骤不具备方向特异性。实验了六个克隆，其中五个显示取向正确。对其中之一测序，显示含有所需的T148C突变。该序列中除188 bp BamH1-Bgl II突变PCR片段之外的其余序列也被确定是正确的。

除了下列区别，取代突变体S144C的构建与T148C的构建是完全相同的。使用诱导突变的正向寡核苷酸BB31 5′GGGCA GATCT TCAAG CAGACCTACT GCAAG TTCGA C3′(SEQ ID NO：38)，而不是BB30。六个实验克隆中两个显示取向正确。对其中之一测序，显示含有所需的S144C突变。该克隆中除188 bp Bam H1-Bgl II突变PCR片段之外的其余序列也被确定是正确的。

还构建了在GH的天然羧基末端加上一个半胱氨酸残基的突变体。这样构建的突变体，命名为stp192C，其构建类似于T148C，但使用了不同的寡核苷酸引物。使用诱导突变的反向寡核苷酸BB32 5′CGCGG TACCG GATCCTTAGC AGAAG CCACA GCTGC CCTCC AC3′(SEQ ID NO：39)，其中在GH羧基末端苯丙氨酸残基的密码子和翻译终止密码子TAA之间插入半胱氨酸的密码子TGC，并且该引物跨越Bam H1位点附近，还使用了上述的BB345′GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT3′(SEQ ID NO：40)。如上述进行PCR和凝胶分析后，选择46℃反应用于克隆。实验的六个克隆中三个显示取向正确。对其中之一测序显示含有所需的stp192C突变。该克隆中除188 bpBam H1-Bgl II突变PCR片段之外的其余序列也被确定是正确的。

可以使用类似的PCR诱变方法生产其它半胱氨酸突变体。诱导突变的寡核苷酸序列的选择根据取代所需半胱氨酸残基的位置和是否靠近有用的限制性核酸内切酶位点来决定。通常，需要将突变即错配片段放置于寡核苷酸中部附近，以增强寡核苷酸与模版的退火。可以凭经验确定寡核苷酸的适当的退火温度。诱导突变的寡核苷酸最好跨越一个独特的限制性酶切位点，以便PCR产物可以被酶切产生一个能够方便地克隆到适当载体中的片段，所述的适当载体，例如，可以是用于表达突变蛋白质或提供用于切割突变基因并方便地将它克隆到该表达载体中的方便的限制性酶切位点的载体。有时突变位点和限制性酶切位点相隔大于合成人工寡核苷酸所需的长度：通常希望该寡核苷酸的长度最好小于80个碱基，长度为30-40个碱基更为优选。

在不适当的实例中，可以对用于诱导突变的目的基因进行再次基因操作或再次合成，以插入适当位置的限制性位点。或者，也可以使用上面应用的PCR诱变方案的改变方案，例如称为“巨引物法”(“MegaprimerMethod”)(Barik，S.，分子生物学方法，pp.277-286，15卷：PCR草案：现代方法和应用，B.A.White编，1993，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ)或“经重叠延伸的基因剪接”(Horton，R.M.，分子生物学方法，pp.251-261，15卷：PCR草案：现代方法和应用，B.A.White编，1993，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ)方案，来构建这些突变体。

6.GH在pCYB1中的表达

为了使GH在E.coli中表达，将pBBT120(不带有克隆到tac表达载体pCYB1中的引导序列的GH基因)和pBBT114(带有克隆到tac表达载体pCYB1中的stII引导序列的GH基因)转化E.coli菌株JM109和W3110。还用母载体pCYB1转化JM109和W3110。

对这些菌株给出下列命名：

BOB119：JM109(pCYB1)

BOB130：W3110(pCYB1)

BOB129：JM109(pBBT120)

BOB133：W3110(pBBT120)

BOB121：JM109(pBBT114)

BOB132：W3110(pBBT114)

菌株在含100μg/ml安苄青霉素的Luria Broth(LB)(Sambrook，等1989)中在37℃生长过夜，以便表达。用含100μg/ml安苄青霉素的LB稀释这些饱和的过夜培养物，至A₆₀₀处的OD值约为0.03，然后在旋转摇床上的摇瓶中于37℃培养，转速一般为250-300 rpm。监测OD值，当培养物的OD值达到约0.25-0.5，典型地在0.3-0.4之间时，加入IPTG至终浓度为0.5 mM。通常在诱导后1、3、5和约16小时时对培养物取样。“约16小时”的时间点表示对培养物培养过夜，准确时间可以从约15-20小时之间变化。离心沉淀诱导培养物和未诱导培养物的样品，重新悬浮于1X样品缓冲液(50 mMTris-HCl(pH 6.8)，2％十二烷基硫酸钠，10％甘油，0.1％溴酚兰)，如果需要可以加入1％的β-巯基乙醇。样品煮沸约10分钟或加热到95℃约10分钟。样品冷却至室温，然后装载到SDS聚丙烯酰胺凝胶上，或者如果不立即跑凝胶，可以-20℃储藏。样品按照供应商的方案，应用快速凝胶池(Ready Gel Cell)电泳装置(Bio-Rad)在预制的15％聚丙烯酰胺“快速凝胶”(“ReadyGels”)(Bio-Rad，Hercules CA)上对样品进行电泳分离。通常样品在200伏特跑电泳约35-45分钟。用考马斯亮蓝对凝胶染色，或电印迹后用Western印迹分析。来自菌株BOB129、BOB133、BOB121和BOB132的全细胞水解产物的考马斯亮蓝染色显示了一条与购自研究诊断学公司(Flanders，NJ)的纯化重组人GH标准品共迁移的约22 kD的色带。该色带是连夜诱导后的诱导培养物中最重要的组分。然而，在上述同样菌株的的未诱导培养物中也观察到一条同样分子量的色带，在携带缺乏GH基因的表达载体pCYB1的BOB119和BOB130对照菌株的诱导和未诱导培养物中也能观察到该色带。为了解释该观察结果，对菌株BOB119、BOB130、BOB129、BOB133、BOB121、和BOB132的诱导培养物的全细胞水解产物进行Western印迹分析。用购自美国生物学；目录#G9000-11(Swampscott，MA)的多克隆兔抗人GH抗血清进行Western印迹。初级抗体以1∶5000的稀释度稀释使用，用购自Pierce(Rockford，IL)的结合了碱式磷酸酶(产品号31341)的山羊抗-兔IgGFc检测初级抗体的结合。次级抗体以1∶10,0000的稀释度稀释使用。用ImmunoPureFast Red TR/AS-MX底物试剂盒(Pierce，Rockford IL)按照供应商的方案检测碱式磷酸酶的活性。Western印迹清楚地证明了GH在BOB129、BOB133、BOB121、和BOB132的诱导后3小时和16小时的诱导培养物的水解产物中存在。在对照菌株，BOB119和BOB130的诱导培养物中，Western印迹没有在诱导后3或16小时的时间点检测到GH。

在这些初步试验中，从BOB132 W3110(pBBT114)中得到GH的产量最高，其中GH基因融合在stII分泌信号序列的下游。进一步检测该菌株是否如期望分泌GH蛋白到周质中。如上述制备BOB132的诱导培养物，然后按照Koshland和Botstein(Cell 20(1980)pp.749-760)的方法对上述培养物进行渗透压刺激。该方法使外膜破裂，使周质的成分释放到周围培养基中。随后从细胞相关成分的残留物中离心分离存在于上清液中的周质成分。在该试验中，发现通过BOB132合成的大部分GH定位在周质中。该结果与大部分总GH跟纯化的GH标准品在大小上也不能分辨的结果相一致，这表明stII信号序列已经被除去。这是分泌型的指标。还对大规模(500 ml)BOB132培养物进行了诱导，连夜培养，并按照Hsiung等，1986(Bio/Technology 4，pp.991-995)描述的方法进行渗透压刺激。凝胶分析再次证明生产的大部分GH是可溶的、定位在周质的、与GH标准品分子量大小无差别的。该材料还可以应用与Becker和Hsiung，1986(FEBS论文集204，pp.145-150)在重组人GH中应用的类似条件定量结合于Q-琼脂糖柱并从其上洗脱。

7.人GH受体的克隆

应用正向引物BB3和反向引物BB4通过PCR克隆人GH受体。BB3的序列为：5’-CCCCG GATCC GCCAC CATGG ATCTC TGGCA GCTGCTGTT-3’(SEQ ID NO：26)。BB4的序列为：5’-CCCCG TCGAC TCTAGAGCTA TTAAA TACGT AGCTC TTGGG-3’(SEQ ID NO：27)。模版为由人肝制备的单链cDNA(由CLONTECH试验室商业提供)。引物BB3和BB4分别含有用于克隆目的的BamHI和SalI限制性位点。100μl PCR反应物含有2.5 ng单链cDNA和1 X PCR缓冲液(含MgCl₂的Perkin-Elmer缓冲液)中20微微摩尔的各引物，四种核苷酸dA、dC、dG和dT各200摩尔浓度，2.5单位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)和2.5单位Pfu聚合酶(Stratagene，Inc.)。PCR反应条件为：96℃3分钟，循环(95℃1分钟；58℃30秒；72℃2分钟)35次，随后72℃10分钟。使用的热循环仪为Amplitron II ThermalCycler(Thermolyne)。用BamHI和SalI消化约1.9 kb的PCR产物，然后用同样酶切的质粒pUC19(New England BioLabs)连接。然而，从含有1.9 kb PCR片段的连接反应物中没有得到转化体。Leung等(Nature，1987，330，pp.537-543)也没有在pUC19中得到人GH受体的全长cDNA克隆。接着，将该PCR片段克隆到低拷贝数的载体pACYC184(New England BioLabs)的BamHI和SalI位点上。以适当的频率得到该克隆，但携带克隆PCR片段的E.coli菌株在用于筛选pACYC184维持生长的氯霉素存在下生长很差，形成较小的、外观类型不同的克隆。

同时将该PCR片段克隆到pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。用BamHI和SalI消化约1.9 kb的PCR产物，然后连接到pCDNA3.1(+)的BamHI和XhoI克隆位点。仅来自该连接的罕见转化体含有克隆GH受体的cDNA，所有这些转化体都含有删除的受体编码序列片段。对这些克隆之一测序，发现在GH受体编码序列中含有135 bp的删除：该基因的其余序列与Leung等(1987)报道的一致。

8.兔GH受体的克隆

用正向引物BB3(如上述)和反向引物BB36通过PCR克隆兔GH受体。BB36序列为：5’-CCCCG TCGAC TCTAG AGCCA TTAGA TACAAAGCTC TTGGG-3’(SEQ ID NO：41)，其含有用于克隆目的的XbaI和SalI限制性位点。兔肝多聚(A)+mRNA购自CLONTECH，Inc.，它被用作单链cDNA第一条链合成中的底物，用来制备PCR扩增的模版。利用来自BoehringerMannheim Corp(Indianapolis，IN)的用于RT-PCR(AMV)试剂盒的第一条链cDNA合成试剂盒，按照供应商的方案实现了单链cDNA第一条链的合成。利用任意六聚物或BB36作为引物合成平行第一条链cDNA。接着用第一条链合成产物作为模版，用引物BB3和BB36作为引物，按照用于RT-PCR(AMV)试剂盒的第一条链cDNA合成试剂盒上的方案，并用2.5单位的Amplitac DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.625单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。PCR反应条件为：96℃保温3分钟，循环(95℃1分钟；58℃30秒；72℃2分钟)35次，随后72℃保温10分钟。使用的热循环仪为Amplitron II Thermal Cycler(Thermolyne)。利用任意六聚物引导或BB36引导的cDNA作为模版的PCR反应液中观察到期望的约1.9 kb的PCR产物。在随后的克隆试验中使用任意六聚物引导的cDNA。用Bam H1和XbaI消化，然后在1.2％的琼脂糖凝胶上跑凝胶。该消化产生两个片段(约365 bp和约1600 bp)，因为兔GH受体基因含有一个内部Bam H1位点。对这两个片段进行凝胶纯化。先洗脱出来的约1600bp的BamH1-XbaI片段克隆到已经用同样这两种酶消化过的pCDNA3.1(+)中。在适度的频率可以方便的得到这些克隆，经限制性酶消化以及随后测序确定这些克隆没有缺失的迹象。为了制备全长克隆，将一个含约1600 bp的Bam H1-Xba I片段(pCDNA3.1(+)∷rab-ghr-2A)的质粒用Bam H1消化，并用小牛肠道碱式磷酸酶(Promega)按照供应商提供的方案处理，凝胶纯化，然后与凝胶纯化的含兔GH受体基因5’部分的约365 bp的Bam H1片段连接。筛选源于这种连接的转化体，并用限制性酶消化和PCR分析，以确定约365 bp片段的存在和它相对于兔GH受体基因远侧片段的取向。经分析四个克隆中三个发现含有约365 bp的片段，该片段以重建兔GH受体基因的正确方向被克隆。相对于人基因在E.coli中的克隆，兔基因在E.coli中的克隆并不复杂，这与Leung等(1987)的结果一致，他们也轻易地从E.coli中得到兔GH受体基因的全长cDNA克隆，而不能从E.coli中得到人基因的全长cDNA克隆。在分析中可以使用人GH作为配体的兔GH受体，因为报道人GH与兔受体的结合具有高度亲合力(Leung等1987)。应该在应用前对含有克隆兔GH受体的质粒测序，以便鉴定兔GH受体cDNA具有正确的序列。

9.人/兔嵌合GH受体基因的构建

作为兔受体的另一种方式，可以构建混合了跨膜人受体的胞外区和兔受体胞质区的嵌合受体。可以通过在人基因和兔基因中共有的唯一Nco I位点重组人和兔基因来构建该嵌合受体(Leung等1987)。该重组体，含有定位于5’端或Nco I位点“上游”的人基因片段和定位于3’端或Nco I位点“下游”的兔基因片段，将编码准确地编码所需类型的嵌合嵌合受体，其具有跨膜人受体的胞外区和兔受体的胞质区。这将能够分析具有天然受体结合位点的GH、GH突变蛋白、和PEG衍生化的GH突变蛋白的相互作用，而不必在E.coli中克隆全长人GH受体。

GH突变蛋白可以在很多表达系统例如细菌、酵母或昆虫细胞中表达。用于将GH突变蛋白表达到这些系统中的载体可以从大量供应商处购买，例如Novagen，Inc.(在E.coli中表达的pET15b)，New England Biolabs(在E.coli中表达的pC4B1)，Invitrogen(利用杆状病毒在昆虫细胞中表达的pVL1392、pVL1393和pMELBAC，在酵母细胞中表达的Pichia载体，以及在哺乳动物细胞中表达的pCDAN3)。已经成功地在E.coli中制备了GH，它为胞质蛋白，并且为利用E.coli的OmpA或STII信号序列促进该蛋白质分泌到周质空间的分泌型的周质蛋白质(Chang等，1987；Hsiung等，1986)。最好GH突变蛋白以分泌蛋白质的形式表达，以致于它们不含天然人蛋白质中不存在的N-末端蛋氨酸残基。为了在E.coli中表达，可以将编码GH或GH突变蛋白的DNA序列克隆到E.coli表达载体中，例如使用强效T7启动子的pET15b或者使用TAC启动子的pCYB1。将IPTG(异丙基硫代吡喃半乳糖，购自Sigma Chemical Company)加入生长培养基，可以诱导蛋白质表达。重组GH将从释放的位置分泌到周质空间，接着纯化，然后用渗透压刺激(Becker和Hsiung，1986)。可以用其它色谱方法例如离子交换色谱、疏水作用色谱和反向色谱进一步纯化该蛋白质，这些技术是本领域技术人员公知的技术(例如，参见Becker和Hsiung，1986)。可以应用商业提供的蛋白质分析试剂盒(例如BioRad Laboratories，Richmond，CA出售的试剂盒)测定蛋白质浓度。如果在E.coli中表达的GH蛋白是不溶解的，那么可以使用本领域技术人员公知的方法使它们再折叠(参见Cox等，1994和世界专利申请WO9422466和WO9412219)。

或者，可以在昆虫细胞中以分泌蛋白质的形式表达该蛋白质。可以调整表达质粒，以使它含有促进蛋白质分泌到培养基中的GH信号序列。可以将cDNA克隆到商业提供的载体中，例如来自invitrogen，Inc.的pVL1392，然后感染昆虫细胞。可以应用常规色谱方法从条件介质中纯化GH和GH突变蛋白。可以使用抗rhGH的抗体结合Western印迹，确定色谱中含GH蛋白的组分。或者，可以应用ELISA分析法鉴定含GH蛋白的组分。

也可以在真核细胞例如酵母或哺乳动物细胞中以胞外或分泌型蛋白质的形式表达引入半胱氨酸的GH变异体。各商业供应公司例如Invitrogen，Inc。Stratagene，Inc.和Clon Tech，Inc.的目录中描述了表达蛋白质的载体和该实验的操作方法。可以应用常规色谱方法纯化GH和GH突变蛋白。

可以应用增殖受GH影响的细胞系测定GH突变蛋白的生物活性。Fuh等(1992)通过用鼠G-CSF受体与兔GH受体胞外区融合的嵌合受体稳定转化骨髓性白血病细胞系——FDC-P1，制备了一种GH-响应细胞系。该细胞系的增殖受GH影响，半数最大有效浓度(EC₅₀)为20微微摩尔。可以应用这些受体的公开序列和标准分子生物学技术构建类似细胞系(Fuh等1992)。或者，应用这些受体的公开序列和标准分子生物学技术将人GH受体的胞外区与鼠G-CSF受体融合。可以通过应用标记GH的流动细胞记数，或者通过转化细胞与放射性标记的GH结合的能力，或者通过转化细胞对加入GH响应的增殖，来鉴定表达嵌合受体的转化细胞。在细胞增殖分析中可以应用表达嵌合受体的细胞对纯化GH和GH突变蛋白进行测试，以测定这些蛋白质的特异活性。可以将细胞在含有各种浓度的GH或GH突变蛋白的96孔平皿上铺板。18小时后，用³H-胸苷处理细胞4小时，然后收获测定合并到其中的放射活性。可以测定各突变蛋白质的EC₅₀。每种突变蛋白质在每个数据点均使用三个孔，使每种分析至少重复三次。与野生型GH相比显示具有类似的或更好的最佳刺激水平和EC₅₀值的GH突变蛋白是优选的。

可以利用购买自Shearwater，Inc.的半胱氨酸反应性8 kDa PEG-马来酰亚胺(或PEG-乙烯砜)对保留体外活性的GH突变蛋白进行PEG衍生化。一般地，用这些试剂对蛋白质进行PEG衍生化的方法类似于世界专利申请WO9412219和WO9422466以及PCT申请US95/06540中描述的方法，仅略微改动。必须用二硫苏糖醇(DTT)部分还原重组蛋白质，以便实现游离半胱氨酸的最佳PEG衍生化。虽然游离半胱氨酸不形成二硫键，但除非进行上述部分还原步骤，否则它仍然与半胱氨酸反应PEG相对不发生反应。部分还原各突变蛋白质所需的DTT的量可以凭经验确定，使用一定浓度范围内的DTT。通常过量5-10倍(摩尔)的DTT室温处理30分钟即可。可以通过蛋白质在反相柱上洗脱曲线的轻微移动探测这种部分还原。需要注意不能过度还原蛋白质，使其它的半胱氨酸残基暴露。可以通过反相-HPLC(蛋白质将具有与完全还原型和变性蛋白质相近的保留时间)和含两个PEG的GH分子的出现(通过SDS-PAGE上的分子量的改变探测)探测过度还原。野生型GH可以用作对照，因为在同样条件下它不应该被PEG衍生化。可以应用尺寸排阻色谱用旋转柱除去过量的DTT。部分还原的蛋白质可以与多种浓度的PEG-马来酰亚胺(PEG：蛋白质的摩尔比为1∶1；5∶1；10∶1和50∶1)反应，用来确定两种物质的优选比率。可以通过应用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)得到的分子量移动监测蛋白质的PEG衍生化。认为能够提供大量单-PEG衍生物而不是双-PEG衍生物的最小量的PEG是优选的(认为80％转化成为单-PEG衍生物是较好的)。通常可以通过尺寸排阻色谱或离子交换色谱将单-PEG衍生蛋白质从未被PEG衍生的蛋白质和未反应的PEG中纯化出来。纯化的PEG衍生蛋白质可以进行上述细胞增殖分析测试，用来确定它的特异活性。

上述实验可以鉴定GH中能够改变成为半胱氨酸残基，进行PEG衍生化，并保留体外生物活性的B-C环、C-D环、或A-B环的N-末端的氨基酸。可以用本领域公知的动物疾病模型测试这些突变蛋白质。

可以通过实验确定PEG分子在适当的位点与蛋白质结合。所述实验可以如下进行：用蛋白水解酶消化蛋白质，利用尺寸排阻、离子交换或反相色谱纯化PEG多肽(它将具有较大的分子量)，最后进行氨基酸测序或质谱分析。偶联PEG的氨基酸将作为氨基酸测序中的空白。

PEG-GH蛋白的药物动力学性质可以如下确定，或者如世界专利申请WO9422466中描述的那样确定。可以对成对大鼠或小鼠静脉快速浓注实验蛋白质。在所需的时间点对动物取少量血样监测24小时的蛋白质体内循环水平。可以用ELISA分析法对实验蛋白质的循环水平定量。还可以进行应用皮下途径给用蛋白质的其它实验。应该用无PEG衍生化的蛋白质作为对照进行同样的实验。这些实验将揭示是否PEG试剂与蛋白质的结合改变了蛋白质的药动学性质。相对于未经PEG衍生的蛋白质，用PEG对蛋白质的共价修饰将增加蛋白质的循环半衰期。较大的PEG分子和/或结合较多的PEG分子应该比小分子PEG更长地延长循环半衰期。

可以在生长激素缺陷(Cox等，1994)和恶病质(Tomas等，1992；Read等，1992)的啮齿动物模型中实验PEG-GH蛋白，以确定优选给药方案并验证效能。这些研究中可以考察不同大小例如8和20 kDa的PEG分子和给药方案，以确定优选的PEG大小和给药方案。预期较大的PEG分子比较小的PEG分子延长循环半衰期，因此将减少给药频率。然而，较大蛋白质可能潜在地降低体内分布体积；因此，一个20 kDa PEG与GH的结合可能将限制生物利用度，从而降低效能。啮齿动物模型将能够确定是否存在这种情况。一旦确定了优选给药方案和PEG大小后，可以在动物模型中比较PEG-GH与GH的效能。虽然所有含有GH活性的PEG-GH蛋白质都包括在本发明范围内，促进生长的能力等于或优于GH，而能够降低给药频率的PEG-GH蛋白质是优选蛋白质。如果PEG-GH和GH都使用较少频率的给药方案，那么PEG-GH应该比GH更有效。

可以使用的一个GH缺陷模型是垂体切除大鼠。在该模型中GH可以刺激体重增长以及骨和软骨的生长(Cox等1994)。可以从Charles River购买垂体切除大鼠。对大鼠注射GH、PEG-GH或安慰剂，每日测定体重的增加，连续10-14天。处死时，测定胫骨骨端的宽度作为骨生长的参数。进行这些研究的实验方法在Cox等(1994)中有描述。

可以用类似方法测试PEG-GH对啮齿动物恶病质模型的效果。每日经渗透泵或皮下注射给用地塞米松，可以促使体重减轻(Tomas等，1992；Read等1992；PCT专利申请/US95/06540)。

实施例2

引入半胱氨酸的红细胞生成素变异体

该实施例涉及引入半胱氨酸的红细胞生成素(EPO)变异体。EPO是促进红细胞生成的主要激素。EPO作用于成熟的红细胞前体，刺激它们进一步增殖和分化成为成熟的红细胞。Amgen，Inc.提供其市售药品。人EPO是由成人肾分泌的一种35-39 kDa的糖蛋白。成熟的人蛋白质含有166个氨基酸，并高度糖基化。Lin等(1985)和Jacobs等(1985)公开了人EPO的序列(SEQ IDNO：2)，它们作为参考引入本文。EPO的一级序列种间高度保守(等同性超过80％；Wen等1994)。糖基团超过蛋白质质量的40％。人EPO含有三个N-连接的糖基化位点和一个O-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点在不同种之间是保守的，而O-连接的糖基化位点不是。EPO的大量糖基化导致该蛋白质不能结晶，因此该蛋白质的X-射线结构还不清楚。人EPO含有四个半胱氨酸残基。二硫键的分配为Cys7到Cys161和Cys29到Cys33。在小鼠EPO中Cys33不是保守的，意味着Cys29到Cys33的二硫键对小鼠EPO的结构或功能不是关键的。该结论可能也适用于人EPO(Boissel等1993)。

EPO的氨基酸序列与GH超基因家族成员的蛋白质一致，突变研究也支持该EPO结构的观点(Boissel等1993；Wen等1994)。推测了模拟GH结构得出的EPO三维结构模型(Boissel等1993；Wen等1994)。已经通过诱变实验鉴定了EPO中对受体结合起重要作用的氨基酸，初步认定它们定位在推测的螺旋A的N-端部分和推测的螺旋D的C-端部分(Boissel等1993；Wen等1994；Matthews等1996)。仅鉴定了一个EPO的细胞表面受体(D’Andrea等1989)。据信EPO与其受体的二聚化基本上与GH与其受体的二聚化相同(Matthews等1996)。

人EPO含有三个通过N-连接的糖基化位点(天冬氨酸-24、-38和-83)和一个通过O-连接的糖基化位点(丝氨酸-126)。N-连接的糖基化位点定位在A-B环和B-C环，O-连接的糖基化位点定位在C-D环。N-连接的糖基化位点在种间是保守的，而O-连接的糖基化位点在啮齿动物EPO中缺乏(Wen等1993)。曾描述过一种126位含有蛋氨酸的非O-连接的糖基化人变异体(美国专利4703008)。N-连接的糖基团高度分枝，并含有末端唾液酸残基(Sasaki等1987；Takeuchi等1988)。N-38和N-83含有分枝程度最高的低聚糖(Sasaki等1988)。

EPO上的末端唾液酸残基对蛋白质的体内功能是关键的，因为消化除去这些残基也就丧失了体内活性(Fukada等1989；Spivak和Hogans，1989)。活性丧失与无唾液酸的蛋白质从体内快速清除有关。无唾液酸的蛋白质在大鼠体内的循环半衰期少于10分钟，相比较而言，有唾液酸的蛋白质的循环半衰期约为2小时(Fukada等1989；Spivak和Hogans，1989)。因此，EPO的体内活性与其循环半衰期直接相关。

通过单独地或组合地使三个含有N-连接的糖基化位点的天冬氨酸残基突变，已经清楚地鉴定了N-连接的糖基团在EPO生物活性中的作用。从哺乳动物细胞中分泌出来的、仅一个N-连接的糖基化位点发生突变的EPO突变蛋白质即N24Q、N38Q和N83Q与野生型EPO同样有效，这表明并不是三个位点上的N-连接的糖基化对蛋白质分泌都是必需的(N24Q指示24位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺)。相比较而言，从哺乳动物中分泌出的、两个或更多N-连接的糖基化位点发生突变的EPO突变蛋白质比野生型EPO生物活性低(Yamaguchi等1991；Delorme等1992)。突变研究发现任何一个单一N-连接的糖基化位点发生突变的蛋白质体外生物活性均等于或大于野生型EPO。因此，得出结论：N-连接的糖基化位点对EPO的分泌或体外生物活性不是必需的。事实上，除去一个糖基化位点可能改善生物活性(Yamaguchi等1991)。

分成两组研究N-连接的糖基化突变蛋白质的体内生物活性。Yamaguchi等(1991)论证N24Q和N83Q突变蛋白质的体内活性大于野生型EPO，这与它们体外活性的增加有关。这些作者发现N38Q突变蛋白质的体内活性比野生型EPO降低约60％。N38是N-连接的糖基化位点中分枝程度最高的位点(Sasaki等1988)。Delorme等(1992)报道任何N-连接的糖基化位点的突变都会降低体内生物活性约50％。两项研究中，两个或更多糖基化位点发生突变的突变蛋白质的体内活性均降低。

上述研究表明某些N-连接的糖基化对EPO的体外和体内活性是必需的。然而，不是三个糖基化位点对于活性都是绝对关键的。N-连接的糖基团增加了EPO的表观分子量，延长了其与生物活性有关的循环半衰期。天然EPO和哺乳动物细胞中生产的EPO具有复杂的N-连接的糖基团，它们含有半乳糖和末端唾液酸残基。半乳糖残基被肝细胞特异性受体识别，促进EPO从体内快速清除，除非半乳糖残基被末端唾液酸掩盖。

诱变研究证明O-连接的糖基化对于EPO的体内或体外功能不是必需的(Delorme等1992)。这与观察到啮齿动物没有O-糖基化一致，也与存在丝氨酸-126取代为蛋氨酸的自然发生的人EPO变异体相应地缺乏O-糖基化一致。丝氨酸-126的诱变揭示该位点上某种氨基酸的改变(改变为颉氨酸、组氨酸或谷氨酸)产生生物活性类似与野生型EPO的EPO突变蛋白质，而其它氨基酸的改变(改变为丙氨酸或甘氨酸)产生活性严重降低的EPO分子(Delorme等1992)。丝氨酸-126改变为半胱氨酸的效果未曾研究。发现S126V EPO的体内生物活性与野生型EPO相近(Delorme等1992)。

复杂的、N-连接的、含有末端唾液酸残基的碳水化合物对EPO的体内生物活性的重要性使该蛋白质的商业生产限于哺乳动物细胞。含有唾液酸的N-连接的糖基团的重要作用在于防止蛋白质聚合、增加蛋白质的稳定性，并延长蛋白质的循环半衰期。末端唾液酸残基掩盖了其下的半乳糖残基(它由肝细胞的特异性受体识别，并促进无唾液酸的蛋白质清除)，从而延长了EPO的循环半衰期。可以在昆虫细胞中制备EPO，它是N-糖基化的，并具有全部体外活性；它的体内活性未见报道(Wojchowski等1987)。

该实施例提供了引入半胱氨酸的EPO变异体的设计方案，以及它们在利用半胱氨酸反应性PEG和其它半胱氨酸反应性试剂制备结合物中的应用。EPO中的某些氨基酸对于生物活性是非必需的，可以突变成为半胱氨酸残基而不会改变正常的二硫键结合模式和分子的整体构型。这些氨基酸定位在A-B环(成熟蛋白质序列的23-58位氨基酸)、B-C环(成熟蛋白质序列的77-89位氨基酸)、C-D环(成熟蛋白质序列的108-131位氨基酸)、螺旋A的近侧(1-8位氨基酸)和螺旋D的远侧(成熟蛋白质序列的153-166位氨基酸)。还推测引入半胱氨酸残基的优选位点可以是蛋白质序列的N-末端或C-末端。半胱氨酸取代的优选位点是O-连接的糖基化位点(丝氨酸-126)和含有三个N-连接的糖基化位点的氨基酸(N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、S85)。糖基化位点是引入半胱氨酸取代和使PEG分子结合于EPO的有吸引力的位点，因为()这些位点暴露于表面；(2)天然蛋白质可以允许这些位置存在大体积的糖基团；(3)糖基化位点位于推测的环区，远离受体结合位点(Wen等1994)；和(4)诱变研究表明这些位点(至少单独地)不是体外或体内活性的关键位点(Yamaguchi等1991；Delorme等1992)。如上面的讨论，包括O-糖基化位点区的区域的局部构型可能对生物活性是很重要的。但还没有研究在126位的半胱氨酸取代是否会影响生物活性。半胱氨酸-29到半胱氨酸-33的二硫键对EPO的生物活性是非必需的，因为将这两个残基同时改变为酪氨酸仍然产生生物活性EPO蛋白质(Boissel等1993；Wen等1994)。可以将半胱氨酸-29或半胱氨酸-33之一改变成为其它氨基酸制备“游离”半胱氨酸。优选的氨基酸改变应该是改变为丝氨酸或丙氨酸。保留的“游离”半胱氨酸(半胱氨酸-29或半胱氨酸-33)应该是用半胱氨酸反应性试剂共价修饰蛋白质的优选位点。

Bill等(1995)用半胱氨酸单独取代N24、N38和N83，报道突变蛋白质的体外生物活性大幅度降低(低于野生型活性的20％)。Bill等(1995)在细菌中表达了融合蛋白质形式的EPO变异体(与谷胱甘肽-硫-转移酶融合)。本发明一方面提供了表达系统，其中N24C、N38C、和N83C EPO变异体将具有与野生型EPO十分相近的体外生物活性。

美国专利4703008构思了EPO的自然发生变异体以及出现在哺乳动物EPO蛋白质中的氨基酸取代。绵羊EPO在多肽链的第88位含有半胱氨酸残基。本发明人没有发现任何其它自然发生的人或动物EPO的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸残基位于本文公开的用于制备引入半胱氨酸的EPO变异体的多肽区。专利4703008具体指示远远不同于引入半胱氨酸的EPO变异体，其中建议可以通过删除半胱氨酸残基或用丝氨酸或组氨酸残基取代自然发生的半胱氨酸残基促进EPO的表达。

EPO的成熟蛋白质形式含有165或166个氨基酸，因为翻译后除去了C-末端的精氨酸。天冬氨酸-165是165个氨基酸构型的C-末端，而精氨酸-166是166个氨基酸构型的C-末端氨基酸。本文描述的半胱氨酸取代和插入突变可以包括成熟EPO的165氨基酸构型和166氨基酸构型。

可以通过聚合酶链式反应(PCR)技术从人HepG2或Hep3B细胞系(它们是已知的缺氧或氯化钴处理下表达EPO的细胞系(Wen等1993)，购自美国典型培养物收藏中心(ATCC))克隆编码EPO的cDNA。可以通过标准噬菌体、质粒或如GH中所述的PCR诱变方法将半胱氨酸突变引入cDNA。如上所述，引入半胱氨酸取代突变的优选位点在A-B环、B-C环、C-D环和螺旋A的近侧区和螺旋D的远侧区。这些区域中的最优选位点是N-和O-连接的糖基化位点：S126-C；N24C；I25C；T26C；N38C；I39C；T40C；N83C；S84C和S85C。半胱氨酸取代突变的其它优选位点在A-B环、B-C环和C-D环，围绕糖基化位点的氨基酸以及蛋白质螺旋A的近侧区和螺旋D的远侧区(Boissel等1993；Wen等1994)。这些区域中用于半胱氨酸取代的其它优选位点为：A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、和R166。还可以在成熟蛋白质第一个氨基酸的近侧，即A1之前，或者在成熟蛋白质中最后一个氨基酸的远侧即D165或R166之后引入半胱氨酸残基。还提供了半胱氨酸-29或半胱氨酸-33被其它氨基酸，优选丝氨酸或丙氨酸取代的其它变异体。

可以利用昆虫细胞表达野生型EPO和EPO突变蛋白，用来确定引入半胱氨酸的突变蛋白质是否具有生物活性。可以将编码EPO/EPO突变蛋白的DNA克隆到杆状病毒表达载体pVL1392中(购自Invitrogen，Inc.和SifmaCororation(St.Louis，MO))，用于感染昆虫细胞。可以使用多克隆抗人EPO抗血清(购自R&D Systems)通过感染昆虫细胞条件介质的Western印迹鉴定生产EPO的重组杆状病毒。可以通过本领域技术人员已知的常规色谱方法纯化分泌的EPO突变蛋白。可以使用商业提供的蛋白质分析试剂盒或ELISA分析试剂盒(购自R&D Systems和Bio-Rad Laboratories)测定蛋白质浓度。

可以用细胞增殖分析法使用受EPO影响的细胞系例如UT7-epo(Wen等1994)或TF1(购自ATCC)测试纯化EPO和EPO突变蛋白，用来确定蛋白质的特异性活性。细胞可以在含有多种浓度的EPO的96孔微滴平板中铺板。测试进行三次。培养1-3天后，可以如GH中所述，通过3H-胸苷的插入测定细胞增殖。可以确定每种突变蛋白质的实现半数-最大刺激的蛋白质浓度(EC₅₀)。每种突变蛋白质至少应该在每个数据点设定三个孔进行三次实验。EC₅₀值可以用来比较突变蛋白质的相对活力。或者，可以利用MTT染料排除分析法分析受EPO突变蛋白影响的细胞增殖(Komatsu等1991)。优选显示与野生型EPO类似的或更好的最佳刺激水平和EC₅₀值的蛋白质。

上述研究明确了EPO中能够改变成为半胱氨酸残基同时保留生物活性的氨基酸残基的定位。可以用如前述用于GH突变蛋白的半胱氨酸反应性8kDa PEG-马来酰亚胺对保留活性的突变蛋白质进行PEG衍生化。应该使用野生型PEG作为对照，因为它不应该在同样的部分还原条件下与半胱氨酸反应性PEG反应。能够得到大量单-PEG衍生产物而不是双-PEG衍生蛋白质的最小量PEG应该优先考虑。可以用尺寸排阻或离子交换色谱将单-PEG衍生蛋白质从没有被PEG衍生的蛋白质和没有反应的PEG中分离出来。应当在上述的细胞增殖实验中测试经纯化的PEG衍生蛋白质以确定它们的生物活性。

选择保留体外生物活性的一种或多种PEG衍生蛋白质用于在动物疾病模型中测试。可以如GH中所述，确定蛋白质衍生化的适当氨基酸。

对利用昆虫细胞表达的PEG衍生化EPO突变蛋白质的体内测试可能需要对它们进行再次基因工程操作，以便在哺乳动物中表达，从而确保适当的糖基化。利用昆虫细胞生产的PEG-EPO供选择物可以在下述动物模型中测试，以便确定是否它们具有体内活性和是否它们与利用哺乳动物细胞表达系统生产的PEG-EPO具有相同的活性。为了在哺乳动物细胞中表达，可以将EPO突变蛋白亚克隆到商业提供的真核细胞表达载体中，然后稳定地转化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(由ATCC提供)。可以利用ELISA分析法筛选表达EPO的亚细胞系。可以制备足够量的昆虫细胞生产的EPO突变蛋白和哺乳动物细胞生产的EPO突变蛋白，用来比较它们在动物缺氧模型中的生物活性。

可以利用人工红细胞增多症或饥饿的啮齿动物模型实验EPO突变蛋白的体内生物活性(Cotes和Bangham，1961；Goldwasser和Gross.，1975)。在饥饿的啮齿动物模型中，在第一天对大鼠断食，在第二天和第三天用实验样品处理大鼠。在第四天，给大鼠注射放射性铁-59。约18小时后，麻醉大鼠，取血样。然后测定标记铁转化到红细胞中的转化百分率。在人工红细胞增多症模型中，将小鼠关在密封罐中，使它连续几天接触低比重大气。然后将动物带到正常气压下。红细胞的形成连续几天受到抑制。返回到正常气压后的第四天或第六天，给小数注射红细胞生成素或生理盐水。每天给小鼠注射一次，连续一到两天。一天后给动物静脉注射标记的铁-59。令小鼠情绪平稳后20小时，测定标记铁插入红细胞的量。在两个模型中可以考察不同的剂量组和不同的注射时间，以确定是否PEG-EPO具有生物活性和/或更有效，并产生比天然EPO更长的作用效果。

实施例3

α干扰素

可以通过真核细胞制备α干扰素，它具有抗病毒、抗肿瘤核免疫调节作用。存在至少20个不同的编码具有70％或更多相同氨基酸的蛋白质的α干扰素基因。Blatt等(1996)中公开了已知的α干扰素种类的氨基酸序列。曾描述过一种将最普遍的氨基酸整合到单一多肽链中的“共有”干扰素(Blatt等1996)。可以通过将α干扰素蛋白质的不同部分连接成为一个蛋白质制备杂交α干扰素蛋白质(Horisberger和Di Marco，1995)。某些α干扰素在螺旋A的近侧区和B-C环附近含有N-连接的糖基化位点(Blatt等1966)。α2干扰素蛋白质(SEQ ID NO：3)含有四个半胱氨酸残基，它们构成两个二硫键。半胱氨酸1-半胱氨酸98的二硫键(某些α干扰素中为半胱氨酸1-半胱氨酸99，例如α1干扰素：SEQ ID NO：4)不是活性必需的。α2干扰素蛋白质不含有任何N-连接的糖基化位点。已经确定了α干扰素的晶体结构(Radhakrishnan等1996)。

该实施例提供了在螺旋A的近侧区、螺旋E的远侧区、在A-B环中、在B-C环中、在C-D环中和D-E环中引入半胱氨酸的变异体。在α干扰素-2的这些区域引入半胱氨酸残基的优选位点为：D2、L3、P4、Q5、T6、S8、Q20、R22、K23、S25、F27、S28、K31、D32、R33、D35、G37、F38、Q40、E41、E42、F43、G44、N45、Q46、F47、Q48、K49、A50、N65、S68，T69，K70，D71，S72，S73，A74，A75，D77，E78，T79，Y89，Q90，Q91，N93，D94，E96，A97，Q101，G102，G104，T106，E107，T108，P109，K112，E113，D114，S115，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，A139，S152，S154，T155，N156，L157，Q158，E159，S160，L161，R162，S163，K164，E165。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸之前即C1之前，或者成熟蛋白质的最后一个氨基酸之后，即E165之后的变异体。还提供了半胱氨酸-1或半胱氨酸-98(在某些α干扰素中为半胱氨酸-99)被其它氨基酸取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代的其它变异体。还提供了半胱氨酸-1被删除(半胱氨酸-1缺陷型)的其他变异体。半胱氨酸变异体可以包括任何自然发生的或非天然的α干扰素序列，例如共有干扰素或干扰素蛋白质杂交体。某些自然发生的α干扰素(例如α干扰素-1)含有一个自然形成的“游离”半胱氨酸。在该干扰素中，自然发生的游离半胱氨酸可以改变成为其它氨基酸，优选改变成为丝氨酸或丙氨酸。

该实施例还提供了包括共有干扰素在内的其它α干扰素的半胱氨酸变异体，半胱氨酸突变发生在这些蛋白质的相同位点。Blatt等(1966)报道了α干扰素-2与其它已知α干扰素和共有干扰素的并列比较。Rhadhakrishnan等(1996)确定了α干扰素-2的晶体结构。Lydon等(1985)发现α干扰素N-末端前四个氨基酸的缺失不会影响生物活性。Valenzuela等(1985)发现α干扰素-2中用半胱氨酸、酪氨酸或丝氨酸取代苯丙氨酸-47，不会该百年该蛋白质的生物活性。半胱氨酸-1和半胱氨酸-98分别单独改变为甘氨酸和丝氨酸，而不改变该蛋白质的生物活性(DeChiara等1986)。

可以从人基因组DNA扩增编码α干扰素-2的DNA序列，因为α干扰素基因不含内含子(Pestka等，1987)。Goeddel等(1980)公开了α干扰素-2的DNA序列。或者，可以从已知自然表达或接触病毒后表达α干扰素的人淋巴母细胞的细胞系中分离α干扰素-2的cDNA(Goeddel等1980；Pickering等1980)。其它这类细胞系可以从美国典型培养物收藏中心(Rockvill，MD)获得。可以应用基于质粒的定点诱变试剂盒(例如，快速改变诱变试剂盒(Quick-Change Mutagenesis Kit)，Stratagene，Inc.)，噬菌体诱变方法，或使用如GH中所述的PCR诱变将特异性突变引入α干扰素序列。

已经成功地在E.coli中生产出胞间蛋白质形式的α干扰素(Tarnowski等1986；Thatcher和Panayotatos，1986)。可以使用类似方法表达α干扰素突变蛋白。可以将编码α干扰素或α干扰素突变蛋白质的质粒克隆到E.coli表达载体中，例如使用强效T7启动子的pET15b(Novagene，Inc.)或使用TAC启动子的pCYB1(New England BioLabs，Beverly，MA)。可以通过将IPTG加入生长培养基诱导蛋白质的表达。

在E.coli中表达的重组α干扰素有时可溶，有时不溶(Tarnowski等1986；Thatcher和Panayotatos，1986)。不溶性可能与蛋白质的过表达程度有关。不溶性α干扰素蛋白质可以以包涵体的形式提取，按照标准氧化再折叠方案恢复其完全活性的构型(Thatcher和Panayotatos，1986；Cox等1994)。可以用其它色谱方法例如离子交换、疏水作用、尺寸排阻和反相树脂进一步纯化α干扰素蛋白质(Thatcher和Panayotatos，1986)。可以利用商业提供的蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)。

如果α干扰素突变蛋白不能成功地在E.coli中表达，可以如用于GH所述在昆虫细胞中以分泌蛋白的形式表达该蛋白质。可以对该蛋白质进行修饰使其含有天然α干扰素的信号序列(Goeddell等1980)或者蜜蜂蜂毒肽(mellitin)信号蛋白序列(Invitrogen，Inc.)，以促进蛋白质的分泌。可以应用常规色谱程序从条件培养基中纯化α干扰素和α干扰素突变蛋白。可以将α干扰素抗体与Western印迹结合，以定位色谱过程中含有α干扰素蛋白的组分。或者，可以用ELISA鉴定含α干扰素蛋白的组分。

可以应用体外病毒噬斑减少分析法测定α干扰素和α干扰素突变蛋白的生物活性(Ozes等1992；Lewis，1995)。可以将人HeLa细胞在96孔平板上铺板，在37℃生长到接近铺满。然后冲洗细胞，并用不同浓度的各种α干扰素制品处理24小时。应该包括没有α干扰素的对照和野生型α干扰素(购自Endogen，Inc.，Woburn，MA)。在平板中加入一种病毒，例如水泡性口膜炎病毒(VSV)和脑心肌炎病毒(EMCV)，将平板在37℃进一步培养24-48小时。还应该包括没有病毒的样品作为对照。当病毒处理后的、无α干扰素的对照孔中有90％或更多的细胞被杀死时(通过观察孔中的病毒决定)，用结晶紫对细胞单层染色，用微平板读数仪记录各孔的吸收度。或者，用染料MTT对细胞单层染色(Lewis，1995)。应该对样品分析两到三次。可以用EC₅₀值(50％抑制病毒的致细胞病变作用所需的蛋白质的量)比较蛋白质的相对潜能。野生型α干扰素保护细胞免受VSV和EMCV的致细胞病变作用，在该分析中其特异性活性约为2X10⁸单位/mg(Ozes等1992)。显示EC₅₀值与野生型α干扰素相当的α干扰素突变蛋白是优选的。

可以应用类似于GH中所述的方法对保留活性的α干扰素突变蛋白进行PEG衍生。野生型α干扰素-2可以作为对照，因为在类似条件下它不会被PEG衍生化。得到大量单-PEG衍生蛋白质而不是双-PEG衍生产物的最小量PEG应该优先考虑。可以通过尺寸排阻或离子交换色谱将单-PEG衍生蛋白质从无-PEG衍生的蛋白质和未反应的PEG中纯化出来。可以利用上述病毒噬斑减少的生物测定实验PEG衍生蛋白质，以便确定它们的生物活性。优选生物活性与野生型α干扰素相当的PEG衍生化α干扰素蛋白。可以对PEG衍生化蛋白应用如用于GH时所述的PEG结合位点的酶谱分析和药动学数据的测定。

可以应用裸鼠的肿瘤异种移植模型和病毒感染模型测试PEG-α干扰素突变蛋白的体内生物活性(Balkwill，1986；Fish等1986)。因为PEG-α干扰素的生物活性可能是种间特异的，因此在体外病毒噬斑减少分析中应该使用类似于前面所述的适当的动物细胞系来确定PEG衍生蛋白质的活性。接着，应该考察不同剂量给药和不同注射时间的影响，以便确定如何使PEG-α干扰素更有效，并因此制备比无PEG衍生的α干扰素作用时间更长的PEG-α干扰素。

可以设计新α干扰素来源0的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例4

β干扰素

β干扰素由成纤维细胞制备，它表现抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。单拷贝β干扰素基因编码一种前蛋白质，它经分裂产生一种166个氨基酸的成熟蛋白质(Taniguchi等1980；SEQ ID NO：5)。该蛋白00质含有三个半胱氨酸，其中半胱氨酸-17是“游离的”，即它不参与形成二硫键。该蛋白质含有一个N-连接的糖基化位点。还未确定该蛋白质的晶体结构(Karpusas等1997)。

本实施例提供了在任意三个含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体(即N80C、E81C、或T82C)。本实施例还提供了在螺旋A的近侧、螺旋E的远侧、A-B环中、B-C环中、C-D环中和D-E环中引入半胱氨酸的变异体。在这些区域中引入半胱氨酸残基的优选位点是：M1、S2、Y3、N4、L5、Q23、N25、G26、R27、E29、Y30、K33、D34、R35、N37、D39、E42、E43、K45、Q46、L47、Q48、Q49、Q51、K52、E53、A68、F70、R71、Q72、D73、S74、S75、S76、T77、G78、E107、K108、E109、D110、F111、T112、R113、G114、K115、L116、A135、K136、E137、K138、S139、I157、N158、R159、L160、T161、G162、Y163、L164、R165和N166。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质第一个氨基酸近侧，即M1之前，或者成熟蛋白质最后一个氨基酸远侧，即N166远侧的变异体。

在天然蛋白质序列或自然发生的“游离”半胱氨酸残基(半胱氨酸-17)改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上制备这些变异体。

可以设计新的来源于β干扰素的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例5

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)

G-CSF是一种多能性细胞因子，它促进粒细胞增殖、分化和发挥作用。该蛋白质由激活的单核细胞和巨噬细胞制备。Souza等(1986)，Nagata等(1986a，b)和美国专利4810643报道了G-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，它们作为参考插入本文。合成的人蛋白质为204或207个氨基酸的前蛋白质，它经分裂形成174或177个氨基酸的成熟蛋白质。较大构型比较小构型的蛋白质特异性低。该蛋白质含有五个半胱氨酸，其中四个参与形成二硫键。半胱氨酸-17不形成二硫键。用丝氨酸取代半胱氨酸-17产生具备全部活性的突变G-CSF蛋白(美国专利4810643)。该蛋白质在成熟蛋白质的苏氨酸-133位有O-糖基化。

本实施例提供了一种在苏氨酸-133位引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A近侧、螺旋D远侧、A-B环中、B-C环中和C-D环中引入半胱氨酸的其它变异体。在这些区域引入半胱氨酸取代的优选位点是：T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，T38，K40，S53，G55，W58，A59，P60，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，Q70，A72，Q90，A91，E93，G94，S96，E98，G100，G125，M126，A127，A129，Q131，T133，Q134，G135，A136，A139，A141，S142，A143，Q145，Q173和P174。本实施例还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质第一个氨基酸近侧即T1之前，或成熟蛋白质最后一个氨基酸远侧即P174之后的变异体。还提供了在天然蛋白质序列或自然发生的“游离”半胱氨酸残基(半胱氨酸-17)改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。

可以从R&D Systems(Minneapolis，MN)购买编码人G-CSF的cDNA或应用从人肿瘤细胞系(例如已知固有地表达G-CSF的5637和U87-MG)分离出的mRNA进行PCR扩增编码人G-CSF的cDNA(Park等1989；Negata，1994)。上述细胞系由美国典型培养物收藏中心(Rockville，MD)提供。可以利用基于质粒的定点诱变试剂盒(例如，快速改变诱变试剂盒，Stratagene，Inc.)，噬菌体诱变法、或应用如用于GH时描述的PCR诱变将特定突变引入G-CSF序列。

已经成功地在E.coli中制备出胞间蛋白质形式的G-CSF(Souza等1986)。可以使用类似方法表达G-CSF和G-CSF突变蛋白。可以将编码G-CSF或G-CSF突变蛋白的质粒克隆到E.coli表达载体中，例如使用强效启动子T7的pET15b(由Novagen，Inc.，Madison，WI提供)或使用强效启动子TAC的pCYB1(由New England BioLabs，Beverly，MA提供)。可以将IPTG加入生长培养基诱导蛋白质表达。在E.coli中表达的G-CSF是不溶的，可以以包涵体的形式提取。可以按照标准氧化再折叠方案恢复蛋白质的完全活性构型(Souza等1986；Lu等1992；Cox等1994)。可以使用类似方法再折叠半胱氨酸突变蛋白质。可以用其它色谱法例如离子交换、疏水作用、尺寸排阻和反相树脂进一步纯化蛋白质(Souza等1986；Kuga等1989；Lu等1992)。可以使用商业提供的蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测定蛋白质浓度。

如果G-CSF或G-CSF突变蛋白不能在E.coli中表达，可以如用于GH时所述将G-CSF或G-CSF突变蛋白以分泌蛋白的形式表达到昆虫细胞中。可以修饰蛋白质使其含有天然G-CSF的信号序列(Souza等1986；Nagata等1986a；Nagata等，1986b)或者蜜蜂mellitin信号序列(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)，用来促进蛋白质的分泌。可以使哟功能常规色谱程序从条件介质中纯化G-CSF和G-CSF突变蛋白。可以将G-CSF抗体与Western印迹结合，以确定色谱中含有G-CSF蛋白质的组分。或者，用ELISA鉴定含G-CSF蛋白质的组分。

还可以如用于红细胞生成素的实施例2所述在哺乳动物细胞G-CSF突变蛋白。

可以使用体外细胞增殖分析法测定G-CSF和G-CSF突变蛋白的生物活性。可以用鼠NFS-60细胞系和人AML-193细胞系测定G-CSF的生物活性(Tsuchiya等1986；Lange等1987；Shirafuji等1989)。这两种细胞系的增殖都受人G-CSF的影响。优选AML-193细胞系，因为它来源与人，因此消除了由于种间差异导致的假结果的可能性。G-CSF影响NFS60细胞系增殖的半数最大有效浓度(EC₅₀)为10-20微微摩尔。在细胞增殖分析中可以使用这些细胞系用公开的方法(Tsuchiya等1986；Lange等1987；Shiraguji等1989)测试G-CSF突变蛋白，以确定蛋白质的特异活性。可以将细胞在加有不同浓度G-CSF或G-CSF突变蛋白的96孔组织培养皿上铺板。在潮湿的组织培养保温箱中于37℃培养1-3天后，如用于GH时所述通过³H-胸苷的插入测定细胞增殖。每种突变蛋白质应该在各数据点设置三个孔，至少分析三次。可以用EC₅₀值比较突变蛋白质的相对潜能。与野生型G-CSF表现类似最佳刺激水平和EC₅₀值的G-CSF突变蛋白是优选的。

可以利用类似用于GH时所述的方法对G-CSF突变蛋白进行PEG衍生化。野生型G-CSF和丝氨酸-17G-CSF可以用作对照，因为在同样条件下它不应该被PEG衍生化。认为得到大量单-PEG衍生化产物而不是双-PEG衍生化产物的最小量PGE是优选的。可以通过尺寸排阻色谱或离子交换色谱将单-PEG衍生蛋白质从未被PEG衍生的蛋白质和未反应的PEG中纯化出来。可以如上述用细胞增殖分析法测试纯化的PEG衍生蛋白质，以确定它们的特异活性。

可以利用类似用于GH所述的方法酶谱分析蛋白质的PEG位点。可以利用用于GH的类似方法获取PEG衍生蛋白质的药动学数据。

可以用正常的Sprague-Dawley大鼠(购自Charles River)进行论证PEG-G-CSF体内效能的初步研究。给各组大鼠单次皮下或静脉注射多种剂量的G-CSF、PEG-G-CSF或安慰剂。每日处死部分动物，直到一周，用来测定外周血中的嗜中性粒细胞和总白细胞数。可以测定其它类型的血细胞(血小板和红细胞)，以证实细胞特异性。

可以用大鼠嗜中性白细胞减少症模型测试PEG-G-CSF的效能。可以通过环磷酰胺处理诱导嗜中性白细胞减少症，环磷酰胺是普遍使用的髓性抑制的化疗药。G-CSF促进环磷酰胺处理动物体内正常嗜中性粒细胞水平的恢复(Kubota等1990)。在0天给大鼠注射环磷酰胺诱导嗜中性白细胞减少症。然后将动物分成不同的组，分别给各组皮下注射G-CSF，PEG-G-CSF或安慰剂。每日测定外周血中的嗜中性粒细胞和总白细胞数，直到上述值返回正常水平。首先，应该确定每日注射G-CSF促进嗜中性粒细胞的恢复。接着，应该考察不同剂量给药和不同注射时间的影响，以确定是否PEG-G-CSF更有效，并制备比无PEG衍生的G-CSF作用时间更长的PEG-G-CSF。

可以设计新的G-CSF来源的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例6

血小板生成素(TPO)

血小板生成素刺激血小板巨核细胞前体的形成。Bartley等(1994)，Foster等(1994)，de Sauvage等(1994)公开了TPO的氨基酸序列(SEQ IDNO：7)，它们作为参考插入本文。

合成的蛋白质为含353个氨基酸的前体蛋白质，它经分裂形成332个氨基酸的成熟蛋白质。N-末端的154个氨基酸与EPO和其它GH超基因家族的成员具有同源性。C-末端的199个氨基酸不与任何其它已知蛋白享有同源性。C-末端区含有六个N-连接的糖基化位点和多个O-连接的糖基化位点(Hoffman等1996)。还在螺旋A的近侧、A-B环中、和螺旋C的C-末端发现O-连接的糖基化位点(Hoffman等1996)。一种仅含成熟蛋白质残基1-195的截短的TPO蛋白具有全部体外活性(Bartley等1994)。

本实施例提供了将任何含有N-连接的糖基化位点和O-连接的糖基化位点的氨基酸改变成半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A近侧、螺旋D远侧、A-B环中、B-C环中和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。

引入半胱氨酸残基的优选位点是：S1，P2，A3，P4，P5，A6，T37，A43，D45，S47，G49，E50，K52，T53，Q54，E56，E57，T58，A76，A77，R78，G79，Q80，G82，T84，S87，S88，G109，T110，Q111，P113，P114，Q115，G116，R117，T118，T119，A120，H121，K122，G146，G147，S148，T149，A155，T158，T159，A160，S163，T165，S166，T170，N176，R177，T178，S179，G180，E183，T184，N185，F186，T187，A188，S189，A190，T192，T193，G194，S195，N213，Q214，T215，S216，S218，N234，G235，T236，S244，T247，S254，S255，T257，S258，T260，S262，S272，S274，T276，T280，T291，T294，S307，T310，T312，T314，S315，N319，T320，S321，T323，S325，Q326，N327，L328，S329，Q330，E331和G332。本发明提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质第一个氨基酸近侧即S1之前，或引入成熟蛋白质最后一个氨基酸远侧即G332之后的变异体。提供了在天然人蛋白质或从天然蛋白质第147位氨基酸到C-末端(即G332)被截掉的变异蛋白质基础上的引入半胱氨酸的变异体。提供了从氨基酸147到332被截掉的TPO蛋白的最后一个氨基酸远侧加上半胱氨酸残基的变异体。

可以设计新的TPO来源的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例7

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

GM-CSF刺激各种造血细胞的增殖和分化，所述造血细胞包括嗜中性粒细胞，单核细胞，嗜曙红细胞，类红细胞，和巨核细胞等细胞族。Cantrell等(1985)和Lee等(1985)报道了人GM-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，它们作为参考插入本文。

制备的GM-CSF位144个氨基酸的前蛋白，它经裂解形成127个氨基酸的成熟蛋白质。该成熟蛋白质具有两个N-连接的糖基化位点。其中一个定位在螺旋A的C-末端；另一个定位在A-B环上。

本实施例提供在所有含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体，即N27C，L28C，S29C，N37C，E38C和T39C。本实施例还提供了在螺旋A近侧，螺旋D远侧，A-B环中，B-C环中，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。在这些区域引入半胱氨酸取代的优选位点是：A1，P2，A3，R4，S5，P6，S7，P8，S9，T10，Q11，R30，D31，T32，A33，A34，E35，E41，S44，E45，D48，Q50，E51，Y53，Q64，G65，R67，G68，S69，L70，T71，K72，K74，G75，T91，E93，T94，S95，A97，T98，T102，I117，D120，E123，V125，Q126和E127。提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质第一个氨基酸近侧即A1近侧，或者引入成熟蛋白质最后一个氨基酸远侧即E127远侧的变异体。

可以设计新的来源于GM-CSF的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例8

IL-2

IL-2是由活化的T细胞合成的T细胞生长因子。该蛋白质促进活化T细胞的克隆发展。合成的人IL-2是153个氨基酸的前体，它经分裂形成133个氨基酸的成熟蛋白质(Tadatsugu等1983；Devos等1983；SEQ ID NO：9)。

Tadatsugu等(1983)和Devos等(1983)阐述了IL-2的氨基酸序列。成熟蛋白质含有三个半胱氨酸残基，其中两个形成二硫键。成熟蛋白质的半胱氨酸-125不参与二硫键。用丝氨酸取代半胱氨酸-125产生完全生物活性的IL-2突变蛋白(Wang等，1984)。该蛋白质在成熟蛋白质链的苏氨酸-3含有O-连接的糖基化。

本实施例提供了在螺旋D的最后四个位置，螺旋D的远侧区，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。提供了在天然蛋白质序列或自然发生的“游离”半胱氨酸残基(半胱氨酸-125)改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧即A1之前，或最后一个氨基酸远侧即T133之后的变异体。

可以设计新的来源于IL-2的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例9

IL-3

IL-2是由活化的T细胞合成的，刺激多能造血干细胞增殖和分化。Yang等(1986)；Dorssers等(1987)和Otsuka等(1988)报道了人IL-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，它们作为参考插入本文。该蛋白质含有两个半胱氨酸残基和两个N-连接的糖基化位点。曾报道过两个等位基因，产生第8位氨基酸位置为丝氨酸或脯氨酸的异构体或者成熟蛋白质。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-3的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例10

IL-4

IL-4是促进单核细胞、T细胞和B细胞增殖和分化的多效性细胞因子。IL-4参与B细胞分泌IgE的过程，据信IgE在哮喘和遗传过敏症中发挥作用。IL-4的生物活性是种间特异性的。合成的IL-4是153个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成129个氨基酸的成熟蛋白质。Yokota等(1986)报道了人IL-4的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，它作为参考插入本文。该蛋白质含有六个半胱氨酸残基和两个N--连接的糖基化位点。糖基化位点定位在A-B环和C-D环。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧即H1之前或最后一个氨基酸远侧即S129之后的变异体。

可以设计新的来源于IL-4的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例11

IL-5

IL-5是嗜酸性粒细胞的分化和激活因子。Yokota等(1987)报道了人IL-5的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，它作为参考插入本文。该成熟蛋白质含有115个氨基酸，它以溶解状态、二硫键连接的均二聚体的形式存在。该蛋白质含有O-连接和N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-5的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例12

IL-6

IL-6促进许多细胞类型的增殖和分化。Hirano等(1986)报道了人IL-6的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)，它作为参考插入本文。合成的IL-6是212个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成184个氨基酸的成熟蛋白质。成熟蛋白质在T137，T138，T142或T143含有两个N-连接的糖基化位点和一个O-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点和O-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-6的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例13

IL-7

IL-7促进不成熟B细胞增殖，并作用于成熟T细胞。Goodwin等(1989)报道了IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，它作为参考插入本文。合成的该蛋白质是177个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成152个氨基酸的成熟蛋白质，它含有三个N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。

可以设计新的来源于IL-4的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

实施例14

IL-9

IL-9是作用于多种类淋巴细胞的多效性细胞因子。IL-9促进活化T细胞和细胞毒性T淋巴细胞增殖，促进肥大细胞前体的增殖，于红细胞生成素协同激活免疫红细胞前体。Yang等(1989)报道了人IL-9的氨基酸序列(SEQID NO：15)，它作为参考插入本文。合成的IL-9是含有144个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成126个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白质含有四个潜在的N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-9的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例15

IL-10

Vieira等(1991)报道了人IL-10的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)，它作为参考插入本文。合成的IL-10是含有178个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成160个氨基酸的成熟蛋白质。IL-10的功能在于激活或抑制免疫系统。该蛋白质与干扰素具有结构同源性，即它含有五个两亲螺旋。该蛋白质含有一个N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在任何含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-10的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例16

IL-11

IL-11是激活造血作用、淋巴细胞增殖作用和急性相反应的多效细胞因子。IL-11与IL-6的生物活性部分相同。Kawashima等(1991)和Paul等(1990)报道了人IL-11的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，二者作为参考插入本文。合成的IL-11是含有199个氨基酸的前体蛋白，它经分裂形成178个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白质不含N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-11的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例17

IL-12 p35

IL-12促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞增殖和分化。IL-12为p35亚基和p40亚基形成的杂二聚体。p35亚基是GH超基因家族的成员。Gubler等(1991)和Wolf等(1991)报道了p35亚基的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)，二者作为参考插入本文。合成的p35亚基是含有197个氨基酸的前体蛋白，经分裂形成175个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白质含有7个半胱氨酸残基和三个潜在的N-连接的糖基化位点。

本实施例提供了在任意三个含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。提供了在天然蛋白质序列或自然发生的“游离”半胱氨酸残基改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-12 p35的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例18

IL-13

IL-13与IL-4的生物学性质部分相同。McKenzie等(1993)和Minty等(1993)报道了人IL-13的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)，二者作为参考插入本文。合成的该蛋白质是含有132个氨基酸的前体蛋白，经分裂形成112个氨基酸的成熟蛋白质。成熟蛋白质含有五个半胱氨酸残基和多个N-连接的糖基化位点。McKenzie等(1993)描述了由于mRNA的交替剪接删除了78位谷氨酰胺的变异体。

本实施例提供了在任意三个含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，螺旋D的远侧，A-B环，B-C环，和C-D环中引入半胱氨酸的变异体。提供了在天然蛋白质序列或预先存在的“游离”半胱氨酸残基改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-14的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

实施例19

IL-15

IL-15促进T细胞，NK细胞，LAK细胞和肿瘤渗透淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocyte)增殖和分化。IL-15可以用于治疗癌症和病毒感染。Anderson等(1995)报道了IL-15的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)，它作为参考插入本文。IL-15含有两个N-连接的糖基化位点，它们定位在C-D环中和D螺旋的C-末端。IL-15编码162个氨基酸的前体蛋白，它经裂解形成114个氨基酸的成熟蛋白质。

本实施例提供了在任意三个在C-D环中或D螺旋的C-末端含有N-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。本实施例还提供了在螺旋A的近侧，A-B环，B-C环，C-D环或螺旋D的远侧引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于IL-15的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例20

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)

M-CSF调节单核细胞生长，分化和发挥作用。该蛋白质是二硫键连接的均二聚体。曾报道由于mRNA的剪接不同导致多种分子量的M-CSF。Kawasaki等(1985)，Wong等(1987)和Cerretti等(1988)报道了人M-CSF及其多种加工形式的氨基酸序列，它们作为参考插入本文。可以遵循该应用的一般教导并按照本文描述的实施例制备引入半胱氨酸的变异体。

可以设计新的来源于M-CSF的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例21

制瘤素M

制瘤素M是影响某些细胞型生长和分化的多功能细胞因子。Malik等(1989)报道了人制瘤素M的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)，它作为参考插入本文。制瘤素M由活化的单核细胞和T淋巴细胞合成。合成的制瘤素M是含有252个氨基酸的前体蛋白，它经连续分裂形成一个含227个氨基酸的蛋白质，然后形成一个含196个氨基酸的蛋白质(Linsley等1990)。成熟蛋白质含有O-连接的糖基化位点和两个N-连接的糖基化位点。该蛋白质在T160，T162和S165存在O-糖基化。成熟蛋白质含有五个半胱氨酸残基。

本实施例提供了在三个含有N-连接的糖基化位点或O-连接的糖基化位点的氨基酸的任意一个上引入半胱氨酸的变异体。本实施例提供了在螺旋A的近侧，A-B环，B-C环，C-D环或螺旋D的远侧引入半胱氨酸的变异体。提供了在天然蛋白质序列或预先存在的“游离”半胱氨酸残基改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于制瘤素M的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例22

睫状神经营养因子(CNTF)

Lam等(1991)报道了人CNTF的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)，它作为参考插入本文。CNTF是含有200个氨基酸的蛋白质，它们不含糖基化位点或用于分泌的信号序列。该蛋白质含有一个半胱氨酸残基。CNTF的功能是神经细胞的存活因子。

本实施例提供了在螺旋A的近侧，A-B环，B-C环，C-D环或螺旋D的远侧引入半胱氨酸的变异体。提供了在天然蛋白质序列或预先存在的“游离”半胱氨酸残基改变为其它氨基酸，优选改变为丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白质基础上的上述变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于CNTF的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

实施例23

白血病抑制因子(LIF)

Moreau等(1988)和Gough等(1988)报道了LIF的氨基酸序列(SEQ IDNO：23)，二者作为参考插入本文。人LIF基因编码含202个氨基酸的前体，它裂解产生含180个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白质含有六个半胱氨酸残基，其均参与形成二硫键。该蛋白质含有多个O-连接和N-连接的糖基化位点。Robinson等(1994)确定了该蛋白质的晶体结构。该蛋白质影响许多细胞型的生长和分化。

本实施例提供了在任意三个含有N-连接的糖基化位点或O-连接的糖基化位点的氨基酸上引入半胱氨酸的变异体。还提供了在螺旋A的近侧，A-B环，B-C环，C-D环或螺旋D的远侧引入半胱氨酸的变异体。还提供了半胱氨酸残基引入成熟蛋白质的第一个氨基酸近侧或最后一个氨基酸远侧的变异体。

可以设计新的来源于LIF的本实施例分子，并基本上如实施例1和2中所述测试其活性，然而需要替换涉及本实施例特异蛋白质的本领域已知的适当测定法和其它考虑因素。

本文引用的所有文件均作为参考插入其中。

本文公开的蛋白质类似物可以本领域公知的基本上相同的剂型和剂量用于具有天然蛋白质的已知治疗用途中。

虽然本文具体地描述了本发明的作为例子的优选实施方式，但本领域普通技术人员将能够认识到除了这些具体描述之外的改变，修改，添加和应用，并可以不偏离本发明的本质修改优选实施例和方法。

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序列表

<110>Cox III，George N

Bolder Biotechnology，Inc.

<120>生长激素和相关蛋白衍生物

<130>BB0011

<140>未知

<141>1998-07-14

<150>60/052，516

<151>1997-07-14

<160>41

<170>专利版本2.0

<210>1

<211>191

<212>蛋白质

<213>人

<400>1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1               5                  10                  15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

         20                  25                  30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

     35                  40                  45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

 50                  55                  60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65                  70                  75                  80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

             85                  90                  95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

        100                 105                 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

    115                 120                 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

130                 135                 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145                 150                 155                 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

            165                 170                 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

        180                 185                 190<210>2<211>166<212>蛋白质<213>人<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1               5                  10                  15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

         20                  25                  30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

     35                  40                  45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

 50                  55                  60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

             85                  90                  95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

        100                 105                 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

    115                 120                 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130                 135                 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg

            165<210>3<211>165<212>蛋白质<213>人<400>3Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

     35                  40                  45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

 50                  55                  60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65                  70                  75                  80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

             85                  90                  95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

        100                 105                 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

    115                 120                 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

130                 135                 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145                 150                 155                 160Leu Arg Ser Lys Glu

            165<210>4<211>166<212>蛋白质<213>人<400>4Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp

         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

     35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile

 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu

            165<210>5<211>166<212>蛋白质<213>人<400>5Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1               5                  10                  15Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

         20                  25                  30Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

     35                  40                 45Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

 50                  55                  60Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65                   70                  75                  80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

             85                  90                  95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

        100                 105                 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

    115                 120                 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130                 135                 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145                 150                 155                 160Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

            165<210>6<211>174<212>蛋白质<213>人<400>6Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1               5                  10                  15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

         20                  25                  30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

     35                  40                  45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

 50                  55                  60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65                  70                  75                  80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

             85                  90                  95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

        100                 105                 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

    115                 120                 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

130                 135                 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145                 150                 155                 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

            165                 170<210>7<211>322<212>蛋白质<213>人<400>7Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1               5                  10                  15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

         20                  25                  30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

     35                  40                  45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

 50                  55                  60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65                  70                  75              80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

             85                  90              95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105             110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120             125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135             140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145                 150             155                     160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

            165             170                     175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

        180             185                     190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile

    l95             200                     205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly

210             215                     220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225             230                     235                 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly

        245                     250                 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser

    260                     265                 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

275                     280                 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro

290                 295                 300Aso Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            325                 330<210>8<211>127<212>蛋白质<213>人<400>8Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val1               5                  10                  15Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr

         20                  25                  30Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp

     35                  40                  45Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln

 50                  55                  60Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met65                  70                  75                  80Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys

             85                  90                  95Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp

        100                 105                 110Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu

    115                 120                 125<210>9<211>133<212>蛋白质<213>人<400>9Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His1               5                  10                  15Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

         20                  25                  30Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

     35                  40                  45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

 50                  55                  60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu65                  70                  75                  80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

             85                  90                  95Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

        100                 105                 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

    115                 120                 125Ile Ser Thr Leu Thr

130<210>10<211>152<212>蛋白质<213>人<400>10Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro1               5                  10                  15Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp

         20                  25                  30Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln

     35                  40                  45Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln

 50                  55                  60Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe65                  70                  75                  80Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile

             85                  90                  95Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr

        100                 105                 110Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg

    115                 120                 125Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln

130                 135                 140Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe145                 150<210>11<211>129<212>蛋白质<213>人<400>11His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser1               5                  10                  15Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile

         20                  25                  30Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala

     35                  40                  45Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg

 50                  55                  60Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile65                  70                  75                  80Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu

             85                  90                  95Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe

        100                 105                 110Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser

    115                 120                 125Ser<210>12<211>134<212>蛋白质<213>人<400>12Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr1               5                  10                  15Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu

         20                  25                  30Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu

     35                  40                  45Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr

 50                  55                  60Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln65                  70                  75                  80Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys

             85                  90                  95Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val

        100                 105                 110Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr

    115                 120                 125Glu Trp Ile Ile Glu Ser

130<210>13<211>212<212>蛋白质<213>人<400>13Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu1               5                  10                  15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro

         20                  25                  30Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr

     35                  40                  45Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile

 50                  55                  60Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser65                  70                  75                  80Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala

             85                  90                  95Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu

        100                 105                 110Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr

    115                 120                 125Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln

130                 135                 140Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn145                 150                 155                 160Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu

            165                 170                 175Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His

        180                 185                 190Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala

    195                 200                 205Leu Arg Gln Met

210<210>14<211>177<212>蛋白质<213>人<400>14Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile1               5                  10                  15Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

         20                  25                  30Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

     35                  40                  45Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

 50                  55                  60Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe65                  70                  75                  80Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

             85                  90                  95Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

        100                 105                 110Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

    115                 120                 125Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130                 135                 140Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu145                 150                 155                 160Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

            165                 170                 175His<210>15<211>144<212>蛋白质<213>人<400>15Met Leu Leu Ala Met Val Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Cys Ser Val1               5                  10                  15Ala Gly Gln Gly Cys Pro Thr Leu Ala Gly Ile Leu Asp Ile Asn Phe

         20                  25                  30Leu Ile Asn Lys Met Gln Glu Asp Pro Ala Ser Lys Cys His Cys Ser

     35                  40                  45Ala Asn Val Thr Ser Cys Leu Cys Leu Gly Ile Pro Ser Asp Asn Cys

 50                  55                  60Thr Arg Pro Cys Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gln Met Thr Asn Thr Thr65                  70                  75                  80Met Gln Thr Arg Tyr Pro Leu Ile Phe Ser Arg Val Lys Lys Ser Val

             85                  90                  95Glu Val Leu Lys Asn Asn Lys Cys Pro Tyr Phe Ser Cys Glu Gln Pro

        100                 105                 110Cys Asn Gln Thr Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu Lys Ser Leu

    115                 120                 125Leu Glu Ile Phe Gln Lys Glu Lys Met Arg Gly Met Arg Gly Lys Ile

130                 135                 140<210>16<211>178<212>蛋白质<213>人<400>16Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val1               5                  10                  15Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

         20                  25                  30Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

     35                  40                  45Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

 50                  55                  60Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys65                  70                  75                  80Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

             85                  90                  95Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

        100                 105                 110Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

    115                 120                 125Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130                 135                 140Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu145                 150                 155                 160Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

            165                 170                 175Arg Asn<210>17<211>199<212>蛋白质<213>人<400>17Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro1               5                  10                  15Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser

         20                  25                  30Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser

     35                  40                  45Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala ALa Gln Leu Arg Asp Lys Phe

 50                  55                  60Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met65                  70                  75                  80Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg

             85                  90                  95Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg

        100                 105                 110Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr

    115                 120                 125Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met

130                 135                 140Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro145                 150                 155                 160Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala

            165                 170                 175Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu

        180                 185                 190Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu

    195<210>18<211>219<212>蛋白质<213>人<400>18Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu1               5                  10                  15Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro

         20                  25                  30Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val

     35                  40                  45Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys

 50                  55                  60Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser65                  70                  75                  80Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys

             85                  90                  95Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala

        100                 105                 110Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr

    115                 120                 125Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys

130                 135                 140Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu145                 150                 155                 160Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr

            165                 170                 175Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys

        180                 185                 190Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr

    195                 200                 205Ile Asp Arg Val Thr Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

210                 215<210>19<211>132<212>蛋白质<213>人<400>19Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly1               5                  10                  15Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu

         20                  25                  30Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys

     35                  40                  45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys

 50                  55                  60Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu65                   70                  75                  80Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala

             85                  90                  95Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala

        100                 105                 110Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu

    115                 120                 125Gly Arg Phe Asn

130<210>20<211>114<212>蛋白质<213>人<400>20Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1               5                  10                  15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

         20                  25                  30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

     35                  40                  45Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

 50                  55                  60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65                  70                  75                  80Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

             85                  90                  95Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

        100                 105                 110Thr Ser<210>21<211>252<212>蛋白质<213>人<400>21Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser

         20                  25                  30Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu

     35                  40                  45Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly

 50                  55                  60Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala65                  70                  75                  80Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu

             85                  90                  95Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp

        100                 105                 110Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu

    115                 120                 125Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu

130                 135                 140Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser145                 150                 155                 160Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro

            165                 170                 175Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys

        180                 185                 190Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val

    195                 200                 205Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro

210                 215                 220His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys225                 230                 235                 240Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg

            245                 250<210>22<211>200<212>蛋白质<213>人<400>22Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu1               5                  10                  15Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr

         20                  25                  30Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile

     35                  40                  45Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp

 50                  55                  60Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr65                   70                  75                  80Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val

             85                  90                  95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu

        100                 105                 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile

    115                 120                 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile

130                 135                 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145                 150                 155                 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu

            165                 170                 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His

        180                 185                 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met

    195                 200<210>23<211>181<212>蛋白质<213>人<400>23Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg His1               5                  10                  15Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln

         20                  25                  30Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln

     35                  40                  45Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val

 50                  55                  60Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys Leu65                  70                  75                  80Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gly Asn

             85                  90                  95Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro Ser Ala Leu Ser Leu His

        100                 105                 110Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn

    115                 120                 125Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Gly His Val Asp Val

130                 135                 140Thr Tyr Gly Pro Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys145                 150                 155                 160Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Val

            165                 170                 175Leu Ala Gln Ala Phe

        180<210>24<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>24gggggtcgac catatgttcc caaccattcc cttatccag<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>25gggggatcct cactagaagc cacagctgcc ctc<210>26<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>26ccccggatcc gccaccatgg atctctggca gctgctgtt<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>27ccccgtcgac tctagagcta ttaaatacgt agctcttggg<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>28cgcggatccg attagaatcc acagctcccc tc<210>29<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>29ccccctctag acatatgaag aagaacatcg cattcctgct ggcatctatg ttcgttttct ctatcg<210>30<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>30gcatctatgt tcgttttctc tatcgctacc aacgcttacg cattcccaac cattccctta tccag<210>31<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>31gcagtggcac tggctggttt cgctaccgta gcgcaggcct tcccaaccat tcccttatcc ag<210>32<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>32ccccgtcgac acatatgaag aagacagcta tcgcgattgc agtggcactg gctggtttc<210>33<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>33ctgcttgaag atctgcccac accgggggct gccatc<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>34gtagcgcagg ccttcccaac catt<210>35<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>35ctgcttgaag atctgcccag tccgggggca gccatcttc<210>36<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>36gggcagatct tcaagcagac ctacagcaag ttcgactgca actcacacaa c<210>37<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；PCR引物<400>37cgcggtaccc gggatccgat tagaatccac agct<210>38<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>

<223>人工序列的描述；PCR引物

<400>38

gggcagatct tcaagcagac ctactgcaag ttcgac

<210>39

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；PCR引物

<400>42

CGCGG TACCG GATCC TTAGC AGAAG CCACA GCTGC CCTCCAC

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；PCR引物

<400>24

GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT

<210>41

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；PCR引物

<400>40

CCCCG TCGAC TCTAG AGCCA TTAGA TACAA AGCTC TTGGG

Claims (23)

1.GH超基因家族成员的半胱氨酸变异体，包括一个取代选自环区氨基酸、α螺旋末端附近的氨基酸、第一个两亲螺旋近侧的氨基酸、最后一个两亲螺旋远侧的氨基酸中的一个氨基酸的半胱氨酸残基或半胱氨酸残基加到蛋白质的N-末端或C-末端。

2.GH超基因家族成员的半胱氨酸变异体，包括引入环区中的两个氨基酸之间、α螺旋末端区、第一个两亲螺旋近侧、或最后一个两亲螺旋远侧的半胱氨酸残基。

3.按照权利要求1的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸是N-或O-连接的糖基化位点的一部分。

4.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸残基导入N-连接的糖基化位点中的两个氨基酸之间或靠近N-连接或O-连接的糖基化位点中的一个氨基酸。

5.按照权利要求1-4的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员选自生长激素、催乳素、胎盘催乳素、红细胞生成素、血小板生成素、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亚基)、白介素-13、白介素-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、cardiotrophin-1和巨噬细胞集落刺激因子。

6.按照权利要求1的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸位于GH超基因家族干扰素/类干扰素-10样成员的A-B环、B-C环、C-D环或D-E环中。

7.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中环区是GH超基因家族干扰素/类干扰素-10样成员的A-B环、B-C环、C-D环或D-E环。

8.按照权利要求1-7的半胱氨酸变异体，其中引入的半胱氨酸被聚乙二醇化。

9.按照权利要求1的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是生长激素。

10.按照权利要求9的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸选自位于A-B环的N-末端，B-C环，C-D环的氨基酸，A、B、C和D螺旋中的前三个或最后三个氨基酸，以及螺旋A近侧和螺旋D远侧的氨基酸。

11.按照权利要求10的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸选自：F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188、和G190。

12.按照权利要求1的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是红细胞生成素。

13.按照权利要求12的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸选自位于A-B环，B-C环，C-D环的氨基酸，螺旋A近侧和螺旋B远侧和N或C末端的氨基酸。

14.按照权利要求13的半胱氨酸变异体，其中被取代的氨基酸选自：丝氨酸-126、N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、R166和S85。

15.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是生长激素。

16.按照权利要求15的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸引入选自A-B环的N-末端，B-C环，C-D环的氨基酸，A、B、C和D螺旋中的前三个或最后三个氨基酸，以及螺旋A近侧和螺旋B远侧的氨基酸区域。

17.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是红细胞生成素。

18.按照权利要求17的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸引入选自A-B环的N-末端，B-C环，C-D环，A、B、C和D螺旋中的前三个或最后三个氨基酸，以及螺旋A近侧和螺旋D远侧的区域。

19.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是α干扰素。

20.按照权利要求19的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸引入选自A-B环的N-末端，B-C环，C-D环，A、B、C和D螺旋中的前三个或最后三个氨基酸区域，以及螺旋A近侧和螺旋D远侧区域。

21.按照权利要求2的半胱氨酸变异体，其中GH超基因家族的成员是粒细胞集落刺激因子。

22.按照权利要求21的半胱氨酸变异体，其中半胱氨酸引入选自A-B环的N-末端，B-C环，C-D环，A、B、C和D螺旋中的前三个或最后三个氨基酸区域，以及螺旋A近侧和螺旋D远侧区域。

23.按照权利要求8-22的半胱氨酸变异体，其中引入的半胱氨酸被聚乙二醇化。