JP7210577B2 - セレノネインの製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、セレノネインの製造方法に関し、特にセレノネイン生産能を有する微生物を用いたセレノネインの製造方法に関する。
セレノネインは、有機セレン化合物の１種であり、生体抗酸化作用及び細胞増殖促進作用などを有することが知られている。また、セレン（Ｓｅ）欠乏に関わる疾病の予防及び治療への、セレノネインの応用が期待されている。
セレノネインの製造方法としては、動物の臓器又は血液から抽出する方法（特許文献１を参照）が知られている。エルゴチオネイン生合成系に関与する遺伝子を導入した分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を利用する方法も知られている（非特許文献１を参照）。
また、ヒスチジン及びセレン化合物を、挿入されたＥｇｔＡ遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させる工程を含む、セレノネインの製造方法が知られている（特許文献２を参照）。
特許第５６６９０５６号公報 ＷＯ２０１７／０２６１７３
ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４ Ｍａｙ １４；９（５）：ｅ９７７７４
特許文献１及び非特許文献１に記載の方法は、セレノネインを高収量で生産できない。したがって、これらの方法は、工業的規模でのセレノネインの生産には不適である。
それに対して、特許文献２に記載の方法は、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に比べて、セレノネインを高収量で生産することができる。そのため、特許文献２に記載の方法は、工業的規模でのセレノネインの製造を可能にする。
しかし、特許文献２に記載の方法で用いられているセレノシスチンなどの有機セレン化合物は高価である。したがって、有機セレン化合物からセレノネインへの変換を利用する方法は経済性が悪い。そこで、有機セレン化合物に代えて無機セレン化合物をセレノネインへ変換することが考えられる。しかし、特許文献２に記載の方法において、無機セレン化合物として亜セレン酸を用いた場合には、十分なセレノネインの生産量が得られない。
したがって、本発明の目的は、セレン化合物として無機セレン化合物を用いる場合であっても、セレノネインを高収量で生産することができる、セレノネインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、亜セレン酸を用いて効率良くセレノネインを生産するべく、菌体を増殖した培養液に、基質である亜セレン酸を加えることによって、セレノネインを大量生産することを試みた。具体的には、特許文献２に記載の方法を、以下のように改変した：アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）を宿主生物として用いて得られた（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株を用い；アスペルギルス・ソーヤに適した培地で該形質転換株を２日間培養し；その後、亜セレン酸を培養液に添加し；さらに培養を行った。しかし、セレノネインの生産量はほとんど増えなかった。
その理由は、アスペルギルス・ソーヤは亜セレン酸に対して感受性があるためであると考えられた。そのため、亜セレン酸を用いる限り、セレノネインを大量に生産することは難しいと考えられた。
そこで、本発明者らは、亜セレン酸に代えて別の無機セレン化合物を出発物質として利用することについて試行錯誤を繰り返した。その結果、本発明者らは、遂に、硫黄同化の生合成経路に着目するに至った。
詳しくは、硫酸から硫化水素へ転換するための第１の生合成経路及び硫化水素からシステインへ転換するための第２の生合成経路を利用すれば、硫酸に代えてセレン酸及びその塩を使用してセレノネインを生産することができるのではないかと考えた。
本発明者らは、第１の生合成経路においてＭｅｔＲ、第２の生合成経路においてＳａｔＡ及びＣｙｓＢを利用することにした。ＭｅｔＲは、硫酸を亜硫酸へ、さらに亜硫酸を硫化水素へ転換する反応を促進する。ＳａｔＡは、セリンをアセチルセリンへ転換する反応を触媒する。ＣｙｓＢは、アセチルセリン及び硫化水素をシステインへ転換する反応を触媒する。本発明者らは、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、ＭｅｔＲ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子及び／又はＣｙｓＢ遺伝子を過剰発現する形質転換体を作製した。本発明者らは、該形質転換体にセレン酸を作用させたところ、セレノネインを生産することができた。
驚くべきことに、上記形質転換体の菌体量を増やした培養液中にセレン酸を添加することにより、セレノネインを大量生産することができた。さらに驚くべきことに、ＥｇｔＡ遺伝子、ＭｅｔＲ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子を過剰発現する形質転換体を用いると、得られるセレノネイン抽出物は、高いセレノネイン含有量を有した。
このようにして、本発明者らは、遂に、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、セレン酸をセレノネインへ転換する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体を用いて、セレン酸からセレノネインを大量に生産する方法を創作することに成功した。本発明は、これらの成功例及び知見に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明の一態様によれば、以下の［１］～［１０］の方法及び形質転換体が提供される。
［１］ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
［２］前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
［３］ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
［４］前記セレン化合物が、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、四塩化セレン、セレン、二酸化セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記形質転換体の宿主生物が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［８］ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
［９］前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である、［８］に記載の形質転換体。
［１０］２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
本発明の一態様である方法及び形質転換体によれば、無機セレン化合物であるセレン酸からセレノネインを高収量で製造することができる。したがって、本発明の一態様である方法及び形質転換体には、工業的規模でセレノネインを製造することが期待される。
さらに、本発明の一態様である方法及び形質転換体によれば、エルゴチオネインに対してセレノネインの割合が高いセレノネイン抽出物を製造できる。したがって、本発明の一態様である方法及び形質転換体には、セレノネインの分離及び／又は精製を簡略化してセレノネイン高含有物を製造することが期待される。
図１Ａは、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤの培養液から得た上清画分におけるセレノネインの量の測定結果を示す図である。 図１Ｂは、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤの培養液から得た菌体画分におけるセレノネインの量の測定結果を示す図である。 図２は、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤにより生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量の測定結果を示す図である。 図３は、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤにより生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合を算出した結果を示す図である。 図４は、後述する例７において、アスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株の、セレン酸ナトリウムに対する感受性を評価した結果を示した図である。
以下、本発明の一態様である方法及び形質転換体の詳細について説明する。本発明の技術的範囲は、以下の説明によって限定されるものではなく、本発明は、その目的を達成する限り、種々の態様をとり得る。
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。
（方法の概要）
本発明の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第１の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第１の形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第１の形質転換体は、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、すなわち、これらの遺伝子のいずれか１種若しくは２種又は３種全てを過剰発現するように、形質転換されている。
本発明の別の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第２の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第２の形質転換体は、２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第２の形質転換体は、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー又は８コピーのＥｇｔＡ遺伝子を挿入することによって、形質転換されている。
例えば、２コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入された形質転換体とは、ＥｇｔＡ遺伝子が宿主生物内で正常に発現するように作製されたＤＮＡコンストラクトの２個を染色体に挿入することによって形質転換された形質転換体を指す。本明細書では、特定の遺伝子が宿主生物内で正常に発現するように作製されたＤＮＡコンストラクトを、該遺伝子の「発現用カセット」ともいう。２コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入された形質転換体は、原則として、２個のＥｇｔＡ発現用カセットからそれぞれ独立してＥｇｔＡ遺伝子を発現する。
本発明の別の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第３の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第３の形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びに２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第３の形質転換体は、第１の形質転換体及び第２の形質転換体が過剰発現する遺伝子の全てを挿入することによって、形質転換されている。
本明細書では、単に形質転換体という場合、「形質転換体」は、第１の形質転換体、第２の形質転換体及び第３の形質転換体の全てを指す。これらの形質転換体は、本発明の別の一態様である。
本明細書において、セレン化合物は、セレン化合物そのものに加えて、セレン化合物の塩、錯体、架橋物及び誘導体を包含する。
本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測に拘泥されるわけではないが、想定される、菌類のセレノネイン生合成系の一形態を、下記スキーム〔Ｉ〕に模式的に示す。スキーム〔Ｉ〕は、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニンを経由してセレノネインを生成する反応を示している。
Figure 0007210577000001
 〔Ｉ〕
（式中、ＰＬＰはピリドキサール ５’－リン酸を表わす。）
スキーム〔Ｉ〕中のＥｇｔＡ、ＳａｔＡ、ＣｙｓＢ及びＭｅｔＲは、それぞれＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子がコードするタンパク質である。
スキーム〔Ｉ〕に示すように、ＥｇｔＡタンパク質は、ヒスチジンからヘルシニンへ転換する反応並びにヘルシニン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインへ転換する反応を触媒する。ＳａｔＡタンパク質は、セリンからアセチルセリンへ転換する反応を触媒する。ＣｙｓＢタンパク質は、アセチルセリン及びセレン化水素からセレノシステインへ転換する反応を触媒する。ＭｅｔＲタンパク質は、転写因子として機能し、セレン酸から亜セレン酸へ転換する反応、さらに亜セレン酸からセレン化水素へ転換する反応を促進する。なお、ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子がそれぞれコードするＥｇｔＢタンパク質及びＥｇｔＣタンパク質は、それぞれ独立して、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインへ転換する反応を触媒する。
本発明の一態様の方法で用いられる形質転換体は、外来遺伝子として挿入されたＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子を過剰発現することにより、ヒスチジン及びセレン化合物から最終的にセレノネインを生成することができる。
第１の形質転換体及び第３の形質転換体におけるＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子のコピー数は、それぞれ１又は２以上である。コピー数の上限は、特に限定されないが、典型的には６程度である。
形質転換体には、ＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子に加えて、他の外来遺伝子が挿入されていてもよい。他の外来遺伝子は、本発明の課題解決を妨げない限り特に限定されず、その例としては、ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子などが挙げられる。形質転換体は、外来遺伝子として挿入されたＥｇｔＢ遺伝子、ＥｇｔＣ遺伝子又はその両方の遺伝子を過剰発現することにより、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインを効率的に生成することができると考えられる。ただし、宿主生物がＥｇｔＢ遺伝子又はＥｇｔＣ遺伝子を十分に発現している場合は、ＥｇｔＢ遺伝子又はＥｇｔＣ遺伝子を挿入しても、セレノネインの生産性は大きくは変化しない。
本明細書では、ＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子、ＭｅｔＲ遺伝子などの、形質転換体に挿入して過剰発現させる遺伝子を、挿入遺伝子と総称する場合がある。また、挿入遺伝子がコードするタンパク質を、挿入遺伝子タンパク質と総称する場合がある。
（挿入遺伝子）
ＥｇｔＡ遺伝子は、ＷＯ２０１７／０２６１７３（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）に記載の「酵素（１）をコードする遺伝子」に相当するものであれば、特に限定されない。ＥｇｔＡ遺伝子は、ＥｇｔＡタンパク質、すなわち、Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子ということができる。
ＳａｔＡ遺伝子は、一般に公知のセリン Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３０）をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。セリン Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、アセチル－ＣｏＡ及びＬ－セリンからＯ－アセチル－Ｌ－セリン及びＣｏＡ（補酵素Ａ）を生成する反応を触媒する活性を有する。
ＣｙｓＢ遺伝子は、一般に公知のシステインシンターゼ（ＥＣ２．５．１．４７）をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。システインシンターゼは、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及び硫化水素からＬ－システイン及び酢酸を生成する反応を触媒する活性を有する。このように、システインシンターゼはＯ－アセチル－Ｌ－セリンと硫化物（Ｓ）との反応を触媒するものであり、本発明者においては、これを応用して、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンとセレン化物（Ｓｅ）であるセレン化水素とからＬ－セレノシステインを得るためにＣｙｓＢ遺伝子を利用する。
多くの微生物がＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子を有することが報告されている。例えば、文献（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），１４６，２６９５－２７０３；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ８４２０８．１；Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．１９９７ Ａｐｒ ３１（４）：３４８－３５６）では、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の有するＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子について報告されている。また、文献（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４ Ｍａｒ ２００７，１５８（５）：４２８－４３６）では、多くの糸状菌の酵素がシステインシンターゼ活性を有することが報告されている。ＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子がコードするタンパク質が介在する、想定されるセリン及びセレン酸からセレノシステインへの転換を、下記スキーム〔ＩＩ〕に示す。
Figure 0007210577000002
 〔ＩＩ〕
ＭｅｔＲ遺伝子は、特許第４０２９９２７号公報に記載の「硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子」に相当する限り、特に限定されない。ＭｅｔＲ遺伝子は、転写因子として、アリルサルファターゼ遺伝子、コリンサルファターゼ遺伝子、サルフェートパーミアーゼ遺伝子及びサルフェートリダクターゼ遺伝子からなる群から選択される硫黄同化系遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする遺伝子ということができる。想定される、硫黄同化系遺伝子がコードするタンパク質による硫酸から硫化水素への転換を、下記スキーム〔ＩＩＩ〕に示す。
Figure 0007210577000003
 〔ＩＩＩ〕
ＭｅｔＲ遺伝子がコードするＭｅｔＲ因子により、硫酸から亜硫酸へ変換する反応、さらには亜硫酸から硫化水素へ転換する反応が促進する。本発明においては、これを応用して、セレン酸から亜セレン酸を得て、さらにはセレン化水素を得るために、ＭｅｔＲ遺伝子を利用している。ＭｅｔＲ因子は、硫黄の同化、特に無機硫黄の同化に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を制御する。例えば、Ａｍｉｃｈらの文献（ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、Ａｕｇｕｓｔ ２０１３ Ｖｏｌ．９、Ｉｓｓｕｅ ８、ｅ１００３５７３）のＦｉｇ．９には、硫黄代謝におけるＭｅｔＲ制御の概観が記載されている。なお、ＭｅｔＲ因子の働きにより、亜セレン酸からセレン酸への酸化転換が妨げられ得る。
ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子がコードするタンパク質が関与する、想定される硫黄同化の生合成経路を下記スキーム〔ＩＶ〕に示す。スキーム〔ＩＶ〕は、上記Ａｍｉｃｈらの文献のＦｉｇ．９から引用している。
Figure 0007210577000004
 〔ＩＶ〕
ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子は、ＷＯ２０１７／０２６１７３に記載の「酵素（２）をコードする遺伝子」に相当する限り、特に限定されない。ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子は、ＥｇｔＢタンパク質及びＥｇｔＣタンパク質、すなわち、ピリドキサール ５’－リン酸を補酵素として、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子ということができる。
挿入遺伝子が形質転換体内で過剰発現されることにより、挿入遺伝子タンパク質が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の活性及び／又は機能を有する形態で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質が、宿主生物が本来生産する量を超えて生産されることを意味する。
宿主生物に導入された際に、挿入遺伝子は、挿入遺伝子の転写後にスプライシングを経由して挿入遺伝子タンパク質を生成し得る遺伝子であってもよく、又は、挿入遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに挿入遺伝子タンパク質を生成し得る遺伝子であってもよい。
挿入遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよい。挿入遺伝子は、少なくとも上記した所定の活性及び／又は機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用する、ハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ハイブリダイゼーション法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件を指す。ストリンジェントな条件は、使用するハイブリダイゼーションの系、並びにプローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定できる。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより、特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
ストリンジェントな条件の具体例は、以下の通りである：プローブとしてＤＮＡプローブを用いる；ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う；洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度は、６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば以下のものが挙げられる：コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡ；並びに、０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ。プローブの調製やハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １－３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」とよぶ場合がある。）などの記載に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度及び温度などの条件に加えて、プローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などのその他の諸条件も含めて、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。そのより詳細な例としては、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。上限は、特に限定されないが、典型的には１００％である。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列が挙げられる。より詳細なその例としては、野生型遺伝子の塩基配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個から数個、好ましくは１個から５０個、より好ましくは１個から３０個、さらに好ましくは１個から２０個、なおさらに好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の、塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列が挙げられる。「塩基の欠失」は、配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味する。「塩基の置換」は、配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味する。「塩基の付加」は、新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である可能性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性及び／又は機能を有する。
挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列は、挿入遺伝子によってコードされるタンパク質と同じ活性及び／又は機能を有する限り、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は、特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個程度、より好ましくは１個、２個、３個、４個又は５個程度を意味する。「アミノ酸の欠失」は、配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味する。「アミノ酸の置換」は、配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。「アミノ酸の付加」は、配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な例としては、１個から数個のアミノ酸が化学的に類似した別のアミノ酸に置き換えられることが挙げられる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、その例としては、ある極性アミノ酸の、それと同じ電荷を有する別の極性アミノ酸による置換を挙げることができる。当該技術分野において、このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に知られている。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列の例としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。より詳細な例としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
（配列同一性を求める方法）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は、特に限定されない。例えば、通常知られる方法を利用できる。詳細には、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、対象となる塩基配列又はアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより、配列同一性を求められる。
２つのアミノ酸配列又は塩基配列の配列同一性を決定するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られている。このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７）。
したがって、当業者は、例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。このようなデータベースは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ゼネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づく。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であれば、タンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（挿入遺伝子の由来）
挿入遺伝子は、例えば、セレノネイン生産能若しくはエルゴチオネイン生産能がある生物種、又は挿入遺伝子の発現が見られる生物種などに由来する。挿入遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物が挙げられる。微生物の中でも、糸状菌が、エルゴチオネイン生産能があることが知られている菌種が多いので好ましい。糸状菌の具体例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌が挙げられ、より具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられる。
上記に挙げたアスペルギルス属糸状菌の具体例のうち、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用に裏打ちされた安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。
上記のとおり、挿入遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される挿入遺伝子タンパク質は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、又はそれぞれの活性や機能を示す可能性がある。そこで、挿入遺伝子の由来生物は、挿入遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
（遺伝子工学的手法による挿入遺伝子のクローニング）
挿入遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、挿入遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。当業者は、挿入遺伝子の取得方法、挿入遺伝子配列情報及び挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの作製方法、並びに形質転換体の作製方法などを、適宜選択することができる。本明細書では、形質転換及び形質転換体は、それぞれ形質導入及び形質導入体を包含する。挿入遺伝子のクローニングの非限定的な一例を後述する。
挿入遺伝子のクローニングには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、挿入遺伝子タンパク質の生産能を有する微生物又は種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
例えば、挿入遺伝子は、挿入遺伝子を有する微生物由来の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。挿入遺伝子の由来生物は、上記したとおりであり、その具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、染色体ＤＮＡは以下のようにして得ることができる：アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を培養し；得られた菌体から水分を取り除き；菌体を液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片を得て；該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーは、挿入遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば、特に限定されない。その例としては、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計した配列番号１９～２０、４５～４６、５４～５５及び５８～５９のプライマーなどが挙げられる。なお、これらのプライマーを用いると、目的遺伝子の全長が増幅されるので、ＲＡＣＥを省略できる。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
また、挿入遺伝子を取得する方法は、特に限定されない。挿入遺伝子の取得は、遺伝子工学的手法によらなくてもよく、例えば、化学合成法を用いて挿入遺伝子を構築することが可能である。
ＰＣＲにより増幅された増幅産物及び化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌 ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）又は大腸菌 ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は、特に限定されない。その例としては、Ｌｉ－ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
（挿入遺伝子を含む組換えベクターの構築）
挿入遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、挿入遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、挿入遺伝子の発現が可能な形で結合することにより、構築することができる。例えば、挿入遺伝子を含む組換えベクターは、適当な制限酵素で挿入遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより、構築することができる。または、挿入遺伝子を含む組換えベクターは、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより、得ることができる。
（形質転換体の作製方法）
形質転換体の作製方法は、特に限定されない。例えば、常法に従って、挿入遺伝子が発現する態様で宿主生物に遺伝子を挿入することによって、形質転換体を作製できる。具体的には、挿入遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで挿入遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、挿入遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－挿入遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、「ＤＮＡコンストラクト」又は「挿入遺伝子発現用カセット」と総称してよぶ場合がある。
挿入遺伝子を、挿入遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は、特に限定されない。その例としては、相同組換え又は非相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結することによって、目的の遺伝子を宿主生物のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下にて宿主生物内で挿入遺伝子を過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは、特に限定されない。その例としては、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、常法により、このプラスミドベクターを用いることによって、対応する宿主生物を形質転換することができる。
そのような、好適なベクター－宿主系は、宿主生物中で挿入遺伝子タンパク質を生産させ得る系であれば、特に限定されない。その例としては、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましい。この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で、ＤＮＡコンストラクトを用いることもできる。
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は、特に限定されない。その例としては、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で挿入遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーター、又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは、特に限定されない。その例としては、適当な発現誘導プロモーター、構成的プロモーターなどが挙げられ、より具体的な例としては、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されず、その例としては、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトにおいて、挿入遺伝子の発現に対する制御配列は、挿入遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は、必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
ＤＮＡコンストラクトには挿入遺伝子タンパク質の精製のためのタグをつけることができる。例えば、挿入遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製が可能になる。
ＤＮＡコンストラクトの一例は、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、挿入遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、プロトプラストをポリエチレングリコール及び塩化カルシウムで処理するプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地としては、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切な培地を用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えによって、宿主生物が本来染色体上に有する挿入遺伝子のプロモーターを、ｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、挿入遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－挿入遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットを使用できる（特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１及び図１を参照）。この場合、挿入遺伝子の上流領域及び挿入遺伝子の全部又は部分が、相同組換えのために利用される。使用する、挿入遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから挿入遺伝子内の途中の領域を含んでもよい。相同組換えに適した領域の長さは、０．５ｋｂ以上である。
形質転換体が作製されたことは、以下の手順で確認できる：挿入遺伝子タンパク質の活性又は機能が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで、培養後に得られた培養物においてセレノネインが検出されることを確認する；又は、検出されたセレノネインの量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物におけるセレノネインの量よりも多いことを確認する。
あるいは、形質転換体が作製されたことは、以下の手順でも確認できる：形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認する。
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
第１の挿入遺伝子を挿入した形質転換体に対して、さらに第２の挿入遺伝子を挿入することにより、第１の挿入遺伝子及び第２の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製することができる。この手順を繰り返すことにより、複数の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製することができる。
複数の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製する際に、第１の挿入遺伝子とともに挿入されるマーカー遺伝子と第２の挿入遺伝子とともに挿入されるマーカー遺伝子とが同一である場合は、第１の挿入遺伝子が挿入された後、第１の挿入遺伝子とともに挿入されたマーカー遺伝子を除去することが好ましい。
例えば、第１の挿入遺伝子、ループアウトのための領域及びマーカー遺伝子を順に連結して含む挿入遺伝子発現用カセットにおいて、ループアウトのための領域と同じ配列をもつ領域が、宿主生物の染色体上における相同組換えで導入可能な部位の下流にある場合は、相同組換えにより挿入遺伝子発現用カセットが宿主生物の染色体上に挿入された後、ループアウトのための領域と下流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きることにより、マーカー遺伝子はループアウトにより除去される。このようにして、第１の挿入遺伝子が挿入された後、第１の挿入遺伝子とともに挿入されたマーカー遺伝子を除去した形質転換体を得ることができる。
（宿主生物）
宿主生物は、挿入遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、挿入遺伝子タンパク質を生産することができる微生物であれば、特に限定されない。その例としては、セレン化合物の有毒性の観点からセレンを代謝できる微生物が挙げられる。宿主生物は、セレン酸レダクターゼ（ＥＣ１．９７．１．９）、セレノシステインリアーゼ（ＥＣ４．４．１．１６）若しくはセリンデヒドラターゼ（ＥＣ４．３．１．１７）又はこれらの２種以上の酵素を発現する微生物であることが好ましく、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物などの糸状菌、光合成微生物及びプロバイオティック微生物などがより好ましい。
例えば、アシネトバクター属微生物（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属微生物（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルスロバクター属微生物（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンジダ属微生物（Ｃａｎｄｉｄａ）、セファロスポリウム属微生物（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、シトロバクター属微生物（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属微生物（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属微生物（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フサリウム属微生物（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属微生物（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ニューロスポラ属微生物（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属微生物（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属微生物（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スコプラリオプシス属微生物（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、セレノモナス属微生物（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）などの微生物には、セレン化合物を酸化又は還元する能力があることが知られている（Ｄ．Ｔ．ＭＡＩＥＲＳ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＯＣｔ．１９８８，ｐ．２５９１－２５９３）。特に、タウエラ・セレナティス（Ｔｈａｕｅｒａ ｓｅｌｅｎａｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）及びバチルス・セレナタルセナティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎａｔａｒｓｅｎａｔｉｓ）からは、セレン酸還元酵素又は該酵素をコードする遺伝子が見出されている（阪口利文、「セレンオキサニオン還元酵素とその遺伝子」、バイオミディア、２０１２年 第３号、ｐ．１３３）。また、アルカリジェネス・ヴィスコラクティス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｖｉｓｃｏｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・シュードディフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・アルカノリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃａ）、ビレビバクテリウム・ロイシノファガム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｕｃｉｎｏｐｈａｇｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アーウィニア・カロトヴォラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アルカリジェネス・ブッケリ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｂｏｏｋｅｒｉ）、アスペルギルス・フィキューム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アブシディア・コリビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ベッキー（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｂｅｃｋｉｉ）、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）はセレノシステインリアーゼ活性を有すること、又は該活性を有する可能性があることも知られている（ＰＡＴＲＩＣＫ ＣＨＯＣＡＴ ｅｔ ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｏｃｔ．１９８３，ｐ．４５５－４５７）。そこで、これらの微生物を宿主生物として使用することができる。あるいは、セレン代謝遺伝子を強化又は異種発現させた微生物を、宿主生物として使用することができる。さらに、挿入遺伝子の由来生物を宿主生物として使用することができる蓋然性がある。
これらの中でも、エルゴチオネインの生産が認められる糸状菌、及び挿入遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌がさらに好ましい。糸状菌の具体例としては、ドナルドらの文献（Ｄｏｎａｌｄ Ｂ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５６，２２３：９－１７）やドロシーらの文献（Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．１９７０，ｐ．４７５－４７８）に記載の糸状菌が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属などに属する糸状菌が挙げられる。挿入遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌としては、例えば、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属などに属する糸状菌などが挙げられる。
糸状菌の中でも、安全性や培養の容易性を考慮して、上記に挿入遺伝子の由来生物として挙げた、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物が好ましい。
宿主生物は、野生株でもよく、又は予め野生株を形質転換した形質転換体でもよい。宿主生物として利用される、予め野生株を形質転換した形質転換体は、特に限定されない。
例えば、アスペルギルス属微生物をはじめとして糸状菌は相同組換え頻度が低い傾向にある。したがって、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのＫｕ遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。
このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができる。例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用してＫｕ遺伝子を破壊することや、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって、Ｋｕ遺伝子を抑制できる。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物の相同組み換え頻度は、Ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物の相同組み換え頻度と比較して、顕著に上昇しており、具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。
また、宿主生物としては、ｐｙｒＧなどのマーカー遺伝子が抑制された形質転換体を使用することが好ましい。抑制すべきマーカー遺伝子は、ＤＮＡコンストラクトに含めるマーカー遺伝子に応じて適宜選択できる。
（挿入遺伝子の具体例）
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の挿入遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載があるＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子などが挙げられる。ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１～４の配列である。また、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子がコードするＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号５～８の配列である。
アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得る方法は、特に限定されない。例えば、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子の塩基配列（配列番号１～４）並びにＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５～８）に基づいて、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得ることができる。また、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物の総タンパク質を基に、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子が挿入遺伝子に相当することは、以下の手順で確認できる：得られた遺伝子により遺伝子の由来生物を宿主生物として形質転換し、得られた形質転換体において、セレノネインが生産されていること又は宿主生物に比してセレノネインの生産量が増強されていることを確認する。
例えば、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のＥｇｔＡ遺伝子としては、ＷＯ２０１７／０２６１７３号における配列表の配列番号２３のＡｏＥｇｔＡ遺伝子などが挙げられる。また、ＡｏＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号において、配列表の配列番号２４として記載されている。
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーは生育条件が近似しているので、これらのうちの１種の微生物が有する遺伝子をこれらのうちの１種の微生物に挿入することにより、これらの微生物を相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、アスペルギルス・ソーヤから得られた挿入遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ニガーに導入して形質転換することができる。挿入遺伝子タンパク質が確実に所望の活性又は機能を有し得ることを鑑みれば、挿入遺伝子の由来生物と宿主生物とが同一であることが好ましい。例えば、アスペルギルス・ソーヤ由来の挿入遺伝子を、アスペルギルス・ソーヤに形質転換することが好ましい。
挿入遺伝子は、アスペルギルス・ソーヤなどに由来する挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、宿主生物に発現させるためにコドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の具体例は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号において配列表の配列番号２７及び２８としてそれぞれ記載されている、大腸菌発現用に合成されたＥｃＥｇｔＡ及びＥｃＥｇｔＣなどが挙げられる。
（形質転換体の一実施態様）
形質転換体の一実施態様は、２～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＳａｔＡ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＣｙｓＢ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質及びＡｓＣｙｓＢタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＭｅｔＲ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＳａｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＣｙｓＢ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＭｅｔＲ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、２～４コピーのＡｏＥｇｔＡ遺伝子をアスペルギルス・オリゼに挿入して、ＡｏＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼである。
上記の形質転換アスペルギルス・ソーヤ及び形質転換アスペルギルス・オリゼは、挿入遺伝子タンパク質を過剰発現することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしても微量であるセレノネインを、検出可能なレベルで生産することができる。さらに、実施例で後述するとおり、形質転換アスペルギルス・ソーヤは、セレノシステインやセレノシスチンといった有機セレン化合物、亜セレン酸などだけでなく、セレン酸などの無機セレン化合物からも、セレノネインを生産することができる。そこで、形質転換体は、宿主生物に比してセレノネインの量が増えるように挿入遺伝子の発現が増強された形質転換体であることが好ましい。
また、実施例で後述するとおり、挿入遺伝子を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、セレノネインを生産できる。より具体的には、該形質転換アスペルギルス・ソーヤを、宿主生物であるアスペルギルス・ソーヤの生育に適したＤＰＹ培地を用いて３０℃、１～３日間程度で培養して菌体増殖を促した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、３～５日間程度で培養することにより、セレノネインを生産できる。生産されたセレノネインは、菌体外に分泌され、又は菌体融解などにより培養液中に蓄積する。
形質転換体のセレノネインの生産能は、特に限定されない。例えば、形質転換体をＤＰＹ培地を用いて３０℃、２日間で培養した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、４日間で培養したときに、セレノネインの生産量は、例えば５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１５ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１７ｍｇ／ｌ以上、なおさらに好ましくは２０ｍｇ／ｌ以上である。このように培養した際のセレノネインの生産量の上限は、特に限定されず、典型的には１００ｍｇ／ｌ程度である。
また、実施例で後述するとおり、挿入遺伝子を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、生産するセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の比率が大きくなる傾向にある。形質転換体のセレノネインの生産能に関し、例えば、形質転換体をＤＰＹ培地を用いて３０℃、２日間で培養した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、４日間で培養したときに、生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合（比率）が例えば５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、なおさらに好ましくは４０％以上である。このように培養した際の上記比率の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
形質転換体は、挿入遺伝子によって生産される挿入遺伝子タンパク質と同時に、宿主生物が本来保有している遺伝子により挿入遺伝子タンパク質と構造的性質が同種又は別種の野生型の挿入遺伝子タンパク質を生産する場合がある。結果として、たとえ挿入遺伝子を導入した形質転換体ではなくとも、形質転換体がセレノネインを生産することができる場合がある。
（方法）
本発明の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、前記形質転換体は、挿入遺伝子が挿入されており、かつ、挿入遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法である。
ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させる方法は、ヒスチジン及びセレン化合物と形質転換体とが接触して、挿入遺伝子タンパク質の活性又は機能によってセレノネインが生産できる限り、特に限定されない。例えば、ヒスチジン及びセレン化合物を含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で、形質転換体を培養することによって、ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させることができる。ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させることによって、セレノネインが製造される。培養方法は、特に限定されず、その例としては、通気又は非通気条件下で行う固体培養法及び液体培養法が挙げられる。セレン化合物の添加量は、形質転換体の生育阻害が認められない量であれば、特に限定されない。例えば、培養開始時のセレン化合物の添加量は、菌体濃度に対して十分に小さい量であり、好ましくは０ｍＭである。大量のセレノネインを得たい場合、培養開始後にセレン化合物を培養系に添加する、又は培養開始後に菌体濃度が高まるにつれて培養系のセレン化合物量を増やすことが好ましい。例えば、培養開始から１～３日程度後に、０．０１～１０ｍＭ、好ましくは０．１～５ｍＭのセレン化合物を追加的に培養液に添加することが好ましい。
培地は、宿主生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有する培地であれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物がアスペルギルス属微生物である場合は、実施例に後述するようなＤＰＹ培地などを使用することができるが、使用する培地はこれに特に限定されない。培地は、ＥｇｔＡタンパク質の活性化に必要な鉄（ＩＩ）を含んでいることが好ましい。鉄（ＩＩ）は、化合物として培地に添加することができ、又はミネラル含有物として添加してもよい。
セレン化合物は、セレンを構成元素として含む限り、特に限定されず、例えば、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩である。このうち有機セレン化合物及びその塩としては、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノメチオニン、Ｓｅ－（メチル）セレノ－Ｌ－システイン、セレノペプチド、セレノプロテイン及びそれらの塩並びにセレン酵母などが好ましく、無機セレン化合物及びその塩としては、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸、二酸化セレン及びそれらの塩などが好ましい。また、セレン化合物は、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩から選択される１種以上を含む有機物であってもよい。該有機物としては、例えば、かつお（加工品、かつお節）、からし（粉、粒入りマスタード、練りマスタード）、ぶた（腎臓、肝臓、生）、うし（マメ、生）、あんこう（きも、生）、すけとうだら（タラコ、生）、くろまぐろ（赤身、生）、まがれい（生）、かつお（秋獲り、生）、ずわいがに（生）、ひまわりの種（フライ、味付け）、まあじ（焼き）、あまだい（生）、顆粒風味調味料、きはだ（生）、びんなが（生）、カキ（水煮）などのセレンを多く含むことが知られている食品などを挙げることができるが、これらに限定されない。セレン化合物としては、これらのうちの１種を単独で又は２種以上を組み合せて用いることができる。
挿入遺伝子が挿入されており、かつ、挿入遺伝子を過剰発現する形質転換体は、セレン酸及びセレン酸ナトリウム、セレン酸カリウムなどのセレン酸塩からセレノネインを生産することに適している。また、セレン酸及びセレン酸塩は、セレノシステイン及びセレノシスチンなどの有機セレン化合物に比べて経済的である。さらに、セレン酸及びセレン酸塩は、亜セレン酸に比べて、細胞の感受性は低く、セレノネイン生産への悪影響が小さい可能性がある。したがって、使用するセレン化合物としては、セレン酸及びセレン酸塩が好ましい。
形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物の培養条件を採用することができる。例えば、宿主生物が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０程度、培養温度は２０～４０℃程度、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、とすることができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができる。これらの培養手段のうちのいずれにおいても、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例は以下の通りである：実施例で後述するＤＰＹ培地を用いて、菌体増殖の目的で、３０℃、１０～３００ｒｐｍでの１～３日間の撹拌又は振盪による培養を行い、セレノネイン生産の目的で、３７℃、１０～３００ｒｐｍでの３～５日間の撹拌又は振盪による培養を行う。
培養終了後に培養物からセレノネインを抽出する方法は、特に限定されない。培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した培養上清をそのまま抽出に供してもよく、あるいは、回収した培養上清を乾燥及び／又は濃縮した培養上清濃縮物を抽出に供してもよい。
抽出溶媒は、セレノネインが溶解する溶媒であれば特に限定されず、その例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。培養上清又は培養上清濃縮物に溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら、セレノネインを抽出する。抽出溶媒温度は室温から１００℃であってよい。
得られた抽出液を、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより、セレノネインを精製することができる。
セレノネインの定性的又は定量的分析は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号又はヤマシタらの文献（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ．２８５，ＮＯ．２４，ｐｐ．１８１３４－１８１３８，Ｊｕｎｅ １１，２０１０、「ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」、“Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”）に記載の条件による、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、実施例で後述する条件で実施できる。
本発明の一態様の方法によれば、高収量でセレノネインが得られる。例えば、特許文献２のＷＯ２０１７／０２６１７３号に記載の方法では、培養菌体からセレノネインを得ているのに対し、本発明の一態様の方法では、培養上清からセレノネインを得ることができる。本発明の一態様の方法では、特許文献２のＷＯ２０１７／０２６１７３号に記載の方法に準じて、適宜、培養菌体から抽出することによってセレノネインを得てもよい。
本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前若しくは後又は工程中に、種々の追加の工程又は操作を含んでもよい。
（セレノネインの用途）
本発明の一態様の方法や形質転換体を利用して得られたセレノネインは、種々の生理活性を有する機能性生体物質であること及び熱に強く水溶性の物質であることを活かして、様々な用途において利用可能である。例えば、得られたセレノネインは、一般飲食品、機能性飲食品、機能性表示飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料など、及びこれらの製品を製造するための原料として、利用可能である。
特に、セレノネインは抗酸化活性を有することが知られており、その活性は、チオアナログであるエルゴチオネインの１，０００倍に達するといわれている。そこで、セレノネインは、例えば、ヒドロキシルラジカルの捕捉作用、ヘム鉄の自動酸化抑制作用などの生体抗酸化作用を示す物質として有用である。また、セレノネインを含有する具体的な製品としては、亜セレン酸及びセレノメチオニンなどに代わる栄養補助剤、癌及び虚血性心疾患などの生活習慣病の予防剤及び治療剤、メチル水銀の解毒剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡを挿入したＥｇｔＡ発現用カセットの作製］
（１）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出１５０ｍｌ容量の三角フラスコに３０ｍｌのポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸；ｐＨ６．０）を、蒸留水を用いて調製し、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。
（２）コンストラクト用プラスミドの作製
プラスミドｐＵＣ１９に、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号９）、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号１０）、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１８３８ｂｐ、配列番号１１）を連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧをＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、本酵素に付属の反応試薬、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従って実施した。Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを増幅するために使用したプライマーを下記表１～３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列は、Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧの各増幅断片をこの順に連結した断片をさらにｐＵＣ１９と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000005
Figure 0007210577000006
Figure 0007210577000007
用いたｐＵＣ１９は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｖｅｃｔｏｒであった。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅにて、増幅したＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを、上記したＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。
得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
（３）対象遺伝子を挿入したコンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆとＴａｌｐとの間に、対象遺伝子であるＡｓＥｇｔＡを連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、本酵素に付属の反応試薬、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表４に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000008
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＡｓＥｇｔＡ（配列番号１）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＡｓＥｇｔＡを増幅するために使用したプライマーを下記表５に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（ＰｔｅｆとＴａｌｐとの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000009
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＡｓＥｇｔＡとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ＡｓＥｇｔＡが挿入された、対象遺伝子を挿入したＤＮＡコンストラクトを得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、５’→３’方向で、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とＡｓＥｇｔＡのＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトである。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＰｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧの増幅断片を得た。使用したプライマーを下記表６に示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000010
アスペルギルス・ソーヤへ相同組換えするための領域１（相同組換えのための領域１）及び領域２（相同組換えのための領域２）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。
相同組換えのための領域１及び相同組換えのための領域２を増幅するために使用したプライマーをそれぞれ下記表７及び表８に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はｐＵＣ１９、Ｐｔｅｆ又はｐｙｒＧに連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000011
Figure 0007210577000012
上記のとおりに得られた相同組換えのための領域１、Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ及び相同組換えのための領域２と、ｐＵＣ１９ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＶｅｃｔｏｒとをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
上記で得たコンストラクト用プラスミドのＴａｌｐとｐｙｒＧとの間を開裂するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表９に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000013
ループアウトのための領域を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ループアウトのための領域を増幅するために使用したプライマーを表１０に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（ＴａｌｐとｐｒｙＧとの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000014
上記のとおりに得られたコンストラクト用プラスミドのベクター断片と、ループアウトのための領域とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
以下の手順により、得られたプラスミドＤＮＡにおける相同組換えのための領域１の一部を除去した。詳細には、上記で得られたコンストラクト用プラスミドを鋳型ＤＮＡとして用い、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）を使用して、該キットに添付されたプロトコールに従ってＰＣＲからセルフライゲーションまでの手順を行った。装置としてはＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用した。使用したプライマーを下記表１１に示す。
Figure 0007210577000015
セルフライゲーション反応液を用いて、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
上記のようにして、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。得られたＤＮＡコンストラクト用プラスミドをｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＥｇｔＡ発現用カセットを得た。使用したプライマーを下記表１２に示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000016
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列を含むＥｇｔＡ発現用カセットを得た。
［例２．１～４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の作製
特許第６２６１０３９号公報の実施例２の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体上のｐｙｒＧ遺伝子及びｋｕ７０遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株を作製した。
（２）アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の形質転換
５００ｍｌ容量の三角フラスコ中の２０ｍＭウリジン及び２０ｍＭウラシルを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを、２０μｇのＥｇｔＡ発現用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換した。次いでその形質転換体を、０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能がある形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン／ウラシル要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン／ウラシル無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。
（３）１コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを用いて形質転換アスペルギルス・ソーヤの選抜
ＥｇｔＡ発現用カセットを相同組換えで導入することが可能な部位はアスペルギルス・ソーヤの染色体上に８箇所ある。そこで、例１に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲを行うことにより、いずれかの部位にＥｇｔＡ発現用カセットが１コピー導入された株を選抜した。使用したプライマーを下記表１３に示す。
Figure 0007210577000017
フォワードプライマー８種とリバースプライマー１種との８通りの組み合わせのうち、１つの組み合わせでＰＣＲ産物が生じるＥｇｔＡ発現用カセットが相同組換えで１か所に導入された株を取得した。
（４）ＥｇｔＡ発現用カセットにおけるｐｙｒＧマーカーを除去したｐｙｒＧ除去株の作製
ＥｇｔＡ発現用カセット中の「ループアウトのための領域」と同じ配列をもつ領域が、相同組換えで導入可能な８箇所の部位の下流に共通してある。相同組換えでＥｇｔＡ発現用カセットが導入された領域において、「ループアウトのための領域」と下流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きると、ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２からなる領域はループアウトにより除去される。そこで、以下の手順により、導入したＥｇｔＡ発現用カセット中のｐｙｒＧを除去した株を得た。
上記で得られた、１コピーのＥｇｔＡ発現用カセットが相同組換えで導入された株の分生子を、３ｍｇ／ｍｌ ５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を含有する２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地に植菌して培養することにより、５－ＦＯＡ耐性株を取得した。ＥｇｔＡ発現用カセットの導入から５－ＦＯＡ耐性株を取得するまでの工程の概要を下記スキーム〔Ｖ〕に示す。なお、スキーム〔Ｖ〕中の、「上」は相同組換えのための領域１を、「下１」は相同組換えのための領域２を、「下２」はループアウトのための領域をそれぞれ表わす。
Figure 0007210577000018
 〔Ｖ〕
得られた５－ＦＯＡ耐性株は、２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では成育し、かつ、ウラシル未添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では生育しないこと、すなわち、ウラシル要求性を示すことを確認した。
ウラシル要求性を確認した株のＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ由来産物が生じないことを確認した。使用したプライマーを下記表１４に示す。
Figure 0007210577000019
さらに、表１３に示す、相同組換え株の選抜のために用いたプライマーのセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が生じたプライマーの組み合わせは、ｐｙｒＧ除去前の株及びｐｙｒＧ除去後の株において同一であり、変化がないことを確認した。
得られたｐｙｒＧ除去株を、ＥｇｔＡ発現用カセットをさらに導入するための宿主として以下で用いた。
（５）２～４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
上記（２）～（４）のＥｇｔＡ発現用カセットによる形質転換、ＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの選抜及びｐｙｒＧ除去株の作製までの操作を繰り返すことにより、２、３及び４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した株を逐次得た。この際、ループアウトによりｐｙｒＧを除去した株を、次の回の宿主として用いた。また、相同組換え株の選抜のためのＰＣＲの際に、産物が生じるプライマーの組み合わせが宿主と比べて新たに１組増えた株を選抜した。
４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した株において、ｐｙｒＧを除去する前のｐｙｒＧを保持する株をｓＡ４株とした。
［例３．遺伝子ＥｇｔＡ、ＳａｔＡ及びＣｙｓＢを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）ＳａｔＡ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＳａｔＡ（配列番号２）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＳａｔＡを増幅するために使用したプライマーを下記表１５に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はベクター断片と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000020
鋳型ＤＮＡとして例１で得られたｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表１６に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000021
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＳａｔＡとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＳａｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
（２）ＳａｔＡ発現用カセットの２分割
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＳａｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドの２種のベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表１７及び表１８に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000022
Figure 0007210577000023
上記のようにして、ｐＵＣ１９（部分）－相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ＳａｔＡ発現用カセット１）及びループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２－ｐＵＣ１９（部分）の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ＳａｔＡ発現用カセット２）を得た。
（３）ＣｙｓＢ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子Ｐｇｐｄ（プロモーター）、遺伝子Ｔａｍｙ（ターミネーター）及び遺伝子ＣｙｓＢ（配列番号３）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。各遺伝子を増幅するために使用したプライマーを下記表１９～２１に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はｐＵＣ１９、Ｐｇｐｄ又はＴａｍｙと連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000024
Figure 0007210577000025
Figure 0007210577000026
上記のとおりに得られたＰｇｐｄ、Ｔａｍｙ及びＣｙｓＢと、ｐＵＣ１９ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＶｅｃｔｏｒとをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養した培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＰｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの増幅断片を得た。使用したプライマーを下記表２２に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はＳａｔＡ発現用カセット１及びＳａｔＡ発現用カセット２と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000027
上記のようにして、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＣｙｓＢ発現用カセットを得た。
（４）ＳａＣｂ発現用カセットの作製
上記のとおりに得られたＳａｔＡ発現用カセット１、ＳａｔＡ発現用カセット２及びＣｙｓＢ発現用カセットを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、大腸菌宿主としてＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養した培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＳａｔＡ＿ＣｙｓＢ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＳａＣｂ発現用カセットを得た。この際、表１２に示すプライマーを用いた。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＳａＣｂ発現用カセットを得た。
（５）４コピーのＥｇｔＡ発現用カセット及び１コピーのＳａＣｂ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
例２で作製したｓＡ４株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＳａＣｂ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＳａＣｂ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＳａＣｂ株と命名した。
［例４．遺伝子ＥｇｔＡ及びＭｅｔＲを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）ＭｅｔＲ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＭｅｔＲ（配列番号４）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＭｅｔＲを増幅するために使用したプライマーを下記表２３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はベクター断片と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure 0007210577000028
鋳型ＤＮＡとして例１で得られたｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを表１６に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＭｅｔＲとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＭｅｔＲ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたＤＮＡコンストラクト、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＭｅｔＲ発現用カセットを得た。この際、表１２に示すプライマーを用いた。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＭｅｔＲ発現用カセットを得た。
（２）４コピーのＥｇｔＡ発現用カセット及び１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
例２で作製したｓＡ４株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＭｅｔＲ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＭｅｔＲ株と命名した。
［例５．遺伝子ＥｇｔＡ、ＳａｔＡ、ＣｙｓＢ及びＭｅｔＲを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
例３で作製したＳａＣｂ株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＭｅｔＲ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＳａＣｂＭｅｔＲ株と命名した。
［例６．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産］
例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤのそれぞれのセレノネイン生産能を以下のとおりに比較した。使用した形質転換アスペルギルス・ソーヤの概要を下記表２４に示す。
Figure 0007210577000029
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（０．５％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、０．５％（ｗ／ｖ）セリン、１％（ｗ／ｖ）カゼインペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；水道水を用いて調製；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で２日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養液に終濃度が１ｍＭになるようにセレン酸ナトリウムを添加して、さらに３７℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。
次いで、培養後の培養物から培養液を桐山ロート（フィルターＮＯ．３）でろ過することにより、菌体と上清とに分けた。得られた上清を０．４５μｍフィルターでろ過することにより、上清画分を得た。
一方、得られた菌体に８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により回収した上清を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、菌体画分の抽出液を得た。
上記のようにして得た上清画分及び菌体画分の抽出液について、ＷＯ２０１７／０２６１７３号（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）及びヤマシタらの文献（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ．２８５，ＮＯ．２４，ｐｐ．１８１３４－１８１３８，Ｊｕｎｅ １１，２０１０、「ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」、“Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”）に記載の条件にて、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳにより、セレノネインを定量した。また、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）に記載のＨＰＬＣにより分析した。
セレノネインの量の測定結果を図１Ａ及び図１Ｂに示し、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量の測定結果を図２に示す。また、図１Ａ及び図２の結果より、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合を求めたものを図３に示す。
図１Ａ及び図１Ｂが示すとおり、いずれの菌株を用いた場合でも、大部分のセレノネインは上清画分に検出された。また、ｓＡ４株に比べて、ＳａＣｂ株、ＭｅｔＲ株及びＳａＣｂＭｅｔＲ株はいずれもセレノネインの生産量が多かった。したがって、ＥｇｔＡ発現用カセット導入株において、セレノシステインの合成系及びセレン酸塩の同化系を強化することにより、セレン酸ナトリウムからセレノネインの生産を増強することができた。また、同様に、セレン酸カリウムを用いても、セレノネインを生産することができた。
また、図２及び図３が示すとおり、ＳａＣｂＭｅｔＲ株は高比率でセレノネインを生産することがわかった。セレノネイン及びエルゴチオネインは構造及び分子量が似通っており、分離及び精製することが難しいところ、ＳａＣｂＭｅｔＲ株を用いればセレノネインの分離や精製を簡略化した工程によってセレノネイン高含有物を得られることがわかった。
［例７．セレン化合物毒性］
セレン酸ナトリウムの細胞毒性を、下記のとおりに試験した。細胞の増殖を定量するため、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）を用いた。
２×ＤＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、４％（ｗ／ｖ）デキストリン、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ｐＨ未調整）、２×ａｌａｍａｒＢｌｕｅ及びアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株の分生子 ２×１０４個／ｍｌからなる混合液を１００μｌずつマイクロプレートの各ウェルに分注した。同じく、各ウェルに、最終濃度が０、０．１２５、０．２５、０．５、１及び２ｍＭになるようにセレン酸ナトリウム水溶液を１００μｌ添加した。なお、分生子及びセレン酸ナトリウム水溶液を加えないものをブランクとした。
マイクロプレートを３０℃で３０時間インキュベートした後に、５７０ｎｍの吸光度を測定した。測定した結果から、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬の取扱説明書に従って、ブランクの６００ｎｍの吸光度を差し引いた値をプロットしたものを図４に示す。
図４に示すとおり、セレン酸ナトリウムによる生育阻害はみられなかった。また、目視によっても、菌糸の生育の程度について差異はみられなかった。
本発明の一態様である方法や形質転換体は、生体抗酸化作用及び細胞増殖促進作用などを有するとされているセレノネインを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、抗酸化機能が付与された化粧品やサプリメントなどの抗酸化製品を製造するための原料を工業的規模で製造するために利用可能である。
 関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１５日出願の日本特願２０１８－１１４９１９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。

Claims (8)

  1. ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
  2. 前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記セレン化合物が、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、四塩化セレン、セレン、二酸化セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記形質転換体の宿主生物が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
  8. 前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である、請求項７に記載の形質転換体。
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