JP5818312B2

JP5818312B2 - プラスミド除去用組み換えプラスミドおよびその利用

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Publication number: JP5818312B2
Application number: JP2011155056A
Authority: JP
Inventors: 山本　真司; 真司山本; 克周鈴木
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2031-07-13
Also published as: JP2013017442A

Description

本発明は、アグロバクテリア菌を用いる遺伝子組み換えに利用される、プラスミド除去用組み換えプラスミド、プラスミドの除去方法、および、遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法に関する。

作物の耐性を増したり、貯蔵性または薬効成分の付与等の目的で、植物に組み換え遺伝子を導入し、遺伝子組み換え植物を作成する技術が頻用されている。アグロバクテリア菌（Agrobacterium tumefaciens（別名Rhizobium radiobacter）等の細菌）は、遺伝子を植物細胞核に輸送する機能を有するため、遺伝子組み換え植物を作成する主要な技術に必要不可欠な細菌である。アグロバクテリア菌は、根頭癌腫病菌および毛状根病菌として自然界から多数分離・保管されている。これらの菌は、種々の宿主範囲を有し、特定の植物種に高い感染・病徴誘導能を持つものも知られている。しかし、採取・保管された野生型アグロバクテリア菌の菌株の大部分は、遺伝子組み換えに使われていない。

一般的に、アグロバクテリア菌を用いて外来遺伝子を植物に組み込む方法には、バイナリーベクター法が用いられている。図１は、バイナリーベクター法でのアグロバクテリア菌を用いて外来遺伝子を植物に組み込む方法の概念を示す図である。なお、例として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の場合を示す。

図１に示すように、まず、野生型アグロバクテリア菌（ａ）がもつ病原プラスミドＡを、植物への感染に必須であるｖｉｒ領域を保持させたままで、全Ｔ−ＤＮＡ領域（ＬＢとＲＢとその内部領域を含む）を除去したプラスミドＡ’に改変する（ｂ）。次に、大腸菌と野生型アグロバクテリア菌との両方で複製可能な小型プラスミドの境界領域（ＬＢとＲＢ）の中に所要のＤＮＡを組み込んでＴ−ＤＮＡ領域としたプラスミドＢを導入する（ｃ、ｄ）。このように作成した当該アグロバクテリア菌を植物に感染させると、プラスミドＡ’にあるｖｉｒ領域の働きで、プラスミドＢのＴ−ＤＮＡ領域を植物に導入することが可能となる（ｅ）。

バイナリーベクター法において、遺伝子組み換え植物を作成するためのアグロバクテリア菌は、腫瘍形成の主体であるＴｉプラスミド、または、毛状根形成の主体であるＲｉプラスミドを改変し、病原発現遺伝子を含むＴ−ＤＮＡ領域が除去されている必要がある。植物に感染し、細胞核にＤＮＡを注入する機能領域は有するが、このようなＴ−ＤＮＡ領域が除去された菌株を作成することは容易ではない。従って、遺伝子組み換え植物の作成に利用されるアグロバクテリア菌株の数は少ない。

病原性アグロバクテリア菌の菌株を用い、遺伝子組み換え植物を作成できるように改変する有力な方法として、野生型アグロバクテリア菌が有するＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをいったん除去し、既に加工しておいたｖｉｒ領域を有するがＴ−ＤＮＡ領域は除去されているＴｉプラスミドを導入する、という方法が開発された(非特許文献１参照)。

ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを除去する手段において、不和合性を用いたプラスミド除去法の場合であれば、除去効率が高く染色体ＤＮＡへの影響も少ない（特許文献１参照）。図２は、不和合性を用いるＴｉプラスミド除去法を示す図である。図２に示すように、ＴｉプラスミドＡと同じ複製遺伝子、薬剤耐性遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子またはゲンタマイシン耐性遺伝子等）、および、ショ糖感受性遺伝子等を含むＴｉ除去用プラスミドＣを、大腸菌（ａ）を介し、野生型アグロバクテリア菌（ｂ）に接合導入する。このように得られるカナマイシンまたはゲンタマイシン、および、リファンピシン耐性等を持つ接合体細胞（ｃ）のうち、Ｔｉプラスミドを失ったアグロバクテリア菌を、オパインの資化性またはハイブリダイゼーション法等により選別する。

ＴｉプラスミドＡを失い、Ｔｉ除去用プラスミドＣをもっているアグロバクテリア菌（ｄ）を、高濃度ショ糖添加寒天培地に塗布、培養し、Ｔｉ除去用プラスミドを失った細胞を選別することで、プラスミドの無いアグロバクテリア菌（ｅ）を得ることができる。なお、同様の方法にてＲｉプラスミドを除去することも可能である。

しかしながら、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドは、アグロバクテリア菌内で安定に維持する複製機構と共に、当該プラスミドの脱落を妨げるプラスミド安定化遺伝子を有するものが多いため、前述したような方法を用いてもプラスミドを除去することができない菌株が存在することが明らかとなった（非特許文献２参照）。

安定なＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの中には、複製遺伝子とは別に、プラスミド安定化遺伝子であるトキシン−アンチトキシン遺伝子を持つものがあることもわかっている（非特許文献２および非特許文献３参照）。図３は、トキシン−アンチトキシン遺伝子によるプラスミド安定化メカニズムの一例を示す図である。図３に示すように、細胞内に存在するトキシン−アンチトキシン遺伝子を含むプラスミドＤは、細胞内において安定な毒性タンパク質と不安定な無毒化タンパク質とを発現しており、毒性タンパク質の毒性は無毒化タンパク質により抑制されている（ａ）。

しかし、プラスミドが脱落した細胞では不安定な無毒化タンパク質は速やかに分解される。その一方で、安定な毒性タンパク質が細胞内に残存して毒性を発揮するため、生育抑制または細胞死が引き起こされる（ｂ）。結果として、プラスミドを失った細胞は生育できず、プラスミドを維持している細胞のみが生育することになる。また、細胞死に至らずとも、毒性タンパク質の作用で生育が強く抑制を受けた細胞では遺伝子の変異率が上昇することが示唆されている（非特許文献２および非特許文献３参照）。

特開２００３−２８４５６１号公報

Kiyokawa K., et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75, 1845-1851 Yamamoto S., et al., 2009, J. Bacteriol. 191, 4656-4666 Yamamoto S., et al., 2007, Genes Genet. Syst. 82, 197-206

以上のように、図２に示される不和合性を用いた方法によりＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを除去する際においても、除去するＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド上に存在するトキシン−アンチトキシン遺伝子が、除去効率を大きく低下させ、その結果細胞の生育抑制または細胞死に繋がる場合があることがわかっている。しかし、除去効率を高めるために、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド上のトキシン−アンチトキシン遺伝子を予め破壊しておくことは容易ではない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アグロバクテリア菌内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの除去効率が高く、かつ生育抑制または細胞死に至ることが少ないプラスミド除去用組み換えプラスミド、プラスミドの除去方法、および、当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを利用する遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドよりもアグロバクテリア菌内から高頻度でＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを除去し、さらには用いたプラスミドを高頻度で脱落させることができる、新規なプラスミドを作成した。具体的には、トキシン−アンチトキシン遺伝子の安定化効果を無効化し、アグロバクテリア菌内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを着実かつ容易な方法で脱落させることが可能である、プラスミド除去用組み換えプラスミドを作成した。

そこで、本発明の第１の態様に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドは、野生型アグロバクテリア菌のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが持つｒｅｐＡＢＣ複製遺伝子と系統的に近縁または同一の複製遺伝子と、アグロバクテリア菌内においてトキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子と、感受性遺伝子とを含有し、
前記アグロバクテリア菌内においてトキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子は、アンチトキシン遺伝子のみからなることを特徴とする。

また、好ましくは、前記アンチトキシン遺伝子は、ｔｉｏｒｆ２４、および／または、ｉｅｔＡであることを特徴とする。

より好ましくは、さらに、薬剤耐性遺伝子を有することを特徴とする。

さらに好ましくは、以下（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１ないし３のいずれかに記載の塩基配列。
（ｂ）配列番号１ないし３のいずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列。

本発明の第２の態様に係るプラスミドの除去方法は、第１の態様に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを、アグロバクテリア菌に導入する工程を含むことを特徴とする。

本発明の第３の態様に係る遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法は、第１の態様に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを、アグロバクテリア菌に導入する工程と、
前記プラスミド除去用組み換えプラスミドを前記アグロバクテリア菌から脱落させる工程と、
を含むことを特徴とする。

好ましくは、前記アグロバクテリア菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌、アグロバクテリウム・ビティス菌、アグロバクテリウム・ルビー菌またはアグロバクテリウム・ラリームレイ菌のいずれかであることを特徴とする。

本発明によれば、アグロバクテリア菌内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの除去効率が高く、かつ生育抑制または細胞死に至ることが少ないプラスミド除去用組み換えプラスミド、プラスミドの除去方法、および、当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを利用する遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法が提供される。

バイナリーベクター法でのアグロバクテリア菌を用いて外来遺伝子を植物に組み込む方法の概念を示す図である。不合和性を用いるＴｉプラスミド除去法を示す図である。トキシン−アンチトキシン遺伝子によるプラスミド安定化メカニズムの一例を示す図である。実施例１に係るｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａの遺伝子地図を示す図である。実施例２に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドのプラスミド安定化遺伝子の様子を示す図である。実施例２に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドの導入による各種アグロバクテリア菌株の接合効率を示す図である。実施例３に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドの導入による各種アグロバクテリア菌株のＴｉプラスミド除去率を示す図である。実施例４に係るｓａｃＢカウンター選別による各種アグロバクテリア菌株のプラスミド除去用組み換えプラスミド脱落率を示す図である。実施例５に係る無毒化Ｔｉプラスミドおよびバイナリープラスミドを持つアグロバクテリア菌株の作成方法を示す図である。実施例６に係る大根に対する形質転換効率の比較を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。

（プラスミド除去用組み換えプラスミド）
本発明の実施の形態１は、プラスミド除去用組み換えプラスミドに関する。具体的には、野生型アグロバクテリア菌が持つ複製遺伝子に不和合性を示す複製遺伝子と、プラスミド安定化遺伝子と、感受性遺伝子とを含有するプラスミド除去用組み換えプラスミドに関する。

本発明において「野生型アグロバクテリア菌」とは、当業者にとって公知である植物への感染能を持つ任意の野生型のアグロバクテリア菌の菌株を意味する。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等の菌株を挙げることができる。これらは土壌や宿主植物から採取することができる。なお、当該野生型アグロバクテリア菌は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドに複製遺伝子ｒｅｐＡＢＣを有している。

また、本発明において「不和合性」とは、一般的に当業者において使用される意味と同様であり、プラスミドの不和合性を指す。すなわち、系統的に近縁もしくは同一の複製遺伝子を有する２種類のプラスミドは、同一宿主細胞内では共存できないというプラスミドの性質を意味する。不和合性を示すプラスミド同士は、その複製遺伝子が系統的に近縁であることに由来するため、その塩基配列は類似している。例えば、後述する本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドは、ＩｎｃＲｈ１に属するＴｉプラスミドの複製遺伝子ｒｅｐＡＢＣを有する。

本発明において、「感受性遺伝子」とは、特定の条件下において細胞増殖能力または生存能力が低下する機能を有する遺伝子を意味する。このような遺伝子としては、例えば、レヴァンスクラーゼ遺伝子等を挙げることができる。この場合、ホスト細胞にショ糖高感受性を付与し、ショ糖を添加した培地中で培養することにより、レヴァンスクラーゼ遺伝子を含むプラスミドが除去された細胞のみを得ることができる。なお、当業者に公知であるその他の任意の感受性遺伝子を用いても構わない。例えば、他の感受性遺伝子としては、発現を制御できるよう加工した毒素遺伝子、または、Fluoro-orotic acid感受性となるｐｙｒＢ遺伝子等を挙げることができる。

ここで、本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドは、特許文献１に記載されているプラスミド除去用組み換えプラスミドとは異なり、プラスミド安定化遺伝子を有している。本発明において、「プラスミド安定化遺伝子」とは、プラスミドを失った細胞（図３参照）の出現頻度を低下させる働きを持ち、当業者において公知である任意の遺伝子を意味する。

例えば、アグロバクテリア菌内において機能するプラスミド安定化遺伝子としては、トキシン−アンチトキシン遺伝子を挙げることができる。本発明において、「トキシン−アンチトキシンシステムを構成する」とは、図３の（ａ）を用いて前述したように、細胞内において安定な毒性タンパク質と不安定な無毒化タンパク質とを発現しており、毒性タンパク質の毒性が無毒化タンパク質により抑制されている状態を意味している。本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドがこのようなトキシン−アンチトキシン遺伝子を有することにより、例えば、アグロバクテリア内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが除去された場合であっても、プラスミド除去用組み換えプラスミドから発現している無毒化タンパク質が働くことで、アグロバクテリアの生育抑制または細胞死が引き起こされる頻度を低下させることができる。

トキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子としては、例えば、ｔｉｏｒｆ２４−ｔｉｏｒｆ２５および／またはｉｅｔＡ−ｉｅｔＳ等を挙げることができる。なお、トキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子として、アンチトキシン遺伝子のみ（例えば、ｔｉｏｒｆ２４および／またはｉｅｔＡ、特にｔｉｏｒｆ２４およびｉｅｔＡ）を持たせることで、最終的に当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを脱落させる際の脱落率（％）も高頻度に保つことができる。

本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドのさらに好ましい例としては、薬剤耐性遺伝子を有する。薬剤耐性遺伝子を有することによって、その薬剤にて細胞培養することにより、本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドが導入されたアグロバクテリア菌を、導入されなかったアグロバクテリア菌から容易に選別することができる。薬剤耐性遺伝子は、当業者において公知である任意の薬剤耐性遺伝子で構わない。例えば、ゲンタマイシン耐性遺伝子Ｇｍ^Ｒ、カナマイシン耐性遺伝子Ｋｍ^Ｒまたはテトラサイクリン耐性Ｔｃ^Ｒ等を挙げることができる。また、薬剤耐性遺伝子は、単独または複数組合せて含有させることができる。なお、野生型アグロバクテリア菌は菌株ごとに異なる薬剤耐性を示すため、当該菌株に適当である薬剤耐性遺伝子を使用すればよい。

このような本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドの具体例としては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列から構成されるｐＫ１８ｍｓｒ２４、配列番号２に記載の塩基配列から構成されるｐＫ１８ｍｓｒＡ、および、配列番号３に記載の塩基配列から構成されるｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａを挙げることができる。本実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドは、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列を含んでいればよい。

プラスミド除去用組み換えプラスミドは、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を含有している場合でもよい。また、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列、または、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有している場合でもよい。相同性に関しては、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。プラスミド除去用組み換えプラスミドは、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列、または、配列番号１ないし３のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有している場合でもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。

（プラスミドの除去方法）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１のプラスミド除去用組み換えプラスミドをアグロバクテリア菌に導入する工程を含む、プラスミドの除去方法に関する。

実施の形態１において述べたような遺伝子から構成される、プラスミド除去用組み換えプラスミドは、野生型のアグロバクテリア菌に導入される。導入の方法としては当業者において公知である任意の方法を用いることができる。例えば、当該プラスミド除去用組み換えプラスミドがｉｎｃＰ型のｏｒｉＴまたはｉｎｃＱ型のｏｒｉＴ等の接合起点遺伝子を有する場合、細胞接合による導入方法を用いることができる。当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを大腸菌内に作成した場合は、アグロバクテリアとの接合効率が１０^−２から１０^−３程度と高いため、細胞接合法が広汎に適用できる。その他、電気的導入方法（エレクトロポレーション法）、または化学的処理によるＤＮＡ導入法等の手段を用いることも可能である。当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを作成するバクテリアとしては大腸菌以外でも構わない。例えば、ネズミチフス菌等であっても構わない。

図２に示したように、前述の実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドと、野生型アグロバクテリア菌に元々存在したＴｉプラスミドとが共存するアグロバクテリア菌は、細胞培養すると、不和合性によって殆どが一方のプラスミドのみを有するアグロバクテリア菌となる。さらに、前述した薬剤耐性遺伝子を利用することによって、Ｔｉプラスミドが除去されたアグロバクテリア菌のみを選別することができる。選別方法については、例えば、オパインによる選別法、サザンハイブリダイゼーション法または電気泳動法等を挙げることができる。これらの方法を用いての選別は、当業者であれば容易に実施可能である（特許文献１参照）。

（遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法）
本発明の実施の形態３は、前述の実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドをアグロバクテリア菌に導入することにより、前述の実施の形態２の通りＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを除去し、次いで、当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを脱落させる、遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法に関する。なお、当該アグロバクテリア菌の好ましい例としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌、アグロバクテリウム・ビティス菌、アグロバクテリウム・ルビー菌またはアグロバクテリウム・ラリームレイ菌等を挙げることができる。

ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが除去されたアグロバクテリア菌を選別した後は、当該アグロバクテリア菌に残っている、前述の実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを脱落させる。この際、前述した感受性遺伝子を利用することによって、プラスミド除去用組み換えプラスミドが脱落した遺伝子組み換え用のアグロバクテリア菌を得ることができる。

このようにして得られたアグロバクテリア菌株細胞に、外来ＤＮＡを持つ別の外来型プラスミドを導入する。プラスミド導入の方法は、当業者において公知の手段を利用すればよい。また、プラスミドが導入されたアグロバクテリアを選別する方法についても、当業者において公知の手段を利用すればよい。例えば、外来型プラスミドとして中間ベクター法による遺伝子組み換えプラスミドを用いることによって、そのまま植物へ感染させて植物の形質転換を行なうことができる。その他の方法としては、後述の実施例５において詳細に説明する。なお、本発明において「遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌」とは、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド、および、前述の実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドが欠失したアグロバクテリア菌、または、当該ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド、および、前述の実施の形態１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドが欠失したアグロバクテリア菌に外来ＤＮＡが導入されたアグロバクテリア菌を意味する。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。

（実施例１）
本実施例１では、プラスミド除去用組み換えプラスミドの作成方法に係る実施例について詳細に述べる。

本実施例１では、プラスミド除去用組み換えプラスミドとしてｐＫ１８ｍｓｒ２４、ｐＫ１８ｍｓｒＡおよびｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａを作成した例について詳細に述べる。これらのプラスミド除去用組み換えプラスミドのプラスミド安定遺伝子として、ｐＫ１８ｍｓｒ２４はｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ由来のｔｉｏｒｆ２４を、ｐＫ１８ｍｓｒＡはｐＴｉＣ５８由来のｉｅｔＡを、ｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａはｔｉｏｒｆ２４およびｉｅｔＡの両方を有するよう作成した。

これらのプラスミド除去用組み換えプラスミドの作成は、ＲＰ４からのｏｒｉＴをもつｐＫ１８ｍｓｒを出発材料とした。当該ｐＫ１８ｍｓｒのプラスミドは、大腸菌からアグロバクテリア菌だけでなく、グラム陽性およびグラム陰性の両方のバクテリアにも移動可能であるプラスミドである（特許文献１および非特許文献３参照）。

当該プラスミド上に存在するｓａｃＢ遺伝子は、細胞を高濃度のショ糖を含む培地で培養すると、細胞を死滅させる効果がある（Steinmetz M., et al., 1983, Mol. Gen. Genet. Syst. 77, 1-9およびGay P., et al., 1985, J. Bacteriol. 164, 918-921参照）。そのため、遺伝子を欠失した細胞の単離、すなわちカウンター選別に有用である。また、ｐＫ１８ｍｓｒは、ｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡの複製遺伝子であるｒｅｐＡＢＣ遺伝子を有しており、アグロバクテリア細胞内で多くのＴｉプラスミドと不和合なプラスミドとして維持される。

次に、ｔｉｏｒｆ２４を含むＤＮＡ断片（ｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ（GenBankアクセッション番号ＡＢ０１６２６０）の全塩基配列中２４，２９７〜２５，１１８）およびｉｅｔＡを含むＤＮＡ断片（ｐＴｉＣ５８（GenBankアクセッション番号ＡＥ００７８７１）の全塩基配列中９７，５３３〜９８，９３８）を、末端にＸｂａＩ切断部位を付加したプライマーを用い、ＰＣＲで増幅後、ＸｂａＩで消化し、それぞれ前述したｐＫ１８ｍｓｒのＸｂａＩ切断部位に挿入した。

このように本実施例１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミド、ｐＫ１８ｍｓｒ２４およびｐＫ１８ｍｓｒＡを作成した。なお、ｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａについては、ｐＫ１８ｍｓｒ２４のＮｈｅＩ切断部位にｉｅｔＡを含むＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片を挿入することによって作成した。図４は、実施例１に係るｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａの遺伝子地図を示す図である。これらの実施例１に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを構成するプラスミド、ＤＮＡ断片（ｔｉｏｒｆ２４、ｒｅｐＡＢＣ、ｉｅｔＡおよびｓａｃＢ等）の塩基配列は全て公知であるため、GenBank等のデータベースを用いて前述のプラスミド除去用組み換えプラスミドを作成することは当業者であれば容易である。前述した通り、当該三つのプラスミドの塩基配列を配列表の配列番号１ないし３に示す。

（実施例２）
本実施例２では、前述の実施例１のプラスミド除去用組み換えプラスミドの接合導入効率に係る実施例について詳細に説明する。

本実施例２では、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドと、本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドとの接合導入効率における比較について説明する。従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドとしては、ｐＫ１８ｍｓｒを用いた。また、ｔｉｏｒｆ２４−ｔｉｏｒｆ２５およびｉｅｔＡ−ｉｅｔＳを含むプラスミドであるｐＫ１８ＳＣａｔと、本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドとしては、前述したｐＫ１８ｍｓｒ２４、ｐＫ１８ｍｓｒＡまたはｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａのプラスミドとを用いた。それぞれこれらのプラスミド除去用組み換えプラスミドを用い、種々のアグロバクテリア菌の菌株におけるＴｉプラスミド除去操作を行った（Uraji M., et al., 2002, Genes Genet. Syst. 77, 1-9参照）。

アグロバクテリア菌の菌株は、ＭＡＦＦ３０１００１、Ｃ５８、Ｃｈ−Ａｇ−１０、Ｐｃｈ−Ａｇ−２、Ｐｌ−Ａｇ−１、Ｃｈ−Ａｇ−２およびＰｃｈ−Ａｇ−４を使用した。各プラスミド除去用組み換えプラスミドの各アグロバクテリア菌株への導入は、それぞれのプラスミド除去用組み換えプラスミドを有する大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒとの接合によって実施した。接合方法は当該分野にて一般的な方法を用いた（Simon R., et al., 1983, Bio/Technology 1, 784-794参照）。まず、ドナーの大腸菌と受け取り側のアグロバクテリア細胞の細胞密度を１．０ＯＤ_６００となるまで培養し、０．９％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌを用いて洗浄した。

次に、アグロバクテリア菌細胞を同量のドナーである大腸菌細胞と混合した後に、ＬＢ寒天培地上のナイロン膜フィルター（Amersham社製）に滴下した。その後、２８℃で１５時間インキュベートし、フィルター上の細胞混合物を０．９％ＮａＣｌに懸濁し、リファンピシン（終濃度３０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天培地上に塗布した。

なお、菌株にＰｃｈ−Ａｇ−２、Ｐｌ−Ａｇ−１、Ｃｈ−Ａｇ−２、Ｃｈ−Ａｇ−１０またはＰｃｈ−Ａｇ−４を用いた際には、細胞の洗浄および懸濁は０．９％ＮａＣｌの代わりにＹＭＡ培地（１％Mannitol、０．４％Yeast extract、０．０５％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．０１％ＮａＣｌおよび０．０２％ＭｇＳＯ_４）を、ＬＢ寒天培地の代わりにＹＭＡ寒天培地を用い、選択培地としてはナルジクス酸（終濃度３０μｇ／ｍｌ）およびネオマイシン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＹＭＡ寒天培地を使用した。その後、三日間の培養で生じたコロニー（接合体）を数え、実験に用いた細胞数当たりの比率（接合効率）として計算した。

図５は、実施例２に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドのプラスミド安定化遺伝子の様子を示す図である。図６は、実施例２に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドの導入による各種アグロバクテリア菌株の接合効率を示す図である。図５において、＋は該安定化遺伝子が該プラスミド除去用組み換えプラスミド上に存在していることを示し、−は該安定化遺伝子が該プラスミド除去用組み換えプラスミド上に存在していないことを示す。図６において、ｎｔは未実施であることを示している。

図６に示すように、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミド（ｐＫ１８ｍｓｒ）と比較すると、特に、ｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａが大半のアグロバクテリア菌株において高い接合導入効率（Transconjugant efficiency）を示していた。

（実施例３）
本実施例３では、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドと、前述の実施例１のプラスミド除去用組み換えプラスミドとを比較した際の、Ｔｉプラスミド除去効率に係る実施例について詳細に説明する。

前述の実施例２における接合体細胞の中に、Ｔｉプラスミドが存在するか否かを試験した。Ｔｉプラスミドのｖｉｒ領域は菌株間で高度に保存されているため、ｖｉｒＣ増幅プライマー（ＶＣＦ３およびＶＣＲ３（塩基配列を配列番号４および５に示す））を用いるＰＣＲによって、多くのアグロバクテリア菌の菌株が持つＴｉプラスミドは高感度に検出できる。すなわち、接合体細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列番号４および５に示されるｖｉｒＣ増幅プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、Ｔｉプラスミドを有している細胞でのみ約４００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が見られる。

まず、このような方法によって各プラスミド除去用組み換えプラスミドによる接合体細胞のＴｉプラスミドの有無を確認し、Ｔｉプラスミド除去率として算出した。図７は、実施例３に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドの導入による各種アグロバクテリア菌株のＴｉプラスミド除去率を示す図である。図６と同様に、ｎｔは未実施を示す。

従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドであるｐＫ１８ｍｓｒと比較すると、ｐＫ１８ＳＣａｔおよび本発明に係るｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａを導入した接合体細胞で、大半のアグロバクテリア菌の菌株においてＴｉ除去率（％）が大きく上昇していた。他の本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドに関しては、ｐＫ１８ｍｓｒ２４についてはＭＡＦＦ３０１００１接合体において、ｐＫ１８ｍｓｒＡについてはＣ５８接合体において、ｐＫ１８ｍｓｒよりも高いＴｉ除去率（％）を示した。さらには、Ｃｈ−Ａｇ−１０、Ｐｌ−Ａｇ−１およびＰｃｈ−Ａｇ−２についてはｐＫ１８ｍｓｒではＴｉプラスミドが除去された細胞は殆ど得られなかったが、ｐＫ１８ＳＣａｔおよびｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａでは、特に効率よく種々のＴｉプラスミド除去株を得ることができていた。

（実施例４）
本実施例４では、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドと、前述の実施例１のプラスミド除去用組み換えプラスミドとを比較した際の、ｓａｃＢカウンター選別によるプラスミド除去用組み換えプラスミドの脱落率に係る実施例について詳細に説明する。

前述の実施例３のＴｉプラスミド除去接合体細胞は、Ｔｉプラスミドの代わりにプラスミド除去用組み換えプラスミドを含んでいる状態である。アグロバクテリア細胞を活用するには、プラスミド除去用組み換えプラスミドを除去する必要がある。図４に示したように、ｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａはホスト細胞をショ糖高感受性にするｓａｃＢ遺伝子を有している。図示していないが、他の実施例１にて述べた本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドにも同様にｓａｃＢ遺伝子を持たせた。

前述した実施例３のＴｉプラスミド脱落菌株を０．９％ＮａＣｌで希釈後、ショ糖を添加したＬＢ寒天培地（終濃度５％）に塗布し、２、３日培養後、コロニーを出現させた。出現したコロニーを、カナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ寒天培地に移植後、２８℃で２、３日培養し、生育の有無を観察した。Ｃｈ−Ａｇ−１０、Ｐｃｈ−Ａｇ−２、Ｃｈ−Ａｇ−２、Ｐｃｈ−Ａｇ−４およびＰｌ−Ａｇ−１由来の接合体細胞に関しては、Ｔｉプラスミド脱落菌株の希釈には０．９％ＮａＣｌの代わりにＹＭＡ培地を用い、塗布および移植にはＬＢ寒天培地の代わりにＹＭＡ寒天培地を用い、カナマイシンの代わりにネオマイシン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を用いた。

このように培養を行った結果、カナマイシンあるいはネオマイシン添加固体培地上で生育しないものをプラスミド除去用組み換えプラスミドを失った細胞と判断した。図８は、実施例４に係るｓａｃＢカウンター選別による各種アグロバクテリア菌株のプラスミド除去用組み換えプラスミド脱落率を示す図である。図６および図７と同様に、ｎｔは未実施を示す。

図８に示すように、安定化遺伝子全て（ｔｉｏｒｆ２４、ｔｉｏｒｆ２５、ｉｅｔＡおよびｉｅｔＳ）を有しているプラスミド除去用組み換えプラスミドでは、ＭＡＦＦ３０１００１およびＣ５８で約３０％、その他の菌株ではほぼ０％の脱落率となっていた。すなわち、前述のＴｉプラスミド除去率の結果では、従来のプラスミド（ｐＫ１８ｍｓｒ）よりも優れていたが、本実施例４に係る脱落率では、従来のプラスミドには劣る結果となり、少々扱い難い点を有することも示唆される。その一方で、ｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａについては全ての菌株において極めて効率よく、プラスミド除去用組み換えプラスミドを脱落させた細胞を得ることができた。

（実施例５）
本実施例５では、Ｔｉプラスミドを除去し、プラスミド除去用組み換えプラスミドを脱落させたアグロバクテリア細胞菌株のその後の操作に係る実施例について詳細に説明する。

なお、本実施例５に係る実験操作は、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドを用いて作成したアグロバクテリア細胞菌株を用いて操作する場合と、本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを用いて作成したアグロバクテリア細胞菌株を用いて操作する場合と同様である。アグロバクテリア菌のＣ５８では従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドｐＫ１８ｍｓｒを用い、Ｐｃｈ−Ａｇ−２では本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドｐＫ１８ｍｓｒ２４Ａを用い、前述の実施例３および実施例４の方法にてプラスミド脱落アグロバクテリア菌株を作成した。

当該アグロバクテリア菌株に、無毒化ＴｉプラスミドｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ−Ｓを大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒを介し、導入した。無毒化ＴｉプラスミドｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ−Ｓは、ｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡのＴ−ＤＮＡ領域を削除し、代わりに大腸菌において働く複製起点ｏｒｉＶ_{ｐＳＣ１０１}、ゲンタマイシン耐性遺伝子Ｇｍ^Ｒ、アンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐ^Ｒおよび転移起点ｏｒｉＴを持たせた無毒化Ｔｉプラスミドである（非特許文献１参照）。

次いで、無毒化ＴｉプラスミドｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ−Ｓを導入したアグロバクテリアＣ５８およびＰｃｈ−Ａｇ−２に、バイナリープラスミドｐＢＩＮＧＩを大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒを介して導入した。バイナリープラスミドｐＢＩＮＧＩは、Ｔ−ＤＮＡ領域（ＬＢとＲＢに挟まれた領域）に、レポーター遺伝子intron−ＧＵＳおよびカナマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩを持つ（非特許文献１参照）。

このように作成した、無毒化Ｔｉプラスミドとバイナリープラスミドとを持つアグロバクテリアＣ５８およびＰｃｈ−Ａｇ−２は、腫瘍または毛状根等の病気を引き起こすこと無く植物または菌類へ、遺伝子導入をすることが可能である。図９は、実施例５に係る無毒化Ｔｉプラスミドおよびバイナリープラスミドを持つアグロバクテリア菌株の作成方法を示す図である。なお、本実施例５では、カナマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩを使用しているため、カナマイシンを含む植物用培地を利用することで遺伝子が導入された植物細胞のみを選択的に生育させることが可能である。また、レポーター遺伝子intron−ＧＵＳは、β−グルクロニダーゼをコードしている。これは、実施例６にて後述するが、形質転換操作を行った植物組織に含まれる当該タンパク質の活性（ＧＵＳ活性）を測定することにより、遺伝子導入の効率を評価するためである。

（実施例６）
本実施例６では、従来使用されていたアグロバクテリア菌株と、本発明での方法によって作出されたアグロバクテリア菌株との形質転換効率の比較に係る実施例について詳細に説明する。

比較した菌株はいずれも無毒化ＴｉプラスミドｐＴｉ−ＳＡＫＵＲＡ−ＳとバイナリープラスミドｐＢＩＮＧＩとを持つアグロバクテリア菌株であるということは同様であるが、当該アグロバクテリア菌株の作成方法（使用したプラスミド除去用組み換えプラスミド）が異なる。遺伝子導入のためのアグロバクテリア菌株は、それぞれ前述の実施例５の菌株と同様である。形質転換効率は、大根（Raphanus sativus L. cv. Aonosachi）の外植片を以て比較した。

まず、無菌処理を施した大根の種子を発芽させ、その子葉、胚軸をそれぞれのアグロバクテリア菌液（０．４ＯＤ_６６０）に５分間浸漬した。その後、植物ホルモン（３μｇ／ｍｌナフタレン酢酸および４μｇ／ｍｌベンジルアデニン）を含むＭＳ固体培地に移し、２２℃において３日間照明下で共存培養した。次いで、形質転換細胞を選択的に生育させるため、セフォタキシム２００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを加えた前述と同様のＭＳ固体培地上に移し、２２℃において２週間照明下で培養した。その後、培地上の植物細胞を回収し、タンパク質を抽出後、ＧＵＳ活性を測定し、形質転換効率を評価した。なお、ＧＵＳ活性評価方法の詳細については、Jefferson R. A. et al., 1987, EMBO J. 6, 3901-3907を参照されたい。

図１０は、実施例６に係る大根に対する形質転換効率の比較を示す図である。図１０に示すように、本発明に係るプラスミド除去用組み換えプラスミドを利用し作成した遺伝子組み換え用アグロバクテリアＰｃｈ−Ａｇ−２では、従来のものを利用し作成した遺伝子組み換え用アグロバクテリアＣ５８よりも、約１．７倍高い形質転換効率を示していた。

本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明者らは鋭意研究を行い、従来のプラスミド除去用組み換えプラスミドよりもアグロバクテリア菌内から高頻度でＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを除去し、かつ用いたプラスミドを高頻度で脱落させることができる、新規なプラスミドを作成した。具体的には、トキシン−アンチトキシン遺伝子の安定化効果を無効化し、アグロバクテリア菌内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを着実かつ容易な方法で脱落させることが可能なプラスミド除去用組み換えプラスミドを作成した。

すなわち、本発明によれば、アグロバクテリア菌内のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの除去効率が高く、かつ生育抑制または細胞死に至ることが少ないプラスミド除去用組み換えプラスミド、プラスミドの除去方法、および、当該プラスミド除去用組み換えプラスミドを利用する遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法が提供される。詳細には、今まで植物の形質転換に活用することができなかった極めて安定なＴｉプラスミドを持つアグロバクテリア病原株を、形質転換に活用できる形に改変することが可能となり、さらには、その菌株のもつ特性が染色体側にあるのかプラスミド側にあるのかを判別することも可能となる。このように改変された菌株は、加工したＴｉプラスミドあるいはＲｉプラスミドを容易に導入可能な有用形質となる。

Claims

野生型アグロバクテリア菌のＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが持つｒｅｐＡＢＣ複製遺伝子と系統的に近縁または同一の複製遺伝子と、アグロバクテリア菌内においてトキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子と、感受性遺伝子とを含有し、
前記アグロバクテリア菌内においてトキシン−アンチトキシンシステムを構成する遺伝子は、アンチトキシン遺伝子のみからなることを特徴とする、プラスミド除去用組み換えプラスミド。
前記アンチトキシン遺伝子は、ｔｉｏｒｆ２４、および／または、ｉｅｔＡであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド除去用組み換えプラスミド。
さらに、薬剤耐性遺伝子を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のプラスミド除去用組み換えプラスミド。
以下（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含有することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のプラスミド除去用組み換えプラスミド。
（ａ）配列番号１ないし３のいずれかに記載の塩基配列。
（ｂ）配列番号１ないし３のいずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列。
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のプラスミド除去用組み換えプラスミドを、アグロバクテリア菌に導入する工程を含むことを特徴とする、プラスミドの除去方法。
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のプラスミド除去用組み換えプラスミドを、アグロバクテリア菌に導入する工程と、
前記プラスミド除去用組み換えプラスミドを前記アグロバクテリア菌から脱落させる工程と、
を含むことを特徴とする、遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法。
前記アグロバクテリア菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌、アグロバクテリウム・ビティス菌、アグロバクテリウム・ルビー菌またはアグロバクテリウム・ラリームレイ菌のいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子組み換え用アグロバクテリア菌の作成方法。