JP2015517816A

JP2015517816A - 真菌における改善された選択

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Publication number: JP2015517816A
Application number: JP2015514483A
Authority: JP
Inventors: リレルンドオルセンカーステン
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2015-06-25
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: BR112014029252B1; CN104395454A; EP2855659A1; JP6449763B2; BR112014029252B8; WO2013178674A1; EP3327113A2; US10351863B2; US9487767B2; CN104395454B; DK3327113T3; US20180298394A1; BR112014029252A2; EP3327113B1; US10351861B2; US20150175981A1; US20170029830A1; EP3327113A3

Abstract

本発明は、ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法に関するものであり、該方法は、組込みポリヌクレオチドコンストラクトによる真菌宿主細胞の形質転換を含み、ここで、該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び、適切なポリヌクレオチドコンストラクト、適切なポリヌクレオチドコンストラクト、及び得られる真菌宿主細胞及び製造方法にも関する。

Description

配列表の参照
本出願は、参照により本明細書に組込まれる、コンピューター読み取り可能な形式で配列表を含む。

発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法に関するものであり、該方法は、組込みポリヌクレオチドコンストラクトによる真菌宿主細胞の形質転換を含み、ここで、該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び、適切なポリヌクレオチドコンストラクト、適切なポリヌクレオチドコンストラクト、及び得られる真菌宿主細胞及び製造方法にも関する。

背景技術
ポリペプチドの高収率工業生産のために、目的の遺伝子のいくつかの染色体に組込まれたコピーを含み抗生物質耐性マーカーを欠く微生物株を提供することが、バイオテクノロジー産業にとって所望されている。抗生物質マーカー遺伝子は、従来、マーカー遺伝子、及び工業目的のポリペプチドをコードする付随する発現カセットの両者の複数コピーを担持する菌株を選択するための手段として使用されてきた。コピー数と最終生成物収率との間に直接的な相互関係が非常に多く存在するため、微生物産生株においてコピー数を高めることによる発現カセットの増幅が所望された。抗生物質選択マーカーを用いる増幅方法が、過去２０年、多くの宿主株に広範に使用されており、個々の発現カセットの発現レベルにかかわらず、比較的短期間で、高収率産生株を開発するための非常に効率的な方法であることが証明されている。

無力化された低レベルプロモーターから発現されるガラクトースエピメラーゼコードの遺伝子が、生成物遺伝子のタンデム増幅コピーの部位特異的ゲノム組込みのための選択マーカーとして使用され得ることが、これまでバチルス（Bacillus）において示されている（国際公開第２００１／９０３９３号；Novozmes Ａ／Ｓ）。しかしながら、真菌宿主細胞に対する類似の仕組みについては記載されていない。

リボスイッチは、タンパク質の関与のない標的低分子に対して直接的に結合できるｍＲＮＡ分子の一部である。標的低分子の結合は、ｍＲＮＡの翻訳に影響を及ぼす[Nudler E, Mironov AS (2004). "The riboswitch control of bacterial metabolism". Trends Biochem Sci 29 (1): 11-7; Vitreschak AG, Rodionov DA, Mironov AA, Gelfand MS (2004). "Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression?". Trends Genet 20 (1): 44-50; Tucker BJ, Breaker RR (2005). "Riboswitches as versatile gene control elements". Curr Opin Struct Biol 15 (3): 342-8; Batey RT (2006). "Structures of regulatory elements in mRNAs". Curr Opin Struct Biol 16 (3): 299-306]。

糸状菌細胞アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）において、ｔｈｉＡ及びｎｍｔＡ遺伝子の発現は、ピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）結合するリボスイッチにより調節され、そして上流オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を条件付で生成するために選択的スプライシングを制御し、それにより下流の遺伝子の発現に影響を及ぼす。Ａ．オリザエ（A. oryzae）のｔｈｉＡリボスイッチは、核内ｍＲＮＡ前駆体イントロン、すなわちスプライセオソームイントロンを含み、選択的スプライシングの促進に関与する。

別の糸状菌リボスイッチがアスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）において見出されており、ここでａｇａＡ遺伝子が、ｍＲＮＡアルギニン−結合により調節され、それにより、選択的スプライシングが促進される[Borsuk, P. et al. (2007). ”L-Arginine influences the structure and function of arginase mRNA in Aspergillus nidulans”. Biol Chem. 388: 135-144]。

抗生物質マーカーを欠いた組換え真菌産生宿主株についての現在の要望に応えるために、本発明者らは複数コピー宿主株を生成するための可能な選択肢を探している。

発明の要約
本発明者は、下流遺伝子の５′未翻訳領域に位置するスプライセオソームイントロンにおける分枝部位とアクセプター部位との間のヌクレオチドの数を変えることにより、スプライシング効率が前記下流遺伝子のために予想外に大きな発現範囲を提供するよう調整できることを見出した。野生型イントロンにおけるヌクレオチドの数は６であり、本発明者は、分枝部位及びアクセプター部位が１つのヌクレオチドと実際にオーバーラップするまで、各ヌクレオチドを連続的に除いた。イントロン変異体のこのライブラリーは、下記実施例が示すように、正常発現から非常に低レベルの発現まで、下流遺伝子の驚くべき広範囲の発現レベルを提供した。本発明者らは、これが遺伝子のコード配列内に位置するスプライセオソームイントロンの場合であると予測している。

低発現レベルは、真菌宿主細胞のゲノム中に組込まれるポリヌクレオチド配列に含まれる選択マーカーとの関連において特に興味深く、その理由は、それらが形質転換された細胞の選択を可能にするからであり、ここでポリヌクレオチドコンストラクトは、複数の直列的に増幅されたコピーの状態でゲノム中に組込まれている。この選択性が可能になる理由は、選択圧下で培養される場合、十分に低レベルで発現される選択マーカーの多くのコピーを有するそれらの細胞が、より少ないコピーを有する細胞よりも増殖優位性を有するからである。組込みコンストラクトにおける発現カセットは、選択マーカーと共に増殖され、それにより、より高い生成物収率を保証する。

さらに、本発明者により研究される特定のスプライセオソームイントロンは、いわゆるリボスイッチ、すなわちアスペルギラス・オリザエのｔｈｉＡリボスイッチ内に位置し、ここで通常、その遺伝子のプレ−ｍＲＮＡ選択的スプライシングに関与し、よって、細胞の必要とする十分なチアミン（むしろ又は、チアミン−ピロリン酸、ＴＰＰ）が存在するか否かに依存して、その発現レベルを調節する。本明細書において作り出されるイントロン変異体により示される予想外の広範囲の発現レベルにもかかわらず、本発明者は、本発明のイントロン変異体を含む宿主細胞に対するＴＰＰの添加が、ｔｈｉＡリボスイッチの作用を介して、さらに場合により検出以下のレベルにまで発現レベルを抑制することを見出した。

従って、第１の観点によれば、本発明は、そのゲノムに組込まれたポリヌクレオチドコンストラクトの、１又はそれ以上のコピーを含む、組換え真菌宿主細胞の構築方法に関するものであり、該方法は以下：
ａ）組込みポリヌクレオチドコンストラクトにより形質転換された真菌宿主細胞を供給し、ここで該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；
ｂ）前記形質転換された真菌宿主細胞を、前記選択マーカーの発現を促進する条件下で培養し；そして
ｃ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピー；好ましくは２以上のコピー；さらにより好ましくは３以上のコピー、最も好ましくは４以上のコピーを、ゲノム内に組み込まれた状態で含む、組換え真菌宿主細胞を単離すること、
を含む。

第２の観点によれば、本発明は、真菌宿主細胞の形質転換及び前記細胞のゲノムへの組込みのために適切なポリヌクレオチドコンストラクトに関するものであり、該コンストラクトは、以下：
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロン；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む。
。

第３の観点によれば、本発明は、ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞であって、該コンストラクトが、
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む。

最後の観点によれば、本発明は目的のポリペプチドの生成方法に関するものであり、以下：
ａ）第３の側面の組換え真菌宿主細胞を培養し；場合により、
ｂ）ポリペプチドを回収する、
ことを含む。

下記実施例のプラスミドpCOls1086の概略図を示す。

下記実施例のプラスミドpCOls1124の概略図を示す。

下記実施例のプラスミドpCOls1118の概略図を示す。

下記実施例のプラスミドpCOls1126の概略図を示す。

スプライセオソームイントロンＲＮＡプロセッシング、及びｔｈｉＡリボスイッチイントロンにおけるイントロン分枝部位「ｃｔａａｃ」（影付き）とイントロンアクセプター部位「ｔａｇ」（影付き）との間の距離が異なるように製造された８種の異なるコンストラクトの一般的な図を示す。２種の部位間の塩基の数は、０−６ｂｐ間で変化し、そして１つのコンストラクトは分枝部位の一部とオーバーラップし、そしてその一部を形成するアクセプター部位を有し、配列「ｃｔａａｃａｇ」をもたらし、ここで分枝部位は「ｃｔａａｃ」であり、アクセプター部位は「ｃａｇ」である。下記表に示されるように、後者の変異体は「イントロン（−１）」と命名された。他は、「イントロン（０）」、「イントロン（１）」、「イントロン（２）」、「イントロン（３）」「イントロン（４）」「イントロン（５）」及び最終的に野生型配列(図５)である「イントロン（６）」として命名された。

下記実施例４におけるサザンブロットの写真を示し；レーン１はＢｓｔＥIIにより消化されたλマーカーＤＮＡであり；レーン２はｐＣＯＩｓ１１７５により形質転換された菌株であり、レーン３はバックグラウンド菌株である。

定義
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟又はスプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写体がｍＲＮＡの前駆体となり、これがスプライシングを含む、一連の処理段階を経て、最終的にスプライシングされた成熟ｍＲＮＡを生じる。

コード配列：用語「コード配列」（coding sequence）とは、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は通常、オープンリーディングフレーム（open reading frame）により決定される。オープンリーディングフレームは、ＡＴＧ、ＧＴＧやＴＴＧ開始コドンにより開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせの何れでもよい。

制御配列：用語「制御配列」（control sequence）とは、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同種（同じ遺伝子から）でも外来（すなわち、異なった遺伝子から）でもよく、互いに同種でも外来でもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、制御配列にリンカーを付加してもよい。これによりそのような制御配列と、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのコード領域との連結が容易になる。

発現：用語「発現」（expression）とは、ポリペプチドの産生に関与する任意の段階を包含する。そのような段階としては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。

発現ベクター：用語「発現ベクター」（expression vector）とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする制御配列に操作可能的に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子を意味する。

宿主細胞：用語「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を含む。用語「宿主細胞」は、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。

単離された：用語「単離された」（isolated）とは、自然界では存在しない形又は環境での物質を意味する。単離された物質の非制限的例は、次のものを包含する：（１）任意の天然に存在しない物質；（２）例えば、限定されるものではないが、酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子をを包含する任意の物質であって、それらは自然界で関連する１又はそれ以上又はすべての天然に存在する構成成分から少なくとも部分的に除去される；（３）自然界で見出される物質に対して人工的に変性された任意の物質；又は（４）自然界で関連する他の成分に対する物質の量を増すことにより変性された任意の物質（例えば、前記物質をコードする遺伝子の複数のコピー；前記物質をコードする遺伝子と自然界において関連するプロモーターよりも強いプロモーターの使用）。単離された物質は、発酵培養液サンプル中に存在してもよい。

核酸コンストラクト：用語「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）とは、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、１又は２以上の制御配列を含む、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する。

作動式に連結された：用語「作動式に連結された」（operably linked）とは、コード配列が制御配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。

配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を、「同一性」（identity）というパラメーターで表す。

本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン５.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）

本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン５.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）

部分配列：用語「部分配列」（subsequence）とは、成熟ポリペプチドコード配列の５'及び／又は３'末端から１又は２以上（数個）のヌクレオチドが欠失してなるポリヌクレオチドを意味し、ここで部分配列は酵素活性を有するフラグメントをコードする。

スプライセオソームイントロン：用語「スプライセオソームイントロン」とは、イントロンとエキソンとの間の境界に位置する特異的イントロン配列により特徴づけられる核内ｍＲＮＡ前駆体イントロンについての別の用語である。それらの配列は、スプライシング反応が開始される場合、スプライセオソームＲＮＡ分子により認識される。さらに、それらは、分枝部位、５′未端に共有結合されるようになるイントロンの３′末端近くの特定のヌクレオチド配列、及び分枝イントロンを生成するスプライシング工程の間、イントロンのアクセプター部位を含む。それらの３種の短い保存された要素とは別に、核内ｍＲＮＡ前駆体イントロン配列は非常に多様である。

イントロン分枝部位：本明細書によれば、イントロン分枝部位は、ヌクレオチド配列「ＣＴＲＡＹ」、ここで、Ｒ＝ＡはＧ、及びＹ＝Ｃ又はＴであり、特に「ＣＴＡＡＣ」により定義される。

イントロンアクセプター部位：イントロンアクセプター部位はしばしば、２種のヌクレオチドＡＧにより特徴づけられるが、ヌクレオチドは、上流で直接的に、スプラシシング効率に影響を及ぼし、従って、本明細書によれば、イントロンアクセプター部位は、ＸＡＧ（ここで、Ｘ＝Ｇ又はＡ又はＴ又はＣ）として定義される。

発明の詳細な説明
ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法は、
ａ）組込みポリヌクレオチドコンストラクトにより形質転換された真菌宿主細胞を供給し、ここで該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；
ｂ）前記形質転換された真菌宿主細胞を、前記選択マーカーの発現を促進する条件下で培養し；そして
ｃ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピー；好ましくは２以上のコピー；さらにより好ましくは３以上のコピー、最も好ましくは４以上のコピーを、ゲノム内に組み込まれた状態で含む、組換え真菌宿主細胞を単離すること、
を含む。

第１の側面の好ましい実施形態によれば、前記工程（ａ）における真菌宿主細胞が成長不全を有し、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが前記宿主細胞のゲノム中に組込まれると、前記成長不全を補完する。これは、真菌細胞を選択する、段階（ａ）と（ｂ）との間の任意の容易な第２段階を可能にし、ここで少なくとも１つのコピーにおいてポリヌクレオチドコンストラクトのゲノム組込みが達成される。

適切な成長不全に関して、好ましくは、前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼを欠き、そして前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、それぞれ機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、又は機能的亜硝酸レダクターゼ、例えばｎｉｉＺをコードする遺伝子を含み；又は前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的エノラーゼを欠いており、そして前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが機能的エノラーゼ、例えばacuNをコードする補足遺伝子を含む。

他の適切な不全は、糖新生炭素源に基づいて増殖する真菌細胞の必須の機能性に関する。例えば、好ましくは、段階（ａ）の真菌宿主は、不活性ａｃｕＫ又はａｃｕＭ遺伝子を有し、そして組込みポリヌクレオチドコンストラクトは、それぞれ、補充性機能的ａｃｕＫ又はａｃｕＭ遺伝子を含む[Hynes M. et al. Transcriptional Control of Gluconeogenesis in Aspergillus nidulans, Genetics 176: 139-150 (May 2007)]。

好ましくは、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトは、形質転換の後、非相同組換えによりゲノム内にランダムに組込まれる。

しかしながら、しばしば、高い程度の制御が好ましく、ここで前記段階（ａ）における組込みポリヌクレオチドコンストラクトの片側又は両側に隣接して相同性ボックスが配置され、当該相同性ボックスが、形質転換の後、相同組換えにより真菌宿主細胞ゲノム中への組込みポリヌクレオチドコンストラクトの位置特異的組込みを可能にするのに十分な大きさ、且つ、前記真菌宿主細胞ゲノム内の特定遺伝子座に対して十分な配列相同性を有する。有利には、真菌宿主における特定の遺伝子座は、成長不全を作り出すために、例えば部分欠損により不活性化された同じ遺伝子を有する。次に、ポリヌクレオチドコンストラクトの相同性ボックスは、同じ遺伝子又はその一部の完全なコピーであってもよく、結果的に、相同性ボックスと、ゲノム不活性化された遺伝子との間の相同組換えを介してポリヌクレオチドコンストラクトの少なくとも１つのコピーを達成できる位置特異的組込みが、ゲノム中の機能的遺伝子の復元又は同じ遺伝子の機能的バージョンによる置換をもたらす。

好ましくは、前記スプライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する。他方では、好ましくは、前記スピライセオソームイントロンは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本発明者らははすでに以下について述べる：本発明者は、Ａ．オリザエからのｔｈｉＡリボスイッチのスプライセオソームイントロンを用いて第１のの観点の方法を行い、そしてこれが、下流遺伝子のさらに大きな程度の発現レベル制御を可能にしたことを示した。従って、第１の観点の方法の好ましい実施形態によれば、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドは、それと操作可能的に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する。

好ましくは、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドは、選択マーカーオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ又はＰｙｒＧをコードする。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドは、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む。

核酸コンストラクト
本発明の第２の観点は、真菌宿主細胞の形質転換及び前記細胞のゲノム中への組込みに適したポリヌクレオチドコンストラクトに関し、ここで前記コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと操作可能的に連結されるリボスイッチが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロン；及び目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含む。

第２の側面の好ましい実施形態によれば、ポリヌクレオチドコンストラクトは、機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、機能的亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は機能的エノラーゼ、例えばａｃｕＮをコードする遺伝子を含む。

第２の側面の好ましい実施形態によれば、ポリヌクレオチドコンストラクトは、組込みポリヌクレオチドコンストラクトの片側又は両側に隣接して相同性ボックスが配置され、当該相同性ボックスが、形質転換の後、相同組換えにより真菌宿主細胞ゲノム中への組込みポリヌクレオチドコンストラクトの位置特異的組込みを可能にするのに十分な大きさ、且つ、前記真菌宿主細胞ゲノム内の特定遺伝子座に対して十分な配列相同性を有する。

好ましくは、前記スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する。他方では、前記スピライセオソームイントロンは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

好ましい実施形態によれば、本発明の組込みポリヌクレオチドコンストラクトに位置する第１ポリヌクレオチドは、それと操作可能的に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する。

好ましくは、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドは、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む。

本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向付ける１又は２以上の制御配列に作動式に連結される本発明の第１及び／又は第２ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関する。

ポリペプチドの発現を可能とするために、ポリヌクレオチドを、種々の手法により操作してもよい。発現ベクターの種類によっては、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作することが好適又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する手法は、当業者には周知である。

制御配列としては、プロモーター、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識されるポリヌクレオチドが挙げられる。プロモーターは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なるポリヌクレオチドであってもよく、突然変異型、切断型、ハイブリッド型のプロモーターであってもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得されてもよい。

糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００/５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼ II、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−キシロシダーゼ由来のプロモーター、並びに NA2-tpiプロモーター（アスペルギルス（Aspergillus）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾されたプロモーターであって、ここで、非翻訳リーダーは、アスペルギラストリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの非翻訳リーダーにより置換されており；非制限的な例としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾されたプロモーターを包含し、ここで非翻訳リーダーはアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの未翻訳リーダーにより置換されている）；並びにこれらの突然変異型、切断型、ハイブリッド型プロモーターが挙げられる。

酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH１、ADH２/GAP）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。

制御配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーターも挙げられる。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に操作可能的に連結される。本発明では、宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。

糸状菌宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ由来のターミネーターが好ましい。

酵母宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。

制御配列はまた、プロモーターの下流及び遺伝子の発現を高める遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化剤領域であってもよい。

適切な安定化剤領域の例は、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis） cryIIIA遺伝子(国際公開第94/25612号) 及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis） SP82 遺伝子から得られる(Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471)。

制御配列としては、リーダーも挙げられる。リーダーは、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に操作可能的に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のリーダーが使用されてもよい。

糸状菌宿主細胞の場合、リーダーとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のリーダーが好ましい。

酵母宿主細胞に適したリーダーとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）由来のリーダー配列が挙げられる。

制御配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、ポリヌクレオチドの３’末端に操作可能的に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。

糸状菌宿主細胞の場合、ポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ由来のポリアデニル化配列が好ましい。

酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。

制御配列としては、シグナルペプチドコーディング領域であってもよくこれは、ポリペプチドのＮ−末端に連結され、ポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するためのシグナルペプチドをコードするシグナルペプチドコード領域である。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、ポリペプチドをコードするコーディング配列のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング配列を有していてもよい。一方では、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコード配列を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング配列が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング配列を有さない場合である。一方では、ポリペプチドの分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング配列により、生来のシグナルペプチドコーディング配列をそのまま置換してもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング配列を使用できる。

糸状菌宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ランギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ由来の配列が挙げられる。

酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼが挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。

制御配列としては、プロペプチドコーディング配列も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ−末端に配置されるプロペプチドをコードする配列である。得られるポリペプチドは酵素前駆体（proenzyme）又はプロポリペプチド（propolypeptide）（或いは場合によりチモーゲン（zymogen））と呼ばれる。プロポリペプチドは通常不活性であるが、触媒又は自己触媒によりプロペプチドがプロポリペプチドから切断されると、活性ポリペプチドに転換される。プロペプチドコーディング配列としては、バチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）アルカリプロテアーゼ（aprE）、バチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）中性プロテアーゼ(nprT)、ミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子由来の配列が挙げられる。

シグナルペプチド及びプロペプチド配列の双方が存在する場合には、ポリペプチドのＺＮ−末端の隣にプロペプチド配列が配置され、プロペプチド配列のＮ−末端の隣にシグナルペプチド領域が配置される。

また、宿主細胞の生育との関連において、ポリペプチドの発現調節を可能にする調節配列を付与することも望ましい。調節系の例としては、調節化合物の存在等の化学又は物理刺激に応答して遺伝子の発現を開始又は停止させる系が挙げられる。原核細胞系における調節系としては、lac、tac、及びtrp オペレータ系が挙げられる。酵母においては、例えば ADH2 系又はGAL1 系が使用できる。糸状菌においては、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA α−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用できる。他の調節配列の例としては、遺伝子の増幅を可能にする系が挙げられる。真核細胞系におけるそれらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動的に連結される。

発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む組換え発現ベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び制御配列を組み合わせ、１又は２以上の制限部位を含む組換え発現ベクターを構築すれば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをそのような部位に挿入又は置換することができ、好適である。他方では、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを作製する際には、発現に適した制御配列とコーディング配列とが操作可能的に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に利用でき、且つポリヌクレオチドの発現を生じ得るものであれば、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）が使用できる。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞と、ベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状でも閉環状プラスミドでもよい。

ベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外成分として存在し、染色体複製とは独立に複製するベクターであってもよい。例としては、プラスミド、染色体染色体要素、ミニ染色体、又は人工染色体等が挙げられる。前記ベクターは、自己複製を促進する任意の手段を含んでいてもよい。他方では、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組み込まれ、統合された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡは、単一のベクター又はプラスミドが含んでいてもよく、又は２以上のベクター又はプラスミドが共同で含んでいてもよい。

ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入等を生じた細胞の選択を容易にする、１又は２以上の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、殺生物剤、ウイルス耐性、重金属耐性、原栄養又は栄養要求性等を付与する物質を産生する遺伝子である。

糸状菌宿主細胞に使用される選択マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hph（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の amdS 及び pyrG 遺伝子、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）の bar 遺伝子が好適である。

ベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み、又は、細胞内におけるゲノムとは独立したベクターの自律的な複製を可能にする（１又は２以上の）要素を含むことが好ましい。

宿主細胞ゲノムへの組み込みの場合、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、或いはベクターのその他の要素に基づく相同又は非相同組換えにより、ゲノムへの組み込みを生じさせてもよい。或いは、宿主細胞ゲノムの（１又は２以上の）染色体内の（１又は２以上の）正確な位置に対して、相同組換えによるベクターの組み込みを生じさせるような更なるヌクレオチド配列を、ベクターが含んでいてもよい。正確な位置に組み込まれる確率を高めるべく、組み込み要素は、相同組換えの可能性を高めるよう、対応する標的配列と高い同一性を有する十分な数の核酸（例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対）を有することが好ましい。斯かる組み込み要素は、宿主細胞のゲノムの標的配列に相同な配列であれば、任意の配列でよい。更に、組み込み要素は、非コード又はコードポリヌクレオチド配列でもよい。一方、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。

自律的な複製の場合、ベクターはさらに、所期の宿主細胞内でのベクターの自律的な複製を可能にする複製起点を含んでいてもよい。複製起点としては、自律的複製を生じさせるプラスミド複製子であって、細胞内で機能する任意の配列が挙げられる。用語「複製起点」（origin of replication）又は「プラスミド複製子」（plasmid replicator）とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。

酵母宿主細胞に使用される複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、及び、ARS4とCEN6との組み合わせが挙げられる。

糸状菌細胞において有用な複製起点の例としては、AMA1 及び ANS1 が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。AMA1 遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の手法により達成することができる。

ポリヌクレオチドを１コピー以上、宿主細胞に挿入することにより、ポリペプチドの産生を増進してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増大は、前記配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノム内に組み込むことにより、或いは、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチド内に含め、適切な選択物質の存在下で細胞を培養した場合に、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、更には前記ポリヌクレオチドの更なるコピーを含む細胞が選択できるようにすることにより達成される。

上述の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築する手法は、当業者には周知である（例えば Sambrook et al., 1989（同上）参照）。

宿主細胞
本発明の第３の側面は、そのゲノムに組込まれるポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーを含む組換え真菌宿主細胞に関し、ここで前記コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと操作可能的に連結されるリボスイッチが、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含む。

第３の側面の好ましい実施形態によれば、真菌宿主細胞は、ポリヌクレオチドコンストラクトの２又はそれ以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で；さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドコンストラクトの３又はそれ以上のコピー、及び最も好ましくは４又はそれ以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む。

好ましくは、組込みポリヌクレオチドコンストラクトは、非相同組換えによりゲノム中にランダムに組込まれ、又は組込みポリヌクレオチドコンストラクトは、相同組換えにより、ゲノム中に；好ましくは硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子中に；より好ましくは、糖新生のために必要とされる遺伝子中に；及び最も好ましくは、ｎｉａＤ、ｎｉｉＡ、ａｃｕＮ、ａｃｕｋ又はａｃｕＭ遺伝子座中に、部位特異的に組込まれる。

好ましい実施形態によれば、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する。

第３の側面の別の好ましい実施形態によれば、スピライセオソームイントロンは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

好ましくは、組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドは、それと操作可能的に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来し；さらにより好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチを含み；最も好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチから成る。

また、好ましくは、組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドは、選択マーカーオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ又はＰｙｒＧをコードする。

第３の側面の別の好ましい実施形態によれば、組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドは、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む。

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの生成を方向付ける1又は２以上の制御配列に操作可能的に連結される。ポリヌクレオチドを含むコンストラクト又はベクターは宿主細胞中に導入され、その結果、コンストラクト又はベクターは、これまでに記載されたように、染色体組込み体として、又は自己複製染色体外ベクターとして維持される。用語「宿主細胞」とは、複製の間に生じる突然変異のために親細胞に対して同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、大部分、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に依存する。

宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成において有用な任意の細胞、例えば真菌細胞であってもよい。

本明細書において「真菌」（fungi）とは、子嚢菌（Ascomycota）門、担子菌（Basidiomycota）門、ツボカビ（Chytridiomycota）門、及び接合菌（Zygomycota）門、並びに卵菌類（Oomycota）及び全ての分生子形成菌を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK の定義による）。

真菌宿主細胞は酵母細胞であってもよい。本明細書において「酵母」（yeast）とは、有子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び不完全菌に属する酵母（Blastomycetes）を含む。酵母の分類は今後変更される可能性があるが、本発明の目的においては、酵母はBiology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載の定義に従うものとする。

酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞であってもよい。

真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」は（Hawksworth et al., 1995（同上）に定義のとおり）全ての真菌亜門（Eumycota）及び卵菌亜門（Oomycota）の線状体を含む。糸状菌は通常、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素代謝は偏性好気性である。対して酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素代謝は醗酵であってもよい。

糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、テルモアスカス（Thermoascus）、ティエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。

例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、ブジェルカンデラ・アジュスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレジエナ（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ジルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロザ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネガンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクララム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコキロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロール（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。

真菌細胞は、公知の手法により、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換してもよい。アスペルギウス（Aspergillus）及びトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号及び Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422に記載されている。フザリウム（Fusarium）種の形質転換に適した手法は、Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、例えばBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；及び Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 に記載の手法により形質転換される。

生成方法
本発明はまた、前記第３の観点に従って、組換え真菌宿主細胞を培養し、そして任意には、ポリペプチドを回収することを含む、目的のポリペプチドの生成方法にも関する。

宿主細胞が、当業者において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養されてもよい。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地において、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、又は小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固体状態発酵を包含する）により培養されてもよい。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業者において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収されてもよい。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。

ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的な、当業者において知られている方法を用いて検出されてもよい。それらの検出方法は、特定の抗体、ポリペプチド生成物の形成、又は酵素基質の消出の使用を包含するが、但しそれらだけには制限されない。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用されてもよい。

ポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収されてもよい。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から回収されてもよい。

本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製されてもよい（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。

別の観点によれば、ポリペプチドは回収されないが、むしろポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞が、ポリペプチド源として使用される。

材料及び方法
固形寒天上及び液体培地注での菌株の増殖
すべての菌株を、形質転換後、３０℃、プレート上で増殖させた。液体培地を用いる場合、インキュベーションを、１８０ｒｐｍでの振盪下、３０℃で行った。

リパーゼアッセイ
・希釈緩衝液：
・５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５
・１０ｍＭＣａＣｌ₂
・０．１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００
・基質原液：１１７μｌｐ−ニトロフェニルバレレート（ＳｉｇｍａＮ４３７７）を、１０ｍｌのメタノールにより希釈する
・基質：１０ｍｌ希釈緩衝液を、１００μｌ基質原液に添加する。
１０μｌのサンプルを、１ｍｌの基質に添加、生成物の形成後４０５ｎｍでの吸光度を測定する。

スクロース培地
１Ｍのスクロース
０．１８μＭＮａ₂Ｂ₄Ｏ₇
２．３μＭＣｕＳＯ₄
４．７μＭＦｅＳＯ₄
４．７μＭＭｎＳＯ₄
３．６μＭＮａ₂ＭｏＯ₄
４５μＭＺｎＳＯ₄
７ｍＭＫＣｌ
４．３ｍＭＭｇＳＯ₄
１１．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄

イン−フュージョンクローニング（In-Fusion Cloning）
イン−フュージョンクローニングを、Clontech Laboratories, Inc.製In-Fusionクローニングキット及びマニュアルを用いて行った。

実施例１：イントロンライブラリーの製造
アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のｔｈｉＡプロモーター、及びその５′未翻訳領域（ＵＴＲ）リボスイッチを、下記プロモーターを用いて増幅した：
P722 (配列番号1): atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac; 及び
P723 (配列番号2): gagctcctcatggtggatccactagtgcatgccaagttgcaatgactatcatctg。
得られる１３３８ｂｐのフラグメントを、Clontech In-Fusionキットを用いて、ベクターpCOls207 (配列番号21)からの７７１８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＨａｍＨＩに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローン化した。得られたベクターを、ｐＣＯＩｓ１０８６と命名し、図１に示す。

プラスミドｐＪａＬ１９６２（配列番号２２で示される完全配列）を、ＳｐｈＩ／ＡｆｅＩにより切断し、得られた４８４０ｂｐのフラグメントを精製した。

プラスミドｐＣＯＩｓ１０８６をＮｈｅＩにより切断し、クレノウに（Klenow）よりブラント末端化し、再びＳｐｈＩ及びＫａｓＩにより切断した。得られる４６７７ｂｐのフラグメントを精製し、そしてｐＪａＬ１２６２からの４８４０ｂｐのフラグメントに連結し、そして得られるベクターを、ｐＣＯＩｓ１１２３と命名した。

アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のｐｙｒＧ遺伝子を、下記プライマーを用いて、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）Ａ１５６０由来の染色体ＤＮＡから増幅した：
P766（配列番号3): gtcattgcaacttggccaacatgtcttccaagtcgc; 及び
P767 (配列番号4): accatgattacgccgcattagtgataccccactctaag。

ＰＣＲ生成物を、ＳｐｈＩにより線状化されたベクターｐＣＯＩｓ１１２３にIn-Fusionクローン化した。

ＳＯＥ−ＰＣＲ生成物を、鋳型及びプライマーとしてｐＣＯＩｓ１１２４を用いて製造した：
P722 (配列番号1): atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac
P769 (配列番号5): ccgcggcaagttgcaatgactatcatctg
P771 (配列番号6): aattcgaaggcctcccatcaccatcaccatcactaag
P503 (配列番号7): acatgatcatataaccaattgccctcatccccatcctttaac。

図３に示されるプラスミドｐＣＯＩｓ１１１８（配列番号２３での完全配列）を、Ｈｉｎｄ III 及びＳａｌＩにより切断した。得られる６７６２ｂｐのフラグメントを、Ｈｉｎｄ III 及びＳａｌＩにより切断されたＳＯＥ−ＰＣＲ生成物に連結した。得られるプラスミドをｐＣＯＩｓ１１２６と命名し、そして図４に示す。

ｔｈｉＡリボスイッチ中のイントロン分枝部位（図５、影付き）とイントロンアクセプター部位「ｔａｇ」（図５、影付き）との間に異なった距離を有する８種の異なったコンストラクトを製造した。２つの部位間の塩基の数を、０〜６ｂｐの間に変え、そして１つのコンストラクトは、分枝部位の一部とオーバーラップし且つその一部を形成するアクセプター部位を有し、結果として配列「ｃｔａａｃａｇ」をもたらし、ここで分枝部位は「ｃｔａａｃ」、アクセプター部位は「ｃａｇ」である。後者の変異体を「イントロン（−１）」と命名した。他は「イントロン（０）」、「イントロン（１）」、（イントロン（２））、「イントロン（３）」、「イントロン（４）」、「イントロン（５）」及び最終的に、「イントロン（６）」（これは、野生型配列（図５）である）と命名した。

野生型配列イントロン（６）(図５)における同じリーディングフレーム中に２つの停止コドン「ＴＧＡＴＡＧ」が存在する。未知の上流遺伝子からの任意のリードスルーを避けるために、野生型配列の場合と同じリーディングフレームに、変異体コンストラクトにおける少なくとも２つの停止コドンを維持することが決定された。これは、単に分枝部位とアクセプター部位との間から、１つのヌクレオチドを除去すること以外に、わずかに配列を修飾することにより達成された。従って、その配列は完全には同一ではないが、しかしこれは、分枝部位とアクセプター部位との間の距離の短縮と比較して、コンストラクトのスプライシング効率における顕著な影響を及ぼすものとは予測されない。

コンストラクトを、フォワード−プライマー：ｐ７８２（配列番号８）：ccttgatactctgtgagcgct；及び以下のリバースプライマーを、コンストラクト当たり１つ用いて、プラスミドｐＣＯＩｓ１１２４におけるリボスイッチのＰＣＲにより製造した。
P783 (配列番号9): gagctcctcatggggccgcggcaatgactatcatctgttagccattccatcaacagg
P784 (配列番号10): gagctcctcatggggccgcggcaatcaactatctcagttagccattccatcaacagg
P785 (配列番号11): gagctcctcatggggccgcggcaatcagactattcagttagccattccatcaacagg
P786 (配列番号12): gagctcctcatggggccgcggcaatcatcactatcagttagccattccatcaacagg
P787 (配列番号13): gagctcctcatggggccgcggcaatcatcaactatcgttagccattccatcaacagg
P788 (配列番号14): gagctcctcatggggccgcggcaatcatcagactatgttagccattccatcaacagg
P789 (配列番号15): gagctcctcatggggccgcggcaatcatcatgactagttagccattccatcaacagg
P792 (配列番号16): gagctcctcatggggccgcggcaatgaggatcatctgttagccattccatcaacagg。

ＰＣＲコンストラクトは、プラスミドｐＣＯＩｓ１１２６由来の７６６１ｂｐのＨｉｎｄIII ／ＳａｃIIフラグメントへそれぞれIn-Fusionクローン化され。下記表１は、別のイントロン（図５に示される）を作り出すために使用されるプライマーの概要、及び得られるプラスミドの名称を与える。

実施例２：マーカー発現を調節するためのイントロン変異体の使用
すべてのリボスイッチイントロン変異体を、pＣＯＩs１１２６のリパーゼレポーター遺伝子に融合させた。得られたコンストラクトは、それぞれ後のコンストラクトにより修復されたniaD遺伝子を部分的に欠損する、アスペルギラス・オリザエ株の１つのコピーのniaD遺伝子座に組込まれ、その結果単独の窒素源として硝酸塩において増殖することを可能にした。

形質転換体は、スクロース培地において３日間増殖させ、そして上清液のリパーゼ活性を、上記に詳述のとおり測定した。確認されたリパーゼ活性を、下記表２に要約する。

当該結果から、発明者らは、下流の作動的に結合された遺伝子の発現レベルの範囲を提供する異なるイントロンスプライシング効果により、一連のイントロン含有５ＵＴＲを作ることを可能にすると結論する。
スプライシング効果が低いと、発現されたmRNAの割合はイントロン配列を含み、イントロン内での翻訳開始及び即時翻訳終了を結果としてもたらし、下流の遺伝子産生物の翻訳を阻止する−表２に示すリパーゼ活性により行われたとおりである。

実施例３：イントロンリボスイッチ変異体はチアミンにより制御可能である
４種のｔｈｉＡリボスイッチイントロン変異体株：（６）、（３）、（０）及び（−１）を、それぞれ、チアミン（１０μＭのチアミンＨＣｌ）の補充を伴わないで又はその補充を伴って、スクロース培地において４８時間、増殖させた。サンプルを、すでに示されているように、リパーゼ活性について分析した：結果は下記表３に示す。

発明者らは、イントロン（０）及びイントロン（−１）からの何れの活性も決定できなかった（「ＵＤ」）が、しかしイントロン（６）の野生型配列は、予測されるように、チアミンの添加により、実際に約１００倍抑制され、そしてイントロン（３）は、その変異体における短縮された分枝及びアクセプター部位の距離により、最大減少で約１０倍、抑制された。

実施例４：高いコピー数の組み込み遺伝子を有する形質転換された株の選択のためへのイントロン変異体の使用
この実施例は、高いコピー数のマーカー遺伝子を有する形質転換体を得るために、(発現レポーターよりもむしろ)選択マーカーの発現を制御するためのイントロン変異体及びそれらのチアミン制御の使用を示す。マーカー遺伝子は、我々が高レベルで発現したいと思う目的の遺伝子を含む発現カセットに連結され；発現カセットは、マーカー遺伝子と共に複製され、従って、そのコピー数は同様に高くなる。

野生型ｔｈｉＡリボスイッチである、イントロン（６）、及び３種のイントロン変異体である、イントロン（３）、イントロン（０）及びイントロン（−１）を、アスペルギラス・オリザエからのｐｙｒＧ遺伝子の前方にクローン化した。コンストラクトを、リパーゼ発現カセットに融合した。そのカセットからの発現を、遺伝子コピー数のためのベンチマークとして使用した。

プラスミドｐＣＯＩｓ１１３０を、下記プライマー対Ｐ７２２／ｐ７６９及びＰ７７５／７６７を用いて、ｐＣＯＩｓ１１２４（図２）上でＳＯＥ−ＰＣＲを実施することにより製造した：
P722 (配列番号1): atctcgagctcgcgaaagcttttcggtaaatacactatcacacac
P769 (配列番号5): ccgcggcaagttgcaatgactatcatctg
P775 (配列番号17): gatagtcattgcaacttgccgcggcaccatgtcttccaagtcgcaattgac
P767 (配列番号18): accatgattacgccgcattagtgataccccactctaag。

次に、ＳＯＥ−ＰＣＲを、プライマー対Ｐ７２２／Ｐ７６７を用いて行い、得られるフラグメントを、ＨｉｎｄIII ／ＢｓｉＷＩにより切断し、ｐＣＯＩｓ１１２４からの８３８９ｂｐのＨｉｎｄIII ／ＢｓｉＷＩフラグメントに連結した。得られるプラスミドを、ｐＣＯＩｓ１１３０と命名した。

ｐｙｒＧに融合された４種のイントロン変異体コンストラクトの構成
プラスミドｐＣＯＩｓ１１３０を、ＨｉｎｄIII ／ＳａｃIIにより切断し、そして９４０６ｂｐのフラグメントを精製した。

プラスミドｐＣＯｌｓ１１３５、ｐＣＯｌｓ１１３８、ｐＣＯｌｓ１１４１及びｐＣＯｌｓ１１４８（表１を参照のこと）をすべて、ＨｉｎｄIII ／ＳａｃIIにより切断し、そして１２８６ｂｐのフラグメントを、ｐＣＯＩｓ１１３０からの９４０６ｂｐのフラグメントに連結した。得られるプラスミドは、下記表４に従って命名された。

４種のプラスミドｐＣＯｌｓ１１７２、ｐＣＯｌｓ１１７３、ｐＣＯｌｓ１１７４及びｐＣＯｌｓ１１７５は、ｐｙｒＧを欠きされ、ｎｉａＤ遺伝子座でプラスミドを組込むことにより修復されることができた部分ｎｉａＤ遺伝子を有するＡ．オリザエ株をにおいて、それぞれすべて形質転換され。形質転換混合物を、次の３種の培地を含むプレート上に広げた。
Ａ）スクロース培地＋１０ｍＭＮａＮＯ₃＋２０ｍＭウリジン
Ｂ）スクロース培地＋１０ｍＭＮａＮＯ₃
Ｃ）スクロース培地＋１０ｍＭＮａＮＣＯ₃＋１０μＭチアミンＨＣｌ
異なったプレート上の形質転換体を、計数し、その結果は、下記表５に示す。

ｐｙｒＧの発現が必要とされる、培地Ｂ及び培地Ｃ上で、発明者らは形質転換体の増殖が異なることを見出した。発明者らは正常且つ野生型株と同じ速度で増殖したそれらの形質転換体である、幾つかの形質転換体を大（large）であると分類した。他の形質転換体は、非常に遅く増殖した。

イントロン（３）及びイントロン（０）について、培地Ｃ上の形質転換体の数は、培地Ｂ上での数よりも低く、このことは、ｐｙｒＧ遺伝子の発現を制御するチアミンの効果が存在することを示唆する。ｐｙｒＧマーカーの前にイントロン（３）、イントロン（０）及びイントロン（−１）を用いる場合、ｐｙｒＧ遺伝子の１以上のコピーが細胞の増殖に必要とされることを発明者らは結論付ける。

イントロン（０）及びイントロン（−１）コンストラクトにより得られる、いわゆる大きなコロニーが発現コンストラクトの非常に高い数のコピー含むことを確認した。これは、ＡａｔII及びＡｆｅＩにより染色体ＤＮＡを消化するサザン分析により、及び次いでｎｉａＤ組込みフラグメントをプローブとして用いることにより決定された（図６を参照のこと）。図６によれば、バックグラウンド株がプローブを結合する１つのフラグメントを有し、一方、ｐＣＯＩｓ１１７５により形質転換された株は、挿入部位を端に有する配列を含むフラグメントへのプローブの結合、及び非常に高い強度を有するバンドを示す完全な発現コンストラクトを示した；これは、発現コンストラクトの多くのコピーを示す。

実施例５：連続(in tandem)リボスイッチはより広範囲のチアミン抑制を示す
特定遺伝子の前の複数のｔｈｉＡリボスイッチは、細胞内のチアミン濃度がＴＰＰ結合部位のある程度の占有を可能にする場合、メッセンジャーＲＮＡが損なわれていないリボスイッチの１つと共に細胞質に侵入する可能性を高めるであろう。実際、高濃度チアミン条件で、２以上のｔｈｉＡリボスイッチが、作動的に連結される下流コード配列のチアミン抑制の増加を促進するはずである。

ｔｈｉＡリボスイッチを、１又は２のコピーに合成的に構築し、ｔｈｉＡリボスイッチの後、及びｐＣＯＩｓ１１２６のリパーゼレポーター遺伝子の前に配置し（図４）、プラスミドｐＣＯＩｓ１１４２（２つのリボスイッチ）及びｐＣＯＩｓ１１４３（３つのリボスイッチ）を得た。
リボスイッチの５′末端は、配列番号１９：ccgctcccacacaattctctであった。
リボスイッチの３′末端は、配列番号２０：tcattgcaacttgであった。

コンストラクトを、１つのコピーで、ｎｉａＤ遺伝子座でＡ．オリザエに組込み、結果として表７に示される株を得た。

表７における３種の株を、チアミンを添加していないスクロース培地において３０℃で４８時間、増殖した。サンプルを採取し、上記のようにリパーゼレポーター活性について分析した。

表７におけるＲｉｂｏ２株の活性は、Ｒｉｂｏ１株に比較してわずか４８％であり、Ｒｉｂｏ３株は、Ｒｉｂｏ１株に見出される活性のわずか３２％を生成した。これらの結果は、所定の遺伝子の前の１又は２のｔｈｉＡリボスイッチの存在はその発現相応に低めることを示す。

我々はまた、培地に１μＭのチアミンの添加を伴う類似の実験を行った、しかしＲｉｂｏ２及びＲｉｂｏ３株からの発現レベルは、発明者らのリパーゼアッセイの検出レベル以下であった。これは、それらの連続コンストラクトを用いて高程度の抑制を示し、同様に１つのリボスイッチを用いる場合より広範囲の抑制を示す。

実施例６：オープンリーディングフレーム内のリボスイッチイントロンはリボソーム再開始の問題を克服する
任意のリボスイッチコンストラクトをｐｇｒＧマーカーの前に配置し、そして我々が十分な抑制を与えるものと予測した濃度のチアミンにおいても、我々は少数の形質転換体を常に得ることができたことを確認した。これは、イントロンに存在するＡＴＧコドンの何れかでの開始を伴わないリボスイッチイントロンのリボソームリードスルーに起因するか、又はｐｙｒＧ開始コドンでの起こった再開始からのものであると考えられる。

ｐｙｒＧマーカーの発現をさらに低いレベルにするために、リボスイッチイントロンを、ｐｙｒＧオープンリーディングフレームの内側に移動することができる。これは、イントロンがスプライシングされていない場合、機能性ｐｙｒＧ発現生成物の形成を防止するであろう。

実施例７：合成イントロンライブラリーの製造
合成イントロンを、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のｔｈｉＡ遺伝子からのリボスイッチにおける第２イントロンの分枝部位、アクセプト部位のコンセンサス配列から構築した。合成イントロンは、非常に良好なコザック配列を有し、そして異なったフレームに存在する２種の非常に効果的な翻訳開始部位を含む。イントロン内のそれらの２種のオープンリーディングフレームが、イントロン分枝部位の前で終結される。さらに、イントロンは、効率の低いコザックを有する６種の他の翻訳開始部位を含み、従って欠損した上流翻訳開始部位を有するリボソームの翻訳開始にあまり寄与しない。修飾されたイントロンを、イントロン内の翻訳開始部位からのリボソーム翻訳を阻止する、すべての３種のリーディングフレームに停止コドンを含む、配列tgtacattgattaattgacaccATG（配列番号２４）に融合した。さらに、配列番号２４は、３′末端にコザック、及び実施例で用いられたリパーゼレポーター遺伝子のための翻訳開始コドンを含む。

合成イントロンの８種の異なった変異体を、分枝部位「ｃｔａａｃ」配列と、スプライスアクセプター部位「ｔａｇ」との間の距離を変えることにより製造した。それらの８種の配列中、イントロン（−１）についてはスプライスアクセプター部位が欠失されたトリプレット「ｔａｇ」の最初の塩基を有し、その結果分枝部位及びアクセプター部位は、配列「ｃｔａａｃａｇ」中に融合され、アクセプター部位は分枝部位の一部をなしている。８種のイントロン変異体の概要については、表８を参照のこと。

すべての８種のイントロン変異体を、リパーゼレポーター遺伝子のスプライス分枝部位と、翻訳開始コドンとの間のｐＣＯＩｓ１１２６に存在するレポーターコンストラクトにクローン化した。得られたコンストラクトは、niaD遺伝子を部分的に欠損する、アスペルギラス・オリザエ株のniaD遺伝子座に１のコピーでそれぞれ組込まれ、それは後にそれぞれコンストラクトにより修復されることにより単一の窒素源として硝酸塩上での増殖を可能にする。。個々のコンストラクトは、結果へのコピー数の影響を除外するために、単一のコピーの存在下で検証された。

効果的スプライシングのためには分枝部位とスプライスレセプター部位との間にある程度の間隔が必要であるため、少ない間隔を有するコンストラクトはレポーター遺伝子の低い発現を示した。翻訳は非スプライスイントロン内の翻訳開始部位で開始され、そしてリパーゼレポーター遺伝子に達する前、停止されるためである。よって、分枝部位とレセプター部位との間の間隔の変更は、遺伝子発現の変更の効果的な手段である。ｔｈｉＡプロモーター及びｔｈｉＡリボスイッチが使用されている当該実施例によれば、チアミンの外因性供給を変更することによってさらに変更することができる。しかしながら、内因性チアミン濃度は、チアミン抑制に影響を及ぼす様々な増殖期で変化し、一方でスプライシングの効率は一定であると予測される。従って、遺伝子発現の一定の調節は、誘発又は抑制可能なプロモーターの使用のに代えて、スプライス部位変異体を用いることにより得られる。これは一定且つ正確なレベルの遺伝子発現が所望される場合、重要である。

Claims

ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法であって、
ａ）組込みポリヌクレオチドコンストラクトにより形質転換された真菌宿主細胞を供給し、ここで該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；
ｂ）前記形質転換された真菌宿主細胞を、前記選択マーカーの発現を促進する条件下で培養し；そして
ｃ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピー；好ましくは２以上のコピー；さらにより好ましくは３以上のコピー、最も好ましくは４以上のコピーを、ゲノム内に組み込まれた状態で含む、組換え真菌宿主細胞を単離すること、
を含む、方法。
前記真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞；好ましくはアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である、請求項１に記載の方法。
前記真菌宿主細胞が、酵母宿主細胞；好ましくはカンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項１に記載の方法。
前記工程（ａ）における真菌宿主細胞が成長不全を有し、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが前記宿主細胞のゲノム中に組込まれると、前記成長不全を補完する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、それぞれ機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、又は機能的亜硝酸レダクターゼ、例えばｎｉｉＺをコードする遺伝子を含み；又は前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的エノラーゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが機能的エノラーゼ、例えばacuNをコードする遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、形質転換の後、非相同組換えによりゲノムにランダムに組込まれる、請求項４に記載の方法。
前記段階（ａ）における組込みポリヌクレオチドコンストラクトの片側又は両側に隣接して相同性ボックスが配置され、当該相同性ボックスが、形質転換の後、相同組換えにより真菌宿主細胞ゲノム中への組込みポリヌクレオチドコンストラクトの位置特異的組込みを可能にするのに十分な大きさ、且つ、前記真菌宿主細胞ゲノム内の特定遺伝子座に対して十分な配列相同性を有する、請求項４に記載の方法。
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する、請求項１〜９の何れか１項記載の方法。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、選択マーカーオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ又はＰｙｒＧをコードする、請求項１〜１０の何れか１項記載の方法。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項１〜１１の何れか１項記載の方法。
真菌宿主細胞の形質転換及び前記細胞のゲノム中への組込みに適したポリヌクレオチドコンストラクトであって、
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロン；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチドコンストラクト。
前記真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞；好ましくはアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である、請求項１３に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記真菌宿主細胞が、酵母宿主細胞、好ましくはカンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項１３に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、機能的亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は機能的エノラーゼ、例えばａｃｕＮをコードする遺伝子を含む、請求項１３〜１５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
形質転換の後、相同組換えにより真菌宿主細胞ゲノム中への組込みポリヌクレオチドコンストラクトの位置特異的組込みを可能にするのに十分なサイズ、且つ前記真菌宿主細胞ゲノム内の特定遺伝子座に対して十分な配列相同性を有する相同性ボックスを、片側又は両側に有する、請求項１３〜１６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項１３〜１７の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する、請求項１３〜１９の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、選択マーカーオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ又はＰｙｒＧをコードする、請求項１３〜２０の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項１３〜２１の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞であって、該コンストラクトが、
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む、組換え真菌宿主細胞。
ポリヌクレオチドコンストラクトの２又はそれ以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で；さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドコンストラクトの３又はそれ以上のコピー、及び最も好ましくは４又はそれ以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む、請求項２３に記載の組換え真菌宿主細胞。
糸状菌宿主細胞；好ましくはアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である、請求項２３又は２４に記載の組換え真菌宿主細胞。
酵母宿主細胞、好ましくはカンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）細胞、例えばクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項２３又は２４に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、非相同組換えによりゲノム中にランダムに組込まれる、請求項２３〜２６の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、相同組換えにより、ゲノム中に；好ましくは硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子中に；より好ましくは、糖新生のために必要とされる遺伝子中に；及び最も好ましくは、ｎｉａＤ、ｎｉｉＡ、ａｃｕＮ、ａｃｕｋ又はａｃｕＭ遺伝子座中に、部位特異的に組込まれる、請求項２３〜２６の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項２３〜２８の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２３〜２８の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来し；さらにより好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチを含み；最も好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチから成る、請求項２３〜３０の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、選択マーカーオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ又はＰｙｒＧをコードする、請求項２３〜３１の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項２３〜３２の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
目的のポリペプチドの生成方法であって、
ａ）請求項２３〜３３の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞を培養し；そして
ｂ）ポリペプチドを回収する、方法。