JP2008525473A - 修飾されたヒト成長ホルモン - Google Patents

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Abstract

修飾された成長ホルモンポリペプチド及びその使用が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願６０／６３８，６１６号及び２００５年１０月１７日に出願された米国仮特許出願６０／７２７，９９６号の優先権を主張し、これらの明細書は、それらの全体が本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸で修飾された成長ホルモンポリペプチドに関する。
成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリー（Ｂａｚａｎ， Ｆ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４ （１９９０）； Ｍｏｔｔ， Ｈ． Ｒ． ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ． Ｄ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４− １２１ （１９９５）； Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ， Ｏ． ａｎｄ ＨｉＩｅ， Ｊ． Ｎ． （１９９６） ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ）は、類似の構造的特徴を有するタンパク質の群を成す。タンパク質のこのファミリーの各メンバーは、４つのヘリックスバンドルを含み、その一般構造が図１に示されている。なお同定されるべきファミリーのさらなるメンバーが未だ存在するが、ファミリーの幾つかのメンバーには、以下のもの：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、εインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）が含まれる。一般に、アミノ酸又はＤＮＡ配列の制限された同一性を有するという事実に関わらず、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、類似の二次構造及び四次構造を有する。構造的特徴の共有により、遺伝子ファミリーの新規メンバーは容易に同定することが可能である。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＦＮα−２及びＧ−ＣＳＦの一般構造は、それぞれ、図２、３、４及び５に示されている。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの１つのメンバーは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ヒト成長ホルモンは、正常なヒトの成長及び発育の制御の多くに関わっている。天然に存在するこの一本鎖下垂体ホルモンは１９１個のアミノ酸残基からなり、天然に存在するこの一本鎖下垂体ホルモンは１９１個のアミノ酸残基からなり、約２２ｋＤａの分子量を有する。ｈＧＨは、とりわけ、線形成長（体発生（ｓｏｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ））、授乳、マクロファージの活性化並びにインシュリン様及び糖尿病誘発効果などの多数の生物学的効果を惹起する（Ｃｈａｗｌａ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ３４：５１９−５４７（１９８３）；Ｉｓａｋｓｓｏｎ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， ４７：４８３−４９９（１９８５）；Ｈｕｇｈｅｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｆｒｉｅｓｅｎ， Ｙｉ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， ４７：４６９−４８２（１９８５））。
ｈＧＨの構造は周知であり（Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４−５４８（１９７９））、ｈＧＨの三次元構造はＸ線結晶学によって解明されている（ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。本タンパク質は、Ｎ末端から始まり、ループによって連結された、Ａ−Ｄと名付けられた４つの両親媒性αヘリックスバンドルを含むコンパクトな球状構造を有する。ｈＧＨは、２つの分子内ジスルフィド結合（Ｃ５３はＣ１６５と対を成し、Ｃ１８２はＣ１８９と対を成す。）に関与する４つのシステイン残基も含有する。本ホルモンはグリコシル化されず、Ｅ．コリ中で、分泌された形態で発現される（Ｃｈａｎｇ， Ｃ， ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ ５５：１８９−１９６（１９８７））。
ｈＧＨの天然に存在する多数の変異体が同定されている。これらには、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｕｒｇ， ＤＮＡ １：２３９（１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、第４，６７０，３９３号及び第４，６６５，１８０号、これらは参照により本明細書中に組み込まれる。）及びｈＧＨの残基３２−４６の欠失を含有する２０−ｋＤａのｈＧＨが含まれる（Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３：２６７９−２６８７（１９７８））。さらに、転写後、翻訳後、分泌、代謝的プロセッシング及びその他の生理的プロセスから生じる多数のｈＧＨバリアントが報告されている（Ｂａｕｍａｎｎ， Ｇ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：４２４（１９９１））。
ｈＧＨの生物学的効果は、特異的細胞受容体とのｈＧＨの相互作用に由来する。本ホルモンは、胎盤性ラクトゲン及びプロラクチンを含む相同なタンパク質のファミリーのメンバーである。しかしながら、ｈＧＨは、幅広い種特異性を示し、及びクローニングされた体細胞起源（Ｌｅｕｎｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５３７−５４３（１９８７））又はプロラクチン（Ｂｏｕｔｉｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ５３：６９−７７（１９８８））受容体の何れかに結合する点で、ファミリーメンバーの中で特異である。構造的及び生化学的研究に基づいて、乳腺刺激性及び体細胞起源の結合ドメインに対する機能的マップが提案されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：３４０７（１９９１））。ｈＧＨ受容体は、造血性／サイトカイン／成長因子受容体ファミリーのメンバーであり、これらには、インターロイキン（ＩＬ）−３、−４及び−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体及びＧ−ＣＳＦ受容体などの幾つかの他の成長因子受容体が含まれる。「Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｄ ＵＳＡ ８７：６９３４−６９３８（１９９０）」を参照されたい。サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、４つの保存されたシステイン残基と、及び膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフとを含有する。保存された配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられる。例えば、「Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． １８４：４８５−４９０（１９９２）」を参照。ｈＧＨとその受容体（ｈＧＨｂｐ）の細胞外ドメイン間の相互作用は、最も深く理解されているホルモン−受容体相互作用の１つである。高解像度Ｘ線結晶学的データ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：８２１−８２５（１９９１））は、ｈＧＨが２つの受容体結合部位を有しており、分子上の異なる部位を用いて、順次、２つの受容体分子に結合することを示した。２つの受容体結合部位は、部位Ｉ及び部位ＩＩと表される。部位Ｉには、ヘリックスＤのカルボキシ末端並びにヘリックスＡ及びＡ−Ｂループの一部が含まれるのに対して、部位ＩＩは、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部を包含する。ＧＨのＧＨ受容体への結合は順次生じ、まず部位Ｉの結合が起こる。次いで、部位ＩＩが第二のＧＨ受容体を巻き込んで、受容体の二量体化及び細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらし、これらがホルモンに対する細胞性応答を引き起こす。Ｇ１２０Ｒ置換が部位ＩＩ中に導入されたｈＧＨ変異タンパク質は、単一のｈＧＨ受容体に結合できるが、２つの受容体を二量体化することはできない。この変異体は、おそらく、細胞内シグナル伝達経路を活性化せずに受容体部位を占拠することにより、インビトロで、ｈＧＨアンタゴニストとして作用する（Ｆｕｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７−１６８０（１９９２））。
組換えｈＧＨは治療剤として使用されており、多数の適応症の治療に対して承認されている。ｈＧＨの欠乏は小人症を引き起こすが、これは、例えば、ホルモンの外因性投与によって、１０年超にわたって首尾よく治療されてきた。ｈＧＨ欠乏に加えて、ｈＧＨは、腎不全（小児）、ターナー症候群及びＡＩＤＳ患者における悪液質の治療に対しても承認されている。最近、食品医薬局（ＦＤＡ）は、非ＧＨ依存性の小人症の治療に対してｈＧＨを承認した。ｈＧＨは、現在、老化、高齢者における脆弱性、短腸症候群及びうっ血性心不全の治療に対しても調査中である。ｈＧＨ治療に対する標的集団には、特発性小人症（ＩＳＳ）を有する小児及びＧＨＤ様症候群を有する成人が含まれる。
組換えｈＧＨは、現在、毎日注射可能な製品として販売されており、現在、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ＮｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／ＳｅｒｏｓｔｉｍＴＭ（Ｓｅｒｏｎｏ）という５つの主要な製品が販売されている。しかしながら、治療剤として成長ホルモンを使用することに対する著しい困難は、本タンパク質が短いインビボ半減期を有しており、従って、最大の有効性のためには、毎日、皮下注射によって投与しなければならないということである（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８１：１８０６−１８０９（１９９６））。製造コストを低減し、患者に対する投与をより容易にし、効力及び安全性特性を向上させ、並びに優位な利点を与えるその他の特性を作り出すことによって、ｈＧＨアゴニスト及びアンタゴニストの投与を改善するための手段に対して、多大な努力が注力されている。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＡｌｋｅｒｍｅｓは、小児成長ホルモン欠乏症に対するｈＧＨのデポー製剤であるＮｕｔｒｏｐｉｎ ＤｅｐｏｔＴＭを以前に販売していた。本デポー製剤は、より少ない頻度での投与（毎日１回ではなく、２−３週毎に１回）を可能とするが、減少した生物利用可能性及び注射部位での痛みなどの望ましくない副作用も伴い、２００４年に市場から撤収された。別の製品ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）も、最近、ＦＤＡによって承認された。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭは、末端肥大症の治療を適応症とする高度に選択的な成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する、ｈＧＨの遺伝的に改変された類縁体である（ｖａｎ ｄｅｒ ＬｅＩｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５８：１７５４−１７５９（２００１）。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ中のアミノ酸残基の幾つかはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで誘導体化されているが、本製品は、なお、毎日１回投与され、医薬特性が最適でないことを示唆する。ＰＥＧ化及びデポー製剤の他に、ｈＧＨの吸入される剤形及び経口剤形など、他の投与経路が、初期段階の前臨床及び臨床開発中であり、ＦＤＡから未だ承認を受けていない。従って、成長ホルモン活性を示すが、より長い血清半減期も提供し、従って、より最適なｈＧＨの治療レベル及び増加した治療半減期を提供するポリペプチドに対する必要性が存在する。
親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略される。）の共有結合は、タンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子を含む、多くの生物活性分子の水溶性を増加させ、生物的利用可能性を増加させ、血清半減期を増加させ、治療半減期を増加させ、免疫原性を調節し、生物学的活性を調節し、又は循環時間を延長する方法である。ＰＥＧは、医薬中で、人工のインプラント上で、及び生体適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の用途において広く使用されてきた。ＰＥＧの所望される特性を最大化するために、生物活性分子に付着される１つ又はそれ以上のＰＥＧポリマーの総分子量及び水和状態は、親分子の生物活性に悪影響を与えずに、増加された水溶解度及び循環半減期などの、ＰＥＧポリマーの付着に典型的に伴う有利な特性を付与するのに十分に高くなければならない。
ＰＥＧ誘導体は、リジン、システイン及びヒスチジン残基、Ｎ末端及び炭水化物部分などの反応性の化学官能基を通じて、しばしば生物活性分子に連結される。タンパク質及び他の分子は、しばしば、ポリマー付着に対して利用可能な反応性部位の限られた数を有する。しばしば、ポリマー付着を介した修飾に最も適した部位は、受容体結合において重要な役割を果たし、分子の生物学的活性の保持に必要である。その結果、生物活性分子上のこのような反応性部位へのポリマー鎖の無差別な付着は、しばしば、ポリマー修飾された分子の生物学的活性の著しい減少又は完全な喪失さえ引き起こす。「Ｒ．Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：２１９６９−２１９７７」。標的分子に所望の利点を付与するのに十分なポリマー分子量を有する結合体を形成するために、従来のアプローチは、典型的には、分子への多数のポリマーアームをランダムに付着させることにより、親分子の生物活性の減少又は完全な喪失のリスクを増加させる。
タンパク質にＰＥＧ誘導体を付着させるための部位を形成する反応性部位は、タンパク質の構造によって規定される。タンパク質（酵素を含む。）は、一般構造Ｈ２Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨを有するα−アミノ酸の様々な配列から構成される。１つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ））に連結してアミド結合を形成し、アミド結合は、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−（下付き文字「ｎ」は、数百又は数千に等しくなり得る。）として表すことが可能である。Ｒによって表される断片は、タンパク質の生物活性のための及びＰＥＧ誘導体の付着のための反応性部位を含有することが可能である。
例えば、アミノ酸リジンの場合には、ε位置及びα位置中に−−ＮＨ２部分が存在する。ε−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下で、反応に利用できる状態にある。ＰＥＧを用いたタンパク質誘導体化の分野の技術の多くは、タンパク質中に存在するリジン残基のε−ＮＨ２部分に付着させるためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられてきた。「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”， Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， ｐｐ．１−１７」。しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体は全て、タンパク質の表面上に存在するしばしば多数のリジン残基の中から選択的に取り付けることができないという共通の限界を有している。これは、タンパク質活性にとってリジン残基が重要である事例（例えば、酵素活性部位中に存在する。）において、又は受容体結合部位の場合のごとく、他の生物学的分子とのタンパク質の相互作用を媒介する上でリジン残基が役割を果たす事例において著しい限界であり得る。
タンパク質のＰＥＧ化のための既存の方法の等しく重要な第二の困難は、ＰＥＧ誘導体が所望でない残基以外の残基と望ましくない副反応を引き起こし得るということである。ヒスチジンは、構造的に−−Ｎ（Ｈ）−−として表される反応性イミノ部分を含有するが、ε−−ＮＨ２と反応する多くの化学的に反応性の種も、−−Ｎ（Ｈ）−−と反応し得る。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、構造的に−ＳＨとして表される遊離のスルフヒドリル基を有する。幾つかの事例では、リジンのε−ＮＨ２基に誘導されたＰＥＧ誘導体も、システイン、ヒスチジン又はその他の残基と反応する。これは、ＰＥＧ誘導化された生物活性分子の複雑で、不均一な混合物を与え、標的とされている生物活性分子の活性を破壊するリスクをもたらし得る。化学的官能基をタンパク質内の単一分子に導入できるようにした後、明確に確定され、且つ予測可能な、タンパク質上の特異的部位において、１つ又はそれ以上のＰＥＧポリマーを生物活性分子に選択的に結合させることを可能とするＰＥＧ誘導体を開発することが望ましい。
リジン残基に加えて、システイン、ヒスチジン及びＮ末端を含む他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化されたＰＥＧ試薬の開発に向けて、この分野では多大な努力が注力されてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）及び「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”， Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， ｐｐ．１−１７」を参照されたい。システイン残基は、部位特異的変異誘発及びこの分野において公知の他の技術を用いて、タンパク質の構造中へ、部位選択的に導入することが可能であり、その結果得られる遊離のスルフヒドリル部分は、チオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応することが可能である。しかしながら、遊離のスルフヒドリル基の導入が、得られるタンパク質の発現、折り畳み及び安定性を複雑化し得るという点で、このアプローチは複雑である。従って、タンパク質への、１つ又はそれ以上のＰＥＧポリマーの選択的カップリングを可能にし、同時に、スルフヒドリル及びタンパク質中に通常見出される他の化学的官能基に適合性である（すなわち、これらとの望ましくない副反応に関与しない。）、生物活性分子中に化学的官能基を導入するための手段を有することが望ましい。
この分野の抽出例から明らかなように、タンパク質の側鎖（特に、リジンのアミノ酸側鎖上の−−ＮＨ２部分及びシステイン側鎖上のーＳＨ部分）へ付着させるために開発されたこれらの誘導体の多くは、これらの合成及び使用に問題があることが判明している。ある場合には、加水分解が起こり、従って、水性環境中（血流中など）で分解し、損傷し、又はその他不安定である、タンパク質との不安定な結合を形成する。ある場合には、より安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解に供せられ、これは、タンパク質が付着可能となる前にＰＥＧ誘導体上の反応性基が不活化され得ることを意味する。ある場合には、幾分毒性であり、従ってインビボでの使用には適していない。ある場合には、反応が遅すぎて実用上有用ではない。ある場合には、タンパク質の活性に関わる部位に付着することによって、タンパク質活性の喪失をもたらす。ある場合には、付着する部位に特異的ではなく、これも、所望の活性の喪失及び結果の再現性の欠如をもたらし得る。ポリ（エチレングリコール）部分でタンパク質を修飾することに伴う困難を克服するために、より安定であるか（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（参照により、本明細書中に組み込まれる。））、又は分子及び表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。））が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応するように求められるまで、生理的環境中で化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体に対する必要性が本分野において明確に存在する。
最近、タンパク質の部位特異的な修飾に付随する制約の多くを克服することを約束する、タンパク質科学における全く新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）（例えば、Ｌ． Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， （２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００）及び真核生物であるサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成装置に新しい成分が付加され、これによって、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、インビボでタンパク質に取り込むことが可能となった。この方法を用いて、光親和性標識及び光異性化可能なアミノ酸、光架橋アミノ酸（例えば、Ｃｈｉｎ， Ｊ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９９：１１０２０−１１０２４；及びＣｈｉｎ， Ｊ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２４：９０２６−９０２７参照）、ケトアミノ酸、重原子含有アミノ酸及びグリコシル化されたアミノ酸など、新しい化学的、物理的又は生物学的特性を有する多数のアミノ酸が、アンバーコドンＴＡＧに応答して、Ｅ．コリ及び酵母中のタンパク質中に、効率的に及び高い精度で取り込まれている。例えば、「Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７」；「Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ， ＆ Ｐ． Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ３（１１）：１１３５−１１３７」； 「Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００２）， ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４」；及び「Ｌ． Ｗａｎｇ， ＆ Ｐ． Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．， １：１−１１」を参照されたい。全ての参考文献は、それらの全内容が参照により組み込まれる。これらの研究は、タンパク質中に見出されず、遺伝的にコードされた２０個の共通アミノ酸中に見出される官能基の全てに対して化学的に不活性である、並びに効率的及び選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用され得るケトン基、アルキン基及びアジド部分などの化学的官能基を選択的及び日常的に導入することが可能であることを示した。
遺伝的にコードされていないアミノ酸をタンパク質中に取り込ませる能力によって、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリルーＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの、天然に存在する官能基に対する価値ある代替物を提供することができる化学的官能基の導入が可能となる。ある種の化学的官能基は、遺伝的にコードされる２０の共通アミノ酸中に見出される官能基に対して不活性であるが、明瞭且つ効率的に反応して安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド及びアセチレン基は、銅の触媒量の存在下、水性条件中で、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応を行うことがこの分野において公知である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈａｍ． ６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１ ：２５９６−２５９９」を参照されたい。タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、例えば、タンパク質中に見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑且つ効率的に反応して環化付加産物を形成する官能基を取り込ませることが可能である。重要なことに、アセチレン部分の不存在下では、アジドは、他のタンパク質側鎖の存在下及び生理的条件下において、化学的に不活性で、非反応性である。
本発明は、とりわけ、ＧＨポリペプチドの活性及び産生に伴う問題に対処し、改善された生物学的又は薬理学的特性（改善された治療的半減期など）を有するｈＧＨポリペプチドの産生にも対処する。
発明の要旨
本発明は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ（例えばｈＧＨポリペプチド）を含むＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーを提供する。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、１つ又はそれ以上の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨポリペプチドは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１つのさらなるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結されている。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、リンカーによって水溶性ポリマーに連結され、又は水溶性ポリマーに結合される。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。幾つかの実施形態において、二官能性ポリマーは、第二のポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、第二のポリペプチドは、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドである。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸は、天然においてコードされていないアミノ酸である。
ＧＨ（例えばｈＧＨ）の領域は、以下のように図示することが可能であり、ここにおいて、ｈＧＨ中のアミノ酸位置は、真ん中の列に記されている。
Figure 2008525473
幾つかの実施形態において、以下のように、天然にコードされていない一つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＧＨ中の二次構造に対応する以下の領域の一つ又はそれ以上の中の任意の位置に取り込まれる。配列番号２から又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸から得られる１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ｈＧＨ配列番号２から得られる残基１−５、３２−４６、９７−１０５、１３２−１４９及び１８４−１９１又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸からなる群から選択される位置において置換される。幾つかの実施形態において、一つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ中の以下の位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０，１５１、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号３若しくは１の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に取り込まれる。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、以下の位置：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において置換される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、以下の位置：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において置換される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、以下の位置：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において置換される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、以下の位置：３０、７４、１０３（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において置換される。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、以下の位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において置換される。
幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ又はそれ以上に位置する天然において存在していないアミノ酸は、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）などの（これらに限定されない。）の位置において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸は、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸は、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）において、水溶性ポリマーに連結される。
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換若しくは位置１に（すなわち、Ｎ末端に）付加又はこれらのあらゆる組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の任意のＧＨ配列中の対応するアミノ酸）を有するものが含まれるがこれらに限定されない。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの親和性と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体に対するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの親和性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの安定性と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの安定性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨ配列番号２中のＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの免疫原性と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの免疫原性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの血清半減期または循環時間と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの血清半減期または循環時間を増加させる置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの水溶解度と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの水溶解度を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの溶解度と比べて、宿主細胞中で産生されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体の溶解度を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨの発現または合成と比べて、宿主細胞中でのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの発現を増加させ、又はインビトロでの合成を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む。この置換を含むｈＧＨポリペプチドは、アゴニスト活性を保持し、及び宿主細胞中での発現レベルを保持又は増加させる。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するＧＨ、例えばｈＧＨのプロテアーゼ耐性と比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体のプロテアーゼ耐性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然において存在しないアミノ酸を使用し得るが、但し、少なくとも１つの置換は、天然においてコードされていないアミノ酸を使用する。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008525473
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；並びにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、並びにＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸はアミノオキシ基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸残基は、アジド基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008525473
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、並びにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008525473
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、並びにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストである。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、天然においてコードされていないアミノ酸と、及び１つ又はそれ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子とを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの部位ＩＩ領域（ＡＣヘリックス−バンドルフェース、ヘリックスＡのアミノ末端領域とヘリックスＣの一部を包含するタンパク質の領域）内に存在する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドアンタゴニストが、第二のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体分子に結合できないようにすることによって、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体の二量体化を妨げる。幾つかの実施形態において、配列番号２（ｈＧＨ）中のＧ１２０は、グリシン以外のアミノ酸に置換される。幾つかの実施形態において、配列番号２中のＧ１２０は、アルギニンに置換される。幾つかの実施形態において、配列番号２中のＧ１２０は、天然においてコードされていないアミノ酸に置換される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの受容体結合領域内に存在し、又は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの受容体結合を妨害する。
本発明は、配列番号２１又は２２に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含む、単離された核酸も提供する。幾つかの実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、五塩基コドン及び四塩基コドンからなる群から選択される。
本発明は、水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、天然においてコードされていないアミノ酸を含む単離されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、前記天然においてコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性リンカーと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた前記天然においてコードされていないアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を示す。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた前記天然においてコードされていないアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性を示す。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基は、アミド結合を通じて、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む天然においてコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、アジド部分を含むポリ（エチレン）グリコール分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレン）グリコール分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａと約５０ｋＤａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は分岐したポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分岐ポリマーの各分岐は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、又は１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。幾つかの実施形態では、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた前記天然においてコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジドン、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸残基はカルボニル部分を含み、水溶性ポリマーはアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸残基はアルキン部分を含み、水溶性ポリマーはアジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸残基はアジド部分を含み、水溶性ポリマーはアルキン部分を含む。
本発明は、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドと、及び医薬として許容される担体とを含む組成物も提供する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、セレクターコドンを含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。幾つかの実施形態において、細胞は、天然においてコードされていないアミノ酸をＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に置換するために、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む。
本発明は、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの発現を許容する条件下で、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチド、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を培養すること、並びに細胞及び／又は培地からＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを精製することを含む。
本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの治療的半減期、血清半減期又は循環時間を増加させる方法も提供する。本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調節する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然に存在するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中の一又はそれ以上の任意のアミノ酸を、天然においてコードされていないアミノ酸と置換することと、及び／又はＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結することを含む。
本発明は、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨ分子の有効量を用いて、このような治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドと医薬として許容される担体とを含む医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、少なくとも一つのアミノ酸が天然においてコードされていないアミノ酸によって置換されていることを除き、配列番号１、２、３若しくは他の任意のＧＨポリペプチド配列中に示されている配列を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態では、前記天然においてコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号３（ｈＧＨ）から得られる残基１−５、８２−９０、１１７−１３４及び１６９−１７６からなる群から選択される位置において置換される。
本発明は、医薬として許容される担体と、及び配列番号１、２、３若しくは他の任意のＧＨポリペプチド配列中に示されている配列を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドとを含み、少なくとも一つのアミノ酸が天然においてコードされていないアミノ酸によって置換されている、医薬組成物も提供する。ある実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、糖質部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、糖質部分を介して、ポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカー、ポリマー又は生物活性分子は、糖質部分を介して、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結されている。
本発明は、共有結合によって、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの単一のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸は、ポリペプチド中に存在する天然においてコードされていないアミノ酸である。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５、９２、１４３又は１４５において置換される。
本発明は、少なくとも一つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸の官能基を通じて前記ポリペプチドに付着されている、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されている。本発明は、一又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸に結合された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、天然においてコードされていないアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれる、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドも提供する。
別の実施形態において、１つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドを、別の分子（ＰＥＧを含むが、これに限定されない。）に結合させることによって、非天然アミノ酸への結合のために使用された一意的な化学的反応のために、実質的に精製されたｈＧＨが得られる。１又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨの、別の分子（ＰＥＧなど）への結合は、実質的に純粋なｈＧＨを提供するための結合工程の前又は後に行われる他の精製技術とともに行ってもよい。
さらに、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーにオキシム結合である共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、このＧＨは、配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列などのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であり、幾つかの実施形態において、前記配列は配列番号２の配列である。このＧＨには、ｐ−アセチルフェニルアラニンであるＮＥＡＡなど、カルボニル基（例えば、ケトン）を含むＮＥＡＡなどの、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むことが可能である。幾つかの実施形態において、オキシム結合は、ＮＥＡＡと水溶性ポリマーの間である。ＧＨは、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換され得る。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、１つ又はそれ以上のポリエチレングリオール（ＰＥＧ）分子を含む。ＰＥＧは、直鎖であり得、例えば、約０．１及び約１００ｋＤａ又は約１及び約６０ｋＤａ又は約２０及び約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量の直鎖ＰＥＧであり得る。幾つかの実施形態においては、ＰＥＧは、分岐ＰＥＧ、例えば、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する分岐ＰＥＧである。幾つかの実施形態において、ＧＨが水溶性ポリマーの複数への共有結合の複数によって連結されており、共有結合の少なくとも１つがオキシム結合である。これらの実施形態の幾つかにおいて、このＧＨは、ヒト成長ホルモン（ＧＨ、例えばｈＧＨ）、例えば、配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列を有するＧＨ、例えばｈＧＨであり、幾つかの実施形態において、前記配列は配列番号２の配列である。ＧＨ、例えばｈＧＨが水溶性ポリマーの複数に連結されている幾つかの実施形態において、ＧＨはＮＥＡＡの複数を含む。
ある種の実施形態において、本発明は、ＧＨ組成物であり、配列番号２の配列を含むＧＨ、例えばｈＧＨを含有し、ＧＨ、例えばｈＧＨが約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されており、前記オキシム結合が配列番号２の位置３５に対応する位置でのｐ−アセチルフェニルアラニンによる置換で形成されている前記ＧＨ組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの直鎖ＰＥＧに、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含有し、このＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、並びに残基１−５、６−３３、３４−７４、７５−９６、９７−１０５、１０６−１２９、１３０−１５３、１５４−１８３及び１８４−１９１からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つのＮＥＡＡを含有する、ホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、前記ＮＥＡＡは、位置１の前（すなわち、Ｎ−末端に）の残基、残基１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１及び１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端に）からなる群から選択される１つ又それ以上の位置において置換されている。幾つかの実施形態において、ＮＥＡＡは、残基３５、９２、１３１、１３４、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている。幾つかの実施形態において、ＮＥＡＡは、残基３０、３５、７４、９２、１０３、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている。幾つかの実施形態において、ＮＥＡＡは、残基３５、９２、１３１、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている。幾つかの実施形態において、ＮＥＡＡは、位置３５において置換されている。ＮＥＡＡの少なくとも１つは、幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。幾つかの実施形態においては、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。
さらに別の実施形態において、本発明は、オキシム結合の形成に適した条件下で、カルボニル基を含むＮＥＡＡを含むＧＨ、例えばｈＧＨを、ＰＥＧオキシアミンと接触させることを含む、オキシム結合を介して水溶性ポリマーへ連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを作製する方法を提供する。ＮＥＡＡは、ケトン基、例えばカルボニルを含有することができる。ＮＥＡＡは、ｐ−アセチルフェニルアラニンであり得る。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応するＧＨ、例えばｈＧＨ中の位置において置換されている。幾つかの実施形態において、ＰＥＧオキシアミンは、モノメトキシＰＥＧ（ＭＰＥＧ）オキシアミンである。幾つかの実施形態において、ＭＰＥＧオキシアミンは、直鎖、例えば、約２０−４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの直鎖ＭＰＥＧである。幾つかの実施形態において、ＭＰＥＧオキシアミンは、直鎖３０ｋＤａのモノメトキシ−ＰＥＧ−２−アミノオキシエチルアミンカルバマート塩酸塩である。幾つかの実施形態において、ＮＥＡＡを含むＧＨ、例えばｈＧＨは、（ｉ）ＧＨ（例えばｈＧＨ）をコードする核酸（核酸は、ＮＥＡＡの取り込み用セレクターコドンを提供するように修飾されている。）及び（ｉｉ）ＮＥＡＡを、（ｉ）の核酸のセレクターコドンに応答して、その細胞機構がＮＥＡＡをタンパク質中に取り込ませることが可能な生物に導入することによって作製される。幾つかの実施形態において、オキシム結合を形成するための反応条件には、ＭＰＥＧ−ＧＨ、例えばｈＧＨ混合物を生成するために、ＭＰＥＧ及びＧＨを、例えば、約４ないし６のｐＨ、約５ないし１０のＭＥＰＧ：ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）比と混合すること、及び約１０ないし５０時間室温で、ＭＰＥＧ−ＧＨ、例えばＭＰＥＧ−ｈＧＨ混合物を穏やかに撹拌することが含まれる。幾つかの実施形態において、本方法は、ＧＨ、例えばｈＧＨを、例えば少なくとも約９９％純粋になるように精製することをさらに含む。
細胞機構には、オルソゴナルｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが含まれるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明は、オキシム結合である共有結合によって少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結された成長ホルモンと、及び医薬として許容される賦形剤とを含むホルモン組成物を含有する医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態において、前記ＧＨは、ＧＨ、例えばｈＧＨである。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ＮＥＡＡを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、直鎖ＰＥＧなどのＰＥＧを含む。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧであり、及びＧＨは、配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されているＧＨ、例えばｈＧＨであり、及びオキシム結合はｐ−アセチルフェニルアラニンとＰＥＧとの間に形成されている。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含有するホルモン組成物の有効量を、治療を必要としている個体に投与することを含み、前記共有結合がオキシム結合である、治療方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ｈＧＨである。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ＮＥＡＡを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、直鎖ＰＥＧなどのＰＥＧを含む。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧであり、及びＧＨが、配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されているｈＧＨであり、及びオキシム結合がｐ−アセチルフェニルアラニンとＰＥＧとの間に形成されている。幾つかの実施形態において、治療される個体はヒトである。幾つかの実施形態において、治療される個体は、小児成長ホルモン欠乏、突発性低身長症、小児期発生の成体成長ホルモン欠乏、成体発生の成体成長ホルモン欠乏又は続発性成長ホルモン欠乏に罹患している。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ｈＧＨである。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ＮＥＡＡを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、直鎖ＰＥＧなどのＰＥＧを含む。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧであり、及びＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されており、及びオキシム結合がｐ−アセチルフェニルアラニンとＰＥＧとの間に形成されている。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量を、治療を必要としている個体に投与することを含み、前記水溶性ポリマーが直鎖ポリマーであり、及び前記ホルモン組成物が、週１回以下、２週に１回以下又は１月に１回以下の頻度で与えられる、治療方法を提供する。幾つかの実施形態において、ポリマーはＰＥＧである。幾つかの実施形態において、ＧＨは、ＮＥＡＡを含む。幾つかの実施形態において、ポリマーは、オキシム結合を介して、ＧＨに連結されている。
幾つかの実施形態において、本発明は、哺乳動物の皮下に投与された場合に、ＧＨ、例えばｈＧＨが少なくとも約１２時間の平均血清半減期を有する、ＧＨ、例えばｈＧＨを含むホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、ＮＥＡＡを含む。幾つかの実施形態において、ホルモン組成物は、ＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧなどの水溶性ポリマーをさらに含有する。
幾つかの実施形態において、本発明は、哺乳動物の皮下に投与された場合に、ＧＨ、例えばｈＧＨが、ＰＥＧを有しないＧＨ、例えばｈＧＨを含む組成物の血清半減期の少なくとも約７倍の平均血清半減期を有する、ＰＥＧに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含むホルモン組成物を提供する。
定義
本発明は、本明細書に記載されている具体的な方法、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、従って、変化し得ることを理解すべきである。本明細書で使用されている用語は、具体的な実施形態を記載するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定する意図ではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。従って、例えば、「ｈＧＨ」という表記は、１つ以上のこのようなタンパク質を表し、当業者に公知のこれらの均等物などを含む。
別段の定義がなければ、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本発明の実施又は検査においては、本明細書に記載されているものと類似又は均等な、あらゆる方法、装置及び材料を使用可能であるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料が記載されている。
本明細書に挙げられている全ての公報及び特許は、例えば、公報中に記載された、本明細書に記載されている発明に関連して使用され得る構築物及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に論述されている公報は、専ら、本願の出願日より前に開示されていることについてのみ提供される。本明細書の記載は、以前の発明に基づいて、又は何らかの理由によって、本発明者らがこのような開示の日付に先行する権利を有しないと認めたものと解釈すべきではない。
「実質的に精製された」という用語は、天然に存在する環境中に、すなわち野生型細胞中又は組換え的に産生されたＧＨ（例えばｈＧＨポリペプチド）の場合には宿主細胞中に見出されるタンパク質に伴われている又は該タンパク質と相互作用する成分を実質的に又は本質的に含み得ないＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを表す。細胞物質を実質的に含まないことができるＧＨ、例えばｈＧＨには、莢雑タンパク質が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量に対して）を有するタンパク質の調製物が含まれる。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％若しくは１％未満で存在し得る。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ若しくは約１ｍｇ／Ｌ未満で、培地中に存在し得る。従って、本発明の方法によって作製された「実質的に精製された」ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動（これらに限定されない。）などの適切な方法によって測定された場合に、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％以上及びそれ以上の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％又はそれ以上の純度レベルを有し得る。
「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、挿入のために使用される方法（例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合又は組換え宿主細胞を作製するための本分野で公知の他の方法）にかかわらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を表す。外来ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えばプラスミドとして維持されることができ、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
本明細書中で使用する「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、Ｅ．コリ又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）宿主細胞及び細胞含有物を含む何らかの宿主細胞を支持し得るか、又は含有し得る、あらゆる培養用培地、溶液、固体、半固体又は強固な支持体を含む。このため、本用語は、宿主細胞をその中で増殖させている培地、例えば、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドがその中に分泌されている培地（増殖工程前又は後の培地を含む。）を包含し得る。本用語は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが細胞内で産生され、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを放出するために宿主細胞が溶解又は破壊される場合など、宿主細胞可溶化液を含有する緩衝液又は試薬も包含し得る。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「還元剤」は、スルフヒドリル基を還元状態に保ち、分子内又は分子間ジスルフィド結合を還元する任意の化合物又は物質として定義される。適切な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン、（２−アミノエタンチオール）及び還元されたグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。様々な還元剤が本発明の方法及び組成物における使用に適していることが、当業者に自明である。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる任意の化合物又は物質として定義される。適切な酸化剤には、酸化されたグルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化されたジチオスレイトール、酸化されたエリスリトール及び酸素が含まれるが、これらに限定されない。様々な酸化剤が本発明の方法における使用に適していることが、当業者に自明である。
「変性試薬」又は「変性剤」とは、本明細書中で使用する場合、タンパク質の可逆的な折り畳み解除を引き起こす、あらゆる化合物又は物質として定義される。変性試薬又は変性剤の強度は、具体的な変性試薬又は変性剤の特性及び濃度の両方によって決定される。適切な変性試薬又は変性剤は、カオトロプ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質又は２つ又はそれ以上のこのような薬剤の組み合わせであり得る。適切なカオトロプには、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどの強い界面活性剤、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの穏やかな陽イオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）又はスルホベテイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルファート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クルルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含む（これらに限定されない。）双性イオン界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノール又はイソプロパノールなどのＣ２−Ｃ４アルカノール）、又は低級アルカンジオール（特に、エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）などの水混和性有機溶媒は、界面活性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又はジヘキサノイルホスファチジルコリン又はジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体若しくはバリアントであり得る。
本明細書において使用される「再折り畳み」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、不適切に折りたたまれ、又は折り畳み解除された状態から、ジスルフィド結合に関して固有の高次構造又は適切に折りたたまれた高次構造へと転換する任意のプロセス、反応又は方法を記載する。
本明細書において使用される「同時折り畳み」とは、互いに相互作用して、折り畳み解除されたポリペプチド又は不適切に折り畳まれたポリペプチドを、適切に折り畳まれた固有のポリペプチドに変換させる少なくとも２つのポリペプチドを使用する再折り畳みプロセス、反応又は方法を具体的に表す。
本明細書において使用される「成長ホルモン」又は「ＧＨ」には、ヒト（ｈＧＨ）、ウシ（ｂＧＨ）、ブタを含む（これらに限定されない。）あらゆる哺乳動物種から得られる成長ホルモン及びニワトリを含む（これに限定されない。）その他の家畜又は農場動物から得られる成長ホルモンの少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質が含まれ、並びに、その生物活性に関わらず、及び組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から作製されるかどうかを問わない。）、インビトロ、インビボ、核酸分子のマイクロインジェクション、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法に関わらず、ＧＨ類縁体、ＧＨイソフォーム、ＧＨ模倣体、ＧＨ断片、ハイブリッドＧＨタンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、バリアント、スプライスバリアント及び変異タンパク質が含まれる。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。典型的な置換には、例えば、固有のｈＧＨの４１位のリジンの置換又は１７６位のフェニルアラニンの置換が含まれる。幾つかの事例では、置換が４１位にある場合には、置換はイソロイシン若しくはアルギニン残基であり得、又は位置が１７６である場合には、チロシン残基である。位置Ｆ１０は、例えば、Ａ、Ｈ又はＩで置換することが可能である。位置Ｍ１４は、例えば、Ｗ、Ｑ又はＧで置換し得る。他の典型的な置換には、
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 を含む（これらに限定されない。）これらの任意の置換又は組み合わせが含まれる。例えば、米国特許第６，１４３，５２３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
天然に存在するｈＧＨ中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換としては、アゴニスト活性を増加させ、プロテアーゼ耐性を増加させ、ポリペプチドをアンタゴニストへ変換するなどの置換が記載されており、「ｈＧＨポリペプチド」という用語によって包含される。
アゴニストＧＨ（例えば、ｈＧＨ配列）には、例えば、以下の修飾、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔを含む、天然に存在するｈＧＨ配列が含まれる。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。さらなるアゴニストｈＧＨ配列には、
Figure 2008525473
 が含まれる。例えば、米国特許第６，０２２，７１１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａに置換を含むｈＧＨポリペプチドは、部位ＩにおいてｈＧＨ受容体に対する親和性を増強する。例えば、米国特許第５，８５４，０２６号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。プロテアーゼに対して増加した耐性を有するｈＧＨ配列には、Ｃ−Ｄループ内の１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む（これに限定されない。）ｈＧＨポリペプチドが含まれる。幾つかの実施形態において、置換には、Ｒ１３４Ｄ、Ｔ１３５Ｐ、Ｋ１４０Ａ及びこれらのあらゆる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、「Ａｌａｍら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：１８３−１９０」を参照。
ヒト成長ホルモンアンタゴニストには、例えば、Ｇ１２０に置換を有するもの（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）及び以下の置換：Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａなどをさらに時折含む。例えば、米国特許第６，００４，９３１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる領域１０６−１０８又は１２７−１２９中に少なくとも１つの置換を含む。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の部位ＩＩ結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、さらに、Ｇ１２０に置換を有する以下の置換：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔを含む（例えば、米国特許第５，８４９，５３５号を参照）。
完全な完全長の天然に存在するヒトＧＨアミノ酸配列並びに成熟した天然に存在するＧＨアミノ酸配列及び天然に存在する変異体については、それぞれ、本明細書中の配列番号１、配列番号２及び配列番号３を参照。幾つかの実施形態において、本発明のＧＨポリペプチド、例えばｈＧＨポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号２と、又は成長ホルモンポリペプチドの他の何れかの配列と実質的に同一である。例えば、幾つかの実施形態において、本発明のＧＨポリペプチド、例えばｈＧＨポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３と、又は成長ホルモンポリペプチドの他の何れかの配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％同一である。幾つかの実施形態において、本発明のＧＨポリペプチド、例えばｈＧＨポリペプチドは、配列番号２と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％同一である。ｈＧＨの天然に存在する多数の変異体が同定されている。これらには、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｕｒｇ， ＤＮＡ １：２３９ （１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、第４，６７０，３９３号及び第４，６６５，１８０号、これらは参照により本明細書中に組み込まれる。）及びｈＧＨの残基３２−４６の欠失を２０−ｋＤａのｈＧＨが含まれる（Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９２５：３１４ （１９８７）； Ｌｅｗｉｓ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３：２６７９−２６８７ （１９７８））。胎盤の成長ホルモンは、「Ｉｇｏｕｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１０）：３９９８ （１９８９）」に記載されている。さらに、タンパク質分解によって切断された又は２鎖バリアントなど（Ｂａｕｍａｎｎ， Ｇ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：４２４ （１９９１））、転写後、翻訳後、分泌、代謝的プロセッシング及び他の生理的プロセスから生じる多数のｈＧＨバリアントが報告されている。Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介して直接連結されたｈＧＨ二量体が、「Ｌｅｗｉｓ， Ｕ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：３６９７−３７０２ （１９７７）； Ｂｒｏｓｔｅｄｔ， Ｐ． ａｎｄ Ｒｏｏｓ， Ｐ．， Ｐｒｅｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９：２１７−２２９ （１９８９）」に記載されている。ｈＧＨ変異体及び変異体ｈＧＨポリペプチドをコードする核酸分子が周知であり、米国特許第５，５３４，６１７号；第５，５８０，７２３号；第５，６８８，６６６号；第５，７５０，３７３号；第５，８３４，２５０号；第５，８３４，５９８号；第５，８４９，５３５号；第５，８５４，０２６号；第５，９６２，４１１号；第５，９５５，３４６号；第６，０１３，４７８号；第６，０２２，７１１号；第６，１３６，５６３号；第６，１４３，５２３号；第６，４２８，９５４号；第６，４５１，５６１号；第６，７８０，６１３号；米国特許出願公開２００３／０１５３００３号（参照により、明細書中に組み込まれる。）。
ｈＧＨの市販の調製物が、ＨｕｍａｔｒｏｐｅTM（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ＮｕｔｒｏｐｉｎTM（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎTM（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎTM（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／ＳｅｒｏｓｔｉｍTM（Ｓｅｒｏｎｏ）という名称で販売されている。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、天然に存在するｈＧＨの、医薬として許容される塩及びプロドラッグ、並びに前記塩のプロドラッグ、多形体、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性なバリアント及び立体異性体並びに天然に存在するｈＧＨのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそのポリペプチド融合物も含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又は両方に追加のアミノ酸を含む融合物は、「ｈＧＨポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、例えば、組換え発現から得られたｈＧＨのＮ末端にメチオニンが連結されたメチオニル成長ホルモン、分泌シグナルペプチド又はそれらの一部を欠如するｈＧＨの成熟型、精製のための融合物（ポリヒスチジン又はアフィニティーエピトープが含まれるが、これらに限定されない。）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物が含まれるが、これらに限定されない。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３７３号は、成長ホルモン及びそれらの各受容体分子に対する変化した結合特性を有する抗体断片バリアントなどの新規タンパク質を選択するための方法を記載している。本方法は、線状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のカルボキシ末端ドメインに、目的のタンパク質をコードする遺伝子を融合することが含まれる。
様々な参考文献が、ポリマー結合又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、ＰＥＧなどのポリマーに結合されたポリペプチドが含まれ、システイン、リジン又は他の残基の１つ以上の追加の誘導体化から構成され得る。さらに、ｈＧＨポリペプチドは、リンカー又はポリマーが結合しているアミノ酸が本発明の非天然アミノ酸であり得るか、又はリジン若しくはシステインへの結合など、本分野で公知の技術を用いて天然においてコードされていないアミノ酸へ結合され得るリンカー又はポリマーを含み得る。
ｈＧＨポリペプチドのポリマー結合が報告されている。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号、第６，１３６，５６３号及び６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。米国特許第４，９０４，５８４号は、少なくとも１つのリジン残基が欠失され、又は他の何れかのアミノ酸残基で置換されている、ＰＥＧ化された、リジン除去されたポリペプチドを開示している。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質上の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されており、及び該タンパク質がタンパク質への結合を達成するのに十分な条件下でＰＥＧと接触される、タンパク質にＰＥＧを結合する方法を開示している。ＷＯ９９／０３８８７号は、システイン残基がポリペプチドの指定された領域中に位置する非必須アミノ酸残基で置換されている、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化されたバリアントを開示している。ＷＯ００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比べて、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含む、アレルギー誘発性が低減された、グリコシル化されたポリペプチドバリアントを製造する方法を開示している。米国特許第５，２１８，０９２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、固有ポリペプチドに比べて、少なくとも１つの追加の炭水化物鎖を導入するために、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び他のポリペプチドを修飾することを開示している。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、何れかのアミノ酸位置がグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ−結合型又はＯ結合型グリコシル化形態などのグリコシル化されたｈＧＨが含まれるが、これらに限定されない。単一のヌクレオチド変化を含有するバリアントも、ｈＧＨポリペプチドの生物学的に活性なバリアントとして考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された、又は融合タンパク質として発現された、１つ又はそれ以上の何れかのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド又は他のあらゆるポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド又はあらゆる種類の他の生物活性分子のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体及び例えば、特異的な欠失又は他の修飾を含有するが、生物活性をなお維持するポリペプチド類縁体も含まれる。
本明細書に記載されているＧＨ、例えばｈＧＨ中のアミノ酸位置に対する全ての表記は、別段の記載（すなわち、比較が配列番号１、３又はその他のｈＧＨ配列に基づいていると記載されている場合）がなければ、配列番号２中の位置に基づいている。当業者であれば、配列番号１、２、３又は他の何れかのＧＨ配列中の位置に対応するアミノ酸位置は、ＧＨ又はｈＧＨ融合物、バリアント、断片などの他の何れかのＧＨ、例えばｈＧＨ分子中に容易に同定可能であることが自明である。配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列中の位置と対応する、タンパク質中の特定の位置を整列及び同定するために、例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列整列プログラムを使用することが可能である。配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列に関して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失又は付加は、本明細書に記載され又は本分野で公知のＧＨ、又はｈＧＨ融合物、バリアント、断片などの対応する位置の置換、欠失又は付加も表すものとして、本発明によって明示的に包含される。
「ｈＧＨポリペプチド」又は「ｈＧＨ」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。本発明のｈＧＨポリペプチドは、１又はそれ以上の非天然アミノ酸修飾とともに、１つ又はそれ以上の天然アミノ酸を用いた修飾から構成され得る。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、プロテアーゼ感受性を減少する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換するなど（これらに限定されない。）、ｈＧＨポリペプチドの生物活性の１つ又はそれ以上を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然に存在するｈＧＨポリペプチド中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ｈＧＨポリペプチド」という用語によって包含される。
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換若しくは位置１に（すなわち、Ｎ末端に）付加又はこれらのあらゆる組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の任意のＧＨ配列中に対応するアミノ酸）を有するものが含まれるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中の少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部内の残基が含まれる。別の実施形態において、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの天然においてコードされていないアミノ酸との、Ｇ１２０の置換。他の実施形態において、上掲の置換は、ｈＧＨポリペプチドを、ｈＧＨアンタゴニストにするさらなる置換と組み合わされる。例えば、天然においてコードされていないアミノ酸は、本明細書中に同定された位置の１つにおいて置換され、同時の置換がＧ１２０に導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ＧＨ又はｈＧＨポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換又は欠失をさらに含む。例えば、付加、置換又は欠失は、ＧＨ、例えばｈＧＨの１又はそれ以上の特性又は活性を調節し得る。例えば、付加、置換又は欠失は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節し、受容体の二量体化を調節し（増加又は減少させることを含むが、これらに限定されない。）、受容体の二量体を安定化し、循環半減期、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出若しくは生物学的利用可能性を調節し、精製を促進し、又は投与の具体的経路を改善若しくは改変し得る。同様に、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、本ポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない。）、精製又は他の形質を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限定されない。）又はアフィニティーを基礎とした他の配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない。）又は連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない。）を含み得る。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、天然においてコードされていないアミノ酸側鎖を介して、同一若しくは別異の天然においてコードされていないアミノ酸側鎖に、天然にコードされているアミノ酸側鎖に直接的に連結されたもの又はリンカーを介して間接的に連結されたものなど、連結されたホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含される。典型的なリンカーには、小有機化合物、ポリ（エチレングリコール）若しくはポリデキストランなどの様々な長さの水溶性ポリマー又は様々な長さのポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
「天然においてコードされていないアミノ酸」とは、２０の共通アミノ酸うちの一つ又はピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）又はセレノシステインでないアミノ酸を表す。「天然においてコードされていないアミノ酸」という用語と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不天然アミノ酸」、「天然において存在しないアミノ酸」、並びに様々にハイフンが付されたそのバージョン及びハイフンが付されていないそのバージョンである。「天然においてコードされていないアミノ酸」という用語には、天然にコードされているアミノ酸（２０の共通アミノ酸又はパイロリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない。）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じ、それ自体は、成長しているポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって本来取り込まれないアミノ酸も含まれるが、これに限定されない。このような天然において存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に付着させることが可能なあらゆる分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどの様々な水溶性ポリマー、ぺプチド若しくはタンパク質又はペプチドの血清半減期を増加させるその他の部分が含まれるが、これらに限定されない。
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語は、明確な、確定可能な部分又は単位を表すために、本分野及び本明細書において使用されている。前記用語は、化学の分野においてある程度同義的であり、何らかの機能又は活性を発揮し、他の分子と反応する分子の部分を表すために本明細書に使用される。
本明細書において「結合」又は「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を表すために使用され、典型的には、共有結合である。加水分解に対して安定な結合とは、該結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下を含む（これに限定されない。）有用なｐＨ値で、長期にわたって、おそらくは永久に水と反応しない結合を意味する。加水分解に対して不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が、水又は例えば、血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が１つまたはそれ以上の酵素によって分解可能であることを意味する。本分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の１つまたはそれ以上との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸の、生物活性因子上のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は、一般に、生理的条件下で加水分解されて、前記因子を放出する。加水分解によって分解可能な他の結合には、カルボナート結合；アミンとアルデヒドの反応から得られたイミン結合；アルコールとホスファート基との反応によって形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（ＰＥＧなどのポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合；及びホスホルアミダイト基（ポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれるが、これらに限定されない。
「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性因子」という用語は、本明細書中で使用する場合、以下に限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物及びヒトを含む、生物系、生物に関連する、経路、分子もしくは相互作用の何らかの身体的又は生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本明細書中で使用する場合、生物活性分子には、以下に限定されないが、ヒトもしくは動物における疾患の、診断、治療、緩和、処置もしくは予防のための、又は、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を促進するためのあらゆる物質が含まれる。生物活性分子の例には、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子又は分子、顔料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物活性因子のクラスには、以下に限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれる。
「二官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを表す。第一の生物活性成分と、二官能性リンカーと、及び第二の生物活性成分とを含む結合体を形成するために、ある生物活性成分上の基と反応する１つの官能基と、第二の生物成分上の基と反応する別の基とを有する二官能性リンカーを使用することができる。ペプチドに様々な化合物を付着するための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８４号；第４，６８０，３３８号及び第４，５６９，７８９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。「多官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つ以上の別個の官能基を含むポリマーを表す。二官能性ポリマー又は多官能性ポリマーは、あらゆる所望の分子長又は分子量であってもよく、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ分子に連結された１つ以上の分子の間に特定の所望されるスペース又は立体構造を提供するように選択され得る。
置換基が、左から右へ書かれた慣用の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左へ構造を書くことによって得られる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と等価である。
「置換基」という用語は、以下に限定されないが、「非妨害置換基」を含む。「非妨害置換基」は、安定な化合物を生じる基である。適切な非妨害置換基又はラジカルには、以下に限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは１から８である。）、アリール、置換されたアリール、置換されたアルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換された複素環基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、各ｍは１から８である。）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、これらの塩などが含まれる。各Ｒは、本明細書中で使用する場合、Ｈ、アルキルもしくは置換されたアルキル、アリールもしくは置換されたアリール、アラルキル又はアルカリールである。
「ハロゲン」という用語には、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素が含まれる。
「アルキル」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、別段の断りがない限り、直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状炭化水素基又はこれらの組合せを意味し、完全に飽和、モノ又はポリ不飽和であり得、指定の炭素原子数を有する（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する。）、二価及び多価の基を含み得る。飽和炭化水素基の例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体及び異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１又はそれ以上の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、以下に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及びこれらより高級の相同体及び異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、別段の注記がない限り、「ヘテロアルキル」など、下記でさらに詳細に定義するアルキルの誘導体を含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ぶ。
「アルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、アルカン由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、構造−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられ、さらに、「ヘテロアルキレン」として下記で述べる基が含まれる。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１から２４個までの炭素原子を有するが、１０個又はそれ以下の炭素原子を有する基が、本明細書に記載されている方法及び組成物の具体的な実施形態である。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル又はアルキレン基であり、通常、８個又はそれ以下の炭素原子を有する。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、これらの慣用の意味で使用し、分子の残りの部分にそれぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子を介して結合されたアルキル基を指す。
単独で又は別の用語と組み合わされた「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記載がなければ、表記の炭素原子数と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも一つの複素原子とからなり、窒素原子及び硫黄原子が場合により酸化されていてもよく、窒素複素原子が場合により四級化されていてもよい、安定な直鎖若しくは分枝鎖若しくは環状炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味する。複素原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置又はアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置され得る。例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれるが、これらに限定されるものではない。最大２個の複素原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ−（ＣＨ３）３のように、連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、同一又は別異の複素原子が、鎖末端の一方又は両方を占めることも可能である（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含むが、これらに限定されない。）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単独で又は他の用語と組み合わせて、別段の断りがない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状形態を表す。従って、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルには、飽和、部分及び完全不飽和環結合が含まれ得る。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、複素原子は、複素環が分子の残部に付着されている位置を占めることが可能である。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、本用語は、二環式及び三環式の環構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキル由来の二価の基を意味し、「シクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、シクロアルキル由来の二価の基を意味する。
本明細書中で使用する場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中で可溶性であるあらゆるポリマーを指す。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドへの水溶性ポリマーの結合は、非修飾形態に比べて、増加若しくは調節された血清半減期、又は増加若しくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、凝集及び多量体の形成、改変された受容体結合並びに改変された受容体二量体化又は多量体化などの調節された物理的会合特性を含む（これらに限定されない。）変化をもたらすことが可能である。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有していてもよく、又は有していなくてもよく、以下に限定されないが、１もしくはそれ以上のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド又は１もしくはそれ以上の生物活性分子を含む他の物質へのＧＨ、例えばｈＧＨの付着のためにリンカーとして利用され得る。適切なポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載（本明細書中に参照により組み込む。）。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（以下に限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールとそれらの誘導体とのコポリマー、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど又はそれらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの誘導体を指す。「ポリアルキレングリコール」及び／又は「ポリエチレングリコール」という用語は、直鎖及び分岐ポリマーの両方、並びに０．１ｋＤａないし１００ｋＤａの平均分子量を包含する。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）」など、供給業者のカタログに列記されている。
「アリール」という用語は、別段の断りがない限り、単環又は多環式（１から３環が含まれるが、これらに限定されない。）であり得る、一緒に縮合するか又は共有結合している、ポリ不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から４個までの複素原子を含有し、窒素及び硫黄原子が場合により酸化されており、並びに窒素原子が場合により四級化されているアリール基（又は環）を表す。ヘテロアリール基は、複素原子を通じて分子の残部に付着させることが可能である。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが含まれる。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下に記載されている許容される置換基の群から選択される。
簡略のため、他の用語と組み合わせて使用される場合（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含むが、これらに限定されない。）、「アリール」という用語は、上記定義のアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。従って、「アリールアルキル」という用語は、アリール基がアルキル基（炭素原子（メチレン基を含むが、これに限定されない。）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むが、これらに限定されない。）に付着された基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが含まれるが、これらに限定されない。）を含むものとする。
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」を含むが、これらに限定されない。）は、表記されている基の置換された形態及び置換されていない形態の両方を含むものとする。基の各種類に対する典型的な置換基が、以下に記載されている。
アルキル及びヘテロアルキル基に対する置換基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む。）は、０から（２ｍ’＋１）（ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である。）までの範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される様々な一又はそれ以上の基とすることができるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含むが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが含まれるが、これらに限定されない。）、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できる。
アルキル基に対して述べた置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基に対する置換基は、様々であり、以下に限定されないが、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（０から芳香環系におけるオープンバレンスの総数の範囲の数で、；並びにＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。）から選択される。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。
本明細書において使用される、「調節された血清半減期」という用語は、修飾されていない形態に比した、修飾されたｈＧＨの循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、ＢＳＰの投与後の様々な時点に血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間の相関関係は、血清半減期の計算を可能とする。望ましくは、増加された血清半減期は、少なくとも約２倍を有するが、それより小幅な増加も有用であり得、例えば、これにより、満足のいく投与計画を可能とするか、又は毒性の影響を避けることができる。幾つかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍である。
「調節された治療半減期」という用語は、本明細書中で使用する場合、その非修飾形態と比較して、ｈＧＨポリペプチドの治療的有効量の半減期が正又は負に変化することを意味する。治療半減期は、投与後に、様々な時点で分子の薬物動態及び／又は薬力学特性及びを測定することにより決定される。増加された治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬治療、特定の有益な総投薬を可能とし、又は所望でない効果を回避する。幾つかの実施形態において、効力の増強、その標的に対する修飾された分子の結合の増加又は減少、このようなプロテアーゼなどの酵素による分子の増加若しくは減少した分解、又は非修飾分子の別のパラメータもしくは作用機構の増加若しくは減少の結果、治療半減期が延びる。
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用される場合、核酸若しくはタンパク質が自然の状態で随伴している他の細胞成分の少なくとも幾つかを、該核酸若しくはタンパク質が含まないことを表し、又はそのインビボ若しくはインビトロ産生の濃度より大きなレベルまで該核酸若しくはタンパク質が濃縮されていることを表す。これは、均質な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態又は溶液（水溶液を含むが、これに限定されない。）とすることができる。単離された物質は、さらなる医薬として許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物の成分であり得る。純度及び均質性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析的化学技術を用いて測定されている。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、該遺伝子に隣接し、対象遺伝子とは別のタンパク質をコードする読み取り枠から分離されている。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に一つのバンドを生じることを表す。特に、「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％又はそれ以上純粋であることを意味し得る。
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びこれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオアート、ホスホロアミダートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ又はそれ以上（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ２６０５−２６０８（１９８５）；ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１−９８（１９９４））。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書において互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに対する記載は、ペプチドという記載及びタンパク質という記載に対しても等しく適用され、逆も同様である。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び１又はそれのアミノ酸残基が天然においてコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、あらゆる長さ（完全長タンパク質を含む。）のアミノ酸鎖を包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び天然において存在しないアミノ酸並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにパイロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合されているα炭素）を有する化合物を表し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを表す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基礎的化学構造を保持している。
本明細書では、アミノ酸は、一般に知られている三文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている一文字記号の何れかによって表記され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受容されている一文字コードによって表記され得る。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方について適用される。ある核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を表し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンによって指定されている全ての場所で、該コドンは、コードされているポリペプチドを変化させずに、任意の対応する記載されているコドンへと変化させることができる。このような核酸の変化は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。この明細書において、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）は、修飾して、機能的に同一の分子を得ることが可能であることを認識できる。このように、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載された配列に言わずとも含れる。
アミノ酸配列について、当業者は、コードされている配列中の単一アミノ酸又はアミノ酸の僅かな割合を変化し、付加し又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への各置換、欠失又は付加は、変化がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加又は化学的に類似するアミノ酸へのアミノ酸の置換をもたらすとき、「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解する。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、当業者に周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、さらに、本発明の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子であり、これらを除外するものではない。
機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、当業者に公知である。以下の８つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．； ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）参照）。
「同一」又はパーセント「同一」という用語は、２又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２又はそれ以上の配列又はサブ配列を指す。以下の配列比較アルゴリズム（又は当業者が利用可能なその他のアルゴリズム）の一つを用いて、又は手で整列し、目で調べることによって測定された場合に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたり、最大の一致度を比較し、並列したときに、当該配列が、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの一定パーセント（すなわち、指定された領域にわたって、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の同一性）を有すれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補物も表す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は７５ないし１００アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、又は、明記されていない場合には、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの配列全体わたって存在することが可能である。
配列比較のために、通常、ある配列が基準配列としての役割をし、この配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、サブ配列座標を指定し、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用することが可能であり、又は別のパラメータを指定することが可能である。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２０から６００まで、通常約５０から２００まで、より一般に約１００から１５０までからなる群から選択される連続する位置の数の任意の一つのセグメントを表し、比較ウインドウの中で、２つの配列が最適に配列された後に、これら配列は連続位置の同じ番号の基準配列について比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当業者に公知である。以下に限定されないが、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は手動でのアラインメント及び目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５、付録）を含む方法により、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。
パーセント配列同一性及び配列同一性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、それぞれ、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２」及び「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０」に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｋｈ．ｇｏｖのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を通じて、公に頒布されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）、１０の予測値（Ｅ；ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低複雑度」のフィルターをオフにして行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一指標は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で一致が偶発的に生じ得る確率の指標を与える。例えば、基準核酸に対して試験核酸を比較した場合に、最少合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であり得る場合、核酸は基準配列と類似していると考えられる。
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」という用語は、その配列が複雑な混合物中（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むが、これらに限定されない。）に存在する場合には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が、あるヌクレオチド配列のみに結合し、二重鎖を形成し、又はハイブリダイズすることを表す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本分野で公知であるように、低いイオン強度と高い温度の条件下での、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくはその他の核酸模倣体の配列又はこれらの組み合わせのハイブリダイーゼションを表す。典型的に、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複雑な混合物（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。）中のその標的サブ配列にハイブリダイズするが、複雑な混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい手引きは、「Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）」に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５ないし１０℃低いように選択される。Ｔｍとは、（標的配列は過剰に存在し、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有されるので）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、短いプローブ（１０ないし５０ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約３０℃、長いプローブの場合（５０ヌクレオチド超を含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、場合によりバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようにすることができる。４２℃でインキュベートする５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ又は６５℃でインキュベートする５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ中で洗浄し、及び６５℃の０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。このような洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分又はそれ以上行うことが可能である。
本明細書において使用される、「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含むが、これらに限定されない。）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含むが、これらに限定されない。）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などの系統発生学的ドメインで真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を表す。
本明細書中で使用する場合、「非真核生物」という用語は、非真核の生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（以下に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ）、Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーミス・サーモフィルス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バシラス・ステロサーモフィルス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エルギノーサ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ）などが含まれる。）系統発生ドメイン、又は古細菌（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、[Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ（ハロフェラクス・ボルカニ）及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）種ＮＲＣ−１などの]Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（アルケログロブス・フルギドゥス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ピロコッカス・フリオサス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ピロコッカス・ホリコシ）、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（ユーロピルム・ペルニクス）系統発生ドメインなどを含む。）に属し得る。
本明細書において使用される「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物、幾つかの実施形態において哺乳動物及び別の実施形態においてヒトを表す。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、治療されている、疾病、症状又は疾患の症候の１つ又はそれ以上をある程度緩和する、投与されている非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、強化的及び／又は治療的処置のために投与することが可能である。
「強化する」又は「強化すること」という用語は、所望の効果の強度又は持続時間の何れかを増加又は延長させることを意味する。従って、治療薬の効果を促進するということに関して、「強化すること」という用語は、系において他の治療薬の強度又は持続時間、効果を増大又は延長させる能力を表す。本明細書において使用される「強化有効量」とは、所望の系において、別の治療剤の効果を強化するのに十分な量を表す。患者に使用される場合、この使用に対して有効な量は、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。
本明細書において使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、アミノ酸組成、化学的構造に対する変化、ポリペプチドの翻訳時修飾又は翻訳後修飾など、あるポリペプチドに対して施された任意の変化を表す。「（修飾された）」形態という用語は、論述されているポリペプチドが場合によって修飾されていること、すなわち、論述されているポリペプチドは修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいことを意味する。
「翻訳後修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、このようなアミノ酸に起こる、天然又は非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、一例に過ぎないが、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾及びインビトロ翻訳後修飾を包含する。
予防的な適用において、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、ある疾病、疾患又は症状が発生しやすい又はそうでなければこれら疾病、疾患又は症状のリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防的有効量」であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。このような予防的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる「保護基」又は部分の存在を指す。保護基は、保護されている化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど）であり得る。本分野において公知の他の保護基も、本明細書に記載されている方法及び組成物中で又は本明細書に記載されている方法及び組成物とともに使用することができ、Ｎｖｏｃ及びＭｅＮｖｏｃなどの光解離性の基が含まれる。本技術分野で公知のその他の保護基もまた、本明細書に記載されている方法及び組成物において、または本明細書に記載されている方法及び組成物とともに使用し得る。
例として、ブロッキング／保護基は、以下から選択され得る。
Figure 2008525473
他の保護基は、「Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄ． ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９９」に記載されている、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
治療的な適用において、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、疾病、症状又は疾患に既に罹患している患者に、該疾病、疾患又は症状の症候を治癒し又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。このような治療的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを表すために使用される。
本明細書に記載されている天然においてコードされていないアミノ酸ポリペプチドには、天然に通常見出される原子量又は質量数とは異なる原子量又は質量数を有する原子によって置換された１つ又はそれ以上の原子で同位体標識された化合物が含まれ得る。本発明の化合物中に取り込まれ得る同位体の例には、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、８Ｆ、３６Ｃｌなど、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素及び塩素などの同位体が含まれる。本明細書中に記載されている同位体標識されたある種の化合物、例えば、その中に３Ｈ及び１４Ｃなどの放射性同位体が取り込まれている化合物は、薬物及び／又は基質の組織分布アッセイにおいて有用であり得る。さらに、重水素、すなわち、２Ｈなどの同位体での置換は、より大きな代謝安定性、例えば、増加したインビボ半減期又は減少した投薬の必要性に起因するある種の治療的な利点を与えることができる。
ジアステレオマー、鏡像異性体及びこれらの混合物を含む（これらに限定されない。）全ての異性体が、本明細書中に記載されている組成物の一部と考えられる。追加の又はさらなる実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、必要とする生物に投与した際に代謝され、所望の効果（所望の治療効果を含む。）を生じさせるためにその後使用される代謝物を産生する。さらなる又は追加の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸ポリペプチドの活性な代謝物である。
幾つかの状況において、天然においてコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在し得る。さらに、本明細書中に記載されている天然においてコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、溶媒和されていない形態で、及び水、エタノールなどの医薬として許容される溶媒で溶媒和された形態で存在することが可能である。溶媒和された形態も、本明細書に開示されていると考えられる。当業者は、本明細書中の化合物の幾つかが数個の互変異性形態で存在できることを認める。このような互変異性体形態の全てが、本明細書中に記載された組成物の一部と考えられる。
別段の記載がなければ、本分野の技術に属する質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ，タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用法が使用される。
詳細な説明
Ｉ．序論
本発明において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨ分子が提供される。本発明のある種の実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、特定の反応基に対して適切であることが当業者に公知である化学の方法を利用した、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類縁体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレートする基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せなどの（これらに限定されない。）、第二の反応性基を含む分子を、第一の反応性基を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸へ付着することを含む。例えば、第一の反応性基はアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、アセチレン部分と称される場合もある。）を含むが、これに限定されない。）であり、前記第二の反応性基はアジド部分であり、［３＋２］環状付加化学方法が使用される。別の例では、前記第一の反応性基はアジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない。）であり、第二の反応性基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのある種の実施形態では、少なくとも一つの翻訳後修飾を含む少なくとも一つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない。）が使用され、この場合、少なくとも一つの翻訳後修飾は糖質部分を含む。ある種の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞又は非真核細胞中、インビボで行われる。
ある一定の実施形態において、タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、別の宿主細胞種によっては通常行われない。ある一定の実施形態において、タンパク質は、ある真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、非真核細胞によっては通常行われない。翻訳後修飾の例には、以下に限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（オリゴ糖は（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）などを含むが、これに限定されない。）のアスパラギンへの付着を含む。別の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の、セリン又はスレオニンへの結合を含む。ある一定の実施形態において、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含むことができる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’−最適化された真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ Ａ分泌シグナル配列及びファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ ＧＩＩＩ及びＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）及びトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａが挙げられる。
目的のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの又は１０若しくはそれ以上の非天然アミノ酸を含有することが可能である。非天然アミノ酸は、同一又は別異とすることが可能であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能である。ある種の実施形態において、タンパク質の天然に存在する様式中に存在する、少なくとも１つ、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
本発明は、天然においてコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を含む、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー、特にｈＧＨを基礎とする方法及び組成物を提供する。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー中に天然にコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を導入することによって、１つ以上の天然においてコードされていないアミノ酸など（これに限定されない。）との特異的化学反応を伴うが、一般に存在する２０アミノ酸とは反応しない結合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）化学の適用が可能となる。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーは、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結されている。本発明は、ケトン、アジド又はアセチレン部分など（これに限定されない。）、天然において取り込まれている２０個のアミノ酸中には見出されない官能基又は置換基を含有するアミノ酸など（これらに限定されない。）、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、セレクターコドンに応答してタンパク質中に、選択的に取り込み、これらのアミノ酸を、適切に反応性を有するＰＥＧ誘導体でその後修飾することを含む、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾する極めて効率的な方法を提供する。一旦取り込まれれば、次いで、このアミノ酸側鎖は、天然においてコードされていないアミノ酸中に存在する官能基又は置換基に適していることが当業者に公知の化学方法を使用することによって修飾することができる。多様な公知の化学方法が、水溶性ポリマーをタンパク質中に取り込むために本発明において使用するのに適している。このような方法には、それぞれ、アセチレン又はアジド誘導体など（これらに限定されない。）とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応が含まれる（例えば、Ｐａｄｗａ． Ａ． ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｖｏｌ． ４， （１９９１） Ｅｄ． Ｔｒｏｓｔ， Ｂ． Ｍ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ． １０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ， Ｒ． ｉｎ １．３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｖｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （１９８４） Ｅｄ． Ｐａｄｗａ， Ａ．， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． １−１７６参照）。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加方法は、求核置換反応ではなく、環化付加を含むので、タンパク質は、極めて高い選択性で修飾することが可能である。該反応は、Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することによって、優れた立体選択性（１，４＞１，５）を有する水性条件において、室温で実施することが可能である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈａｍ． ６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１ ：２５９６−２５９９」；及びＷＯ ０３／１０１９７２を参照されたい。［３＋２］環化付加を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子には、アジド又はアセチレン誘導体など（これらに限定されない。）の適切な官能基又は置換基を有する実質的に全ての分子が含まれる。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アセチレン基を有する非天然アミノ酸、又は、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アジド基を有する非天然アミノ酸に付加されることが可能である。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化から得られる５員環は、還元環境では、一般に可逆的でなく、水性環境中では長期間、加水分解に対して安定である。従って、様々な物質の物理的及び化学的特性は、本発明の活性なＰＥＧ誘導体を用いて、要求度の高い水性条件下で修飾することができる。さらに重要なことに、アジドとアセチレン部分は互いに対して特異的であるので（及び、例えば、遺伝子によってコードされている２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない。）、タンパク質は、極めて高い選択性で、一又はそれ以上の特異的な部位において修飾されることが可能である。
本発明は、ＰＥＧ誘導体の水溶性且つ加水分解に対して安定な誘導体及び一つ又はそれ以上のアセチレン又はアジド部分を有する関連の親水性ポリマーも提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答して、タンパク質中に選択的に導入されたアジド部分との結合に対して高度に選択的である。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答し、タンパク質中に選択的に導入されるアセチレン部分との結合に対して高度に選択的である。
より具体的には、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジド及びこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレン並びにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。
本発明は、他の物質（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質などを含むが、これらに限定されない。）との、多様な官能基、置換基又は部分を有する物質の結合体を提供する。本発明には、アジド又はアセチレン部分を有する物質の、対応するアセチレン又はアジド部分を有する物質の、ＰＥＧポリマー誘導体との結合体も含まれる。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能性を有する遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有するタンパク質中の位置において、生物活性分子へ結合することが可能である。ＰＥＧと生物活性分子を結合させる連結には、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加産物が含まれるが、これに限定されない。
ＰＥＧは、生物材料の表面を修飾するために使用できることが本分野では十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ， Ｒ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．， ３（１）：１２５−１３６（２０００）参照、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。）。本発明には、１つ又はそれ以上の反応性アジド又はアセチレン部分を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化結合を介して、該表面に結合された本発明のアジド又はアセチレン含有ポリマーの１つ又はそれ以上とを含む生物材料も含まれる。生物材料及び他の物質は、その後の反応に利用可能なアジド又はアセチレン部分を残すために、カルボン酸、アミン、アルコール又はチオール部分を含む結合を介してなど、アジド又はアセチレン結合以外の結合を介して、アジド又はアセチレン活性化されたポリマー誘導体に結合することも可能である。
本発明には、本発明のアジド及びアセチレン含有ポリマーを合成する方法も含まれる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一つの末端にアジド部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、より反応性の高い部分（メシラート、トレシラート、トシラート又はハロゲン脱離基など）をその上に有する置換されたポリマーを生成する。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子及び他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者に周知である。得られた置換されたポリマーは、次いで、反応を行って、ポリマーの末端にあるアジド部分を、さらに反応性の高い部分に置換する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、及びアジド部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアジドを有する連結剤と反応を行う。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシラート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどの求核及び求電子部分は、当業者に公知である。
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲン又は他の活性化された脱離基を除去する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、及びアセチレン部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアセチレンを有する連結剤と反応を行う。有機合成におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核及び求電子部分の使用並びにＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者にとって十分に確立されている。
本発明は、ＰＥＧ及びアジド又はアセチレン部分を含有するＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマーを含む（これらに限定されない。）他の物質を、修飾されたタンパク質に付加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法も提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解度及び免疫原性の欠如が重要である、一方、同時に、本分野で既に公知であるタンパク質にＰＥＧ誘導体を付着するさらに選択的な手段を与えながら、表面及び分子の特性を修飾するために使用することが可能である。
ＩＩ．成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリー
以下のタンパク質には、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質（Ｂａｚａｎ， Ｆ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９０）；Ｂａｚａｎ， Ｊ． Ｆ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１３（１９９２）；Ｍｏｔｔ， Ｈ． Ｒ． ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ． Ｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ， Ｏ． ａｎｄ ＩｈＩｅ， Ｊ． Ｎ．， ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ（１９９６））：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、αインターフェロン、βインターフェロン、εインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）など、が含まれる。本遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、遺伝子クローニング及び配列決定を通じて、将来同定されることが理解される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般に、限定的なアミノ酸又はＤＮＡ配列の同一性を有するという事実に関わらず、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、類似の二次構造及び四次構造を有する。共有された構造的特徴によって、遺伝子ファミリーの新たなメンバーを容易に同定することが可能となり、本明細書に記載されている非天然アミノ酸方法及び組成物が同様に当てはまる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの間の構造的相同性の程度に鑑みれば、天然においてコードされていないアミノ酸は、本発明を用いて、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバー中に取り込まれ得る。タンパク質の本ファミリーの各メンバーは、その構造が図１に示されている４ヘリックスバンドルを含む。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＦＮα−２及びＧ−ＣＳＦｎｏ一般的構造は、それぞれ、図２、３、４及び５に示されている。
Ｇ−ＣＳＦ（Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１４：４３５（１９９２）；Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：８４５３（１９９４）；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５１６７（１９９３））、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １５４：１７７９−１７８２（１９９１）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２２４：１０７５−１０８５（１９９２））、ＩＬ−２（Ｂａｚａｎ， Ｊ． Ｆ． ａｎｄ ＭｃＫａｙ， Ｄ． Ｂ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１３（１９９２）、ＩＬ−４（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１１０２９−１１０３５（１９９１）；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７３−１６７７（１９９２））及びＩＬ−５（Ｍｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：１７２−１７６（１９９３））を含む多数のサイトカインの構造が、Ｘ線回折及びＮＭＲ研究によって決定されており、著しい一次構造相同性の欠如にも関わらず、ＧＨ構造との顕著な保存を示している。ＩＦＮは、モデリング及び他の研究に基づいて、このファミリーのメンバーであると考えられている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１５：３４１（１９９５）；Ｍｕｒｇｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：６２（１９９３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１４５３（１９９６）；Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２７４：６６１（１９９７））。ＥＰＯは、モデリング及び変異誘発研究に基づいて、このファミリーのメンバーであると考えられている（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１５９８３−１５９９３（１９９３）；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２２８３９−２２８４６（１９９４））。現在では、上記サイトカイン及び成長因子の全てが、１つの巨大な遺伝子ファミリーを含むと考えられている。
類似の二次構造及び四次構造を共有していることに加え、本ファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために細胞表面受容体をオリゴマー化しなければならないという特性を共有している。ＧＨ及びＥＰＯを含む（これらに限定されない。）幾つかのＧＨファミリーメンバーは、受容体の単一種類に結合し、これホモ二量体とする。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６を含む（これらに限定されない。）他のファミリーメンバーは、受容体２種類以上を結合し、受容体に、ヘテロ二量体又はこれより高次の凝集物を形成させる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８；Ｐａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）， ＥＭＢＯ Ｊ． １４：１９４２−１９５１；Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５））。変異誘発研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカイン及び成長因子が、複数の（通例、２個の）受容体結合部位を含有し、それらのコグネート受容体に順次結合する（Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９３：９４７１−９４７６））。ＧＨ同様に、これらの他のファミリーメンバーに対する一次受容体結合部位は、主に、４つのαヘリックス及びＡ−Ｂループ中に存在する。受容体結合に関与するヘリックスバンドル中の具体的アミノ酸は、ファミリーメンバーの間で異なる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面受容体の多くは、構造的に関連しており、第二の巨大マルチ遺伝子ファミリーを構成する。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの様々なメンバーの変異研究から到達される一般的な結論は、αヘリックスを連結しているループは、一般に、受容体結合に関与していない傾向があるということである。特に、短いＢ−Ｃループは、全てではないとしても、ほとんどのファミリーメンバーにおいて、受容体結合に対して不可欠でないように見受けられる。この理由のため、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにおいて本明細書中に記載されているように、Ｂ−Ｃループは、天然においてコードされていないアミノ酸で置換され得る。Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（及びＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０様メンバーのＤ−Ｅループ）も、天然において存在しないアミノ酸で置換され得る。ヘリックスＡに対して近位にあり、及び最終ヘリックスに対して遠位にあるアミノ酸も、受容体結合に関与していない傾向があり、天然において存在しないアミノ酸を導入するための部位であり得る。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７個又はこれより多いアミノ酸など（これらに限定されない。）、ループ構造中のあらゆる位置において置換される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていない１つ又はそれ以上のアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７個又はこれより多いアミノ酸内で置換される。
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びβインターフェロンなど（これらに限定されない。）、ＧＨファミリーのある種のメンバーは、Ｎ結合型及び／又はＯ結合型の糖を含有する。タンパク質中のグリコシル化部位は、ほとんど専ら、ループ領域中に存在し、αヘリックスバンドル中には存在しない。このループ領域は、一般に、受容体結合に関与しないので、及びこのループ領域は、糖基の共有付着のための部位であるので、これらは、天然において存在しないアミノ酸置換をタンパク質中に導入するための有用な部位であり得る。タンパク質中のＮ−結合型及びＯ−結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸は表面に露出されているので、天然において存在しないアミノ酸置換に対する部位であり得る。従って、天然のタンパク質は、これらの部位においてタンパク質に付着された嵩高い糖基を許容することが可能であり、このグリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、将来発見される可能性がある。ＧＨスーパー遺伝子の新規メンバーは、予測されるタンパク質配列のコンピュータ補助された二次及び四次構造解析を通じて、並びに特定の標的に結合する分子を同定するように設計された選択技術によって同定することが可能である。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、典型的には、非ヘリックスアミノ酸（ループ領域）によって結合された４つ又は５つの両親媒性ヘリックスを有する。これらタンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、これらのＮ末端に疎水性シグナル配列を含有し得る。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのこのような後に発見されるメンバーも、本発明に含まれる。関連出願は、２００５年８月１８日に、ＷＯ０５／０７４６５０号として公開され、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｏｕｒ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｂｕｎｄｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ」と題された国際特許出願である。
このように、成長ホルモンスーパー遺伝子の記述は、例示のために及び一例として提供されているものであり、本明細書に記載されている方法、組成物、戦略及び技術の範囲に対して限定するものではない。さらに、本出願におけるＧＨポリペプチドという表記は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーの例として総称を使用することが意図される。従って、ｈＧＨポリペプチド又はタンパク質に関して本明細書に記載されている修飾及び化学は、本明細書に具体的に列記されているものを含む、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーに対して等しく適用できることが理解される。
ＩＩＩ．本発明により使用するための一般的な組み換え核酸方法
本発明の多くの実施形態において、関心のあるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードする核酸を単離し、クローニングし、多くの場合組み換え法を用いて変更する。以下に限定されないが、タンパク質発現について、又はバリアント、誘導体、発現カセットもしくはＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド由来のその他の配列の作製の間に、このような実施形態を使用する。幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を異種プロモーターに操作可能に連結させる。ｈＧＨの単離及び宿主細胞中でのｈＧＨの産生は、例えば、米国特許第４，６０１，９８０， ４，６０４，３５９号、第４，６３４，６７７号、第４，６５８，０２１号、第４，８９８，８３０号、第５，４２４，１９９号、第５，７９５，７４５号、第５，８５４，０２６号、第５，８４９，５３５号、第６，００４，９３１号、第６，０２２，７１１号、第６，１４３，５２３号及び６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
親ポリペプチド（配列番号２（ｈＧＨ）に示されているアミノ酸配列を有するものを含むが、これに限定されない。）のアミノ酸配列に基づき、次いで、適切なアミノ酸残基の導入（即ち取り込み又は置換）又は除去（即ち欠失又は置換）が実施されるようにヌクレオチド配列を変化させて、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し得る。従来の方法に従い、部位特異的変異誘発法により、ヌクレオチド配列を都合よく修飾し得る。あるいは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成装置を用いることによるもの（所望するポリペプチドのアミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくは、組み換えポリペプチドを産生させる宿主細胞において好適であるコドンを選択する。）を含む化学合成により、ヌクレオチド配列を調製し得る。例えば、所望するポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、連結又は連結連鎖反応により組み立て得る。例えば、「Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８：１８９−１９３（１９９１）」；米国特許第６，５２１，４２７号（これらを本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
本発明は、遺伝子組み換えの分野での通常の技術を利用する。本発明で役立つ一般的方法を開示する基礎的な教科書としては、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）」；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。分子生物学技術を記載する一般的教科書としては、「Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）」；「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．ＩｎｃとＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同出版（１９９９まで補充あり。）」（「Ａｕｓｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は、変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター及び、以下に限定されないが、非天然アミノ酸、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルシンテターゼ及びこれらの組合せなどのタンパク質産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子又はポリヌクレオチドの生成など（これらに限定されない。）、多くのその他の関連のある話題を記載している。
様々な目的のために（以下に限定されないが、新規シンテターゼ又はｔＲＮＡを作製するため、ｔＲＮＡ分子を変異させるため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリを作成するため、シンテターゼのライブラリを作製するため、セレクターコドンを作製するため、関心のあるタンパク質又はポリペプチド中に非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためなど）、変異誘発法の様々なタイプを本発明において使用する。これらには、以下に限定されないが、部位特異的、ランダムポイント変異誘発法、相同的組み換え、ＤＮＡシャッフル又はその他の繰り返し用いられる変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを用いた変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発法、ホスホロチオアート修飾ＤＮＡ変異誘発法、ギャップのある二本鎖ＤＮＡなどを用いた変異誘発法又はこれらのあらゆる組合せが含まれる。さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を用いた変異誘発法、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発法、全遺伝子合成による変異誘発法、二本鎖切断修復などが挙げられる。以下に限定されないがキメラ構築物を含むものなどの、変異誘発法もまた本発明に含まれる。ある実施形態において、天然に存在する分子又は変更もしくは変異を施された天然に存在する分子の公知の情報（以下に限定されないが配列、配列比較、物理特性、二次、三次又は四次構造、結晶構造などを含む。）により、変異誘発を導くことができる。
本明細書中で見出される教科書及び例は、これらの手段を記載する。さらなる情報は、以下の文献中で引用される次の刊行物及び参考文献において見出すことができる：Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，インビトロ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ インビトロ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．及びＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｕｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７−６５００ （１９８２）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍｌ ３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＮｃｉＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ及びＦｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ インビトロ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ インビトロ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｓｅ／ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋｍａｒ及びＫｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｏｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ 「ｓｈｏｔ−ｇｕｎ」ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記の方法の多くにおけるさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１５４巻中に見い出され、これは、様々な変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題に対する有用な制御についても述べている。
例えば、本発明の変異導入（例えば、シンテターゼのライブラリーを変異させ、又はｔＲＮＡを変化させる。）において使用するためのオリゴヌクレオチドは、通常、例えば、「Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：６１５９−６１６８ （１９８４）」に記載されているような自動化された合成装置を用いて、「Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２， （１９８１）」によって記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。
本発明はまた、真核宿主細胞、非真核宿主細胞、及びオルソゴナルｔＲＮＡ／ＲＳペアを介した非天然アミノ酸のインビボ取り込みのための生物にも関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は以下に限定されないが本発明のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。）などの、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを用いて遺伝子操作（以下に限定されないが、形質転換、形質導入又は形質移入されるなど）されている。例えば、オルソゴナルｔＲＮＡのコード領域、オルソゴナルｔＲＮＡシンテターゼ及び誘導体化されるべきタンパク質は、所望の宿主細胞中で機能的である遺伝子発現調節要素に作用可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、微生物、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は結合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリクス内又は表面上の何れかに核酸を有する小粒子による高速弾丸貫入（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７、７０−７３（１９８７））などを含む標準的方法により、細胞及び／又は微生物にベクターを導入する。
例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞の選択などの作業に対して適切なように改変された従来の栄養培地中で、人工処理された宿主細胞を培養することができる。これらの細胞は、場合により、トランスジェニック生物中で培養することができる。その他の有用な参考文献としては（以下に限定されないが（例えば続く核酸単離にのための）細胞単離及び培養に関するものなどを含む。）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこで引用されている文献；Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ならびに、Ａｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．が挙げられる。
標的核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法を利用可能であり、そのいずれも本発明で使用することができる。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとのレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、発射体射撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及びウイルスベクターによる感染（下記でさらに述べる。）などが含まれる。本発明のＤＮＡコンストラクトを含有するプラスミド数を増幅するために、細菌細胞を使用することができる。対数増殖期まで細菌を増殖させ、細菌内のプラスミドを当技術分野で公知の様々な方法により単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）。さらに、細菌からのプラスミド精製のために、キットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ、両方とも、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈより；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ；及びＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐＴＭ）。次に、単離及び精製されたプラスミドをさらに人工処理して、他のプラスミドを生成させ、細胞を形質移入し、又は生物に感染させるために関連ベクターに組み込むために使用する。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、ならびに、特定の標的核酸の発現制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合によって、少なくとも１個の独立したターミネーター配列、真核もしくは原核細胞又は両方においてカセットの複製を可能にする配列（以下に限定されないが、シャトルベクターを含む。）及び原核生物及び真核細胞系両方に対する選択マーカーを含有する一般的発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞又はこの両方での複製及び組み込みに適切である。Ｇｉｌｌｍａｎ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１）１０−１４：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て先述）を参照のこと。クローニングに有用な、細菌及びバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより与えられている（例えば、Ｔｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）、ＡＴＣＣにより出版。）。配列決定、クローニング及び分子生物学のその他の態様に対するさらなる基本的手段ならびに基礎となる理論的考察はまた、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ 第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにも見出すことができる。さらに、基本的にあらゆる核酸（及び標準的又は非標準的であれ、実際にはあらゆる標識された核酸）を、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、ｍｃｒｃ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能。）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能。）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能。）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及びその他の多くの業者などの、あらゆる様々な市販ソースから特別注文又は通常注文することができる。
（ａ）セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを広げる。例えば、セレクターコドンには、以下に限定されないが、ユニークな３個の塩基コドン、ナンセンスコドン、例えば、停止コドン（以下に限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン又はオパールコドン（ＵＧＡ）などを含む。）、非天然コドン、４又はそれ以上の塩基コドン、レアコドンなどが含まれる。当業者にとって当然のことながら、少なくともｈＧＨポリペプチドの一部をコードする１つのポリヌクレオチド中に、以下に限定されないが、１つ又はそれ以上、２又はそれ以上、３又はそれ以上、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上など、所望する遺伝子又はポリヌクレオチド中に導入することができる、セレクターコドンの様々な数が存在する。
ある実施形態において、本方法は、インビボで１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を取り込むための停止コドンであるセレクターコドンの細胞中での使用を含む。例えば、以下に限定されないが、ＵＡＧを含む停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、所望する非天然アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによりアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。以下に限定されないがＴＡＧを含む停止コドンを関心のあるポリペプチドの関心のある部位に導入するために、従来の部位特異的変異誘発法を使用することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，（１９８８）、５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７９１−８０２を参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び関心のあるポリヌクレオチドをコードする核酸をインビボで組み合せる場合、非天然アミノ酸をＵＡＧコドンに反応して取り込み、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを与える。
真核宿主細胞を顕著に混乱させることなく、インビボでの非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（以下に限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含む。）と真核放出因子（以下に限定されないが、ｅＲＦを含む。）（これは、停止コドンに結合し、リボソームからの成長しているペプチドの放出を開始させる。）との間の競合に依存するので、以下に限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを向上させることなどにより、抑制効率を調節することができる。
非天然アミノ酸は、レアコドンによってもコードされ得る。例えば、インビトロタンパク質合成反応において、アルギニン濃度が減少すると、稀なアルギニンコドンＡＧＧは、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによって、Ａｌａを挿入するのに効率的であることが判明している。例えば、「Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：７９３９（１９９３）」を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で微少な種として存在する、天然のｔＲＮＡ Ａｒｇと競合する。幾つかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用するとは限らない。ミクロコッカス・ルテウス中の割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロ転写／翻訳抽出物中にアミノ酸を挿入するために使用されている。例えば、「Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２５：４６８５（１９９７）」を参照のこと。本発明の成分は、これらのレアコドンをインビボで使用するために生成することができる。
セレクターコドンはまた、延長したコドン（以下に限定されないが、４又はそれ以上の塩基コドン、例えば、４、５、６又はそれ以上の塩基コドンを含む。）も含有する。４塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５個の塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特性には、フレームシフト抑制に基づく、延長されたコドンを用いることが含まれる。４又はそれ以上の塩基コドンは、以下に限定されないが１又は複数の非天然アミノ酸などを同じタンパク質に挿入することができる。例えば、以下に限定されないがアンチコドンループ（例えば少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含む、変異されたＯ−ｔＲＮＡの存在下で、４又はそれ以上の塩基コドンを１個のアミノ酸として読む。他の実施形態において、以下に限定されないが、少なくとも４塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン又は少なくとも６塩基以上のコドンなどの、アンチコドンループを解読できる。２５６個の可能な四塩基コドンが存在するので、４又はそれ以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ 「Ｓｈｉｆｔｙ」Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９を参照のこと。
例えば、インビトロ生合成法を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、四塩基コドンが使用されてきた。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９；及びＨｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：３４を参照のこと。ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵを使用して、２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロでストレプトアビジンに２−ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体を同時に取り込ませた。例えば、Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４を参照のこと。インビボ実験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＵＣＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ Ｌｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑制する能力を調べ（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）、０又は−１フレームでの解読がほとんどなく、１３％から２６％の効率で、クアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＵＡＧＡが、ＵＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ Ｌｅｕにより解読され得ることが分かった。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５を参照のこと。ある実施形態において、本発明にて、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく延長コドンを使用することができ、他の不必要な部位で、ミスセンス、リードスルー及びフレームシフト抑制を減少させることができる。
ある一定の系に関し、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンのうち１個を含みむことができ、この場合内在性の系は、この天然塩基コドンを使用しない（又は稀にしか使用しない。）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
セレクターコドンは、場合によって非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対はさらに、既存の遺伝子アルファベットを拡張する。１つの余分な塩基対により、６４から１２５にトリプレットコドン数が増加する。第三の塩基対の特性には、安定で、選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる、ＤＮＡへの高忠実度の効率的な酵素的取り込み及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続したプライマー伸長が含まれる。方法及び組成物に対して適応させることができる非天然塩基対の記述としては、例えば、「Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２」が挙げられる。「Ｗｕ，Ｙ．， ｅｔ ａ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連する刊行物は、下記に列記されている。
インビボでの使用のために、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応するトリホスファートを形成する。さらに、増加した遺伝情報は安定であり、細胞性酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒら及びその他による以前の研究は、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋペアにおけるものとは異なる水素結合パターンを利用しており、最も価値ある例は、ｉｓｏ−Ｃ：ｉｓｏ−Ｇペアである。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２を参照のこと。これらの塩基は通常、ある程度天然塩基と誤対合し、酵素的に複製することはできない。Ｋｏｏｌ及び共同研究者らは、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合を置換して、塩基対の形成を推進できることを明らかにした。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ及びＫｏｏｌ、（１９９８）ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６，２８２５を参照のこと。上記の要求全てを満足させる非天然塩基対を開発する目的で、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者らは、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、研究を行った。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対合が、天然塩基対よりも安定で、Ｅ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のＫｌｅｎｏｗ断片により、ＤＮＡに効率的に取り込まれ得ることが分かっている。例えば、ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：３２７４を参照のこと。ＫＦにより、生物機能に十分効率的かつ選択的に、３ＭＮ：３ＭＮ自己対合を合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：８８０３を参照のこと。しかし、両塩基とも、さらなる複製に対して連鎖停止剤として作用する。変異ＤＮＡポリメラーゼは最近、ＰＩＣＳ自己対合を複製するために使用できることが分かった。さらに、７ＡＩ対合を複製することができる。例えば、Ｔａｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １２３：７４３９を参照されたい。Ｃｕ（ＩＩ）を結合した際に安定なペアを形成する、新規メタロ塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙもまた開発されている。Ｍｅｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：１０７１４を参照のこと。延長コドン及び非天然コドンは、天然コドンに対して本質的にオルソゴナルなので、本発明の方法は、それらに対するオルソゴナルｔＲＮＡを生成させるためにこの特性の長所を利用することができる。
所望するポリペプチド中に非天然アミノ酸を取り込むために、翻訳回避系を使用することもできる。翻訳回避系では、大きな配列を遺伝子中に取り込むが、タンパク質に翻訳されない。この配列は、リボソームがその配列を跳び越すよう誘発し、挿入の下流で翻訳を開始するきっかけとして働く構造を含有する。
ある一定の実施形態において、本発明の方法及び／又は組成物における関心のあるタンパク質又はポリペプチド（又はその一部）は核酸によりコードされる。典型的には、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個又はそれ以上のセレクターコドンを含有する。
当業者にとって周知であり、本明細書中に記載の方法を用いて、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に対して変異誘発を行い、例えば、非天然アミノ酸の取り込みのための１つ又はそれ以上のセレクターコドンを含むようにすることができる。例えば、関心のあるタンパク質に対する核酸に対して変異誘発を行い、１又は複数のセレクターコドンを含むようにし、それにより１又は複数の非天然アミノ酸が取り込まれるようにする。本発明は、あらゆるこのようなバリアント（以下に限定されないが、変異体、例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むあらゆるタンパク質の型など）を含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、即ち、１又は複数の非天然アミノ酸をコードする１又は複数のセレクターコドンを有する何らかの核酸も含む。
ｈＧＨポリペプチドなどの目的タンパク質をコードする核酸分子に対して容易に変異誘発を行い、ポリペプチドの何れかの所望の位置にシステインを導入し得る。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は多岐にわたるその他の分子を関心のあるタンパク質に導入するために、システインは広く使用されている。ポリペプチドの所望の位置にシステインを取り込むのに適切な方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載のもの及び標準的変異誘発技術など、当業者に周知である。
ＩＶ．天然においてコードされていないアミノ酸
非常に多岐にわたる天然においてコードされていないアミノ酸が本発明における使用に適切である。天然においてコードされていないアミノ酸のあらゆる数を、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に導入することができる。一般に、導入された天然においてコードされていないアミノ酸は、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸（即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、効率的かつ選択的に２０種類の一般的なアミノ酸では見られない官能基（以下に限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基など）と反応し、安定な結合体を形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ポリマー（ポリ（エチレングリコール）を含むが、これに限定されない。）又はアルキン部分を含有する第二のポリペプチドで処理して、アジド及びアルキン官能基の選択的反応をもたらす安定な結合体を形成させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加産物を形成させることが可能である。
α−アミノ酸の一般構造を以下に示す（式Ｉ）。
Figure 2008525473
天然においてコードされていないアミノ酸は、典型的に、上記で挙げた式（式中、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸で使用されるもの以外の何らかの置換基であり、本発明での使用に適切であり得る。）を有するあらゆる構造である。本発明の天然においてコードされていないアミノ酸は、典型的に、側鎖の構造のみが天然アミノ酸と異なるので、天然においてコードされていないアミノ酸は、天然に存在するポリペプチドにおいてアミド結合が形成されるのと同様にして、以下に限定されないが天然又は非天然コードのものを含む他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし、天然においてコードされていないアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、場合によって、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など又はこれらのあらゆる組合せを含む。本発明における使用に適切であり得る関心のある他の天然において存在しないアミノ酸には、以下に限定されないが、光活性化可能な架橋を含むアミノ酸、スピン標識されたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有又は非共有相互作用するアミノ酸、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換されたセリンなどグリコシル化されたアミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換されたアミノ酸、化学切断可能及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長された側鎖を有するアミノ酸（以下に限定されないが、ポリエーテル又は、約５を超えるもしくは約１０炭素を超える（これらに限定されない。）長鎖炭化水素など）、炭素結合された糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１又は複数の毒性部分を含むアミノ酸が含まれる。
本発明における使用に適切であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である天然においてコードされていないアミノ酸の例としては、以下に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド及びアルキン反応基を有するものが挙げられる。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ−又はＯ−結合が、一般に天然では見られない共有結合（以下に限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む。）により置換されている例が挙げられる。このようなアミノ酸の例としてはまた、天然に存在するタンパク質では一般に見られない糖、例えば、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどが挙げられる。
本明細書中で与えられる天然においてコードされていないアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓの部門、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。場合によっては、本明細書中で与えるように、又は当業者にとって公知の標準的方法を用いて、市販されていないものを合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。また、米国特許出願公開２００３／００８２５７５及び２００３／０１０８８８５（参照により本明細書中に組み込む。）も参照のこと。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸もまた、場合によって、以下に限定されないが、式ＩＩ及びＩＩＩの構造で示されるような修飾された骨格構造を含む。
Figure 2008525473
式中、Ｚは、典型的には、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、Ｘ及びＹは、同じ又は異なり得、典型的には、Ｓ又はＯを含み、並びにＲ及びＲ’は、場合によっては同じ又は異なり、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸に対して上記Ｒ基に対する構成成分の同じ一覧ならびに水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、場合によっては、式ＩＩ及びＩＩＩにより示されるように、アミノ又はカルボキシル基中に置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシラートが含まれ、以下に限定されないが、一般的な２０種類の天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖などを有する。さらに、α炭素における置換には、場合によっては、以下に限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などの、Ｌ、Ｄ又はα−α−２置換アミノ酸が含まれる。他の構造的代替物には、プロリン類似体ならびに、３、４、６、７、８及び９員環のプロリン類似体などの環状アミノ酸、置換されたβ−アラニン及びγ−アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が含まれる。
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明での使用に適切である。チロシン類似体としては、以下に限定されないが、パラ−置換されたチロシン、オルト−置換されたチロシン及びメタ置換されたチロシンが挙げられ、置換されたチロシンとしては、以下に限定されないが、ケト基（以下に限定されないが、アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖もしくは分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などが挙げられる。さらに、多置換されたアリール環も想定される。本発明での使用に適切であり得るグルタミン類似体としては、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換された誘導体、環状誘導体及びアミド置換されたグルタミン誘導体が挙げられる。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、以下に限定されないが、パラ−置換されたフェニルアラニン、オルト−置換されたフェニルアラニン及びメタ−置換されたフェニルアラニンが挙げられ、置換基としては、以下に限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（以下に限定されないがアセチル基を含む。）、ベンゾイル、アルキニル基などが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体例としては、以下に限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化されたフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニ、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「インビボ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」と題されたＷＯ２００２／０８５９２３に記載されている。また、さらなるメチオニン類似体について、Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ ９９：１９−２４（参照により、本明細書中に組み込まれる。）も参照のこと。
ある実施形態において、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど）を含むｈＧＨポリペプチドの組成物が提供される。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン及び、以下に限定されないが、タンパク質及び／又は細胞などを含む様々な組成物も提供される。ある態様において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、さらにオルソゴナルｔＲＮＡを含む。以下に限定されないが、オルソゴナルｔＲＮＡに対してアミノアシル結合を介して共有結合で、オルソゴナルｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに対して共有結合で、など、オルソゴナルｔＲＮＡに非天然アミノ酸を（以下に限定されないが、共有結合により）結合させることができる。
タンパク質に取り込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分は、様々な長所を提供し、タンパク質の様々な操作が可能となる。例えば、ケト官能基はユニークな反応性を有するので、これによりヒドラジン又はヒドロキシルアミン含有試薬のあらゆる数を用いて、タンパク質をインビトロ及びインビボで選択的に修飾することができるようになる。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データを位相整合するのに有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入によっても、重原子の位置を選択的かつ柔軟に選択できる。光反応性非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ベンゾフェノン及びアリールアジド（以下に限定されないがフェニルアジドなど）側鎖を有するアミノ酸など）により、例えば、タンパク質の効率的なインビボ及びインビトロ光架橋連結が可能になる。光反応性非天然アミノ酸の例としては、以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。次に、光反応基を与える時間的制御の励起により、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を随意に架橋することができる。一つの例において、以下に限定されないが、核磁気共鳴及び振動分光法などを使用した、局所構造及びダイナミクスのプローブとして、同位体標識したもの（以下に限定されないがメチル基など）で、非天然アミノのメチル基を置換することができる。アルキニル又はアジド官能基により、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、分子を用いてタンパク質を選択的に修飾できるようになる。
アミノ末端でポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸において使用されるもの以外の何れかの置換基であるＲ基及び、α−アミノ酸に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応性基から構成され得る（式Ｉ参照。）。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応性基とともに、カルボキシル末端で取り込むことができる（式Ｉ参照。）。
本発明の非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸で利用できないさらなる特徴を提供するように選択又は設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、その中にそれらが取り込まれるタンパク質の生物学的特性を修飾するように、場合によって設計又は選択され得る。例えば、タンパク質中に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性：毒性、生体内分布、溶解度、安定性、例えば、熱的安定性、加水分解安定性、酸化的安定性、酵素分解に対する耐性など、精製及び加工の促進、構造特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒活性、酸化還元電位、半減期、（例えば、共有又は非共有的に）他の分子と反応する能力などを場合により修飾し得る。
非天然アミノ酸の構造及び合成：カルボニル基、カルボニル様基、マスクされたカルボニル基、保護されたカルボニル基及びヒドロキシルアミン基
幾つかの実施形態において、本発明は、オキシム結合によって、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。
天然においてコードされていないアミノ酸の多くの種類が、オキシム結合の形成に適している。これらには、カルボニル、ジカルボニル又はヒドロキシルアミン基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。このようなアミノ酸は、２００４年１２月２２日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ， ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ， ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された米国特許出願６０／６３８，４１８号；６０／６３８，５２７号；及び６０／６３９，１９５号に記載されており、これらは、参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。このようなアミノ酸も、２００５年７月１日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ， ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ， ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された米国特許出願６０／６９６，２１０号；６０／６９６，３０２号及び６０／６９６，０６８号に記載されており、これらは、参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。天然においてコードされていないアミノ酸は、２００２年４月１９日に出願された米国特許出願１０／１２６，９３１号及び２００２年４月１９日に出願された米国特許出願１０／１２６，９２７号にも記載されていおり、これらは、参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の幾つかの実施形態は、１つ又はそれ以上の位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンアミノ酸で置換されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを使用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、「Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（本参照により組み込む。）。当業者によって、他のカルボニル又はジカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。さらに、ここに含まれる非天然アミノ酸の非限定的な典型的合成が、米国特許出願１０／１２６，９３１号の図４、２４−３４及び３６−３９（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
求電子反応基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加反応を介して分子を連結するための様々な反応を可能とする。このような求電子反応性基には、カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む。）、カルボニル様基（これは、カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む。）と同様の反応性を有し、カルボニル基と構造的に類似する。）、遮蔽されたカルボニル基（これは、カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む。）へと容易に変換できる。）、又は保護されたカルボニル基（これは、脱保護すると、カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む。）と類似の反応性を有する。）が含まれる。このようなアミノ酸には、式（ＩＶ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｊは、
Figure 2008525473
 であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
各Ｒ’’は、独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル若しくは保護基であり、又は２以上のＲ’’基が存在する場合には、２つのＲ’’は、場合によって、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｒ３及びＲ４の各々は、独立に、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換された低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４若しくは２つのＲ３は、場合によって、シクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し；
又は−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ−基は、一緒に、ジカルボニル基、保護されたカルボニル基を含み、保護されたジカルボニル基、若しくはマスクされたカルボニル基を含み、マスクされたジカルボニル基を含む少なくとも１つのカルボニル基を含む二環式若しくは三環式シクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し；
又は−Ｊ−Ｒ−基は、一緒に、ジカルボニル基、保護されたカルボニル基を含み、保護されたジカルボニル基、又はマスクされたカルボニル基を含み、マスクされたジカルボニル基を含む少なくとも１つのカルボニル基を含む単環式若しくは二環式シクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し；
但し、Ａがフェニレンであり、及びＲ３がＨであり、Ｂが存在する場合、並びにＡが−（ＣＨ２）４−であり、各Ｒ３がＨであり、Ｂが−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−でない場合；並びにＡ及びＢが不存在であり、及び各Ｒ３がＨである場合には、Ｒはメチルでない。
さらに、式（Ｖ）の構造を有するものが含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
但し、Ａがフェニレンであり、及びＲ３がＨであり、Ｂが存在する場合、並びにＡが−（ＣＨ２）４−であり、Ｂが−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−でない場合；並びにＡ及びＢが不存在である場合には、Ｒはメチルでない。
さらに、式（ＶＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ｂは、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択される。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、このような化合物は、場合によってアミノ保護された基、カルボキシ保護されまたはその塩である。さらに、以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
さらに、式（ＶＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択され；並びにｎは、０〜８であり；
但し、Ａが−（ＣＨ２）４である場合、Ｂが−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではない。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、このような化合物は、場合によってアミノ保護され、場合によってカルボキシル保護され、場合によってアミノ保護及びカルボキシル保護されており、またはこれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
さらに、式（ＶＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
さらに、式（ＩＸ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択される。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、このような化合物は、場合によってアミノ保護され、場合によってカルボキシル保護され、場合によってアミノ保護及びカルボキシル保護されており、またはこれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
さらに、式（Ｘ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−アルキレン又は置換されたアルキレン）−−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択され；並びにｎは、０〜８である。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、このような化合物は、場合によってアミノ保護され、場合によってカルボキシル保護され、場合によってアミノ保護及びカルボキシル保護されており、またはこれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
モノカルボニル構造に加えて、本明細書中に記載されている非天然アミノ酸は、ジカルボニル、ジカルボニル様、マスクされたジカルボニル及び保護されたジカルボニル基などの基を含み得る。
例えば、式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
 ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
さらに、式（ＸＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択される。）
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2008525473
 も含まれ、このような化合物は、場合によってアミノ保護され、場合によってカルボキシル保護され、場合によってアミノ保護及びカルボキシル保護されており、またはこれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
さらに、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ｂは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換された低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換されたアルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択され；並びにｎは、０〜８である。
さらに、以下のアミノ酸：
Figure 2008525473
 も含まれ、このような化合物は、場合によってアミノ保護され、場合によってカルボキシル保護され、場合によってアミノ保護及びカルボキシル保護されており、またはこれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸は何れも、非天然アミノ酸ポリペプチド中に取り込まれ得る。
さらに、式（ＸＩＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり；及びＬは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）
さらに、式（ＸＩＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）である。
さらに、式（ＸＩＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）である。
さらに、式（ＸＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり；及びｎは、０、１、２、３、４又は５であり；並びに、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は何れのＲ８及びＲ９も、一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成し、又は隣接するＲ８基の何れも、一緒にシクロアルキルを形成することが可能である。
さらに、式（ＸＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４又は５であり；並びに、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は何れのＲ８及びＲ９も、一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成し、又は隣接するＲ８基の何れも、一緒にシクロアルキルを形成することが可能である。
さらに、式（ＸＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
ｎは、独立に、０、１、２、３、４又は５であり；並びに、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は何れのＲ８及びＲ９も、一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成し、又は隣接するＲ８基の何れも、一緒にシクロアルキルを形成することが可能である。
さらに、式（ＸＶＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり；及びＬは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）である。
さらに、式（ＸＶＩ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）である。
さらに、式（ＸＶＩ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換されたアルキレン、Ｎ（Ｒ’）アルキレン又はＮ（Ｒ’）（置換されたアルキレン）（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。）である。
さらに、式（ＸＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ａは、場合によって存在し、存在する場合には、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換された低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換された低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換された低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換されたアルカリーレン、アラルキレン又は置換されたアラルキレンであり；
Ｍは、
Figure 2008525473
 であり；
（ａ）はＡ基への結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基への結合を表し、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル若しくは置換されたシクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３及びＲ４は若しくは２つのＲ３基若しくは２つのＲ４基は、場合によって、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを形成することを示し；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、及びＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
さらに、式（ＸＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、Ｍは、
Figure 2008525473
 であり、（ａ）はＡ基への結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基への結合を表し、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル若しくは置換されたシクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３及びＲ４は若しくは２つのＲ３基若しくは２つのＲ４基は、場合によって、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを形成することを示し；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、及びＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；
Ｒ１は、場合によって存在し、存在する場合には、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；及び
Ｒ２は、場合によって存在し、存在する場合には、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり；
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ（各Ｒ’は、独立に、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキルである。）からなる群から独立に選択される。
さらに、式（ＸＩＸ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルであり；及び
Ｔ３は、Ｏ又はＳである。）
さらに、式（ＸＸ）の構造を有するアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ここにおいて、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル又は置換されたシクロアルキルである。
さらに、式（ＸＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
Figure 2008525473
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（参照により組み込む。）。当業者によって、その他のカルボニル又はジカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。さらに、本明細書中に含まれる非天然アミノ酸の非限定的な典型的合成が、図４、２４−３４及び３６−３９に記されている。
幾つかの実施形態において、非天然アミノ酸を含むポリペプチドを化学的に修飾して、反応性カルボニル又はジカルボニル官能基を生じさせる。例えば、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から、結合反応に有用なアルデヒド官能基を生じさせることができる。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在するか、化学的もしくは酵素的消化により曝露され得る。）を使用し、過ヨウ素酸塩を用いて穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されている。
本発明において、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する非天然アミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに取り込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位で酸化を避けるために穏やかな条件下でメタ過ヨウ素酸ナトリウムの過剰モルを添加することを含む。酸化反応のｐＨは、典型的に、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム約１．５モル濃度過剰量を添加し、続いて、暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照。
水溶液中で、穏やかな条件下にて、カルボニル又はジカルボニル官能基を選択的にヒドロキシルアミン含有試薬と反応させて、生理的条件下で安定な、対応するオキシム結合を形成させることができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。さらに、カルボニル又はジカルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照のこと。
非天然アミノ酸の構造及び合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸
米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号は、参照により、その全体を組み込まれる。従って、米国仮特許出願第６０／６８３，４１８号中のＶ節（「非天然アミノ酸」と題されている。）、Ｂ部（「非天然アミノ酸の構造及び合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸」と題されている）中に提供された開示内容は、あたかも、このような開示内容が本明細書中に完全に記されているのと同じ程度まで、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを作製し、精製し、性質決定し、及び使用するための方法、組成物（式Ｉ−ＸＸＸＶを含む。）、技術及び戦略に対して完全に適用される。
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書中に記載されているようにして、又は様々な刊行物に記載されているようにして、又は当業者にとって公知の標準的方法を用いて、場合により合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；並びにＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について述べているさらなる刊行物としては、例えば、ＷＯ２００２／０８５９２３（題名「インビボ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」；Ｍａｔｓｏｕｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．及びＫｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．及びＣｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．及びＦｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２３９−１２４６；Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が含まれる。また、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ」と題された米国特許公開２００４／０１９８６３７（参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照のこと。
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加又はアルドール縮合反応を介して分子（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性分子など）を連結する様々な反応が可能となる。
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008525473
式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；並びに、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、並びに、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、及びＲ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、及びＲ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（本明細書中に参照により組み込む。）。当業者は、他のカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドを化学的に修飾して、反応性カルボニル官能基を生じさせる。例えば、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から、結合反応に有用なアルデヒド官能基を生じさせることができる。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在するか、化学的もしくは酵素的消化により曝露され得る。）を使用し、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、「Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）」を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されている。
本発明において、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する天然においてコードされていないアミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに取り込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位で酸化を避けるために穏やかな条件下でメタ過ヨウ素酸ナトリウムの過剰モルを添加することを含む。酸化反応のｐＨは、典型的に、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム約１．５モル濃度過剰量を添加し、続いて、暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
水溶液中で、穏やかな条件下にて、カルボニル官能基を選択的にヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−又はセミカルバジド含有試薬と反応させて、生理的条件下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾン結合をそれぞれ形成させることができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。さらに、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、「Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）」を参照のこと。
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性ポリマーを用いたものなど）結合体を形成させるための様々な求電子基による反応が可能となる。
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド含有アミノ酸の例は、以下のように表すことができる。
Figure 2008525473
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキルもしくは置換されたアリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
幾つかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１存在せず、及びＸはＮである。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、この酸素原子は、アリール環のアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）基に対してパラ位にある。
ヒドラジド−、ヒドラジン−及びセミカルバジド含有アミノ酸が市販されている。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。当業者は、市販のものを購入できないその他のアミノ酸を調製することができる。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド官能基を有する天然においてコードされていないアミノ酸を含有するポリペプチドと、を効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド官能基のユニークな反応性により、２０種類の一般的アミノ酸に存在する求核基（以下に限定されないが、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基又はリジンのアミノ基及びＮ末端を含む。）と比較して、アルデヒド、ケトン及びその他の求電子基に対するこれらの反応性が顕著に高くなる。
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる。）基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧはその他の水溶性ポリマーなどとの）結合体を形成するための、様々な求電子基との反応が可能となる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドのように、アミノオキシ基の求核性が高まることにより、アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応できるようになる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８３９−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照のこと。しかし、ヒドラジン基との反応により生じるものが対応するヒドラゾンである一方、オキシムは、一般に、ケトンなどのカルボニル含有基とアミノオキシ基との反応に由来するものである。
典型的なアミノオキシ基含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
Figure 2008525473
式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、並びに、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、及びＹは存在する。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、並びにＹは存在しない。
容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びスレオニン）からアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ及びＲ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）を参照。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などのある一定のアミノオキシ含有アミノ酸が天然源から単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：１６３５−１６４１（１９９７））。当業者は、その他のアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。
Ｄ．アジド及びアルキン反応基
アジド及びアルキン官能基のユニークな反応性により、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾にこれらの官能基が非常に有用となる。有機アジド、特にアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）アジド及びアルキンは、一般に、通常の反応化学状態に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両者とも、天然に存在するポリペプチドで見られる２０種類の一般的アミノ酸の側鎖（即ちＲ基）に対して不活性である。しかし、密接に近接させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」のような性質が現れ、それらは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾールを生成させる。例えば、「Ｃｈｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）」を参照のこと。
Ｈｕｉｓｇｅｎの付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含むので（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｖｏｌ．４，（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，ら編、１９９１）、ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−ＤＩＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｐａｄｗａ，Ａ．編、１９８４）、ｐ．１−１７６を参照。）、アジド及びアルキン含有側鎖を有する天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みによって、生じるポリペプチドが天然においてコードされていないアミノ酸の位置で選択的に修飾を受けることができるようになる。アジド又はアルキン含有ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、インシトゥ、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）（以下に限定されないが、ＣｕＳＯ４の触媒量の形態など）を添加することにより、室温にて、水性条件下で行うことができる。例えば、「Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）」を参照のこと。典型的な還元剤としては、以下に限定されないが、アスコルビン酸塩、金属銅、キニン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋及び印加電圧が挙げられる。
ある場合においては、アジドとアルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が所望される場合、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、アルキン部分を含む天然においてコードされていないアミノ酸を含み、アミノ酸に付着される水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。あるいは、逆の反応を行うこともできる（即ち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いる。）。
アリールエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基とを選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンが近接するエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。例えば、「Ｅ．Ｓａｘｏｎ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、２００７−２０１０（２０００）」を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（以下に限定されないが、２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸を含む。）又はアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）の何れかであり得る。
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーの例は、次のように表すことができる。
Figure 2008525473
式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、及びＲ基はＨ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリール基であり得る。典型的なＲ基としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、これらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが含まれるが、これらに限定されない。）、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できる。
チオエステルを含有し、及びアリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンがチオエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。チオエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる。
Figure 2008525473
 （式中、ｎは１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、及びＷは、水溶性ポリマーである。）。
典型的なアルキン含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008525473
式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキルもしくは置換されたアリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり；Ｘは存在せず、ｍは０であり、及びアセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、及びプロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する（すなわち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、並びにｍは０である（即ち、プロパリルグリシン）。
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸を標準的方法に従い調製することができる。例えば、「Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載のようにして、例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを合成することができ、「Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）」に記載のようにして、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを合成することができる。当業者は、その他のアルキン含有アミノ酸を調製することができる。
典型的なアジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008525473
式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、及びアジド部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは０から４であり、並びにＲ１及びＸは存在せず、並びにｍ＝０である。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、及びβ−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
アジド含有アミノ酸は市販されている。例えば、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）から４−アジドフェニルアラニンを入手することができる。市販されていないアジド含有アミノの場合、以下に限定されないが、適切な脱離基（以下に限定されないが、ハロゲン化物、メシラート、トシラートなど）の置換を介するか、又は適切に保護化ラクトンの開環を介するなど、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、比較的容易にアジド基を調製することができる。例えば、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
Ｅ．アミノチオール反応基
β−置換されたアミノチオール官能基のユニークな反応性により、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生物分子の選択的修飾のために、これらの官能基が非常に有用となる。例えば、「Ｊ．Ｓｈａｏ及びＪ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８３９−３８９９」を参照のこと。幾つかの実施形態において、β−置換されたアミノチオールアミノ酸をＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに取り込み、次いで、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。幾つかの実施形態において、チアゾリジンの形成を介して、水溶性ポリマー、薬物結合体又はその他のペイロードをβ−置換されたアミノチオールアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドにカップリングさせることができる。
非天然アミノ酸の細胞性取り込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは、以下に限定されないが、タンパク質への取り込みなど、非天然アミノ酸を設計し選択する際に通常考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の電荷密度は高いので、これらの化合物は細胞透過性である可能性は少ないことが示唆される。天然アミノ酸は、タンパク質を利用した輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞により取り込まれるかを評価するスクリーニングを迅速に行うことができる。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ」と題された米国特許公開２００４／０１９８６３７号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）における毒性アッセイ；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６：４７８０−４７８５を参照のこと。取り込みは様々なアッセイを用いて容易に分析できるが、細胞への取り込み経路に適した非天然アミノ酸の設計に対する代替手段は、インビボでアミノ酸を生成させるための生合成経路を提供することである。
（ｉ）非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及び他の化合物の産生のための多くの生合成経路が細胞において既に存在する。特定の非天然アミノ酸についての生合成法は天然には（以下に限定されないが、細胞においてなど）存在し得ないが、本発明はそのような方法を提供する。例えば、新しい酵素を添加するか又は既存の宿主経路を改変することにより、場合によって非天然アミノ酸についての生合成経路を宿主細胞において生じさせる。追加の新しい酵素は、場合によって天然に存在する酵素又は人工的に生じさせた酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（ＷＯ２００２／０８５９２３、題名「インビボ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」における実施例に提示されているように。）は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞の形質転換を行うことによって、これらの酵素の遺伝子を真核細胞中に導入することができる。細胞中で発現させる場合、この遺伝子は、所望する化合物を合成するための酵素的経路を与える。場合によっては添加される酵素のこのタイプの例は、下記の実施例で与える。例えばＧｅｎｂａｎｋにおいて、さらなる酵素の配列が記載されている。人工的に生じさせた酵素もまた、場合によって同様に細胞中に添加される。このようにして、細胞の機構及び細胞のリソースを操作して非天然アミノ酸を産生させる。
生合成経路での使用のために又は既存経路を進化させるために、新規酵素を産生させるための様々な方法を利用できる。例えば、以下に限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）により開発されたものなど、繰り返して用いられる組み換えを場合によって使用して、新規酵素及び経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ インビトロ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：インビトロ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈＴＭを、場合によって、以下に限定されないが、細胞中にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生成させるために経路を人工処理することなど、代謝経路の人工処理のために使用する。この技術により、以下に限定されないが機能的ゲノム科学並びに分子進化及び設計などにより特定されたものなどの新しい遺伝子及び組合せを用いて、宿主生物において既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）もまた、以下に限定されないが新しい経路を作るためなど、遺伝子ライブラリ及び遺伝子経路の迅速なスクリーニングのための技術を提供する。
通常、人工処理を行った本発明の生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成に十分な濃度（以下に限定されないが、天然の細胞量など）である一方、他のアミノ酸の濃度に影響を与えない又は細胞リソースを枯渇させない程度に産生される。このようにしてインビボで産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路について所望される酵素を産生させるのに使用される遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞を形質転換し、非天然アミノ酸が生成されたら、リボソームタンパク質合成及び細胞増殖の両方について非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、インビボ選択を場合によって使用する。
（ｂ）非天然アミノ酸を有するポリペプチド
非天然アミノ酸は、様々な目的のために、例えば、タンパク質構造及び／又は機能における変化の適応化、サイズの、酸性度の、求核性の、水素結合の、疎水性の、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分（以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど）への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節（例えば腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞又は器官特異性又は分布の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ耐性の調節など（これらに限定されない。）のために行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された特性、又は完全に新しい触媒若しくは生物物理学的特性を有することが可能である。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によって変更する：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（以下に限定されないが、血清半減期など）、他の分子との反応能（以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など）など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（以下に限定されないが、抗体など）及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２を参照のこと。
本発明の一態様において、組成物は、少なくとも１個の、以下に限定されないが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０若しくはそれ以上などの非天然アミノ酸を有する少なくとも１個のタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然のアミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能であるなど（これらに限定されない。）、同一又は別異とすることが可能である。別の態様において、組成物は、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、タンパク質に存在する特定のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。２以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得る（以下に限定されないが、タンパク質は、非天然アミノ酸の２つ又はそれ以上の異なる型を含むか又は同じ非天然アミノ酸２個を含み得る。）。３以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じもの異なるもの又は同じ種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物及び方法を用いて産生された少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する、ポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（以下に限定されないが、医薬として許容される賦形剤を含む。）もまた、タンパク質とともに存在し得る。
真核生物細胞中で、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドを生産することによって、タンパク質又はポリペプチドは、通常、真核生物の翻訳後修飾を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸及び真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核生物細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある態様において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（以下に限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）など）のアスパラギンへの結合を含む。真核生物タンパク質のＮ結合型オリゴ糖の幾つかの例を列挙する表１を参照（図示されていないさらなる残基も存在し得る。）。別の態様において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン若しくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン結合による又はＧｌｃＮＡｃ−セリン若しくはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の、セリン又はスレオニンへの結合を含む。
Figure 2008525473
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前駆体のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質へのアセンブリーもしくは巨大分子アセンブリー、細胞の別の部位（以下に限定されないが、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官へ、又は分泌経路を通じて、などを含む。）への変換を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。米国特許第４，９６３，４９５号及び第６，４３６，６７４号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、ｈＧＨポリペプチドの分泌を改善するように設計された構築物を詳述している。
非天然アミノ酸の１つの長所は、これが、追加の分子を加えるために使用できる追加の化学部分を与えることである。真核又は非真核細胞においてインビボで又はインビトロで、これらの修飾を行い得る。したがって、ある一定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されている殆どの反応は、以下に限定されないが、ヒスチジン又はシステイン側鎖とのα−ハロケトンの反応など、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間での共有結合形成を含む。これらの事例での選択性は、タンパク質中の求核残基の数及び接近可能性により決定される。本発明のタンパク質において、非天然ケト−アミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボでの反応など、より選択的な他の反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７を参照のこと（これらは全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）。これにより、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体及び細胞毒性分子を含む多数の試薬による、事実上あらゆるタンパク質の選択的標識が可能となる。「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題された米国特許第６，９２７，０４２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）も参照されたい。アジドアミノ酸を通じた（これを含むが、これに限定されない。）翻訳後修飾は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結（トリアリールホスフィン試薬を用いることを含むが、これに限定されない。）を通じて行うことも可能である。例えば、「Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ， ＰＮＡＳ ９９：１９−２４」を参照されたい。
本発明は、タンパク質の選択的修飾のための別の高効率の方法を提供し、この方法は、以下に限定されないが、セレクターコドンに反応してアジド又はアルキニル部分をタンパク質に含有させるなど、非天然アミノ酸の遺伝的取り込みを含む。次に、これらのアミノ酸側鎖を、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）Ｐａｄｗａ，Ａ．編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６を参照。）などにより、以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体などをそれぞれ用いて修飾することができる。この方法は、求核置換ではなく付加環化を含むので、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することにより、優れた位置選択性（１，４＞１，５）で、水性条件下、室温にてこの反応を行うことができる。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈａｍ． ６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１ ：２５９６−２５９９」を参照されたい。使用できる別の方法は、テトラシステインモチーフを用いた、ビスヒ素化合物における配位子交換である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２を参照のこと。）。
付加環化により本発明のタンパク質に付加できる分子には、事実上、アジド又はアルキニル誘導体を有するあらゆる分子が含まれる。分子には、以下に限定されないが、色素、蛍光、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（以下に限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体など）、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、レジン、ビーズ、第二のタンパク質又はポリペプチド（又はさらなるもの。）、ポリヌクレオチド（以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物などが含まれる。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アルキニル基を有する非天然アミノ酸、又は、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アジド基を有する非天然アミノ酸に付加されることが可能である。
Ｖ．遺伝的にコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのインビボ生成
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、天然に存在する系ではコードされていないアミノ酸を付加し又は置換するために修飾されたｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを用いて、インビボで生成することが可能である。
天然に存在する系でコードされていないアミノ酸を使用する、ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを生成させるための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（これらを参照により本明細書中に組み込む。）で述べられている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性である、シンテターゼ及びｔＲＮＡとは独立に機能する（したがって、「オルソゴナル」と呼ばれることがある。）翻訳機構を生成させることを含む。通例、この翻訳系は、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通例、Ｏ−ＲＳは、翻訳系中に少なくとも１個の天然において存在しないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、この系において他のｔＲＮＡにより認識されない少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。したがって、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、この系で産生されたタンパク質に天然においてコードされていないアミノ酸を挿入し、それにより、コードされたポリペプチドの位置においてアミノ酸を「置換」する。
特定の合成アミノ酸をポリペプチド中に挿入するために、多岐にわたるオルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で述べられており、これらは一般に本発明での使用に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）で述べられている。代表的なＯ−ＲＳ又はその一部は、ポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第出願公開第２００３／００８２５７５号及び２００３／０１０８８８５号（それぞれ、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対するＯ−ＲＳ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１４から１６及び２９から３２、並びにアミノ酸配列、配列番号：４６から４８及び６１から６４が挙げられる。本発明での使用に適切なＯ−ｔＲＮＡ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１から３が挙げられる。特定の天然においてコードされていないアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルＬ−ｔＲＮＡシンテターゼペアのその他の例は、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）で記載されている。Ｓ．セレビシエにおいてケト及びアジド含有アミノ酸の両方を取り込む、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
幾つかの他のオルソゴナル対が報告されている。Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）中への非天然アミノ酸の取り込みの可能性に関して、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｔＲＮＡに由来するグルタミル（例えば、Ｌｉｕ， Ｄ． Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ．（１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ． Ｓ． Ａ． ９６：４７８０−４７８５参照）、アスパルチル（例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，（２０００） ＨｅＩｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ８３：２２７７−２２８６参照）及びチロシル（例えば、Ｏｈｎｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ． Ｊｐｎ．） １２４：１０６５−１０６８；及びＫｏｗａｌ， Ａ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ． Ｓ． Ａ． ９８：２２６８−２２７３参照）系及びシンテターゼが記載されている。Ｅ．コリのグルタミル（例えば、Ｋｏｗａｌ， Ａ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ． Ｓ． Ａ． ９８：２２６８−２２７３参照）及びチロシル（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｈ．， ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ， Ｐ．（１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：１６３３−１６４１参照）シンテターゼに由来する系が、Ｓ．セレビシアエでの使用について記載されている。哺乳動物細胞における、インビボでの３−ヨード−Ｌ−チロシンの取り込みのために、Ｅ．コリのチロシル系が使用されている。「Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９」を参照されたい。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、天然においてコードされていないアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。あらゆるコドンを使用できるが、一般に、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において殆ど使用されないか又は全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、代表的なコドンには、停止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４又はそれ以上の塩基のコドン及び殆ど使用されないか又は全く使用されないその他の天然の３塩基コドンが含まれる。
当技術分野で公知の変異誘発法（以下に限定されないが、部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発法、制限選択変異誘発法などを含む。）を用いて、配列をコードするＧＨ、例えばｈＧＨポリヌクレオチド中の適切な位置に特異的セレクターコドンを導入することができる。
天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むために使用できる、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びオルソゴナルＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成させるための方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。天然においてコードされていないアミノ酸のインビボ取り込みのための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。生物のインビボ翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択する方法もまた、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。「Ｓｉｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０３５７４３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ケトアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０９４５９３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、真核生物の宿主細胞中に、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。
少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を作製する方法は、（ａ）以下に限定されないが、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィリス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの原核生物又は真核生物などを含む、第一の生物から、少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては変異体の）ＲＳのライブラリを作製すること、（ｂ）天然においてコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーに対してＲＳ（場合によっては変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）し、それにより活性のある（場合によっては変異体）ＲＳのプールを提供することと；及び／又は（ｃ）（場合によってはネガティブ選択によって）天然においてコードされていないアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（以下に限定されないが、変異体ＲＳを含む。）に対するプールを選択して、それにより少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供すること、を含み；少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳが天然においてコードされていないアミノ酸を伴うＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
ある実施形態において、ＲＳは、不活性なＲＳである。活性ＲＳに対して変異誘発を行うことにより、不活性ＲＳを生成させることができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６又は少なくとも約１０若しくはそれ以上のアミノ酸について、以下に限定されないがアラニンなどの、異なるアミノ酸へと変異誘発を行うことにより不活性ＲＳを生成させることができる。
以下に限定されないが、タンパク質三次元ＲＳ構造に基づいた合理的設計又は、無作為もしくは合理的設計技術でのＲＳヌクレオチドの変異誘発などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて、変異体ＲＳのライブラリを作製することができる。例えば、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、多様性を生成する組み換え変異誘発、キメラ構築、合理的設計により、及び本明細書中に記載の又は当技術分野で公知のその他の方法により、変異体ＲＳを生成させることができる。
ある実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下でオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化（これに限定されない。）するものなど、活性のあるメンバーについてＲＳ（場合によっては変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）することには、ポジティブ選択及びスクリーニングマーカー（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子など）、ＲＳ（場合によっては変異体）のライブラリを複数の細胞に導入すること（ポジティブ選択及び／又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個の、以下に限定されないがアンバー、オーカー又はオパールコドンなどの、セレクターコドンを含む。）；選択物質の存在下で複数の細胞を増殖させること；ポジティブ選択もしくはスクリーニングマーカーにおいて少なくとも１個のセレクターコドンを抑制することにより選択及び／又はスクリーニング物質の存在下で生存している（又は特異的反応を示す）細胞を同定すること（これにより、活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールを含有するポジティブに選択された細胞のサブセットを提供する。）を含む。場合によっては、選択及び／又はスクリーニング物質の濃度を変化させることができる。
ある態様において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。場合によって、ポジティブ選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。別の態様において、正のスクリーニングマーカーは、蛍光又は発光性のスクリーニングマーカー又は親和性を利用したスクリーニングマーカー（以下に限定されないが、細胞表面マーカーなど）を含む。
ある実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の非存在下においてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては変異体）のプールをネガティブに選択又はスクリーニングすることには、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを、ポジティブ選択又はスクリーニングからの活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールを用いて、第二の生物の複数の細胞に導入すること（このネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含む（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子（以下に限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）を含む。）。）；並びに天然においてコードされていないアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を補充した第一の培地において生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、天然においてコードされていないアミノ酸及び選択又はスクリーニング物質を補充しない第二の培地中で生存できないか又は特異的反応を示さない細胞を同定すること、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを伴う、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を与える。例えば、適切なＯ−ＲＳ組み換え体の決定において、ＣＡＴ同定プロトコールは、場合によって、ポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして機能する。例えば、１又は複数の天然においてコードされていないアミノ酸の存在下、又は非存在下の何れかで、場合によって、ＣＡＴを含有する（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）クローンのプールを増殖プレート上に複製する。したがって、天然においてコードされていないアミノ酸を含有するプレート上で専ら増殖するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含有するとみなされる。ある態様において、選択（及び／又はスクリーニング）物質の濃度が変化する。ある態様において、第一及び第二の生物は異なる。したがって、第一及び／又は第二の生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
別の実施形態において、活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールをスクリーニング又は選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など）することは、活性のある変異体ＲＳのプールをポジティブ選択段階（ｂ）から単離すること；ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが、毒性マーカー遺伝子（以下に限定されないが、少なくとも１個のセレクターコドンを含む、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子など）を含む。）。）及び活性のある（場合によっては変異体）ＲＳのプールを第二の生物の複数の細胞に導入すること；並びに天然においてコードされていないアミノ酸が補充されていない第一の培地中で生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、非天然コードアミノが補充されている第二の培地中で生存できないか又は特異的スクリーニング反応を示さない細胞を同定すること、を含み、これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ（この少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、天然においてコードされていないアミノ酸に対して特異的である。）を有する、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を提供する。ある態様において、少なくとも１個のセレクターコドンとは、約２又はそれ以上のセレクターコドンを含む。このような実施形態には、場合によって、少なくとも１個のセレクターコドンが２又はそれ以上のセレクターコドンを含む場合並びに第一及び第二の生物が異なる（以下に限定されないが、各生物には、場合によって、原核、真核、哺乳動物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。）場合が含まれ得る。また、いくつかの態様には、ネガティブ選択マーカーが、（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子を含む場合も含まれる。他の態様には、スクリーニングマーカーが、場合によっては、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む場合が含まれる。本明細書中の実施形態において、スクリーニング及び／又は選択には、場合によっては、スクリーニング及び／又は選択ストリンジェンシーの変更が含まれる。
ある実施形態において、少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成させるための方法はさらに、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離すること；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二のＯ−ＲＳのセット（場合によっては変異された）を生成させること；並びに（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含む変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すこと、を含み得る。場合によって、以下に限定されないが少なくとも約２回など、段階（ｄ）−（ｆ）を繰り返す。ある態様において、以下に限定されないがランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、組み換え又はこれらの組合せなどの、変異誘発により、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二の変異Ｏ−ＲＳのセットを生成させることができる。
上述の方法における、以下に限定されないが、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方などの、選択／スクリーニング段階のストリンジェンシーは、場合によって、選択／スクリーニングストリンジェンシーを変更することを含む。別の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方は、レポーターを使用することを含み、この場合、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によりレポーターを検出するか又は発光によりレポーターを検出する。場合によって、ファージディスプレイなどで、レポーターを細胞表面に提示し、天然においてコードされていないアミノ酸又は類似体に関する親和性又は触媒活性に基づき、選択する。ある実施形態において、ファージディスプレイなどで、変異されたシンテターゼを細胞表面に表示する。
組み換えオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成させるための方法は、（ａ）第一の生物から、以下に限定されないがサプレッサーｔＲＮＡなどの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製すること；（ｂ）第一の生物からのＲＳの非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのライブラリの、選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など）又はスクリーニングを行うことと（これにより、ｔＲＮＡ（場合によっては変異体）のプールが与えられる。）；並びに（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについてｔＲＮＡ（場合によっては変異体）のプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含み；この少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。ある実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は、天然及び／又は非天然塩基のユニークな３塩基コドンを含むか又はナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドンもしくはオパール停止コドンである。ある実施形態において、組み換えＯ−ｔＲＮＡは、オルソゴナルが向上している。当然のことながら、ある実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変の必要なく、場合によっては、第二の生物から第一の生物に持ち込まれる。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり、場合によって、以下に限定されないが、原核生物（以下に限定されないが、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）など）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、場合によっては、天然においてコードされていないアミノ酸によりアミノアシル化され、この場合、この天然においてコードされていないアミノ酸は、天然に又は遺伝子操作によりインビボで生合成される。天然においてコードされていないアミノ酸は、場合によって、少なくとも第一又は第二の生物用の増殖培地に添加される。
ある態様において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡについてライブラリの選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択を含む）又はスクリーニングを行うこと（段階（ｂ））は、第二の生物由来の複数の細胞に毒性マーカー遺伝子（この場合、この毒性マーカー遺伝子は、セレクターコドンの少なくとも１つ（又は毒性もしくはスタティック（ｓｔａｔｉｃ）物質の産生を導く遺伝子又は生物にとって必須の遺伝子（このようなマーカー遺伝子は少なくとも１個のセレクターコドンを含む。））を含む。）及び（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのライブラリを導入すること；生存細胞を選択すること（この場合、生存細胞は、少なくとも１つのオルソゴナルｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを含有する。）を含む。例えば、比較比率細胞密度アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
別の態様において、毒性マーカー遺伝子は、２又はそれ以上のセレクターコドンを含み得る。この方法の別の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、このリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含む。場合によって、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つ又はそれ以上のアンバーコドンを含み得る。
ある実施形態において、導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー遺伝子（この正のマーカー遺伝子は、薬物耐性遺伝子（以下に限定されないが、Ｏ−ＲＳとともに、少なくとも１つのアンバー停止コドンなどのセレクターコドンの少なくとも１つを含むβ−ラクタマーゼ遺伝子など）又はその生物に必須の遺伝子又は毒性物質の解毒を導く遺伝子を含む。）及び（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを第二の生物由来の複数の細胞に導入することと；限定されないが抗生物質を含む、選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させた、生存している又はスクリーニングされた細胞を同定することと（これにより少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを与える。）を含み、この少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答して、正のマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する。別の実施形態において、選択及び／又はスクリーニング物質の濃度が変更される。
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳのペアを生成させるための方法が与えられる。方法は、（ａ）第一の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物由来のＲＳ非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリをネガティブに選択又はスクリーニングすることと（これにより、（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールが与えられる。）；（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすること（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含む。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。この方法はまた、（ｄ）第三の生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては変異体）ＲＳのライブラリを作製することと；（ｅ）天然においてコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて変異体ＲＳのライブラリを選択又はスクリーニングすること（これにより、活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールが与えられる。）；（ｆ）天然においてコードされていないアミノ酸非存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性な（場合によっては変異体の）ＲＳについて前記プールをネガティブに選択又はスクリーニングすること（これにより、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが与えられる。）を含み、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、天然においてコードされていないアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ及び少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを含む。この方法により生成された特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアには、以下に限定されないが、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが含まれ得る。さらに、このような方法は、第一及び第三の生物が同じである（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）など）場合を含む。
第二の生物のインビボでの翻訳系において使用するためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択するための方法もまた本発明に含まれる。この方法は、マーカー遺伝子、ｔＲＮＡ及び、第一の生物から単離された又はこれに由来するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第二の生物由来の細胞の第一のセットに導入すること；マーカー遺伝子及びｔＲＮＡを第二の生物由来の２つ組の細胞セットに導入すること；２つ組の細胞セットにおいて生存できない第一のセットにおける生存細胞に対する選択を行うか又は２つ組の細胞セットにおいてこのような反応を与えられない、特異的なスクリーニング応答を示す細胞についてスクリーニングを行うこと、を含み、この場合、第一のセット及び２つ組の細胞セットを選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させ、生存細胞又はスクリーニングされた細胞は、第二の生物のインビボでの翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを含む。ある実施形態において、比較及び選択又はスクリーニングを行うことは、インビボ相補性アッセイを含む。選択又はスクリーニング物質の濃度は変更することができる。
本発明の生物は、様々な生物及び様々な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり得る。ある実施形態において、この生物は、場合により、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ． ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、この生物は、場合によって、植物（単子葉植物又は双子葉植物などの複雑な植物を含むが、これらに限定されない。）、藻類、原生生物、真菌（酵母などを含むが、これに限定されない。）、動物（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含むが、これらに限定されない。）などを含む（これらに限定されない。）真核生物を含む。別の実施形態において、第二の生物は、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ． ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、第二の生物は、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞などを含む（これらに限定されない。）真核生物とすることが可能である。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は異なる。
ＶＩ．ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドにおける天然において存在しないアミノ酸の位置
本発明は、１つ又はそれ以上の天然において存在しないアミノ酸の、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中への取り込みを想定する。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において、１つ又はそれ以上の天然において存在しないアミノ酸が取り込まれ得る。「保存的」置換（以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など）を行うことにより、及び／又は活性に必要のない位置に、天然において存在しないアミノ酸を挿入することにより、これを遂行することができる。
ＧＨ、例えばｈＧＨの領域は、以下のように図示することが可能であり、ここにおいて、ｈＧＨ中のアミノ酸位置は、真ん中の列に記されている（配列番号２）。
Figure 2008525473
様々な生化学的及び構造的アプローチを利用して、天然においてコードされていないアミノ酸を用いた置換を行うための所望の部位を、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド内に選択することができる。当業者にとって当然のことながら、ポリペプチド鎖のあらゆる位置が、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むための選択に適切であり、選択は、合理的設計に基づくか、又は、何らかの所望の目的のための又は所望の目的なしの、ランダム選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、以下に限定されないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、二量体又は多量体形成などの、何らかの所望の特性又は活性を有するが、ネイティブ分子と比較して活性又は特性に変化がないＧＨ、例えばｈＧＨ分子を産生するためのもの、又は、溶解性、凝集又は安定性などのポリペプチドの何らかの物理的又は化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、当技術分野で公知の点変異分析、アラニンスキャニング又はホモローグスキャニング法を用いて、ＧＨ、例えばｈＧＨの生物活性に必要とされるポリペプチド中の位置を同定することができる。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）」（ＧＨ、例えばｈＧＨ生物活性に対して極めて重要である１４個の残基を同定している。）及び「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）」（相同体スキャニング変異誘発を用いて、抗体及び受容体エピトープを同定している。）を参照されたい。米国特許第５，５８０，７２３号；第５，８３４，２５０号；第６，０１３，４７８号；第６，４２８，９５４号；及び第６，４５１，５６１号（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、標的物質との、ポリペプチドの活性に影響を与える活性ドメインを同定することによって、ｈＧＨなどのポリペプチドの構造及び機能を系統的に分析するための方法を記載している。アラニン又はホモローグスキャニング変異誘発により生物活性に重要と同定されるもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然においてコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。あるいは、生物活性に重要と同定される部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然においてコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖の各位置において天然においてコードされていないアミノ酸で単純に連続した置換を行い、ポリペプチドの活性に対する影響を観察することである。当業者にとって当然のことながら、何らかのポリペプチド中への非天然アミノ酸による置換を行う位置を選択するための、あらゆる手段、技術又は方法が本発明での使用に適切である。
天然においてコードされていないアミノ酸による置換を許容する可能性があるタンパク質の領域を決定するために、欠失を含有するｈＧＨポリペプチドの天然に存在する変異体の構造及び活性を調べることも可能である。例えば、ｈＧＨについては、「Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３：２６７９−２６８７（１９７８）」を参照されたい。同様に、プロテアーゼ消化及びモノクローナル抗体は、ｈＧＨ受容体を結合するために必要とされるｈＧＨの領域を同定するために使用することが可能である。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；Ｍｉｌｌｓ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １０７：３９１−３９９（１９８０）；Ｌｉ， Ｃ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４６：３１−４１（１９８２）」（残基１３４−１４９間のアミノ酸は、活性を喪失させずに欠失させることができることを示している。）を参照されたい。天然においてコードされていないアミノ酸による置換基を許容できない可能性がある残基が一旦除去されれば、残りの位置の各々における提案された置換の影響は、ｈＧＨ及びその結合タンパク質の三次元結晶構造から調べることが可能である。ｈＧＨについては、「ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：３０６−３１２（１９９２）」を参照。ｈＧＨの全ての結晶構造は、タンパク質及び核酸の巨大分子の三次元構造データを含有する集中管理されたデータベースであるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（３ＨＨＲ、１ＡＸＩ及び１ＨＷＧを含む。）（ＰＤＢ，Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて、ｒｃｓｂ．ｏｒｇで利用可能）において入手可能である。三次元構造データが利用できなければ、ポリペプチドの二次及び四次構造を調査するモデルを作製し得る。従って、当業者は、天然においてコードされていないアミノ酸で置換できるアミノ酸位置を容易に同定できる。
幾つかの実施形態において、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ポリペプチドのヘリックス又はβシート二次構造を破壊しないタンパク質の領域中に位置する一つ又はそれ以上の天然において存在しないアミノ酸を含む。
天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的な残基は、その受容体に結合した又は結合していないｈＧＨポリペプチドの三次元結晶構造、二次、三次又は四次構造によって予測されるように、受容体結合領域である可能性がある領域（部位Ｉ及び部位ＩＩを含むが、これらに限定されない。）から除外される残基であり得、完全に又は部分的に溶媒曝露され得、近くの残基と最小限の水素結合相互作用又は非水素結合相互作用を有し、近くの反応性残基へ最小限度で曝露され得、及び高度に柔軟であり（Ｃ−Ｄループを含むが、これに限定されない。）、又は構造的に堅固である（Ｂヘリックスを含むが、これに限定されない。）領域中に存在し得る。
幾つかの実施形態において、以下のように、天然にコードされていない一つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＧＨ中の二次構造に対応する以下の領域の一つ又はそれ以上の中の任意の位置に取り込まれる。配列番号２から得られる１−５（Ｎ末端、６−３３（Ａヘリックス、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）に対応する位置。他の実施形態において、本発明のＧＨポリペプチド、例えばｈＧＨポリペプチドは、例えば、配列番号２のＮ末端（１−５）、Ａ−ＢループのＮ末端（３２−４６）；Ｂ−Ｃループ（９７−１０５）、Ｃ−Ｄループ（１３２−１４９）及びＣ末端（１８４−１９１）に対応する領域からなる群から選択されるＧＨ、例えばｈＧＨの少なくとも一つの領域中に位置する少なくとも一つのアミノ酸に対して置換された天然に存在しない少なくとも一つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸に対応するＧＨ、例えばｈＧＨの位置の１つ又はそれ以上に取り込まれる。
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的な部位には、配列番号２から得られる２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、配列番号２から得られる２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ＧＨ、例えばｈＧＨの結晶構造の調査、及びＧＨ、例えば、ｈＧＨ受容体とのその相互作用は、これらのアミノ酸残基の側鎖が完全に又は部分的に溶媒に接近可能であること、及び天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖はタンパク質表面から遠ざかり、溶媒中を向き得ることを示唆している。
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な位置には、配列番号２から得られる３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ＧＨ、例えばｈＧＨの結晶構造の調査、及びＧＨ、例えば、ｈＧＨ受容体とのその相互作用は、これらのアミノ酸残基の側鎖が完全に溶媒に曝露されていること、及びネイティブ残基の側鎖は溶媒中を向いていることを示唆している。
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、配列番号２から得られる３０、７４、１０３に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位の別のサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための部位には、配列番号２から得られる３５に対応する部位又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも一つは、カルボニル基、例えばケトン基を含有する。ある種の実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも一つは、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸の複数を含有する幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の２以上が、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸の複数を含有する幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の実質的に全てが、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸に対応する。）に対応する位置など（これらに限定されない。）において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、これらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に対応する位置を含む（これらに限定されない。）位置において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、これらの位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に対応する位置を含む（これらに限定されない。）位置において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３５、９２、１４３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然において存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られる位置３５（これに限定されない。）に対応する位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨに連結される水溶性ポリマーには、１つ又はそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ポリマー、例えばＰＥＧは、直鎖又は分岐であり得る。典型的に、本発明において使用される直鎖ポリマー、例えばＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。典型的に、本発明において使用される分岐ポリマー、例えばＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＰＥＧなどのポリマーは、本明細書中にさらに記載されている。ある種の実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間の結合は、オキシム結合である。
本発明のある種の実施形態は、オキシム結合である共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含む組成物を包含する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧである。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された少なくとも１つの直鎖ＰＥＧを包含する幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された少なくとも１つの分岐ＰＥＧを包含する幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態において、前記ＧＨはＧＨ、例えばｈＧＨであり、これらの実施形態のうち幾つかにおいて、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列を有する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２の配列である配列を有する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいて、少なくとも１つのオキシム結合は、天然においてコードされていないアミノ酸と少なくとも１つの水溶性ポリマーの間に存在する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸はケトン基などのカルボニル基を含有する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸はｐ−アセチルフェニルアラニンである。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において置換される。
従って、幾つかの実施形態において、本発明は、オキシム結合である共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーは、分岐ＰＥＧであるＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、天然においてコードされていないアミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然にコードされていないカルボニル含有アミノ酸である天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、天然にコードされていないカルボニル含有アミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合であるＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、天然にコードされないカルボニル含有アミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態において、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、ケトン基を含む天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、ケトン基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、ケトン基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態において、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、ｐ−アセチルフェニルアラニンと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ｐ−アセチルフェニルアラニンである天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
ある種の実施形態において、本発明は、配列番号２を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２の位置３５に対応する位置において、約３０ｋＤａの分子量の直鎖ＰＥＧへのオキシム結合によって連結されたｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されているＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば、直鎖ＰＥＧへのオキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えば、ｈＧＨを含むホルモン組成物であり、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する、前記ホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置（これらに限定されない。）を含む１つもしくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせなど（これらに限定されない。）に対応する１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５など（これらに限定されない。）に対応する１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへオキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含むホルモン組成物であり、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する、前記ホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５に対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ，例えばｈＧＨが、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、複数の水溶性ポリマー、例えば複数のＰＥＧに連結されており、共有結合の１つ又はそれ以上が、天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも１つと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧとの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、約２〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜５０個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約２〜２５個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜１０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜５個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約５〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５〜５０個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約５〜２５個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５〜１０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜５０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜２０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２０〜５０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結され得る。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、本明細書に記載されている任意の位置において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ中に取り込まれ得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、天然にコードされないカルボニル含有アミノ酸、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンなどの天然にコードされないケトン含有アミノ酸である天然にコードされない少なくとも１つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、ｐ−アセチルフェニルアラニンを含む。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれ、ここに、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、オキシム結合によって、ポリマーの１つ、例えばＰＥＧの１つに連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの少なくとも１つは、天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも１つへの共有結合によって、ＧＨ、例えばｈＧＨへ連結される。幾つかの実施形態において、共有結合はオキシム結合である。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数は、天然においてコードされていないアミノ酸の複数への共有結合によって、ＧＨ、例えばｈＧＨへ連結される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの共有結合は、オキシム結合である。幾つかの実施形態において、共有結合の複数がオキシム結合である。幾つかの実施形態において、結合の実質的に全部がオキシム結合である。水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数は、直鎖、分岐又はこれらのあらゆる組み合わせであり得る。１つ又はそれ以上の直鎖ＰＥＧを取り込む実施形態において、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。１つ又はそれ以上の分岐ＰＥＧを取り込む実施形態において、分岐ＰＥＧは約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数を使用する実施形態は、一般に、単一のＰＥＧが使用される実施形態より少ない分子量のこのようなポリマーを使用することが理解される。従って、幾つかの実施形態において、ＰＥＧの複数の総分子量は、約０．１−５００ｋＤａ又は約０．１−２００ｋＤａ又は約０．１−１００ｋＤａ又は約１−１０００ｋＤａ又は約１−５００ｋＤａ又は約１−２００ｋＤａ又は約１−１００ｋＤａ又は約１０−１０００ｋＤａ又は約１０−５００ｋＤａ又は約１０−２００ｋＤａ又は約１０−１００ｋＤａ又は約１０−５０ｋＤａ又は約２０−１０００ｋＤａ又は約２０−５００ｋＤａ又は約２０−２００ｋＤａ又は約２０−１００ｋＤａ又は約２０−８０ｋＤａ、約２０−６０ｋＤａ、約５−１０ＯｋＤａ、約５−５０ｋＤａ又は約５−２０ｋＤａである。
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換若しくは位置１に（すなわち、Ｎ末端に）付加又はこれらのあらゆる組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の任意のＧＨ配列中の対応するアミノ酸）を有するものが含まれるがこれらに限定されない。
天然においてコードされていない多様なアミノ酸が、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中の所定の位置において置換され、又はｈＧＨポリペプチド中の所定の位置に取り込まれることが可能である。一般に、具体的な天然においてコードされていないアミノ酸は、その受容体を伴うＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの三次元結晶構造の調査、保存的置換に対する選好性（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニン又はＯ−プロパルギルチロシンなど、アリールをベースとした天然においてコードされていないアミノ酸）及びＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中への導入を希望する特異的な結合化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーを用いたＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加、又はアリールエステルを有し、続いて、ホスフィン部分を取り込む水溶性ポリマーを用いたアミド結合形成を実施することを望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、取り込みのために選択される。
ある実施形態において、本発明はさらに、タンパク質中に非天然アミノ酸を取り込むこと（この非天然アミノ酸は、第一の反応基を含む。）；及び第二の反応性基を含む分子（以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質を含む。）と、タンパク質を接触させること、を含む。第一の反応性基が第二の反応性基と反応して、［３＋２］付加環化を介して非天然アミノ酸に分子を付着させる。ある実施形態において、第一の反応基は、アルキニル又はアジド部分であり、第二の反応性基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第一の反応性基は、アルキニル部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおいて、など）であり、第二の反応性基はアジド部分である。別の例において、第一の反応性基はアジド部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて）であり、第二の反応性基はアルキニル部分である。
ある場合において、天然においてコードされていないアミノ酸置換は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド内の他の付加、置換又は欠失と組み合わされて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの他の生物学的特性に影響を与える。ある場合において、他の付加、置換又は欠失により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの安定性（以下に限定されないが、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性など）が向上するか、又はＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体に対するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの親和性が向上し得る。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、配列番号２中のＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの溶解性（以下に限定されないが、Ｅ．コリ又はその他の宿主細胞で発現させた場合など）が向上し得る。幾つかの実施形態において、付加、置換又は欠失により、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上し得る。幾つかの実施形態において、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性を増加させる非天然アミノ酸取り込みのための別の部位に加えて、天然コードアミノ酸又は非天然アミノ酸での置換のための部位を選択する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（増加又は減少が含まれるが、これらに限定されない。）、受容体二量体を安定化する、循環半減期を調節する、放出もしくは生物利用可能性を調節する、精製を促進するか、又は特定の投与経路を改善するかもしくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。例えば、本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を導入することに加えて、ＧＨ、例えばｈＧＨバリアントの、その受容体に対する親和性を増加させるために、以下の置換の１つ又はそれ以上：Ｆ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ又はＦ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ又はＭ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ及びＩ１７９Ｔが導入される。同様に、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、化学的又は酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗原結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど）又はその他の親和性ベースの配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど）又は、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰなど）、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、ｈＧＨサイズの縮小又はポリペプチドのその他の特性を改善する連結分子（以下に限定されないが、ビオチンなど）を含み得る。
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の置換は、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストを生成する。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７又は位置１の前への付加（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他のあらゆるＧＨ配列中の対応するアミノ酸）が含まれる。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部内の残基が含まれる。別の実施形態において、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの天然においてコードされていないアミノ酸との、Ｇ１２０の置換。他の実施形態において、上掲の置換は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストにする他の置換と組み合わされる。例えば、天然においてコードされていないアミノ酸は、本明細書中に同定された位置の１つにおいて置換され、同時の置換がＧ１２０に導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨ、例えばｈＧＨ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの事例において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸を、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の置換をさらに含む。例えば、幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨの以下の領域中に存在する１つ又はそれ以上の残基は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸：１−５（Ｎ末端）；３２−４６（Ａ−ＢループのＮ末端）、９７−１０５（Ｂ−Ｃループ）；及び１３２−１４９（Ｃ−Ｄループ）及び１８４−１９１（Ｃ末端）で置換される。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨの以下の領域：１−５（Ｎ末端、６−３３（Ａヘリックス、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中の１つ又はそれ以上の残基は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていない残基は、１つ又はそれ以上のより低分子量の直鎖又は分岐ＰＥＧ（約５〜２０ｋＤａ又はこれ未満の質量）に連結されることにより、より高分子量の単一のＰＥＧに付着された種に比べて、結合親和性と同等の血清半減期を増大させる。
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨの以下の残基の最大２つが、位置：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、置換の以下の対：Ｋ３８Ｘ＊及びＫ１４０Ｘ＊；Ｋ４１Ｘ＊及びＫ１４５Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＥ８８Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＦ９２Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＹ１４３Ｘ＊；Ｆ９２Ｘ＊及びＹ１４３Ｘ＊（Ｘ＊は、天然においてコードされていないアミノ酸を表す。）の何れかの置換が為される。２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための好ましい部位には、以下の残基：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７の組み合わせが含まれる。２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための特に好ましい部位には、以下の残基：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５の組み合わせが含まれる。
２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸のＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込むための好ましい部位には、以下の残基：配列番号２から得られる位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又はこれらのあらゆる組み合わせが含まれる。
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物における発現
クローニングしたＧＨ、例えばｈＧＨポリヌクレオチドの高レベル発現を得るために、通例、転写、転写／翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸へのための場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，に記載されている。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）及びサルモネラなどにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系は当業者に公知であり、これも市販されている。オルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを発現させる場合、オルソゴナル成分を宿主細胞が使用する能力に基づいて発現用の宿主細胞を選択する。代表的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（以下に限定されないが、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など）及びグラム陰性細菌（Ｅ．コリ、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）など）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。本明細書中に記載されているとおりに、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞を使用することができる。
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成することができるようになる。ある態様において、この組成物は、場合によっては、以下に限定されないが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム若しくはそれ以上含むか、又はインビボタンパク質産生方法により達成され得る量を含む（組み換えタンパク質産生及び精製に対する詳細は本明細書中に記載されている。）。別の態様において、このタンパク質は、場合によっては、以下に限定されないが、細胞可溶化液、緩衝液、医薬緩衝液又は他の懸濁液などの中で（以下に限定されないが、約１ｎＬから約１００Ｌ又はそれ以上などの何れかの体積で）、以下に限定されないが、１Ｌあたり少なくともタンパク質１０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質７５マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク１００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５００マイクログラム、１Ｌあたり少なくとも１ミリグラム又は１Ｌあたり少なくともタンパク質１０ミリグラム又はそれ以上の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞でのタンパク質の大量産生（以下に限定されないが、他の方法（以下に限定されないが、インビトロ翻訳など）で通常可能なものを超える量など）は、本発明の特徴である。
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成することができるようになる。例えば、細胞抽出液、細胞可溶化液、培養液、緩衝液などの中で、以下に限定されないが、少なくとも、タンパク質１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル又はそれ以上などの濃度で、非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生させることができる。
Ｉ．発現系、培養及び単離
例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含む多くの適切な発現系においてＧＨ、例えばｈＧＨを発現させ得る。代表的な発現系の説明を下記で行う。
酵母
本明細書中で使用する場合、「酵母」という用語は、ＧＨ、例えばｈＧＨをコードする遺伝子を発現することができるあらゆる様々な酵母を含む。このような酵母としては、以下に限定されないが、有子嚢酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、エンドミセタレス）、担子胞子酵母及び、不完全菌類（ブラストミセテス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が挙げられる。有子嚢酵母は、スペルモフトラセア（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）及びサッカロミセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の２種類の科に分けられる。後者は、４種類の亜科、シゾサッカロミコイデ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄａｅ）（例えばシゾサッカロミセス属）、ナドソニオイデア（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミコイデア（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミコイデ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属）からなる。担子胞子酵母は、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシディエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属を含む。不完全菌類（ブラストミセテス）に属する酵母は、スポロボロミセタセア（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属及びブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属）及びクリプトコッカセア（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えばカンジダ属）の２種類の科に分けられる。
本発明との使用に特に興味深いのは、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（以下に限定されないが、Ｐ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．グイレリモンディ（ Ｐ． ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．カルルスベルゲンシス（Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ディアスタチクス（Ｓ． ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ダグラシ（Ｓ． ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クリベリ（Ｓ． ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（Ｓ， ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、Ｓ．オビフォルミス（Ｓ． ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ． ｍａｌｔｏｓａ）及びＨ．ポリモルファ（Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）など）に属する種である。
ＧＨ、例えばｈＧＨの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者の技術の範疇に属する。発現のための酵母宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性、優れた分泌圧能、優れたか要請タンパク質産生及び全体的な頑健性を有することを示すものを含み得る。酵母は通常、以下に限定されないが、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
「酵母宿主」「酵母宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた酵母を含む。この用語は、組み換えベクター又は他のトランスファーＤＮＡを受容した当初の酵母宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、１個の親細胞の子孫は、当初の親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくは全体ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ＧＨ、例えばｈＧＨをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
多くの酵母宿主への形質転換のために、染色体外レプリコン又は組み込みベクターを含む発現及び形質転換ベクターが開発されてきた。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ． ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣＳ（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンディ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号；同第４，９２９，５５５号；及び同第４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ（１９８５）５：３３７６）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９８２）３００：７０６）；及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２１１；及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．レーシア（Ｔ．ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ０２４４２３４）；及び糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（ＷＯ９１／００３５７）など（それぞれ参照により本明細書中に組み込む。）について発現ベクターが開発された。
酵母ベクターについての制御配列は当業者にとって公知であり、以下に限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ０２８４０４４）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセリン酸ムターゼ；及びピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ０３２９２０３）などの遺伝子からのプロモーター領域が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供し得る（Ｍｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主との使用に適切な他のプロモーター配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５：２０７３）；及び他の解糖系酵素、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＤＶ．ＥＮＺＹＭＥ ＲＥＧ．（１９６８）７：１４９）が挙げられる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有する誘導型酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関与する分解酵素；並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域が含まれ得る。酵母発現での使用に適切なベクター及びプロモーターはさらにＥＰ００７３６５７に記載されている。
酵母エンハンサーを酵母プロモーターと一緒に使用することもできる。さらに、合成プロモーターも酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性領域と連結させることができ、これにより合成ハイブリッドプロモーターを作製できる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結させられたＡＤＨ制御配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号及び同第４，８７６，１９７号（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照。ハイブリッドプロモーターのその他の例としては、ＧＡＰ又はＰｙＫなどの解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨＯ５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ０１６４５５６号を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合して、転写を開始させる能力を有する非酵母由来の天然に存在するプロモーターを含み得る。
酵母発現ベクターの一部を含み得る他の制御エレメントには、ターミネーター、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のものが含まれる（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）。さらに、２μプラスミドオリジンからの複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ−２欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
外来性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は当業者にとって公知であり、典型的に、以下に限定されないが、アルカリ陽イオンで処理された、スフェロプラスト又は無傷酵母宿主細胞の何れかの形質転換が含まれる。例えば、Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ．（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴ．（１９７７）１３０：９４６に記載の方法に従い、酵母の形質転換を行うことができる。しかし、核注入、エレクトロポレーション又はプロトプラスト融合など、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も、一般にＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（２００１）に記載のように使用し得る。次いで、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、酵母宿主細胞を培養し得る。
酵母宿主細胞中で異種タンパク質を発現するための他の方法は、当業者に公知である。一般に、米国特許出願２００２００５５１６９号、米国特許出願第６，３６１，９６９号；第６，３１２，９２３号；第６，１８３，９８５号；第６，０８３，７２３号；第６，０１７，７３１号；第５，６７４，７０６号；第５，６２９，２０３号；第５，６０２，０３４号；及び第５，０８９，３９８号；米国再審査特許ＲＥ３７，３４３及びＲＥ３５，７４９；ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ ９９／０７８６２１；ＷＯ ９８／３７２０８；及びＷＯ ９８／２６０８０；欧州特許出願ＥＰ ０ ９４６ ７３６；ＥＰ ０ ７３２ ４０３；ＥＰ ０ ４８０ ４８０；ＷＯ ９０／１０２７７；ＥＰ ０ ３４０ ９８６；ＥＰ ０ ３２９ ２０３；ＥＰ ０ ３２４ ２７４；及びＥＰ ０ １６４ ５５６を参照されたい。Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＡＮＴＯＮＩＥ ＶＡＮ ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２） ６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＹＥＡＳＴ（１９９２） ８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９０） １８５：３−７も参照されたい（それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。
当業者にとって公知である標準的なフィードバッチ発酵法を用いて、増幅段階の際、発酵装置中で酵母宿主株を増殖させ得る。この発酵法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の違いを明らかにするために適合させ得る。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵には、単一のグルコース供給、複合窒素源（例えばカゼイン加水分解物）及び複数ビタミンの供給が必要であり得る。これに対して、メチロトローフ酵母、Ｐ．パストリスは、グリセロール、メタノール及び微量元素の供給を必要とし得るが、最適な増殖及び発現のために、単純なアンモニウム（窒素）塩のみが必要であり得る。例えば、参照により、本明細書中に組み込まれる。米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＨＥＭ（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨ ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３を参照のこと。
しかし、このような発酵法は、使用する酵母宿主と無関係なある一定の一般的な特徴を有し得る。例えば、最大限に増殖させるために、増幅期の際に、増殖制限栄養、通常炭素、を発酵装置に添加し得る。さらに、発酵法は通常、炭素、窒素、基本的塩、リン及びその他の微量栄養素（ビタミン、微量元素及び塩など）の適正な量を含有するように設定された発酵培地を用いる。ピチアとともに使用するのに適切な発酵培地の例は、米国特許第５，３２４，６３９号及び同第５，２３１，１７８号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。
バキュロウイルス感染昆虫細胞
「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができる又は使用されてきた昆虫を指す。この用語は、形質移入された当初の昆虫宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、単一の親細胞の子孫は、当初の親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくは全体ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ＧＨ、例えばｈＧＨの発現に適切な昆虫細胞の選択は、当業者にとって公知である。アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など、いくつかの昆虫種が当技術分野で詳しく記載されており、市販されている。発現のための昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた分泌能、低タンパク質分解活性及び全体的な頑強性を有することを示すものを含み得る。昆虫は通常、以下に限定されないが、Ｉｎｓｅｃｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分には、トランスファーベクター、通常、バキュロウイルスゲノムの断片と及び発現させる異種遺伝子の挿入のための使いやすい制限部位の両方とを含有する細菌プラスミド；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これにより、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組み換えが可能となる。）；及び適切な昆虫宿主細胞ならびに増殖培地が含まれる。ベクターの構築、細胞の形質移入、プラークの回収、培養での細胞増殖などで使用される、材料、方法及び技術は、当技術分野で公知であり、これらの技術を記載するマニュアルが利用可能である。
トランスファーベクターに異種遺伝子を挿入した後、ベクター及び野生型ウイルスゲノムを、ベクター及びウイルスゲノムの組み換えを行う昆虫宿主細胞に形質移入する。パッケージングされた組み換えウイルスを発現させ、組み換えプラークを同定し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料及び方法は、キット形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。これらの技術は一般に当者にとって公知であり、ＳＵＭＭＥＲＳ ＡＮＤ ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に詳しく記載されている（参照により本明細書中に組み込む。）。また、ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（１９９５）；ＡＵＳＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １６．９−１６．１１（１９９４）；ＫＩＮＧ及びＰＯＳＳＥＥ，ＴＨＥ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＳＹＳＴＥＭ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＧＵＩＤＥ（１９９２）；及びＯ’ＲＥＬＬＹ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）も参照のこと。
実際に、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた様々な異種タンパク質産生が当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同第６，３４２，２１６号；同第６，３３８，８４６号；同第６，２６１，８０５号；同第６，２４５，５２８号、同第６，２２５，０６０号；同第６，１８３，９８７号；同第６，１６８，９３２号；同第６，１２６，９４４号；同第６，０９６，３０４号；同第６，０１３，４３３号；同第５，９６５，３９３号；同第５，９３９，２８５号；同第５，８９１，６７６号；同第５，８７１，９８６号；同第５，８６１，２７９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８４３，７３３号；同第５，７６２，９３９号；同第５，７５３，２２０号；同第５，６０５，８２７号；同第５，５８３，０２３号；同第５，５７１，７０９号；同第５，５１６，６５７号；同第５，２９０，６８６号；ＷＯ０２／０６３０５；ＷＯ０１／９０３９０；ＷＯ０１／２７３０１；ＷＯ０１／０５９５６；ＷＯ００／５５３４５；ＷＯ００／２００３２；ＷＯ９９／５１７２１；ＷＯ９９／４５１３０；ＷＯ９９／３１２５７；ＷＯ９９／１０５１５；ＷＯ９９／０９１９３；ＷＯ９７／２６３３２；ＷＯ９６／２９４００；ＷＯ９６／２５４９６；ＷＯ９６／０６１６１；ＷＯ９５／２０６７２；ＷＯ９３／０３１７３；ＷＯ９２／１６６１９；ＷＯ９２／０３６２８；ＷＯ９２／０１８０１；ＷＯ９０／１４４２８；ＷＯ９０／１００７８；ＷＯ９０／０２５６６；ＷＯ９０／０２１８６；ＷＯ９０／０１５５６；ＷＯ８９／０１０３８；ＷＯ８９／０１０３７；ＷＯ８８／０７０８２（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクターである、バキュロウイルス、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス核（ＡｃＮＰＶ）由来の、昆虫発現及びトランスファーベクターを含む。この系由来のウイルス発現ベクターは通常、強力なウイルスポリへドリン遺伝子プロモーターを使用して異種遺伝子の発現を駆動する。一般的に、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）を参照のこと。
バキュロウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する前に、プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関心のあるコード配列及び転写終結配列を含む上述の成分は、典型的には、中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクト（トランスファーベクター）中に集められる。中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクトは、細菌などの宿主において安定した維持が可能な染色体外エレメント（例えばプラスミド）など、レプリコンにおいて維持されることが多い。レプリコンは複製系を有し、したがって、これにより、クローニング及び増幅に適切な宿主において維持されるようになる。より具体的には、プラスミドは、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）及び原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子及びＥ．コリでの選択及び増殖のための複製起点を含有し得る。
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための、よく使用されるあるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、ＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する。）をはじめ、当業者にとって公知である、多くのその他のベクターも設計されてきた。Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ １７０：３１（１９８９）を参照のこと。その他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。
異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクター及び野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主中に共形質移入する。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当技術分野で公知である。ＳＵＭＭＥＲＳ及びＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ ＮＯ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７：３１を参照のこと。例えば、相同二重交叉組み換えにより、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に挿入し得、所望のバキュロウイルス遺伝子に組み込まれた制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１も参照のこと。
エレクトロポレーションによりトランスフェクションを遂行し得る。ＴＲＯＴＴＥＲ及びＷＯＯＤ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：（１９９５）；Ｍａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。あるいは、リポソームを使用して、昆虫細胞に組み換え発現ベクター及びバキュロウイルスを形質移入し得る。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６；及びＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４．２：２７４を参照のこと。市販のリポソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。さらに、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用し得る。ＴＲＯＴＴＥＲ及びＷＯＯＤ、３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７；並びにＭａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。
バキュロウイルス発現ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモーターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現は制御されるか又は構造的である。
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス性ポリへドロンタンパク質をコードする遺伝子（ＦＲＩＥＳＥＮ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（１９８６）；ＥＰ０１２７８３９及び０１５５４７６）及びｐ１０タンパク質をコ―ドする遺伝子（Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９；７６５）由来の配列が挙げられる。
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターを、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージし、続いて、当業者に公知の技術によって、増殖されたプラークを精製し得る。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＥＹＳ（１９８９）４：９１；ＳＵＭＭＥＲＳ及びＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
いくつかの昆虫細胞への感染のために、組み換えバキュロウイルス発現ベクターが開発されてきた。例えば、とりわけ、アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｈｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の組み換えバキュロウイルスが開発されている。Ｗｒｉｇｈｔ、ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６を参照のこと。一般に、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，インビトロ ＣＥＬＬ．ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクター系に対して使用される細胞株としては、一般に、以下に限定されないが、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルタ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルタ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、カタログ番号１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（トリコプルシア・ニー）及びＨｉｇｈ−ＦｉｖｅＴＭＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（トリコプルシア・ニー）が挙げられる。
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接及び融合発現両方のための、細胞及び培養用培地が市販されており、細胞培養技術は一般に当業者にとって公知である。
Ｅ．コリ、シュードモナス種ならびに他の原核生物
細菌発現技術は、当業者に公知である。細菌宿主での使用に対して多岐にわたるベクターが利用可能である。ベクターは、単一コピー又は低コピーもしくは高多コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び／又は発現に役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターが市販されていること、並びにベクター及びそれらの制限地図及び特性を記載するマニュアルを考慮すると、本明細書中で幅広い考察を行う必要はない。周知のとおり、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、このマーカーは、細胞毒性物質耐性、原栄養性又は免疫性を規定し得る。しばしば、複数のマーカーが存在し、これらが様々な特性を提供する。
細菌性プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインも有し得、これは、ＲＮＡ合成が開始される隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重なり得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特異的遺伝子の転写が抑制されるので、オペレーターにより、負に制御された（誘導型）転写が可能となる。オペレーターなどの負の制御エレメントの非存在下で恒常的発現が起こり得る。さらに、遺伝子活性化タンパク質結合配列により、正の制御を行い得、これは、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の一例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ｌａｃオペロンの転写開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３）。したがって、制御された発現は、正又は負の何れかのものであり得、それにより、転写が促進されるか又は抑制させる。
代謝経路酵素をコードする配列は、特に、有用なプロモーター配列を与える。一例として、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６）及びマルトースなどの糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６７７６号及び同第１２１７７５号（参照により本明細書中に組み込む。））などの生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８）及びＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号、参照により、本明細書中に組み込まれる。）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を与える。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用して、高レベルでＧＨ、例えばｈＧＨを誘導する。このようなベクターの例は当業者に公知であり、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリーズ及びＷＯ９９／０５２９７（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載のｐＰＯＰベクターが含まれる。このような発現系は、宿主細胞生存能又は増殖パラメータを害することなく宿主において高レベルのＧＨ、例えばｈＧＨを産生する。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、本分野において公知の別のベクターである。
さらに、天然にはない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を別の細菌又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結させて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る（米国特許第４，５５１，４３３号（参照により本明細書中に組み込む。））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーにより制御されるｌａｃオペロン配列の両方からなる、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．（１９８３）８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる非細菌由来の天然プロモーターを含み得る。原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルで発現させるために、非細菌由来の天然プロモーターを適合するＲＮＡポリメラーゼと組み合わせることもできる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組み合わされたプロモーター系の一例である（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーター及びＥ．コリオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開第２６７８５１）。
機能するプロモーター配列に加え、原核細胞での外来遺伝子の発現に対しては効率的なリボソーム結合部位も有用である。Ｅ．コリにおいて、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｈｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）及び開始コドンの３から１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｅｌｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｓｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編、１７９７））。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子及び原核遺伝子を発現させるために（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．１９８９）。
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又は他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる又は使用されてきた細菌を指す。この用語は、形質移入されたオリジナルの細菌宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、単一の親細胞の子孫は、当初の親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくは全体ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者にとって公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた封入体形成能、低タンパク質分解活性及び全体的な頑強性を有することを示すものを含み得る。細菌宿主は通常、以下に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。工業的／製薬的発酵は通常、Ｋ株（例えばＷ３１１０）由来の細菌又はＢ株（例えばＢＬ２１）由来の細菌を使用する。これらの株は、その増殖パラメータが非常によく知られておりロバストなので、特に有用である。さらに、これらの株は、非病原性であり、安全性及び環境面の理由で商業上重要である。適切なＥ．コリ宿主の別の例には、ＢＬ２１の株、ＤＨ１０Ｂ又はこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法の別の実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、以下に限定されないがＯＭＰ−及びＬＯＮ−などの、プロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、以下に限定されないが、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などの（これらに限定されない。）シュードモナス種であり得る。シュードモナス・フルオレセンス次亜種１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＭＢ１０１株と呼ばれる。）は、組み換え産生に有用であることが知られており、治療用タンパク質産生過程で利用可能である。シュードモナス発現系の例としては、宿主株として、Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ、ｄｏｗ．ｃｏｍにおいてＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで利用可能。）から入手可能な系が挙げられる。米国特許第４，７５５，４６５号及び同第４，８５９，６００号（参照により本明細書中に組み込む。）は、ＧＨ、例えばｈＧＨ産生のための宿主細胞としてのシュードモナス株の使用について述べている。
組み換え宿主細胞株を確立（即ち、発現コンストラクトを宿主細胞に導入し、正しい発現コンストラクトを有する宿主細胞を単離する。）した後、ＧＨ、例えばｈＧＨの産生に適切な条件下でその組み換え宿主細胞株を培養する。当業者にとって当然のことながら、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用する発現コンストラクトの性質及び宿主細胞の種類に依存する。当業者にとって公知である方法を用いて組み換え宿主株を普通に培養する。組み換え宿主細胞は、典型的には、炭素、窒素及び無機塩の同化可能なソースを含有し、場合によっては、当業者にとって公知である、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及びその他のタンパク性の培地補助物質を含有する液体培地中で培養する。宿主細胞培養用の液体培地は、望ましくない微生物の増殖を防ぐために抗生物質又は抗真菌剤を場合によっては含有し得、及び／又は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するために、以下に限定されないが抗生物質などの化合物を含有し得る。
組み換え宿主細胞をバッチ若しくは連続様式の何れかで培養し、細胞を回収するか（ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが細胞内に蓄積する場合。）、又はバッチ若しくは連続様式で培養上清を回収し得る。原核生物宿主細胞で産生を行う場合、バッチ培養及び細胞回収が好ましい。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、組み換え系での発現後、通常精製される。本分野で公知の様々な方法により、宿主細胞又は培地からＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを精製し得る。細菌宿主細胞中で産生されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、溶解性が低いか、又は不溶性であり得る（封入体形態において）。本発明のある実施形態において、本明細書中で開示する、ならびに本分野で公知の方法を利用して、組み換え産生されたタンパク質の溶解度を高める目的で選択したアミノ酸置換をＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドにおいて容易に行い得る。不溶性タンパク質の場合、遠心分離により宿主細胞溶解液からタンパク質を回収し得、さらに続いて、細胞の均質化を行い得る。溶解性の乏しいタンパク質の場合、化合物（以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。）を添加して、ある程度可溶性のタンパク質の沈殿を誘導し得る。次に、沈殿したタンパク質を従来どおり遠心分離により回収し得る。当業者にとって周知である様々な方法を用いて、組換え宿主細胞を破壊又は均質化して細胞内から封入体を放出させ得る。以下に限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波破砕、ダウンス型均質化又は高圧放出破壊法などの周知の技術を用いて、宿主細胞破壊又は均質化を行い得る。本発明の方法のある実施形態において、高圧放出破壊法を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を破壊し、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの封入体を放出させる。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの封入体を扱う場合、可溶化、機械的せん断又はタンパク質分解などの要素による喪失なく封入体の回収率を最大にするために、繰り返しでの均質化時間を最短にすることが有利であり得る。
次に、当技術分野で公知の多くの適切な可溶化剤の何れかを用いて、不溶性のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド又は沈殿した不溶性のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを可溶化し得る。不溶性のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、尿素又は塩酸グアニジンを用いて可溶化し得る。都合よく操作できるバッチサイズを用いて大きなバッチを産生できるように、可溶化された不溶性のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの体積は最少に抑えるべきである。数千リットルもの体積であるバッチにおいて組み換え宿主を増殖させ得る大規模な工業的設定において、この要素は重要であり得る。さらに、大規模な工業的設定で不溶性のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを製造する場合、特にヒトの医薬品の用途の場合、機械類もしくは容器類又はタンパク質産物そのものに損傷を与え得る強い化学物質の回避は、可能であれば避けるべきである。本発明の方法においては、強い変性剤である塩酸グアニジンの代わりにより穏やかな変性剤である尿素を使用してＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド封入体を可溶化できることが示されている。尿素を使用することにより、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド封入体を効率的に可溶化しながら、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの製造及び精製過程で利用するステンレス鋼の設備に損傷を与えるリスクが顕著に低下する。
可溶性ｈＧＨタンパク質の場合には、ペリプラスム間隙又は培地中にｈＧＨを分泌させ得る。さらに、宿主細胞の細胞質に可溶性ｈＧＨが存在し得る。精製段階を行う前に、可溶性ｈＧＨを濃縮することが望まれ得る。当業者に公知の標準的技術を用いて、例えば、細胞可溶化液又は培地から、可溶性ｈＧＨを濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質又はペリプラスム間隙から可溶性ｈＧＨを放出させ得る。
融合タンパク質としてＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが産生される場合には、融合配列は除去され得る。酵素的又は化学的切断によって、融合配列の除去を行い得る。当業者にとって公知の方法を用いて、融合配列の酵素的除去を行い得る。融合配列を除去するための酵素の選択は、融合物が何であるかによって決まり、当業者にとって当然のことながら、反応条件は選択した酵素によって特定される。化学的切断は、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ及びその他の試薬など（これらに限定されない。）、当業者に公知の試薬を用いて行い得る。切断されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、切断された融合配列から、当業者に公知の方法により精製され得る。当業者にとって当然のことながら、融合配列及びＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが何であるか及びそれらの特性により、このような方法が決定される。精製方法には、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析又はそれらの何らかの組合せが含まれ得る。
ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、またタンパク質溶液からＤＮＡを除去するために精製され得る。沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーなど、何らかの適切な当技術分野で公知の方法により、ＤＮＡを除去し得るが、以下に限定されないが硫酸プロタミンなどの、核酸沈殿剤を用いた沈殿により除去され得る。以下に限定されないが遠心分離又はろ過などの、標準的な周知の方法を用いて、沈殿されたＤＮＡからＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを分離し得る。ヒトを治療するためにＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを使用すべき状況において、宿主核酸分子の除去は重要な要素であり、本発明の方法により、宿主細胞ＤＮＡが医薬として許容されるレベルに低下する。
小規模又は大規模発酵の方法はまた、以下に限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空ファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌タンクバイオリアクター系など、タンパク質発現において使用することもできる。バッチ、半回分式又は連続様式過程において、これらの方法のそれぞれを行うことができる。
本発明のヒトｈＧＨポリペプチドは、一般に、当技術分野で標準的な方法を用いて回収し得る。例えば、培地又は細胞可溶化液を遠心分離又はろ過して、細胞残屑を除去することができる。上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか、又はさらなる精製のための調製に馴化するために適切な緩衝液中に透析ろ過することができる。本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのさらなる精製には、変形されていない形態からのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの脱アミド化及び短縮型を分離することが含まれる。
次の代表的な操作の何れかを本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの精製に用いることができる：アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー以下に限定されないが、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを用いる。）；シリカにおけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５などを用いる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動操作（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動を含む。）、異なる溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。
当業者にとって公知であり、当業者により使用されている標準的手段に従い、以下に限定されないが非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する結合対などを含む、本発明のタンパク質は、部分的に又は実質的に均一になるように精製することができる。したがって、以下に限定されないが硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む、当業者に公知の多くの方法の何れかにより、本発明のポリペプチドを回収及び精製することができる。正しく折り畳まれた成熟タンパク質の生成において、所望のとおりに、タンパク質再折り畳み段階を使用することができる。高純度が望まれる最終精製段階において、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又はその他の適切な方法を利用することができる。一実施形態において、以下に限定されないが、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質又の親和性を利用した精製のためなど、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して作製された抗体を精製試薬として使用する。望みどおり、ある程度又は均一になるまで精製した後、以下に限定されないがアッセイ成分、治療剤、予防剤、診断薬、研究試薬及び／又は抗体産生のための免疫原などとして、ポリペプチドを多岐にわたる用途に場合によっては使用する。
本明細書で示した他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折り畳み法が当業者に公知であり、これには、以下に限定されないが、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｎｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．第２版 Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第３版 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ，（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９８８），ＣＤ−ＲＯＭのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及び上記文献で引用されている参考文献が含まれる。
真核宿主細胞又は非真核宿主細胞での、非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドの産生の長所の１つは、通常、天然の立体構造で、タンパク質又はポリペプチドが折り畳まれていることである。しかし、本発明のある一定の実施形態において、合成、発現及び／又は精製後、タンパク質が、適切なポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有し得ることを当業者は認識する。本発明の一態様において、発現されたタンパク質を場合によっては変性させ、次いで再生する。以下に限定されないが、関心のあるタンパク質又はポリペプチドへのシャペロニンの添加によるもの、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中でタンパク質を可溶化することによるもの、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなど、当技術分野で公知の方法を利用してこれを行う。
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元し、次いで好ましい立体構造にポリペプチドを再折り畳みすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを関心のある翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び再生する方法は、当業者にとって公知である（上記の参考文献及び、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０を参照のこと。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジンＤＴＥ中での封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。以下に限定されないが、酸化されたグルタチオン及びＬ−アルギニンなどを含有するレドックス緩衝液中でタンパク質を再折り畳みすることができる。再折り畳み剤を流動させるか、あるいは１もしくはそれ以上のポリペプチド又はその他の発現産物と接触させるように移動させるか、又はその逆を行うことができる。
原核生物によるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの産生の場合、このように産生されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを誤折り畳みさせて、生物活性を失わせるか又は低下させることができる。「再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）」することにより、タンパク質の生物活性を復元し得る。一般に、例えば１又はそれ以上のカオトロピック剤（例えば尿素及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化し（ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドも不溶性である場合）、折り畳みを解き、還元することにより、誤折り畳みされたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを再折り畳みする。カオトロープの中程度の濃度において、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）を添加し、これにより、ジスルフィド結合を再形成させる。米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号及び同第４，５１２，９２２号に記載の方法などの、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを再折り畳みし得る。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、他のタンパク質と共折り畳みしてヘテロ二量体又はヘテロ多量体を形成することができる。
再折り畳み後、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをさらに精製し得る。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど又はこれらのあらゆる組み合わせを含む、当業者に公知の様々な技術を用いて達成され得る。さらなる精製は、精製されたタンパク質の乾燥又は沈殿の工程も含み得る。
精製後、ＧＨ、例えばｈＧＨポは、限外ろ過、透析ろ過及び透析などの（これらに限定されない。）、当業者に公知の様々なあらゆる方法によって異なる緩衝液中に交換し及び／又は濃縮し得る。単一の精製されたタンパク質として与えられるＧＨ、例えばｈＧＨは、凝集及び沈殿に供し得る。
精製されたＧＨ、例えばｈＧＨは、逆相高性能液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された場合に）少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋、又は少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％又はこれより純粋であり得る。ＧＨ、例えばｈＧＨの複数の正確な数値に関わらず、ＧＨ、例えばｈＧＨは、医薬品として使用するために、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合など、さらなる加工のために十分に純粋である。
ある種のＧＨ、例えばｈＧＨ分子は、他の活性成分若しくはタンパク質（賦形剤、担体及び安定化剤、血清アルブミンなど以外）の不存在下で、治療剤として使用することができ、又は他のタンパク質若しくはポリマーと複合体化させ得る。
一般的な精製方法
ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを含む、細胞可溶化液、抽出物、細胞培地、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質若しくは他の物質に対して、又は何らかの単離段階（以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層吸着又はこれらの何らかの組合せ及び／又は繰り返し（あらゆる適切な順番で）など）の結果生じるあらゆるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
本明細書中に記載の技術を行う際に使用する装置及びその他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及びシステム全体は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。以下に限定されないが、交換マトリックス材料、溶液及び緩衝液を含むクロマトグラフィーの材料もまた、このような会社から入手可能である。
ポンプなどの特別に設計された装置を用いて、平衡化並びに洗浄及び溶出などの本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィー過程における他の段階をより迅速に行うことができる。市販のポンプとしては、以下に限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）ポンプＰ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ Ｐ−１、Ｐｕｍｐ Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（Ｒ）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。ミキサーはまた、ｐＨ及び直線的な濃度勾配を形成するために利用できる。市販されているミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｉｘｅｒ ＧＭ−１及びＩｎ−Ｌｉｎｅ Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
何らかの市販のモニターを使用してクロマトグラフィー過程をモニタリングし得る。このようなモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨ及び伝導度などの情報を収集し得る。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（Ｒ）Ｓ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−Ｍ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ｐＨ／Ｃ９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。実際に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得られる様々なＡＫＴＡ（Ｒ）システムなど、全体的なシステムが市販されている。
本発明の一実施形態において、まず、得られた精製ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを尿素中で変性させた後、還元剤（ＤＴＴなど）を含有する適切なｐＨのＴＲＩＳ緩衝液中に希釈することによって、例えば、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを還元及び変性させ得る。別の実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、約２Ｍと約９Ｍの間の濃度範囲の尿素中で変性された後、約５．０ないし約８．０の範囲のｐＨのＴＲＩＳ緩衝液中に希釈される。本実施形態の再折り畳み混合物は、次いで、インキュベートし得る。一実施形態において、再折り畳み混合物は、４ないし２４時間の室温でインキュベートする。次いで、還元及び変性されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物は、さらに単離又は精製し得る。
本明細書中で述べるように、何らかの以降の単離段階を行う前に、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合液のｐＨを調整し得る。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知である技術を用いて、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を含む溶出緩衝液を、次の単離段階に適切な緩衝液に交換し得る。
イオン交換クロマトグラフィー 一実施形態において及び場合により実施されるさらなる段階として、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物に対してイオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。このようなカラムは、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ及びＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ及びＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体；及びＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する。精製過程の何れかの段階でＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを単離し得る。何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋された陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの複合物が挙げられる。
陽イオン交換マトリクスは、強及び弱陽イオン交換体を含む、何らかの適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広範囲のｐＨにわたりイオン化したままであり、したがって、広範囲のｐＨにわたり、ＧＨ、例えばｈＧＨに結合することが可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨの関数として、イオン化性を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、約ｐＨ４又はｐＨ５より下にｐＨが低下すると電荷を失い得る。適切な強い陽イオン交換体には、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホナート（Ｓ）又はスルホエチル（ＳＥ）などの帯電した官能基が含まれるが、これらに限定されるものではない。陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、約２．５から約６．０のＧＨ、例えばｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、約２．５から約５．５のＧＨ、例えばｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。この陽イオン交換マトリクスは、約３．０のＧＨ、例えばｈＧＨ結合ｐＨを有する強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、この陽イオン交換マトリクスは、約６．０から約８．０のＧＨ、例えばｈＧＨ結合ｐＨ範囲を好ましく有する強い陽イオン交換体であり得る。この陽イオン交換マトリクスは、約８．０から約１２．５のＧＨ、例えばｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、強い陽イオン交換体は、約８．０から約１２．０のＧＨ、例えばｈＧＨｐＨ範囲を有し得る。
ＧＨ、例えばｈＧＨを載せる前に、例えば、希釈弱酸の数カラム体積、例えば２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３の４カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。平衡化した後、ＧＨ、例えばｈＧＨを添加し得、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨを溶出する前に、また弱い酢酸などの弱酸溶液又はリン酸溶液を用いて、カラムを１回から数回洗浄し得る。例えば、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３のおよそ２から４カラム体積を使用して、カラムを洗浄し得る。例えば０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５又は、０．１Ｍ塩化ナトリウムと混合した０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５の２から４カラム体積を使用して、さらなる洗浄を行うことができる。あるいは、当技術分野で公知の方法を用いて、希釈した弱塩基の数カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。
あるいは、十分に低いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝液と陽イオン交換マトリクスを接触させてマトリクスからＧＨ、例えばｈＧＨを排除することにより、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０であり得る。より具体的には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０の範囲であり得る。溶出緩衝液は、約３．０のｐＨを有し得る。さらに、溶出緩衝液の量は広く変動することができ、一般に、約２から約１０カラム体積の範囲である。
陽イオン交換マトリクスへのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの吸着後、十分に高いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝液とマトリクスを接触させてマトリクスからＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを排除することにより、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ８．０から約ｐＨ１２．５であり得る。より具体的には、溶出緩衝液は、約ｐＨ８．０から約ｐＨ１２．０の範囲を変動し得る。十分に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの高ｐＨ溶出での使用に適切な緩衝液としては、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、クエン酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が含まれ、本発明において用途を見出し得る。
逆相クロマトグラフィー
当業者にとって公知である適切なプロトコールに従い、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照のこと。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対してＲＰ−ＨＰＬＣを行って、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用し得る（これは、スチレンポリマー樹脂である。）。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを洗浄し得る。ＳｏｕｒｃｅＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの別の例である。
イオン対合剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はエタノールなどの有機変性剤を含有する適切な溶出緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを溶出し得る。最も一般的に使用されるイオン対合剤としては、以下に限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム及び酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられる。分離時間を短くし、ピーク幅を狭めるのに好ましい勾配条件を用い、１つ又はそれ以上の勾配もしくは定組成条件を用いて、溶出を行い得る。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２種類の勾配を使用することを含む。本明細書中での使用に適切な溶出緩衝液の例には、以下に限定されないが、酢酸アンモニウム及びアセトニトリル溶液が含まれ得る。
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行い得る。全般に、ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照のこと（参照により本明細書中に組み込む。）。適切なＨＩＣマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋されたアガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリラート）マトリクス及び混合された様式の樹脂（以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換されたポリ（メタクリラート）マトリクスなど）を含む、アルキル又はアリール置換されたマトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換されたマトリクスなどが含まれ得る。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。簡単に述べると、酢酸／塩化ナトリウム溶液又は硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳなどの、当業者にとって公知の標準的緩衝液を用いて、試料添加前にＨＩＣカラムを平衡化し得る。ＨＩＣカラムに搭載するための緩衝液として、硫酸アンモニウムを使用し得る。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを添加した後、次に、望ましくない物質を除去するが、ＨＩＣカラム上にＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを保持するために、標準的緩衝液及び条件を用い、カラムを洗浄し得る。特に、ＥＤＴＡ及び平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液又は酢酸／塩化ナトリウム緩衝液などの標準的緩衝液の約３から約１０カラム体積でＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを溶出し得る。例えばリン酸カリウム勾配を用いて、塩を直線的に低下させる勾配を使用して、ＧＨ、例えばｈＧＨ分子を溶出することもできる。次に、例えば透析ろ過又は限外ろ過などのろ過により、溶出物を濃縮し得る。透析ろ過を利用して、ＧＨ、例えばｈＧＨを溶出するために用いた塩を除去し得る。
その他の精製技術
例えば、ゲルろ過（ＧＥＬ ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（参照により本明細書中に組み込む。）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）などの、適切なマトリクス）、ＨＰＬＣ、膨張層吸着、限外ろ過、透析ろ過、凍結乾燥などを用いて、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対してさらに別の単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終薬剤産物の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
当業者にとって公知の技術を用いて、本明細書中に記載されている各段階で、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの収率を観察し得る。最後の単離段階後に、このような技術を用いて、実質的に精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの収率を評価することもできる。例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどの、様々なアルキル鎖長を有する幾つかの逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムの何れかを用いて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの収率を観察し得る。
本発明の具体的な実施形態において、各精製段階後のＧＨ、例えばｈＧＨの収率は、各精製段階の出発物質中のＧＨ、例えばｈＧＨの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％又は少なくとも約９９．９９％であり得る。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準的技術を用いて、又はウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてＧＨ、例えばｈＧＨを測定することにより、純度を決定し得る。例えば、ネガティブ対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離したタンパク質に対してポリクローナル抗体を生成させ得る。この抗体を使用して、混入宿主細胞タンパク質の存在を調べることもできる。
ＲＰ−ＨＰＬＣ物質、Ｖｙｄａｃ Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を有する表面からなる。タンパク質性不純物からのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度の相違に基づく。希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて溶出を行う。ステンレス鋼カラムを用いて分取ＨＰＬＣを行う（Ｖｙｄａｃ Ｃ４シリカゲル２．８から３．２Ｌで満たす。）。トリフルオロ酢酸を添加することにより、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出液を酸性化し、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムに添加する。洗浄及び溶出のために、希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いる。画分を回収し、すぐにリン酸緩衝液で中和する。ＩＰＣ限界内のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド画分をプールする。
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）物質は、セファロースビーズの表面に共有結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基への選択したＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。保持されることなく、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸がカラムを通過する。これらの物質を洗い流した後、低ｐＨの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより、微量の不純物を除去する。次に、このカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、イオン強度が上昇していく緩衝液を用いてＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを溶出する。カラムにＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗを充填する。３から１０ｍｇのＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド／ｍｌゲルの範囲でＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを添加することができるようにするために、カラム体積を調整する。水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムを洗浄する。ＨＰＬＣ溶出の画分をプールしたものを添加し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄する。続いて、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムからＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを溶出し、主たる溶出プロファイルに従い、単一の画分中に回収する。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出液を指定の伝導度に調整する。得られた薬物物質をろ過滅菌してＴｅｆｌｏｎボトルに入れ、−７０℃で保管する。
利用し得るさらなる方法としては、エンドトキシンを除去する段階が挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシンは、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に位置するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低下させる方法は当業者にとって公知であり、これには、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、アフィニティー、サイズ排除、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組合せなどが含まれる。一緒に移動したタンパク質などの夾雑物を目的のポリペプチドから除去するために、変法又はさらなる方法が必要であり得る。エンドトキシンのレベルを測定するための方法は当業者に公知であり、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｃｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイが含まれるが、これに限定されない。
以下に限定されないが、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、マススペクトロメトリー（以下に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。）及び当業者にとって公知の、タンパク質の特徴を調べるための他の方法など、多岐にわたる方法及び手段を使用して、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨタンパク質の収率及び純度を評価することができる。
さらなる方法には、タンパク質染色法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析的陰イオン交換、クロマトフォーカシング及び円二色性が含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩＩＩ．代替系での発現
非組み換え宿主細胞、変異誘発された宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかの戦略が利用されてきた。これらの系はまた、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの作製での使用にも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変換された。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的連結及びネイティブ化学連結の最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ及びＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６９：９２３（２０００）。化学的ペプチド連結及び固有化学的連結は、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許公開第２００４／０１３８４１２号、米国特許公開第２００３／０２０８０４６号、ＷＯ ０２／０９８９０２号及びＷＯ ０３／０４２２３５号に記載されており、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。１００を超える非天然アミノ酸を実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成を支持可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，ＳＪ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ、ＣＧ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質折り畳み、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、幅広い官能基がタンパク質に導入されてきた。
野生型シンテターゼの乱交性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を利用して、選択圧取り込みと呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照のこと。天然アミノ酸の限定濃度を含有する最小培地で、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路のスイッチがオフになっている栄養要求性株を増殖させ、同時に標的遺伝子の転写を抑制する。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸を枯渇させ、非天然アミノ酸類似体で置き換える。組み換えタンパク質の発現の誘発により、非天然類似体を含有するタンパク質の蓄積が起こる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンをタンパク質に取り込み、容易に同定できる、ＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩が示され（例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照。）；トリフルオロメチオニンを使用して、バクテリオファージＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換し、１９Ｆ ＮＭＲによりチトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が調べられ（例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに取り込み、その結果、ロイシンジッパ―タンパク質の温度及び化学安定性が高まった。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照のこと。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンを様々な組み換えタンパク質に取り込み、Ｘ線結晶解析での相の溶解を促進させる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ及びＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ及びＭ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照のこと。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニン類似体もまた効率的に取り込まれ、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる修飾が可能となった。例えば、Ｊ．Ｃ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開２００２／００４２０９７（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般に、これにはタンパク質翻訳の忠実度を確実にする高い選択性が必要である。本方法の範囲を広げるある方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、これが遂行されたのは限られたケースである。例えば、エシェリヒア．コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙで置換することにより、基質結合ポケットが大きくなり、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｉｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この変異ＰｈｅＲＳを有するエシェリヒア・コリ株により、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの取り込みが可能となる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、エシェリヒア．コリのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位付近の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、アザチロシンがチロシンよりも効率的に取り込まれることが分かった。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｌｌ及びＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで取り込むための別の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは識別することができず、したがって、同種の天然アミノ酸と構造的に類似のアミノ酸を活性化する。このエラーは別の部位で補正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからのミスチャージアミノ酸が脱アシル化される。シンテターゼの校正活性が機能しない場合、間違って活性化された構造類似体が編集機能を逃れ、取り込まれる。バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）により、このアプローチが近年明らかにされた。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ及びＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：５０１（２００１）を参照のこと。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノブチラート（Ａｂｕ）で間違ってアミノアシル化し得；続いて、編集ドメインによりこれらの非同種アミノ酸を加水分解する。エシェリヒア・コリ染色体のランダム変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位に変異を有する変異エシェリヒア・コリ株を選択した。この編集機能欠損ＶａｌＲＳは、ＣｙｓによりｔＲＮＡＶａｌを不正確に処理する。Ａｂｕは立体的にＣｙｓに類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基はＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置き換えられている。）、この変異エシェリヒア・コリ株をＡｂｕ存在下で増殖させた場合、変異ＶａｌＲＳもまたタンパク質にＡｂｕを取り込む。質量分析から、天然型タンパク質中の各バリン位置においてバリンの約２４％がＡｂｕにより置換されることが示される。
固相合成及び半合成法によってもまた、新規アミノ酸を含有する多くのタンパク質の合成が可能となった。例えば、次のような、以下の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｈ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ，２２：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
インビトロでタンパク質に補因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドなどの様々な非天然側鎖を導入するために、化学修飾が使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．ｅｔ Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅｒ Ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，８８：３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照のこと。
あるいは、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロで合成されたタンパク質に取り込むために、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成法が使用されてきた。例えば、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｓｃｅｎｔ ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
以前、所望のアンバーナンセンス変異を含有する遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＭＡを加えることにより、非天然アミノ酸がインビトロでタンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることが示された。これらのアプローチを用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である株を使用し、多くの一般的な２０種類のアミノ酸を構造が近い相同体で、例えばフェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．２０２ ３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照のこと。
例えば、停止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡを調製し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化した。従来の部位特異的変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子の関心のある部位に停止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ及び変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組合せた場合、指定の位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質を与えるＵＡＧコドンに反応して非天然アミノ酸が取り込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験から、所望するアミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定された位置に取り込まれること、及びこのアミノ酸がタンパク質中の他の何れの位置にも取り込まれないことが分かった。例えば、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（６）：４２５−４３２；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照のこと。
ｔＲＮＡは、化学的又は酵素的なアミノアシル化を含む（これらに限定されない。）あらゆる方法又は技術によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、又はリボザイムを含む（これに限定されない。）他の酵素分子によって達成し得る。「リボザイム」という用語は、「触媒的ＲＮＡ」と互換的である。Ｃｅｃｈと共同研究者ら（Ｃｅｃｈ， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３６：１５３２−１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２１−２２６）は、触媒として作用することが可能な天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在を実証した。しかしながら、これらの天然ＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質に対して、切断及びスプライシングのために作用することが示されているに過ぎず、リボザイムの人工的な進化の最近の発展により、様々な化学反応に対する触媒のレパートリーが拡大している。研究によって、それら自身の（２’）３’末端に対してアミノアシルＲＮＡ結合を触媒することが可能なＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：６４３−６４７）及びあるＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子へとアミノ酸を転移させることが可能なＲＮＡ分子（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４４２−４４４）が同定されている。
米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、リボザイムを構築する方法並びに天然にコードされているアミノ酸及び天然においてコードされていないアミノ酸を用いた、ｔＲＮＡのアミノアシル化におけるそれらの使用について記載している。ｔＲＮＡをアミノアシル化させることが可能な酵素的分子（リボザイムを含むが、これに限定されない。）の基質に固定された形態は、アミノアシル化された産物の効率的なアフィニティー精製を可能とし得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれる。アミノアシル化用リボザイムの基質固定化された形態の作製及び使用は、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３， １０：１０７７−１０８４」及び米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
化学的なアミノアシル化の方法には、アミノアシル化におけるシンテターゼの使用を回避するために、Ｈｅｃｈｔと共同研究者ら（Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． １９９２， ２５， ５４５；Ｈｅｃｋｌｅｒ， Ｔ． Ｇ．；Ｒｏｅｓｓｅｒ， Ｊ． Ｒ．；Ｘｕ， Ｃ；Ｃｈａｎｇ， Ｐ．；Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８， ２７， ７２５４；Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ．；Ａｌｆｏｒｄ， Ｂ． Ｌ．；Ｋｕｒｏｄａ， Ｙ．；Ｋｉｔａｎｏ， Ｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９７８， ２５３， ４５１７）並びにＳｃｈｕｌｔｚ、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びその他（Ｃｏｒｎｉｓｈ， Ｖ． Ｗ．；Ｍｅｎｄｅｌ， Ｄ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９５， ３４， ６２１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｓ． Ａ．；Ｅｌｌｍａｎ， Ｊ． Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３， ２７２２；Ｎｏｒｅｎ， Ｃ． Ｊ．；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ， Ｓ． Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ， Ｍ． Ｃ；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９， ２４４， １８２；Ｂａｉｎ， Ｊ． Ｄ．；Ｇｌａｂｅ， Ｃ． Ｇ．；Ｄｉｘ， Ｔ． Ａ．；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ， Ａ． Ｒ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８９， １１１， ８０１３；Ｂａｉｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２， ３５６， ５３７；Ｇａｌｌｉｖａｎ， Ｊ． Ｐ．；Ｌｅｓｔｅｒ， Ｈ． Ａ．；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｄ． Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９７， ４， ７４０；Ｔｕｒｃａｔｔｉ， ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ２７１， １９９９１；Ｎｏｗａｋ， Ｍ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８， ４３９；Ｓａｋｓ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９９６， ２７１， ２３１６９；Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， ３４）（これらは、参照により、本明細書宙に組み込まれる。）によって導入された方法が含まれるが、これらに限定されない。このような方法又は他の化学的アミノアシル化の方法は、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために使用し得る。
触媒的ＲＮＡを生成するための方法は、ランダム化されたリボザイム配列の分離したプール生成すること、プールに対して誘導された進化を実施すること、所望のアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングすること、及び所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選択すること、を含み得る。
リボザイムは、ＧＧＵモチーフ及びＵが豊富な領域などの、アシル化活性を促進させるモチーフ及び／又は領域を含むことが可能である。例えば、Ｕが豊富な領域はアミノ酸基質の認識を促進させ得ること、及びＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成し得ることが報告されている。共同して、ＧＧＵ及びモチーフ及びＵが豊富な領域は、アミノ酸とｔＲＮＡの両方の同時認識を同時に促進し、これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を促進する。
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎ ＣＣＣＧと結合された、部分的にランダム化されたｒ２４ｍｉｎｉを使用し、続いて、活性なクローン中に見出されるコンセンサス配列の体系的エンジニアリングを行うインビトロ選択によって生成することが可能である。本方法によって得られた典型的なリボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と名付けられ、米国出願公開２００３／０２２８５９３号（その内容は、参照により本明細書宙に組み込まれる。）に記載されており、同族非天然アミノ酸が搭載された様々なアミノアシル−ｔＲＮＡの合成のための多目的触媒として作用する。
基質上への固定は、アミノアシル化されたｔＲＮＡの効率的なアフィニティー精製を可能とするために使用し得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれるが、これらに限定されない。対応するジアルデヒドを生じさせて樹脂上のＲＮＡの固定化を促進するために、ＲＮＡのリボース上の３’−シス−ジオールを過ヨウ素酸塩で酸化することが可能であるなど、ＲＮＡの化学的構造を活用することによって、樹脂の上にリボザイムを固定することが可能である。安価なヒドラジド樹脂など、樹脂の様々な種類を使用することが可能であり、還元的アミノ化が樹脂とリボザイム間の相互作用を不可逆的連結とする。アミノアシル−ｔＲＮＡの合成は、このオンカラムアミノアシル化技術によって著しく促進することが可能である。「Ｋｏｕｒｏｕｋｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；３６：２３９−４」は、カラムを基礎としたアミノアシル化システムを記載している。
アミノアシル化されたｔＲＮＡの単離は、様々な様式で達成することが可能である。１つの適切な方法は、１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えた酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンーＮ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液又は単純にＥＤＴＡ緩衝化された水（ｐＨ７．０）などの緩衝液で、アミノアシル化されたｔＲＮＡをカラムから溶出することである。
翻訳反応によって作製されるポリペプチド中の選択された位置に、ｔＲＮＡのアミノアシル化に用いたアミノ酸を取り込ませるために、翻訳反応にアミノアシル化されたｔＲＮＡを添加することが可能である。本発明のアミノアシル化されたｔＲＮＡが使用され得る翻訳系の例には、細胞可溶化液が含まれるが、これに限定されない。細胞可溶化液は、入力ｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロ翻訳するために必要な反応成分を提供する。このような反応成分の例には、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始及び伸長因子及び翻訳と関連するさらなる因子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、翻訳系は、バッチ翻訳又は区画化された翻訳であり得る。バッチ翻訳系は単一コンパートメント中の反応成分を組み合わせるのに対して、区画化された翻訳系は翻訳効率を阻害することが可能な反応産物から翻訳反応成分を分離する。このような翻訳系は市販されている。
さらに、連結された転写／翻訳系を使用し得る。連結された転写／翻訳系は、対応するｍＲＮＡへの入力ＤＮＡの両転写を可能とし、次いで、対応するｍＲＮＡは反応成分によって翻訳される。市販の連結された転写／翻訳の例は、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ， Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）である。系は、リボソーム及び翻訳因子などの翻訳成分を提供するために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）可溶化液を含有する混合物を含む。さらに、翻訳において使用するためのｍＲＮＡテンプレートへと、入力ＤＮＡを転写するために、ＲＮＡポリメラーゼが含められる。ＲＴＳは、供給／廃棄コンパートメント及び転写／翻訳コンパートメントを含む反応コンパートメントの間に介在される膜によって反応成分のコンパートメント化を使用することが可能である。
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒的抗体、多機能タンパク質などを含む（これらに限定されない。）他の因子によって実行し得る。
「Ｌｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ．２００１ Ｏｃｔ；８（４）：７５９−６９」は、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに、タンパク質を化学的に連結させる方法（発現されたタンパク質の連結）を記載している。
非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、マイクロインジェクション技術も使用されてきた。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照のこと。インビトロで作製された２種類のＲＮＡ種（関心のあるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）をアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注入した。次に、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究が可能となった（これは、通常、インビトロ発現系に適さない。）。例としては、蛍光共鳴エネルギー転移により距離を測定するための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への取り込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ及びＡ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照。）；イオンチャネルにおいて表面に曝露された残基を同定するためのビオチン化アミノ酸の取り込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照。）；イオンチャネルにおける立体構造変化をリアルタイムでモニタリングするためのケージ化されたチロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）を参照；及びそれらのゲーティング機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変化させるためのαヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ及びＪ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照のこと。
インビボでタンパク質に非天然アミノ酸を直接取り込むことができることから、変異タンパク質の収率が高くなること、技術が容易であること、細胞もしくは可能であれば生きている生物での変異タンパク質の研究の可能性、ならびに、治療処置でのこれらの変異タンパク質の使用などの（これらに限定されない。）様々な長所が得られる。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性及びその他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることができれば、タンパク質機能を調べ、かつ新規の特性を有する新しいタンパク質又は生物を作製するための、タンパク質構造に対する合理的かつ体系的な操作能が飛躍的に拡大し得る。
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを取り込むある試みにおいて、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求性エシェリヒア．コリ株で、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼペアが使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）を参照のこと。
無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリヌクレオチドの発現を得ることも可能であり得る。翻訳系は、細胞又は無細胞であり得、及び原核生物又は真核生物であり得る。細胞翻訳系には、所望の核酸配列をｍＲＮＡへ転写し、ｍＲＮＡを翻訳することができる透過化された細胞又は細胞培養物などの完全な細胞調製物が含まれるが、これらに限定されるものではない。無細胞翻訳系は市販されており、多くの異なる種類及び系が周知である。無細胞系の例には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）可溶化液などの原核生物可溶化液並びに麦芽抽出物などの真核生物可溶化液、昆虫細胞可溶化液、ウサギ赤血球可溶化液、ウサギ卵母細胞及びヒト細胞可溶化液が含まれるが、これらに限定されない。得られるタンパク質が、グリコシル化され、リン酸化され、又はその他の修飾を受けている場合には、このような多くの修飾は真核生物系でのみ可能なので、真核生物抽出物又は可溶化液が好ましいことがあり得る。これらの抽出物及び可溶化液の幾つかは市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， １１１．；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎ．Ｙ．）。分泌タンパク質を翻訳するのに有用である、ミクロソーム膜を含有するイヌ膵臓抽出物などの膜抽出物も使用できる。これらの系では（テンプレートとしてのｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてのＤＮＡ（組み合わされたインビトロ転写と翻訳）の何れかを含むことができる。）、インビトロ合成は、リボソームによって誘導される。無細胞タンパク質発現系の開発に対して多大な努力が行われてきた。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１５３７−１５４２（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６，１８０−１８８（１９９９）；及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４，８６２−８６８（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開２００２／００８１６６０；ＷＯ００／５５３５３；ＷＯ９０／０５７８５（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの発現に対して適用し得る別のアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が含まれる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照のこと。このアプローチにおいて、ピューロマイシンに連結されているｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１つ又はそれ以上のｔＲＮＡ分子が改変されている場合、非天然アミノ酸もそのペプチドに取り込ませることができる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピューロマイシンがペプチドのＣ末端を捕獲する。生じたｍＲＮＡ−ペプチド結合体が関心のある特性を有することがインビトロアッセイにおいて分かった場合、ｍＲＮＡ配列からそれが何であるかを容易に明らかにすることができる。このようにして、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定し得る。さらに最近、精製された成分を用いたインビトロリボソーム翻訳により、天然においてコードされていないアミノ酸で置換されたペプチドの合成が可能となることが報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照のこと。
再構成された翻訳系も使用し得る。ｍＲＮＡをタンパク質へと首尾よく翻訳するために精製された翻訳因子の混合物も使用され、及び可溶化液の組み合わせ又は開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（α又はβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）又は終結因子などの精製された翻訳因子が補充された可溶化液も使用されてきた。無細胞系は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３）」に記載されているように（参照により、特に本明細書に具体的に組み込まれる。）、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡへと転写され、ｍＲＮＡが翻訳される連結された転写／翻訳系でもあり得る。真核生物転写系中で転写されたＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）又は５’末端ｃａｐｓ（７−メチルグアノシン）及び３’末端ポリＡ尾部化された成熟ｍＲＮＡの形態であり得、これは、ある種の翻訳系において有利であり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、赤血球可溶化液系中で、高い効率で翻訳される。
ＸＶ．ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結された巨大分子ポリマー
本明細書に記載されている組成物、方法、技術及び戦略を用いて、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質が含まれる。）を含む。本明細書に記載されている、組成物、方法、技術及び戦略の例示的な非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略がまた、他の官能基（以下に限定されないが上記で挙げたものなど）を添加するのに適用可能（必要に応じて適切な改変を行い、これは当業者が本明細書中開示を用いて行い得る。）であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに多岐にわたる巨大分子ポリマー及びその他の分子を連結してＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの生物学的特性を調節する、及び／又はＧＨ、例えばｈＧＨ分子に新しい生物学的特性を与えることができる。天然コードアミノ酸を介して、天然においてコードされていないアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の何らかの官能置換基又は、天然もしくは非天然アミノ酸に付加されている何らかの置換基もしくは官能基を介して、これらの巨大分子ポリマーをＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結することができる。このポリマーの分子量は、広範囲にわたり、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上などである。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
本発明は、ポリマー：タンパク質結合体の実質的に均一な調製物を与える。「実質的に均一な」とは、本明細書中で使用する場合、ポリマー：タンパク質結合体分子がタンパク質全体の半分よりも多いことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質結合体は、生物活性を有し、本明細書中で提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド調製物は、均一な調製物の長所（例えば、ロットの異なるものの薬物動態の予測可能性において臨床適用が容易であるなど）を示すよう十分均一であるものである。
ポリマー：タンパク質結合体分子の混合物を調製することを選択することもでき、それにより与えられる長所とは、混合物に含めるためのモノポリマー：タンパク質結合体の比を選択し得るということである。したがって、所望であれば、様々な数の結合されたポリマー部分を有する（即ち、ジ−、トリ−、テラ−など）様々なタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質結合体と前記結合体を組み合わせ、モノ−ポリマー：タンパク質結合体の前もって決定された比率を有する混合物を有することができる。
選択されたポリマーは、これに結合させるタンパク質が水性環境（生理的環境など）で沈殿しないように水溶性であり得る。このポリマーは、分枝又は非分枝であり得る。最終産物調製物の治療用途の場合、このポリマーは医薬として許容される。
ポリマーの例には、ポリアルキルエーテル及びそのアルコキシキャップ化類縁体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、及びメトキシ又はエトキシキャップ化されたその類縁体、特にポリオキシエチレングリコール、後者は、ポリエチレングリコール又はＰＥＧとしても知られる。）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン及びポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド及びポリヒドロキシアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリラート；ポリシアル酸及びその類縁体；親水性ペプチド配列；デキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストランサルファート、アミノデキストランを含む多糖及びそれらの誘導体；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチン及びその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸及びその誘導体；デンプン；アルギナート；コンドロイチンサルファート；アルブミン；プルラン及びカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸及びその誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルタミド；スチレンマレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテルマレイン酸無水物共重合体などのマレイン酸無水物共重合体；ポリビニルアルコール；その共重合体；そのターポリマー；その混合物及び先述されているものの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は、反応混合物中におけるこれらの濃度と同じく、変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応性基の数において決定され得る。分子量に関連して、典型的には、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率が高くなる。
本明細書中で使用する場合、及びＰＥＧ：ＧＨ（例えばｈＧＨポリペプチド）結合体を想定する場合、「治療的有効量」という用語は、患者に対して所望の有効性を与える量を指す。この量は、個々の患者により変化し、患者の全体的な身体的状態及び治療を行うべき状態の根本的な原因を含む、多くの要因に依存する。治療に使用されるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの量は、許容可能な変化の速度を与え、有用なレベルで所望の応答を維持する。本発明の組成物の治療的有効量は、公に入手可能な物質及び手段を用いて当業者により容易に確定され得る。
水溶性ポリマーは、以下に限定されないが、直鎖状、フォーク状又は分枝状を含む、あらゆる構造形態であり得る。典型的には、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などであるが、その他の水溶性ポリマーも利用できる。一例として、ＰＥＧを使用して、本発明のある一定の実施形態を説明する。
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当業者に公知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，１３８−１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさ又はＰＥＧの末端の修飾に関わらずあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結される場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
により表すことができる。
（式中、ｎは、２から１０，０００であり、及びＸはＨであり、又は、以下に限定されないがＣ１−４アルキル、保護基又は末端修飾基などの末端修飾である。）
ある場合において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。あるいは、ＰＥＧは反応性基で終結することができ、これにより、二官能性ポリマーが形成される。典型的な反応性基には、２０種類の一般的アミノ酸で見られる官能基（以下に限定されないが、マレイミド基、活性化されたカーボナート（以下に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）、活性化されたエステル（以下に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）及びアルデヒドなど）ならびに、２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが天然においてコードされていないアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基（アジド基、アルキン基などを含むが、これらに限定されない。）と反応させるために一般に使用される反応性基が含まれ得る。ＰＥＧの他方の末端（上記式中では、Ｙによって示される。）は、天然又は天然においてコードされていないアミノ酸を介して、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに直接又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、アミド、カルバマート又は、ポリペプチドのアミノ基（以下に限定されないが、リジンのεアミン又はＮ末端が含まれるが、これらに限定されない。）への尿素結合であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（以下に限定されないが、システインのチオール基が含まれるが、これらに限定されない。）へのマレイミド結合であり得る。あるいは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成させることができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を天然においてコードされていないアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の産物を形成させることができる。幾つかの実施形態において、強い求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドなど）を天然においてコードされていないアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成させることができ、規定どおりに、ある場合においては、適切な還元剤を用いた処理によりそれをさらに還元することができる。あるいは、天然においてコードされていないアミノ酸を介して強い求核試薬をＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込み、これを使用して水溶性ポリマーに存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させることができる。
実際に所望される場合は、以下に限定されないが、要望どおり、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ又はそれ以上（以下に限定されないが、時には、０．１から５０ｋＤａ又は１０から４０ｋＤａなど）など、ＰＥＧのあらゆる分子量を使用することができる。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上が含まれる。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。以下に限定されないが、各鎖が１から１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する（以下に限定されないが、１から５０ｋＤａ又は５から２０ｋＤａなど）ＰＥＧ分子を含む分枝鎖ＰＥＧもまた使用することができる。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、以下に限定されないが、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、及び１，０００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと２０，０００Ｄａの間である。以下に限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（参照により本明細書中に組み込む。）などに、多岐にわたるＰＥＧ分子が記載されている。
一般に、天然においてコードされていないアミノ酸との反応に、少なくとも１つのＰＥＧ分子の末端を利用できる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書に記載のとおり、天然においてコードされていないアミノ酸にＰＥＧを連結させることができる。天然においてコードされていないアミノ酸がアジドを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］付加環化産物の形成を実現するためのアルキン部分又は、アミド結合の形成を実現するためのホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（即ち、エステル、カルボナート）の何れかを含有する。あるいは、天然においてコードされていないアミノ酸がアルキンを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化産物の形成を実現するためのアジド部分を含有する。天然においてコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含有する場合、ＰＥＧは、典型的には、対応するヒドラゾン、オキシム及びオキシム及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれ実現するために、強力な求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基など）を含む。あるいは、上述の反応基の方向が逆であるものを使用することができ、即ち、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と天然においてコードされていないアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアントは、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性がある化学官能基を含有する。
本発明は、幾つかの実施形態において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格を含む、アジド−及びアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、以下に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール及びその他の関連ポリマーを含む（ポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）など）多岐にわたる水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、このような分子全てを包含し、含むものとすることを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）（二官能性ＰＥＧ、複数アーム化されたＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に垂れ下がった、１つ又はそれ以上の官能基を有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）又はその中に分解性の結合を有するＰＥＧなど）を含む。
ＰＥＧは、典型的には、透明で無色、無臭、水溶性、熱安定性、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は分解せず、通常は無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であるとみなされ、つまり、ＰＥＧは、害を与えることなく生体組織又は生物と共存可能である。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、身体において免疫反応を生じさせる傾向がない。生物活性物質など、身体においていくつかの望ましい機能を有する分子に付着させる場合、ＰＥＧは、その物質をマスクする傾向があり、生物がその物質の存在を耐容できるように、あらゆる免疫反応を低下させるか、又は取り除くことができる。ＰＥＧ結合体は実質的な免疫反応を引き起こさないか、又は凝固もしくはその他の不必要な影響を生じさせない傾向がある。式：−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−を有するＰＥＧ（式中、ｎは約３から約４０００、典型的には約２０から２０００である。）は、本発明での使用に適切である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、これは、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
ポリマー骨格は、直鎖又は分岐であり得る。分枝ポリマー骨格は、一般に、当技術分野において公知である。典型的に、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分を有し、直鎖状ポリマー鎖の複数が中央分枝コアに連結されている。ＰＥＧは、一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加により調製することができる分枝形態で使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸由来であり得る。Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールなどのコア部分由来であり、ｍは腕部分の数を表す。）のような一般式で分枝ポリ（エチレングリコール）を表すことができる。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；同第５，２２９，４９０号；同第４，２８９，８７２号；米国特許公開２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９；及びＷＯ９３／２１２５９（それぞれ本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に記載のものなどの、多アーム化されたＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用できる。
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、Ｚは指定された長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。）によって表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得る。
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応基を有する。
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中の弱い又は分解性結合を用いて、ポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解に供されるポリマー骨格中のエステル結合を用いてＰＥＧを調製できる。下記で示すように、この加水分解の結果、ポリマーがより低分子量の断片に切断される。
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語が、以下に限定されないが、本明細書中に開示されているものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことが、当業者により理解される。
多くの他のポリマーもまた本発明での使用に適切である。幾つかの実施形態において、水溶性であり、２から約３００の末端を有するポリマー骨格は本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、その他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、そのコポリマー（以下に限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど）、そのターポリマー、これらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であり得るが、典型的に、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
実質的に水溶性の骨格に対する前述の一覧は、網羅的なものではなく、単なる例示に過ぎず、上述の質を有する全てのポリマー性物質が本発明での使用に適切なものとして想定されることを、当業者は認識する。
本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、つまり、ポリマー骨格が少なくとも２つの末端を有し、官能基により官能化又は活性化された、約３００末端にのぼる末端を有する可能性があることを意味する。多官能性ポリマー誘導体としては、以下に限定されないが、２つの末端（各末端は同じもしくは異なり得る官能基に結合されている。）を有する直鎖状ポリマーが挙げられる。
一実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは連結部分（存在してもよく、存在しなくてもよい。）であり；
ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じであるか、又は異なっていてもよい。）であり；
Ｘは、第二の官能基である。）を有する。
Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられ、１個から１０個の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素又は硫黄などの複素原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、複素原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分の他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下の炭素原子を含有する多官能性アリール基が挙げられ、５個から６個の炭素原子を含有し得る。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又は硫黄原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとして想定されることを、当業者は認める。
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カルボナート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカルボナート及び１−ベンゾトリアゾリルカルボナートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアジドが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないよう、アジド基と適合可能であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアジド部分であることを意味するか又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど）であり得る。当技術分野で公知のその他の保護基もまた、本発明において使用し得る。
文献中の末端官能基の具体例としては、以下に限定されないが、Ｎ−スクシニミジルカルボナート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）を参照。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｚら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照。）、スクシニミジルプロピオナート及びスクシニミジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１７０−１８１、Ｈａｒｒｉｓ及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９７を参照。；米国特許第５，６７２，６６２号も参照のこと。）、スクシニミジルスクシナート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照。）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照。）、ベンゾトリアゾールカルボナート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号参照。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照。）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１（１９８５）を参照。）、ｐ−ニトロフェニルカルボナート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）；及びＳａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ２：２９（１９８４）及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照。）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照。）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照。）が挙げられる。上記参考文献及び特許を全て、本明細書中に参照により組み込む。
本発明のある一定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、及び
ｎは約２０から約４０００である。）
を有するポリマー骨格を含む。
別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、
Ｗは、１個から１０個の炭素原子を含む、脂肪族又は芳香族リンカー部分であり；
ｎは約２０から約４０００であり；
Ｘは上述のような官能基であり、ｍはｍは１から１０である。）
を有するポリマー骨格を含む。
当技術分野で公知及び／又は本明細書中に開示されている様々な方法により、本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。下記で示すある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な脱離基に第二の末端が結合するポリマー骨格）をアジド陰イオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどの適切な対イオンの何れかの数と対合し得る。）と反応させる。脱離基は求核置換され、アジド部分により置換され、これにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３ −→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されているように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。）を有する。適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン及びビニルピリジンならびにケトンが挙げられる。適切な脱離基の例としては、以下に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート及びトシラートが挙げられる。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、アジド官能基を含有する連結剤を平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（ここで、この連結剤は、連結基によりアジドがポリマー骨格から離されているアジド含有ポリマー誘導体産物を形成するために、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応する化学官能基を有する。）に接触させる。
例となる反応スキームを以下に示す。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；及び、Ｍは、アジド官能基と反応性がないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。）
適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、Ｎがアミンである場合、Ｍが、カルボン酸、カルボナート又は活性エステルである；Ｎがヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合、Ｍがケトンである；Ｎが求核試薬である場合、Ｍが脱離基であるものが挙げられる。
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要であれば）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を下記に示すが、この場合、アミンのうち１個がｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分により保護され、アジド官能基を有する連結部分と、生じたモノ保護化ＰＥＧジアミンとを反応させる。
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この例において、塩化チオニル又はカルボジイミド剤及びＮ−ヒドロキシスクンイミド又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの様々な活性化剤を用いて、アミン基をカルボン酸基とカップリングさせ、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を形成させることができる。アミド結合をうまく形成させた後、生じたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護化アジド含有誘導体を直接用いて、生物活性分子を修飾するか、又はこれをさらに変化させて、その他の有用な官能基を取り込むことができる。例えば、強酸での処理によりＮ−ｔ−Ｂｏｃ基を加水分解して、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成させることができる。生じたアミンを合成ハンドルとして使用して、有用なヘテロ二官能性試薬を生成させるための、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどのその他の有用な官能基を取り込むことができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたい場合、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧにより、ＰＥＧの一方の末端への、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カルボナートなどの活性化された求電子基を有する分子の結合及びＰＥＧの他方の末端へのアセチレン基を有する分子の結合が可能となる。
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（式中、Ｒは、Ｈ又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリールもしくは置換されたアリール基の何れかであり得；
Ｂは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよい。）であり；
ポリは、水溶性非抗原性ポリマーであり；
Ａは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じか異なっていてもよい。）であり、
Ｘは第二の官能基である。）
を有する。
Ａ及びＢの連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられ、１個から１０個の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素又は硫黄などの複素原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、複素原子において分枝され得る。Ａ及びＢの連結部分の他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下の炭素原子を含有する多官能性アリール基が挙げられ、５個から６個の炭素原子を含有し得る。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又は硫黄原子により置換され得る。適切な連結基の他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号；及び同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する多様な連結部分が本発明での使用に有用なものとして想定されることを、当業者は認める。
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カルボナート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカルボナート及び１−ベンゾトリアゾリルカルボナートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアセチレンが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないよう、アセチレン基と適合可能であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは第二の官能基（即ちＸ）もアセチレン部分であることを意味し、又はヘテロ二官能性であり得、これは第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、
ｎは約２０から約４０００であり、及び
ｍは１から１０である。）
を有するポリマー骨格を含む。
ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーのそれぞれの具体例を下記に示す。
当業者にとって公知の方法及び／又は本明細書中で開示する方法を用いて、本発明のアセチレン−含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。ある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な求核基に第二の末端が結合するポリマー骨格）を、アセチレン官能基とおよび脱離基（ＰＥＧ上の求核基との反応に適切なもの）の両方を有する化合物と反応させる。求核部分を有するＰＥＧポリマー及び脱離基を有する分子を組み合わせた場合、脱離基において求核置換が起こり、求核部分により置換され、これにより、所望のアセチレン含有ＰＥＧポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されているように、本反応での使用する好ましいポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、及びＸは、Ｎｕ、Ｌ又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。）を有する。
Ｎｕの例としては、以下に限定されないが、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシラート、ヒドラジド、アミノオキシ基（主にＳＮ２型の機構を介して反応する。）が挙げられる。Ｎｕ基のさらなる例としては、求核付加反応を介して主に反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート及びトシラート及び、求核置換が行われると予想される他の基ならびに、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β−不飽和カルボニル基、カルボナート及び、求核試薬により付加が起こると予想される他の求電子基が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、Ａは、１個から１０個の間の炭素原子の脂肪族リンカー又は６個から１４個の間の炭素原子の置換されたアリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり、一方の末端に保護化された官能基又はキャッピング剤の何れかを有しており、他方の末端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーをアセチレン陰イオンと接触させる。
例となる反応スキームを以下に示す。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；及びＲ’は、Ｈ又は、アルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシ基もしくは置換されたアルキル、アルコキシル、アリールもしくはアリールオキシ基の何れかである。）
上記の例において、脱離基Ｌは、アセチレン陰イオンの十分な濃度と接触させた場合に、ＳＮ２型の置換を起こすよう十分に反応性があるべきである。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２型の置換を遂行するのに必要な反応条件は、当技術分野で周知である。
未精製産物の精製は、通常、産物の沈殿後、場合により行われるクロマトグラフィーなど（これらに限定されない。）本分野で公知の方法によって達成することが可能である。
水溶性ポリマーは、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結することが可能である。水溶性ポリマーは、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸又は何れかの官能基又は天然にコードされていない若しくは天然にコードされているアミノ酸の置換基、又は天然においてコードされていない若しくは天然においてコードされているアミノ酸に付加された何らかの官能基若しくは置換基を介して連結され得る。あるいは、水溶性ポリマーは、天然に存在するアミノ酸（システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基を含むが、これらに限定されない。）を介して、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込まれているＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結される。幾つかの事例では、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマー（ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖を含むが、これらに限定されない。）に連結されている、１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個の非天然アミノ酸を含む。幾つかの事例では、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、さらに、水溶性ポリマーに連結されている１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個又はそれ以上の天然にコードされたアミノ酸を含む。幾つかの事例において、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸及び水溶性ポリマーに連結された天然に存在する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明において使用される水溶性ポリマーは、結合されていない形態に比べて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの血清半減期を増大させる。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）は、インビボ半減期などの変化された（増加又は減少を含むが、これらに限定されない。）薬理学的、薬物動態的又は薬力学的特性を提供するように調整することが可能である。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨの半減期は、修飾されていないポリペプチドに比べて、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍増加する。
強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明のある実施形態において、カルボニル含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、ＰＥＧ骨格へ直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾する。
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によって存在しても存在しなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
幾つかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、及びＸは、場合によって存在しても存在しなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有し、分枝ＰＥＧ誘導体で修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０から４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５−２０ｋＤａの範囲のＭＷであり得る。
本発明の別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によって存在しても存在しなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
幾つかの実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
水溶性ポリマーがｈＧＨポリペプチドに連結している程度及び部位により、ｈＧＨポリペプチド受容体への、部位１におけるｈＧＨポリペプチドの結合を調節することができる。幾つかの実施形態において、本発明は、オキシム結合によって少なくとも１つのＰＥＧに連結されているＧＨ、例えばｈＧＨを提供し、オキシム結合を形成するために反応中で使用されるＰＥＧは、図１９に示されているように、直鎖の、３０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミンカルバマート塩酸塩である。図２０は、本発明のある種の実施形態の合成において有用な、直鎖の、３０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミンカルバマート塩酸塩の合成の図式例を示している。
本明細書に記載されている組成物、方法、技術及び戦略とともに使用し得るＰＥＧ試薬の種類又はクラスの単なる例として、及びＰＥＧ試薬の種類又はクラスの限定としてではなく、図２１は、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応して、ＰＥＧ基に連結されたオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することが可能なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のさらなる実例を示しており、並びに、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチド又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応して、ＰＥＧ基に連結された新規オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することが可能なカルボニル含有ＰＥＧ試薬の例を示している。図２２は、ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬又はヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成するための合成方法の４つの実例を示している。図２３は、アミド結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬又はアミド結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はアミド結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成するための合成方法の実例を示している。図２４及び図２５は、カルバマート結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬又はカルバマート結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はカルバマート結合されたヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成するための合成方法の実例を示している。図２６は、単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬又は単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又は単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成するための合成方法の実例を示している。さらに、図２７は、連結されたＰＥＧ基の複数の分岐を有するヒドロキシルアミン含有試薬の実例を示しており、連結された複数ＰＥＧ分岐基を有するオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための、１つのこのようなヒドロキシルアミン含有複数ＰＥＧ分岐試薬の、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応をさらに示している。
本発明において有用な水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、例えばオキシム結合を形成することができるように改変されたＰＥＧのさらなる例は、２００４年１２月２２日に出願され、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ， ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ， ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された米国特許出願６０／６３８，４１８号；６０／６３８／５２７号及び６０／６３９，１９５号（これらは、参照により、全体が本明細書中に組み込まれる。）中に認め得る。これらは、２００５年７月１日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ， ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ， ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された米国特許出願６０／６９６，２１０号；６０／６９６，３０２号及び６０／６９６，０６８号（参照により、これらの全体が本明細書中に組み込まれる。）にも記載されている。
水溶性ポリマーがＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに連結している程度及び部位により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体の部位１へのＧＨ例えばｈＧＨポリペプチドの結合を調節することができる。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨについて「Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：７８６２−７８６７（１９８８）」に記載されているように、平衡結合アッセイによって測定された場合に、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが、約４００ｎＭ以下のＫｄで、１５０ｎＭ以下のＫｄで、幾つかの事例では、約１００ｎＭ以下のＫｄで、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体の部位１に結合するように、結合が調整される。
ポリマーの活性化のためのならびにペプチドとの結合のための方法及び化学反応は、文献中に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般に使用される方法としては、以下に限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタールアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化が挙げられる。（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、ＰＲＯＴＥＩＮ ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＬＩＧＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照。）。
ＰＥＧの官能化及び結合のいくつかの概説及び論文が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照のこと。
ポリマーの活性化のための方法はまた、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号及びＷＯ９３／１５１８９においても、並びに活性化されあたポリマーと、以下に限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジムスターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−５２（１９８５））を含む酵素との間の結合についても見出すことができる。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
何らかの従来法により、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。例えば、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体によりＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをＰＥＧ化する。簡潔に述べると、室温にて、撹拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの水溶液に固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量を添加する。典型的には、反応を行うｐＨ付近（通常約ｐＨ４から１０）のｐＫａを有する緩衝液で水溶液を緩衝化する。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例としては、例えば、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ホスファート、ボラート、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨを連続して観察し、必要であれば調整する。反応は、典型的には、約１時間から４８時間連続して行う。
続いて反応産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及び、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端で活性化されている場合に形成され得、それによりＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント分子を架橋する、ＰＥＧ化ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの全ての高分子量複合体から、ＰＥＧ化ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの際の条件は、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムから流出し、一方であらゆる架橋ＰＥＧ化ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント複合体は、１又はそれ以上のＰＥＧ基に結合されている１個のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント分子を含有する所望の形態の後に溶出するようなものである。適切な条件は、架橋複合体対所望の結合体の相対サイズにより異なり、当業者は容易にこれを決定する。所望の結合体を含有する溶出物を限外ろ過により濃縮し、透析ろ過により脱塩する。
必要に応じて、以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを使用する。）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５などを使用する。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動操作（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動など）、異なる溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）又は抽出などの、当業者にとって公知の１つ又はそれ以上の手段により、疎水性クロマトグラフィーから得たＰＥＧ化されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドをさらに精製することが可能である。球状タンパク質標準（Ｐｒｅｎｅｔａ，ＡＺ ｉｎ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ編）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９，２９３−３０６）と比較することによるＧＰＣによって、見かけの分子量を推定し得る。タンパク質分解（以下に限定されないが、トリプシン切断など）を行い、次いでマススペクトロメトリー分析を行うことにより、ＧＨ、例えばｈＧＨ−ＰＥＧ結合体の純度を評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
何らかの従来法により、例えばｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンなどのカルボニル基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。限定的でない例として、カルボニル含有天然においてコードされていないアミノ酸、例えばｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含有するＧＨ、ｈＧＨポリペプチドは、分子量約０．１ないし１００ｋＤａ、又は約１ないし１００ｋＤａ、又は約１０ないし５０ｋＤａ、又は約２０ないし４０ｋＤａ、又は例えば３０ｋＤａのアミノオキシエチルアミンカルバマートｍＰＥＧ誘導体でＰＥＧ化される。簡潔には、固体ＭＰＥＧ−オキシアミン、例えばｍＰＥＧ（３０，０００）−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＯＮＨ３ ＋（直鎖３０ｋＤａモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミオノキシエチルアミンカルバマート塩酸塩、３０Ｋ ＭＰＥＧ−オキシアミン）の過剰量が、室温で撹拌しながら、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン含有ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの水溶液へ添加される。ＰＥＧ：ＧＨ、例えばｈＧＨのモル比は、約２ないし１５、又は約５ないし１０、又は約５、６、７、８、９若しくは１０であり得る。典型的には、水溶液は、反応が実施されるべきｐＨ近くの（一般には、ｐＨ約２ないし８）ｐＫａを有する緩衝液で緩衝される。ｐＨ４．０でのＰＥＧ化についての適切な緩衝液の１つには、例えば酢酸の添加によってｐＨ４．０へ調整される酢酸ナトリウム／グリシン緩衝液が含まれるが、これには限定されない。反応は、典型的には、室温で穏やかに振盪しながら、約１ないし６０時間、又は約１０ないし５０時間、又は約１８ないし４８時間、又は約３９ないし５０時間継続する。ＰＥＧ化は、ＳＤＳゲルによって確認され得る。
その後、反応生成物は、例えば遊離３０Ｋ ＭＰＥＧ−オキシアミン及びＰＥＧ化されたＧＨの高分子量複合体（例えば、遮断されていないＰＥＧが分子の両端で活性化される時に形成され、これによりＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント分子を架橋し得るｈＧＨポリペプチド）からの精製へ供される。いずれかの適切な精製方法、例えばＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液Ａ及びＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液Ｂを使用するＳｏｕｒｃｅＱカラムによる実施などのカラムクロマトグラフィーが使用され得る。反応混合物は、カラムへの負荷の前に、トリス塩基及びＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液Ａ及びＭｉｌｌｉＱ水で希釈され得る。望ましい結合体を含有する溶出液は、限外ろ過によってさらに濃縮され得、透析ろ過によって脱塩され得る。
必要であれば、クロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、当業者に公知の及び本明細書に記載の１つ又はそれ以上の手法によってさらに精製され得る（例えば、上述参照）。最終的なＰＥＧ化されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、９９．９又は９９．９９％を超える純度で取得し得る。純度は、本分野で公知の方法によって測定され得る。純度を評価する典型的な非限定的方法には、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを使用してＧＨ、例えばｈＧＨを測定するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ブラッドフォードアッセイ、（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含むが、これには限定されない）質量分析、ＲＰ ＨＰＬＣ、陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどのＨＰＬＣ法、並びに当業者に公知のタンパク質を特徴付けるための他の方法が含まれる。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのアミノ酸へ連結された水溶性ポリマーは、限定なしに、さらに誘導体化され得るか又は置換され得る。
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、末端アジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａの範囲の、及び５−２０ｋＤａであり得るＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アルキン含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。例えば、ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及びＸは、場合によって、各場合において、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である（存在してもよいし、存在しなくてもよい。）。）
を有する。
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している末端アジド又は末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、アルキン含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、末端アルキン部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａの範囲の、及び５から２０ｋＤａであり得るＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アジド含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。例えば、ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によって、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、又は存在しない。）を有する。
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化された官能基（以下に限定されないが、エステル、カルボナートなど）を含有するＰＥＧ誘導体により、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、幾つかの実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2008525473
 （式中、ｎは１から１０であり、ＸはＯ、Ｎ、Ｓであり得るか、又は存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、及びＷは水溶性ポリマーである。）
を有する。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2008525473
式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、及びＲはＨ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリール基であり得る。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、これらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが含まれるが、これらに限定されない。）、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できる。
他のＰＥＧ誘導体及び一般的なＰＥＧ化技術
ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドへ連結され得るその他の典型的なＰＥＧ分子及びＰＥＧ化方法には、米国特許公開２００４／０００１８３８；２００２／００５２００９；２００３／０１６２９４９；２００４／００１３６３７；２００３／０２２８２７４；２００３／０２２０４４７；２００３／０１５８３３３；２００３／０１４３５９６；２００３／０１１４６４７；２００３／０１０５２７５；２００３／０１０５２２４；２００３／００２３０２３；２００２／０１５６０４７；２００２／００９９１３３；２００２／００８６９３９；２００２／００８２３４５；２００２／００７２５７３；２００２／００５２４３０；２００２／００４００７６；２００２／００３７９４９；２００２／０００２２５０；２００１／００５６１７１；２００１／００４４５２６；２００１／００２１７６３；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６（これらを参照により本明細書中に組み込む。）に記載されているものが含まれる。本明細書に記載されているＰＥＧ分子の何れも、一本鎖、分枝鎖、マルチアーム鎖、単一官能性、二官能性、多官能性又はこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）あらゆる形態で使用され得る。
血清アルブミンに対する親和性の促進
様々な分子を本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに融合させて、血清中のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの半減期を調節することもできる。幾つかの実施形態において、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに分子を連結又は融合させて、動物中の内在性血清アルブミンに対する親和性を増大させる。
例えば、ある場合において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドと及びアルブミン結合性配列との組み換え融合物を作製する。代表的なアルブミン結合性配列には、以下に限定されないが、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｉｔｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）及びＳｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照。）又は例えばＤｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが含まれる。
他の実施形態において、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを脂肪酸でアシル化する。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照のこと。
他の実施形態において、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを血清アルブミン（以下に限定されないが、ヒト血清アルブミンなど）と直接融合させる。本発明において、多岐にわたるその他の分子をＧＨ、例えばｈＧＨに連結させて、血清アルブミン又はその他の血清成分への結合性を調節することもできることを、当業者は認識する。
ＸＶＩ．ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドのグリコシル化
本発明は、糖残基を有する１又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を取り込んでいるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを含む。糖残基は、天然（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンなど）又は非天然（以下に限定されないが、３−フルオロガラクトースなど）の何れかであり得る。糖はＮ−又はＯ−結合型グリコシド結合（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンなど）又は非天然結合（以下に限定されないが、オキシム又は対応するＣ−もしくはＳ−結合型グリコシドなど）の何れかにより、天然においてコードされていないアミノ酸に連結し得る。
糖（以下に限定されないが、グリコシルなど）部分をインビボ又はインビトロの何れかでＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに付加し得る。本発明の幾つかの実施形態において、アミノオキシ基により誘導体化された糖を用いてカルボニル含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾し、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化されたポリペプチドを生成させる。天然においてコードされていないアミノ酸に付着させた後、グリコシルトランスフェラーゼ及びその他の酵素を用いた処理を行ってＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成させることにより、糖をさらに加工し得る。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照のこと。
本発明の幾つかの実施形態において、アミノオキシ誘導体として調製された規定される構造を有するグリカンを用いて、カルボニル含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを直接修飾する。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジドなどの他の官能基を使用して、天然においてコードされていないアミノ酸に糖を連結させることができることを、当業者は認める。
本発明の幾つかの実施形態において、次いで、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（以下に限定されないが、それぞれアルキニル又はアジド誘導体などを用いて。）などにより、アジド又はアルキニル含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾することができる。この方法により、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができるようになる。
ＸＩ．ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの二量体及び多量体
本発明はまた、以下に限定されないが、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体（即ち、三量体、四量体など）などの、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの組み合わせ（ＧＨ、例えばｈＧＨ及びｈＧＨ類縁体を含むが、これらに限定されない。）を提供するが、この場合、１又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＧＨ、例えばｈＧＨなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは、ポリペプチド骨格に直接、又はリンカーを介しての何れかで、別のＧＨ、例えばｈＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーもしくはそれらのバリアント又は非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー若しくはそれらのバリアントである何らかの他のポリペプチドに結合されている。単量体と比較してその分子量が増加していることから、ＧＨ、例えばｈＧＨなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの二量体又は多量体結合体は、以下に限定されないが、単量体ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーと比べて、異なる薬理学的、薬物速度論的、薬物動態的特性、調節された治療半減期又は調節された血漿半減期など、新しい、又は所望する特性を示し得る。幾つかの実施形態において、本発明の二量体、ＧＨ、例えばｈＧＨなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー受容体の二量体化を調節する。別の実施形態において、本発明のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー二量体又は多量体は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー受容体のアンタゴニスト、アゴニスト又は調節物質として作用する。
幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するｈＧＨ中に存在するＧＨ、例えばｈＧＨ分子の１又はそれ以上は、部位ＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。このため、二量体又は多量体のＧＨ、例えばｈＧＨ分子の各々は、部位Ｉインターフェースを介して、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体への結合のために接近可能であるが、部位ＩＩインターフェースを介した、第二のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体への結合のためには利用できない。従って、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド二量体又は多量体は、２つの異なるＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体の各々の部位Ｉ結合部位に関与することが可能であるが、ＧＨ、例えばｈＧＨ分子は、部位ＩＩ領域中に存在する遺伝的にコードされていないアミノ酸に付着された水溶性ポリマーを有するので、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド受容体は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドリガンドの部位ＩＩ領域に関与することができず、二量体又は多量体は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドアンタゴニストとして作用する。幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に存在するＧＨ、例えばｈＧＨ分子の１又はそれ以上は、部位Ｉ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含み、部位ＩＩ領域への結合を可能とする。あるいは、幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド中に存在するＧＨ、例えばｈＧＨ分子の１又はそれ以上は、両部位が結合に利用可能なように、部位Ｉ又は部位ＩＩ結合領域内ではない部位に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、部位Ｉ、部位ＩＩを有し、又は両者を結合に使用できるＧＨ、例えばｈＧＨ分子の組み合わせが使用される。少なくとも１つが結合に利用可能な部位Ｉを有し、及び少なくとも１つが結合に利用可能な部位ＩＩを有するＧＨ、例えばｈＧＨ分子の組み合わせは、所望の活性又は特性を有する分子を提供し得る。さらに、結合に利用可能な部位Ｉ及び部位ＩＩを両方有するＧＨ、例えばｈＧＨ分子の組み合わせは、スーパーアゴニストＧＨ、例えばｈＧＨ分子を産生し得る。
ある実施形態において、以下に限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合などを介して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは直接連結される。幾つかの実施形態において、連結されたＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは、二量体化を促進するために、異なる天然においてコードされていないアミノ酸を含み、以下に限定されないが、第一のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの１つの天然においてコードされていないアミノ酸中のアルキン及び第二のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドの第二の天然においてコードされていないアミノ酸中のアジドなどは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により結合される。あるいは、ヒドロキシルアミン含有天然においてコードされていないアミノ酸を含む第二のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドに、第一のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー及び／又は、ケトン含有天然においてコードされていないアミノ酸を含む連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドを結合させ、対応するオキシムの形成を介してこれらのポリペプチドを反応させる。
あるいは、２個のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーが、リンカーを介して連結される。何らかのヘテロ又はホモ二官能性リンカーを使用して、２個のスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド（同じ又は異なる一次配列を有し得る。）を連結させることができる。ある場合において、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドを一緒に連結するために使用するリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であり得る。このリンカーは、幅広い分子量又は分子長を有し得る。より大きい又はより小さい分子量のリンカーを使用して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーと連結された物体との間に、又はＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーとＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーに対する受容体との間に、又は連結された物体とＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーに対する受容体との間に、所望の空間的関係又は立体構造を与え得る。より長い又はより短い分子長のリンカーを使用して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーと連結された物体の間に、又はＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーとその受容体の間に、又は連結された物体とＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーに対する受容体との間に、所望の空間又は柔軟性を与えることもできる。同様に、特定の形又は立体構造を有するリンカーを利用して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーがその標的に到達する前又は後の何れかに、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー又は連結された物体に特定の形又は立体構造を与え得る。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーと連結された物体との間の空間的関係をこのように最適化することにより、新しい、調節された、又は所望の特性を分子に対して与え得る。
ある実施形態において、本発明は、ダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供するが、これには以下のものを含む：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第一の末端における、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分；及びｂ）ポリマー骨格の第二の末端における少なくとも第二の官能基。第二の官能基は、第一の官能基と同じ又は異なり得る。第二の官能基は、ある実施形態において、第一の官能基と反応性がない。本発明は、ある実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
ある実施形態において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
（式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２から１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分であり得、Ｒは、Ｘと同じもしくは異なり得る、キャッピング基、官能基又は脱離基である。）
を有する水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された、１つ又はそれ以上のＧＨスーパー遺伝子ファミリーの要素（ＧＨ、例えばｈＧＨなど）を含む多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボナート、１−ベンゾトリアゾリルカルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート及びトレシラート、アルケン及びにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
ＸＩＩ．ｈＧＨポリペプチドの活性及びｈＧＨポリペプチド受容体に対するｈＧＨポリペプチドの親和性の測定
ｈＧＨ受容体は、「ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４５：４９４−４９９（１９８９） ａｎｄ Ｌｅｕｎｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３０：５３７−５４３（１９８７）」に記載されているように調製することが可能である。ｈＧＨポリペプチド活性は、標準的な又は公知のインビトロ又はインビボアッセイを用いて測定することが可能である。例えば、ｈＧＨ受容体結合を観察するために、ｈＧＨの存在下で増殖する細胞株（例えば、ｈＧＨ受容体又は乳腺刺激受容体を発現する細胞株）を使用することが可能である。例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３６）：２１９６９（１９９６）；Ｗａｄａ， ｅｔ ａｌ．， ＭｏＩ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １２：１４６−１５６（１９９８）；Ｇｏｕｔ， Ｐ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４０， ２４３３−２４３６（１９８０）；ＷＯ ９９／０３８８７を参照のこと。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化又はＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドの場合、ホルモン受容体に対するホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって測定することが可能である。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号；Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２６３：７８６２−７８６７（１９８８）を参照のこと。ｈＧＨ活性を検査するためのインビボ動物モデルには、例えば、「Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３６）：２１９６９−２１９７７（１９９６）」に記載されているものが含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの二量体化能力に対するアッセイは、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：８２１−８２５（１９９１） ａｎｄ Ｆｕｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６：１６７７−１６８０（１９９２）」に記載されているように実施することが可能である。引用する参考文献及び特許を全て、本明細書中に参照により組み込む。
アッセイ方法に関する参考文献の編集は網羅的なものではなく、当業者であれば、所望される最終結果を検査するために有用な他のアッセイが自明である。
ＸＩＩＩ．効力、機能的インビボ半減期及び薬物動態学的パラメータの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのポリペプチドの結合あり又は無しで、ｈＧＨポリペプチドの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ｈＧＨポリペプチド血清濃度が急激に減少することにより、結合及び非結合ｈＧＨポリペプチド及びそれらのバリアントを用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。好ましくは、本発明の、結合及び非結合ｈＧＨポリペプチドならびにそれらのバリアントは、皮下又は静脈内投与後にも延長された血清半減期を有することができ、これにより、例えばＥＬＩＳＡ法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）から得られるＥＬＩＳＡ又はＲＩＡキットを使用し得る。インビボ生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているとおりに実施される。
天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの効力及び機能的インビボ半減期は、「Ｃｌａｒｋ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３６）：２１９６９−２１９７７（１９９６）」に記載されているプロトコールに従って決定することが可能である。
天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドに対する薬物動態学的パラメータは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Ｎ＝５動物／処置群）において評価することが可能である。動物は、２５μｇ／ラット静脈内又は５０μｇ／ラット皮下の単回投与の何れかを受け、予め確定された時間（一般に、水溶性ポリマーに結合されていない、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの場合には、約６時間、天然においてコードされていないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに結合されているＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの場合には、約４日に及ぶ。）に従って、約５−７個の血液試料を採取する。ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対する薬物動態データは、幾つかの種において詳しく研究されており、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対して得られたデータに対して直接比較することが可能である。ＧＨ、例えばｈＧＨに関する研究については、「Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（ｌｌ）：１３５１−５９（１９９１）」を参照されたい。
薬物動態学的パラメータは、霊長類、例えば、カニクイザルにおいて評価することも可能である。典型的には、単一の注射は、皮下又は静脈内の何れかで投与することができ、経時的に、血清ＧＨ、例えばｈＧＨレベルがモニターされる。さらなる記述については、実施例を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳類へ皮下投与されるとき、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、４、１５、１６時間又は１６時間超の平均血清半減期を有するＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳類へ皮下投与されるとき、少なくとも約０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間又は１２時間超の平均血清半減期を有するＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。「平均」血清半減期は、少なくとも３匹の動物、又は少なくとも４匹の動物、又は少なくとも５匹の動物又は５匹超の動物の平均である。哺乳類は、いくつかの実施形態において、ラットであり、いくつかの実施形態において、哺乳類は、カニクイザルなどまたはヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態において、本発明は、皮下投与されるときに、非ＰＥＧ化形態にあるＧＨ、例えばｈＧＨの少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍又は５０倍超の平均血清半減期である、哺乳類における平均血清半減期を有するＰＥＧ化したＧＨ、例えばＰＥＧ化したｈＧＨを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、皮下投与されるときに、哺乳類中で、非ＰＥＧ化形態にあるＧＨ、例えばｈＧＨの少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍又は５０倍超の平均血清半減期を有するＰＥＧ化されたＧＨ、例えばＰＥＧ化されたｈＧＨを提供する。「平均」血清半減期は、少なくとも３匹の動物、又は少なくとも４匹の動物、又は少なくとも５匹の動物又は５匹超の動物の平均である。哺乳類は、いくつかの実施形態において、ラットであり、いくつかの実施形態において、哺乳類は、カニクイザルなどまたはヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態において、ＧＨは、ＧＨ、例えばｈＧＨである。いくつかの実施形態において、成長ホルモンは、少なくとも１つの水溶性ポリマーへ共有結合によって連結され、ここにおいて、共有結合はオキシム結合である。ＧＨは、ＧＨ、例えばｈＧＨであり得る。いくつかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨには、カルボニル含有の天然においてコードされていないアミノ酸などの、天然においてコードされていないアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ケトン含有アミノ酸、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２におけるアミノ酸３５に相当するＧＨ、例えばｈＧＨにおけるある位置で置換される天然においてコードされていないアミノ酸、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する。水溶性ポリマーは、ＰＥＧであり得る。適切なＰＥＧには、直鎖及び分岐鎖のＰＥＧが含まれ、本明細書に記載のいずれかのＰＥＧが使用され得る。特定の実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし１００ｋＤａ又は約１ないし１００ｋＤａ又は約１０ないし５０ｋＤａ又は約２０ないし４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えばオキシム結合によって３０ｋＤａ ＰＥＧへ連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含有し、ここにおいてオキシム結合は、配列番号２におけるアミノ酸３５に相当するＧＨ中の位置に存在するｐ−アセチルフェニルアラニンと、ＰＥＧとの間にある。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの比活性は、本分野において公知の様々なアッセイによって測定することが可能である。本発明に従って取得及び精製されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドミュテイン又はその断片の生物学的活性は、本明細書に記載された若しくは参照された方法によって、又は当業者に公知の方法によって検査することが可能である。
ＸＩＶ．投与及び医薬組成物
以下に限定されないが、適切な医薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質（以下に限定されないが、ＧＨ、例えばｈＧＨ、シンテターゼ、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質など）を場合によっては使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬として許容される担体又は賦形剤とを含有する。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はこれらの組合せが挙げられる。製剤は、投与様式に適切となるように作製される。一般に、タンパク質の投与方法は、当業者に周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、オキシム結合である共有結合によって少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結された成長ホルモンと、及び医薬として許容される賦形剤とを含むホルモン組成物を含有する医薬組成物を提供する。ＧＨは、ｈＧＨであり得る。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、カルボニルを含有する天然においてコードされていないアミノ酸などの天然においてコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ケトン含有アミノ酸、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２中のアミノ酸３５に対応するＧＨ、例えばｈＧＨ中の位置において置換された、天然においてコードされていないアミノ酸、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する。水溶性ポリマーは、ＰＥＧであり得る。適切なＰＥＧには、直鎖及び分岐ＰＥＧが含まれ、本明細書中に記載されている全てのＰＥＧを使用し得る。特定の態様において、ＰＥＧは、約０．１ないし１００ｋＤａ又は約１ないし１００ｋＤａ又は約１０ないし５０ｋＤａ又は約２０ないし４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧである。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、ＧＨ、例えばオキシム結合によって３０ｋＤａ ＰＥＧへ結合したＧＨ、例えばｈＧＨを含有し、ここで、オキシム結合は、配列番号２におけるアミノ酸３５に相当する位置において、ＧＨ中に存在するｐ−アセチルフェニルアラニンと、ＰＥＧとの間にある。
当業者に公知の方法に従い、本発明の１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む治療用組成物を、場合によって１つ又はそれ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボ疾患動物モデルにおいて試験し、有効性、組織代謝を確認し、投与量を推定する。特に、投薬量は最初、天然アミノ酸相同体に対する本明細書中の非天然物（以下に限定されないが、天然アミノ酸ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドに対する、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの比較など）の、活性、安定性又はその他の適切な指標により、即ち、適切なアッセイにおいて、決定することができる。
投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用されるあらゆる経路による。何らかの適切な様式で、場合により、医薬として許容される１又はそれ以上の担体とともに、本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する。本発明の関連におけるこのようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であるが、２以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができ、特定経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な作用又は反応を得られることが多い。
一部、投与される特定の組成物によってならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物の多岐にわたる適切な製剤が存在する。
本発明のｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）は、タンパク質又はペプチドに適したあらゆる慣用経路（皮下若しくは静脈内又は注射若しくは注入の他のあらゆる形態を含む（これらに限定されない。）非経口、例えば注射を含むが、これに限定されない。））によって投与し得る。ポリペプチド組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段を含む（これらに限定されない。）多数の経路によって投与することが可能である。リポソームを介して修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物を投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は通常、当業者にとって公知である。天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）は、単独で、又は医薬担体などの他の適切な成分と組み合わせて使用し得る。
単独又はその他の適切な成分と組み合わせて非天然アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、エアロゾル製剤に調製して（即ち、これらは「霧状」にすることができる。）、吸入により投与することもできる。加圧された許容可能なプロペラント（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）にエアロゾル製剤を入れることができる。
例えば、関節内投与（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路などの非経口投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器において、ｈＧＨの製剤を提供することができる。
非経口投与及び静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用されている製剤による、天然アミノ酸相同体治療薬に対して既に使用されている投与経路（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は医薬として送達される何らかの他のタンパク質について通常されるものなど）は、本発明のポリペプチドに対する好ましい投与経路及び処方を与える。
本発明において、患者に投与される用量は、時間にわたって患者において有効な治療応答を有するのに十分なものであるか又は適用に応じて他の適切な活性を有するのに十分なものである。特定のベクターもしくは処方の効率及び使用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性もしくは血清半減期及び患者の状態、ならびに処置される患者の、体重もしくは表面積により、用量を決定する。特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随する何らかの不都合な副作用の、存在、性質及び程度によっても、用量サイズが決定される。
疾患（以下に限定されないが、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の治療又は予防において投与されるべきベクター又は製剤の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、疾患の進行及び／又は適切な場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
例えば、７０ｋｇの患者に投与する用量は、典型的には、現在使用されている治療用タンパク質の投薬量と等しい範囲であり、関連組成物の変化した活性又は血清半減期に対して調節される。本発明のベクター又は医薬製剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物反応調節物質などの投与など、何らかの公知の従来の治療による治療状態を補完することができる。
投与のために、以下に限定されないが大部分及び全体的な患者の健康に対して適用する場合を含め、適切な製剤のＬＤ−５０又はＥＤ−５０及び／又は様々な濃度での非天然アミノ酸の何らかの副作用の観察により決定される速度で本発明の製剤を投与する。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。
製剤の注入を行っている患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を発症した場合、その患者にアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又はその他の疼痛／発熱制御薬の適量を与える。発熱、筋肉痛及び悪寒など、注入に対する反応が出たことがある患者には、それ以降の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミドフェン又は以下に限定されないがジフェンヒドラミンなどの何れかを前もって与える。解熱剤及び抗ヒスタミン剤に対して迅速に応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重症度によって、細胞注入の速度を遅くするか、又は中断する。
哺乳動物対象に、本発明のヒトｈＧＨポリペプチドを直接投与することができる。投与は、ｈＧＨポリペプチドを対象に導入するために通常使用される何れかの経路による。本発明の実施形態によるｈＧＨポリペプチド組成物には、経口、直腸、局所、吸入（以下に限定されないが、エアロゾルを介したものなど）、口腔内（以下に限定されないが、舌下など）、膣内、非経口（以下に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内など）、局所（即ち、皮膚及び粘膜表面の両方、気道表面を含む。）及び経皮投与に適切なものが含まれるが、いかなる場合も、最適な経路は、治療されている状態の性質及び重症度に依存する。投与は局所又は全身投与の何れかであり得る。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器中に、化合物の製剤を提供することができる。単位用量の注射用形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョンなど）での医薬として許容される担体との混合物において本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを調製することができる。持続注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプなどを用いる。）、単一ボーラス又は徐放デポー製剤により、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを投与することもできる。
投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の溶液、等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、溶液及び懸濁液を調製し得る。
フリーズドライは、タンパク質を提示するために一般的に使用されている技術であり、、目的のタンパク質調製物から水を除去する役割を果たす。フリーズドライ又は凍結乾燥は、乾燥されるべき材料をまず凍結した後、真空環境中で、昇華により、氷又は凍結した溶媒を除去するプロセスである。フリーズドライプロセス中に安定性を増強させるために、及び／又は、凍結乾燥された産物の保存時における安定性を向上させるために、予め凍結乾燥された製剤中に賦形剤を含めることができる。Ｐｉｋａｌ， Ｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ３（９）２６−３０（１９９０）及びＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ８（３）：２８５−２９１（１９９１）。
医薬の噴霧乾燥も、当業者に公知である。例えば、「Ｂｒｏａｄｈｅａｄ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ． Ｐｈａｒｍ， １８（１１ ＆ １２）， １１６９−１２０６（１９９２）」を参照されたい。小分子医薬に加えて、様々な生物学的材料が噴霧乾燥されており、これらには、酵素、血清、血漿、微生物及び酵母が含まれる。噴霧乾燥は、一段階の工程で、液体の医薬調製物を、微細な、無粉塵の粉末又は凝集した粉末に変換することができるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの工程：ａ）スプレー中への、フィード溶液の微粒化；ｂ）スプレー−空気接触；ｃ）スプレーの乾燥；ｄ）及び乾燥空気からの、乾燥された産物の分離を含む。米国特許第６，２３５，７１０号及び第６，００１，８００号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、スプレー乾燥による、組換えエリスロポエチンの調製について記載している。
本発明の医薬組成物及び製剤は、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含み得る。ある程度、投与する特定の組成物によってならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物（場合により、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含む。）の多岐にわたる適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ． １９８５参照。）。
適切な担体には、スクシナート、ホスファート、ボラート、ＨＥＰＥＳ、シトラート、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、イミダゾール、アセタート、バイカーボナート及びその他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満のものを含むが、これに限定されない。）；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどの（これらに限定されない。）タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの（これらに限定されない。）親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸又はリジンなどの（これらに限定されない。）のアミノ酸；トレハローズ、スクロース、グルコース、マンノース又はデキストリンなどの（これらに限定されない。）、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；亜鉛、コバルト又は銅などの（これらに限定されない。）二価金属イオン；マンニトール又はソルビトールなどの（これらに限定されない。）糖アルコール；ナトリウムなどの（これに限定されない。）塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルバート８０）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリソルバート２０；ＰＳ２０））、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ及び他のプルロニック酸（プルロニック酸Ｆ６８（ポロキサマー１８８）を含むが、これに限定されない。）などの非イオン性界面活性剤又はＰＥＧが含まれる。適切な界面活性剤には、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）、すなわち（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）又はポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレノキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）又はこれらの組み合わせを基礎としたポリエーテル（これらに限定されない。）が含まれる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ及びＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、Ｒ−ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ及びＲ−ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．， Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ， Ｍｉｃｈ．）の商品名で市販されており、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第４，８２０，３５２号にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、適切な界面活性剤であり得る。撹拌から生じるストレスを含む（これに限定されない。）１つ又はそれ以上のストレスに対して、ＰＥＧ化されたｈＧＨを安定化するために界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを使用し得る。上記の幾つかは、「充填剤」と表記され得る。幾つかは、「張度調整剤」とも称され得る。
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されているものを含む、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、徐放システムにより又は徐放システムの一部として投与することもできる。徐放組成物としては、以下に限定されないがフィルム又はマイクロカプセルなどの（これらに限定されない。）、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクスなど（これに点芸されない。）が挙げられる。徐放マトリクスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーンなどの生体適合性の物質由来のものが含まれる。徐放組成物にはまた、リポソームに封入された化合物が含まれる。それ自身公知の方法により、化合物を含有するリポソームを調製する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許公開８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
リポソーム中に封入されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、例えばＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；米国特許第４，４８５，０４５号；ＥＰ１４３，９４９；米国特許第５，０２１，２３４号；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法により調製することができる。組成物及びリポソームサイズは周知であるか、又は当業者により経験的に容易に決定可能である。リポソームのいくつかの例が、例えばＰａｒｋ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ Ｄ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ（編）：ＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＬＹＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＤＣ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｅｉｃｈｅｒ Ｂ（編）：ＣＡＮＣＥＲ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＵＢ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
本発明に関連して、患者へ投与される用量は、時間とともに対象において有効な応答を生じさせるのに十分な用量とすべきである。一般に、非経口的に投与される本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの、投与あたりの総医薬的有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であるが、これは治療での判断に委ねられる。投与頻度もまた、治療での判断に委ねられ、ヒトでの使用が認可されている市販のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチド製品よりも多い又は少ない頻度であり得る。一般に、上述の何れかの投与経路により、本発明のＰＥＧ化されたＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを投与することができる。幾つかの実施例において、本発明は、本明細書中に記載されている保存及び投薬計画に対して十分に安定である医薬組成物中に、本明細書に記載されているＧＨ、例えばｈＧＨの何れかを含む組成物を提供する。安定性を検査する方法は、本分野において公知である。
ＸＶ．本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの治療的使用
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨアゴニストポリペプチドの投与は、例えば、発育不全、免疫疾患を治療するのに、及び心機能を刺激するのに有用であり得る。成長欠乏の個体には、例えば、ターナー症候群を有する個体、ＧＨ欠乏の個体（子供を含む。）、成長板が閉じる約２−３年前の正常な成長曲線に遅れ又は遅延を経験する子供（時折、「低身長の正常児（ｓｈｏｒｔ ｎｏｒｍａｌ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」として知られる。）及びインシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のＧＨに対する応答が化学的に（すなわち、グルココルチコイド処理によって）又はＧＨに対するＩＧＦ−Ｉ応答が自然な状態で減少している成体患者におけるような正常状態によって遮断されている個体が含まれる。本発明のｈＧＨポリペプチドは、以下の症状：小児成長ホルモン欠乏、突発性低身長症、小児期発生の成体成長ホルモン欠乏、成体発生の成体成長ホルモン欠乏又は続発性成長ホルモン欠乏を有する個体を治療するのに有用であり得る。成体期に成長ホルモン欠乏を有すると診断された成体は、下垂体腫瘍又は放射線被爆を有している場合があり得る。メタボリックシンドローム、頭部傷害、肥満、骨粗鬆症又はうつ病を含む（これらに限定されない。）症状は、成体における成長ホルモン欠乏様の症候をもたらし得る。
アゴニストＧＨ、例えばｈＧＨバリアントは、増加が抗体の媒介によるものであれ、又は細胞の媒介によるものであれ、及び免疫系がＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドで処理される宿主にとって内在性のものであれ、又はＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドが与えられる宿主レシピエントにドナーから移植されるものであれ（骨髄移植におけるように）、哺乳動物の免疫機能を増加させることによって、哺乳動物の免疫系を刺激するように作用し得る。「免疫疾患」には、個体の免疫系が、抗原に対して正常より低下した抗体又は細胞応答を有するあらゆる症状が含まれ、薬物（例えば、化学療法）治療のために低下した免疫を有する小さな脾臓を有する個体が含まれる。免疫疾患を有する個体の例には、例えば、高齢の患者、化学療法又は放射線療法を行っている個体、大病から回復した個体又は手術を行おうとしている個体、ＡＩＤＳを有する個体、低ガンマグロブリン血症、一般的な多様な無ガンマグロブリン血症及び選択的な免疫グロブリン欠乏（例えば、ＩｇＡ欠乏）などの先天性及び後天的Ｂ細胞欠乏を有する患者、患者の免疫応答より短いインキュベーション時間で狂犬病などのウイルスに感染した患者、及びディジョージ症候群などの遺伝性疾患を有する個体が含まれる。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストポリペプチドは、巨人症及び末端肥大症状、糖尿病及び糖尿病に起因する合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症）、血管性眼疾患（例えば、増殖性新血管形成を含む。）、神経症及びＧＨ反応性悪性腫瘍の治療にとって有用であり得る。
血管性眼疾患には、例えば、（例えば、未熟児又は鎌型赤血球貧血症によって引き起こされる）網膜症及び黄斑変性が含まれる。
ＧＨ反応性悪性腫瘍には、例えば、ウィルムス腫瘍、肉腫（例えば、骨原性肉腫）、乳癌、大腸癌、前立腺癌及び甲状腺癌並びにＧＨ受容体ｍＲＮＡを発現する組織（すなわち、胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、リンパ節及びバーキットリンパ腫、大腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病及び悪性黒色腫から得た組織）の癌が含まれる。
本発明のＧＨ、例えばｈＧＨアゴニストポリペプチドは、例えば、慢性腎不全、慢性腎不全（ＣＲＩ）に伴う成長不全、ターナー症候群に伴う低身長、小児性プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）、消耗又は悪液質を有するＨＩＶ患者、不当軽量児（ＳＧＡ）として生まれた子供、肥満及び骨粗鬆症を治療するのに有用であり得る。
ＧＨ、例えばｈＧＨの平均量は変動することができ、特に、資格を有する医師の推奨及び処方に基づくべきである。ＧＨ、例えばｈＧＨの正確な量は、治療されている症状の正確な種類、治療されている患者の状態及び組成物中の他の成分などの因子に従う好みの問題である。本発明は、別の活性因子の治療的有効量の投与も提供する。与えられるべき量は、ｈＧＨを用いた治療に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
本発明の医薬組成物は、従来の様式で製造され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーへ、オキシム結合である共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量を、治療を要する個体へ投与することを含む治療の方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法には、個体、例えばヒトへ、ＧＨ、例えばｈＧＨを投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨには、カルボニル含有の天然においてコードされていないアミノ酸などの、天然においてコードされていないアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、ケトン含有アミノ酸、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２におけるアミノ酸３５に対応するＧＨ、例えばｈＧＨ中の位置で置換された天然においてコードされていないアミノ酸、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する。水溶性ポリマーは、ＰＥＧであり得る。適切なＰＥＧには、直鎖及び分岐ＰＥＧが含まれ、本明細書に記載のいずれかのＰＥＧが使用され得る。特定の実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし１００ｋＤａ又は約１ないし１００ｋＤａ又は約１０ないし５０ｋＤａ又は約２０ないし４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＧＨ、例えばオキシム結合によって３０ｋＤａ ＰＥＧへ連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含有し、ここで、オキシム結合は、配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置に存在するＧＨ中のｐ−アセチルフェニルアラニンとＰＥＧとの間にある。いくつかの実施形態において、治療される個体は、小児成長ホルモン欠乏、特発性低身長、小児期の発症の成体成長ホルモン欠乏、成体期の発症の成体成長ホルモン不全又は続発性成長ホルモン欠乏を罹患する。
ＧＨ、例えばｈＧＨは、本明細書に記載のとおり、及び本分野で公知のとおり、いずれかの適切な形態、経路、用量、頻度及び期間で個体へ投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーへ、共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量を、治療を要する個体へ投与することを含む治療の方法を提供し、ここにおいて、水溶性ポリマーは直鎖ポリマーであり、ホルモン組成物は、１日おきに約１回以下、３、４、５又は６日おきに約１回、１週間あたり１回、８、９、１０、１１、１２又は１３日おきに１回、２週間あたり１回、１５、１６、１７、１８、１９又は２０日おきに１回、３週間おきに１回、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日おきに１回、１ヶ月あたり１回、又は１ヶ月あたり約１回未満の頻度で付与される。投与の頻度は、個体の裁量で、又はより典型的には治療を施している専門家に応じて変化し得、頻度のいずれかの組み合わせが使用され得ることが理解される。いくつかの実施形態において、ＧＨ組成物は、１週間あたり約１回以下、２週間あたり１回、３週間あたり１回又は１ヶ月あたり１回で投与される。いくつかの実施形態において、ＧＨ組成物は、１週間あたり約１回以下、２週間あたり１回又は１ヶ月あたり１回で投与される。いくつかの実施形態において、ＧＨ組成物は、１週間あたり約１回以下で投与される。いくつかの実施形態において、ＧＨ組成物は、２週間あたり約１回以下で投与される。いくつかの実施形態において、ＧＨ組成物は、１ヶ月あたり約１回以下で投与される。
本発明は、本発明のｈＧＨとともに別の活性剤の治療的有効量の投与についても提供する。付与されるべき量は、ｈＧＨによる療法に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
本発明の医薬組成物は、従来の方法において製造され得る。
（実施例）
次の実施例は、請求される本発明を説明するために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載されている本発明に限定を加えるものではない。
本実施例は、天然においてコードされていないアミノ酸のｈＧＨへ取り込むための好ましい部位の選択に関する基準の多くの可能性のあるセットのうちの１つを記載する。
本実施例は、ｈＧＨポリペプチド内の好ましい部位が、天然においてコードされていないアミノ酸の導入に関して、どのように選択されたかを示す。受容体（ｈＧＨｂｐ）の細胞外ドメインの２つの分子と複合体を形成したｈＧＨで構成される結晶構造３ＨＨＲを使用して、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸が導入され得る好ましい位置を決定した。他のｈＧＨ構造（例えば、ＩＡＸＩ）を利用して、結晶構造データセット間の一次及び二次構造要素の可能なバリエーションを検討した。これらの構造の配位は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９９７， １１２， ｐｐ ５３５）から、又はｒｃｓｂ．ｏｒｇでのＷｉｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上で利用可能なＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＰＤＢを介して利用可能である。構造モデル３ＨＨＲは、残基１４８ないし１５３及び、結晶中の無秩序のために省略されたＣ末端Ｆ１９１残基を除く、ｈＧＨの完全に完熟した２２ｋＤａ配列を含有する。２つのジスルフィド架橋が存在し、Ｃ５３及びＣ１６５並びにＣ１８２及びＣ１８５によって形成される。本実施例において使用される配列の付番は、配列番号２に示される成熟ｈＧＨ（２２ｋＤａ変異体）のアミノ酸配列に従っている。
以下の基準を使用して、天然においてコードされていないアミノ酸を導入するためのｈＧＨの各位置を評価した。すなわち、残基は、（ａ）３ＨＨＲ、１ＡＸＩ、及び１ＨＷＧ（ｈＧＨｂｐ単量体又は二量体と結合したｈＧＨの結晶構造）の構造分析に基づいて何れのｈＧＨｂｐの結合も妨害すべきではなく、（ｂ）アラニン又は相同体走査変異誘発によって影響を受けるべきではなく（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） ２４４：１０８１−１０８５及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） ２４３：１３３０−１３３６）、（ｃ）表面露出されており、及び取り囲んでいる残基との最小のファンデルワールス結合相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＧＨバリアントにおいて欠失されるか又は可変的であるべきであり（例えば、Ｔｙｒ３５、Ｌｙｓ３８、Ｐｈｅ９２、Ｌｙｓ１４０）、（ｅ）天然においてコードされていないアミノ酸との置換の際に、保存された変化を生じ、並びに（ｆ）（ＣＤループを含むがそれには制限されない）高度に柔軟な領域又は（へリックスＢを含むがそれには限定されない）構造上強固な領域のいずれかにおいて見出され得る。さらに、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １８， ｐｐ ９８０）を利用して各タンパク質原子についての突出の程度を評価するために、ＧＨ分子に対してさらなる計算を実施した。結果として、幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸が、ｈＧＨの次の位置の１つ又は以上に組み込まれるがこれらには限定されない。すなわち、位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、ｌ０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号２、又は配列番号１若しくは３中の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、次の位置のうちの１つ又はそれ以上で置換される。２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、及び１８７（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、次の位置のうちの１つ又はそれ以上で置換される。２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、及び１８７である（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、次の位置のうちの１つ又はそれ以上で置換される。３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、及び１５５（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。
いくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を、次の位置：３０、７４、１０３である（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）のうちの１つ以上で置換される。。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、次の位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）のうちの１つ又はそれ以上で置換する。
幾つかの実施形態において、これらの位置のうちの１つ又はそれ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸は、次の位置を含む（これらには限定されない。）水溶性ポリマーへ結合させる。位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）である（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、これらの位置のうちの１つ又は以上に位置する天然において存在しないアミノ酸は、次の位置を含む（これらには限定されない。）水溶性ポリマーへ結合させる。２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３０、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７（配列番号２又は配列番号１若しくは３の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、これらの位置のうちの１つ又は以上に位置する天然において存在しないアミノ酸を、次の位置を含む（これらには限定されない。）水溶性ポリマーへ結合させる。２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、及び１８７（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、これらの位置のうちの１つ又はそれ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸を、次の位置を含む（これらには限定されない。）水溶性ポリマーへ結合させる。３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、及び１５５（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、これらの位置のうちの１つ又はそれ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸を、次の位置：３０、７４、１０３（配列番号２、あるいは配列番号１又は３の相当するアミノ酸）を含む（これらには限定されない。）水溶性ポリマーへ結合させる。幾つかの実施形態において、これらの位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、あるいは配列番号１又は３）のうちの１つ又はそれ以上に位置する天然において存在しないアミノ酸を、水溶性ポリマー、へ結合させる。
ｈＧＨアンタゴニストを作製するためのいくつかの部位には、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、又は位置１前の付加、又はこれらのいずれかの組み合わせが含まれる（配列番号２又は配列番号１、３若しくはその他のＧＨ配列中の相当するアミノ酸）。アゴニストデザインの基準（ｃ）ないし（ｅ）を利用して、これらの部位を選択した。アンタゴニストデザインには、ｈＧＨｂｐに対する結合親和性を増大させるための部位Ｉ残基の部位特異的修飾も含まれ得る。
本実施例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。本実施例は、修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物活性を評価するためのある方法も記載する。
ｈＧＨ及びその断片をクローニングするための方法は、米国特許第４，６０１，９８０号、第４，６０４，３５９号、第４，６３４，６７７号、第４，６５８，０２１号、第４，８９８，８３０号、第５，４２４，１９９号及び第５，７９５，７４５号に詳述され、参照により本明細書に組み入れられる。完全長のｈＧＨ又はＮ末端シグナル配列を欠失するｈＧＨの成熟形態をコードするｃＤＮＡを、配列番号２１及び配列番号２２にそれぞれ示す。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入された翻訳システムを使用して、天然においてコードされていないアミノ酸を含有するｈＧＨを発現する。Ｏ−ＲＳは、天然においてコードされていないアミノ酸で、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。次いで、翻訳システムは、コードされたセレクターコドンに応答して、天然においてコードされていないアミノ酸をｈＧＨ中に挿入する。
Figure 2008525473
修飾されたｈＧＨ遺伝子及び（望ましい天然においてコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有するプラスミドによるＥ．コリの形質転換によって、天然においてコードされていないアミノ酸のｈＧＨポリペプチドへの部位特異的組み込みが可能となる。特定の天然においてコードされていないアミノ酸０．０１ないし１００ｍＭを含有する培地中にて、３７℃で増殖された被形質転換Ｅ．コリは、高い忠実度及び効率で修飾されたｈＧＨを発現する。天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＨｉｓタグ付きｈＧＨは、封入体又は凝集体としてＥ．コリ宿主細胞によって産生される。凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌ中の変性条件下でアフィニティー精製する。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ ＣｕＳＯ４及び２％（ｗ／ｖ）サルコシル中、４℃で一晩透析することによって再折り畳みを実施する。次に、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２に対して材料を透析した後、Ｈｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１５９８３−９３を参照のこと。ｈＧＨの精製のための方法は、当業者に公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析又はエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析などの実験によって確認される。
図６は、精製されたｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。製造者によって提供される標準的なＨｉｓタグ付きタンパク質精製手法を介して、ＰｒｏＢｏｎｄ Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の後に、ゲルへの負荷前に陰イオン交換カラムを使用して、Ｈｉｓタグ付き変異体ｈＧＨタンパク質を精製した。レーン１は、分子量マーカー、レーン２は、非天然アミノ酸を組み込んでいないＮ−Ｈｉｓ ｈＧＨを表す。レーン３ないし１０は、それぞれ位置Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、及びＫ１４５の各々に、非天然アミノ酸であるｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むＮ−Ｈｉｓ ｈＧＨ変異体を含有する。
修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物活性をさらに評価するため、ｈＧＨの受容体とのｈＧＨの相互作用の下流マーカーを測定するアッセイを使用した。ｈＧＨとその内在的に産生される受容体との相互作用によって、ヒトＩＭ−９リンパ球細胞系における転写ファミリーの一員であるＳＴＡＴ５のシグナル伝達物質及び活性化因子のチロシンがリン酸化を受ける。ＳＴＡＴ５の２つの形態（ＳＴＡＴ５Ａ、及びＳＴＡＴ５Ｂ）を、ＩＭ−９ｃＤＮＡライブラリから同定した。例えば、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．， ＭｏＩ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． （１９９６） １０（５）：５０８−５１８を参照のこと。ラット成長ホルモンも、ヒトプロラクチンも検出可能なＳＴＡＴ５リン酸化をもたらさなかったので、ＩＭ−９細胞上のヒト成長ホルモン受容体は、ヒト成長ホルモンに対して選択的である。重要なことに、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞外ドメイン及びＧ１２０Ｒ保有ｈＧＨは、ｈＧＨにより刺激されるｐＳＴＡＴ５リン酸化に対して効果的に競合する。
ＩＭ−９細胞を本発明のｈＧＨポリペプチドで刺激した。ヒトＩＭ−９リンパ球をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入し、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、及び熱により不活化された１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で生育させた。アッセイ培地（フェノール赤を含まないＲＰＭＩ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％熱不活化木炭／デキストランで処理されたＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイシン）中で、ＩＭ−９細胞を一晩飢餓状態にした後、３７℃で１０分間、ｈＧＨポリペプチドの１２点用量範囲で刺激した。刺激された細胞を１％ホルムアルデヒドで固定した後、９０％氷冷メタノールにより氷上で１時間透過処理した。ＳＴＡＴ５のリン酸化レベルを、一次ホスホ−ＳＴＡＴ５抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて、室温で３０分間の後、ＰＥ結合された二次抗体で細胞内染色することによって検出した。試料の獲得は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）上で解析された獲得データを使用して、ＦＡＣＳアレイ上で実施した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用するタンパク質濃度に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）でプロットされた用量反応曲線からＥＣ５０値を誘導した。
以下の表３は、変異体ｈＧＨポリペプチドを用いて得られたＩＭ−９データを要約する。非天然アミノ酸置換を異なる位置に有する様々なｈＧＨポリペプチドを、記載されるようにヒトＩＭ−９細胞を用いて検査した。具体的には、図７、パネルＡは、Ｈｉｓタグ付きｈＧＨポリペプチドについてのＩＭ−９データを示し、図７、パネルＢは、Ｙ１４３についての非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓタグ付きのｈＧＨについてのＩＭ−９データを示す。同一アッセイを使用して、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの生物活性を評価した。
Figure 2008525473
本実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入、及びアミノオキシ含有ＰＥＧとのその後の反応について詳述する。
本実施例は、約５，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧとその後反応する、ケトン含有の天然においてコードされていないアミノ酸を組み込む、ｈＧＨポリペプチドを作製する方法を示す。実施例１（ｈＧＨ）の基準に従って同定される各残基３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１２０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５を、次の構造：
Figure 2008525473
 を有する天然においてコードされていないアミノ酸と個別に置換する。
ｈＧＨへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的組み込みに用いた配列は、配列番号２（ｈＧＨ）及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び上述の実施例２に記載される１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５又は６）である。
修飾された後、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドバリアントを、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒはメチル、ｎは３、Ｎは約５，０００ＭＷである。）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。。２５ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ６．０中、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ７．０中、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ４．５中の１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製されたｈＧＨを、アミノオキシ含有ＰＥＧの１０ないし１００倍過剰量と反応させた後、室温で１０ないし１６時間撹拌する（Ｊｅｎｃｋｓ， Ｗ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５９， ８１， ｐｐ ４７５）。次に、中間精製及び分析のため、ＰＥＧ−ｈＧＨを適切な緩衝液中へ希釈する。
アミド結合を介してＰＥＧへ結合されるヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの結合。
実施例３に記載の手法を使用して、次の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、及びＮは、約２０，０００ＭＷである。）
を有するＰＥＧ試薬を、ケトンを含有する天然においてコードされていないアミノ酸へ結合させる。すなわち、反応、精製、及び分析の条件は、実施例３に記載されるとおりである。
本実施例は、天然にコードされない２つの異なるアミノ酸のｈＧＨポリペプチドへの導入を詳述する。
本実施例は、次の残基、すなわち、Ｅ３０、Ｅ７４、Ｙ１０３、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｋ１４０及びＫ１４５のうち２つの位置にケトン官能基を含む天然においてコードされていないアミノ酸を組み込むｈＧＨポリペプチドの作製方法を示す。セレクターコドンが核酸内の２つの異なる部位に導入されることを除き、ｈＧＨポリペプチドは実施例１及び２に記載されているとおりに調製される。
本実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧへのｈＧＨポリペプチドの結合、及びその後のインシチュ還元を詳述する。
カルボニル含有アミノ酸を取り込んでいるｈＧＨポリペプチドを、実施例２及び３に記載の手法にしたがって調製する。修飾された後、次の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、及びＮ＝１０，０００ＭＷ、及びＸはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。）
を有するヒドラジド含有ＰＥＧを、ｈＧＨポリペプチドへ結合させる。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製されたｈＧＨを、２５ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ６．０中、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中で０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬで溶解し、ヒドラジド含有ＰＥＧの１ないし１００倍過剰量と反応させ、Ｈ２Ｏ中で１０ないし５０ｍＭの最終濃度へ溶解した１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）原液の添加によって、相当するヒドラゾンをインシチュで還元する。暗所にて、４℃ないし室温で、反応を１８ないし２４時間実施する。約７．６の１Ｍトリス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の５０ｍＭトリス最終濃度への添加により反応を停止させるか、又は即時精製のために適切な緩衝液中へと希釈する。
本実施例は、ｈＧＨペプチドへのアルキン含有アミノ酸の導入及びアジ化ｍＰＥＧによる誘導体化を詳述する。
次の残基、３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１４０、１４３、１４５及び１５５を各々、次の天然においてコードされていないアミノ酸（ｈＧＨ、配列番号２）と置換する。
Figure 2008525473
ｐ−プロパルギル−チロシンのｈＧＨへの部位特異的取り込みに利用される配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキーｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＲ）及び上述の実施例に記載の９、１０、又は１１である。プロパルギルチロシンを含有するｈＧＨポリペプチドを、Ｅ．コリにおいて発現させ、実施例３に記載の条件を使用して精製する。
ＰＢ緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）及びアジ化物含有ＰＥＧの１０ないし１０００倍過剰量中の０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬで溶解された、プロパルギル−チロシンを含有する精製されたｈＧＨを、反応混合物へ添加する。次に、ＣｕＳＯ４及びＣｕワイヤの触媒量を反応混合物へ添加する。混合物をインキュベートした後（室温若しくは３７℃で約４時間、又は４℃で一晩を含むが、これらにには限定されない）、Ｈ２Ｏを添加し、透析膜を通じて混合物をろ過する。実施例３に記載の同様の手法などにより（これに限定されない。）、試料を添加のために分析し得る。
本実施例において、ＰＥＧは、次の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（式中、Ｒはメチル、ｎは４、及びＮは１０，０００ＭＷである。）
を有する。
本実施例は、ｈＧＨポリペプチド中の大きな疎水性アミノ酸の、プロパルギルチロシンとの置換を詳述する。
ｈＧＨの次の領域、すなわち、１ないし５（Ｎ末端）、６ないし３３（Ａヘリックス）、３４ないし７４（ＡヘリックスとＢヘリックスとの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５ないし９６（Ｂヘリックス）、９７ないし１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスとの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６ないし１２９（Ｃヘリックス）、１３０ないし１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスとの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４ないし１８３（Ｄヘリックス）、１８４ないし１９１（Ｃ末端）（配列番号２）のうちの１つの中に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を、実施例７に記載されるように、以下の天然においてコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2008525473
修飾された後、ＰＥＧを、アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体へ結合させる。ＰＥＧは、次の構造、すなわち
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有し、結合の手法は、実施例７における手法に従う。これにより、天然に存在する大きな疎水性アミノ酸のうちの１つとほぼ等立体的であり、ポリペプチド内の異なる部位においてＰＥＧ誘導体で修飾された天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体が生じる。
本実施例は、１つ以上のＰＥＧリンカーによって分離されるｈＧＨポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、又はヘテロ多量体の生成を詳述する。
２つのｈＧＨ分子がＰＥＧにより物理的に分離される、対応するｈＧＨポリペプチドホモ二量体を作製するために、約５，０００の平均ＭＷを有する実施例７で産生されたアルキン含有ｈＧＨポリペプチド変異体を、形態：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（式中ｎは４であり、ＰＥＧは、約５，０００の分子量を有する。）
の二機能性ＰＥＧ誘導体と反応させる。類似の方法において、ｈＧＨポリペプチドは、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成するための１つ又はそれ以上の他のポリペプチドへ結合され得る。結合、精製及び分析は、実施例７及び３のとおりに、実施される。
本実施例は、ｈＧＨポリペプチドへの糖類部分の結合を詳述する。
次のうちの１つの残基を、以下の天然においてコードされていないアミノ酸と置換する。すなわち、実施例３に記載される２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、及び１８７（ｈＧＨ、配列番号２）。
Figure 2008525473
修飾されたら、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合したアミノオキシアナログと反応させる。ｈＧＨポリペプチド変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）及びアミノオキシ糖類（２１ｍＭ）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液緩衝液（ｐＨ５．５）中に混合し、３７℃で７ないし２６時間インキュベートする。糖類が結合されたｈＧＨポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）を、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）及びβ−１，４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４単位／ｍＬ）とともに大気温で４８時間インキュベートすることによって、第二の糖類を酵素的に、第一の糖類に結合させる（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｒｎ． １９７０， ２４５， ５０５７−５０６１）。
本実施例は、ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチドアンタゴニストの作製を詳述する。
次の残基：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３又は１２７（ｈＧＨ、配列番号２、又は配列番号１若しくは３中の相当するアミノ酸）のうちの１つを、実施例３に記載されるような次の天然においてコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2008525473
修飾されたら、ポリペプチド内の単一部位に、ＰＥＧ誘導体で修飾された天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドアンタゴニストを得るために、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中Ｒはメチル、ｎは４、及びＮは２０，０００ＭＷ）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。
ｈＧＨ分子が直接結合されたｈＧＨポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の作製。
アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含む別のｈＧＨポリペプチドバリアントへ直接結合することが可能であり、これらの各々は、実施例１０に記載されている部位（これらに限定されない。）に、天然においてコードされていないアミノ酸置換を含む。これにより、２つのｈＧＨポリペプチドバリアントが、部位ＩＩ結合界面で物理的に結合する対応するｈＧＨポリペプチドホモ二量体が得られる。類似する方法で、ｈＧＨポリペプチドを１つ又はそれ以上の他のポリペプチドへ結合させ、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成し得る。結合、精製及び分析は、実施例３、６、及び７のように実施する。
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’ Ａ Ｂ
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキル（Ａ）と反応させ、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは１ないし９の整数であり、Ｒ’は直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和Ｃ１ないしＣ２０アルキル基又はヘテロアルキル基であり得る。Ｒ’は、Ｃ３ないしＣ７の飽和若しくは不飽和環状アルキル若しくは環状ヘテロアルキル、置換型若しくは非置換型のアリール基又はヘテロアリール基、又は置換型若しくは非置換型のアルカリル基（アルキルは、Ｃ１ないしＣ２０の飽和型又は不飽和型アルキルである。）又はヘテロアルカリル基でもあり得る。典型的には、ＰＥＧ−ＯＨは、８００ないし４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ、２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、キシレン中の８０重量％溶液（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）として溶解される臭化プロパルギルの溶液、及びＫＩの触媒量を溶液へ添加し、生じた混合物を２時間還流加熱した。次に、水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へ添加したのは、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）であり、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで低下させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液を、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴加した。生じた沈殿物を回収し、冷ジエチルエーテルの部分で何回も洗浄し、乾燥させると、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧが得られた。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ、２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、５−ブロモ−１−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０当量及びＫＩの触媒量を混合物へ添加した。生じた混合物を１６時間還流加熱した。次に、水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へ添加したのはＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）であり、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで低下させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液を、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴加した。生じた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテルの部分で何回も洗浄し、乾燥させると、相当するアルキンを生じる。５−クロロ−１−ペンチンが、同様の反応で使用され得る。
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液へ、まず、粉末状の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を添加し、次に、キシレン（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）中の８０重量％溶液として溶解した臭化プロパルギルの溶液を添加した。反応混合物を６時間還流加熱した。混合物へ、１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で残渣を抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、３−プロパルギルオキシベンジルアルコールが得られた。
塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加し、反応物を冷蔵庫中に１６時間安置した。通常の作業により、青みがかった黄色の油として、メシラートが得られた。この油（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間還流加熱した後、室温へ冷却した。混合物へ水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、望ましい臭化物を付与した。
ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、溶液を氷槽中で冷却した。激しく撹拌しながら数分間にわたってＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した後、上述から得られる臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）及びＫＩの触媒量を添加した。冷却槽を除去し、生じた混合物を１２時間還流加熱した。水（１．０ｍＬ）を混合物へ添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へ添加したのはＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）であり、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬに低下させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴加により、白色沈殿を生じ、ＰＥＧ誘導体を得るために回収した。
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
末端官能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーを、上記アルキン官能基を含有する反応性分子へ結合させることによって、末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーも取得し得る。ｎは１ないし１０である。Ｒ’は、Ｈ又はＣ１ないしＣ４の小アルキル基であり得る。
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（ｐｅｎｔｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。生じた粗ＮＨＳエステル７を、さらに精製せずに、次の反応で使用した。
５，０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、混合物を４℃へ冷却した。激しく撹拌しながら、ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。混合物を３時間撹拌し続け、その間室温まで加温した。次に、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を残渣へ添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで低下させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）へ滴加した。生じた沈殿を回収し、真空下で乾燥させた。
本実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホナート又はメシラートとも呼ばれ得るポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステルの調製を表す。相当するトシラート及びハロゲン化物は、同様の手法により調製され得る。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
トルエン１５０ｍＬ中のｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３，４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、窒素下で２時間、共沸的に蒸留し、溶液を室温へ冷却した。無水ＣＨ２Ｃｌ２４０ｍＬ及び無水トリエチルアミン２．１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を溶液へ添加した。溶液を氷槽で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル１．２ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。室温、窒素下で溶液を一晩撹拌し、無水エタノール２ｍＬを添加することによって、反応を停止させた。混合物を真空下で蒸発させて、溶媒、主としてトルエン以外のものを除去し、ろ過し、真空下で再度濃縮した後、ジエチルエーテル１００ｍＬ中に沈殿させた。冷ジエチルエーテルの数部分でろ液を洗浄し、真空下で乾燥させると、メシラートを生じた。
ＴＨＦ７５ｍＬ中にメシラート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）を溶解し、溶液を４℃へ冷却した。冷却した溶液へ、アジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。窒素下で２時間、反応物を還流加熱した。次に、溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。容積を２０ｍＬにまで低下させ、冷無水エーテル１５０ｍＬへの添加によって、生成物を沈殿させた。
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
参照により本明細書中に組み入れられる米国特許第５，９９８，５９５号に記載されている方法を使用して、４−アジドベンジルアルコールを生産することが可能である。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃でＣＨ２Ｃｌ２中の４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、反応物を冷蔵庫に１６時間安置した。通常の作業により、青みがかった黄色の油としてメシラートが得られた。この油（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間還流加熱した後、室温へ冷却した。混合物へ添加したのは水（２．５ｍＬ）であり、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、望ましい臭化物を付与した。
ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を混合物へ、ＫＩの触媒量とともに添加した。生じた混合物を１２時間還流加熱した。水（１．０ｍＬ）を混合物へ添加し、溶媒を真空下で除去した。ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を残渣へ添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬへ低下させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下による添加によって沈殿が生じ、これを回収してｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ３，４００Ｄａ、２．０ｇ）を、ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）の飽和水溶液中に溶解し、溶液を０℃へ冷却した。プロピオン酸３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５当量）を、激しく撹拌しながら添加した。３時間後、Ｈ２Ｏ２０ｍＬを添加し、混合物を室温でさらに４５分間撹拌した。ｐＨが３になるように０．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４で調整し、ＮａＣｌを添加して約１５重量％の濃度にした。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルによる沈殿後、ろ過により生成物を回収し、真空下で乾燥させると、ω−カルボキシ−アジ化ＰＥＧ誘導体を生じた。
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
本分野で公知のように調製され、ＴＨＦ中に溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を、ＴＨＦ中で−７８℃へ冷却されたリチウムアセチリド（４当量）の溶液へ、激しく撹拌しながら滴加した。３時間後、反応物を室温まで加温し、ブタノール１ｍＬの添加により反応を停止する。次に、Ｈ２Ｏ２０ｍＬを添加し、室温でさらに４５分間、混合物を撹拌した。０．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨが３になるように調整し、ＮａＣｌを添加して約１５重量％の濃度にした。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で反応混合物を抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させると、１−（ブト−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が得られた。
Ｌ． Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， （２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００， Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７ （２００３））， Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７； Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ， ＆ Ｐ． Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ３（１１）：１１３５−１１３７； Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００２）， ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４：ａｎｄ， Ｌ． Ｗａｎｇ， ＆ Ｐ． Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．． １：１−１１に記載されている方法を使用して、アジド及びアセチレン含有アミノ酸を部位選択的にタンパク質へと組み込んだ。アミノ酸が組み込まれたら、２ｍＭ ＰＥＧ誘導体、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、及び約１ｍｇＣｕワイヤの存在下で、リン酸緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ８中の０．０１ｍＭタンパク質で、３７℃で４時間、環状付加反応を実施した。
本実施例は、ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）誘導体及びｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成を記載する。
Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｂ． Ａ． Ｃ， Ｗａｎｇ， Ｌ．， Ｂｒｏｃｋ， Ａ．， Ｃｈｏ， Ｃ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （２００３） ４２， ６７３５−６７４６にすでに記載された手法を使用して、ラセミのｐＡＦを合成した。
ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するため、次の手法を完了した。室温（ＲＴ）で１時間撹拌した、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）中の（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ、メトキシポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ．３０Ｋ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａ社製）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４８時間、反応物を撹拌した後、約１００ｍＬへ濃縮した。混合物を冷エーテル（８００ｍＬ）へ滴下して添加した。ｔ−Ｂｏｃ保護された生成物を沈殿し、ろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬにより洗浄した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に再度溶解し、エーテル（８００ｍＬ）で２回沈殿させることによってさらに精製した。生成物を真空下で乾燥させると、７．２ｇ（９６％）が得られ、これはＮＭＲ及びニンヒドリン検査によって確認された。
上述で得られた保護された生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中、０℃で１時間実施した後、室温で１．５時間実施した。真空下でＴＦＡのほとんどを除去した後、ジオキサン（１ｍＬ）中の４Ｎ ＨＣｌを残渣へ添加することによって、ヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩へ変換した。沈殿物をＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中で再度沈殿させた。最終生成物（６．８ｇ、９７％）をろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬで洗浄し、真空下で乾燥させ、窒素下で保存した。同一の手法を使用して、他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体を合成した。
本実施例は、非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドについて使用される発現及び精製方法を記載する。宿主細胞をオルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｈＧＨコンストラクトで形質転換した。
形質転換したＤＨ１０Ｂ（ｆｉｓ３）細胞の凍結したグリセロール原液からの少しの穿刺を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを有する２ｍＬの定義された培地（ロイシン、イソロイシン、微量金属及びビタミンで補強されたグルコース最小培地）中、３７℃でまず生育させた。ＯＤ６００が２ないし５に到達した時点で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを有する６０ｍＬの新鮮な所定の培地へ６０μＬを移し、３７℃で再度、２ないし５のＯＤ６００まで増殖させた。培養物５０ｍＬを、５Ｌ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ）中の１００マイクロｇ／ｍＬアンピシリンを有する所定の培地２Ｌへ移した。発酵槽のｐＨを炭酸カリウムでｐＨ６．９に調節し、温度を３７℃にし、気流速度を５ｌｐｍにし、ポリアルキレン消泡剤ＫＦＯ Ｆ１１９（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）で泡立てた。撹拌器の速度を自動調整し、溶存酸素レベルを３０％以上に維持し、撹拌器の速度がその最大値に到達する場合、純粋な酸素を使用して、空気散布を補充した。３７℃で８時間後、指数関数的に増大する速度で、所定の培地の５０×濃縮物へ培養物を供給し、０．１５時−１の比増殖速度を維持した。ＯＤ６００が約１００に到達した時点で、ｐ−アセチル−フェニルアラニンのラセミの混合物を添加して、３．３ｍＭの最終濃度にし、温度を２８℃へ低下させた。０．７５時間後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加して０．２５ｍＭの最終濃度にした。細胞を２８℃でさらに８時間生育させ、ペレットにし、さらなる処理まで−８０℃で凍結した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの使用説明書マニュアルによって提供される標準的なＨｉｓタグ付きタンパク質の精製を介するＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）後に、陰イオン交換カラムを使用して、Ｈｉｓタグ付きの変異体ｈＧＨタンパク質を精製した。
精製されたｈＧＨを８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、反応緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）と緩衝液交換した。ＭＰＥＧ−オキシアミン粉末を、ｈＧＨ溶液へ、ＰＥＧ：ｈＧＨの２０：１のモル濃度比で添加した。２８℃で２日間穏やかに振盪しながら反応を実施した。陰イオン交換カラムを介して未反応のＰＥＧ及びｈＧＨからＰＥＧ−ｈＧＨを精製した。
動物実験に入る前に３回のアッセイによって、各ＰＥＧ化した変異体ｈＧＨの質を、評価した。未変性条件下でＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファーを使用する４ないし１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲルに通すこと（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ＰＥＧ−ｈＧＨの純度を評価した。クーマシーブルーでゲルを染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは、濃度測定走査に基づき、９５％純度より大きかった。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）社製ＫＴＡ２キットを使用する動力学的ＬＡＬアッセイによって、各ＰＥＧ−ｈＧＨ中のエンドトキシンレベルを検査したが、１用量あたり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２において記載される）ＩＭ−９ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイで評価し、ＥＣ５０値は１５ｎＭ未満であった。
本実施例は、非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの純度及び均一性を評価するための方法を記載する。
図８は、位置９２にある非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ゲルのレーン３、４及び５は、５ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧ分子のいずれかへ共有結合された、位置９２にｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨを示す。ＰＥＧ化された非天然アミノ酸を含むさらなるｈＧＨポリペプチドを図１１に示す。各ＰＥＧ−ｈＧＨタンパク質５μｇを各ＳＤＳ−ＰＡＧＥへ負荷した。図１１、パネルＡ：レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２μｇ）；レーン３及び７、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン４、３０ＫＰＥＧ−Ｙ３５ｐＡＦ；レーン５、３０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン６、２０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン８、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２０μｇ）。図１１、パネルＢ：レーン９、分子量マーカー；レーン１０、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２μｇ）；レーン１１、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン１２、３０ＫＰＥＧ−Ｋ１４５ｐＡＦ；レーン１３、３０ＫＰＥＧ−Ｙ１４３ｐＡＦ；レーン１４、３０ＫＰＥＧ−Ｇ１３１ｐＡＦ；レーン１５、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ／Ｇ１２０Ｒ；レーン１６、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２０μｇ）。図９は、ＩＭ−９細胞中での、ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチド（５ｋＤａ、２０ｋＤａ、又は３０ｋＤａＰＥＧ）の生物活性を示し、方法は実施例２に記載されるとおり実施した。
ｈＧＨ−ＰＥＧ結合体の純度は、（トリプシン開裂を含むが、これには限定されない）タンパク質分解後の質量分析によって評価し得る。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ ＲＢ．， ｅｔ ａｈ， Ｊ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ． ＆ Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９７（３）：１０５９−６６ （２００１）。トリプシン消化を実施するための方法は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ （２００２） ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ． １９３８にも記載されている。記載されている方法に対する改変を実施した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で試料を一晩透析した。ｒｈＧＨポリペプチドをトリプシン（ＴＰＣＫ処理したトリプシン、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）とともに、６６：１の質量比で、３７℃の水槽中、４時間インキュベートした。氷上で数分間、試料をインキュベートして消化反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析中に４℃で維持した。消化した試料（〜２００ｋｇ）を０．１％トリフルオロ酢酸中の２５×０．４６ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ−８カラム（５μｍビーズサイズ、１００Å孔サイズ）へ負荷し、０ないし８０％アセトニトリル勾配で７０分かけて、３０℃で１ｍＬ／分の流速で溶出した。トリプシンペプチドの溶出を２１４ｎｍでの吸光度によりモニターした。
図１０、パネルＡは、表記トリプシン開裂部位及び矢印で指定される非天然アミノ酸置換Ｆ９２ｐＡＦを有するｈＧＨの一次構造を示す（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８８） １０（４）：３２６−３３７から改変した図）。パネルＢは、ＰＥＧ化された天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じたペプチド（３０Ｋ ＰＥＧ Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨ、標識Ａ）、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じたペプチド（Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨ、標識Ｂ）及び野生型ｈＧＨから生じたペプチド（ＷＨＯ ｒｈＧＨ、標識Ｃ）の重ね合わせたトリプシンマップを示す。ＷＨＯ ｒｈＧＨ及びＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのトリプシンマップの比較は、２つのみのピーク移行、すなわちペプチドピーク１及びペプチドピーク９の移行を評価し、残りのピークは同一である。これらの差異は、発現したＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのＮ末端へのＨｉｓ６の付加によって引き起こされ、ピーク１のシフトをもたらすのに対し、ピーク９のシフトは、残基９２のフェニルアラニンをｐ−アセチル−フェニルアラニンと置換することにより生じる。パネルＣ―パネルＢからのピーク９の拡大図を示す。Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ及び３０Ｋ ＰＥＧ Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのトリプシンマップの比較は、Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのＰＥＧ化に際するピーク９の消失を評価し、したがって、改変がペプチド９に得意亭であることを確認する。
本実施例は、各々非天然アミノ酸を含む２つのｈＧＨポリペプチドから形成されるホモ二量体を示す。
図１２は、位置９２にｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓタグ付きのｈＧＨポリペプチドから得られたＩＭ−９アッセイ結果を、ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５で記載した官能基と反応性を有する二機能性のリンカーと結合されたこの修飾ポリペプチドのホモ二量体と比較する。
本実施例は、ｈＧＨアンタゴニストとして作用する、単量体及び二量体ｈＧＨポリペプチドを記載する。
Ｇ１２０Ｒ置換が部位ＩＩへ導入されたｈＧＨ変異タンパク質は、単一のｈＧＨ受容体と結合できるが、２つの受容体を二量体化することはできない。変異タンパク質は、細胞内シグナル伝達経路を活性化せずに受容体部位を占有することによって、インビトロでおそらくｈＧＨアンタゴニストとして作用する（Ｆｕｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７−１６８０ （１９９２））。図１３、パネルＡは、Ｇ１２０Ｒ置換を有するｈＧＨによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータを示す。同一位置（Ｇ１２０）で組み込まれる非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドは、図１３、パネルＢに示されるように、ｈＧＨアンタゴニストとしても作用する分子をもたらす。ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５に記載した官能基及び反応性を有する二機能性であるリンカーと結合して、図１３、パネルＢに示されるｈＧＨアンタゴニストの二量体を構築した。図１４は、この二量体がＩＭ−９アッセイにおける生物活性も欠失することを示す。
さらなるアッセイを実施し、Ｇ１２０ｐＡＦ置換を含むｈＧＨポリペプチドを、ＰＥＧリンカーによって結合されたＧ１２０ｐＡＦ修飾ｈＧＨポリペプチドの二量体と比較した。ＳＴＡＴ５のＷＨＯ ｈＧＨにより誘導されるリン酸化を、単量体及びＰＥＧリンカーによって連結された二量体の用量反応範囲で拮抗した。単量体及び二量体が、ＩＭ−９及びラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）／ＢＡＦ３細胞上での細胞表面受容体結合に関してＧＨと競合することを示す表面受容体競合研究も実施した。二量体は、単量体よりも強力なアンタゴニストとして作用した。表４は、これらの研究からのデータを示す。
Figure 2008525473
本実施例は、ｈＧＨ活性の測定結果及びｈＧＨ受容体に対するｈＧＨの親和性を詳述する。
ラットＧＨ受容体のクローニング及び精製
ラットＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ＧＨＲ ＥＣＤ、アミノ酸Ｓ２９ないしＴ２３８）を、Ｃ末端６Ｈｉｓタグを有するフレーム中のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間においてｐＥＴ２０ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内へクローニングした。Ｌ４３のＲへの変異を導入して、ヒトＧＨ受容体結合部位にさらに近接させた（Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． （１９９５） ９２（４）：９５９−６３）。３０℃で４ないし５時間、０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導することによって、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．コリ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で組換えタンパク質を産生した。細胞を溶解した後、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の３０ｍＬで加圧型細胞破砕装置中に再懸濁し、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の入っていない同一緩衝液で２回再懸濁することにより、ペレットを洗浄した。この時点で、封入体は、９５％超のＧＨＲ ＥＣＤからなり、０．１Ｍトリス、ｐＨ１１．５、２Ｍ尿素中で可溶化した。５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、１Ｍ Ｌ−アルギニン、３．７ｍＭシスタミン、６．５ｍＭシステアミンで平衡化したＳ１００（Ｓｉｇｍａ）ゲルろ過カラムに封入体溶液の一定分量を通過させることによって、再折り畳みを達成した。可溶性タンパク質を含有する画分を合わせ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して透析した。全ての沈殿を除去するために試料を簡単に遠心分離し、製造者の使用説明書にしたがって、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の一定分量とインキュベートした。５ｍＭイミダゾールを補充した透析緩衝液の２０容積で樹脂を洗浄した後、タンパク質を透析緩衝液中の１２０ｍＭイミダゾールで溶出した。最後に、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロールに対して、試料を一晩透析し、簡単に遠心分離して全ての沈殿物を除去し、２０％グリセロール最終濃度へ調整し、一定分量に分け、−８０℃で保存した。ε＝６５，７００Ｍ−１＊ｃｍ−１の算出された消光計数を使用するＯＤ（２８０）によって、タンパク質の濃度を測定した。
ＧＨのＧＨＲへの結合のＢｉｏｃｏｒｅ（商標）分析
製造者によって推奨されるように、標準的なアミン共役手法を使用して、可溶性ＧＨＲ ＥＣＤの約６００ないし８００ＲＵをＢｉｏｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上へ固定した。受容体の有意な部分がこの技術によって不活化されるが、固定のこのレベルは、約１００ないし１５０ＲＵの最大特異的ＧＨ結合反応を生じるのに十分であり、結合動力学に顕著な変化がないことを実験上見出した。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９９３） ２３４（３）：５５４−６３及びＷｅｌｌｓ ＪＡ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９９６） ９３（１）：１−６を参照してほしい。
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉｏｃｏｒｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中の野生型又は変異体ＧＨ（０．１ないし３００ｎＭ）の様々な濃度を、ＧＨＲ表面上に４０μＬ／分の流速で４ないし５分間注入し、注入後１５分間、解離をモニターした。４．５Ｍ ＭｇＣｌ２の１５秒パルスによって、表面を再生した。少なくとも１００回の再生周期の後に、結合親和性の最小の損失（１ないし５％）が観察されたに過ぎなかった。受容体が固定されていない基準細胞を使用して、一切の緩衝液バルク効果及び非特異的結合を差し引いた。
ＧＨ力価実験から得られた動力学的結合データをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア（Ｂｉｏｃｏｒｅ（商標））で処理した。「二価の分析物」会合モデルは、提唱される連続的な１：２（ＧＨ：ＧＨＲ）二量体化（Ｗｅｌｌｓ ＪＡ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （１９９６） ９３（１）：１−６）と一致して、満足な適合（一般に３未満のカイ２値）を提供した。平衡解離定数（Ｋｄ）は、個々の速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出した。
表４は、ＣＭ５チップ上に固定されたラットＧＨＲ ＥＣＤ（Ｌ４３Ｒ）を使用するＢｉｏｃｏｒｅ（商標）からの結合因子を示す。
Figure 2008525473
ＩＬ−３依存性マウス細胞系ＢＡＦ３を、ＩＬ−３源としてのＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、５０μＭ２−メルカプトエタノール及び１０％ＷＥＨＩ−３細胞系調整培地中でルーチンに継代培養した。すべての細胞培養物を、３７℃で、５％ＣＯ２の高湿大気中で維持した。
ＢＡＦ３細胞系を使用して、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）安定細胞クローン２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を確立した。簡潔には、１×１０７個の中程度に集密状態となったＢＡＦ３細胞を、全長のラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）ｃＤＮＡを含有する直鎖状になったｐｃＤＮＡ３．１プラスミド１５μｇで電気穿孔した。形質移入した細胞を４８時間回収させた後、８００μｇ／ｍＬのＧ４１８及び５ｎＭのＷＨＯ ｈＧＨを含有する培地中で制限希釈することによってクローニングした。形質移入体を発現するＧＨＲを、ヒトＧＨＲに対する抗体による表面染色（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）により同定し、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）上で分析した。次に、後述のようなＢｒｄＵ増殖アッセイにおいて、ＧＨＲの良好なレベルを発現する形質移入体を、（ＨＯ ｈＧＨに対する増殖活性についてスクリーニングした。表面受容体発現及び増殖能について一定のプロファイリングを行いながら、１．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８及び５ｎＭのｈＧＨの存在下で、所望の形質移入体の反復したサブクローニングのさらに２回のラウンドを行った時点で、安定して形質移入されたラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞クローンが確立された。このようにして確立された細胞クローン２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ１４を、ｈＧＨの不存在下で、１．２ｍｇ／ｍＬＧ４１８を加えたＢＡＦ３培地中にルーチンに維持する。
ＢｒｄＵ標識による増殖
ＢＡＦ細胞系２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を発現する血清飢餓ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）を、９６穴プレート中に、５×１０４個細胞／ウェルの密度で播種した。ｈＧＨタンパク質の１２点の用量範囲で細胞を活性化し、５０μＭのＢｒｄＵで同時に標識した（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。培養４８時間後、ＢＤ細胞固定／細胞透過処理溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを用い、室温で３０分間、細胞を固定／細胞透過した。ＢｒｄＵエピトープを露出させるため、固定／透過処理した細胞を、ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）の３０μｇ／ウェルで、３７℃で１時間処理した。ＡＰＣ結合型抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による免疫蛍光染色により、ＦＡＣＳアレイ上での使用分析が可能となった。
表６は、ｐＳＴＡＴ５（ＩＭ−９）及びＢｒｄＵ増殖アッセイで特性が明らかにされたＰＥＧ ｈＧＨ変異体の生物活性を示す。アッセイ間の比較を統一するために、ＷＨＯ ｈＧＨが発現されている。
Figure 2008525473
本実施例は、ＰＥＧ化されたｈＧＨのインビトロ及びインビボ活性を測定するための方法を記載する。
細胞結合アッセイ
標識していないＧＨ、ｈＧＨ、又はＧＭ−ＣＳＦのさまざまな濃度（容積：１０μＬ）の存在下又は非存在下、及び１２５Ｉ−ＧＨ（約１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下で、０℃で９０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μＬ）中で、二つ組みにて、０℃で９０分間、細胞（３×１０６個）をインキュベートする（総容積：１２０μＬ）。次に、細胞を再懸濁し、３５０μＬプラスチック製遠心チューブの中の２００μＬの氷冷ＦＣＳ上に層状に積み重ね、遠心分離する（１０００ｇ、１分）。チューブの末端を切断することによってペレットを回収し、ペレット及び上清を個別にガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）において計数した。
競合剤のない状態での総結合から未標識のＧＨの１００倍過剰量の存在下での結合（非特異的結合）（ｃｐｍ）を差し引いて、特異的な結合（ｃｐｍ）を決定する。非特異的結合を、使用される各細胞タイプについて測定する。１２５Ｉ−ＧＨの同一調製を使用して別の日に実験を実施し、内部一貫性を示すべきである。１２５Ｉ−ＧＨは、ＧＨ受容体産生細胞への結合を示す。結合は、未標識の天然ＧＨによって用量依存的な様式で阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦ又は他のネガティブコントロールによっては阻害されない。天然ＧＨに類似する天然１２５Ｉ−ＧＨの結合についてｈＧＨが競合し得るということは、受容体が、両形態を等しく十分に認識することを示唆する。
ＰＥＧ化されたｈＧＨのインビボ研究
ＰＥＧ−ｈＧＨ、非修飾ｈＧＨ及び緩衝溶液をマウス又はラットに投与する。結果は、有意な体重増加によって示される非修飾ｈＧＨと比べて、本発明のＰＥＧ化されたｈＧＨの優れた活性及び長期の半減期を示す。
結合型及び非結合型ｈＧＨ及びそのバリアントのインビボ半減期の測定
すべての動物実験は、ＡＡＡＬＡＣ公認施設及びＳｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物取り扱い及び使用委員会によって認可されるプロトコールの下で実施した。ラットは、１２時間明暗周期の部屋でケージの中で個別に飼育した。動物には、認可されたＰｕｒｉｎａ ｒｏｄｅｎｔ ｃｈｏｗ ５００１及び水への自由アクセスを与えた。下垂体切除ラットについては、飲料水は、さらに、５％グルコースを含有した。
薬物動態学的研究
ＰＥＧ化された各変異体ｈＧＨの質を、動物実験に入る前に、３回のアッセイによって評価した。非還元条件下でＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファーを使用する４ないし１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲルに通すことによって、ＰＥＧ−ｈＧＨの純度を検査した。クーマシーブルーでゲルを染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは、濃度測定走査に基づいて９５％超であった。各ＰＥＧ−ｈＧＨ中のエンドトキシンレベルを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）社製ＫＴＡ２キットを使用するＬＡＬアッセイによって検査し、１回用量あたり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２に記載される）ＩＭ−９ ｐＳＴＡＴ５生物アッセイで評価し、ＥＣ５０値が１５ｎＭ未満であることを確認した。
ＰＥＧにより修飾された成長ホルモン化合物の薬物動態学的特性を互いに比較し、及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（２６１ないし４２５ｇ）におけるＰＥＧ化されていない成長ホルモンと比較した。血液回収のため、カテーテルを頸動脈へと外科的に設置した。首尾よくカテーテルを設置した後、動物を薬物投与前に処理群（１群あたり３ないし６匹）へ割り当てた。動物に０．４１ないし０．５５ｍＬ／ｋｇの用量容積で化合物の１ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。体内に留置したカテーテルを介して、及びＥＤＴＡによりコーティングされたミクロチューブ中に、さまざまな時点で、血液試料を回収した。遠心分離後、血漿を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）社製又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）社製のいずれかの抗体サンドイッチ成長ホルモンＥＬＩＳＡキットを使用して、化合物濃度を測定した。投与された類縁体に相当する標準物質を使用して、濃度を算出した。モデリングプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ （Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ， ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１を使用して、薬物動態学的因子を概算した。直線アップ／対数ダウンの台形積分による非区画分析を使用し、濃度データを均一に計測した。
図１５は、ラットにおける単回皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群あたりｎ＝３ないし４）に、１ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ ｈＧＨ）、Ｈｉｓタグ付きのｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、又は３０ＫＤａＰＥＧに共有結合された位置９２に非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むＨｉｓタグ付きのｈＧＨポリペプチド（３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ）の単回大量瞬時投与量を付与した。表記時間間隔にわたって、血漿試料を採取し、記載されるように注入された化合物についてアッセイを行った。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨは、コントロールｈＧＨと比較して劇的に循環が上昇した。
図１６は、ラットにおける単回の皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群あたりｎ＝３ないし６）に、１ｍｇ／ｋｇのタンパク質の単回大量瞬時投与量を付与した。６個の異なる位置の各々で３０ｋＤａＰＥＧへ共有結合された非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドを、ＷＨＯ ｈＧＨ及び（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較した。表記時間間隔にわたって血漿試料を採取し、記載されるように注入された化合物についてアッセイを行った。表７は、図１６に示されるｈＧＨポリペプチドの単回用量投与についての薬物動態学的パラメータを示す。濃度対時間曲線を非区画分析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ， ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１）により評価した。表記されている値は、平均（±標準偏差）である。Ｃｍａｘ：最大濃度、末端ｔ１／２：末端半減期、ＡＵＣ０→ｉｎｆ：無限大に外挿された濃度−時間曲線下の面積、ＭＲＴ：平均残留時間、Ｃｌ／ｆ：見かけの総血漿クリアランス、Ｖｚ／ｆ：末端相の間の分布の見掛けの容積。
Figure 2008525473
薬力学的研究
下垂体切除したオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。下垂体を３ないし４週齢で外科的に切除した。動物を３週間順化させ、その間、体重をモニターした。研究の開始前７日間にわたって０ないし８ｇの体重増加をした動物を含め、処理群へ無作為化した。ラットに大量瞬時投与量又は日用量のいずれかを皮下投与した。研究を通じてラットを毎日連続して体重計測し、麻酔し、採血し、（適用可能なとき）投与した。ヘパリン化毛細管を使用して眼窩洞から血液を回収し、ＥＤＴＡコーティングしたミクロチューブへと入れた。血漿を遠心分離により単離し、分析まで−８０℃で保存した。
図１７は、下垂体切除したラットにおける単回皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群あたりｎ＝５ないし７）に２．１ｍｇ／ｋｇタンパク質の単回大量瞬時投与量を付与した。２つの異なる位置（位置３５、９２）の各々で３０ｋＤａＰＥＧへ共有結合した非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドからの結果を示す。表記時間間隔にわたって血漿試料を採取し、記載される注入された化合物についてアッセイを行った。
ペプチドＩＧＦ−１は、ソマトメジン又はインスリン様成長因子のファミリーのメンバーである。ＩＧＦ−１は、成長ホルモンの成長促進効果の多くを媒介する。提供されたラット／マウスＩＧＦ−１標準物質に対する競合的結合酵素免疫アッセイキット（Ｄｉａｇｎｏｓｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＩＧＦ−１濃度を測定した。両側分布の対になっていない等分散を使用するｔ検定によって、有意差を決定した。図１８、パネルＡは、下垂体切除したラットでの化合物の評価を示す。ラット（１群あたりｎ＝５ないし７）に単回用量又は日用量のいずれかを皮下的に付与した。動物を毎日連続して体重測定し、麻酔し、採血し、（適用可能なとき）投与した。偽薬処理、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、Ｈｉｓタグ付きのｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）並びに位置３５及び９２で３０ｋＤａＰＥＧへ共有結合されたｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについて、体重の結果を示す。図１８、パネルＢ−ＰＥＧ化された天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後の循環する血漿ＩＧＦ−１レベルに対する効果の図を示す。バーは、標準偏差を表す。図１８、パネルＡにおいて、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ３５（ｈｉｓ）ｈＧＨの９日目における体重増加は、より大きな体重増加が観察されたという点で、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物とは有意に異なった（ｐ＜０．０００５）。
図１８、パネルＣは、下垂体摘出ラット中での化合物の評価を示している。ラット（Ｎ−１１／群）に、単回用量又は日用量のいずれかを皮下的に付与した。動物を毎日連続して体重測定し、麻酔し、採血し、（適用可能なとき）投与した。偽薬処理、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）並びに位置９２、１３４、１４５、１３１及び１４３で３０ｋＤａＰＥＧへ共有結合されたｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについて、体重の結果が示されている。図１８、パネルＤ―偽薬処理及び野生型ｈＧＨと比較した、ＰＥＧ化された（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後における循環する血漿ＩＧＦ−１レベルに対する効果の図を示す。図１８、パネルＥは、ＰＥＧ化された（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに相当する平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。表記時間間隔にわたって血漿試料を採取し、記載されるように注入された化合物についてアッセイした。バーは、標準偏差を表す。
天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性及び／又は有効性に関するヒト臨床治験
目的
（ヒューマトロープ（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ）（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ニュートロピン（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ）（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ノルジトロピン（Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ）（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ゲノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、及びサイゼン／セロスチム（Ｓａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ）（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含む（これらに限定されない。）市販のｈＧＨ生成物のうちの１つ又はそれ以上と、天然においてコードされていないアミノ酸を含む、皮下投与されたＰＥＧ化した組換えヒトｈＧＨの安全性及び薬物動態学を比較すること。
患者
２０ないし４０歳、体重６０ないし９０ｋｇの範囲の１８名の健常なボランティアを研究に登録する。被験者は、血液学又は血清化学についての臨床的に有意な異常な測定値、ネガティブな尿毒物学的スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有さない。被験者は、次のうちのいずれの徴候も有するべきでない。すなわち、高血圧、いずれかの一次的な血液学的病歴、有意な肝性、腎性、心臓循環器系、胃腸管系、尿生殖器系、代謝性、神経性の病歴、貧血又は癲癇の疾患暦、細菌若しくは哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する公知の感受性、カフェイン含有飲料の習慣的又は重度消費者、その他の臨床治験に参加したこと又は研究への参加の３０日以内に輸血又は献血をしたこと、研究への参加の３ヶ月以内にｈＧＨに曝露されたこと、研究への参加の７日以内に病気を有していたこと、及び研究前身体検査又は研究参加の１４日以内の臨床的研究評価において有意な異常性を有することである。すべての被験者は、安全性に関して評価でき、薬物動態学的分析のための血液回収はすべて、計画通りに回収する。すべての研究は、研究所の倫理委員会の承認及び患者の同意を得て実施した。
研究デザイン
これは、健常男性ボランティアにおける第Ｉ相の単一センターでの非盲検無作為化２期間クロスオーバー研究である。１８名の被験者を２つの処理シーケンス群（１群あたり９名の被験者）のうちの１つへ無作為に割り当てる。天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨ及び選択された市販の生成物の等しい投与量を使用して、大腿における大量瞬時皮下注射として、２つの別個の投与期にわたって投与する。市販の生成物の投与の用量及び頻度は、包装ラベルに教示されるとおりである。市販の生成物を使用する際に所望される、追加投与、投与頻度又は他のパラメータは、被験者の追加群を含めることによって、本研究へ追加し得る。各投与期間は、１４日間の休薬期間によって隔てられる。２回の投与期間の各々について投与の少なくとも１２時間前及び投与の７２時間後に、被験者は研究センターへ拘束されるが、１回目の投与期間と２回目の投与期間の間は拘束されない。ＰＥＧ化されたｈＧＨについても検査されるべき追加投与、頻度又は他のパラメータが存在すべき場合、被験者のさらなる群を追加し得る。ヒトへの使用について認可されたＧＨの複数の製剤を本研究において使用し得る。ヒューマトロープ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ニュートロピン（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ノルジトロピン（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ゲントロピン（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、及びサイゼン／セロスチム）（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）は、ヒトの使用に認可された市販のＧＨ生成物である。ｈＧＨの実験的な製剤は、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨである。
血液サンプリング
ｈＧＨの投与前及び投与後に直接的な静脈穿刺によって、連続血を採血する。投与の約３０分前、２０分前及び１０分前（３ベースライン試料）に、及び投与後の概ね次の時間：１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後に、血清ＧＨ濃度測定用の静脈血試料（５ｍＬ）を得る。各血清試料を２つの一定分量へと分割する。すべての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で輸送する。１日目の初回投与直前、４日目の午前、１６日目の投与の直前及び１９日目の午前に、迅速な臨床研究室検査（血液学、血清化学、及び尿検査）を実施する。
生体分析方法
ＥＬＩＳＡキット手法（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ［ＤＳＬ］， Ｗｅｂｓｔｅｒ ＴＸ）を使用して、血清ＧＨ濃度を測定する。
安全性の決定
各投与の直前（１及び１６日目）、並びに各投与の６、２４、４８及び７２時間後にバイタルサインを記録する。安全性の決定は、有害事象の発生率及びタイプ、並びにベースラインからの臨床研究室検査の変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定結果の研究前からの変化及び身体測定結果を評価する。
データ解析
投与の３０、２０及び１０分前に回収される３つの試料からＧＨレベルを平均することによって測定される平均ベースラインＧＨ濃度を、投与後の各値から差し引くことによって、投与前ベースラインＧＨ濃度について、投与後の血清濃度値を補正する。投与前血清ＧＨ濃度は、アッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の算出に含まれない。ベースラインＧＨ濃度について補正された血清濃度データから薬物動態学的パラメータを求める。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムに関するモデル独立方法によって、薬物動態学的パラメータを算出する。次の薬物動態学的パラメータ：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度に至る時間（ｔｍａｘ）、線形台形則の使用で算出される時間０から最後の採血時間までの（ＡＵＣ０−７２）濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積、及び排除率定数から算出される末端排除半減期（ｔ１／２）を決定する。対数−直線濃度−時間プロットの末端直線領域における連続したデータ地点の直線回帰によって、排除率定数を概算する。薬物動態学的パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を各処理について算出する。パラメータの平均の比（保存された製剤／保存されていない製剤）を算出する。
安全性の結果
有害事象の発生率を処理群にわたって等しく分布させる。ベースライン又は研究前の臨床研究室検査又は血圧からの臨床的に有意な変化は存在せず、並びに身体検査結果及びバイタルサイン測定結果に研究前からの顕著な変化は存在しない。２つの処理群についての安全性の特性は、同様であるように見受けられるはずである。
薬物動態学的結果
（ヒューマトロープ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ニュートロピン（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ノルジトロピン（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ゲントロピン（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、及びサイゼン／セロスチム）（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含むが、これらには限定されない。）市販のｈＧＨ生成物のうちの１つ又はそれ以上の単回投与を受容した後の１８名の被験者全員の（ベースラインＧＨレベルについて補正されていない）平均血清ＧＨ濃度−時間特性を、測定される各時点での天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨと比較する。すべての被験者は、正常な生理学的範囲内の投与前ベースラインＧＨ濃度を有すべきである。投与前平均ベースラインＧＨ濃度について補正された血清データから、薬物動態学的パラメータを求め、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。選択された臨床比較因子（ヒューマトロープ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ニュートロピン（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ノルジトロピン（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ゲントロピン（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、及びサイゼン／セロスチム）（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ））についての平均ｔｍａｘは、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨについてのｔｍａｘよりも有意に短い。天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化したｈＧＨについての末端半減期と比較して、検査される市販のｈＧＨ生成物についての末端半減期値は有意に短い。
本研究は、健常な男性被験者において実施されるが、同様の吸収特徴及び安全性特性が、ガン又は慢性腎疾患を有する男性若しくは女性患者、小児科腎疾患患者、自己沈着前プログラム（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｅｄｅｐｏｓｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ）にある患者、又は待機的手術について計画された患者など、他の患者集団においても期待される。結論として、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの皮下投与される単回投与は、安全であり、健常な男性被験者によって十分に耐容される。有害事象の比較的発生率、臨床研究室値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づくと、ｈＧＨの市販の形態及び天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性特性は等しい。天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨは、患者及び医療提供者に対して、大きな臨床上の有用性を提供する可能性を秘めている。
次の実施例において、ａｈＧＨ及びＰＥＧ−ａｈＧＨは、それぞれ、３５の位置にｐ−アセチルフェニルアラニンを有する配列番号２のｈＧＨ及びＰＥＧ化されたｈＧＨであり、ＰＥＧ化したｈＧＨにおいては、ＰＥＧは、ｐ−アセチルフェニルアラニンとともに形成されるオキシム結合を介して結合され、ＰＥＧは、直鎖３０ｋＤａＰＥＧである。
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイ
ｈＧＨとその受容体との相互作用は、ヒトＩＭ−９リンパ球細胞系中で転写ファミリーメンバーＳＴＡＴ５のシグナル伝達因子及び活性化因子のチロシンリン酸化をもたらす。ａｈＧＨ及びＰＥＧ−ａｈＧＨの濃度を増加させながらＩＭ−９を活性化した後、ホスホ−ＳＴＡＴ５について細胞内免疫蛍光染色することによって、（５０％最大ＳＴＡＴ５リン酸化（ＥＣ５０）に必要な）ａｈＧＨ及びＰＥＧ−ａｈＧＨの濃度を測定した。世界保健機構（ＷＨＯ）標準物質ｈＧＨのＥＣ５０を１．０とすると、ＷＨＯ ｈＧＨと比較したときのａｈＧＨの相対的なＥＣ５０を１．１であると決定され、ＰＥＧ−ａｈＧＨの相対的なＥＣ５０は、１０．９であった。
増殖アッセイ
成長ホルモンに反応して増殖する細胞系の使用によって、ＰＥＧ−ａｈＧＨ活性をインビトロで決定した。このような細胞系の一例は、２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４と命名されたラットＧＨＲ［Ｌ４３Ｒ］／ＢＡＦ３細胞クローンであり、これは、位置４３にＬｅｕからＡｒｇへの置換を有するラットＧＨＲでマウスＢＡＦ３細胞を安定して形質移入することによって生じる系である。ラット受容体のＬｅｕ−４３をＡｒｇ−４３へ変換することによって、ラットＧＨＲはより「ヒト様」となるため、効率的なｈＧＨ結合が可能となる。活発に分裂しているラットＧＨＲ［Ｌ４３Ｒ］／ＢＡＦ３細胞のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識を採用して、成長ホルモン誘導性増殖の定量化についての高分解能の非放射性方法を提供した。ＷＨＯ ｈＧＨに対するＥＣ５０を統一のために設定し、ＷＨＯ ｈＧＨと比較したときのａｈＧＨ及びＰＥＧ−ａｈＧＨの相対的ＥＣ５０は、それぞれ、１．０６±０．２９（ｎ＝１１）及び５．３７±１．２３（ｎ＝９）であると決定された。
ＰＥＧ化されたｈＧＨの有効性研究
臨床前有効性研究を、成長ホルモン欠乏性のラットモデルにおいて実施した。このモデルにおいて、約４週齢で下垂体を外科的に除去した。これらの下垂体除去ラットの体重を術後モニターし、研究前７日間にわたって体重増加が７．５ｇ未満を示す動物を、下垂体除去に成功したと考え、処理群のうちで無作為化した。体重減少が２．５ｇ超を示す動物を、健常ではないと考え、本研究から除外した。本研究は、術後約３週間で開始した。
偽薬又は増大するＰＥＧ−ａｈＧＨ用量のいずれかを動物に毎週投薬（すなわち、０及び７日目に投与）。さらなる処理群には、ゲノトロピン又は偽薬を毎日与えた。体重及び血液を投与前及び毎日回収した。すべての動物を１４日目に屠殺した。図２８は、研究を通じての血漿ＩＧＦ−１レベルを示す。ＩＧＦ−１の強固な用量依存的増大が観察された。
ＩＧＦ−１ Ｃｍａｘの用量依存的増大を、各投与間隔後に観察された。第一投与からのＣｍａｘ値のカーブフィッティングにより、最小（Ｅｏ）及び最大（Ｅｍａｘ）ＩＧＦ−１ Ｃｍａｘは、それぞれ１３６．７ｎｇ／ｍＬ及び１，１３６．２ｎｇ／ｍＬであると推測され、ＥＤ５０が０．１３６ｍｇ／ｋｇであることが決定された（表８）。
血漿ＩＧＦ−１レベルは、ＡＵＣとして表したといに明確な用量依存性の増加も示した。このパラメータについては、ＡＵＣは、有効なＩＧＦ−１血漿レベルを上回るＡＵＣとして表される。以前の実験は、ベースラインを上回る３４ｎｇ／ｍＬという持続的ＩＧＦ−１濃度が下垂体切除したラットの体重増加をもたらすことを示した。本研究では、本研究を通じて偽薬群から求められたベースラインＩＧＦ−１レベルは、１２８ｎｇ／ｍＬであった。１２８ｎｇ／ｍＬを上回る３４ｎｇ／ｍＬの増大は、１６２ｎｇ／ｍＬの有効なＩＧＦ−１レベルを推測する。したがって、１６２ｎｇ／ｍＬを上回るＡＵＣを積分した。この分析から、有効なレベルを上回るＡＵＣの用量依存的増大が各投与間隔後に観察された。第一投与から得られたＡＵＣ値の曲線適合により、Ｅｏ及びＥｍａｘ ＩＧＦ−１ ＡＵＣは、それぞれ、０ｎｇＸｈｒ／ｍＬ及び５，０２９．８ｎｇＸｈｒ／ｍＬであることが推測され、このパラメータについてのＥＣ５０は０．９０９ｍｇ／ｋｇであると決定された（表７）。
第一投与後の推定有効レベルを上回って誘導されるＩＧＦ−１レベルの時間を求めた。より多量の投与時には、ＩＧＦ−１レベルは、第二投与の前にベースラインへと回復しなかった。これらの場合、ＩＧＦ−１濃度は、算出した末端傾斜（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｌｏｐｅ）を使用して、有効なレベルへと外挿した。この評価から、有効なレベルを上回るＩＧＦ−１濃度の時間の用量依存的増大が明白であった。カーブフィッティングによって、最小時間及び最大時間がそれぞれ、０日及び８．８４日であると推定され、このパラメータに対するＥＤ５０は０．１７３ｍｇ／ｋｇであることが決定された（表８）。
ＰＥＧ−ａｈＧＨ ＥＤ５０を算出するため、さらなる薬力学的指標として骨成長を使用した。本研究の終了時に各動物から脛骨を回収し、１０％中性緩衝化されたホルマリン中に浸漬固定した後、Ｘ線検査をした。結果を図２９に示す。ＰＥＧ−ａｈＧＨ処理した動物に関しては、脛骨長の明確な用量依存的増大が存在した。さらに、毎日のゲノトロピンと比較して、用量節約効果が存在した。７日間間隔にわたって投与されるゲノトロピンの量は、毎週（すなわち０日目及び７日目）付与されるＰＥＧ−ａｈＧＨの２．１ｍｇ／ｋｇと等価である。ゲノトロピンと同様の脛骨長の増大の誘導を、０．４２ないし１．０ｍｇ／ｋｇでＰＥＧ−ａｈＧＨについて示される。このことは、ゲノトロピンと比較したときに、ＰＥＧ−ａｈＧＨに５０％以上の用量節約効果が存在することを表す。
ＰＥＧ−ａｈＧＨは、体重における用量依存的増加も誘導した（図３０）。さらに、脛骨長の誘導とともに、ＰＥＧ−ａｈＧＨには、ゲノトロピンを上回る用量節約効果が明白であった。０．３ｍｇ／ｋｇ／日でのゲノトロピンによる毎日の処理は、０日目から１４日目における２７．７４（±７．９２）％の体重の変化を誘導した。ＧＨの等価の量（すなわち、０日目及び７日目での２．１ｍｇ／ｋｇ）で投与されるＰＥＧ−ａｈＧＨは、ゲノトロピンを上回るより大きな体重増加を誘導した。ＰＥＧ−ａｈＧＨのこの用量は、０日目から１４日目における３３．６６（±７．５５）％の体重の変化をもたらした。０日目及び７日目に１．０ｍｇ／ｋｇのより低い用量で投与されたＰＥＧ−ａｈＧＨによって誘導される％体重変化は、１４日目に２７．０２（±３．９７）％の体重変化を誘導した。本結果は、ＰＥＧ−ａｈＧＨに関して、ほぼ５０％の用量節約効果を表す。２．１ｍｇ／ｋｇ用量で毎週ＰＥＧ化しされていないＧＨを投与しても、体重増加を誘導することはできなかった。
１４日目での％体重変化のカーブフィッティングにより、ＰＥＧ−ａｈＧＨによって誘導される最小及び最大の％体重変化は、それぞれ、７．１７及び５０．６５であると推定された。この曲線から、このパラメータについてのＥＣ５０は、１．０９７ｍｇ／ｋｇであることが決定された（表８）。
Figure 2008525473
ＩＧＦ−１濃度測定のために回収された同一血漿試料を、ＰＥＧ−ａｈＧＨ濃度についてアッセイした。使用されるＥＬＩＳＡアッセイは、ｈＧＨに対して特異的であり、低下したが、ＰＥＧ−ａｈＧＨに対してなお強固な反応を示し、ラットＧＨを検出しない。ＰＥＧ−ａｈＧＨ血漿濃度−時間特性を図３１に示す。ＰＥＧ−ａｈＧＨ Ｃｍａｘの用量依存的増大が起こった。循環中のＰＥＧ−ａｈＧＨ残留期間は、全体のＰＥＧ−ａｈＧＨ ＡＵＣと同様、用量依存的な様式で増大した。毎日投与されるゲノトロピンは、おそらくは迅速なクリアランスのために、血漿中で検出できなかった。ＰＥＧ−ａｈＧＨ暴露結果のは、上記用量依存的な有効性を支持する。
上述の下垂体切除したラット研究により、以下のことが示された。
１．ＰＥＧ−ａｈＧＨは、ＩＧＦ−１血漿濃度を用量依存的に増大させた。ＩＧＦ−１ Ｃｍａｘ並びにＩＧＦ−１ ＡＵＣ及び有効レベルを上回る期間はすべて、用量依存的に増大した。
２．脛骨長及び体重は、用量依存的に増大した。
３．毎日投与されたゲノトロピンに比べて５０％以上の用量節約を示した。
４．ＰＥＧ−ａｈＧＨは、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ及び上述の薬力学的効果と相関した循環中の持続性における用量依存的増大を示した。
薬物動態学的研究
ラット薬物動態学
ラット疾病モデルにおいて、様々な投与量で皮下投与されたＰＥＧ−ａｈＧＨについての血漿濃度対時間特性を、上述の実施例３４に示す。
霊長類薬物動態学
分子がＮ末端位置にメチオニンを含有した点のみが異なるＰＥＧ−ａｈＧＨのバージョン（ＰＥＧ−ａ（ｍｅｔ）ｈＧＨ）の薬物動態学的特性を、オスのカニクイザルにおいて評価した（図３２）。
ＰＥＧ−ａ（ｍｅｔ）ｈＧＨの単回注入を、それぞれ０．７５ｍｇ／ｋｇ又は０．１５ｍｇ／ｋｇの皮下又は静脈内投与のいずれかで投与した。皮下投与後、４，９７７（±１，２８６）ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘは、注入約１６時間後に到達した。見かけの末端半減期は、ＰＥＧ−ａｈＧＨを与えたラットにおける７．０５（±０．４７）と比較して、１２．２３（±１．７２）時間であった。静脈内投与後の半減期は、６．４２（±０．５１）時間であった。用量により補正されたＡＵＣ値は、皮下及び静脈内投与について、それぞれ、３６２，４４３ｎｇＸｈｒＸｋｇ／ｍＬ／ｍｇ及び３１２，４４０ｎｇＸｈｒＸｋｇ／ｍＬ／ｍｇであった。皮下投与からの生物学的利用率は１１６％であると算出された。
臨床プロトコールにおいて提唱される用量及び投与計画についての理論的根拠
ヒトにおけるＰＥＧ化されたＧＨについての最適な投与計画を、動物における次の研究から決定する。
臨床前有効性研究において観察されるラット有効性研究−用量節約（すなわち、低いＰＥＧ−ａｈＧＨ投与量ではあるが、ゲノトロピンに対して比較上の有効性）を、ヒトでの生物学的活性について必要な用量概算において使用する。
ラット及びカニクイザルにおける薬物動態学的評価−非比例的なスケーリングを使用して、ヒトにおける薬物動態学的因子を概算する。
ラット及びカニクイザルにおける単回用量の一過性の安全性研究を使用して、暴露を評価し、ＮＯＡＥＬを決定する（負の効果レベルは観察されない。）。
ラットの１ヶ月の反復用量ＧＬＰ安全性研究―ヒトへの最大推奨用量（ＭＲＨＤ）を上回る２×、６×、及び２０×である用量から、暴露の１ヶ月後を評価する。小児科ＧＨＤについて、ＭＲＨＤ＝０．３６ｍｇ／ｋｇ／週。
カニクイザルの１ヶ月の反復用量ＧＬＰ安全性研究―ヒトへの最大推奨用量（ＭＲＨＤ）を上回る２×、１０×、及び３０×である用量から、暴露の１ヶ月後に安全性を評価する。小児科ＧＨＤについて、ＭＲＨＤ＝０．３６ｍｇ／ｋｇ／週。
ラット６ヶ月反復用量ＧＬＰ安全性研究。ラットにおける暴露が、ヒトにおけるＭＲＨＤでの観察される暴露の１ないし２×及び１０×であるよう、投与による暴露の６ヶ月後の安全性を評価する。
カニクイザルの６ヶ月の反復用量ＧＬＰ安全性研究。サルにおける暴露が、ヒトにおけるＭＲＨＤで観察された暴露の１ないし２×及び１０×であるよう、投与による暴露の６ヶ月後の安全性を評価する。
本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、単に例示を目的としたものにすぎず、これらに照らして様々な改変又は変更が当業者に示唆され、これらは、本願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれるべきことが理解される。本願に引用されている全ての公報、特許、特許出願及び／又は他の文献は、各個別の公報、特許、特許出願及び／又は他の文書が、あらゆる目的のために、参照により個別的に組み込まれることが記されている場合と同じ程度まで、あらゆる目的のために、それらの全体が、参照により組み込まれる。
Figure 2008525473
４へリックスバンドルタンパク質についての一般的な構造の図が示される。 ４へリックスバンドルタンパク質成長ホルモン（ＧＨ）についての一般的な構造の図が示される。 ４へリックスバンドルタンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）についての一般的な構造の図が示される。 ４つのへリックスバンドルタンパク質であるインターフェロンアルファ−２（ＩＮＦα−２）についての一般的な構造の図が示される。 ４へリックスバンドルタンパク質である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）についての一般的な構造の図が示される。 次の位置、すなわち、Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３又はＫ１４５の各々に、天然においてコードされていないアミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを含むｈＧＨの発現を示す、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥが示される。 パネルＡ及びＢ―天然においてコードされていないアミノ酸（パネルＢ）及び野生型ｈＧＨ（パネルＡ）を含むｈＧＨの、ＩＭ９細胞に対する生物活性の図が示される。 パネルＡ及びＢ―天然においてコードされていないアミノ酸（パネルＢ）及び野生型ｈＧＨ（パネルＡ）を含むｈＧＨの、ＩＭ９細胞に対する生物活性の図が示される。 ＰＥＧ（５、２０、及び３０ｋＤａ）の天然においてコードされていないアミノ酸への共有結合によってＰＥＧ化される天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨの産生を示すクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥが示される。 天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨのさまざまなＰＥＧ化した形態の、ＩＭ９細胞に対する生物活性を示す図が示される。 パネルＡ―この図は、表記のトリプシン開裂部位及び矢印で指定される非天然アミノ酸置換Ｆ９２ｐＡＦを有するｈＧＨの一次構造を示す（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８８） １０（４）：３２６−３３７から改変された図）。 パネルＢ―ＰＥＧ化された天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じるペプチド（標識されたＡ）、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じるペプチド（標識されたＢ）、及びＷＨＯ ｒｈＧＨから生じるペプチド（標識されたＣ）の重ね合わされたトリプシンマップが示される。 パネルＣ―パネルＢからのピーク９の拡大図が示される パネルＡ及びパネルＢは、精製されたＰＥＧ−ｈＧＨポリペプチドのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 パネルＡ及びパネルＢは、精製されたＰＥＧ−ｈＧＨポリペプチドのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 ＩＭ９細胞に対するｈＧＨ二量体分子の生物活性の図が示される。 パネルＡ―Ｇ１２０Ｒ置換を有するｈＧＨアンタゴニストによってｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータの図が示される。 パネルＢ―同一位置（Ｇ１２０）に取り込まれた非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドによってｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータの図が示される。 図１３のパネルＢに示されるｈＧＨアンタゴニストの二量体がＩＭ−９アッセイにおける生物活性も欠失することを示す図が示される。 ＰＥＧ化されている天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期を、ＰＥＧ化されていないｈＧＨポリペプチドと比較する図が示される。 ＰＥＧ化されている天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期を比較する図が示される。 ＰＥＧ化しされている天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期を比較する図が示される。ラットに２．１ｍｇ／ｋｇを１回投与した。 パネルＡ―ＰＥＧ化されている（位置３５、９２）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後のラットの体重増加に及ぼす影響の図が示される。 パネルＢ―ＰＥＧ化されている（位置３５、９２）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後の循環する血漿ＩＧＦ−１レベルに及ぼす効果の図が示される。 パネルＣ―ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後のラットの体重増加に及ぼす効果の図が示される。 パネルＤ―ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１）天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回用量の投与後の循環する血漿ＩＧＦ−１レベルに及ぼす効果の図が示される。 パネルＥ―ＰＥＧ化されている天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの、ラットにおける血清半減期を比較する図が示される。 直鎖の３０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミンカルバマートの図が示される。 カルバマートにより連結されるオキシアミノ誘導体化されたＰＥＧの合成を示す図が示される。 図２１は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するために使用され得るＰＥＧ含有試薬の合成の非限定的な実例を示す。 図２２は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するために使用され得るＰＥＧ含有試薬の合成の非限定的な実例を表す。 図２３は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するのに使用され得るアミドベースのヒドロキシルアミンＰＥＧ含有試薬の合成の非限定的な実例を表す。 図２４は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するのに使用され得るカルバマートを基礎としたＰＥＧ含有試薬の合成の非限定的な実例を表す。 図２５は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するのに使用され得るカルバマートをベースとしたＰＥＧ含有試薬の合成の非限定的な実例を表す。 図２６は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するのに使用され得る単純なＰＥＧを含有する試薬の合成の非限定的な実例を表す。 図２７は、オキシムにより連結されたＰＥＧ含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するのに使用され得る分岐したＰＥＧを含有する試薬の非限定的な実例、及びカルボニルをベースとした非天然アミノ酸ポリペプチドを改変するためのこのような試薬の使用を表す。 図２８は、偽薬で若しくはＰＥＧ−ａｈＧＨの漸増用量で毎週、又は偽薬若しくはゲノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）で毎日処理した、下垂体切除したラットにおけるＩＧＦ−１血漿濃度を示すグラフを表す。 図２９は、偽薬もしくはＰＥＧ−ａｈＧＨで毎週、又は偽薬若しくはゲノトロピンで毎日処理した、下垂体切除したラットにおける脛骨長を示すグラフを表す。 図３０は、偽薬もしくはＰＥＧ−ａｈＧＨで毎週、又は偽薬若しくはゲノトロピンで毎日処理した、下垂体切除したラットにおける体重変化の百分率を示すグラフを表す。 図３１は、第０日及び第７日に皮下投与されるＰＥＧ−ａｈＧＨについての血漿濃度対時間を示すグラフを表す。 図３２は、単回皮下又は静脈内用量として投与されるＰＥＧ−ａ（ｍｅｔ）ｈＧＨについての血漿濃度対時間を示すグラフを表す。

Claims (79)

  1. 少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含み、前記共有結合がオキシム結合である、ホルモン組成物。
  2. 前記ＧＨがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である、請求項１に記載のホルモン組成物。
  3. 前記ｈＧＨが配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列を含む、請求項２に記載のホルモン組成物。
  4. 前記ｈＧＨが配列番号２の配列を含む、請求項２に記載のホルモン組成物。
  5. 前記ＧＨが天然においてコードされていないアミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む、請求項１又は２に記載のホルモン組成物。
  6. ＮＥＡＡと水溶性ポリマーとの間のオキシム結合を含む、請求項５に記載のホルモン組成物。
  7. ＮＥＡＡがカルボニル基を含む、請求項６に記載のホルモン組成物。
  8. ＮＥＡＡがケトンを含む、請求項７に記載のホルモン組成物。
  9. ＮＥＡＡがｐ−アセチルフェニルアラニンである、請求項８に記載のホルモン組成物。
  10. ｐ−アセチルフェニルアラニンが、配列番号２の位置３５に対応する位置において置換されている、請求項９に記載のホルモン組成物。
  11. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１又は２に記載のホルモン組成物。
  12. ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項１１に記載のホルモン組成物。
  13. ＰＥＧが約０．１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１２に記載のホルモン組成物。
  14. ＰＥＧが約１と約６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１２に記載のホルモン組成物。
  15. ＰＥＧが約２０と約４０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１２に記載のホルモン組成物。
  16. ＰＥＧが約３０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１２に記載のホルモン組成物。
  17. ＰＥＧが分岐ＰＥＧである、請求項１１に記載のホルモン組成物。
  18. ＰＥＧが約１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１７に記載のホルモン組成物。
  19. ＰＥＧが約３０と約５０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１７に記載のホルモン組成物。
  20. ＰＥＧが約４０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１７に記載のホルモン組成物。
  21. 水溶性ポリマーがＰＥＧを含む、請求項７に記載のホルモン組成物。
  22. ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項２１に記載のホルモン組成物。
  23. ＰＥＧが約０．１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２１に記載のホルモン組成物。
  24. ＰＥＧが約１と約６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２１に記載のホルモン組成物。
  25. ＰＥＧが約２０と約４０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２１に記載のホルモン組成物。
  26. ＰＥＧが約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項２１に記載のホルモン組成物。
  27. ＰＥＧが分岐ＰＥＧである、請求項７に記載のホルモン組成物。
  28. ＰＥＧが約１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２８に記載のホルモン組成物。
  29. ＰＥＧが約３０と約５０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２８に記載のホルモン組成物。
  30. ＰＥＧが約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項２８に記載のホルモン組成物。
  31. 前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、請求項１０に記載のホルモン組成物。
  32. ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項３１に記載のホルモン組成物。
  33. ＰＥＧが約０．１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３２に記載のホルモン組成物。
  34. ＰＥＧが約１と約６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３２に記載のホルモン組成物。
  35. ＰＥＧが約２０と約４０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３２に記載のホルモン組成物。
  36. ＰＥＧが約３０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３２に記載のホルモン組成物。
  37. ＧＨがｈＧＨである、請求項３２に記載のホルモン組成物。
  38. ｈＧＨが配列番号２を含む、請求項３７に記載のホルモン組成物。
  39. 水溶性ポリマーの複数への共有結合の複数によって連結されたＧＨを含み、少なくとも１つの共有結合がオキシム結合である、請求項１に記載のホルモン組成物。
  40. ＧＨがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である、請求項３９に記載のホルモン組成物。
  41. ｈＧＨが配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列を含む、請求項４０に記載のホルモン組成物。
  42. ｈＧＨが配列番号２の配列を含む、請求項２に記載のホルモン組成物。
  43. ＧＨがＮＥＡＡの複数を含む、請求項３９又は４１に記載のホルモン組成物。
  44. ホルモン組成物であり、少なくとも１つの直鎖ＰＥＧにオキシム結合を介して連結されたｈＧＨを含み、前記ｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、並びに残基１−５、６−３３、３４−７４、７５−９６、９７−１０５、１０６−１２９、１３０−１５３、１５４−１８３及び１８４−１９１からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つのＮＥＡＡを含む、前記ホルモン組成物。
  45. ＮＥＡＡが、位置１（すなわち、Ｎ−末端に）の前の残基、残基１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１及び１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端に）からなる群から選択される１つ又それ以上の位置において置換されている、請求項４４に記載のホルモン組成物。
  46. ＮＥＡＡが、残基３５、９２、１３１、１３４、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている、請求項４４に記載のホルモン組成物。
  47. ＮＥＡＡが、残基３０、３５、７４、９２、１０３、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている、請求項４４に記載のホルモン組成物。
  48. ＮＥＡＡが、残基３５、９２、１４３及び１４５からなる群から選択される１つ又はそれ以上の位置において置換されている、請求項４４に記載のホルモン組成物。
  49. 位置３５において置換されたＮＥＡＡを含む、請求項４４に記載のホルモン組成物。
  50. ｐ−アセチルフェニルアラニンであるＮＥＡＡを含む、請求項４４、４５、４６、４７、４８又は４９に記載のホルモン組成物。
  51. ＰＥＧが約０．１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項５０に記載のホルモン組成物。
  52. ＰＥＧが約１と約６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項５０に記載のホルモン組成物。
  53. ＰＥＧが約２０と約４０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項５０に記載のホルモン組成物。
  54. 直鎖ＰＥＧが約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項５０に記載のホルモン組成物。
  55. カルボニル基を含むＮＥＡＡを含むＧＨを、ＰＥＧオキシアミンとオキシム結合の形成に適した条件下で接触させることを含む、オキシム結合を介して水溶性ポリマーへ連結されたＧＨを作製する方法。
  56. ＮＥＡＡがケトン基を含有する、請求項５５に記載の方法。
  57. ＮＥＡＡがｐ−アセチルフェニルアラニンである、請求項５６に記載の方法。
  58. ｐ−アセチルフェニルアラニンが、配列番号２の位置３５に対応するＧＨ中の、例えばｈＧＨ中の位置において置換されている、請求項５７に記載の方法。
  59. ＰＥＧオキシアミンがモノメトキシＰＥＧ（ＭＰＥＧ）オキシアミンである、請求項５５に記載の方法。
  60. ＭＥＰＧオキシアミンが直鎖である、請求項５９に記載の方法。
  61. ＰＥＧの分子量が約２０−４０ｋＤａである、請求項６０に記載の方法。
  62. ＰＥＧの分子量が約３０ｋＤａである、請求項６１に記載の方法。
  63. ＭＰＥＧオキシアミンが直鎖３０ｋＤａのモノメトキシＰＥＧ−ＰＥＧ−２−アミノオキシエチルアミンカルバマート塩酸塩である、請求項６２に記載の方法。
  64. （ｉ）ＧＨをコードする核酸（該核酸は、ＮＥＡＡの取り込み用シグナルを与えるように修飾されている。）と、及び
    （ｉｉ）ＮＥＡＡ
    を（ｉ）の核酸のシグナルに応答して、タンパク質中にＮＥＡＡを取り込むことができる生物へ、導入することを含む方法によって、ＮＥＡＡを含むＧＨを作製することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  65. 前記条件が、
    （ｉ）ＭＰＥＧとＧＨを混合して、約５ないし１０のＭＥＰＧ：ＧＨ比率を有するＭＰＥＧ−ＧＨ混合物を生成すること、
    （ｉｉ）約４ないし６のｐＨ；及び
    （ｉｉｉ）室温で、約１０ないし５０時間、ＭＰＥＧ−ＧＨを穏やかに撹拌すること、
    を含む、請求項５５に記載の方法。
  66. ＧＨを精製することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  67. 前記方法によって生成されたＧＨが少なくとも約９９％純粋である、請求項５６に記載の方法。
  68. 少なくとも１つの水溶性ポリマーにオキシム結合である共有結合によって連結された成長ホルモンを含むホルモン組成物と、
    （ｉｉ）医薬として許容される賦形剤と、
    を含む、医薬組成物。
  69. ＧＨがｈＧＨである、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 組成物が、医薬として許容される注射用製剤液体を含む、請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
  71. ＧＨがＮＥＡＡを含む、請求項６９に記載の医薬組成物。
  72. 水溶性ポリマーがＰＥＧを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。
  73. ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項７１に記載の医薬組成物。
  74. ＰＥＧが約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧであり、及びＧＨが、配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置において、ｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されているｈＧＨであり、及びオキシム結合がｐ−アセチルフェニルアラニンとＰＥＧとの間に形成されている、請求項７３に記載の医薬組成物。
  75. 少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量を、治療を必要としている個体に投与することを含み、前記共有結合がオキシム結合である、治療方法。
  76. 前記個体が、小児成長ホルモン欠乏、突発性低身長症、小児期発生の成体成長ホルモン欠乏、成体発生の成体成長ホルモン欠乏及び続発性成長ホルモン欠乏からなる群から選択される症状に罹患している、請求項７５に記載の方法。
  77. 少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合によって連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量を、治療を必要としている個体に投与することを含み、前記水溶性ポリマーが直鎖ポリマーであり、及び前記ホルモン組成物が、週１回以下、２週に１回以下又は１月に１回以下の頻度で与えられる、治療方法。
  78. 哺乳動物の皮下に投与された場合に、ＧＨが少なくとも約１２時間の平均血清半減期を有する、ＧＨを含むホルモン組成物。
  79. 哺乳動物の皮下に投与された場合に、ＧＨが、ＰＥＧを有しないＧＨを含む組成物の少なくとも約７倍の血清半減期の平均血清半減期を有する、オキシム結合を介してＰＥＧに連結されたＧＨを含むホルモン組成物。
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