JPS59166086A - 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 - Google Patents
新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法Info
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- JPS59166086A JPS59166086A JP58038439A JP3843983A JPS59166086A JP S59166086 A JPS59166086 A JP S59166086A JP 58038439 A JP58038439 A JP 58038439A JP 3843983 A JP3843983 A JP 3843983A JP S59166086 A JPS59166086 A JP S59166086A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子工学の分野に関するものであり。
より詳しくは、プロキモシン遺伝子を含有する組換えＤ
ＮＡの調製とそれらを利用して、プロキモシンを大垣に
生産するための微生物を得る方法に関する。
ＮＡの調製とそれらを利用して、プロキモシンを大垣に
生産するための微生物を得る方法に関する。
「遺伝子工学」とは外部遺伝子と適当なベクターを含有
する組換えＤＩ’ＪＡを形成し、希望する遺伝情報に基
づいてＤＮＡを選択し、そして選択されたＤＮＡを適当
な宿主微生物に２４人し、これらの過程によって外部の
遺伝情報が宿主の遺伝部体となる。一連の生体外での・
象作技術を意味する。
する組換えＤＩ’ＪＡを形成し、希望する遺伝情報に基
づいてＤＮＡを選択し、そして選択されたＤＮＡを適当
な宿主微生物に２４人し、これらの過程によって外部の
遺伝情報が宿主の遺伝部体となる。一連の生体外での・
象作技術を意味する。
この技術によって調製され裁伝子操作をほどこされた像
化・′吻は、適当な培養条件のもとで、外部遺伝子をそ
の＋１ｆｆｄ胞中で発現することが可能であシ、該遺伝
子がコードする物質（例えば、酵素、ホルモン、蛋白質
等）を灰化ずることができる。
化・′吻は、適当な培養条件のもとで、外部遺伝子をそ
の＋１ｆｆｄ胞中で発現することが可能であシ、該遺伝
子がコードする物質（例えば、酵素、ホルモン、蛋白質
等）を灰化ずることができる。
不明、１４ｉ１薔甲に記載された酵紫蛋白質キモシンは
またレンニンとして知られている。これは予め反腐する
子牛の胃の甲に見い出される主要方加水分解性蛋白であ
り、牛乳を凝固する。そのだめキモシンは長い間、チー
ズ製造業に於いて、ミルクカゼインを凝固させるのに使
用されてきた。キモシンは分子量３５．６５２で３２３
個のアミノ酸からなる。プロキモシン（別名プロレンニ
ン）はキモシン分子のアミン末端に４２個の付加アミン
酸を■するキモシンの前、枢体であり、敵性条件下、そ
の付加アミノ酸を失うことによりキモシンそのものに変
候される。プロキモシンは分子量４０，７７７で３６５
個のアミノ酸からなる。プロキモシンの完全なアミカ唆
西己夕：Ｊ’ｎＢ、 Ｆ’ｏｌｔｑｎｔｘｎｎ ら
、 Ｐｒｏｑ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
またレンニンとして知られている。これは予め反腐する
子牛の胃の甲に見い出される主要方加水分解性蛋白であ
り、牛乳を凝固する。そのだめキモシンは長い間、チー
ズ製造業に於いて、ミルクカゼインを凝固させるのに使
用されてきた。キモシンは分子量３５．６５２で３２３
個のアミノ酸からなる。プロキモシン（別名プロレンニ
ン）はキモシン分子のアミン末端に４２個の付加アミン
酸を■するキモシンの前、枢体であり、敵性条件下、そ
の付加アミノ酸を失うことによりキモシンそのものに変
候される。プロキモシンは分子量４０，７７７で３６５
個のアミノ酸からなる。プロキモシンの完全なアミカ唆
西己夕：Ｊ’ｎＢ、 Ｆ’ｏｌｔｑｎｔｘｎｎ ら
、 Ｐｒｏｑ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７４，２３２１（１９７７）に記
載さ？１でいるが、仮にアミノ鋤ン位置数ケ所に誤まシ
が蛇見されたので、正しいアミノ酸配列とプロキモシン
の完１ｊｌ ｆｔ Ｄ Ｎ Ａ配列を肌１図に示す。
載さ？１でいるが、仮にアミノ鋤ン位置数ケ所に誤まシ
が蛇見されたので、正しいアミノ酸配列とプロキモシン
の完１ｊｌ ｆｔ Ｄ Ｎ Ａ配列を肌１図に示す。
キモシンは、生後間もない仔牛の第４冑の粘膜から分泌
されるため、闇粟生産では仔牛の胃から侍られでさた。
されるため、闇粟生産では仔牛の胃から侍られでさた。
ところが、仔牛からキモシンを得るには数々の問題があ
る。この方法は非電に複雑ないくつもの工程を心安とし
、大量のキモシンを１％−昧するにはし対ＡＨがありす
きる。ｊに、方法自体。
る。この方法は非電に複雑ないくつもの工程を心安とし
、大量のキモシンを１％−昧するにはし対ＡＨがありす
きる。ｊに、方法自体。
、１狂済的でなく、近年、商業需要に追いつかない状態
でめる。このようなノ里由〃・ら、チーズ製造業では幾
つかの代替：吻が欧州を認められている。これら代替物
の主−女なものは微生物起源のレンネットでありムコー
ル・プシラス（Ｍｑｂｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｏｕｓ）−
ムｆｆｌ −ル・ミーハイ（Ｍｕｃｏｒ ｔｒｔ、ｉｇ
ｈｅｉ）、 ｘンドシアｔｉｅラシチカ（Ｅｎｄ、ｏｔ
ｈｉａ ｐｃｔｒａｓｉｔｉｃａ）がある。
でめる。このようなノ里由〃・ら、チーズ製造業では幾
つかの代替：吻が欧州を認められている。これら代替物
の主−女なものは微生物起源のレンネットでありムコー
ル・プシラス（Ｍｑｂｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｏｕｓ）−
ムｆｆｌ −ル・ミーハイ（Ｍｕｃｏｒ ｔｒｔ、ｉｇ
ｈｅｉ）、 ｘンドシアｔｉｅラシチカ（Ｅｎｄ、ｏｔ
ｈｉａ ｐｃｔｒａｓｉｔｉｃａ）がある。
しかしながら、微生物レンネットはかなシ強い蛋白質分
解１生を持っており、チーズ熟成には、基・質特異性が
尚く蛋白質分解１生が弱いキモシン程適合してはいない
。従って、大量のキモシンを提供することは商業ｌ：ｉ
９に重要な２（ｓ；−・気がある。
解１生を持っており、チーズ熟成には、基・質特異性が
尚く蛋白質分解１生が弱いキモシン程適合してはいない
。従って、大量のキモシンを提供することは商業ｌ：ｉ
９に重要な２（ｓ；−・気がある。
本イ５明の工、１呈は新規の発現プラスミドを利用する
ものであり、それらは以前に調製された公矢口の、ｆ、
ｌｉ換え）０ラスミドからプロキモシンをコードする遺
伝子を有するＤ Ｎ’ Ａを単）配し１．）頼当なベク
ター［押入することにより調製さね、る、、発現プラス
ミドは形質転換がＴ５Ｊ能な条件で感受性ある敵生物を
力釘は転換するのに用いられる。：叔生′勿は、粗挨え
発現シラスミドを含有する形ＪＡ！１頭侠、床を収碩で
きる条件で、培会さ７１．る。一旦宿主′淑生吻が形質
転４奥されると、微生′、吻の、ＩＸ１旧旭ば、１改生
（吻をう箇当な一１１成培地で培養することにより、・
・２・１り返し、繁り直されキモシンをコードする遺伝
子が微生物の細胞内に発現される。こうして微生劾のｑ
酵によるプロキモシンの犬幇生並が笑槻町罷になり、プ
ロキモシンをコ腫正な１面格で提供できるようになるだ
ろう。
ものであり、それらは以前に調製された公矢口の、ｆ、
ｌｉ換え）０ラスミドからプロキモシンをコードする遺
伝子を有するＤ Ｎ’ Ａを単）配し１．）頼当なベク
ター［押入することにより調製さね、る、、発現プラス
ミドは形質転換がＴ５Ｊ能な条件で感受性ある敵生物を
力釘は転換するのに用いられる。：叔生′勿は、粗挨え
発現シラスミドを含有する形ＪＡ！１頭侠、床を収碩で
きる条件で、培会さ７１．る。一旦宿主′淑生吻が形質
転４奥されると、微生′、吻の、ＩＸ１旧旭ば、１改生
（吻をう箇当な一１１成培地で培養することにより、・
・２・１り返し、繁り直されキモシンをコードする遺伝
子が微生物の細胞内に発現される。こうして微生劾のｑ
酵によるプロキモシンの犬幇生並が笑槻町罷になり、プ
ロキモシンをコ腫正な１面格で提供できるようになるだ
ろう。
本う６明に関連ある公昶文献は、米国特許４．２３７゜
２２４号（コーヘン・ボイヤー）、特願昭５６−１３１
、６３１号（別府輝度）、西森ら、Ｇｅｎｅ 。
２２４号（コーヘン・ボイヤー）、特願昭５６−１３１
、６３１号（別府輝度）、西森ら、Ｇｅｎｅ 。
±９．３３７（ｉ９８２）、＋ｆ開昭５７−１４１゜２
８７号（コラボラティグ・リサーチ）、符開昭５８−９
．６８７号（セルチック・リミテッド）である。特に、
本出原、旧人に」二る特ｔ８ｇ１昭５６−１３１゜６３
１−号（１旧オζロ５６年８月２４日出ムｉ−）には。
８７号（コラボラティグ・リサーチ）、符開昭５８−９
．６８７号（セルチック・リミテッド）である。特に、
本出原、旧人に」二る特ｔ８ｇ１昭５６−１３１゜６３
１−号（１旧オζロ５６年８月２４日出ムｉ−）には。
ｌａｃ Ｕ Ｖ フｏ モー タト大ｙＡ田ペーターガ
ラスクトシダーゼのＮ−末端アミノ１１に一１ｄ台さノ
１．ブヒプロキモシンｃｌ）ｉＶ’Ａのほとんど全配列
を含有する発現プラスミドが開示されている。
ラスクトシダーゼのＮ−末端アミノ１１に一１ｄ台さノ
１．ブヒプロキモシンｃｌ）ｉＶ’Ａのほとんど全配列
を含有する発現プラスミドが開示されている。
不完・男の一つの目Ｈ′９（は新規な発現プラスミドを
調製するのに用いる特定のプロキモシン遺伝子を提供す
ることにある。
調製するのに用いる特定のプロキモシン遺伝子を提供す
ることにある。
本発明の別の目的は新規な発現プラスミドを提供し、更
に１．ｌｉ！ｆ主微生物細１ｊ己内にプロキモシンの商
い発現を得る為に該プラスミドを利用することにある。
に１．ｌｉ！ｆ主微生物細１ｊ己内にプロキモシンの商
い発現を得る為に該プラスミドを利用することにある。
本発明の他の目的は該プラスミドをＨＩＩ（Ｊ１５！す
る方法ケ提供することにある。
る方法ケ提供することにある。
本発明のさらに別の目的は大腸１ｇ１ａｃ・オペロン・
７’ Ｏモーターの代りに大暢關トリプトファン・オペ
ロン・プロモーター’ｉ ）ｉＪいることにある。
７’ Ｏモーターの代りに大暢關トリプトファン・オペ
ロン・プロモーター’ｉ ）ｉＪいることにある。
本発明のさらに別の目げ９ｖ、よ今まで知られている頷
生物よりも“、−４貫的により多はのプロキモシンを産
生８Ｊ能な遺伝子操作されたｆＩ反生・勿會侍ることに
ある。
生物よりも“、−４貫的により多はのプロキモシンを産
生８Ｊ能な遺伝子操作されたｆＩ反生・勿會侍ることに
ある。
本ヲら明のさらに別の目的は７、ん伝子：ｊ作さルた微
生物を用いてプロキモシンを生産する方法を提供本発明
のさらに他の目的は前記目的に一致する方法によって生
埋されたプロキモシンを提供することにある。
生物を用いてプロキモシンを生産する方法を提供本発明
のさらに他の目的は前記目的に一致する方法によって生
埋されたプロキモシンを提供することにある。
不明細訃中で用いられるプロキモシン遺伝子とはプロキ
モシンをコードするすべてのヌクレオチド配列として定
義され、第１図に示されるヌクレオチド配列中のいかな
る部分でもが貰わない。
モシンをコードするすべてのヌクレオチド配列として定
義され、第１図に示されるヌクレオチド配列中のいかな
る部分でもが貰わない。
本発明の方法によれば、宿主細胞中のプロキモシンの発
現及び生産は下記の各工程からなっている。
現及び生産は下記の各工程からなっている。
１、’：、、Ｆ定のプロキモシン遺伝子を公知の組換え
グラスミドから制限酵素切断により単離する。
グラスミドから制限酵素切断により単離する。
２、 プロキモシン遺伝子はベクターとともに結合され
発現プラスミドを形成する。もし結合され＊７”＊％／
ン辺ｋ 子がプロキモシン全コーティング配列に対応
しない場合には、欠落しているヌクレオチド配列部分を
含む付加的な合成オリゴヌクレオチドを単離した遺伝子
にくつつけることができる。会成りＮＡ片は好適にはプ
ロキモシン遺伝子部分の先端に軸合された翻訳開始コド
ンを含有していてもよい。
発現プラスミドを形成する。もし結合され＊７”＊％／
ン辺ｋ 子がプロキモシン全コーティング配列に対応
しない場合には、欠落しているヌクレオチド配列部分を
含む付加的な合成オリゴヌクレオチドを単離した遺伝子
にくつつけることができる。会成りＮＡ片は好適にはプ
ロキモシン遺伝子部分の先端に軸合された翻訳開始コド
ンを含有していてもよい。
３、適当な宿主細ｊ＠は発現プラスミドと塩化カルシウ
ム処−タ２里により形質転換される。
ム処−タ２里により形質転換される。
４、アンぎシリン耐性形質転換株を選択する。
５、形質転換細胞を標準の功３″、ミ方法により培養す
る。
る。
６、 １７（（１，ｉＪ包の粗抽出物は、ラジオイムノ
アッセイ法によりプロキそシンのン１τ無が１矢定さ〕
１．る。
アッセイ法によりプロキそシンのン１τ無が１矢定さ〕
１．る。
前記の公知の組庚えプラスミドの中でもつとも興味のあ
るプラスミドはρＣＲ３０１と呼ばれており、西脈ら、
Ｇｇｎｇ、１９，３３７（１９８２）に詳しく艶鍼キれ
ている。プロキモシンｃ Ｄ ＮＡを含有する他のプラ
スミドの調製方法は、西森ら。
るプラスミドはρＣＲ３０１と呼ばれており、西脈ら、
Ｇｇｎｇ、１９，３３７（１９８２）に詳しく艶鍼キれ
ている。プロキモシンｃ Ｄ ＮＡを含有する他のプラ
スミドの調製方法は、西森ら。
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、 、 ９０ 、９０ ｔ （１
９ｓ ｔ ）そして前記に引用された他の文献中（ｆこ
見い出される。
９ｓ ｔ ）そして前記に引用された他の文献中（ｆこ
見い出される。
これらのプラスミドはプロキモシン遺伝子の入手源とし
て有用であシ１通常、下記の方法によって調製される。
て有用であシ１通常、下記の方法によって調製される。
１、 プロキモシン遺伝子の伝令１１ Ｎ Ａ （’
ｍ ＲＮ Ａ ）を修生の第４胃から単離する。
ｍ ＲＮ Ａ ）を修生の第４胃から単離する。
２、 ｍ ＲＮＡを常法により二本鎖ＤＮＡに変換す
る。
る。
３ 付嘱リンカ−を二本鎖Ｄ Ｎ’ Ａの両端に結合す
る。
る。
４、 ｃ ｊ） Ｎ Ａ分子を適凸なベクター・プラ
スミド（例えば、ｐＢ８３２２）に尋人する。
スミド（例えば、ｐＢ８３２２）に尋人する。
５、組換えシラスミドを次に形質転換により宿主ア１Ｘ
ｉｌＪ月包に入れる。
ｉｌＪ月包に入れる。
６、 正しいクローンをコロニーハイブリダイゼーショ
ン法とハイブリッドアレステツドトランスレーション法
によシ選択し、プロキモシン遺伝子の存仔を確認する。
ン法とハイブリッドアレステツドトランスレーション法
によシ選択し、プロキモシン遺伝子の存仔を確認する。
７、 クローン中のＤＮＡ挿入体はｈｆａｘａｍ−Ｇｉ
ｌ ｂ ｅ ｒ を法によシ、塩基配列を決定する。
ｌ ｂ ｅ ｒ を法によシ、塩基配列を決定する。
後に、好ましい笑施態様を参照することによシ、詳しく
説明するように、本発明は次の方法を提供することを理
解するべきである。なお、プロキモシンコーデング配列
の先端部分が欠如しているプロキモシン遺伝子から生産
される蛋白質をプロキモシンｒｌ 低蛋白質と称し、又
、プロキモシンのＮ末端にメチオニンが付層しているプ
ロキモシンをＮ末端メチオニルプロキモシンと称し、本
４ｈ明においてプロキモシンと呼ぶことがある。
説明するように、本発明は次の方法を提供することを理
解するべきである。なお、プロキモシンコーデング配列
の先端部分が欠如しているプロキモシン遺伝子から生産
される蛋白質をプロキモシンｒｌ 低蛋白質と称し、又
、プロキモシンのＮ末端にメチオニンが付層しているプ
ロキモシンをＮ末端メチオニルプロキモシンと称し、本
４ｈ明においてプロキモシンと呼ぶことがある。
プロキモシン遺伝子を単離すること、転写プロモーター
および翻訳開始コドンを遺伝子に結合し発現プラスミド
を形成させること、発現プラスミドを形質転換とによシ
宿主細胞に導入すること、そしてプロキモシン、Ｎ末端
メチオニルプロキモシンもしくはプロキモシン類似−蛋
白質の高レベルの発現を有する形質転換された細胞を選
択することから成シ、該プロキモシン遺伝子はクローン
化されたプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａを含有する組換え
プラスミドに由来し、且つプロキモシンのコード配列中
少なくとも第５番目の翻訳コドンから配列の末端までを
有する、この配列はｔ ｒ ｐ ′Ｌ又はｔｒｐＥ遺伝
子のＮ末端に結合している、大腸菌宿主細胞中でプロキ
モシンコード遺伝子を発現させる方法。
および翻訳開始コドンを遺伝子に結合し発現プラスミド
を形成させること、発現プラスミドを形質転換とによシ
宿主細胞に導入すること、そしてプロキモシン、Ｎ末端
メチオニルプロキモシンもしくはプロキモシン類似−蛋
白質の高レベルの発現を有する形質転換された細胞を選
択することから成シ、該プロキモシン遺伝子はクローン
化されたプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａを含有する組換え
プラスミドに由来し、且つプロキモシンのコード配列中
少なくとも第５番目の翻訳コドンから配列の末端までを
有する、この配列はｔ ｒ ｐ ′Ｌ又はｔｒｐＥ遺伝
子のＮ末端に結合している、大腸菌宿主細胞中でプロキ
モシンコード遺伝子を発現させる方法。
プロキモシン遺伝子を単離すること、該週７伝子から欠
落しているプロキモシンのコーディング配列部分を有す
る合成ヌクレオチドを遺伝子に結合すること、転写プロ
モーターおよび仙訳％始コドン（該合成ヌクレオチドに
存在しない時）を汎伝子に条ぢ合し発現プラスミドを形
成させること、宿主細胞を発現プラスミドで形質転換す
ること、そしてプロキモシンの高レベルの発現を有する
形質転換されたｉ牙１胞を７か択することから成り、該
プロキモシン遺伝子はクローン、化されたプロキモシン
ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドに由来し、該合成
ヌクレオチドは邦訳開始コドンを有していてもよい、太
曝菌宿主細胞、中でプロキモシンコード遺伝子をララ現
させる方法。
落しているプロキモシンのコーディング配列部分を有す
る合成ヌクレオチドを遺伝子に結合すること、転写プロ
モーターおよび仙訳％始コドン（該合成ヌクレオチドに
存在しない時）を汎伝子に条ぢ合し発現プラスミドを形
成させること、宿主細胞を発現プラスミドで形質転換す
ること、そしてプロキモシンの高レベルの発現を有する
形質転換されたｉ牙１胞を７か択することから成り、該
プロキモシン遺伝子はクローン、化されたプロキモシン
ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドに由来し、該合成
ヌクレオチドは邦訳開始コドンを有していてもよい、太
曝菌宿主細胞、中でプロキモシンコード遺伝子をララ現
させる方法。
プロキモシン遺伝子を単晶すること、転写プロモーター
および翻訳開始コドンを遺伝子に結合し発現プラスミド
を形成させること１発現シラスミド金形質伝換により゛
１ｄ主細）賊に導入すること、プロキモシンの高レベル
の発現を肩する移置４バ換されたｒｉ＋ｌＩＩ施を選択
すること、ヤして細Ｈｉ！、を栄養培地で〜４支するこ
とから成り、該プロキモシン遺伝子はクローン化された
プロキモシンｃｌ）ｉＶＡを官有する。゛１且遺えプラ
スミドに由来する。犬、に’ｉ ’ｌＪ’ｌ １″ｄ王
ｒｈｌ１１ 歳中でプロキモシンコード遺伝子を発現さ
せろ手法によりプロキモシンを生産する方法。
および翻訳開始コドンを遺伝子に結合し発現プラスミド
を形成させること１発現シラスミド金形質伝換により゛
１ｄ主細）賊に導入すること、プロキモシンの高レベル
の発現を肩する移置４バ換されたｒｉ＋ｌＩＩ施を選択
すること、ヤして細Ｈｉ！、を栄養培地で〜４支するこ
とから成り、該プロキモシン遺伝子はクローン化された
プロキモシンｃｌ）ｉＶＡを官有する。゛１且遺えプラ
スミドに由来する。犬、に’ｉ ’ｌＪ’ｌ １″ｄ王
ｒｈｌ１１ 歳中でプロキモシンコード遺伝子を発現さ
せろ手法によりプロキモシンを生産する方法。
プロキモシン遺伝子とそれに１′「用命に結合したベク
ターから成り、該ベクターにｐＢＲ３２２に出来しぞし
て転写プロモータと、瀾訳１剤始コドンを言Ｍする梶現
シラスミド。
ターから成り、該ベクターにｐＢＲ３２２に出来しぞし
て転写プロモータと、瀾訳１剤始コドンを言Ｍする梶現
シラスミド。
不発明はさらに、時短のプロキモシン遺伝子、葭逍：伝
子を含むコーディング配列、新規な発現プラスミドのε
Ｊ、・」整方法、形ｖ丁伝俟された微生物、そして七え
Ｌから産生されたプロキモシンをも包含することを到１
角イすべきである。
子を含むコーディング配列、新規な発現プラスミドのε
Ｊ、・」整方法、形ｖ丁伝俟された微生物、そして七え
Ｌから産生されたプロキモシンをも包含することを到１
角イすべきである。
好ｊＥ：↓な実施！甜様
宿主１、教生物
いかなる微生物でも、望みのベクター・プラスミドを受
容し、複製できるならば、・１史用できる。
容し、複製できるならば、・１史用できる。
しかし、本発明では天川的７Ｉメ；↓山がら犬ｉｆ４
ｆｎ Ｃ６００由来、７未が用いられる。特に・“仔子
４には、犬）烏田布、皿Ｃ６００ｒｋ−ｔｎｋ−株が月
１いられる。
ｆｎ Ｃ６００由来、７未が用いられる。特に・“仔子
４には、犬）烏田布、皿Ｃ６００ｒｋ−ｔｎｋ−株が月
１いられる。
細胞に通常知られた培養糸作で育成される。例えば、大
腸菌のための培地は次のとおりである。
腸菌のための培地は次のとおりである。
Ｌ 栄養培地（Ｌ ｂｒｏｔｈ）
ｌ当り
テトロイト）
パクト酵母抽出物 ５ｇデトロイト）
ノＶαｃｔ
ｉｏ ｇグルコース
２ｇＭ ９ ’−４’Ｌ養培地（Ｍ ９ ｂｒｏｔｈ
） ｌ肖りＮａ’＞ｌ１ＰＯ，６ｇ ＫＨ２Ｐ０． ３．ｌ
ｉ’ＮａＣ１５，９’ Ｎ１−１．Ｃ１１ｇ ＣαＣ１２１５７％’ Ａ４ｇＳＯ，・７１１□ＯＯ，１ｊ９ Ｂｌ（チアミンＨＣｌ”） 必委ならば５〜ｃａ
ｓａｍｉｎ、ｏ ａ、ｃｉｄ ２．
５ ｊ！ａｃｉｄ） 標準的な技術に於いて、大腸菌は３０℃ないし４０℃の
温度で、ＩＡ’当り１０〜３０Ｘ１０”イ向ｉ圃服の密
度まで生育される。
ｉｏ ｇグルコース
２ｇＭ ９ ’−４’Ｌ養培地（Ｍ ９ ｂｒｏｔｈ
） ｌ肖りＮａ’＞ｌ１ＰＯ，６ｇ ＫＨ２Ｐ０． ３．ｌ
ｉ’ＮａＣ１５，９’ Ｎ１−１．Ｃ１１ｇ ＣαＣ１２１５７％’ Ａ４ｇＳＯ，・７１１□ＯＯ，１ｊ９ Ｂｌ（チアミンＨＣｌ”） 必委ならば５〜ｃａ
ｓａｍｉｎ、ｏ ａ、ｃｉｄ ２．
５ ｊ！ａｃｉｄ） 標準的な技術に於いて、大腸菌は３０℃ないし４０℃の
温度で、ＩＡ’当り１０〜３０Ｘ１０”イ向ｉ圃服の密
度まで生育される。
プロモーター
クローン化された遺伝子を信主皿１力己中に発現させる
には、培１当なプロモーターを・１胎えたベクター・プ
ラスミドｋ・Ｗ用することが必恢でめる。１ツＴＷの１
可主ハ・ｉ＋］升包甲でン占１生である１奴り、叙４−
ｕ≠白のプロモーターを便用することができる。望１し
くに、本発明に於いて、大腸ロトリプトファンオペロン
・プロモーターが・閲１ｉｉされる。
には、培１当なプロモーターを・１胎えたベクター・プ
ラスミドｋ・Ｗ用することが必恢でめる。１ツＴＷの１
可主ハ・ｉ＋］升包甲でン占１生である１奴り、叙４−
ｕ≠白のプロモーターを便用することができる。望１し
くに、本発明に於いて、大腸ロトリプトファンオペロン
・プロモーターが・閲１ｉｉされる。
組」災、えプラスミド
ｐｃｉ？、３０１
本発明によノ１．は、遺伝子は便■上１えに公却文献に
ｂ１小“４さハ５ている５３１次のＡ且１模えフ０ラス
ミドから侍ることかでさる。こｆＬらのプラスミドは昧
々な買さを有するプロキモシン這云子を含有している。
ｂ１小“４さハ５ている５３１次のＡ且１模えフ０ラス
ミドから侍ることかでさる。こｆＬらのプラスミドは昧
々な買さを有するプロキモシン這云子を含有している。
その中筬つ刀・のプラスミドば１１．す限酵撚切断によ
り正確な遺伝」６図がわかっている。それ故、増当な制
限Ｕ素により切断することにより−プロキモシン遺伝子
のイイ用な部分を分ｍ１ｉＬ、ベクター・プラスミドへ
第２のクローン化するためのＤ Ｎ’ Ａの材料として
用いることができる。このようなプラスミドの代ネぐ的
なものはｐｃＲ３（ＪＬである。プラスミドｐｃＩ１３
０１１ｔ’ｉラクトースオペロン・プロモータ−ドア”
Ｏキモシン遺伝子の全長のｐＨ１ｉ初の４つのコドンの
みが欠けたヌクレオチド１３査（編５コドン）から末端
の１０９５食（第３６５コドン）丑でのＤＮＡ配列を含
有する。このプラスミドはｐ Ｂ Ｒ３２２プラスミド
（１’、 ＢｏｌｖａｒらＧｅｎｅ、 ２ 、９５（
１’９７７ ） ）に由来する。プラスミド中の翻訳開
始コドンとクローン化されたプロキモシン遺伝子との間
のヌクレオチド配列（これはベーターガラクトシダーゼ
のＮ末端アミノ醒をコードするヌクレオチドに対応する
）を次に示す。
り正確な遺伝」６図がわかっている。それ故、増当な制
限Ｕ素により切断することにより−プロキモシン遺伝子
のイイ用な部分を分ｍ１ｉＬ、ベクター・プラスミドへ
第２のクローン化するためのＤ Ｎ’ Ａの材料として
用いることができる。このようなプラスミドの代ネぐ的
なものはｐｃＲ３（ＪＬである。プラスミドｐｃＩ１３
０１１ｔ’ｉラクトースオペロン・プロモータ−ドア”
Ｏキモシン遺伝子の全長のｐＨ１ｉ初の４つのコドンの
みが欠けたヌクレオチド１３査（編５コドン）から末端
の１０９５食（第３６５コドン）丑でのＤＮＡ配列を含
有する。このプラスミドはｐ Ｂ Ｒ３２２プラスミド
（１’、 ＢｏｌｖａｒらＧｅｎｅ、 ２ 、９５（
１’９７７ ） ）に由来する。プラスミド中の翻訳開
始コドンとクローン化されたプロキモシン遺伝子との間
のヌクレオチド配列（これはベーターガラクトシダーゼ
のＮ末端アミノ醒をコードするヌクレオチドに対応する
）を次に示す。
−ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣ’ｌ
’ＧＭ’ｅｔ ベーターガラクトシダーゼ開始
コドン ＧＡＡＴＴＣＣＧＧ−３’ ｒｇ プロキモシン遺伝子 ｐｃＲ３０１の制限酵素地図は距３１シ］に示す。
’ＧＭ’ｅｔ ベーターガラクトシダーゼ開始
コドン ＧＡＡＴＴＣＣＧＧ−３’ ｒｇ プロキモシン遺伝子 ｐｃＲ３０１の制限酵素地図は距３１シ］に示す。
ヱ旦至Ｉヱ
プラスミドｐＯｃＴ２はｐ Ｂ Ｒ３２２のｇｃｏＲ１
部位に、咀み込まれた約５００ Ｊ：Ｍｖａ）対からな
る大腸菌トリプトファンオペロンＣＢ、 ｃｏｌｉ
ｔｒｐｏｐａｒｏｎ’）のＥ ｃ ｏ ＲＩ １９’（
片を含有する。Ｅ ｃ ｏｌｌＩｌｌ上テロモーター、
オペレーターセしてｔｒｐＬ′領域内にあるＡ、 Ｔ
Ｇコドンの仮初の塩基（Ａ）から敬えて２３個の塩基を
持っている。第４図にはｐＯｃｉ”２（Ｄｔｒ７）プｅ
ｌ−ｅ−ター近辺の約３００＞＝ｉ対からなるヌクレチ
ド配列が示されている。
部位に、咀み込まれた約５００ Ｊ：Ｍｖａ）対からな
る大腸菌トリプトファンオペロンＣＢ、 ｃｏｌｉ
ｔｒｐｏｐａｒｏｎ’）のＥ ｃ ｏ ＲＩ １９’（
片を含有する。Ｅ ｃ ｏｌｌＩｌｌ上テロモーター、
オペレーターセしてｔｒｐＬ′領域内にあるＡ、 Ｔ
Ｇコドンの仮初の塩基（Ａ）から敬えて２３個の塩基を
持っている。第４図にはｐＯｃｉ”２（Ｄｔｒ７）プｅ
ｌ−ｅ−ター近辺の約３００＞＝ｉ対からなるヌクレチ
ド配列が示されている。
プラスミド中のＪ専ノにの配列方向ｔｄ−ｔｒｐプロモ
ーターのｔｏ：制御下による転写方向が時計捷わりにな
るように構成されている。
ーターのｔｏ：制御下による転写方向が時計捷わりにな
るように構成されている。
ｐ ７’ ＲＥ １
プラスミドｐｉ’ＲＥ１はｐＯｃＴ２に由来し、アンぎ
シリン耐・住・唄域近くの一つのＥ ｃ ｏ １１１部
位がｐＯｃＴ２から除かれたために単一のＥｃ６Ｒ７部
位を有する。このプラスミドは第２図に示すように手つ
かずのｐＯｃＴのｔｒｐオペロン部分を含む。ｐ Ｔ
ＩＪｔ Ｅ ｌの調製は次のように行われる。
シリン耐・住・唄域近くの一つのＥ ｃ ｏ １１１部
位がｐＯｃＴ２から除かれたために単一のＥｃ６Ｒ７部
位を有する。このプラスミドは第２図に示すように手つ
かずのｐＯｃＴのｔｒｐオペロン部分を含む。ｐ Ｔ
ＩＪｔ Ｅ ｌの調製は次のように行われる。
プラスミドｐＯｃＴ２ｆ、ＨＥｃ ｏｆｌｌで部分分解
すると、アンピシリン耐性鎖酸に近いＥ ｃ ｏ Ｒ１
部位のみが１病裂される。一本鎖部分のＤＮＡはＤＮＡ
ポリメラーゼにより修復され、修復された末端どおしＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合され、ｐ ｉ” ＲＥ
１ができあがる。ｐｌ’ＲＥｘの制限ｌ、＃紫地図は駆
２図に示される。
すると、アンピシリン耐性鎖酸に近いＥ ｃ ｏ Ｒ１
部位のみが１病裂される。一本鎖部分のＤＮＡはＤＮＡ
ポリメラーゼにより修復され、修復された末端どおしＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合され、ｐ ｉ” ＲＥ
１ができあがる。ｐｌ’ＲＥｘの制限ｌ、＃紫地図は駆
２図に示される。
ｐｉ”ＲＬｌ
プラスミドｐ Ｉ’ ＲＬ １１１ Ｅ ｃ ｏ ＲＩ
とＲｓ ａ １部位にはさま、１１．たｐＯｃＴ２から
の部分勿々する。
とＲｓ ａ １部位にはさま、１１．たｐＯｃＴ２から
の部分勿々する。
この部分はｐＯｃＴ２上のｔ ｒ ｐ Ｚ、 領：！、
１４中未知のＥ ｃ ｏ ）ゼＩ部位から１ＲｓａＩ昔
ｊ＜ 泣−にでの３６ｏｉＢ不対からＴｉ’Ｉｌ、る。
１４中未知のＥ ｃ ｏ ）ゼＩ部位から１ＲｓａＩ昔
ｊ＜ 泣−にでの３６ｏｉＢ不対からＴｉ’Ｉｌ、る。
その中のある部分に・・４４図に示されている。ｐＴＲ
Ｌｌの１ｊｌｊｄ製は次のように行われる。
Ｌｌの１ｊｌｊｄ製は次のように行われる。
プラスミドｐ ＯＣＴ ２をＥ ｃ ｏ ＲＩで分屏後
、１１ ｓ ａ Ｉで部分分解するとｔｑ“ｐプロモー
ター領域を含む３６０塩蝙対のＪ） Ｎ’ Ａ ｌ”、
、１１片〃１侍られる。
、１１ ｓ ａ Ｉで部分分解するとｔｑ“ｐプロモー
ター領域を含む３６０塩蝙対のＪ） Ｎ’ Ａ ｌ”、
、１１片〃１侍られる。
この断片の切断されたＲ ｓ ａ Ｉ ｉ！ｊｊｓｉに
Ｅ ｃ ｏ Ｉｔ Ｉリンカ−を連結し次いでＥ ｃ
ｏ Ｉｆ Ｉで・ｊｊ・理すると付右瑞をイ１する断片
ができあがる。これを７．Ｉ Ｂ Ｒ３２２のＭ ｃ
ｏ Ｒ１部位に押入すると二鎖う追の組与嵐えプラスミ
ドがイイられるが、ｐｌ’１ｌＬ１はｔｒｐプロモータ
ーからの転写方向が時計回りであるものである。
Ｅ ｃ ｏ Ｉｔ Ｉリンカ−を連結し次いでＥ ｃ
ｏ Ｉｆ Ｉで・ｊｊ・理すると付右瑞をイ１する断片
ができあがる。これを７．Ｉ Ｂ Ｒ３２２のＭ ｃ
ｏ Ｒ１部位に押入すると二鎖う追の組与嵐えプラスミ
ドがイイられるが、ｐｌ’１ｌＬ１はｔｒｐプロモータ
ーからの転写方向が時計回りであるものである。
ｐＴＪＲＬｌの制限酵素地図を紀２図に示す。
Ｔｌ１Ｐ１
シラスミドｐ１’ＲＰ１はｉｉ ｐ ａ ＩとＣｌａｌ
部位にはさまれ′Ｉｃｐ ｉ’ ｋ Ｅｌからのｆ’ｌ
ｌｓ分を有する。
部位にはさまれ′Ｉｃｐ ｉ’ ｋ Ｅｌからのｆ’ｌ
ｌｓ分を有する。
この部分は元来ｐＢ１１３２２に由来する約４６４０’
；（Ａ 基対）ＨＡ状ＤＮＡから成る。ｐＴｌｌＰｌは
１ｉＰａＩとＴａｑ１部位にはさ壕れ７？Ｃｐｉ’ノｆ
、 Ａ’ １７）・らの別の部分をもンｆ４する。この
部分はｔ ｒｐ Ｌプロモーターに対応する３２塩基対
からなる。ｐ Ｔ ＲＰ １０ル、β肘目次のように１
丁なう。
；（Ａ 基対）ＨＡ状ＤＮＡから成る。ｐＴｌｌＰｌは
１ｉＰａＩとＴａｑ１部位にはさ壕れ７？Ｃｐｉ’ノｆ
、 Ａ’ １７）・らの別の部分をもンｆ４する。この
部分はｔ ｒｐ Ｌプロモーターに対応する３２塩基対
からなる。ｐ Ｔ ＲＰ １０ル、β肘目次のように１
丁なう。
プラスミドｐＴノビ＆１をＨｐ ａ ＩおよびｃｌαＩ
で重視分解することにより約４６４０塩基対から成る線
状のＤ Ａ” Ａ ＩＫ＞’ｉ片をイｉイる。同むくに
、ｌ−１ｐ ａ １部位からＴａｑ部位までの３２塩基
対の１） Ｎ ＡｙＢ、片がｐＴＩｉＥｌから切り出さ
れる。ｊ６Ｊ方のＤ Ｎ Ａ断片がりガーゼによ、！１
７重合金れｐＴＲＰｌができあがる。
で重視分解することにより約４６４０塩基対から成る線
状のＤ Ａ” Ａ ＩＫ＞’ｉ片をイｉイる。同むくに
、ｌ−１ｐ ａ １部位からＴａｑ部位までの３２塩基
対の１） Ｎ ＡｙＢ、片がｐＴＩｉＥｌから切り出さ
れる。ｊ６Ｊ方のＤ Ｎ Ａ断片がりガーゼによ、！１
７重合金れｐＴＲＰｌができあがる。
ｐ、ＴＩ（Ｐｌの制限地図を編２図に示す。
発」２Ｑ２シラスミド
前述したと同じく当果者に知られた腺準的手法を用いて
、クローン化てれたプロキモシン遺伝子を含む形′Ｍ転
換体中のＤＮＡを抽出して、ｌｔｉ！Ｉｔ収醇系で切Ｍ
ｔする。ベクタープラスミドを同、像に切断し、荀らオ
Ｌ ｆｃ ｌ折片を混合してリガーゼを用いて結付する
。刃・くして犬）勃丙中で７０ロキモシンの発現を可［
イににするように組み立てらり、乏発現プラスミＦ、ｐ
Ｃ１ｉ５０１ ＋ ｐｃ’１１６０１２Ｌびｐ Ｃｌｌ
７０１が造成された。
、クローン化てれたプロキモシン遺伝子を含む形′Ｍ転
換体中のＤＮＡを抽出して、ｌｔｉ！Ｉｔ収醇系で切Ｍ
ｔする。ベクタープラスミドを同、像に切断し、荀らオ
Ｌ ｆｃ ｌ折片を混合してリガーゼを用いて結付する
。刃・くして犬）勃丙中で７０ロキモシンの発現を可［
イににするように組み立てらり、乏発現プラスミＦ、ｐ
Ｃ１ｉ５０１ ＋ ｐｃ’１１６０１２Ｌびｐ Ｃｌｌ
７０１が造成された。
ｐｃ１ン５０１
プラスミド７ＪＣＲ５０１１ｒｒ ｐ ＴＲＡ’ １
）ＭＳ分を含む。該部分はｐｃＲ３０１をイずられるプ
ロキモシン分子をコードする約１ｏｏｏのヌクレオチド
に詰合されている。ｐ ＣＲ５０’、Ｌの調製は次のよ
うにして行なう。
）ＭＳ分を含む。該部分はｐｃＲ３０１をイずられるプ
ロキモシン分子をコードする約１ｏｏｏのヌクレオチド
に詰合されている。ｐ ＣＲ５０’、Ｌの調製は次のよ
うにして行なう。
プラスミドｐ Ｔ ｉンＥ１をＥｃｏＲＩで切断し、Ｓ
１ヌクレアーゼレこよって一不鎖′ｌ昂分を除去する。
１ヌクレアーゼレこよって一不鎖′ｌ昂分を除去する。
Ｔ、ＤＮＡＩＪガーゼを用いて：４預する。このＤＮＡ
を次にＥｃｏＲＩおよび５ａｌｌで切断して約４２１０
：ＬｔＫ基対から成る線状ＤＮＡ（α）を調製する。
を次にＥｃｏＲＩおよび５ａｌｌで切断して約４２１０
：ＬｔＫ基対から成る線状ＤＮＡ（α）を調製する。
一方、プラスミドｐＣＲ３０１をＥｃｏＲＩそして１（
７）ｔｂ Ｉで切Ｆ′ｉＪ↑して、ＤＮＡ１所片（ｂ）
を得る。このｌυ［片はプロキモシン遺伝子がベーター
ガラクトシダーゼをコードする。ｉ跣伝子［結合された
２４６Ｊ：紫繞対の；１己列である。同様に、ｐｃＲ３
０１をＫ ｐ ｎ Ｉと５ａｉｌで切断して、ＤＮＡ断
片（Ｃ）を得る。この断片ばＣ木端を含むゾロキモシン
遺伝子の１０２５塩基対の配列である。ＤＮＡ断片（α
）。
７）ｔｂ Ｉで切Ｆ′ｉＪ↑して、ＤＮＡ１所片（ｂ）
を得る。このｌυ［片はプロキモシン遺伝子がベーター
ガラクトシダーゼをコードする。ｉ跣伝子［結合された
２４６Ｊ：紫繞対の；１己列である。同様に、ｐｃＲ３
０１をＫ ｐ ｎ Ｉと５ａｉｌで切断して、ＤＮＡ断
片（Ｃ）を得る。この断片ばＣ木端を含むゾロキモシン
遺伝子の１０２５塩基対の配列である。ＤＮＡ断片（α
）。
（ｂ）寂よび（Ｃ）をＴ、ＤＮＡリガーゼで連禾吉する
。連結したＤＮＡケ犬１腸困Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｃ６０
０に纏入しアンピシリン耐性コロニー（ｐｃｌｉ！ ５
０１ ’ｆ：含む）を選択する。側３図に示すとと＜、
ＬＩＢ＜ＪのプラスミドｐｃＡ！５０１を制限−糸切１
４ノ［で分析すると、ｔｒｐプロモーターとプロキモシ
ンをコードする１９ ｉ ｏ ｏ ｏヌクレオチド（ヌ
クレオチド１３奮から遺伝子の禾ｙ１ｍｌヌクレオチド
１０９５全壕で即ち”ａ’−５曾目のコドン〃・ら３６
５１杼目筐で）′に含むことがわかる。
。連結したＤＮＡケ犬１腸困Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｃ６０
０に纏入しアンピシリン耐性コロニー（ｐｃｌｉ！ ５
０１ ’ｆ：含む）を選択する。側３図に示すとと＜、
ＬＩＢ＜ＪのプラスミドｐｃＡ！５０１を制限−糸切１
４ノ［で分析すると、ｔｒｐプロモーターとプロキモシ
ンをコードする１９ ｉ ｏ ｏ ｏヌクレオチド（ヌ
クレオチド１３奮から遺伝子の禾ｙ１ｍｌヌクレオチド
１０９５全壕で即ち”ａ’−５曾目のコドン〃・ら３６
５１杼目筐で）′に含むことがわかる。
１剤ｙｐ、 Ａ Ｔ Ｇコドンとゾロキモシン５１．１
ｆｉ目のコドンまでのヌクレオチド配列は以下の遡りで
ある。
ｆｉ目のコドンまでのヌクレオチド配列は以下の遡りで
ある。
ＧＡＡ ＴＴＣＣＧＧ−” ’
Ａ ｒ 、ｇ
プロキモシン
発現プラスミドを／ばする形負虻侠Ｍｉｌｌ旅はクロー
ン化すれたプロキモシン遺伝子を発ｚシ、ｔτｐＥプロ
モーターの制御のもとにプロキモシンを雄牛ずる。
ン化すれたプロキモシン遺伝子を発ｚシ、ｔτｐＥプロ
モーターの制御のもとにプロキモシンを雄牛ずる。
′φに７ｉ！６０１
プラスミドｐ（、’Ｒ６０１はｐＴＲＥｌの一部分とｐ
Ｔ ＲＬ １からの５６塩基対の断片を含む。この小
断片はｐ ＣＲ５（ｊ １中に存在するゾロキモシンを
コードするヌクレオチド配列と全く同じ配列にｋｉ５合
されている。ｐｃｉ？、６０１の調製は次のようにして
行なう。
Ｔ ＲＬ １からの５６塩基対の断片を含む。この小
断片はｐ ＣＲ５（ｊ １中に存在するゾロキモシンを
コードするヌクレオチド配列と全く同じ配列にｋｉ５合
されている。ｐｃｉ？、６０１の調製は次のようにして
行なう。
プラスミドｐＴ’ＲＥ１をＨｐ ａ Ｉと５ａｌＩで切
断し、４０１０堪基対の繭状ＤＮＡ断片（ｄ）を切９出
す。次にプラスミドｐ Ｔ ＲＬ １をＨｐαＩとＥ
ｃ ｏ ｊｉ Ｉで切断し、５６塩基対の線状Ｄ Ｎ
Ａ （ｇ）（ｔｒｐＬプロモーターを含む）を借る。Ｄ
ＮＡ１舟片（ｄ）および（ｅ）は前記の断片（ｂ）およ
び（６）（共ニｐＧＲ３０１から切り出される）と共に
１４ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。この連結され
たＬ）１〜７，４で大腸凶Ｇ６ｏｏを形質伝’Ｒ％ Ｌ
プラスミドルＣ１１′６０１を含むアンピシリン耐コロ
ニーヲ選択する。ら１３図に示すごとく、目１Ｇのシラ
スミドｐＣ１ｔ６０１を制限酵累切断で分析するとｔγ
ｐＬプロモーターとプロキモシンをコードする約ｉｏｏ
。
断し、４０１０堪基対の繭状ＤＮＡ断片（ｄ）を切９出
す。次にプラスミドｐ Ｔ ＲＬ １をＨｐαＩとＥ
ｃ ｏ ｊｉ Ｉで切断し、５６塩基対の線状Ｄ Ｎ
Ａ （ｇ）（ｔｒｐＬプロモーターを含む）を借る。Ｄ
ＮＡ１舟片（ｄ）および（ｅ）は前記の断片（ｂ）およ
び（６）（共ニｐＧＲ３０１から切り出される）と共に
１４ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。この連結され
たＬ）１〜７，４で大腸凶Ｇ６ｏｏを形質伝’Ｒ％ Ｌ
プラスミドルＣ１１′６０１を含むアンピシリン耐コロ
ニーヲ選択する。ら１３図に示すごとく、目１Ｇのシラ
スミドｐＣ１ｔ６０１を制限酵累切断で分析するとｔγ
ｐＬプロモーターとプロキモシンをコードする約ｉｏｏ
。
ヌクレオチド（ヌクレオチド１３’４４ｆから直伝子の
木端ヌクレオチド１ｏ９５査まで即ちシフ、’−５１ｂ
目のコドンから３６５査目まで）を含有することが見い
出される。
木端ヌクレオチド１ｏ９５査まで即ちシフ、’−５１ｂ
目のコドンから３６５査目まで）を含有することが見い
出される。
！刑始Ａ Ｔ Ｇコドンとプロキモシン５企目のコドン
までのヌクレオチド門己列は以下の通りである。
までのヌクレオチド門己列は以下の通りである。
Ｍｅｔ ｔｒｐＬ領域
ｃａａ−３’
ノＬｒｇ
プロキモシン
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、ｔτｐＬフロ
モーターの制御のもとにプロキモシン５企目ずる。
モーターの制御のもとにプロキモシン５企目ずる。
ｃＲＴＯ１
プラスミドｐｃＲ’ｌＯ１はｐ Ｔ ＲＰ １の一部分
とｐｃＲ３０１から得られるプロキモシンコーディング
配列に結合された合成ヌクレオチド片を含有する。ｐＣ
Ｒ７０１のｉＲ４ｊＪｃＬ Ｉｄ次のようにして行なう
。プラスミドｐＴＲＰ １をｌｉｉｎｄｍあ・よびδ′
αｌｘで重複分解すると約４０５０塩基対の線状ＤＮＡ
４片ωを得る。次にプラスミドｐＣＲ３（Ｈｆ Ｂ ａ
ｍＨＩおよび５ａｌＩで切断して、１２６４塙基対の
線状ＤＮ’Ａ断片（ｇ）を切り出す。一方、化学合成に
より下記の塩基配列を二角する２２塩基対の合成オリゴ
ヌクレオチド（ｅ）を調製する。
とｐｃＲ３０１から得られるプロキモシンコーディング
配列に結合された合成ヌクレオチド片を含有する。ｐＣ
Ｒ７０１のｉＲ４ｊＪｃＬ Ｉｄ次のようにして行なう
。プラスミドｐＴＲＰ １をｌｉｉｎｄｍあ・よびδ′
αｌｘで重複分解すると約４０５０塩基対の線状ＤＮＡ
４片ωを得る。次にプラスミドｐＣＲ３（Ｈｆ Ｂ ａ
ｍＨＩおよび５ａｌＩで切断して、１２６４塙基対の
線状ＤＮ’Ａ断片（ｇ）を切り出す。一方、化学合成に
より下記の塩基配列を二角する２２塩基対の合成オリゴ
ヌクレオチド（ｅ）を調製する。
５ ′ＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧ
” ’３′ ＡＴＡＣ（、”ＧＡＧ’１’ＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＡ
Ｇ ５’三つの断片（ト）、（ｇ）そして（Ａ）をＴ、
ＤＮＡリガーゼで連結する。この連台ＤＮＡを形質転換
によって犬ｊ・’Ａｒｍ Ｃ６００に尋人して％ｐｃＲ
ＴＯ１を含むアンぎシリン耐性コロニーを選択する。楓
３１ワに示すごとく、目的のプラスミドｐｃＲＴＯ１を
制眠酢系切断で分析するとｔｒｐＬプロモーターとプロ
キモシンの全コード配列（ヌクレオチド１食から遺伝子
の末端ヌクレオチド１０９５査まで即ちｐ、≧１ 箱目
のコドンから３６５−１ｉ−目のコドンまで）金官有す
ることが見い出される。ｐ・ＣＩＩＴＯ１中のｔ ｒ
ｐ Ｌ ＳＤ Ｃ３ｈｉｎｏｎ Ｄｇｌｇｃｔｒｎｏ）
’ｉ（截は開始コドン、４７’ Ｇから１３ヌクレオチ
ド７．１ｊｔ ｔｔでおり。
” ’３′ ＡＴＡＣ（、”ＧＡＧ’１’ＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＡ
Ｇ ５’三つの断片（ト）、（ｇ）そして（Ａ）をＴ、
ＤＮＡリガーゼで連結する。この連台ＤＮＡを形質転換
によって犬ｊ・’Ａｒｍ Ｃ６００に尋人して％ｐｃＲ
ＴＯ１を含むアンぎシリン耐性コロニーを選択する。楓
３１ワに示すごとく、目的のプラスミドｐｃＲＴＯ１を
制眠酢系切断で分析するとｔｒｐＬプロモーターとプロ
キモシンの全コード配列（ヌクレオチド１食から遺伝子
の末端ヌクレオチド１０９５査まで即ちｐ、≧１ 箱目
のコドンから３６５−１ｉ−目のコドンまで）金官有す
ることが見い出される。ｐ・ＣＩＩＴＯ１中のｔ ｒ
ｐ Ｌ ＳＤ Ｃ３ｈｉｎｏｎ Ｄｇｌｇｃｔｒｎｏ）
’ｉ（截は開始コドン、４７’ Ｇから１３ヌクレオチ
ド７．１ｊｔ ｔｔでおり。
（ｉｒＪ 始コドンはプロキモシン、・１を伝子の先端
コドンに接合されている。
コドンに接合されている。
〕０ロキモシン
発現プラスミドをイ１する形賞転撲イ、１１１胞はタロ
ーン化されたプロキモシン遺伝子を光現し、ｔγｐＬプ
ロ七−ターのｔＲＩＪ仰のもとにプロキモシン５企目生
する。
ーン化されたプロキモシン遺伝子を光現し、ｔγｐＬプ
ロ七−ターのｔＲＩＪ仰のもとにプロキモシン５企目生
する。
犬ｌ勅凶中のプロキモシン５企目
前述の完す９シラスミドをざ肩する形・貞転俟細用を３
β−インドリルアクリル或（１５μｉ ／ ｒｎｌ！、
）寂よびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を言むＡ４
９曾成増地に接４幕して培云する。細胞の増殖か最大に
雇した時に柔凶して、ｕｊ体を音波破壊によってイ仮咳
し無ふｆｉｌ 、ｌ＋１！１１’ｉｄ出液を得る。この
抽出液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドヶ゛ル゛喝ヌ℃泳
８１ｖに〃・ける。生ＪＪｙ、屯白負はラジオイムノ法
υζよす伏出される。このような手法に従って、プラス
ミドｐｃｎ５ｏ１゜ｐ ＣＲ６０，１又はｐｃＲ７０１
をゴ■する形質駄候体全谷々プロキモシン産ｌｌｆ能に
ついて伏豊した。
β−インドリルアクリル或（１５μｉ ／ ｒｎｌ！、
）寂よびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を言むＡ４
９曾成増地に接４幕して培云する。細胞の増殖か最大に
雇した時に柔凶して、ｕｊ体を音波破壊によってイ仮咳
し無ふｆｉｌ 、ｌ＋１！１１’ｉｄ出液を得る。この
抽出液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドヶ゛ル゛喝ヌ℃泳
８１ｖに〃・ける。生ＪＪｙ、屯白負はラジオイムノ法
υζよす伏出される。このような手法に従って、プラス
ミドｐｃｎ５ｏ１゜ｐ ＣＲ６０，１又はｐｃＲ７０１
をゴ■する形質駄候体全谷々プロキモシン産ｌｌｆ能に
ついて伏豊した。
オートラソオダラフイー（轟ｔｏｒａ、ｄｉｏ’ｇｒａ
ｐｈ４）にする程度の大きさの帝の伍白質を産生するこ
とが明らかとなった。この枯木はプロキモシンが各発現
プラスミドを有する犬１易蘭１“田川中で生噴δれてい
ることを示すものである。さらに加えて、免反羊的手法
により大ｆｉ船［ｉ ｉｌ：叱賄当ＩＪ？ｆＪ３万分子
以上のプロキモシンの生産レベルであることが明らかに
された。以上の実験結果を通して、プラスミドｐｃＲ５
０１、７）Ｃｌピロ０１又！ｉ ｐ ＣＲ７ｒ） １
ｒ。
ｐｈ４）にする程度の大きさの帝の伍白質を産生するこ
とが明らかとなった。この枯木はプロキモシンが各発現
プラスミドを有する犬１易蘭１“田川中で生噴δれてい
ることを示すものである。さらに加えて、免反羊的手法
により大ｆｉ船［ｉ ｉｌ：叱賄当ＩＪ？ｆＪ３万分子
以上のプロキモシンの生産レベルであることが明らかに
された。以上の実験結果を通して、プラスミドｐｃＲ５
０１、７）Ｃｌピロ０１又！ｉ ｐ ＣＲ７ｒ） １
ｒ。
肩する大Ｉｉ：、、１１４中でプロキモシンが犬４Ｊ
Ｌａ ｔｒ７） オペロン・プロモーターの制御のもと
に生汁されしかもその生産レベルが以前に報告された大
ｒＨ’ｉ １７１ａｃ、オペロン・プロモーターの山＋
ｊ （Ｉ叩のもとの生産レベルより実質的に商いことが
兄い出された。本発明の手法と同じスキームに従って、
ｔｒｐ プロモーターをプロキモシンの開り合コドンに
より〕江づけて、端金ぜせることによシ、好′ましくは
さらに開始コドンをプロキモシン、は伝子の先端に結合
させれば−よ＋）尚レベルの発現を連成することができ
るとメリｊ待δれる。
Ｌａ ｔｒ７） オペロン・プロモーターの制御のもと
に生汁されしかもその生産レベルが以前に報告された大
ｒＨ’ｉ １７１ａｃ、オペロン・プロモーターの山＋
ｊ （Ｉ叩のもとの生産レベルより実質的に商いことが
兄い出された。本発明の手法と同じスキームに従って、
ｔｒｐ プロモーターをプロキモシンの開り合コドンに
より〕江づけて、端金ぜせることによシ、好′ましくは
さらに開始コドンをプロキモシン、は伝子の先端に結合
させれば−よ＋）尚レベルの発現を連成することができ
るとメリｊ待δれる。
不発明の方法により拌３Φされた犬１助国は、工業ブ支
后トｆ院］成生こ１勿工業ｊ反術債ｆ死ノツｆｒ（ブタ
ペスト条幻に随って冨託石れており、合一４′Ａ（＆こ
与えられた受託１け号により・酢定さオＬる。
后トｆ院］成生こ１勿工業ｊ反術債ｆ死ノツｆｒ（ブタ
ペスト条幻に随って冨託石れており、合一４′Ａ（＆こ
与えられた受託１け号により・酢定さオＬる。
本祐明υ士以下の〕４施し１４ ｉ／（：よりさらに師
しく記述笛れるが、僚々な変更又は・験正が１発明の孜
術Ｊ絶１Ｍ１べで許されることを）垂解丁べきである。
しく記述笛れるが、僚々な変更又は・験正が１発明の孜
術Ｊ絶１Ｍ１べで許されることを）垂解丁べきである。
実施例
灸施例中常に用いられているＴＥＸ？緩衝液はトリス塩
＠、２０ｍＭ、ＮａＣｌ３０ｍＭ、、ＥＤＴＡｌｍＭを
含みｐＨは約７．５である。
＠、２０ｍＭ、ＮａＣｌ３０ｍＭ、、ＥＤＴＡｌｍＭを
含みｐＨは約７．５である。
実施例１ プラスミドｐＴＲＥｌの調製シラスミドｐ
ＯｃＴ２１．５μｒ （１５μＡのＴＥＩＶ）ｆＥｃ
ｏＲＩ（２，５単位０．５ ｐＬ ＴＥＮ中）、Ｅ ｃ
ｏＲＩ緩衝液（３μｔ）、水１１．５μＬから成る最
終容量３０μｔの溶液中２０°Ｃで７．５分間保温（イ
ンキュベート）することによ、！１ｌｌＥＣＯＲＩで＝
ｌｓｌ油分した。アガロースダルから目的のＤ Ｎ Ａ
ｆ回収しく４０μ、ＩＴＥＮ） 、６ｏ℃で５分１ｂ
ｊ７ＪＩＩ熱した。このＤＮＡ溶液（４０μＬ）にＤＮ
Ａポリメラーゼｌ’（４単位４μＨＴ’ＥＮ） 、ｌ
６兜１ずＡＴＰ （４μＬ） 、１６ｍＭＴＴＰ （４
μＬ）、ポリメラーゼ緩衝液６μｔ１水２μｔを加えて
最終容量６０μｔとし、２５℃で３０分間保湿した。
ＯｃＴ２１．５μｒ （１５μＡのＴＥＩＶ）ｆＥｃ
ｏＲＩ（２，５単位０．５ ｐＬ ＴＥＮ中）、Ｅ ｃ
ｏＲＩ緩衝液（３μｔ）、水１１．５μＬから成る最
終容量３０μｔの溶液中２０°Ｃで７．５分間保温（イ
ンキュベート）することによ、！１ｌｌＥＣＯＲＩで＝
ｌｓｌ油分した。アガロースダルから目的のＤ Ｎ Ａ
ｆ回収しく４０μ、ＩＴＥＮ） 、６ｏ℃で５分１ｂ
ｊ７ＪＩＩ熱した。このＤＮＡ溶液（４０μＬ）にＤＮ
Ａポリメラーゼｌ’（４単位４μＨＴ’ＥＮ） 、ｌ
６兜１ずＡＴＰ （４μＬ） 、１６ｍＭＴＴＰ （４
μＬ）、ポリメラーゼ緩衝液６μｔ１水２μｔを加えて
最終容量６０μｔとし、２５℃で３０分間保湿した。
これに０．２５ＭＥＤＴＡｆｔ４ｐＬｔＪＸＩ：ｔだ”
ｊ＋、フェノール処理、エーテル処理を行いエタノール
でＤＮＡ’ｃｔＪＪｊＪｔサセｆｃ。ＤＮＡｆ、Ｔ４Ｄ
＃Ａ リガーゼ（１単位、１ｐｌ） 、３ｍ、ＡｆＡＴ
Ｐ （２Ｐｔ）、リガ゛−ゼ緩衝液（２μｔ）、水（５
μｔ）の最終谷ｉｉ：１０μＬの浴液に溶解し２２℃で
２時間保温シタ。インキュベーション後エタノールでＤ
ＩＪＡケ沈絞芒せ、沈殿ＤノｖＡをＴＥＮ浴液に溶）仔
した。
ｊ＋、フェノール処理、エーテル処理を行いエタノール
でＤＮＡ’ｃｔＪＪｊＪｔサセｆｃ。ＤＮＡｆ、Ｔ４Ｄ
＃Ａ リガーゼ（１単位、１ｐｌ） 、３ｍ、ＡｆＡＴ
Ｐ （２Ｐｔ）、リガ゛−ゼ緩衝液（２μｔ）、水（５
μｔ）の最終谷ｉｉ：１０μＬの浴液に溶解し２２℃で
２時間保温シタ。インキュベーション後エタノールでＤ
ＩＪＡケ沈絞芒せ、沈殿ＤノｖＡをＴＥＮ浴液に溶）仔
した。
この、台数をＣ’ａ”＋で処理した大腸菌り、 ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００を形劉仏摂するのに用いた。１２個のコロ
ニー７２株のｐＴＲＥｌがｑ、入された形質転換株？：
得た。
ｉ Ｃ６００を形劉仏摂するのに用いた。１２個のコロ
ニー７２株のｐＴＲＥｌがｑ、入された形質転換株？：
得た。
実施例２ プラスミドｐＴＲＬ ｌの調製１）ｐＯｃ
’Ｔ２からＤＮＪＮわ１片（１）の調製プラスミドｐＯ
ｃＴ２ｆ：、ｐＯｃＴ２ １０．６μｆ（，１００μＩ
ＴＥＮ） 、ＥｃｏＲＩ （４０単位、８μｔＴＥＩＶ
） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液（１２μｔ）を含む最終容量１
２０μＬの溶液中、３７°Ｃ２時間保温することによＩ
）Ｅｃｏ、ＲＩで切１４７ｉシた。インキュベーション
後、エタノールでＤＮＡ−ｆ沈殿させ、沈）ＱｋＤ Ｎ
Ａを５０μｔのＴＥＮに溶解した。この切１ｔＪＴＤ
Ａ’ Ａ ｋ含ｂ ｆ＆液４９μＡｉｊゴａ ｍＨＩ
緩衝液６ ｐｉＸＨ，、ＯｊＰＡ、 Ｒｓａｌ （２０
単位、２ｐｌ。
’Ｔ２からＤＮＪＮわ１片（１）の調製プラスミドｐＯ
ｃＴ２ｆ：、ｐＯｃＴ２ １０．６μｆ（，１００μＩ
ＴＥＮ） 、ＥｃｏＲＩ （４０単位、８μｔＴＥＩＶ
） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液（１２μｔ）を含む最終容量１
２０μＬの溶液中、３７°Ｃ２時間保温することによＩ
）Ｅｃｏ、ＲＩで切１４７ｉシた。インキュベーション
後、エタノールでＤＮＡ−ｆ沈殿させ、沈）ＱｋＤ Ｎ
Ａを５０μｔのＴＥＮに溶解した。この切１ｔＪＴＤ
Ａ’ Ａ ｋ含ｂ ｆ＆液４９μＡｉｊゴａ ｍＨＩ
緩衝液６ ｐｉＸＨ，、ＯｊＰＡ、 Ｒｓａｌ （２０
単位、２ｐｌ。
Ｔ ＥＩＶ）に加え最終行進６０ｐＡの溶液を２０℃で
１０分間保温することによｆ６、Ｒｓａｌで部分消化し
た。生ｆ３９ Ｄ Ａ’ Ａ ｆエタノールで沈殿させ
、７尤＃：’イ１）ＮＡを２０μｔの１“ｘＡ＋に清Ｊ
Ｊイした。このＹ；−［７１ゲをポリアクリルアミド′
屯気泳ｇ曲にかけ、３６４塩糸対の線状ＤＮＵ （ｏ、
ｉ ６μ２４０μｚｒＥｎ中）を単ド、１ｔシた。一方
、ＥｃｏＲＩリンカ−を、リンカ−ｓ ｐｆ？ （５
μＬＴＥＩＶ） 、３ｍＪ（ＡＴＰ（２μｔ）、キネ−
ジョン緩衝液（２μｔ）、水（９μｔ）、キナーゼ（２
２単位２μｌ Ｔ Ｅ 、７Ｖ ）を含む最終容量２０
μＬの溶液中、３７°Ｃ１時間で処理した。２０μｔの
キネ−ジョン混合物を上記ＯＤ Ａ” Ａ溶液に加えさ
らにＴ４ＤＮ、Ａリガーゼ（５単位、５μｔＴＥＮ）
、リガーゼに衝液（４μＪ−）と６ ｍＭＡＴ Ｐ （
７ｐ ｌ） を添加した。全混合物（７１μＬ）を２２
℃で２時間保温することによりＤＮＡ連結を行なった。
１０分間保温することによｆ６、Ｒｓａｌで部分消化し
た。生ｆ３９ Ｄ Ａ’ Ａ ｆエタノールで沈殿させ
、７尤＃：’イ１）ＮＡを２０μｔの１“ｘＡ＋に清Ｊ
Ｊイした。このＹ；−［７１ゲをポリアクリルアミド′
屯気泳ｇ曲にかけ、３６４塩糸対の線状ＤＮＵ （ｏ、
ｉ ６μ２４０μｚｒＥｎ中）を単ド、１ｔシた。一方
、ＥｃｏＲＩリンカ−を、リンカ−ｓ ｐｆ？ （５
μＬＴＥＩＶ） 、３ｍＪ（ＡＴＰ（２μｔ）、キネ−
ジョン緩衝液（２μｔ）、水（９μｔ）、キナーゼ（２
２単位２μｌ Ｔ Ｅ 、７Ｖ ）を含む最終容量２０
μＬの溶液中、３７°Ｃ１時間で処理した。２０μｔの
キネ−ジョン混合物を上記ＯＤ Ａ” Ａ溶液に加えさ
らにＴ４ＤＮ、Ａリガーゼ（５単位、５μｔＴＥＮ）
、リガーゼに衝液（４μＪ−）と６ ｍＭＡＴ Ｐ （
７ｐ ｌ） を添加した。全混合物（７１μＬ）を２２
℃で２時間保温することによりＤＮＡ連結を行なった。
連結されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、さらに沈殿
Ｄｆｉ／Ａを５０μＬのＴＥＩＶに浴角イした。この溶
液（４５μＬ）にＥｃｏＲＩ （３５０卯位、７０μ
ｔＴ ＥＮ）、ＥｃｏＲＩ緩衝液２０μｔ１水６５μｔ
を加え、２００μＬの混合物を３７℃で３時間保温した
。
Ｄｆｉ／Ａを５０μＬのＴＥＩＶに浴角イした。この溶
液（４５μＬ）にＥｃｏＲＩ （３５０卯位、７０μ
ｔＴ ＥＮ）、ＥｃｏＲＩ緩衝液２０μｔ１水６５μｔ
を加え、２００μＬの混合物を３７℃で３時間保温した
。
７−Ｔ−／−ル処理ニよりインキュベーション”ｋ ′
’７ 止させ、ＤＩＶＡをエーテルで抽出し、エタノー
ルで沈ｆ’ｉ２ サセ、沈）Ｊ７９ＤＩＶ Ａ ｆ ４
．０ μＡノＴ Ｅ Ｎ Ｋｒ’４４角’ｎした。この
溶液をポリアクリルアミドダル電気泳動にかけ、軍気泳
動後、付Ｎ端を翁するＤＮＡ断片（ｊ） （０，１μ
？、２４０μｔのトリスｉｉ’ｒｒ弯緩衝液中）を単離
した。
’７ 止させ、ＤＩＶＡをエーテルで抽出し、エタノー
ルで沈ｆ’ｉ２ サセ、沈）Ｊ７９ＤＩＶ Ａ ｆ ４
．０ μＡノＴ Ｅ Ｎ Ｋｒ’４４角’ｎした。この
溶液をポリアクリルアミドダル電気泳動にかけ、軍気泳
動後、付Ｎ端を翁するＤＮＡ断片（ｊ） （０，１μ
？、２４０μｔのトリスｉｉ’ｒｒ弯緩衝液中）を単離
した。
１ｉ）ｐＢＲ３２２からＤＮＡ断片（２）の調製プラス
ミドｐ Ｂ Ｒ３２２を、７ｙ Ｂ Ｒ３２２４，５μ
グ（２０μＪ：ＴＥＮ） 、ＥｃｏＲＩ （２０単位Ｊ
４μＬＴＥ７ｖ）、ＥＣ０１７Ｉ緩衝液３μＬ１水３μ
Ａｔ甘ｔｒｉ終ｙｆ７．Ｈａ ｏ ｐ １（ＤＨ液液中
３７°ＣＩ Ｈ存１＝ｉＪ保温う゛ることにより、Ｅｃ
ｏＲＩで切１ｎ■した。
ミドｐ Ｂ Ｒ３２２を、７ｙ Ｂ Ｒ３２２４，５μ
グ（２０μＪ：ＴＥＮ） 、ＥｃｏＲＩ （２０単位Ｊ
４μＬＴＥ７ｖ）、ＥＣ０１７Ｉ緩衝液３μＬ１水３μ
Ａｔ甘ｔｒｉ終ｙｆ７．Ｈａ ｏ ｐ １（ＤＨ液液中
３７°ＣＩ Ｈ存１＝ｉＪ保温う゛ることにより、Ｅｃ
ｏＲＩで切１ｎ■した。
インキュベーションケフエノールｉ、４４ ｉ−ｇ、
ｆＣＪ リｉ’Ｙ ＪＬし、ＤＩＶＡｆエーテルで抽出
し、エタイールで沈殿サセ、沈殿ＤＩＶＡを１０ｍ＃ト
＋ノスｌ’＃ｔ ｎ Ｍ ’４Ａ ’ｌ’＆４０μＬに
溶解した。この溶液を１０μＬのＭ、ＡＴＥＢＡＰと６
５℃で１時間インキュペー１− ｔ、た。
ｆＣＪ リｉ’Ｙ ＪＬし、ＤＩＶＡｆエーテルで抽出
し、エタイールで沈殿サセ、沈殿ＤＩＶＡを１０ｍ＃ト
＋ノスｌ’＃ｔ ｎ Ｍ ’４Ａ ’ｌ’＆４０μＬに
溶解した。この溶液を１０μＬのＭ、ＡＴＥＢＡＰと６
５℃で１時間インキュペー１− ｔ、た。
インキュベーション振、ＭＡ Ｔ Ｅ Ｂ Ａ １“
ｆ（ｉン！６合物を２０μｔの１０ηｖＭト＋）ス塙酸
緩衝７シにで洸ス？することにより除去されブζ。こう
して４２μ？のＤ ＩＶ Ａ Ｉｊ；ｉｆ片（２）が６
ｏｐＬｃｔ）ｌｏｍＭト’）スｍ酸緩衝液中に回収され
た。
ｆ（ｉン！６合物を２０μｔの１０ηｖＭト＋）ス塙酸
緩衝７シにで洸ス？することにより除去されブζ。こう
して４２μ？のＤ ＩＶ Ａ Ｉｊ；ｉｆ片（２）が６
ｏｐＬｃｔ）ｌｏｍＭト’）スｍ酸緩衝液中に回収され
た。
１ｉｉ）Ｄ、＃Ａ断片（１）と断片（２）のりガーゼを
用いる連結 断片（ｔ）ＤＩＪス酢酸斥価液１２０μを中０．０５％
Ｓ’） と断片 （２） （１０ｍＭトリス塩酸緩
キ１１（液２μＬ中０．１４μ？）を混合し、混合液を
エタノール処理した。生成した沈殿を５０μＬのＴＥＮ
Ｋ浴解した役、４０μｔの溶液を結合反応に使）」ｊし
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（０，９単位、１ｐ９ＴＥＩＶ
）、リガーゼ緩衝液（５μＡ） 、６ ？７１ＭＡＴｐ
（５μＬ）を加え、最終容量５１μｌの溶液を２２℃
で２時間保温した。結合ＤＩＶＡをエタノールで沈殿さ
せ、沈殿を５０μｔのＴＥＩ’Ｊに溶解した。
用いる連結 断片（ｔ）ＤＩＪス酢酸斥価液１２０μを中０．０５％
Ｓ’） と断片 （２） （１０ｍＭトリス塩酸緩
キ１１（液２μＬ中０．１４μ？）を混合し、混合液を
エタノール処理した。生成した沈殿を５０μＬのＴＥＮ
Ｋ浴解した役、４０μｔの溶液を結合反応に使）」ｊし
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（０，９単位、１ｐ９ＴＥＩＶ
）、リガーゼ緩衝液（５μＡ） 、６ ？７１ＭＡＴｐ
（５μＬ）を加え、最終容量５１μｌの溶液を２２℃
で２時間保温した。結合ＤＩＶＡをエタノールで沈殿さ
せ、沈殿を５０μｔのＴＥＩ’Ｊに溶解した。
ｉｖ）形質転換
上記の結合ＤＩＶＡを含む溶液２０μｔを大腸循Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｃ６００の形質転換に用いた。約１５００個
の形質転換体が得られたが、約２０個に１の形質転換体
がプラスミドｐＴＲＬ、を含んでいることを制限酵素分
解で薙かめた。
ｏｌｉ Ｃ６００の形質転換に用いた。約１５００個
の形質転換体が得られたが、約２０個に１の形質転換体
がプラスミドｐＴＲＬ、を含んでいることを制限酵素分
解で薙かめた。
１）ｐＴＲＥｌからＤ Ｎ Ａ 前片（３） （Ｄ Ｅ
’Ａプラスミドｐ ＴＲＥ １をｐＴＲＥｌ ２．４
６μ！ （３０μｌ、Ｔ ＥＮ） 、Ｈｐａｌ （３’
０単位、６μ、ｌ、） 、ＨｐａＩ緩衝液４μｔを含む
最終容量４０μＬの必朕中、３７℃で１．５時間保温す
ることによ）ＩＨｐａｌで切断した。このＤＩＶＡ溶液
をＣ１ａＩ緩衝液ｓｐ’ｔおよびＣ１ａｌ（２５単位、
５μＡ）ｋ含む１０μｔの溶液に加え、３７℃で１．５
時間保温することによｆ）、ＤＩＶＡｆさらにＣ１ａｌ
で切断した。生成したＤＮＡはエタノールで沈殿させ、
沈殿を４０μＬのＴＥＥｌ溶液に溶解した。この溶液を
゛アガロースケ゛ル電気泳動にかけ、２．３５μｍ（８
０μｔＴＥＮ）の約４６４０ ｂａｙから４．るＤＮＡ
断片を単離した。
’Ａプラスミドｐ ＴＲＥ １をｐＴＲＥｌ ２．４
６μ！ （３０μｌ、Ｔ ＥＮ） 、Ｈｐａｌ （３’
０単位、６μ、ｌ、） 、ＨｐａＩ緩衝液４μｔを含む
最終容量４０μＬの必朕中、３７℃で１．５時間保温す
ることによ）ＩＨｐａｌで切断した。このＤＩＶＡ溶液
をＣ１ａＩ緩衝液ｓｐ’ｔおよびＣ１ａｌ（２５単位、
５μＡ）ｋ含む１０μｔの溶液に加え、３７℃で１．５
時間保温することによｆ）、ＤＩＶＡｆさらにＣ１ａｌ
で切断した。生成したＤＮＡはエタノールで沈殿させ、
沈殿を４０μＬのＴＥＥｌ溶液に溶解した。この溶液を
゛アガロースケ゛ル電気泳動にかけ、２．３５μｍ（８
０μｔＴＥＮ）の約４６４０ ｂａｙから４．るＤＮＡ
断片を単離した。
１ｔ）ｐ７’Ｊ＜ＥｌからＤＮＡ断片（４）の調製ｐ
Ｔ ＲＥ ｌをｐＴＲ’Ｅ１． ８．２μＦ（１００μ
ｆｌ’ＥＡｌ） 、ｌ１ｐａｌ （５７単位、８μｍ
）、ＨｐαＩλそ価液１２μｔを含む最終容量１２’０
μｔの１谷液中、３７℃で１．５時間保温することによ
りＨｐ ａ Ｉで切断しＡ為この反応混合物にＴａｑｌ
（８０単位、９μｔ）及びＨｐαＩ緩価液１μｔを力１
え、１３０μｔの混合物を６５°にで１時間保温した。
Ｔ ＲＥ ｌをｐＴＲ’Ｅ１． ８．２μＦ（１００μ
ｆｌ’ＥＡｌ） 、ｌ１ｐａｌ （５７単位、８μｍ
）、ＨｐαＩλそ価液１２μｔを含む最終容量１２’０
μｔの１谷液中、３７℃で１．５時間保温することによ
りＨｐ ａ Ｉで切断しＡ為この反応混合物にＴａｑｌ
（８０単位、９μｔ）及びＨｐαＩ緩価液１μｔを力１
え、１３０μｔの混合物を６５°にで１時間保温した。
インキュベーションの後、Ｄ Ａ’ Ａ ’、（エタノ
ールで沈殿させ、沈１嗅を４０μｔＯＴＥＮ液に浴勉し
グこ。この溶液を）ｊ？リアクリルアミド′屯気θ（動
にかじ、０．０５４μ？ （４０μ〕、ＴＥＩ’：／）
の３２ｂｐからなるＤＩＶＡ断片（４）を単離した。
ールで沈殿させ、沈１嗅を４０μｔＯＴＥＮ液に浴勉し
グこ。この溶液を）ｊ？リアクリルアミド′屯気θ（動
にかじ、０．０５４μ？ （４０μ〕、ＴＥＩ’：／）
の３２ｂｐからなるＤＩＶＡ断片（４）を単離した。
１ｉｉ）ＤＡ’、Ａ１ｈ片（３）と（４）のりガーゼを
用いる連結 ０．２９ 、ａ ？ （Ｌ Ｏｐ、／、Ｔ、ＥＮ） ｃ
ｒ）ＤＮＡＧｊ「片（３） 、０．０１４μｍ（１０μ
ｌ、ＴＥＮ）のＤＮＡ断片（４） 、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（３，６単位、４μｍ＞ 、リガーゼ緩彷液、５ ｍ
ＭＡＴ Ｐ ’（３μ７）を含む混合物３０μｔを２２
°Ｃで２時間保温した。連結されたＤ７ｖＡをエタノー
ルで沈殿させ、沈殿を４０μＬのＴＥＮに溶解した。
用いる連結 ０．２９ 、ａ ？ （Ｌ Ｏｐ、／、Ｔ、ＥＮ） ｃ
ｒ）ＤＮＡＧｊ「片（３） 、０．０１４μｍ（１０μ
ｌ、ＴＥＮ）のＤＮＡ断片（４） 、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（３，６単位、４μｍ＞ 、リガーゼ緩彷液、５ ｍ
ＭＡＴ Ｐ ’（３μ７）を含む混合物３０μｔを２２
°Ｃで２時間保温した。連結されたＤ７ｖＡをエタノー
ルで沈殿させ、沈殿を４０μＬのＴＥＮに溶解した。
ｉｖ）形質転換
上記の連結されｆＤＪ’ＪＡ溶で７ス３０μｔを犬１：
闇ぼＡＥ、ｃｏｌｉｃ６００の形質転換に用いた。約８
４０の形質・、へ換体が得られたが、それらのすべてが
ｐＴＲｐｌを含んでいた。
闇ぼＡＥ、ｃｏｌｉｃ６００の形質転換に用いた。約８
４０の形質・、へ換体が得られたが、それらのすべてが
ｐＴＲｐｌを含んでいた。
リ ｐＴＲＥｌからＤＮ’Ａ断片（ａ） （Ｄ Ｈｌ”
ｌ ａＪプラスミドｐＴＲＥ、を、ｐ ：ｒ ＲＥ １
８．２μＩｔ’（１００μＩＴＥＮ） 、石ｃｏＲＩ
（２５単位、５μＡ） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液、水（３μ
Ｌ）を含む最終容量１２０μｔの溶液中、３７°Ｃ２時
ｍ」保温することよりＥｃｏＲＩで消化した。フェノー
ル処理、エーテルによシ抽出、エタノールで＋７） 沈
殿化ノ後、沈殿ｆ ５０μｔのＴＥＩＶ溶液に溶解させ
た。
ｌ ａＪプラスミドｐＴＲＥ、を、ｐ ：ｒ ＲＥ １
８．２μＩｔ’（１００μＩＴＥＮ） 、石ｃｏＲＩ
（２５単位、５μＡ） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液、水（３μ
Ｌ）を含む最終容量１２０μｔの溶液中、３７°Ｃ２時
ｍ」保温することよりＥｃｏＲＩで消化した。フェノー
ル処理、エーテルによシ抽出、エタノールで＋７） 沈
殿化ノ後、沈殿ｆ ５０μｔのＴＥＩＶ溶液に溶解させ
た。
この浴液２５μＬ１δ゛ｌヌクレアーゼ（１００単位、
１０μり、Ｓ１緩術液（１５μｍ＞ 、水（１０μｔ）
ビ含む混住物５０μｔを２２℃で３０分子ｋｉ保温した
。フェノール処理でインキュベーションを・１へ、止さ
せ１．ｏ Ｊｖ Ａ４）ニーデルで抽出し、エタノール
で沈駿キせ７こ。−万、ＥｃｏＲＩリン刀−會、リンカ
−５／”ｙ Ｃ５μｔ） 、３ｍＭＡＴｐ（２μｔ）
、キナーゼ綴衝液２μＬ１水９ｐ、ｌ、。
１０μり、Ｓ１緩術液（１５μｍ＞ 、水（１０μｔ）
ビ含む混住物５０μｔを２２℃で３０分子ｋｉ保温した
。フェノール処理でインキュベーションを・１へ、止さ
せ１．ｏ Ｊｖ Ａ４）ニーデルで抽出し、エタノール
で沈駿キせ７こ。−万、ＥｃｏＲＩリン刀−會、リンカ
−５／”ｙ Ｃ５μｔ） 、３ｍＭＡＴｐ（２μｔ）
、キナーゼ綴衝液２μＬ１水９ｐ、ｌ、。
キナーゼ（２２単反、２ ／ｌ Ａ ＴＥ″Ｎ）を含む
最終答す２０μｔの溶液中、３７°゛Ｃで１時７９ｊ保
温することによシ１゛４ ポリヌクレオチドキナーゼで
消化した。このＥｃｏＲリンカ−を含む溶液２ｏμｔを
上記の切ｗｒ １） Ｎ Ａ ｖｃ加え、さらに３ ｔ
ｒｉＭＡ Ｔ Ｐ ５μを及び４．５単位の１４ リガ
ーゼ（５μｔＴＥＮ）を加えて、最終容量３０μｌの混
合物を２２℃で２歴間保温した。生成Ｊ）ＩＶＡをエタ
ノールで沈殿させ、沈殿を６０μ１−ＴＥＮに溶解した
。このＤＩｓ／Ａ溶液５０μｔにＥｃｏＲＩ （５００
単位、５０μ、ｌ、ＴＥＮ中） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液、
水（８０／ｚｇを加えた最終容量２００μｔの混合物を
３７℃で２Ｒｔｔｌ］保温した。インキュベーションを
フェノール処理で停止させ、ＤＩＶＡをエーテルで抽出
してエタノールで沈殿させた。沈殿ＤＨＡＩ／Ｃ３ａＬ
Ｉ（ｌｏｏｔｐ位、２０ ｐ ｔ） 、Ｓａ” Ｍ衝
液（１０μＬ）、水（８０μｔ）を加えた１１０μＬの
溶液を３７℃で１．５時間保温する。イン、ｙ−ユペー
ション後、切断されたＤ Ｎ’ Ａをエタノールで沈殿
させ、沈殿′ｆｃ６０μＬのＴＥＮに溶解さぜた。この
溶液をアガロ−スケ゛ル電気泳動にかけると３．５μｆ
ｔ （１００ｐｔＴＥＮ） （ＤＤＮＡＩｌｊｉ片（ａ
）が単離された。
最終答す２０μｔの溶液中、３７°゛Ｃで１時７９ｊ保
温することによシ１゛４ ポリヌクレオチドキナーゼで
消化した。このＥｃｏＲリンカ−を含む溶液２ｏμｔを
上記の切ｗｒ １） Ｎ Ａ ｖｃ加え、さらに３ ｔ
ｒｉＭＡ Ｔ Ｐ ５μを及び４．５単位の１４ リガ
ーゼ（５μｔＴＥＮ）を加えて、最終容量３０μｌの混
合物を２２℃で２歴間保温した。生成Ｊ）ＩＶＡをエタ
ノールで沈殿させ、沈殿を６０μ１−ＴＥＮに溶解した
。このＤＩｓ／Ａ溶液５０μｔにＥｃｏＲＩ （５００
単位、５０μ、ｌ、ＴＥＮ中） 、ＥｃｏＲＩ緩衝液、
水（８０／ｚｇを加えた最終容量２００μｔの混合物を
３７℃で２Ｒｔｔｌ］保温した。インキュベーションを
フェノール処理で停止させ、ＤＩＶＡをエーテルで抽出
してエタノールで沈殿させた。沈殿ＤＨＡＩ／Ｃ３ａＬ
Ｉ（ｌｏｏｔｐ位、２０ ｐ ｔ） 、Ｓａ” Ｍ衝
液（１０μＬ）、水（８０μｔ）を加えた１１０μＬの
溶液を３７℃で１．５時間保温する。イン、ｙ−ユペー
ション後、切断されたＤ Ｎ’ Ａをエタノールで沈殿
させ、沈殿′ｆｃ６０μＬのＴＥＮに溶解さぜた。この
溶液をアガロ−スケ゛ル電気泳動にかけると３．５μｆ
ｔ （１００ｐｔＴＥＮ） （ＤＤＮＡＩｌｊｉ片（ａ
）が単離された。
１ｉ）ｐＣＲ３ｏｌからＤＮＡ断片（ｂ）の調製プラス
ミドｐＣＲ３０１を、ｐｃＲ３０１７，３ｐ？ （１０
０μｔ７”ＥＡ’） 、Ｋｐｎｌ （３５単位、６ ｐ
７） 、Ｋｐｎｌ緩衝溶液（１２μｔ）、水（２μｌ
）を含む最終容量１２０μｔの溶液中３７°Ｃで１．５
時間保温することによりＫ ｐ ｎ Ｉで切断した。こ
の反応混合物にＥｃｏＲＩ （３０単位、６μｔ）とＥ
ｃｏＲＩ緩価液１４ｐｔｆ加えた１４０μＬ（７；ｌ清
液を３７℃でｌ［時ＩＪＪ保温した。生成した切断ＤＩ
ＶＡはエタノールで沈殿させ、沈殿を６０μＬのＴＥＮ
に溶解させた。この溶液をポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、０．０３μｍ（４ｍｅ Ｔ Ｅ ＃中）ｔ
ｙ）ＤＩＶＡ断片（ｂ） （２４６ｂｐ）ｋ単離した
。
ミドｐＣＲ３０１を、ｐｃＲ３０１７，３ｐ？ （１０
０μｔ７”ＥＡ’） 、Ｋｐｎｌ （３５単位、６ ｐ
７） 、Ｋｐｎｌ緩衝溶液（１２μｔ）、水（２μｌ
）を含む最終容量１２０μｔの溶液中３７°Ｃで１．５
時間保温することによりＫ ｐ ｎ Ｉで切断した。こ
の反応混合物にＥｃｏＲＩ （３０単位、６μｔ）とＥ
ｃｏＲＩ緩価液１４ｐｔｆ加えた１４０μＬ（７；ｌ清
液を３７℃でｌ［時ＩＪＪ保温した。生成した切断ＤＩ
ＶＡはエタノールで沈殿させ、沈殿を６０μＬのＴＥＮ
に溶解させた。この溶液をポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、０．０３μｍ（４ｍｅ Ｔ Ｅ ＃中）ｔ
ｙ）ＤＩＶＡ断片（ｂ） （２４６ｂｐ）ｋ単離した
。
１ｉｉ）ｐＣＲａｏｔからＤＩＶＡ断片（Ｃ）の調製プ
ラスミドｐｃＲ３０１をｐｃ、Ｒ３０１１，５ｐ ？
（１００ｐｔ（ＤＴＥＮ） 、Ｋｐｎｌ （３５単位、
６μｔ） 、ＫｐｎＩ緩衝溶液１２μｔ、水（２μｔ）
を含む最終容量１２０μｔの溶液中３７℃で１，５時間
保温することによりＫ ｐ ＴＬＩで切断した。次いで
、５ａｌ（３２単位、４ｐｔ＞、水（２μｔ）、５ａｌ
Ｉ緩衝液（１４μｔ）を上記のインキュベーション混合
物に加えた１４０μＬの浴液を３７°Ｃで１時間保温し
た。切断されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、沈殿′
ｆ：６０μＬの’Ｉ’ＥＮに溶解した。この溶液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ２゜５μｆ（１８０μ、ｌ、
ＴＥＮ）のＤＩＶＡ断片（Ｃ）（１０２５ｂｐ）を単離
した。
ラスミドｐｃＲ３０１をｐｃ、Ｒ３０１１，５ｐ ？
（１００ｐｔ（ＤＴＥＮ） 、Ｋｐｎｌ （３５単位、
６μｔ） 、ＫｐｎＩ緩衝溶液１２μｔ、水（２μｔ）
を含む最終容量１２０μｔの溶液中３７℃で１，５時間
保温することによりＫ ｐ ＴＬＩで切断した。次いで
、５ａｌ（３２単位、４ｐｔ＞、水（２μｔ）、５ａｌ
Ｉ緩衝液（１４μｔ）を上記のインキュベーション混合
物に加えた１４０μＬの浴液を３７°Ｃで１時間保温し
た。切断されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、沈殿′
ｆ：６０μＬの’Ｉ’ＥＮに溶解した。この溶液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ２゜５μｆ（１８０μ、ｌ、
ＴＥＮ）のＤＩＶＡ断片（Ｃ）（１０２５ｂｐ）を単離
した。
（ｖ）１）ＨＡ断片（α）、（ｂ）および（Ｃ）の連結
１μ？（３０μｔＴＥＮ）のＤＮＡ断片（α）、０．０
３μ？ （４μｔ）の断片（ｂ）、０．４μ２の断片（
Ｃ）を凍結乾燥させた。凍結乾燥後、沈殿をエタノール
で洗浄した。リガーゼ緩街液４μｔ１３ｍＭＡＴＰ （
４μｔ） 、水１１μｔおよびＴ４ＤＩＶ’Ａ ！Ｊ
カーゼ（０，９単位、１ ｐ １．）を上記の沈殿に加
えた２０μｔの溶液を２２°Ｃで２時間保温した。連結
されたＤＮＡはエタノールで沈殿させ、沈殿を４０μｔ
のＴＥＮに溶解した。
３μ？ （４μｔ）の断片（ｂ）、０．４μ２の断片（
Ｃ）を凍結乾燥させた。凍結乾燥後、沈殿をエタノール
で洗浄した。リガーゼ緩街液４μｔ１３ｍＭＡＴＰ （
４μｔ） 、水１１μｔおよびＴ４ＤＩＶ’Ａ ！Ｊ
カーゼ（０，９単位、１ ｐ １．）を上記の沈殿に加
えた２０μｔの溶液を２２°Ｃで２時間保温した。連結
されたＤＮＡはエタノールで沈殿させ、沈殿を４０μｔ
のＴＥＮに溶解した。
■）形質転換
上記の連結ＤＮＡを含む３０μｔのＴＥＮ溶液を用いて
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００の形質転換を行なった結果
、２０のｐ ＣＲ５０：ｌ：を含む形質転換体が得られ
た。この菌株Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐ
ＣＲ５０１）は微工研に受託番号ＦＥＲＭ已Ｐ２乙２号
として寄託された。
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００の形質転換を行なった結果
、２０のｐ ＣＲ５０：ｌ：を含む形質転換体が得られ
た。この菌株Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐ
ＣＲ５０１）は微工研に受託番号ＦＥＲＭ已Ｐ２乙２号
として寄託された。
実施例５ プラスミドｐ ＣＲ６０１の調製１）ｐＴ
ＲＥｘからＤＮＡ断片Ｃｄ）の調製プラスミドｐＴＲＥ
Ｌを、ｐＴＲＥｌ ２．４６ｐ？ （３０ｐＬＴＥＮ
） 、Ｈｐａｌ （３５単位、６μＡ） 、ＨｐαＩ
緩衝液（４μｔ）を含む最終容量４０μＬの溶液中、３
７°Ｃで１時間保温することによｐｊｊｐａｌで消化し
た。この溶液に５ａｌｌ （２０単位、５ｐｔ＞ と５
ａＬＩ緩釣液（５μＬ）′Ｊｆ：加えた５０μｔの混合
物音３７℃で１時間保温した。
ＲＥｘからＤＮＡ断片Ｃｄ）の調製プラスミドｐＴＲＥ
Ｌを、ｐＴＲＥｌ ２．４６ｐ？ （３０ｐＬＴＥＮ
） 、Ｈｐａｌ （３５単位、６μＡ） 、ＨｐαＩ
緩衝液（４μｔ）を含む最終容量４０μＬの溶液中、３
７°Ｃで１時間保温することによｐｊｊｐａｌで消化し
た。この溶液に５ａｌｌ （２０単位、５ｐｔ＞ と５
ａＬＩ緩釣液（５μＬ）′Ｊｆ：加えた５０μｔの混合
物音３７℃で１時間保温した。
切断されたＤＲＡをエタノールで沈殿させ、沈殿’ｉｒ
： ４０ μＬ （７） ７” Ｅ ７′ｖＦ（Ｉ 浴
用’＋’ サセタ。コノ行’ｊ ’Ａ’ｊ、 ｆ ７ガ
ロ一ス１１↓気泳両にかけ、２，０μ？ （４０μＬＴ
ＥＮ）（ＤＤＮＡＵＩ片（ｄ）（４０１０ｂｐＶｉ単内
１１シた。
： ４０ μＬ （７） ７” Ｅ ７′ｖＦ（Ｉ 浴
用’＋’ サセタ。コノ行’ｊ ’Ａ’ｊ、 ｆ ７ガ
ロ一ス１１↓気泳両にかけ、２，０μ？ （４０μＬＴ
ＥＮ）（ＤＤＮＡＵＩ片（ｄ）（４０１０ｂｐＶｉ単内
１１シた。
１ｉ）ｐＴＲＬｌからり、ＮＡ断片（Ｃ）の調製プラス
ミドｐ ＴＲＬ １をｐＴＲＬｌ １５．４μ？ （
１００ｐＬＴＥＩＶ） 、Ｅ’ｐａｌ （２５単位、
５μｚ） 、１１７ｙａｌ緩衝溶液１２μＡおよび水３
ｐ、Ｌを含む最終芥散１２０μｔの溶液中、３７℃で１
゜５時間保温することによｐＨｐａＩで切断した。この
溶液に、ＥｃｏＲＩ （３０ｊｌｉ位、６ μ、ｌ−Ｔ
Ｅ ＩＶ ）そしてＥｃｏＲＩ緩衝液１４μｔを加え
た１４０μＬの混合物を３７℃で１時間保温した。こう
してＨｐａｌ、、、Ｅ ｃ ｏＲＩ テ切断さ、れたＤ
ＮＡ−ｆ、エタ、／−ルで沈殿させ、沈殿を４０μＬの
Ｉ’ Ｅ Ｎに溶解した。この溶液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に布けて、０．１８μ２ （４０μｍ、
ＴＥＮ）のＤＮＡ断片（ｅ） （５６ｂ７））を単離
した。
ミドｐ ＴＲＬ １をｐＴＲＬｌ １５．４μ？ （
１００ｐＬＴＥＩＶ） 、Ｅ’ｐａｌ （２５単位、
５μｚ） 、１１７ｙａｌ緩衝溶液１２μＡおよび水３
ｐ、Ｌを含む最終芥散１２０μｔの溶液中、３７℃で１
゜５時間保温することによｐＨｐａＩで切断した。この
溶液に、ＥｃｏＲＩ （３０ｊｌｉ位、６ μ、ｌ−Ｔ
Ｅ ＩＶ ）そしてＥｃｏＲＩ緩衝液１４μｔを加え
た１４０μＬの混合物を３７℃で１時間保温した。こう
してＨｐａｌ、、、Ｅ ｃ ｏＲＩ テ切断さ、れたＤ
ＮＡ−ｆ、エタ、／−ルで沈殿させ、沈殿を４０μＬの
Ｉ’ Ｅ Ｎに溶解した。この溶液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に布けて、０．１８μ２ （４０μｍ、
ＴＥＮ）のＤＮＡ断片（ｅ） （５６ｂ７））を単離
した。
１ｉｉ）ｐＣＲ３ｏｘからＤＩＶ ＡＩｆＪ片（ｂ）の
調製実施例４の方法に便い、Ｋｐｎ１３２単位とＥｃｏ
ＲＩ３０単位でｐ Ｃ’ Ｒ３０１を切断したところ、
０４６μｍ （４０μｔのＴＥＮ）の〜「片（ｂ）が得
られた。
調製実施例４の方法に便い、Ｋｐｎ１３２単位とＥｃｏ
ＲＩ３０単位でｐ Ｃ’ Ｒ３０１を切断したところ、
０４６μｍ （４０μｔのＴＥＮ）の〜「片（ｂ）が得
られた。
１ｖ）ｐ（？Ｒ３ｏｔからＤＩＶＡＪｆ「片（ｃ）ノｔ
ｆｌ製実施例４の方法に従い、３０単位のＫ ｐ ｎ
Ｉと２４単位の５ａｌＩでｐｃＲ３０１を切断したとこ
ろ、３．９ｐ？ （４０ｐｌ、ＴＥＮ）（７）断片（ｃ
）が得られた。
ｆｌ製実施例４の方法に従い、３０単位のＫ ｐ ｎ
Ｉと２４単位の５ａｌＩでｐｃＲ３０１を切断したとこ
ろ、３．９ｐ？ （４０ｐｌ、ＴＥＮ）（７）断片（ｃ
）が得られた。
ｖ）ＤＮＡリガー片（ｂ）、（Ｃ）、（ｄ）オよび（ｇ
）の連結 ０．０６ ｐ ｙ （５ｐｉＴＥｌｖ） ノ？Ｉｆｔ
片（ｂ） 、ｏ。
）の連結 ０．０６ ｐ ｙ （５ｐｉＴＥｌｖ） ノ？Ｉｆｔ
片（ｂ） 、ｏ。
４９μｍ（５μＬ）の断片（Ｃ）、０５μ？（１０μＩ
ＴＥＮ）の断片（ｄ） 、０．４９μｍ （５μＬ）ノ
断片（ｅ） 、Ｔ、ＤＮＡリガー−Ｖ （５，５却位、
６μＩＴＥＮ） 、リガーゼ緩価液、および６ｍＭＡ
Ｔ Ｐ （４，５ｐ Ａ）を含む溶液４５μＬを２２°
Ｃで２ ＋＋ｉｆ間保温した。連結されたＤＩＶＡをエ
タノールで沈殿させ、沈殿を６０ 、ｕ ｌのＴＥＮに
溶解さぜノと。
ＴＥＮ）の断片（ｄ） 、０．４９μｍ （５μＬ）ノ
断片（ｅ） 、Ｔ、ＤＮＡリガー−Ｖ （５，５却位、
６μＩＴＥＮ） 、リガーゼ緩価液、および６ｍＭＡ
Ｔ Ｐ （４，５ｐ Ａ）を含む溶液４５μＬを２２°
Ｃで２ ＋＋ｉｆ間保温した。連結されたＤＩＶＡをエ
タノールで沈殿させ、沈殿を６０ 、ｕ ｌのＴＥＮに
溶解さぜノと。
ｖｉ）形質転換
上記の連結Ｄ ノｖ’ Ａを含む２０μｔのＴＥＮｉ３
液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉｃ６００の形質転換を行
なった結果２７の形質転換体が得られたが、その内の８
株がｐ ＣＲ６０１を含有することを制限酵素分解によ
って確かめた。この菌株Ｅ、ｃｏｌｉＣ６’０ ’Ｏｒ
ｋ−７ｎｋ−：＜ｐＣＲ６０１）は微工研に受託番号Ｆ
Ｅ ＲＭ Ｆ３ｐ ２４絹として寄託された。
液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉｃ６００の形質転換を行
なった結果２７の形質転換体が得られたが、その内の８
株がｐ ＣＲ６０１を含有することを制限酵素分解によ
って確かめた。この菌株Ｅ、ｃｏｌｉＣ６’０ ’Ｏｒ
ｋ−７ｎｋ−：＜ｐＣＲ６０１）は微工研に受託番号Ｆ
Ｅ ＲＭ Ｆ３ｐ ２４絹として寄託された。
実施例６ プラスミドｐｃＲＴＯ１の調製ｌｉ）’ｆ
ｉＴＲＰ１からＤＮＡ断片（ｆ）の調製プラスミドｐＴ
ＲＰｌ ’２５．２μグ （１００μ１ＴＥＩＶ） 、
−／ｉｉｎｄｍ （４８単位、８ｆｉｔＴＥＩＶ）、
Ｈｉ ｎ ｄ、 ｎ１５衝液を含む１２０μＡの溶液を
３７°Ｃで１時間保温することによｐ ｐＴＲｐｌをＨ
ｉｎｄ■で切断した。この溶液にさらに５ａｌＩ （
２４単位、６ ｐ ＡＴ ＥＩＶ’） 、Ｓａ、ｌ Ｉ
緩？肋液（１４μＡ）を加えた１４０μＬの溶液を３７
°Ｃで２時間保温して、ｐｒＲｐｌを５ａｌｌで切断し
た。切断されたＩＪ）’ＮＡはエタノールで沈殿させ、
沈殿を６０μ１ＴＥＮに溶解した。この溶液をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、８．２μｒ（１２０μ、Ｉ Ｔ
Ｅ Ａ’ ）のＤＮＡ断片Ｃｆ）を単離した。
ｉＴＲＰ１からＤＮＡ断片（ｆ）の調製プラスミドｐＴ
ＲＰｌ ’２５．２μグ （１００μ１ＴＥＩＶ） 、
−／ｉｉｎｄｍ （４８単位、８ｆｉｔＴＥＩＶ）、
Ｈｉ ｎ ｄ、 ｎ１５衝液を含む１２０μＡの溶液を
３７°Ｃで１時間保温することによｐ ｐＴＲｐｌをＨ
ｉｎｄ■で切断した。この溶液にさらに５ａｌＩ （
２４単位、６ ｐ ＡＴ ＥＩＶ’） 、Ｓａ、ｌ Ｉ
緩？肋液（１４μＡ）を加えた１４０μＬの溶液を３７
°Ｃで２時間保温して、ｐｒＲｐｌを５ａｌｌで切断し
た。切断されたＩＪ）’ＮＡはエタノールで沈殿させ、
沈殿を６０μ１ＴＥＮに溶解した。この溶液をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、８．２μｒ（１２０μ、Ｉ Ｔ
Ｅ Ａ’ ）のＤＮＡ断片Ｃｆ）を単離した。
１１） ｐＣＲ３０１からＤＮＡ断片（（７）のＭｊ”
ｊ製プラスミドｐＣＲ３０１３９μグ （１００μｔＴ
ＥＮ） 、５ａｌｌ （３２単位、８ｐｔＴＥＮ）、
Ｓａｌ Ｉ緩衝液を含む１２０μｔの溶液を３７℃で１
１Ｆｑ ｌｕＪ 保ｔ’ａスル？ＣトＫ ヨ’）、２）
Ｃ、Ｒ３０１′（１−５ａｌｌで切断した。このＪ）Ｎ
Ａ溶液に２５単位のＢａｍ、Ｈ’ｌ（５μＬ）を添加し
て、２２℃で３０分間保温してｐｃＲ３０１をＢａｍＨ
Ｉで部分分解した。
ｊ製プラスミドｐＣＲ３０１３９μグ （１００μｔＴ
ＥＮ） 、５ａｌｌ （３２単位、８ｐｔＴＥＮ）、
Ｓａｌ Ｉ緩衝液を含む１２０μｔの溶液を３７℃で１
１Ｆｑ ｌｕＪ 保ｔ’ａスル？ＣトＫ ヨ’）、２）
Ｃ、Ｒ３０１′（１−５ａｌｌで切断した。このＪ）Ｎ
Ａ溶液に２５単位のＢａｍ、Ｈ’ｌ（５μＬ）を添加し
て、２２℃で３０分間保温してｐｃＲ３０１をＢａｍＨ
Ｉで部分分解した。
生成したＤ Ｎ’ Ａをエタノールで沈殿させ、沈殿を
６０μｔのＴＥＮに溶ＪＳ’Ｇｔ〜た。この溶液ケアガ
ロースダル電気泳動にかけ、２μｇ （８０μＬＴＥＡ
）のＤＩＪＡ断片＜（１） （１２６４Ｌｓｌ））を
単離した。
６０μｔのＴＥＮに溶ＪＳ’Ｇｔ〜た。この溶液ケアガ
ロースダル電気泳動にかけ、２μｇ （８０μＬＴＥＡ
）のＤＩＪＡ断片＜（１） （１２６４Ｌｓｌ））を
単離した。
１：ｒ） １）ｙ、４Ｂイノｒ片 （ｈ）化学合成に
よシ次のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド
を得た。
よシ次のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド
を得た。
５’ ＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧ
３’ａ’ ＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣ
ＴＡＧ ｓ’ｉ■）ＤＡ’、（断片（ｆ）、（ｇ）およ
び（ｈ）の連結 ｏ’、６８μ？ （ｌ Ｏ７ｔ、ｔＴＥＩＶ） ｏ’ｌ
（’、１丁片（ｆ）、０．２５μ７ （ｌＯμＬ）の断
片（ｇ） 、０．０４６ｐ ｙ （ｉ ｏ ｐｉｅ）
ノｍ＋片（Ｊ 、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１，８単位、
２μｇ 、リガーゼ緩（ｉＩｔｉ液４μＡ、６ｍＭＡＴ
Ｐ４ｐＬ（Ｄ混合４ｍ ４０ ｐ ｔを２２℃で２時間
保温した。リガーゼで連結されたＤＮＡはエタノールで
沈殿させ、沈殿を５０μＬのＴＥＨに俗解した。
３’ａ’ ＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣ
ＴＡＧ ｓ’ｉ■）ＤＡ’、（断片（ｆ）、（ｇ）およ
び（ｈ）の連結 ｏ’、６８μ？ （ｌ Ｏ７ｔ、ｔＴＥＩＶ） ｏ’ｌ
（’、１丁片（ｆ）、０．２５μ７ （ｌＯμＬ）の断
片（ｇ） 、０．０４６ｐ ｙ （ｉ ｏ ｐｉｅ）
ノｍ＋片（Ｊ 、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１，８単位、
２μｇ 、リガーゼ緩（ｉＩｔｉ液４μＡ、６ｍＭＡＴ
Ｐ４ｐＬ（Ｄ混合４ｍ ４０ ｐ ｔを２２℃で２時間
保温した。リガーゼで連結されたＤＮＡはエタノールで
沈殿させ、沈殿を５０μＬのＴＥＨに俗解した。
■）形質転換
上記の連結ＤＡＩ Ａを含む２０μＬのＴＥＩＶ溶液を
用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００の形質転換を行左っ
た結果８個の形質弘換体が得られだが、その内４株がｐ
ｃｌ＜ＴＯｌを含有することを制限酵素分解によって確
かめた。この１株ＩＦ、ｃｏｌｉｃ６００ ｒｋ”−ｍ
ｋ−（ｐ、ＣＲ７０１）は螢工研に受託番号１？ Ｅ
ＲＭ Ｆ３ｐ’２６４号として寄託された〇実施例７
大腸菌に於けるプロキモシンの発現プラスミドｐｃＲ
５０３ｐＣＲ６０１又はｐＣＲ７０１を含有する大腸菌
をＬ培地中３７°Ｃの悪度で〕・ｂ１□ｊ培養した。培
養物の約１０分の１をＭ９培地に移しかえ、１時間和培
養した後、を当り１５ノ”・りのインドールアクリル敏
をノへ地に加えて３７℃の温肢で３〜４時間培養しブζ
。この後、１ｊｉｌ ｌ胆は１５０００ｒｐｍで約１５
分間遠心分離により収集し、名゛波により一＋：、Ｊｊ
、体を破壊した。１４η１１坦を金管ない抽出物を２７
０００τｐ’ｒｒｔで３０分間遠心分Ｍｔを行ない肖ら
れた上澄液をＳＤＳグルを含むづ？１ノアクリルアミド
′省気泳Ｉ頭でかけ鞘製分社した。オートラジオダラフ
イーを行なうとい）ずれの菌枳乏の場合もプロキモシン
と同じ大きさの帯が観ｇｚされた。さらに免疫学０勺方
法により、偉品の２０ロキモシンの螢の密度とこの実践
でイ゛すられブξ帯のそＪｚとを比較すると大腸蘭−細
胞当り約３万以上のプロキモシン蛋白質が産生ずること
がわかった。
用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００の形質転換を行左っ
た結果８個の形質弘換体が得られだが、その内４株がｐ
ｃｌ＜ＴＯｌを含有することを制限酵素分解によって確
かめた。この１株ＩＦ、ｃｏｌｉｃ６００ ｒｋ”−ｍ
ｋ−（ｐ、ＣＲ７０１）は螢工研に受託番号１？ Ｅ
ＲＭ Ｆ３ｐ’２６４号として寄託された〇実施例７
大腸菌に於けるプロキモシンの発現プラスミドｐｃＲ
５０３ｐＣＲ６０１又はｐＣＲ７０１を含有する大腸菌
をＬ培地中３７°Ｃの悪度で〕・ｂ１□ｊ培養した。培
養物の約１０分の１をＭ９培地に移しかえ、１時間和培
養した後、を当り１５ノ”・りのインドールアクリル敏
をノへ地に加えて３７℃の温肢で３〜４時間培養しブζ
。この後、１ｊｉｌ ｌ胆は１５０００ｒｐｍで約１５
分間遠心分離により収集し、名゛波により一＋：、Ｊｊ
、体を破壊した。１４η１１坦を金管ない抽出物を２７
０００τｐ’ｒｒｔで３０分間遠心分Ｍｔを行ない肖ら
れた上澄液をＳＤＳグルを含むづ？１ノアクリルアミド
′省気泳Ｉ頭でかけ鞘製分社した。オートラジオダラフ
イーを行なうとい）ずれの菌枳乏の場合もプロキモシン
と同じ大きさの帯が観ｇｚされた。さらに免疫学０勺方
法により、偉品の２０ロキモシンの螢の密度とこの実践
でイ゛すられブξ帯のそＪｚとを比較すると大腸蘭−細
胞当り約３万以上のプロキモシン蛋白質が産生ずること
がわかった。
第１図はプロキモシンの完全なヌクレオチド°西己列を
示すものである。 第２図は各種ベクター・プラスミド°の市１１μＨ１ｍ
１図を示す。 第３図は各Ｓ発現プラスミドの制限士市図を示す。 第４図はプラスミドｐ ＯＣＴ ２のｔｒｐプロモータ
ーの周りのＤＮＡ配列を示す。 萄許出１県人別府輝彦 茅３ ５′ＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧ
ＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴ丁ＴＧＣＧＣＣＧＡＤ ＴＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧ
ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＣＡ
ＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡ
ＧＣＧＧＧＣＴＴ下第４図 第１頁の続き ０発 明 者 日高真誠 東京都文京区西片２−１６−２１ 手続補正書 昭和５８年１１月１５日 特許片長′山 若 杉 オロ 夫 殿１、事件の
表示 喘ム８ＡＨイ４５８−３８４３９ 号 ２、発明の名称 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて修生プロキモ
ン／這１太子を犬賜閑内で兄現させる力詠、３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京ｉｌＳ杉並区堀の内１−５−２１名 称
別 Ｈ） 舜 彩（氏 名） ４代 理 人〒１０７ ６補正の対象 〔１′３ 明細書の“′発明の詳細な説明″の欄の記載
を、以下のとおり訂ＩＥする。 （１） 明細店第１５負１２〜１３行に、「アミノ酸
からなる。」とある後に、以下のとおり加入する。 「キモシンとして、キモシンＡとキモシンＢが存在する
ことが知られている。これらはヌクレオチド配列中、ア
ミノ酸コドン２８６位（ヌクレオチド８５７位）が異な
っており、キモシンＡではコドンＧＡＴであるところ、
キモシンＢではコドンＧＴＴであろう。」 （２）明細書第２ ｔｉｔ を行に、［ラジオイムノア
ッセイ法」とある後に、 「及ヒ蛋白買プロンティング法」 と加入する。 （３） 明細書第２７貞１４行と１５行の行間に、「
グルコース ５２ アンピシリン ５０〃曖 」 と加入する。 （４） 明ＩＩＩ ４Ｆ第２７頁下から３行Ｖｃ［ａ
ｃｉｄ ） Ｊとある後に、行を改めて、以下のとおり
加入する。 「形質転換 通冨の形質転換実験は５０μ９７ ｍｌのアニビゾリン
を含むＬ−培地中で、Ｎｏｒｇａｒａら、Ｇｅｎｅ３．
２７９ （１９７８）の方法に従う。」（５）明ハ′Ｉ
Ｉ官第３０貝ドから９行〜３行に、「プラスミド７）Ｏ
ＣＴ ２は・・・・・・・・・・塩基を竹っている。」
とあるを、以下のとｓ−９ｍＪ正する。 「フ０ラスミドｐＯｃＴ２の母体となるプラスミドｐＯ
ｃＴ３は、グラスミドｐノＪ ／？ ３２２のＥｃ。 Ｒ１部位にｔｒρプロモーターオペレーター、ｔｒ、ｐ
Ｌ、 ｔｒｐ ｌ’、′を含むＤ Ａ’ Ａ ｌｌｆ
片刃団１み込１れたシラスミドであり、これらは約５０
０地基対の大腸菌トリプトファンオペロン（Ｅ、 ｃＯ
ｌｉ ｔｒｐｏｐｅｒｏｎ ）を構成する。ｐ ＯＣ
７’ ：３プラスミドは大阪大学医学部松原謙−教授よ
り寄贈された。グラスミドｐＯｃＴ ３を１１．ｏＲｌ
で切断し、トリプトファンオペロンＤＮＡ断片を切シ出
し、切断末端ｒ逆向きに入れ換え、再びＴ４リガーゼを
用いてＬ″ｃｏＲＩ位に挿入するとｐＯｃ’Ｔ２ができ
あがる。従って、ｐＯＣｌ３とｐＯＣＴ２では転写方向
が逆向きになっている。ｐ ＯＣＴ３では転写方向が遂
時１捷わりであるところ、ｐＯＣｌ２では時計まわり（
５′位から３′位）である。ｐＯＣｌ”２からｐＯＣｌ
３を４δ成する模様を第５図に示す。ｐＯｃ’Ｔ２の制
限酵素地図は第２図に示す。」（６） 明細簀第３１
典ｌ〜３１テに、「プラスミド中の・・・・・・・・・
構成されている。」とあるを、削除する。 （７）明＋１＋ＩＩＩ書謁３１負９行に、「ｐＯＣＴ」
とあるを、 「ｐ’０ＣＴ２」 と訂正する。 （８） 明細書画３１頁末行に、「第２図に示される
。」とある後に、 ［”ｐＯＣＴ２からｐＴＲＥｌを構成する模様を第５図
に示す。」 と加入する。 （９）明細書第３２＠末行に、「時計回り」とあるを、 「遂時耐回り」 と訂正する。 （則 明細書第３６貞１１に、「紀２図に示す。」とあ
る後に、 Ｆ、ｐＯＣＴ２からｐＴ、ＲＬｌを構成する模様は第６
図に示される。」 と加入する。 旧） 明卸１書第３４頁２行に、「制限地図を第２図に
示す。」とあるを、 「制限酵累地図を第２図に示す。ｐＴＲＥｌがら７）Ｔ
ＲＰｌを構成する模様を第７図に示す。」と訂正する。 ｕｚ 明絹書第３４頁下から３行に、「３ｏ１を」と
あるを、 「３０１から」 と訂正する。 Ｏａ 明細書第３６貞９行に、「ことがわかる。」と
ある後に、 「第８図にｐ、 （、’ Ｒ３０１とｐＴＲＥｌから２
Ｃ１イ５０１を’ｈ’ｒ；成する模様を図示する。」■
加入１３・ｕ４１ 明細書第３６貞１１行に、「ヌク
レオチド配列は」とある後に、 「Ｍａｘａｍ −Ｇ１１ｂｅｒｔ法によｐ １？４析す
ると」と加入する。 （１５１明細書第３７負２〜３行に、ｒ産生する。」と
ある後に、 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ａ’；ｔｔ：Ｊｉ吊第１番目ないし第４番目のアミノ酸
を欠き、その代シに前孔コーディング配列に由来するメ
チオニン以下ｔｒｐ Ｅプロモーターがコードするアミ
ノ酸８個及びβ−ガラクシトシダーゼに由来する２個の
アミノ酸残基を有するン°ロギモシン類似蛋白質である
。」 と加入する。 ０６）°明細上第３８員１０行に、「出される。」とあ
る後に、 「第９図にｐＴＲＥｌ、ｐ Ｔ ＲＬ １、ｐＣＲ３０
１からｐ Ｃ’ Ｒ６０１を構成する模様を図示する。 」と加入する。 ０７） 明卸１害第３８頁１２行に、［ヌクレオチド
配列は」とある後に、 ｉ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により解析すると」
と加入する。 ０ａ 明細書第３９頁３〜４行に、「産生ずる。」と
ある後に、以下のとおり加入する。 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ｎ末端第１番目ないし第４第目のアミノ酸を欠き、その
代シに声記コーディング配列に由来するメチオニン以下
ｔｒｐ Ｌプロモーターがコードするアミノ酸６個及び
β−ガラクシトシダーゼに由来する２個のアミノ酸残基
を有するプロキモシン類似蛋白質である。」 （ｌ！＋ 明細書第３９０マ行に、「ｐｃｉ（３０ＬＪ
とあるを、 「ｐＣｊン５０１」 と訂正する。 （２υ、 明細書第３９真下から６行に、「ｐＣＲ３０
１Ｊとあるを、 ＦｐＣ）＜５０Ｌ１ と訂正する。 （２１１明細書第３９頁下から２行に、「調製する。」
とある後に、以下のとおシ加入する。 「このＩＮＮΔ断片によりプロキモシン遺伝子（第１図
）のヌクレオチド第１４番を切断するＢａｍＩＪＩ消化
によって除去されてしまったヌクレオチド配列が回復す
る。」 （２２） 明細書第４０頁１１行に、「見い出される
。」とある後に、 「徳１０図にｐＴＲｐｔ、ｐＣＲ５ｏ１がらｐＣＲ７０
１を構成する模様を図示する。」と加入する。 （２３）明細書第４０ＪＸ１２行に、「領域は」とある
後に、 ７ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によＩ） Ｍ析する
と」と加入する。 Ｉ２４）明細書第６４頁３〜４行Ｅｔｃ、「産生する。 」とある後に、以下のとおシ加入する。 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ｎ末端に開始コドンＡ ＴＧがコードするメチオニンが
付いているＮ末端メチオニルプロキモシンである。」 （ハ）明ａ＠第４１貞６行に「形質転換細胞Ｊとある後
に、 「を含む培養物（Ｌ培地中）の一部」 と刀■人する。 （２６） 明細店゛第４１貝９行に、「に接種して」
とあるを、 「中でＪ と訂正する。 Ｑ７） 明細書第４１頁下がら５行に、ラジオイムノ
法」とあるを、 「蛋白質プロッティング法」 と訂正する。 （支））明細督第４１真下から４行に、「手法に従って
」とあるを、 「手法あるいはラジオイムノ法に従って」と訂正する。 Ｃ１９ｉ 明細書第４２貞５〜６行に、「免疫学的手
法により」とあるを、削除する。 ３０）明細書第４２頁８行に、「以上の」とあるを、「
ラジオイムノアッセイ法による分析でも同様の結果が得
られた。これらの」 と訂正する。 （３１）明細書第６１真下から３行及び下から２行に、
夫々、ｌ’−３０１ｊとあるを、 ５ｏｒｌ と訂正する。 ＯＡ 明細書詑６２頁２行に、「３０１」とあるを、
１”５ｏｔ４ と訂正する。 Ｃ，（：３１ 明細書第６４頁３〜４行に、「温度で
予備培養・・・・・・・・・・・・移しかえ、」とある
を、「温度で一晩予備培養した。培養物の１πＥをＭ９
培地（１，ｏ＊）に移しかえ、」 と訂正する。 斡１ 明細書第６４貞８行〜床行に、「音波によシ・・
・・・・・・・・・産生ずることがわかった。」とある
を、以下のとおり訂正する。 「ｐｌｄＳＩ’（フェニルメナルスルホニル フルオラ
イド）１ｍＪｆを含有するｐ Ｂ Ｓ緩衝液（２０？７
Ｌ ｋｆリン酸ナトリウム緩衝剤中１り０１ｎ＃の塩化
ナトリウムを含むｐＨ７，０） ３ ｙｔｔ＋に）醋濁
させた。 コノ懸濁液１１Ｃ２５０ｔｎ、ＡＩのＥＤＴＡ （６０
μ／＝）と１０ｍＡ／ｌのリゾチーム（３０μｔ）を加
え、３０分間Ｏ℃に保温した。 生成したスフェロプラストを音波で破壊し、これに８Ｍ
尿紫（３０９祠）を加えた細胞処理溶解物（ｃｅｌｌ
１ｙｓａｔｅ ）を３７℃で１時間保温した。 ３０００γｍｐで３０分間遠心分離にかけた後、上漬液
をｐ ７１ Ｓ緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジ
オイムノアッセイ（ｂｉｎｒｉｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉ
ｔｉｖｅｒａｄ ｉ ｏ ｉ ｍｔｎｕｎｏα５ｓａｙ
’、前述の西森ら、Ｇ ｅ ｉｚ ｅ誌に詳述の方法）
を適用した。 この方法によって免疫沈殿したプロキモシン中の放射性
同位元素（＋２５Ｉ）の量をガ゛ンマー緑割量器で測定
した。一方、標品のプロキモシンの濃度を種々変化させ
て得られる検量線ケ作成し、と１１゜と比較して細胞抽
出液中のプロキモシンの量を４出した。この実験からプ
ラスミドρｃｊ＜５ａ１を保有する大腸菌の培養物が最
高の発現率を示しく寄生細胞−個あたシ約３０万分子の
プロキモシン）、ｐＣＪイア０１を保有する大ＩＫ菌の
培秀中での発現が最低であることがわかった。更に、前
記の音波処理した無細胞抽出液を４ Ｊｌ尿素で処理し
、遠心分離した後上庶液をＳＤＳグルを含むｉＩ￥リア
クリルアミド電気泳動にかけた。移動した蛋白質をニト
ロセルローズフィルターに吸着させ、このフィルターを
前述の文献（西森ら、Ｇｅｎｅ誌）Ｋ記載の方法に従っ
て処理した後、オートラソオグラフイーにかけて分析し
た。 いずれの菌株の場合も標品プロキモシンに対応する帯が
観察された。プロキモシン帯の密度この実験で得られた
帯のそれとを比較するとｐＣＲ５０１を保有する大腸菌
が一細胞当り約３０万分子のプロキモシンを産生ずるこ
とが確認された。 各プラスミドによるプロキモシン合成能はシソオイムノ
アッセイの結果と一致して、ｐｃ’Ｒ５０１≧ｐＣＲ６
０ｌ＞７）ＣＲＴ ＯＬの順であった。 験 発現プラスミドを保有する大腸菌培養物を音波処理し、
８Ｍ尿素で処理した後に、尿素を除去するために２５彬
Ｉｆ重炭酸ソーダ（ｐ）／’ １０．０ ）に対して透
析した。続いて、５０ｒｎＪ１′１） リス−塩酸（ｐ
ｊ１７．５）に対して透析した後、０．４Ｍグリシン緩
衝液Ｃｐｌｉ２３）を加え、室温に１５分間保ち、プロ
キモシンの活性化を行った。 凝乳試験はフォルトマンの方法（Ｂ、 Ｆｏ ｌ ｔｍ
ａｎ 。 ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ ａｎａ ｃｈｙｍｏｓｉｎ
Ａｉｅｔｌｂｏｃｌｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
９．４２１ （１９７０））に従って実施した。この試
験で、ＬＯｔｎ、７のスキムミルク（Ｄｉｆ、ｃｏ ）
を３０“Ｃユで１００秒間内に嵯固する凝乳活性度を（
ｌキモシン単位：Ｃ（Ｊ）と定′５資した。各プラスミ
ドがプロキモシンを発現した大腸菌培養物抽出液につい
て、プロキモシンを活性化後（即ち、キモシンに変換後
）、凝乳活性度を測定すると、７＋ＣＲ５０’ｌの場合
９．３ ＣＵ ／ ｍｇ、ｐＣＲ’１０１の場合３．７
ＣＵ ／ ｒノ・ｙであった０尚＼発現プラスミドを
含有しない大腸菌培養物の抽出液は上記試験方法により
全く凝乳活性を示さなかった。」 〔■〕 明細書の“図面の簡単な説明″のＳの記載を、
以下のとお９訂正する。 （１）明細ギ４：第６５頁８行に、「Ｄ Ｎ Ａ配列を
示す。」とある後に、行を改めて、以下のとおり加入す
る。 「第５図はｐＯｃＴ３．ＥＩ）ｐＯｃｉ’２を作り、更
に７）ＯＣＴ ２よＩ） ｐ Ｔ ＲＥｌを構成する模
様を示す模式図である。 第６図はｐ ＯＣＴ ２とｐ ；３ Ｒ３２２からｐ
Ｔ ＲＬｌを構成する模様を示す模式図である。 第７図はｐＴｌぜ九°１から７ｙ Ｔ ＲＰ ｌを（１
４成する模様を示す模式図である。 第８図はｐＣＲ３０１とｐＴＲＥｌから７） Ｃ’ Ｒ
５０１を構成する模様を示す模式図である。 第９図はｐｃＲ３０１、ｐ Ｔ ＲＥ １、ｐ Ｔ Ｒ
Ｌｌからｐ ＣＲ６０，１を構成する模様を示づ゛模式
図である。 第１０図はｐｃＲ５０１とｐ ＴＲ１）ｌからｐｃＲ７
０１を構成する模様を示す模式図である。」ｃ Ｉｌ＋
］ （１）第２図を別添第２図のとおり訂正する。 （２）別添第５図、第６図、第７図、第８図、第９図及
び第１０図を補元する。 載 ）図 築５図
示すものである。 第２図は各種ベクター・プラスミド°の市１１μＨ１ｍ
１図を示す。 第３図は各Ｓ発現プラスミドの制限士市図を示す。 第４図はプラスミドｐ ＯＣＴ ２のｔｒｐプロモータ
ーの周りのＤＮＡ配列を示す。 萄許出１県人別府輝彦 茅３ ５′ＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧ
ＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴ丁ＴＧＣＧＣＣＧＡＤ ＴＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧ
ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＣＡ
ＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡ
ＧＣＧＧＧＣＴＴ下第４図 第１頁の続き ０発 明 者 日高真誠 東京都文京区西片２−１６−２１ 手続補正書 昭和５８年１１月１５日 特許片長′山 若 杉 オロ 夫 殿１、事件の
表示 喘ム８ＡＨイ４５８−３８４３９ 号 ２、発明の名称 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて修生プロキモ
ン／這１太子を犬賜閑内で兄現させる力詠、３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京ｉｌＳ杉並区堀の内１−５−２１名 称
別 Ｈ） 舜 彩（氏 名） ４代 理 人〒１０７ ６補正の対象 〔１′３ 明細書の“′発明の詳細な説明″の欄の記載
を、以下のとおり訂ＩＥする。 （１） 明細店第１５負１２〜１３行に、「アミノ酸
からなる。」とある後に、以下のとおり加入する。 「キモシンとして、キモシンＡとキモシンＢが存在する
ことが知られている。これらはヌクレオチド配列中、ア
ミノ酸コドン２８６位（ヌクレオチド８５７位）が異な
っており、キモシンＡではコドンＧＡＴであるところ、
キモシンＢではコドンＧＴＴであろう。」 （２）明細書第２ ｔｉｔ を行に、［ラジオイムノア
ッセイ法」とある後に、 「及ヒ蛋白買プロンティング法」 と加入する。 （３） 明細書第２７貞１４行と１５行の行間に、「
グルコース ５２ アンピシリン ５０〃曖 」 と加入する。 （４） 明ＩＩＩ ４Ｆ第２７頁下から３行Ｖｃ［ａ
ｃｉｄ ） Ｊとある後に、行を改めて、以下のとおり
加入する。 「形質転換 通冨の形質転換実験は５０μ９７ ｍｌのアニビゾリン
を含むＬ−培地中で、Ｎｏｒｇａｒａら、Ｇｅｎｅ３．
２７９ （１９７８）の方法に従う。」（５）明ハ′Ｉ
Ｉ官第３０貝ドから９行〜３行に、「プラスミド７）Ｏ
ＣＴ ２は・・・・・・・・・・塩基を竹っている。」
とあるを、以下のとｓ−９ｍＪ正する。 「フ０ラスミドｐＯｃＴ２の母体となるプラスミドｐＯ
ｃＴ３は、グラスミドｐノＪ ／？ ３２２のＥｃ。 Ｒ１部位にｔｒρプロモーターオペレーター、ｔｒ、ｐ
Ｌ、 ｔｒｐ ｌ’、′を含むＤ Ａ’ Ａ ｌｌｆ
片刃団１み込１れたシラスミドであり、これらは約５０
０地基対の大腸菌トリプトファンオペロン（Ｅ、 ｃＯ
ｌｉ ｔｒｐｏｐｅｒｏｎ ）を構成する。ｐ ＯＣ
７’ ：３プラスミドは大阪大学医学部松原謙−教授よ
り寄贈された。グラスミドｐＯｃＴ ３を１１．ｏＲｌ
で切断し、トリプトファンオペロンＤＮＡ断片を切シ出
し、切断末端ｒ逆向きに入れ換え、再びＴ４リガーゼを
用いてＬ″ｃｏＲＩ位に挿入するとｐＯｃ’Ｔ２ができ
あがる。従って、ｐＯＣｌ３とｐＯＣＴ２では転写方向
が逆向きになっている。ｐ ＯＣＴ３では転写方向が遂
時１捷わりであるところ、ｐＯＣｌ２では時計まわり（
５′位から３′位）である。ｐＯＣｌ”２からｐＯＣｌ
３を４δ成する模様を第５図に示す。ｐＯｃ’Ｔ２の制
限酵素地図は第２図に示す。」（６） 明細簀第３１
典ｌ〜３１テに、「プラスミド中の・・・・・・・・・
構成されている。」とあるを、削除する。 （７）明＋１＋ＩＩＩ書謁３１負９行に、「ｐＯＣＴ」
とあるを、 「ｐ’０ＣＴ２」 と訂正する。 （８） 明細書画３１頁末行に、「第２図に示される
。」とある後に、 ［”ｐＯＣＴ２からｐＴＲＥｌを構成する模様を第５図
に示す。」 と加入する。 （９）明細書第３２＠末行に、「時計回り」とあるを、 「遂時耐回り」 と訂正する。 （則 明細書第３６貞１１に、「紀２図に示す。」とあ
る後に、 Ｆ、ｐＯＣＴ２からｐＴ、ＲＬｌを構成する模様は第６
図に示される。」 と加入する。 旧） 明卸１書第３４頁２行に、「制限地図を第２図に
示す。」とあるを、 「制限酵累地図を第２図に示す。ｐＴＲＥｌがら７）Ｔ
ＲＰｌを構成する模様を第７図に示す。」と訂正する。 ｕｚ 明絹書第３４頁下から３行に、「３ｏ１を」と
あるを、 「３０１から」 と訂正する。 Ｏａ 明細書第３６貞９行に、「ことがわかる。」と
ある後に、 「第８図にｐ、 （、’ Ｒ３０１とｐＴＲＥｌから２
Ｃ１イ５０１を’ｈ’ｒ；成する模様を図示する。」■
加入１３・ｕ４１ 明細書第３６貞１１行に、「ヌク
レオチド配列は」とある後に、 「Ｍａｘａｍ −Ｇ１１ｂｅｒｔ法によｐ １？４析す
ると」と加入する。 （１５１明細書第３７負２〜３行に、ｒ産生する。」と
ある後に、 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ａ’；ｔｔ：Ｊｉ吊第１番目ないし第４番目のアミノ酸
を欠き、その代シに前孔コーディング配列に由来するメ
チオニン以下ｔｒｐ Ｅプロモーターがコードするアミ
ノ酸８個及びβ−ガラクシトシダーゼに由来する２個の
アミノ酸残基を有するン°ロギモシン類似蛋白質である
。」 と加入する。 ０６）°明細上第３８員１０行に、「出される。」とあ
る後に、 「第９図にｐＴＲＥｌ、ｐ Ｔ ＲＬ １、ｐＣＲ３０
１からｐ Ｃ’ Ｒ６０１を構成する模様を図示する。 」と加入する。 ０７） 明卸１害第３８頁１２行に、［ヌクレオチド
配列は」とある後に、 ｉ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により解析すると」
と加入する。 ０ａ 明細書第３９頁３〜４行に、「産生ずる。」と
ある後に、以下のとおり加入する。 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ｎ末端第１番目ないし第４第目のアミノ酸を欠き、その
代シに声記コーディング配列に由来するメチオニン以下
ｔｒｐ Ｌプロモーターがコードするアミノ酸６個及び
β−ガラクシトシダーゼに由来する２個のアミノ酸残基
を有するプロキモシン類似蛋白質である。」 （ｌ！＋ 明細書第３９０マ行に、「ｐｃｉ（３０ＬＪ
とあるを、 「ｐＣｊン５０１」 と訂正する。 （２υ、 明細書第３９真下から６行に、「ｐＣＲ３０
１Ｊとあるを、 ＦｐＣ）＜５０Ｌ１ と訂正する。 （２１１明細書第３９頁下から２行に、「調製する。」
とある後に、以下のとおシ加入する。 「このＩＮＮΔ断片によりプロキモシン遺伝子（第１図
）のヌクレオチド第１４番を切断するＢａｍＩＪＩ消化
によって除去されてしまったヌクレオチド配列が回復す
る。」 （２２） 明細書第４０頁１１行に、「見い出される
。」とある後に、 「徳１０図にｐＴＲｐｔ、ｐＣＲ５ｏ１がらｐＣＲ７０
１を構成する模様を図示する。」と加入する。 （２３）明細書第４０ＪＸ１２行に、「領域は」とある
後に、 ７ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によＩ） Ｍ析する
と」と加入する。 Ｉ２４）明細書第６４頁３〜４行Ｅｔｃ、「産生する。 」とある後に、以下のとおシ加入する。 「この産生されたプロキモシンは真正なプロキモシンの
Ｎ末端に開始コドンＡ ＴＧがコードするメチオニンが
付いているＮ末端メチオニルプロキモシンである。」 （ハ）明ａ＠第４１貞６行に「形質転換細胞Ｊとある後
に、 「を含む培養物（Ｌ培地中）の一部」 と刀■人する。 （２６） 明細店゛第４１貝９行に、「に接種して」
とあるを、 「中でＪ と訂正する。 Ｑ７） 明細書第４１頁下がら５行に、ラジオイムノ
法」とあるを、 「蛋白質プロッティング法」 と訂正する。 （支））明細督第４１真下から４行に、「手法に従って
」とあるを、 「手法あるいはラジオイムノ法に従って」と訂正する。 Ｃ１９ｉ 明細書第４２貞５〜６行に、「免疫学的手
法により」とあるを、削除する。 ３０）明細書第４２頁８行に、「以上の」とあるを、「
ラジオイムノアッセイ法による分析でも同様の結果が得
られた。これらの」 と訂正する。 （３１）明細書第６１真下から３行及び下から２行に、
夫々、ｌ’−３０１ｊとあるを、 ５ｏｒｌ と訂正する。 ＯＡ 明細書詑６２頁２行に、「３０１」とあるを、
１”５ｏｔ４ と訂正する。 Ｃ，（：３１ 明細書第６４頁３〜４行に、「温度で
予備培養・・・・・・・・・・・・移しかえ、」とある
を、「温度で一晩予備培養した。培養物の１πＥをＭ９
培地（１，ｏ＊）に移しかえ、」 と訂正する。 斡１ 明細書第６４貞８行〜床行に、「音波によシ・・
・・・・・・・・・産生ずることがわかった。」とある
を、以下のとおり訂正する。 「ｐｌｄＳＩ’（フェニルメナルスルホニル フルオラ
イド）１ｍＪｆを含有するｐ Ｂ Ｓ緩衝液（２０？７
Ｌ ｋｆリン酸ナトリウム緩衝剤中１り０１ｎ＃の塩化
ナトリウムを含むｐＨ７，０） ３ ｙｔｔ＋に）醋濁
させた。 コノ懸濁液１１Ｃ２５０ｔｎ、ＡＩのＥＤＴＡ （６０
μ／＝）と１０ｍＡ／ｌのリゾチーム（３０μｔ）を加
え、３０分間Ｏ℃に保温した。 生成したスフェロプラストを音波で破壊し、これに８Ｍ
尿紫（３０９祠）を加えた細胞処理溶解物（ｃｅｌｌ
１ｙｓａｔｅ ）を３７℃で１時間保温した。 ３０００γｍｐで３０分間遠心分離にかけた後、上漬液
をｐ ７１ Ｓ緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジ
オイムノアッセイ（ｂｉｎｒｉｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉ
ｔｉｖｅｒａｄ ｉ ｏ ｉ ｍｔｎｕｎｏα５ｓａｙ
’、前述の西森ら、Ｇ ｅ ｉｚ ｅ誌に詳述の方法）
を適用した。 この方法によって免疫沈殿したプロキモシン中の放射性
同位元素（＋２５Ｉ）の量をガ゛ンマー緑割量器で測定
した。一方、標品のプロキモシンの濃度を種々変化させ
て得られる検量線ケ作成し、と１１゜と比較して細胞抽
出液中のプロキモシンの量を４出した。この実験からプ
ラスミドρｃｊ＜５ａ１を保有する大腸菌の培養物が最
高の発現率を示しく寄生細胞−個あたシ約３０万分子の
プロキモシン）、ｐＣＪイア０１を保有する大ＩＫ菌の
培秀中での発現が最低であることがわかった。更に、前
記の音波処理した無細胞抽出液を４ Ｊｌ尿素で処理し
、遠心分離した後上庶液をＳＤＳグルを含むｉＩ￥リア
クリルアミド電気泳動にかけた。移動した蛋白質をニト
ロセルローズフィルターに吸着させ、このフィルターを
前述の文献（西森ら、Ｇｅｎｅ誌）Ｋ記載の方法に従っ
て処理した後、オートラソオグラフイーにかけて分析し
た。 いずれの菌株の場合も標品プロキモシンに対応する帯が
観察された。プロキモシン帯の密度この実験で得られた
帯のそれとを比較するとｐＣＲ５０１を保有する大腸菌
が一細胞当り約３０万分子のプロキモシンを産生ずるこ
とが確認された。 各プラスミドによるプロキモシン合成能はシソオイムノ
アッセイの結果と一致して、ｐｃ’Ｒ５０１≧ｐＣＲ６
０ｌ＞７）ＣＲＴ ＯＬの順であった。 験 発現プラスミドを保有する大腸菌培養物を音波処理し、
８Ｍ尿素で処理した後に、尿素を除去するために２５彬
Ｉｆ重炭酸ソーダ（ｐ）／’ １０．０ ）に対して透
析した。続いて、５０ｒｎＪ１′１） リス−塩酸（ｐ
ｊ１７．５）に対して透析した後、０．４Ｍグリシン緩
衝液Ｃｐｌｉ２３）を加え、室温に１５分間保ち、プロ
キモシンの活性化を行った。 凝乳試験はフォルトマンの方法（Ｂ、 Ｆｏ ｌ ｔｍ
ａｎ 。 ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ ａｎａ ｃｈｙｍｏｓｉｎ
Ａｉｅｔｌｂｏｃｌｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
９．４２１ （１９７０））に従って実施した。この試
験で、ＬＯｔｎ、７のスキムミルク（Ｄｉｆ、ｃｏ ）
を３０“Ｃユで１００秒間内に嵯固する凝乳活性度を（
ｌキモシン単位：Ｃ（Ｊ）と定′５資した。各プラスミ
ドがプロキモシンを発現した大腸菌培養物抽出液につい
て、プロキモシンを活性化後（即ち、キモシンに変換後
）、凝乳活性度を測定すると、７＋ＣＲ５０’ｌの場合
９．３ ＣＵ ／ ｍｇ、ｐＣＲ’１０１の場合３．７
ＣＵ ／ ｒノ・ｙであった０尚＼発現プラスミドを
含有しない大腸菌培養物の抽出液は上記試験方法により
全く凝乳活性を示さなかった。」 〔■〕 明細書の“図面の簡単な説明″のＳの記載を、
以下のとお９訂正する。 （１）明細ギ４：第６５頁８行に、「Ｄ Ｎ Ａ配列を
示す。」とある後に、行を改めて、以下のとおり加入す
る。 「第５図はｐＯｃＴ３．ＥＩ）ｐＯｃｉ’２を作り、更
に７）ＯＣＴ ２よＩ） ｐ Ｔ ＲＥｌを構成する模
様を示す模式図である。 第６図はｐ ＯＣＴ ２とｐ ；３ Ｒ３２２からｐ
Ｔ ＲＬｌを構成する模様を示す模式図である。 第７図はｐＴｌぜ九°１から７ｙ Ｔ ＲＰ ｌを（１
４成する模様を示す模式図である。 第８図はｐＣＲ３０１とｐＴＲＥｌから７） Ｃ’ Ｒ
５０１を構成する模様を示す模式図である。 第９図はｐｃＲ３０１、ｐ Ｔ ＲＥ １、ｐ Ｔ Ｒ
Ｌｌからｐ ＣＲ６０，１を構成する模様を示づ゛模式
図である。 第１０図はｐｃＲ５０１とｐ ＴＲ１）ｌからｐｃＲ７
０１を構成する模様を示す模式図である。」ｃ Ｉｌ＋
］ （１）第２図を別添第２図のとおり訂正する。 （２）別添第５図、第６図、第７図、第８図、第９図及
び第１０図を補元する。 載 ）図 築５図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、犬に、’ｍ’ｔｄ主細胞中で、プロキモシン遺伝子
を発現させる方法であって、 グロキモシンスヘ伝子を単離すること、転写プロモータ
ーおよび翻訳開始コドンを遺伝子に紹合し＠現プラスミ
ドを形成させること。 弁現プラスミドを形・ＬＡ転便により宿主＋ｉ４Ｊ胞に
心入することセして、 プロモモシンの尚レベルの発現を有する形負転夙された
１ｆｉｌＵ胞を選択することから７も児り、ｄ遺伝子は
クローン化されたプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａを含有す
る耐候えプラスミドに白米し、そしてプロキモシンのコ
ード配列の少なくとも第５誉目の翻訳コドンから配列の
末端（３６５食目ニドン）１でを有することをｔｒｆ徴
とする方法。 ２ 該用艮えプラスミドがｐｃｌｔ３０１ブラスミ ド
″′Ｃめり、僑王細廁が犬肋囚り、止り１ｃ６００ｒｋ
−、’ｎ’Ｌｔ、に白米し、転写７°ロモーターが大腸
菌ｔｒｐオペロン・プロモーターで七→キー各也ｉに）
祷−−゛パ ある酌、許請求の軛 囲糺゛・１項記載の方法。 ３．１該発現プラスミドがｐｃ８’５０１、ｐＣＲ６０
１又はｐｃＲ７０１でめる的、計ｕ’ｌｊｆ求の範囲第
１項記１匹の方法◎ ４、太ｉ％ 拍宿主細胞中でプロモーター）（伝子を発
現させる方法であって、 プロキモシン遺伝子を単＝＋ｈすること、該遺伝子から
欠落しているプロキモシンのコード配列部分？有する合
成ヌクレオチドを遺伝子に結合すること。 転写プロモーターおよび翻訳開始コドン（該合間ヌクレ
オチドに存在しない時）を遺伝子に結合し元りＬ７°、
、、？スミドを形成させること、発現プラスミドを形質
伝、喚（でニジ宿主細胞に導入することセして、 プロキモシンの、ｉ１５レベルの発現を有する形つば転
侠さ）′した細胞を選択することから成り、該遺伝子は
クローン化さｉ”ｔ、／こプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａ
全含有するｄ援えプラスミドに由来し、該甘酸ヌクレ
オチドは翻訳開始コドンを有していてもよいことを慣・
徴とする方法。 ５、該組換えプラスミドがｐｃＲ３０１プラスミドであ
シ、Ｗ主血胞が太ノ揚閑寿′、−とリエＣ６Ｃ６００ｒ
ｋに由来し％５写プロモーターが犬＋局ｔ＝ｔｒｐオペ
ロン・プロモーターで和参Ｆ寺台港≠−１，、ある’ｔ
Ｖ♂」−制氷の砲 ６、該発現プラスミドがｐｃｌｌＴＯｌである特許請求
の範囲第４項記柩の方法。 ７、 プロキモシン遺伝子とそれに作用的に結合したベ
クター力・ら成り、該ベクターはｐ Ｂ Ｒ３２２プラ
スミドに由来し、そして転写プロモーターとｉ’ｔ４４
訳開始コドンを含有する発現プラスミド。 ８、 該プロキモシン遺伝子がプロキモシンのコード配
ゲ１」のλ７言５着目のコドン力・ら配列の末尾−まで
（３６５，ｉ１目のコドン）のヌクレオチド配列であり
１．転写プロモーターが大腸しＪ ｔｒ ｐオペロン・
プロモーターであり、翻訳ｕｉ−１ミー１始コドンＧコ
ドンである７ｉ子♂ｔｒ＋ｎ求の範囲比７項ｄ己１ｊ戊
の発現プラスミド。 ９、訊プロキモシン遺伝子がプロキモシンのコード配列
の鳩五沓目のコドン〃・ら配列の末尾（３６Ｊｉ目のコ
ドン）までのヌクレオチド配列であ−リ、転写プロモー
ターが大腸ｆ酌ｔ ｒ ｐオペロン・プロモーターで
、 ｆ、’＋ 、１ 、：：、 ＊予≠≠
略あるｔ１許請求の範囲１７項記載の発現プラスミド。 １０、該翻訳ト丙始コドンがｔｒｐオペロン同ｔｒｐＥ
又はｔｒｐＬ領域に存在する特許請求の範囲第８項記載
の発現プラスミド。 １１、該プロキモシン遺伝子がその５′末端に於いて次
のＤＮＡ配列に結合されている脣許訪求の１尼囲ｇ１０
項記載の発現プラスミド。 ＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣ−３’１２、該プロキ
モシン遺伝子がその５′末端に於いて次のＤＮＡ配列に
結合されている特許請求の範囲第１０項記載の発現プラ
スミド。 ＧＴＧＧＡＡＴ’ｌ・Ｃ−３′ １３、ＬＦａ訳に４始コドンがｔｒｐオペロン内ｔｒｐ
Ｌ領域に存在する特許請求の範囲第９項記載の発現プラ
スミド。 １４、以８Ｑ’Ａ訳ＬＩｆｌ始コドンがプロキモシンコ
ード配列の先端に結合されている特許請求の範囲第１３
項記載の発現プラスミド。 １５、Ｚプロキモシン遺伝子がその５′末端に於いて次
のＤＮＡ配列に結合され、ている第１４項り上載の発現
プラスミド。 ５′ −ＡＡＧＧＧＴＡ’ｌ・ＣＧＡｉ’ＡＡＧＣＴＴＡＴＧ
−３’１６、 プロキモシンのコード叱己列の第１査
目のコドン（Ｇ、ＣＴ）かＧ：ｒｆＡ ａ ６ ｓ ４
目のコドン（ＡＴＣ）までのヌクレオチド配列から成
るプロキモシン遺伝子。 １７、 ε俵１番目のコドンの先端にＡＴＧコドンが
結合された特許請求の範囲１７項記載のプロキモシン遺
伝子。 ｌ＆ プロキモシンのコード自己夕１」の第５９升目の
＝ｒ ｒン（ＣＧＧ ）カラ第３６５：’ｉ目のコドン
（ＡＴ（、’）］でのヌクレオチド配列〃・ら成るプロ
キモシン遺伝子。 １９、 次の工程より成るｐＴｋＥ１プラスミドのｌ
ｉ４成方法。 α） ン０ラスミドｐＯｃＴ２をＥ Ｒ１でｆ、ｃ’
Ｂ分消Ｏ 化しアンピシリン耐性域圧近込Ｅｃ０７７１部位葡切断
する。 ｂ） 切１１された一本鎖ＤＮ’Ａ部分をＤｌゾＡポリ
メラーゼｖｃより修復する。 ｃ ） Ｔ、４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼヶ用いて・１
仮ぢれプヒ禾端を接合する。 ２０、 次の工程よジ酸るｐＴＲＬＩプラスミドの捕
取方法。 ａ） プラスミドｐ ＯＣＴ ２ ｆＥｃｏＲＩで柚化
し、史に、ｌヒｓａＩで部分（Ｐ化して縁状ＤＮＡ断片
を得る。 ｂ） 、ｖ状ＤＮＡにキナーゼ処理したＥｃｏＲＩリン
カ−を結合した後、ＥｃｏＲＩで切断してＤ Ｈ’ Ａ
断片（１ンを作る。 Ｃ） シラスミドｐＢＲ３２２をＥ ｃ ｏ ＩＩ Ｉ
テｒｎ化し、絖いてｉＶＩ Ａ Ｔ Ｅ Ｂ Ａ
Ｐで処理してＤＮＡ断片（２）を作る。 ｄ） ＤｉＶＡ断片（１）と（２）をＴ、ＤＮＡリガー
ゼにより結合する。 ２１、 次の工程より成るｐＴＲＰ１ｆラスミドの信
成方法。 ａ） シラスミドｐＴＲＥ１をＨｐ ａ Ｉ及びＣ１ａ
Ｉ−Ｔｌ化して、ＤＮＡ断片（３１ｆ １乍る。 ｂ）、ｐＴＲＥｌをｌｉ ｐ ａ Ｉ及びＴ ａ ｑ
Ｉで消化してＬ）ＮＡ断片（４）を作る。 ｃ） ｊ）ＨＡ断片（３）と（４）をＴ４ＤＮＡリガー
ゼにより結付する。 ２２、 次の工程よ勺成るｐｃＲ５０１プラスミドの
４．４成方法。 α） プラスミドｐｌ″ｕｇｔをＡ’ ｃ ｏ ＲＩで
切断し、Ｓｔヌクレアーゼにより一不頌幇８分を除去し
て７線状ＤＮＡを作る。 ｂ）、ＥｃｏｌビＩリンカ−を逐ヲｉ、汚して、Ｅｃｏ
ｌｌＩ及び５ａｌＩで消化してＤ Ａ／ Ａ断片（ａ）
を作る。 Ｃ） プラスミドｐに’＃’３０１を−Ｋ ｐ ｎ Ｉ
とＥｃｏＲＩ消化してＤ Ｈ’ Ａ Ｉ、４［片＜ｂ＞
を＋’Ｆる。 ｄ） ｃ）とは別にｐｃＲ３０１ｉ７ｉ＜ｐｎＩと５ａ
ｌｌで消化してＤＮＡ断片（Ｃ） ｆｆｉ １−’ｌ：
る。 ｇ） ＤＡ７Ａ断片（（Ｚ） 、 （ｂ） 、 （（
ｉ）を共にＴ４ＤＮＡリガーゼで運１１．．：する。 ２３、 仄の工程より成るｐｃ；７＜６０１プラスミ
ドの栴成方法。 α） プラスミドｐｌ’ＪＩＥ１をＨｐαＩそして５ａ
ｌｌで消化してＤＮＡ断片Ｃｄ）をｒトる。 ｂ） プラスミドｐ Ｔ Ｉ：ｔＬ １をＨｐ ａ Ｉ
そしてＥｃｏＲＩで消化してｌ）＃’ Ａ ７ｉ片（ｇ
）ｋ作る。 Ｃ） プラスミドｐｃノ１３ｏｘをに−ｐ ｎ Ｉとル
”ＣＯノンＩで消化してＤＮＡ断片（ｂ）を又Ｋｐｎｌ
と５ａｌｌで消化して１）、ＮＡＩＥｉ「片（Ｃ）を・
１乍る。 ｄ） ＤＮＡ断片（ｂ） 、 （Ｃ） 、 （の、（
ｇ）ｉ共にｉ’、 ＤＮＡリガーゼで連結する。 ２４、次の工程よ勺成るｐｃＥ７０１プラスミドの７＋
ｌＩ；）筑方法。 ａ） プラスミドｐｌ’ＲＰ１を１ｉｉｎｄ■と５ａｌ
Ｉで消化しＤＮＡｊ踵片Ｖ）を作る。 ｂ） プラスミドｐｃＲ３０１を５ａｌＩで消化し、Ｂ
ａｍＨＩで部分羽化しテＪ−）Ｎ Ａ 断片（ｇ）を作
る。 ｄ） 仄のヌクレオチド配列を・ｂする合成オリゴヌク
レオナト（ＤＩ’ＪＡ断片（／ｌ））を得る。 ５１ ３′ＡＧＣ
２”ＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣ：ＡＣＣＡＧｇ）
１）ＨＡ断片（イ）、 （ｇ） 、 （ｈ）を共にＴ４
．ＤＮＡリガーゼで連結する。 ２５、 倣エイσトに受託奇岩Ｆ’ＥＲＭｆ３ρ２乙
２牙として寄託された大腸菌中に見い出される組換えプ
ラスミド。 ２６、微工研に受託奇岩”’ Ａ Ｊｅ Ｍ ＢＰ ２
６３ ｑとして脊部された犬ｊ助閑中に見い出される組
→泉えプラスミド。 ２７、彼工研に受託：１．’ｆ号ｐ゛ｇ ｔｔｙ４３
Ｐ ２６ ＜％として薔託されまた大腸国中に児い出さ
れる組づ殉えプラスミド。 ２８、 犬Ｊ腸菌宿王泊軸碗中で、プロキモシン遺伝
子を発現右せる手法にょシプロ卑モシンを生産スる方法
であって、 プロキモシン遺伝子を単離すること、 転写プロモーターおよび翻訳開始コドンを遺伝子に請甘
し、発現シラスミドを形成させること、発現プラスミド
を形貿転換に上りイ占王７′１■胞に導入すること、 プロキモシンの間レベルの発現を有する形質転奥された
１１闘己をＪ８択することそして細胞を栄養培地で培養
することがら）Ｊ４ｉ １）１．戊プロキモシン遺伝子
はクローン化されたプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａ ｆ
含有する組換えプラスミドに由来することを特徴とする
方法。 ２９、該、：且侠えプラスミドがｐＧＲ３０１プラスミ
ドであり、イ６主剤ｋｌが大腸菌Ｌ”、ｃｏｌｉＣ６０
０ｒ７６ ｍｋＫ由来し、転写プロモーターが大ｇ％７
ｔｒｐオペロン・プロモーターでｉ務芒ヰ４・・・
−“へ “ある特許ＭＷ求の力・巳囲紀２８項
記載の方法。 ３０、 阪元税プラスミドがｐ ＣＡｓ２１− ｐ
ＣＲ６０１そしてｐｃＲＴＯｌよりなる群〃・ら選択さ
れ、ｉＪ、イａ主＋＋＋ｉＢ Ｉｌｊ！ＩＩが大腸菌Ｅ
、 Ｃｏ１１ Ｃ６００？’に−７７１４に白米する
待計請求の範囲用２８狽記載の方法。 ３１、該プレ貿仏換された細胞が倣工研受託・Ｍ号ＦＥ
ＲＭｅＰ２−６’２． 、 Ｆ Ａ’ Ｒｉ”ｒ４
、Ｂｐ ２乙３％ ｖＦ゛ル’ＲＭ３Ｐλ６４
蜀からなる群刀・ら選は几る薔託大ノ肋−の中に見い出
されるｔｔ’ｓ’ ｔｉｌ−訓示のｌ記囲褐２８項記ｒ
、病の方法。 ３２、 時２ｉ′Ｆ、；Ｉ′ｆオ〈の範囲ぶ１４２８
項記載の方法によって生産されたプロキモシン。 ３３、 プラスミドｐＣＥ５０１ 、 ｐＣＲ６０１
そしてｐｃＲＴＯｌ力・らなる（ｉ＋ＥＪら込ばれる発
現プラスミドを含有しプロキモシンを箆圧することがで
さる大腸菌。 ３４、倣工研に受託食号Ｆル゛ｌビｌＷ −Ｂ Ｐ ２
ど２号として寄託された大腸菌。 ３５、微工研に受託：諭告ＦＥＢ、Ｍ Ｂ Ｐ ２６３
号としてを託された犬ｊ助菌。 ３６、微工研に受託番号ｐＥ ｉｔＭ Ｆ３１） ’２
６４号として寄託された大腸菌。
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| JP58038439A JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
| DK136184A DK136184A (da) | 1983-03-09 | 1984-02-29 | Fremgangsmaade til udtrykkelse af et gen, der koder for prochymosin, i e.coli-vaertsceller og udtrykkelsesplasmid til brug ved fremgangsmaaden |
| AU25357/84A AU572827B2 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Recombinant plasmid containing prochymosin coding gene |
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| NZ20741484A NZ207414A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Expression of prorennin (prochymosin) using recombinant plasmids in an e. coli host |
| FI840918A FI86886C (fi) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e. coli |
| BR8401049A BR8401049A (pt) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Processo para expressar um gene de codificacao de proquimosina em celulas hospedeiras de e.coli.plasmideo de expressao,gene de proquimosina e processo para fazer plasmideos |
| IE55984A IE57264B1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Novel expression plasmids and their use in the method for expressing prochymosin coding gene in e.coli |
| AR29597484A AR241795A1 (es) | 1983-03-09 | 1984-03-09 | Metodo para expresar un gen que codifica proquimosina; plasmidos aplicados en ese metodo; metodo para obtenerlos; el gen incorporado a esos plasmidos. |
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| JP58038439A JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
Publications (2)
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