JP2007259787A - 遺伝子発現制御ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの提供。
【解決手段】真核生物のチアミン二リン酸（ＴＰＰ）結合型リボスイッチにおけるステムループ形成領域Ｐ１からＰ５からなるＴＰＰ結合構造形成領域を含み、５'末端及び３'末端が、それぞれ、前記ＴＰＰ結合型リボスイッチにおけるＴＰＰ存在下の５'スプライス部位及び３'スプライス部位である本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド１は、図１に示すとおり、発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に配置されることにより、ＴＰＰ又はその類似体の非存在下において前記遺伝子の発現を抑制し、ＴＰＰ又はその類似体の存在下において前記遺伝子の発現を誘導する。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子発現制御ポリヌクレオチドに関する。

リボスイッチとは、一般的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５'−非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）に見られる構造エレメントであって、ここに小型の代謝物が結合することにより遺伝子発現が制御される。現在知られているすべてのリボスイッチは、リボスイッチ（ＲＮＡ）と前記代謝物との結合にタンパク質が関与しないという共通の特徴を有する（非特許文献１参照）。

リボスイッチは、最初に大腸菌の遺伝子発現制御機構において見出され、現在では、原核生物に広く存在することが確認されている（非特許文献２及び特許文献１参照）。原核生物におけるリボスイッチの多くは、代謝物の結合により遺伝子発現を“負”に制御する。この負の制御は、大きく分けて２つの方式で行われる。一方は、転写のターミネータ構造を形成することにより完全長ｍＲＮＡの産生を阻害する方式であり、他方は、完全長ｍＲＮＡは産生されるが、その翻訳開始を阻害する方式である。リボスイッチに結合する代謝物は多岐にわたり、例えば、グアニン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、リジン、チアミン二リン酸（ＴＰＰ）、アデニン、グルコサミン‐６リン酸（Ｇｌｃ６Ｐ）、グリシンなどが知られている（非特許文献１参照）。

真核生物における最初のリボスイッチは、麹菌アスベルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae、以下、Ａ．ｏｒｙｚａｅという。）のチアミン合成遺伝子（ｔｈｉＡ）のプロモーター領域（特許文献２参照）の５'−ＵＴＲにおいて見出されたＴＰＰ結合型リボスイッチである。このＡ．ｏｒｙｚａｅのＴＰＰ結合型リボスイッチは、原核生物の多くのリボスイッチと同様にＴＰＰが結合すると遺伝子発現を負に制御するものであるが、その制御方式は、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＴＰＰ結合型リボスイッチにはスプライシングが関与する点で原核生物のリボスイッチとは異なる（非特許文献３及び４参照）。その制御方式の模式図を図２に示す。同図に示すとおり、ＴＰＰ非存在下においては、リボスイッチが存在するイントロンは正常にスプライシングされ、成熟ｍＲＮＡが産生され、タンパク質が産生される。一方、ＴＰＰ存在下においては、ＴＰＰの結合によりスプライシングの位置が変化し、未成熟のｍＲＮＡが産生され、タンパク質産生が阻害（抑制制御）される。

Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子のプロモーター領域（７２９ｎｔ）を図３Ａに示す。同図において、ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１と同一の配列であり、左の番号は翻訳開始点の１つ手前を−１としたときの位置を示す。同図において、四角の囲み（−５２８〜−５２２）が推定上のＴＡＴＡボックスであり、“○”を付した位置（−４７５）が推定上の転写開始点である。前記ｔｈｉＡ遺伝子の５'−ＵＴＲには、２つのイントロン（イントロン１及びイントロン２）が存在するが、同図に、それぞれ、一重下線及び二重下線で示す。前記イントロン２は、０．３ｋｂにわたる大きなイントロンであり、このイントロン２がＴＰＰ結合型リボスイッチとして機能する。すなわち、ＴＰＰ非存在下では、同図において“*”を付した“ｇｔ”が５'スプライス部位として機能する正常なスプライシングが起こり、イントロン２全体が切り出される。しかし、ＴＰＰ存在下では、前記５'スプライス部位の８５ヌクレオチド下流の同図において“**”を付した“ｇｔ”が５'スプライス部位として機能するスプライシングが起こり、未成熟ｍＲＮＡが産出される（図２参照）。このスプライシング位置の変化は、図３ＡにおいてＰ１からＰ５で示すステムループ形成領域が図３Ｂに示すような特殊な二次構造をとるためであると考えられている。ステムループ形成領域Ｐ１からＰ５は、バクテリアのＴＰＰ結合型リボスイッチと真菌類のＴＰＰ結合型リボスイッチで保存されている。特に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４及びＰ５ステムループ形成領域は、例えば、図４に示すとおり、大腸菌とＡ．ｏｒｙｚａｅを含む真菌類とでアライメントすることにより、明確に認識できる（非特許文献２のFigure1、非特許文献３のFig.1及びFig.4、並びに、非特許文献４の図３参照）。
特表２００６−５０００３０号公報 特開２００４−２５４６７０号公報 Tucker, B.J. and Breaker, R.R. "Riboswitches as versatile gene control elements" Curr. Opin. Struct. Biol. vol.15, 342 (2005) Winkler, W. et al. "Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression" Nature, vol.419, 952, (2002) Kubodera, T. et al. "Thiamine-regulated gene ezpression of Aspergillus oryzae thiA requires splicing of the intron containing a riboswithc-like domain in the 5'-UTR" FEBS Lett., vol.555, 516 (2003) 窪寺隆文、"転写因子を介しない新規な糸状菌の遺伝子発現制御機構"、第４回糸状菌分子生物学コンファレンス（２００４年１１月４日、５日）、要旨、オンライン<http://www.biochem.osakafu-u.ac.jp/・fmbsj/4thprogram-J.html>

現在のところ、真核生物のリボスイッチにおいて、“正”の制御をするリボスイッチは存在しない。また、バクテリアのリボスイッチの一部には、正の制御をするものもあるが（非特許文献１参照）、ＴＰＰ結合型リボスイッチに関しては、バクテリアにおいても正の制御をするものは存在しない。

したがって、本発明は、ＴＰＰ（チアミン二リン酸）結合型リボスイッチであって正の制御が可能な遺伝子発現制御ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、真核生物のＴＰＰ結合型リボスイッチにおけるステムループ形成領域Ｐ１からＰ５からなるＴＰＰ結合構造形成領域を含み、５'末端及び３'末端が、それぞれ、前記ＴＰＰ結合型リボスイッチにおけるＴＰＰ存在下の５'スプライス部位及び３'スプライス部位であり、発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に配置されることにより、ＴＰＰ又はその類似体の非存在下において前記遺伝子の発現を抑制し、ＴＰＰ又はその類似体の存在下において前記遺伝子の発現を誘導するポリヌクレオチドである。

本発明者らは、上述したとおり、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターが、ＴＰＰによって負の制御が可能なプロモーターであること及び前記負の制御がＴＰＰ結合型リボスイッチによるものであることを見出した（特許文献２、非特許文献３及び４）。本発明者らは、さらに、前記ＴＰＰ結合型リボスイッチを改変して正の制御に利用することの着想を得て鋭意研究を重ね、負の制御の原因となる領域、すなわち、上述したイントロン２（図３Ａの二重下線部）のうち、ＴＰＰ存在下で切り取られずに残る部位を削除すればＴＰＰによる正の制御が可能となることを見出し、本発明に到達した（図１参照）。

本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドによれば、ＴＰＰ又はその類似体による正の制御が可能であるから、例えば、遺伝子発現誘導が著しく容易となる。菌体を用いて有用タンパク質を産生させる場合、培養初期には前記有用タンパク質の産生を抑制し増殖を優先させ、十分な菌体密度に達した時点でタンパク質の産生を開始することが好ましい場合がある。従来の負の制御のリボスイッチを使用してこのような遺伝子発現誘導をする場合、発現抑制のためにあらかじめチアミンなどを加え、発現誘導したい所望の時間でそのチアミンなどを除去することとなる。一旦添加したチアミンなどを環境下から速やかに除去することは困難がともなう。しかしながら、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドであれば、チアミンなどを加えるという簡便かつ迅速な作業で遺伝子発現を誘導でき、効率的な目的タンパク質の生産が可能となる。

また、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドによれば、ＴＰＰやチアミン、チアミン一リン酸などにより遺伝子発現誘導が可能であるから、例えば、生体に適用しても安全性の点で問題がなく、ヒトや動物などの生体における医療分野においても利用可能である。

本発明の一態様において、前記ＴＰＰ結合構造形成領域は、配列表の配列番号１の４９７番目から６６９番目で表されるヌクレオチド配列若しくは前記配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列又はそれらの相補配列であることが好ましい。

また、本発明のさらなる態様において、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、
（１）配列表の配列番号２又は１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号２又は１１で表されるヌクレオチド配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、ＴＰＰ若しくはその類似体を結合可能であるポリヌクレオチド、又は、
（３）前記（１）若しくは（２）のポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドである。

本発明の遺伝子ベクターは、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドを含むベクターである。

本発明の細胞は、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド又は本発明の遺伝子ベクターが導入された細胞である。

本発明の遺伝子発現制御方法は、発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドが組み込まれた遺伝子が導入された細胞又は生命体を準備する工程、及び、前記遺伝子の発現を誘導する場合に、ＴＰＰ又はその類似体を投与する工程を含む遺伝子発現制御方法である。

以下に、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドについて説明する。

本発明において、ＴＰＰ結合型リボスイッチとは、上述のとおり、転写されたｍＲＮＡにタンパク質が介在することなくＴＰＰ又はその類似体が結合することで遺伝子発現が制御されるＲＮＡエレメントをいう。上述のとおり、天然型ＴＰＰ結合型リボスイッチは、現在のところ、すべて負の制御を行うリボスイッチである。前記真核生物のＴＰＰ結合型リボスイッチとしては、特に制限されないが、例えば、イントロンであって、ＴＰＰの存在下でスプライシングの位置が変化して未成熟なｍＲＮＡを産出するものが挙げられる。前記真核生物のＴＰＰ結合型リボスイッチとしては、例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅを含む糸状菌のＴＰＰ結合型リボスイッチが挙げられ、より具体的には、上述のとおり、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡの５'−ＵＴＲにおけるイントロン２（図３Ａの二重下線部、配列表の配列番号１の第３９２番目〜第７１２番目）が挙げられる。

本発明において、ＴＰＰ結合構造形成領域とは、ＴＰＰ結合型リボスイッチにおけるＰ１からＰ５のステムループ形成領域からなるものである。前記Ｐ１からＰ５のステムループ形成領域は、図４に示すとおり、バクテリア及び真菌類で保存された領域であって、ＴＰＰ存在下で図３Ｂに示すような二次構造をとると考えられる領域である。Ｐ１からＰ５のステムループ形成領域は、例えば、図４に示すように当業者に公知のソフトウエア又は方法によりアライメントすることで決定でき、又は、当業者に公知のソフトウエアを使用して図３Ｂに示すような二次構造をとるか否かを調べるにより決定することもできる。なお、ステムループ形成領域Ｐ３は、図４に示すとおり、様々な長さを示す領域であるが、例えば、その他のＰ１、Ｐ２、Ｐ４及びＰ５のステムループ形成領域をアライメントして特定することにより、２つのＰ２領域の間の領域として前記Ｐ３ステムループ形成領域を特定することができる。前記Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡのイントロン２におけるＴＰＰ結合構造形成領域は、配列表の配列番号１の４９７番目から６６９番目である。

本発明において、前記ＴＰＰ結合構造形成領域は、ＴＰＰを結合できる範囲で、野生型のＰ３ステムループ形成領域以外の領域のヌクレオチド配列が、１個から数個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列であってもよい。また、Ｐ３ステムループ形成領域については、上述のとおり、より多くの塩基の欠失などが可能であり、ＴＰＰを結合できる範囲で、野生型のＰ３ステムループ形成領域のヌクレオチド配列が、例えば、１個から１００個の範囲の塩基、例えば、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、４０個又は８０個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列であってもよい。ＲＮＡがＴＰＰを結合するか否かは、公知の方法で調べることができる。例えば、標識ＲＮＡをＴＰＰ存在下及び非存在下でアルカリ処理又はＲＮａｓｅによる部分処理し、その処理試料を電気泳動して切断部位の変化し比較することで、ＴＰＰの結合を確認することができる。

本発明において、５'スプライス部位及び３'スプライス部位とは、スプライシングにより切り出される領域の５'側及び３'側の少なくとも２塩基、好ましくは、２塩基である。したがって、前記Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡのイントロン２において、ＴＰＰ存在下における５'スプライス部位は、例えば、図３Ａにおいて“**”を付した“ｇｔ”（配列番号１の第４７７番目及び第４７８番目）であり、３'スプライス部位は、例えば、“ａｇ”（配列番号１の第７１１番目及び第７１２番目）である。

本発明において、ＴＰＰの類似体とは、例えば、チアミン、チアミン一リン酸、ピリチアミン又はこれらの塩などの公知の類似体が挙げられる。チアミン（ビタミンＢ１）チアミン一リン酸、ＴＰＰなどは、生体にとって安全である。したがって、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、細胞や生命体に適用可能である。また、前記ＴＰＰ結合構造形成領域に結合可能であれば、ジセチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、プロスルチアミン、および、ベンフォチアミンなどのチアミン誘導体並びにこれらの塩を使用してもよい。

本発明において、遺伝子の転写領域とは、前記遺伝子がタンパク質である場合、翻訳領域のみならず、５'及び３'の非翻訳領域を含む領域である。

次に、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの製造方法について説明する。本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、前記ＴＰＰ結合構造形成領域の５'側にＴＰＰ存在下における５'スプライス部位を配置し、３'側にＴＰＰ存在下における３'スプライス部位を配置することで製造することができる。これらの配置は、最も簡単には、図２で示すような真核生物のＴＰＰ結合型リボスイッチの場合、イントロン部分からＴＰＰ存在下で切り取られず残る領域を削除することで、図１に示すような本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド１とすることができる。例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡのイントロン２の場合、配列表の配列番号１の第３９２番目〜第４７６番目の領域を削除することで本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドとすることができる。

本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの製造方法において、前記５'スプライス部位及び／または３'スプライス部位と前記ＴＰＰ結合構造形成領域との間の領域に欠失、置換若しくは付加を施すことで、ＴＰＰ存在下のスプライシング効率や発現誘導効率を向上させたり、ＴＰＰ非存在下の発現抑制効率をより向上させたりすることができる。前記イントロン２に由来する本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドにおいて、５'スプライス部位とＴＰＰ結合構造形成領域との間の領域に５塩基（配列表の配列番号１の第４８４番目〜第４８８番目）の欠失を導入し遺伝子発現誘導効率を向上させた一例が、配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列からなる本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドである。

したがって、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、好ましい一態様として、
（１）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、ＴＰＰ若しくはその類似体を結合可能であるポリヌクレオチド、又は、
（３）前記（１）若しくは（２）のポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドである。前記欠失、置換若しくは付加される塩基数としては、上述のとおり、例えば、Ｐ３ステムループ形成領域以外の領域であれば、１個から数個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個であり、Ｐ３ステムループ形成領域であれば、例えば、１個から１００個の範囲の塩基、例えば、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、４０個又は８０個である。また、ＲＮＡがＴＰＰを結合するか否かは、上述のとおり、公知の方法で調べることができる。

また、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドのその他の例として、前記イントロン２から配列表の配列番号１の第３９２番目〜第４７６番目の領域を削除し、さらに、５'スプライス部位とＴＰＰ結合構造形成領域との間の領域に９塩基（配列表の配列番号１の第４７９番目〜第４８７番目）の欠失を導入し遺伝子発現誘導効率を向上させた配列表の配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。したがって、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、その他の態様として、（１'）配列表の配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（２'）配列表の配列番号１１で表されるヌクレオチド配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、ＴＰＰ若しくはその類似体を結合可能であるポリヌクレオチド、又は、（３'）前記（１'）若しくは（２'）のポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドである。前記欠失、置換若しくは付加される塩基数としては、上述のとおりである。

本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの起源となる真核生物のＴＰＰ結合型リボスイッチは、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡのイントロン２に制限されず、当業者は、上述の記載に基づき、その他のＴＰＰ結合型リボスイッチに基づき本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドを製造することができる。

次に、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの使用方法について説明する。本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドは、発現制御をする遺伝子の転写領域の任意の箇所に挿入して使用することができる。挿入箇所としては、５'−ＵＴＲが好ましい。例えば、まず、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドを任意のプロモーターの下流に連結させ、さらにその下流に目的タンパク質をコードする遺伝子、さらに下流に任意のターミネータを連結したベクターを構築する。次に、このベクターを任意の宿主細胞に導入し、遺伝子導入細胞を得る。そして、この遺伝子導入細胞を十分増殖させた時点でＴＰＰ又はその類似体を添加し、効率的に目的タンパク質を産生させる。前記ベクターを導入する宿主細胞は、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドにＴＰＰ又はその類似体が結合した場合にスプライシングが生じる真核細胞であれば、特に制限されず、例えば、ヒト、動物、植物、真菌の細胞が挙げられ、前記真菌としては、例えば、糸状菌、アスベルギルス属の菌、及び、Ａ．ｏｒｙｚａｅが挙げられる。

次に、本発明の遺伝子ベクターについて説明する。本発明の遺伝子ベクターは、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の遺伝子ベクターの１つの態様としては、任意の遺伝子（例えば、タンパク質の遺伝子）を発現させるための発現ベクターであって、任意のプロモーター、その下流に配置される本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド、さらにその下流に発現目的の遺伝子をクローニングするクローニング部位、及び、さらにその下流に任意のターミネータを備え、ＴＰＰ及びその類似体により正の発現制御を受けるベクターが挙げられる。本発明の遺伝子ベクターのその他の態様としては、特定の遺伝子（例えば、タンパク質の遺伝子）を発現させるための発現ベクターであって、任意のプロモーター、前記特定遺伝子、任意のターミネータをこの順に含み、この遺伝子の転写領域内のいずれかに本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドが配置され、ＴＰＰ及びその類似体により正の発現制御を受けるベクターが挙げられる。本発明の遺伝子ベクターは、例えば、必要に応じて目的の遺伝子を連結させ、任意の真核生物細胞に導入し、上述のようにタンパク質の産生などに使用できる。前記プロモーターやターミネータは、導入する細胞の種類に応じて適宜選択できる。本発明の遺伝子ベクターを導入する細胞の例は、上述のとおりである。

したがって、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド又は本発明の遺伝子ベクターが導入された細胞は、本発明の一態様を構成する。前記ポリヌクレオチド又はベクターを導入する方法は、特に制限されず。導入目的の細胞に応じた従来公知の遺伝子導入方法を選択できる。さらに、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド又は本発明の遺伝子ベクターを含み、必要に応じて、取扱説明書を含む遺伝子発現制御のためのキットもまた、本発明のその他の態様を構成してもよい。

本発明の遺伝子発現制御方法は、発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドが組み込まれた遺伝子が導入された細胞又は生命体を準備する準備工程、及び、前記遺伝子の発現を誘導する場合に、ＴＰＰ又はその類似体を投与する誘導工程を含む遺伝子発現制御方法である。前記準備工程は、例えば、上述したとおり、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド及び所望の遺伝子（例えば、タンパク質の遺伝子）を含むベクターを細胞に導入する工程などが挙げられる。前記誘導工程において、ＴＰＰ又はその誘導体の投与量は、適宜調節することができる。上述のとおり、チアミン（ビタミンＢ１）チアミン一リン酸、ＴＰＰなどは、生体にとって安全であり、また、水溶性である点で、大量の投与も可能である。本発明の遺伝子発現制御方法は、例えば、タンパク質の誘導時期を細胞の増殖の程度に応じて調節することが可能なタンパク質の産生方法に使用できる。また、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドが組み込まれた遺伝子が導入された細胞をヒトや動物の目的患部に導入し、ＴＰＰ又はその類似体を効果的かつ集中的に送り込むことにより有用タンパク質を選択的に発現させて治療効果を高めるなど、医療分野にも適用可能である。

本発明は、ＴＰＰ結合型の真核生物のリボスイッチについて言及しているが、ＴＰＰ以外の代謝物結合型の真核生物のリボスイッチでも、ＴＰＰ結合型と同様に、イントロン部分に存在している場合がある。したがって、ＴＰＰ以外の代謝物結合型の真核生物のリボスイッチを用いて得られる遺伝子発現制御ポリヌクレオチド、遺伝子ベクター、これらが導入された細胞、及び、これらを用いた遺伝子発現方法も、本発明の一態様となりうる。

以下に、実施例を用いて本発明を説明する。

配列表の配列番号２で表される本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドによるレポーター遺伝子の遺伝子発現制御を、Ａ．ｏｒｙｚａｅ細胞内で確認した。

（プラスミドｐＮＧ１の作成）
プラスミドｐＮＧ１は、図５の模式図に示すとおり、麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅへの形質転換用選択マーカーである“ｎｉａＤ”遺伝子（硝酸還元酵素遺伝子）［Ｍｏｌ.Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ., ２１８, ９９, １９８９］、レポーター遺伝子である大腸菌の“ｕｉｄＡ”遺伝子（β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子）［Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃｔａｄ. Ｓｃｉ., ８３, ８４４７, １９８６］、及び、前記ｕｉｄＡ遺伝子の下流に配置されたＡ．ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢ遺伝子ターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を含むプラスミドである。ｐＮＧ１は、ｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドｐＵＮ１［Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ６１, １３６７, １９９７］のＳａｌＩ−ＳｐｈＩサイトに、ＰＣＲ法により増幅したｕｉｄＡ遺伝子とその下流に位置するａｍｙＢ遺伝子ターミネータとを含むＤＮＡ断片を挿入して作成した。前記ＰＣＲは、プラスミドｐＧＡＰＧ１［Ｃｕｒｒ. Ｇｅｎｅｔ., ２２, ８５, １９９２］を鋳型として、ＳａｌＩサイトを付加した上流プライマーＳａｌｕｓ（５'-ｇｇｔｃｇａｃａｔｇｔｔａｃｇｔｃｃｔｇｔａｇａａａｃｃｃｃ-３'：配列番号３）及びＳｐｈＩサイトを付加した下流プライマーＳｐｈｕａ（５'-ｃｃｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔａｔａａｔａｇａｃｔａｇｃｇ-３'：配列番号４）を用いて行った。

（ｔｈｉＡ遺伝子プロモーター領域の改変）
上述したとおり、野生型Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子プロモーター領域のイントロン２（図３Ａの二重下線部）は“負”の制御を行うＴＰＰ結合型リボスイッチであるが、このリボスイッチを改変することで、“正”の制御を行うリボスイッチ（配列表の配列番号２）とした。具体的には、図３Ａに示す配列表の配列番号１において、第３９２番目〜第４７６番目を削除し、さらに、第４８４番目〜第４８８番目を削除した改変ｔｈｉＡ遺伝子プロモーター領域を作成した。

前記改変は以下のようにして行った。まず、野生型ｔｈｉＡ遺伝子プローター領域（配列表の配列番号１）を有する鋳型（例えば、プラスミドｐＮＧＴＨ［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ., ５５５, ５１６, ２００３］）から前記ｔｈｉＡ遺伝子プローター領域の全長を増幅可能な１組のプライマーＰｐｔｒｓ３（配列番号５）及びＰｐｔｒａｓ１（配列番号６）、並びに、改変部位特異的変異導入用プライマーＦ−Ｏｎ１（配列番号７）及びＲ−Ｏｎ１（配列番号８）を準備した。なお、Ｆ−Ｏｎ１とＲ−Ｏｎ１とは相補的である。
Ｐｐｔｒｓ３：ｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｃａｇａｃｇｇｇｃａａｔｔｇａｔｔａｃｇ
Ｐｐｔｒａｓ１：ｃｃｇｔｃｇａｃｇｔｔｔｃａａｇｔｔｇｃａａｔｇａｃ
Ｆ−Ｏｎ１：ｃｃａａａｃｃａａｃｃｇａｃａａｔｇｔａｔｃｔｔａｃｇｔｃｔｔｔｇｇ
Ｒ−Ｏｎ１：ｃｃａａａｇａｃｇｔａａｇａｔａｃａｔｔｇｔｃｇｇｔｔｇｇｔｔｔｇｇ
次に、プライマーＰｐｔｒｓ３とＲ−Ｏｎ１のペアと、プライマーＦ−Ｏｎ１とＰｐｔｒａｓ１のペアでそれぞれＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物は、プライマーＲ−Ｏｎ１とＦ−Ｏｎ１に対応する領域で相補的となる。そこで、両ＰＣＲ産物を混合し、プライマーＰｐｔｒｓ３とＰｐｔｒａｓ１により全長遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片はＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて５'末端をリン酸化した。すべてのＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、反応条件は、（９４℃, １５秒）→（５５℃, ３０秒）→（６８℃, １分）で２０サイクル行った。ＰＣＲ増幅後の反応液はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。

上記のようにして得られた改変ｔｈｉＡ遺伝子プローター領域を、前記プラスミドｐＮＧ１上のｕｉｄＡ遺伝子（レポーター遺伝子）の上流に位置するＳｍａＩサイトに挿入して解析用プラスミドを得た。

（解析用プラスミドの組み換え導入）
前記解析プラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株に導入（形質転換）し、前記解析用プラスミドがｎｉａＤ遺伝子を介した相同組み換えにより前記変異株ゲノムに導入された形質転換株を作成した。具体的には、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株ｎｉａＤ３００（独立行政法人酒類総合研究所）をデキストリン−ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ｐＨ ５．５）で３０℃、１４５ｒｐｍ、２０時間回転振とう培養後、得られた菌体を滅菌水で洗浄した。この菌体をプロトプラスト化緩衝液（０.６Ｍ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５０ｍＭ マレイン酸緩衝液、ｐＨ５．５、０．５％ Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ社製））に懸濁し、３０℃、２時間、緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化した。得られたプロトプラストを乾熱滅菌した３Ｇ−２のグラスフィルターでろ過して残存する菌体を除去した後、ＴＦ液１（１．２Ｍ ソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ₂、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次にこのプロトプラストをＴＦ液１に２×１０⁸個／ｍｌとなるように懸濁してコンピテントセルを調製した。

上記コンピテントセル０．２ｍｌに導入するプラスミドを２０μｇ加え、氷上で３０分間静置後、ＴＦ液２（６０％ ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５）１．３５ｍｌを加えてさらに１５分間室温で静置した。これにＴＦ液１ １０ｍｌを添加後、１８００ｒｐｍ、５分間遠心してプロトプラストを回収し、再度ＴＦ液１ ０．５ｍｌに懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を再生用下層最少平板培地（０．６％ ＮａＮＯ₃、０．１５２％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５２％ ＫＣｌ、０．０５２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１％グルコース、１．２Ｍ ソルビトール、１μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８．８μｇ／ｍｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．４μｇ／ｍｌ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．１５μｇ／ｍｌ ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、０．１μｇ／ｍｌ Ｎａ₂ＢＯ₇・１０Ｈ₂Ｏ、０．０５μｇ／ｍｌ （ＮＨ₄）６Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ、２％ ａｇａｒ、ｐＨ６．５）上にのせ、さらに事前に４５℃に保温しておいた再生用上層最少培地（再生用下層最少平板培地のａｇａｒ濃度を０．５％に、グルコース濃度を５％にしたもの）５ｍｌを重層してプロトプラストを包埋した。３０℃、１０日間培養後、ｎｉａＤ遺伝子の導入により硝酸資化能が相補されて最少培地上で生育可能となった形質転換株を釣菌した。

さらにサザン解析によって、形質転換株の中からｎｉａＤ座位にプラスミドが１コピー導入された菌株を選抜した。各形質転換株より抽出したゲノムＤＮＡをＳａｌＩで完全消化し、０．８％アガロース電気泳動により分離してナイロンメンブレン・ハイボンドＮ＋ （アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。プローブとしてＰＣＲ法により増幅したｎｉａＤ遺伝子の塩基配列の一部を用いた。プローブを増幅するため鋳型としてはｐＵＮ１を用い、プライマーは上流側として、Ｐｒｎｉｓ（５'-ｇｇｃａａｃｃａｔｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｇｇ-３'：配列番号９）、下流側として、Ｐｒｎｉａ（５'-ｇｇｔａａｇａｃｇｃｇｇｔｔｇｔｃａｔｔｇ-３'：配列番号１０）を用いた。

プローブのラベリングおよびシグナルの検出はＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。宿主であるＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ３００変異株においては８．２ｋｂのシグナルが現れるが、プラスミドがｎｉａＤ座位に１コピー導入した形質転換株はこのシグナルが消失し、代わりに８．５ｋｂ及び１１ｋｂの２本のシグナルが現れる。これに基づいて目的の形質転換株である改変ｔｈｉＡ遺伝子プロモーター領域導入株を選抜した。

（ＧＵＳ活性測定による発現制御の確認）
得られた改変ｔｈｉＡ遺伝子プロモーター領域導入株についてチアミン存在下、非存在下の培養条件下における菌体内のＧＵＳ活性を測定し、改変したリボスイッチのスプライシング効率の指標とした。ＧＵＳ活性は公知の方法［Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８３, ８４４７, １９８６］に準じて測定した。すなわち、最少培地（０．６％ ＮａＮＯ₃、０．１５２％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５２％ ＫＣｌ、０．０５２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８．８μｇ／ｍｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．４μｇ／ｍｌ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．１５μｇ／ｍｌ ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、０．１μｇ／ｍｌ Ｎａ₂ＢＯ₇・１０Ｈ₂Ｏ、０．０５μｇ／ｍｌ（ＮＨ₄）６Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ、ｐＨ６．５）１００ｍｌに２％グルコース、又は２％グルコースと１０μＭチアミンを添加した２種類の液体培地へ形質転換体の分生子を５×１０⁷個／１００ｍｌとなるよう接種し、３０℃、４８時間、１８０ｒｐｍで回転振とう培養した。菌体を３Ｇ−１のグラスフィルターで回収、滅菌水で３回洗浄、濾紙にはさんで十分脱水の後、液体窒素で凍結して乳鉢で破砕した破砕菌体０．５ｇを抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、１０ｍＭ ２-ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ₂、０．１％ Ｎ-ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎｅ、ｐＨ ７．０）５ｍｌに懸濁した。これを室温で１ 分間ボルテックスミキサーにより攪拌後、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を粗酵素液とした。

上記粗酵素液０．０５ｍｌをＧＵＳ反応液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、１０ｍＭ ２-ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１ｍＭ ｐ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ-β-Ｄ-ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、ｐＨ ７．０）０．４５ｍｌに加え、３７℃、３０分間反応させ、反応停止液（２．５Ｍ ２-ａｍｉｎｏ-２-ｍｅｔｈｙｌ-１,３-ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）０．２ｍｌを混和した後、４１５ｎｍの吸光度を測定し、遊離したｐ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量を求めた。粗酵素液のタンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準物質とし、日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社のプロテインアッセイを用いて定量した。ＧＵＳ活性は基質であるｐ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ-β-Ｄ-ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅから１分間に１ｎｍｏｌのｐ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを遊離する活性を１Ｕとして表した。得られた結果を表１に示す。

２％グルコースの培地に１０μＭチアミンを添加した場合、未添加のものに比べてＧＵＳ活性が約５倍に増加し、ＧＵＳタンパク質の発現をチアミンによって制御することができた。

配列表の配列番号１１で表される本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドによるレポーター遺伝子の遺伝子発現制御を、Ａ．ｏｒｙｚａｅ細胞内で確認した。プラスミドの構築、形質転換株の製造、及び、ＧＵＳ活性の測定は、実施例１で使用したプライマーＦ−Ｏｎ１及びＲ−Ｏｎ１に換えて下記Ｆ−Ｏｎ２（配列番号１２）及びＲ−Ｏｎ２（配列番号１３）を使用した以外は実施例１と同様にして行った。得られた結果を表２に示す。
Ｆ−Ｏｎ２：ｃｃａａａｃｃａａｃｃｇａｃａａｔｇｔａａｃｇｔｃｔｔｔｇｇｃｇｔｇ
Ｒ−Ｏｎ２：ｃａｃｇｃｃａａａｇａｃｇｔｔａｃａｔｔｇｔｃｇｇｔｔｇｇｔｔｔｇｇ

２％グルコースの培地に１０μＭチアミンを添加した場合、未添加のものに比べてＧＵＳ活性が約４倍に増加し、ＧＵＳタンパク質の発現をチアミンによって制御することができた。

以上説明したとおり、本発明によれば、チアミンなどによる遺伝子発現の“正”の制御が可能であるから、例えば、細胞を用いたタンパク質産生に関する分野、例えば、食品、栄養補助食品、医薬、医療の分野で有用である。

図１は、本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチドの機能を説明する模式図である。 図２は、従来の真核生物ＴＰＰ結合型リボスイッチの機能を説明する模式図である。 図３Ａは、麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子のプロモーター領域を説明する図であり、図３Ｂは、ＴＰＰを結合するＲＮＡエレメント（ＴＰＰ結合構造形成領域）が形成すると考えられる二次構造の模式図である。 図４は、ＴＰＰ結合構造形成領域の大腸菌と真菌類とのアライメントの図である。 図５は、プラスミドｐＮＧ１の構成を説明する図である。

符号の説明

１・・本発明の遺伝子発現制御ポリヌクレオチド

配列番号２：ＴＰＰ結合型リボスイッチ
配列番号３：プライマー Ｓａｌｕｓ
配列番号４：プライマー Ｓｐｈｕａ
配列番号５：プライマー Ｐｐｔｒｓ３
配列番号６：プライマー Ｐｐｔｒａｓ１
配列番号７：プライマー Ｆ−Ｏｎ１
配列番号８：プライマー Ｒ−Ｏｎ１
配列番号９：プライマー Ｐｒｎｉｓ
配列番号１０：プライマー Ｐｒｎｉａ
配列番号１１：ＴＰＰ結合型リボスイッチ
配列番号１２：プライマー Ｆ−Ｏｎ２
配列番号１３：プライマー Ｒ−Ｏｎ２

Claims (6)

1. 遺伝子発現制御ポリヌクレオチドであって、
   真核生物のチアミン二リン酸（ＴＰＰ）結合型リボスイッチにおけるステムループ形成領域Ｐ１からＰ５からなるＴＰＰ結合構造形成領域を含み、
   ５'末端及び３'末端が、それぞれ、前記ＴＰＰ結合型リボスイッチにおけるＴＰＰ存在下の５'スプライス部位及び３'スプライス部位であり、
   発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に配置されることにより、ＴＰＰ又はその類似体の非存在下において前記遺伝子の発現を抑制し、ＴＰＰ又はその類似体の存在下において前記遺伝子の発現を誘導することを特徴とするポリヌクレオチド。
2. 前記ＴＰＰ結合構造形成領域が、配列表の配列番号１の４９７番目から６６９番目で表されるヌクレオチド配列若しくは前記配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列又はそれらの相補配列である請求項１記載のポリヌクレオチド。
3. （１）配列表の配列番号２又は１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
   （２）配列表の配列番号２又は１１で表されるヌクレオチド配列の１個以上の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、ＴＰＰ又はその類似体を結合可能であるポリヌクレオチド、及び、
   （３）前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチド、
   からなる群から選択される請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
4. 遺伝子ベクターであって、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
5. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項４記載のベクターが導入された細胞。
6. 遺伝子発現制御方法であって、発現制御を行う所望の遺伝子の転写領域内に請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた遺伝子が導入された細胞又は生命体を準備する工程、及び、前記遺伝子の発現を誘導する場合に、ＴＰＰ及びその類似体を投与する工程を含む遺伝子発現制御方法。
   
   

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