JP2023030077A - イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 - Google Patents

Abstract

【課題】高収量のアスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを安定的に製造することができる製造方法を提供する。【解決手段】アスコフラノン、イリシコリンＡもしくはアスコクロリンの生合成遺伝子によって形質転換された形質転換体もしくはこれらの遺伝子のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを得る工程を含む、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドの製造方法を提供する。【選択図】図６

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１７年５月１１日出願の日本特願２０１７－９４５０９号及び２０１８年１月１７日出願の日本特願２０１８－００５８８８号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。

本発明は、アスコフラノン、アスコクロリン、イリシコリンＡといったイソプレノイドを合成するための遺伝子並びに該遺伝子を利用したイソプレノイドの製造方法に関する。

人口が密集した地域が点在する日本国を含む先進国及び開発途上国においては、ウイルスや原虫などによる感染症がたびたび問題となる。また、２型糖尿病、高コレステロール血症、癌及びこれらの疾患に起因する合併症などの生活習慣病は、医療費の増大及び労働力の低下などを招き、とりわけ日本国では深刻な問題となっている。

そこで、これらの疾患の治療や予防に対して有効とされる物質の開発が望まれている。そのような物質の一つとして、イソプレノイド系の生理活性物質であるアスコクロリン及びアスコフラノンが知られている。アスコクロリン及びアスコフラノンは、電子伝達系を阻害して細胞内ＡＴＰ濃度を低下することにより、例えば、ツエツエバエによって媒介される原虫トリパノソーマによる原虫感染症であるアフリカ睡眠病の治療や予防に際して有望視されている（例えば、下記特許文献１を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。

アフリカ睡眠病に罹患すると、感染初期に原虫が血流中で増殖する。慢性期に入ると中枢神経が侵されて、精神錯乱や全身の痙攣などの症状を呈し、最終的には嗜眠状態に陥って死に至る。アフリカ睡眠病によるアフリカでの死者は、年間１万人以上であり、潜在的に感染のリスクがある人口は７，０００万人以上といわれている。現在のところ、アフリカ睡眠病に対してワクチンによる予防方法はなく、その治療は薬剤療法に頼っている。しかし、アフリカ睡眠病に対して効果的な治療薬は副作用が強いなどの問題点がある。

そこで、アスコクロリンやアスコフラノンにより、トリパノソーマの電子伝達系を特異的に阻害することによる、アフリカ睡眠病の予防や治療が期待されている。原虫は哺乳類体内に侵入すると、主にグリコソーム内の解糖系でＡＴＰ合成を行い、これにはトリパノソーム・オルターネイティブ・オキシダーゼ（ＴＡＯ）が触媒するＮＡＤ^＋の再生が必要であるところ、アスコクロリンやアスコフラノンはこのＴＡＯの働きを阻害する。感染した哺乳類はＴＡＯと同様の酵素を有していないことから、トリパノソーマを特異的に駆除することが可能となる。なお、特にアスコフラノン及びその誘導体は非常に低濃度であってもＴＡＯを阻害することが報告されている。

また、アスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの誘導体には、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用などが存在することが知られている（例えば、下記特許文献２を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。さらに、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成経路の中間体にあるイリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）もまた、高い抗原虫剤（下記特許文献３、該文献の全記載はここに開示として援用される）や、免疫抑制剤、リウマチ治療剤、抗癌剤、拒絶反応治療薬、抗ウイルス薬、抗Ｈ．ピロリ薬及び糖尿病治療薬等（下記特許文献４、該文献の全記載はここに開示として援用される）の作用に基づいて、新たな医薬品の有効成分として期待されている。さらに、イリシコリンＡはアスコクロリンやアスコフラノンのみならず他のイソプレノイドの生合成の中間体としても知られており、それらの原料としても有用な化合物である。

イソプレノイドのうち、アスコフラノンやアスコクロリンの製造方法としては、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）糸状菌を培養し、菌糸中に蓄積したアスコフラノンを分離採取する方法が知られている（例えば、下記特許文献５及び６を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。なお、アスコフラノンの生産株として知られていたアスコキタ・ビシア（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ）は、正しくは、アクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）であることが下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される）によって報告されている。

特開平０９－１６５３３２号公報 特開２００６－２１３６４４号公報 国際公開第２０１２／０６０３８７号 国際公開第２０１３／１８０１４０号 特公昭５６－２５３１０号公報 特公昭４５－９８３２号公報

Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）. ２０１６ Ｎｏｖ ２. Ｒｅ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃｏｆｕｒａｎｏｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ ａｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ.

特許文献５及び６に記載の方法のような、アスコクロリンやアスコフラノンを生産することが知られている糸状菌を用いる方法によれば、これらの物質の収率は使用する糸状菌に大きく依存することになる。しかし、これまでに知られている微生物におけるアスコクロリンやアスコフラノンの含有量は工業的規模の生産量としては少ないこと、さらに該含有量は僅かな培養条件の違いで大きく異なってくることから、既存の方法では大量のアスコクロリンやアスコフラノンの安定生産が実現できないという問題がある。また、イリシコリンＡに至っては、大量に得るための製造方法についてこれまでに知られていない。

例えば、アスコクロリンやアスコフラノン及びその中間体であるイリシコリンＡといったイソプレノイドの大量生産を実現するためには、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株を単離又は育種することや生物工学技術を駆使してイソプレノイドの生合成に関与する遺伝子を挿入した形質転換株を構築することが考えられる。しかし、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株についてはこれまでにほとんど知られておらず、さらにイソプレノイドの生合成経路については不明な部分が依然として多い。

また、イソプレノイドのうち、アスコクロリン、アスコフラノン及びイリシコリンＡの生合成遺伝子についても、未だ不明な部分が多い。

したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにそれらの誘導体といったイソプレノイドを高収量で安定的に生産することができることから、工業的規模でのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）において、アスコクロリン及びイリシコリンＡの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＢ～遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子）に続いて、アスコフラノンの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＩ～遺伝子ａｓｃＫの３遺伝子）を特定することに成功した。

次に、本発明者らは、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで得られたＤＮＡコンストラクトを宿主生物として、糸状菌の一種であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物やアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物に導入して形質転換することによって、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。さらに、アクレモニウム属微生物のａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩのノックアウト糸状菌を作製することにも成功した。

上記形質転換糸状菌は、通常の糸状菌を培養する方法に準じて培養することができ、その増殖速度などについても宿主生物と格別相違がないものであった。これらのことより、上記形質転換糸状菌やノックアウト糸状菌を用いればアスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを生産し得ることがわかった。

一方で、アスコクロリン生合成遺伝子クラスターにある遺伝子ａｓｃＡは、転写因子であると考えられるため、遺伝子ａｓｃＡを導入して発現させなくとも、アスコクロリンの生合成には影響しないと考えられた。実際に、上記したとおり、遺伝子ａｓｃＡを有していないアスペルギルス属微生物に、遺伝子ａｓｃＢ～遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子を導入した形質転換糸状菌を用いれば、アスコクロリンを生合成し得ることがわかっている。

かかる事実があるにもかかわらず、本発明者らは、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子を有するアクレモニウム・スクレロティゲナムに遺伝子ａｓｃＡを導入することにより、遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。そして、驚くべきことに、この遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を用いることにより、アスコクロリンだけではなく、アスコフラノンもまた大量に生産することができることを見出した。

本発明は上記のような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。

したがって、本発明の一態様によれば、下記［１］～［１１］の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法が提供される。
［１］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＩ。
（１）配列表の配列番号８に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［２］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドからアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＪ。
（１）配列表の配列番号９に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［３］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＫ。
（１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１０に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号２０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号２０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［４］上記［１］～［３］に記載の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［５］さらに遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、上記［４］に記載の形質転換体。
［６］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＧのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［７］上記［６］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。上記［６］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体の製造方法。
［８］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＦのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［９］上記［８］に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。上記［８］に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体の製造方法。
［１０］上記［１］に記載の遺伝子ａｓｃＩを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＩのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
［１１］上記［１０］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。上記［１０］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体の製造方法。

また、本発明の別の一態様において、下記［１２］～［２２］の遺伝子、形質転換体及び製造方法が提供される。
［１２］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦ。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１３］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧ。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１４］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＨ。
（１）配列表の配列番号７に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１７又は４１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１７又は４１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１５］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、ＬＬ－Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＥ。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）ＬＬ－Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１４又は３８に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１４又は３８に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１６］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、アセチルＣｏＡからＯ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＤ。
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）アセチルＣｏＡからＯ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１３又は３７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１３又は３７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１７］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、Ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＢ。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）Ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１１又は３５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１１又は３５に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１８］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＣ。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１２又は３６に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１２又は３６に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１９］［１２］～［１８］に記載の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［２０］［１９］に記載の形質転換体を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。
［２１］［１９］に記載の形質転換体を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
［２２］［１９］に記載の形質転換体を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。

また、本発明の別の一態様において、下記［２３］～［３１］のタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法が提供される。
［２３］下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有する、ＡｓｃＡタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
［２４］下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかの塩基配列であって、［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＡ。
（Ａ）［２３］に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列
（Ｃ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（Ｄ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
［２５］［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、［２３］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法。
［２６］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［２５］に記載の方法。
［２７］［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［２８］前記形質転換体は、宿主生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物である、［２７］に記載の形質転換体。
［２９］［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、［２３］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［３０］［２７］～［２８］のいずれか１項に記載の形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［３１］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［２９］又は［３０］に記載の方法。
また、本発明の別の一態様において、下記［３２］～［３３］のノックアウト生物及び方法が提供される。
［３２］遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物に由来する、遺伝子ａｓｃＧのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
［３３］［３２］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを生産する工程を含む、イソプレノイドの製造方法。

本発明によれば、高収量のアスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを安定的に製造することができる。その結果、本発明によれば、工業的規模で、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを製造することが期待できる。

図１は、トランスクリプトーム解析により予測されたアスコクロリン生合成遺伝子クラスターを示した図である。 図２は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥ株抽出物及びイリシコリンＡ標準品のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図３は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥ株、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧ株及びＡｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図４Ａは、後述する実施例に記載されているとおりの、野生株反応液及びＡｓ－Ｆ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図４Ｂは、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液及びＡｓ－ＦＧ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図５は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＦＧ反応液及びＡｓ－ＦＧＨ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図６は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示したスキーム図である。 図７は、トランスクリプトーム解析により予測されたアスコフラノン生合成遺伝子クラスターを示した図である。 図８は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液、Ａｓ－ＦＩ反応液、Ａｓ－ＦＩＪ反応液、Ａｓ－ＦＩＫ反応液、Ａｓ－ＦＪＫ反応液、Ａｓ－ＩＪＫ反応液及びＡｓ－ＦＩＪＫ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図９は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液を用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果及びＭＳ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図１０は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液、Ａｓ－ＦＩ反応液、Ａｓ－ＦＩＪ反応液、Ａｓ－ＦＩＫ反応液、Ａｓ－ＦＪＫ反応液、Ａｓ－ＩＪＫ反応液及びＡｓ－ＦＩＪＫ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図１１は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示した図である。 図１２は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株及びＡｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１３は、後述する実施例に記載されているとおりの、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１４は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｔｒ－ＤＢ株及びＡｓ－ＤＢ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１５は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株及びＡｓ－ＤＢＣ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１６は、イリシコリンＡエポキシドからアスコフラノンに至る反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示したスキーム図である。 図１７は、後述する実施例に記載されているとおりの、ΔａｓｃＧ株及びΔａｓｃＧ－Ｉ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１８は、後述する実施例に記載されているとおりの、ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ株及びΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ＋Ｎｄ－ａｓｃＧ株の抽出物並びにＡｓ－ＦＧ反応液のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１９は、後述する実施例に記載されているとおりの、野生株及びＡｓｃＡ強制発現株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。

以下、本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。また、本発明の技術的範囲は、本明細書における、いかなる憶測や推論に拘泥されるわけではない。

（イソプレノイド）
本明細書における「イソプレノイド」は、通常知られているとおりのイソプレンを構成単位とする化合物であれば特に限定されず、例えば、イリシコリン酸Ｂ（グリフォリン酸）、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ（ＬＬ－Ｚ１２７２β）、イリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ただし、本明細書では、主として、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにこれらの誘導体のことを「イソプレノイド」とよぶ場合がある。また、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリンＡエポキシド、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノールを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢを「イリシコリンＡ前駆体」とよぶ場合がある。

本明細書でいう「誘導体」とは、化学合成法、酵素合成法、醗酵法又はそれらを組み合わせた方法などにより、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ、イリシコリンＡ、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノンなどを経由して取得された修飾化合物の全てを含む。ただし、「誘導体」には、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ、イリシコリンＡ、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノンなどを経由せずとも、本明細書記載の酵素のいずれか１つを用いて生合成され得る、上記化合物と類似構造を有する化合物、及びそれらの修飾化合物の全てを含む。アスコフラノン、アスコクロリン、イリシコリンＡやこれらの前駆体は全て、ポリケタチド化合物とテルペノイド化合物がハイブリッドしたメロテルペノイド化合物である。本明細書で示すように、メロテルペノイド化合物は、ＡｓｃＤのようなポリケチド・シンターゼによりポリケチド骨格が生合成された後に、ＡｓｃＢのようなプレニル・トランスフェラーゼによってＣ１０、Ｃ１５、Ｃ２０等のイソプレノイド化合物が転移されることで、ポリケタチド化合物とテルペノイド化合物がハイブリッドされることによって生合成される。つまり、基質特異性を改変した、又は同一性は高いが、基質特異性の異なるＡｓｃＤやＡｓｃＢの組み合わせを変えることにより、種々のイリシコリン酸Ｂ類縁体化合物が生合成され得る。一例として、コレトクロリンＢは、イリシコリンＡのイソプン骨格が１つ短い、つまりＣ１０のモノテルペン構造を有するイリシコリンＡに似た類縁化合物であるが、該化合物は、本明細書のＡｓｃＤ及び特異性を改変したＡｓｃＢ、又は基質特異性の異なるＡｓｃＢと同一性の高い酵素の２つ酵素の反応を組み合わせること、若しくは有機化学合成法によって、イリシコリン酸Ｂのテルペン部分がＣ１０のモノテルペン構造である化合物を取得した後に、さらにＡｓｃＣ、ＡｓｃＥの反応によって合成され得るため、本明細書でいう「誘導体」に含み得る。

（酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列）
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＢは、ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（１）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＣは、イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（２）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＤは、アセチルＣｏＡからｏ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（３）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＥは、ＬＬ－Ｚ１２７２β からイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（４）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。酵素（４）は、イリシコリン酸Ｂからイリシコリン酸Ａを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であってもよい。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＦは、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（５）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＧは、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（６）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。酵素（６）を用いた反応によってイリシコリンＡエポキシドから生成される化合物はイリシコリンＣである。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＨは、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（７）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＩは、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（８）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応とは、イリシコリンＡエポキシドの水素原子（－Ｈ）をヒドロキシ基（－ＯＨ）に置換する反応をいう。酵素（８）を用いた反応によってイリシコリンＡエポキシドから生成される化合物はヒドロキシイリシコリンＡエポキシドである。

本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＪ及びａｓｃＫは、イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、それぞれ「酵素（９）」及び「酵素（１０）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

本発明の技術的範囲はいかなる憶測や推論に拘泥されるわけではないが、酵素（１）はプレニル・トランスフェラーゼと同様の機能を有し；酵素（２）はオキシドリダクターゼと同様の機能を有し；酵素（３）はポリケチド・シンターゼと同様の機能を有し；酵素（４）はハロゲナーゼと同様の機能を有し；酵素（５）はエポキシダーゼとしてのｐ４５０／ｐ４５０リダクターゼと同様の機能を有し；酵素（６）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；酵素（７）はデヒドロゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（８）はモノオキシゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（９）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；及び酵素（１０）はデヒドロゲナーゼと同様の機能を有する蓋然性がある。ただし、後述する実施例に記載があるとおり、酵素（９）及び酵素（１０）は、これらの酵素をコードする遺伝子の両方が発現することにより、ＡｓｃＩタンパク質の反応物からアスコフラノンを合成し得る。本明細書では、具体的な作用機序にかかわらず、２種の酵素をコードする遺伝子が発現することにより特定の反応が生じる場合において、一方の酵素は他方の酵素と「共役する」とよぶ。ただし、酵素（９）は、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシドからアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であるといえる。酵素（１０）は、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であるといえる。

本発明の一態様のＡｓｃＡタンパク質は、酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子のうち、1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有する、タンパク質である。ＡｓｃＡタンパク質は、酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子のうち、1つ以上の遺伝子の発現を増強することによって、これらの遺伝子を含む生物体におけるイソプレノイドの生合成が促進し、もって該生物体によるイソプレノイドの産生が増大する。ＡｓｃＡタンパク質は酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子の正の転写因子として機能し得る。なお、ＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子は、アスコクロリン生合成遺伝子又はアスコフラノン生合成遺伝子に含まれ得る。ＡｓｃＡタンパク質は、厳密には転写因子であり、酵素ではないが、本明細書では便宜上ＡｓｃＡタンパク質を酵素として捉え、「酵素（１１）」とよぶ場合がある。

酵素（１）乃至（１１）は、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。

例えば、上記した酵素活性を有する酵素（１）の一態様として配列番号１１、３５及び４７に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（２）の一態様として配列番号１２、３６及び４８に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（３）の一態様として配列番号１３、３７及び４９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（４）の一態様として配列番号１４、３８及び５０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（５）の一態様として配列番号１５及び３９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性する酵素（６）の一態様として配列番号１６及び４０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（７）の一態様として配列番号１７及び４１に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（８）の一態様として配列番号１８に示すアミノ酸配列；上記した酵素活性を有する酵素（９）の一態様として配列番号１９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（１０）の一態様として配列番号２０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（１１）の一態様として配列番号６６に示すアミノ酸配列がある。

配列番号１１～２０及び６６に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアクレモニウム属糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１～１０及び６５に示す塩基配列である。

配列番号３５～４１及び６７に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＮｄ－ＡｓｃＢ、Ｎｄ－ＡｓｃＣ、Ｎｄ－ＡｓｃＤ、Ｎｄ－ＡｓｃＥ、Ｎｄ－ＡｓｃＦ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ、Ｎｄ－ＡｓｃＨ及びＮｄ－ＡｓｃＩタンパク質と名付けられる。また、Ｎｄ－ＡｓｃＧタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号６４に示す塩基配列である。

配列番号４７～５０に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＴｒ－ＡｓｃＢ、Ｔｒ－ＡｓｃＣ、Ｔｒ－ＡｓｃＤ及びＴｒ－ＡｓｃＥタンパク質と名付けられる。また、Ｔｒ－ａｓｃＣ、Ｔｒ－ＡｓｃＤ及びＴｒ－ＡｓｃＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号５３、５７及び６０に示す塩基配列である。

ＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫタンパク質は、アクレモニウム属、ネオネクトリア属又はトリコデルマ属の染色体ＤＮＡ上に存在するこれらの酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質」や「野生型酵素」と本明細書ではよぶ場合がある。

酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列は、それぞれ上記した酵素（１）乃至（１１）の酵素活性を有するものであれば、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。

「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。

酵素（１）乃至（１１）を入手する方法は特に限定されないが、例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養し、次いで培養物中の酵素（１）乃至（１１）を回収することを含む方法などが挙げられる。培養物中から酵素（１）乃至（１１）を回収する手段は特に限定されず、例えば、常法に従って、不純物を取り除いた培養物上清から、硫安沈殿などにより酵素（１）乃至（１１）を含むタンパク質濃縮液を得て、次いで酵素（１）乃至（１１）の分子量を指標としたゲルろ過クロマトグラフィーやＳＤＳ－ＰＡＧＥなどを用いることによって、酵素（１）乃至（１１）を単離することができる。なお、配列番号１１～２０及び６６に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質の構成元素から算出される理論分子量は、それぞれ３７０００、１２００００、２３００００、６１０００、１２００００、３１０００、６１０００、５７０００、４２０００、３２０００及び５５０００程度である。

（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子）
遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪａｓｃＫ及びａｓｃＡ（以下、これらを総称して「酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記した酵素活性を有する酵素（１）乃至（１１）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が生物体内で発現することにより酵素（１）乃至（１１）が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が本来の機能や活性、特に酵素活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が生産されることを包含する。

酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由して酵素（１）乃至（１１）を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに酵素（１）乃至（１１）を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。

酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、上記した酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。

本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。

本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。

ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ 、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １－３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。該文献の全記載はここに開示として援用される）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。

野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から４０個、好ましくは１から３５個、好ましくは１から３０個、好ましくは１から２５個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４又は５個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。

野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ活性を有するものである。

また、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、配列番号２１～２４、２８～３０及び６１に記載の塩基配列などが挙げられる。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。

（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。

２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３、該文献の全記載はここに開示として援用される）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０、該文献の全記載はここに開示として援用される）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７、該文献の全記載はここに開示として援用される）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。

上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５－１４４１、１９８５、該文献の全記載はここに開示として援用される）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。

（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、例えば、イリシコリンＡ、アスコフラノン、アスコクロリンなどのイソプレノイドの生産能がある生物種や酵素（１）乃至（１１）の発現が見られる生物種などに由来する。酵素（１）乃至（１１）の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられる。微生物の中でも糸状菌はアスコクロリン生産能又はアスコフラノン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。アスコクロリンやアスコクロリン類縁体の生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ネオネクトリア属糸状菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）糸状菌、シリンドロカルポン属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）糸状菌、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）糸状菌、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）糸状菌、シリンドロクラジウム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ）糸状菌、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）糸状菌、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）糸状菌、ニグロサブラム属（Ｎｉｇｒｏｓａｂｕｌｕｍ）糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｇｅｎｕｍ）、コレトトリカム・ニコチアナエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）などが挙げられる。アスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）糸状菌、バーティシリウム属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイ、ペシロマイセス・バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。また、イリシコリンＡ生産能を有する糸状菌の具体例としては、トリコデルマ属糸状菌が挙げられ、より具体的にはトリコデルマ・リーゼイが挙げられる。なお、上記のアスコクロリン生産能を有する糸状菌及びアスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例は、イリシコリンＡ生産能を有する糸状菌の具体例であり得る。

上記のとおり、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素（１）乃至（１１）は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。

（遺伝子工学的手法による酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のクローニング）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の取得方法や、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の塩基配列、酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。

酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素（１）乃至（１１）の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。

例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどを挙げることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナムを培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。

次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。

また、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を構築することが可能である。

ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌 ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌 ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製する。

該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３、該文献の全記載はここに開示として援用される）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列を知り得る。

（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。

（形質転換体の作製方法）
形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。

酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えまたは非相同組み換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。

相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。

非相同組換えを利用する方法では、相同な配列を必要とせず、宿主生物のゲノム中の任意の領域にランダムに挿入され、多コピーで挿入されることもあり得る。形質転換に用いるＤＮＡコンストラクトは直鎖状であっても環状であってもどちらでも良い。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。

ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。

そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主生物中で酵素（１）乃至（１１）を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、該文献の全記載はここに開示として援用される）及び糸状菌の系などが挙げられる。

ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５）、該文献の全記載はここに開示として援用される）にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。

ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＧ３、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。

ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。

ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。

ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えばｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５’相同組み換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３’相同組み換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。

ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーターであるＰｔｅｆ、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ｔｅｆ１遺伝子ターミネーターであるＴｔｅｆやａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。

相同組み換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。

相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。

宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。

また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１号公報に記載の実施例や図１を参照して、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流領域及び酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。糸状菌の場合、相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。

形質転換体が作製されたことの確認は、酵素（１）乃至（１１）が有する活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物、例えば、アスコクロリン、イリシコリンＡ、アスコフラノンといったイソプレノイドが検出されること、又は検出された目的産物の量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物における目的産物の量よりも多いことを確認することにより行うことができる。

また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。

相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。

（ノックアウト生物の作製方法）
「ノックアウト」とは、遺伝子の一部若しくは全部を欠損させること、変異導入若しくは遺伝子に任意の配列を挿入させること、その遺伝子の発現に必要なプロモーターを欠損させることなどにより、その遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を失わせることを意味する。厳密にいえばその遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を完全には失っていない、つまり、その遺伝子がコードするタンパク質が機能発現している可能性があっても、その機能発現を大部分失っている限り、本明細書でいう「ノックアウト」に含み得る。なお、本明細書中で「ノックアウト生物」のことを、「破壊株」や「欠損株」などとよぶ場合がある。

ノックアウトの作製方法は特に限定されず、例えば、下記の実施例で示したような相同組み換えを用いて遺伝子の一部もしくは全部を欠損させること、又はＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのゲノム編集技術により遺伝子の欠失、挿入、置換を引き起こすことなど、どのような方法を用いても良い。相同組み換えにより遺伝子をノックアウトする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトであるが、これに限定されない。

相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトなどである。

（宿主生物）
宿主生物としては、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト又は酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素（１）乃至（１１）を生産することやイソプレノイドを生産することができる生物であれば特に限定されず、例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、ネオネクトリア属微生物、フザリウム属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。イリシコリンＡ、アスコクロリン、アスコフラノンなどのイソプレノイドの生産能が認められる糸状菌や酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌であってもよい。

宿主生物がアスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を有さないことなどにより、イソプレノイドの生産能が認められない場合は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子により形質転換する。すなわち、アスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を導入して、イソプレノイドを異種発現するように形質転換した形質転換体、例えば、形質転換糸状菌も宿主生物として利用可能である。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。

イソプレノイドの生産能が認められる生物としては、アクレモニウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、フザリウム属糸状菌、シリンドロカルポン属糸状菌、バーティシリウム属糸状菌、ネクトリア属糸状菌、ペシロマイセス属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイ、ペシロマイセス・バリオッティ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。

糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。

なお、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物をはじめとして糸状菌は相同組換え頻度が低い傾向にあることから、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのＫｕ遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。

このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができるが、例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用したＫｕ遺伝子を破壊することや、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって達成可能である。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物は、Ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。

また、宿主生物は、ｐｙｒＧなどのマーカー遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。抑制すべきマーカー遺伝子は、ＤＮＡコンストラクトに含めるマーカー遺伝子に応じて適宜設定できる。

（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の具体例）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１～１０及び６５に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及びａｓｃＡが挙げられる。なお、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１～２０及び６６として示す。

アクレモニウム・スクレロティゲナム及びアクレモニウム・スクレロティゲナム以外の生物から酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫの塩基配列（配列番号１～１０及び６５）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ａｓｃＡ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及びａｓｃＡの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１～２０及び６６）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ及びＡｓｃＩタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、ネオネクトリア属由来の配列番号３５～４１及び６７のアミノ酸配列；アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ及びＡｓｃＥタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、トリコデルマ由来の配列番号４７～５０のアミノ酸配列などが挙げられる。

アクレモニウム・スクレロティゲナムから得られた酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、又は酵素（１）乃至（１１）と配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物やアクレモニウム属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。

（形質転換体）
形質転換体の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＡ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（１）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現したＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及び／又はＡｓｃＫの作用によって宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを検出可能の量又はそれ以上の量で生産することができる。

形質転換体の別の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのすべて、又は一部を含む、野生型由来生合成遺伝子クラスター遺伝子（ＯＲＦ以外のプロモーター配列等も含む。）、及び、ＡｓｃＡのような該生合成遺伝子クラスターの転写を制御する転写因子を高発現又は低発現するように設計されたＤＮＡコンストラクトが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（２）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現量の変化した転写因子の作用によって、宿主生物又は形質転換体に適した条件で培養又は生育することにより、宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを検出可能の量又はそれ以上の量で生産することができる。

形質転換体の具体的な一態様は、アスペルギルス・ソーヤなどを宿主生物とする形質転換体であって、遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫに加えて、遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体；遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫに加えて、遺伝子ａｓｃＦが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体などであるが、これに限定されない。

形質転換体の具体的な一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイなどを宿主生物とする形質転換体であって、ａｓｃＡ～Ｉのいずれか１つ以上の遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体などであるが、これに限定されない。

（ノックアウト生物）
ノックアウト生物の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンとアスコフラノンの両方を産生するような、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＧをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（１）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物は、アスコクロリンの生合成に関与する酵素であるＡｓｃＧタンパク質を発現しないので、アスコクロリンに代えてアスコフラノン又はアスコフラノン前駆体のみを生産することができ、例えば、野生型生物に比べて、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体を大量に生産する可能性がある。

ノックアウト生物の別の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムやオネクトリア・ディティシマなどのアスコクロリン又はアスコクロリン前駆体を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ及びａｓｃＦを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＦをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（２）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物を野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、野生型生物に比べて、イリシコリンＡを大量に生産する可能性がある。

ノックアウト生物の別の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリン及びアスコフラノンの両方を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物、又はオネクトリア・ディティシマなどの遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＩをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（３）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物はアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるＡｓｃＩタンパク質を発現しないので、アスコフラノンに代えてアスコクロリンのみを生産することができ、例えば、野生型生物に比べて、アスコクロリンを大量に生産する可能性がある。

ノックアウト生物の別の一態様は、トリコデルマ・リーゼイなどのイリシコリンＡ誘導体を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ及びイリシコリンＡ以降の生合成に関与する遺伝子を有する野生型生物から、イリシコリンＡ以降の生合成に関与する遺伝子をノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（４）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物を野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、野生型生物に比べて、イリシコリンＡを大量に生産する可能性がある。

（製造方法）
本発明の一態様の製造方法は、形質転換体（１）又は形質転換体（２）を宿主細胞に適した条件で培養することにより、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。

本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ－Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）等の、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）に作用させて、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。例えば、イリシコリンＡを形質転換体に作用させる方法は、イリシコリンＡと形質転換体とが接触して、形質転換体が有する酵素によってアスコクロリン又はアスコフラノンが生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、イリシコリンＡを含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、アスコクロリンを製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。

本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ－Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ等の、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）より抽出した酵素を作用させて、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。

本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（１）を野生型生物に適した条件で培養することにより、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体を得る工程を少なくとも含む、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体の製造方法である。

本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（２）又は（４）を、野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、イリシコリンＡを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡの製造方法である。

本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（３）を、野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、アスコクロリン又はアスコクロリン前駆体を得る工程を少なくとも含む、アスコクロリン又はアスコクロリン前駆体の製造方法である。

以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本発明の各態様の製造方法は下記記載に限定されない。

培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＧＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。

形質転換体やノックアウト生物（以下では、これらを総称して「形質転換体等」ともよぶ。）の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等がアクレモニウム属やアスペルギルス属などの糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＧＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。

培養終了後に培養物からアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡなどの目的産物（イソプレノイド）を抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。

抽出溶媒は目的産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら目的産物を抽出する。

また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。

得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。

定性的分析又は定量的分析は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ、ＭＳ／ＭＳなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。

本発明の各態様の製造方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。

（方法）
本発明の一態様の方法は、ａｓｃＢ～ａｓｃＫのいずれか1つ以上の遺伝子、あるいは、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法である。本発明の別の一態様の方法は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。本発明の別の一態様の方法は、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。

ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段は特に限定されないが、例えば、使用する糸状菌として、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を用いること；遺伝子ａｓｃＡを含むアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌について、培養条件を調整することや他の転写因子を導入するなどして、該糸状菌が本来有する遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することなどの手段が挙げられる。

糸状菌によるイソプレノイドの産生が増大しているか否かは、例えば、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じていないアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量と、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じたアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量とを比較することにより確認することができる。

（用途）
本発明の一態様の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法を利用して得られたアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡなどのイソプレノイドは、抗原虫活性、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用など種々の生理活性を有することが期待できる機能性生体物質であるとともに、その特徴を活かして、医薬品、医薬部外品などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

（アスコクロリン生合成遺伝子の探索）
アスコフラノン産生菌であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ Ｆ－１３９２株；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．７０：３０４－３０７（２０１６）、該文献の全記載はここに開示として援用される）を用いて、アスコフラノンの産生量が４００倍以上異なる２つの培養サンプルを取得した。

それらのサンプルから、５０～１００ｍｇの菌体を回収し、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、標準プロトコールに従って全ＲＮＡを回収した。

回収した全ＲＮＡから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｍＲＮＡを単離し、トランスクリプトームライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）をＩｏｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて構築した。

なお、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの品質及びトランスクリプトームライブラリーの濃度測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ ｐｉｃｏ ｋｉｔ及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ともにＡｇｉｌｅｎ社製）を用いて確認した。

得られたｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡシーケンス解析をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシステムを用いて以下のように行った。

得られたｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ／Ｌに希釈し、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ２を用いてエマルジョンＰＣＲによってライブラリーの増幅を行った。増幅したライブラリーは、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ＥＳを用いて濃縮し、Ｉｏｎ ＰＧＭ ｓｙｓｔｅｍによってＲＮＡシーケンス解析を行った。Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ２にはＩｏｎ ＰＧＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＯＴ２ ２００ Ｋｉｔを用い、Ｉｏｎ ＰＧＭにはＩｏｎ ＰＧＭ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２００ Ｋｉｔ ｖ２を用いた。

ＲＮＡシーケンスにはＩｏｎ ＰＧＭ Ｉｏｎ ３１６ ｖ２チップを使用した。得られたシーケンス情報をアクレモニウム・スクレロティゲナムのゲノム配列データベースにマッピングし、２つのサンプル間における遺伝子の発現量の違いを解析した。

マッピングされたｃＤＮＡのリード数をそれぞれの遺伝子の長さで補正した値（ＲＰＫＭ：ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ）を基に、高生産サンプルと低生産サンプルとの間の発現倍率を計算した。

高生産サンプルの遺伝子のうち、低生産サンプルのものと比較して３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子の探索を行った結果、２遺伝子以上が連続しており、３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子が集中した唯一の領域を見出すことができた。これがアスコフラノン生合成遺伝子クラスターであると予測し、３００倍以上の倍率で高発現していた遺伝子をａｓｃＡ～Ｈと名付けた（図１を参照）。

また、それぞれの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、ＡｓｃＡ～Ｈは表１のような機能を持つことが予測された。このうち、ＡｓｃＡは、転写因子であると考えられたため、アスコフラノンの生合成には遺伝子ａｓｃＢ～Ｈ（配列番号１～７）がコードするＡｓｃＢ～Ｈタンパク質（配列番号１１～１７）が関与すると予想された。

（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥ発現形質転換体の作製）
麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＮＲＲＣ４２３９株）のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号１５～１８の遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットを導入した。

具体的には、各ａｓｃ遺伝子を発現させるための発現カセットとして、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号２５）をプロモーターとして用い、及びアルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号２６）をターミネーターとして用いた。また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５,３５ｂｐを含む１，８３８ｂｐ、配列番号２７）を用いた。

例えば、ユーンらの文献（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００９ Ｍａｒ;８２（４）:６９１－７０１. ｄｏｉ: １０．１００７／ｓ００２５３－００８－１８１５－５. Ｅｐｕｂ ２００８ Ｄｅｃ ２４. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｉｎｔｕｐｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ. 、該文献の全記載はここに開示として援用される）で報告されているように、形質転換に用いるＤＮＡ中に遺伝子挿入位置（相同組み換え領域）の上流又は下流の配列と相同な配列が含まれている場合、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含む培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることができ、何度もｐｙｒＧマーカーを使用すること（マーカーリサイクリング）が可能となる。よって、５’相同組み換え配列（５’ａｒｍ）、Ｐｔｅｆ、ａｓｃ遺伝子、Ｔａｌｐ、マーカーリサイクリング用相同配列（下流遺伝子との相同配列；ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ）、ｐｙｒＧ、３’相同組み換え配列（３’ａｒｍ）の順に連結したものを形質転換用ＤＮＡとして用いることでｐｙｒＧのマーカーリサイクルを行い、各ａｓｃ遺伝子の発現カセットをアスペルギルス・ソーヤの染色体上へａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥの順に挿入した。

また、それぞれのＤＮＡの連結にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号３１及び３２のプライマーを、ａｓｃＤは配列番号３３及び３４のプライマーを用いてＰＣＲによりそれぞれのＤＮＡ断片を増幅させた。このとき、遺伝子ａｓｃＤ用のフォワードプライマーには、５’末端にＰｔｅｆと相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとの連結が可能となる。

以上のようにして調製した５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを用いて、アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株を形質転換することで、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットのそれぞれを順に１コピーずつ導入したＡｓ－Ｄ株、Ａｓ－ＤＢ株、Ａｓ－ＤＢＣ株及びＡｓ－ＤＢＣＥ株を取得した。

次に、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－Ｄ株、Ａｓ－ＤＢ株、Ａｓ－ＤＢＣ株及びＡｓ－ＤＢＣＥ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。

回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－ＤＢＣＥ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析及びＭＳ解析（ネガティブモード）を行ったところ、Ａｓ－Ｄ株では宿主株（ＮＢＲＣ４２３９株）では見られなかった新たなピークがｏ－オルセリン酸の標準品と同じ溶出位置に確認された。また、Ａｓ－ＤＢ株ではＡｓ－Ｄ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はイリシコリン酸Ｂに相当する３７１であることがわかった。また、Ａｓ－ＤＢＣ株ではＡｓ－ＤＢ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はＬ－Ｚ１２７２βに相当する３５５であることがわかった。さらに、Ａｓ－ＤＢＣＥ株ではＡｓ－ＤＢＣ株では見られなかった新たなピークがわずかながら確認され、該ピークはイリシコリンＡ（ｉｌｉｃｉｃｏｌｉｎ Ａ）標準品と同じ溶出位置に見られた（図２を参照）。

なお、図２のＨＰＬＣは、メタノール：水：酢酸（４５０：５０：１０）を移動相（１ｍｌ／ｍｉｎ）とし、粒子径３μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ（ＴＯＳＯＨ社製）のＯＤＳカラムを用いて実施した。

さらに、特願２０１７－２０６８０９号明細書に記載のｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号５４）を用いて、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ及びａｓｃＥをそれぞれ多コピーで導入したＡｓ－ＤＢＣＥ－ｍｕｌｔｉ－ｃｏｐｙ株では、イリシコリンＡが多く蓄積していることがわかった（図２を参照）。なお、ｐｙｒＧ３遺伝子は、糸状菌において、任意の遺伝子を多コピーで染色体に組み込むための、ｐｙｒＧ内のプロモーター領域を改変し、発現量を低下させた選択マーカー遺伝子である。

また、ＬＣ／ＭＳ解析により、該ピークの化合物がイリシコリンＡ標準品と同じｍ／ｚ値３８９（ｎｅｇａｔｉｖｅモード）を示すこと、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析においてもイリシコリンＡ標準品と同様のピークパターンを示したことから、発現したＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥタンパク質によって、イリシコリンＡが生合成されていることがわかった。なお、図２中で、約７分の溶出位置で見えているピークは、Ａｓ－ＤＢＣ株で確認されたピークと溶出位置が一致しており、ＭＳ解析の結果、ＬＬ－Ｚ１２７２βのｍ／ｚ値と一致していることがわかった。

（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨ発現形質転換体の作製）
Ａｓ－ＤＢＣＥ株と同様にして、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２～２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのいずれかを含む発現カセットを順次導入することで、ＡｓｃＦ発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦ株；ＡｓｃＦ及びＡｓｃＧの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＧ株；及び、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株を作製した。これらの株を上記と同様にして培養し、ＨＰＬＣ解析を行った。

なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．２５ｍｌ/ｍｉｎで、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のＯＤＳカラムを用いて解析を行った。

図３に示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株ではＡｓ－ＤＢＣＥ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦＧ株では見られなかった新たなピークが確認された。

このことから、イリシコリンＡ以降は、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用して反応が進むことがわかった。

（粗酵素液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ解析）
アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２～２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの発現カセットのいずれかを導入したＡｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ－ａｓｃ遺伝子－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３をｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。

アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株（野生株）、Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を加えることで野生株、Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株の粗酵素液を抽出した。

得られた粗酵素液（菌体５～１０ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）～（４）を調製した：
（１）野生株反応液：野生株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（２）Ａｓ－Ｆ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（３）Ａｓ－ＦＧ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（４）Ａｓ－ＦＧＨ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液

上記反応液（１）～（４）をそれぞれ室温で一晩反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。

ＬＣ解析は、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。

その結果、図４Ａに示すとおり、Ａｓ－Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３において野生株反応液では見えなかった新たなピークが確認された。また、図４Ｂに示すとおり、Ａｓ－ＦＧ反応液ではｍ／ｚ値４０５においてＡｓ－Ｆ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、図５に示すとおり、Ａｓ－ＦＧＨ反応液ではｍ／ｚ値４０３においてＡｓ－ＦＧ反応液やＡｓ－ＦＧ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ－ＦＧＨ反応液で確認されたピークはアスコクロリン標準品のピークと溶出時間が一致し、さらにアスコクロリンのｍ／ｚ値は４０３であることから、これらの結果よりイリシコリンＡからＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用することによりアスコクロリンが生合成されることがわかった。

以上のように、アスコフラノン生合成に関与すると予測した遺伝子クラスターは、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターであることがわかった。予想されるアスコクロリンの生合成スキームを図６に示す。図６に示すとおり、アスコクロリンの生合成経路は、アスコフラノンの生合成経路とは、一部重複があるものの、全く別異なものであることがわかった。このことより、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターを導入した形質転換体により生産されるものは、アスコクロリンであってアスコフラノンではないことがわかった。

（内在性エポキシドヒドロラーゼ遺伝子破壊株の解析）
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により、Ａｓ－Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３のピークが確認されたため、アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株で発現させたＡｓｃＦの粗酵素液による反応生成物はジヒドロキシ化されたイリシコリンＡ（図６参照）であることが予測された。しかしながらホソノらの文献（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）. ２００９ Ｏｃｔ；６２（１０）:５７１－４. 、該文献の全記載はここに開示として援用される）によると、アクレモニウム属微生物において、イリシコリンＡエポキシド（ｍ／ｚ値４０５）が蓄積していることが明らかとなっており、よって本来のＡｓｃＦ反応生成物はイリシコリンＡエポキシドであると考えられた。つまり、アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株では、内在性のエポキシドヒドロラーゼによってイリシコリンＡエポキシドが開環し、ジヒドロキシル化されたイリシコリンＡが生成している可能性が考えられた。そこで、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株において、アスペルギルス・ソーヤ由来のエポキシドヒドロラーゼをコードすると予測される遺伝子のうち、最も発現量の高いエポキシドヒドロラーゼ遺伝子（配列番号４２）を欠損させたＡｓ－ＤＢＣＥＦ－ΔＥＨ株を作製した。Ａｓ－ＤＢＣＥＦ－ΔＥＨ株を上記と同様に培養し、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、ＭＳ解析により、該ピークはエポキシド化合物に相当するｍ／ｚ値を有していることがわかった。よって、ＡｓｃＦはイリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒することがわかった。

（アスコフラノン生合成遺伝子の探索）
図６に示すとおり、イリシコリンＡエポキシドによりアスコフラノンが生合成されるためには、一原子酸素添加反応が必要であると想定し、この反応にはＡｓｃＦ以外の別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが関与していると予測した。そこで、上記のＲＮＡシーケンス解析の結果を用いて、アスコフラノン高生産サンプルにおいて高発現しているＰ４５０遺伝子を探索した。その結果、アスコフラノン高生産サンプルにおいて、ＡｓｃＦの約６割の発現量を有し、かつ、低生産サンプルではほとんど発現していないＰ４５０遺伝子を新たに見出した。また、該Ｐ４５０遺伝子の隣接する２つの遺伝子も同様にアスコフラノン高生産サンプルでのみ高発現していることがわかり、これら３つの遺伝子がクラスターを形成していることが示唆された（図７を参照）。該Ｐ４５０遺伝子に隣接する２つの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、一方は機能未知のタンパク質であり、もう一方はデヒドロゲナーゼであることがわかった。

（粗酵素液を用いたアスコフラノン合成）
上記にようにして見出した３つの遺伝子、Ｐ４５０遺伝子（配列番号８）、機能未知遺伝子（配列番号９）及びデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１０）を、それぞれａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫと名付けた。また、これらの遺伝子がそれぞれコードするＡｓｃＩタンパク質（配列番号１８）、ＡｓｃＪタンパク質（配列番号１９）及びＡｓｃＫタンパク質（配列番号２０）がアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるかをｉｎ ｖｉｔｒｏ解析で確認することにした。

アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、配列番号８～１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫの発現カセットのいずれかを導入したＡｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ－ａｓｃ遺伝子－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧをｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。

Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を加えることでＡｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株の粗酵素液を抽出した。

得られた粗酵素液（菌体５～７．５ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）～（７）を調製した：
（１）Ａｓ－Ｆ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（２）Ａｓ－ＦＩ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（３）Ａｓ－ＦＩＪ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（４）Ａｓ－ＦＩＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（５）Ａｓ－ＦＪＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（６）Ａｓ－ＩＪＫ反応液：Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液
（７）Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の混合液

上記反応液（１）～（７）をそれぞれ３０℃で１時間反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。

ＬＣ解析は、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。ＬＣ／ＭＳ解析の結果を図８及び図１０に示し、ＭＳ／ＭＳ解析の結果を図９に示す。

その結果、図８に示すとおり、（７）Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液でのみアスコフラノンに相当するｍ／ｚ値４１９のピークがアスコフラノン標準品と同じ溶出時間に検出された。さらに、（７）で検出されたｍ／ｚ値４１９のピークについて、コリジョンエネルギー４５ｅｖでＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、図９で示すようにアスコフラノン標準品と同様のフラグメンテーションパターンを示した。

また、図１０に示すとおり、（２）Ａｓ－ＦＩ反応液では、（１）Ａｓ－Ｆ反応液では見られなかったｍ／ｚ値４３９の新たなピークが検出され、さらに該ピークはＡｓｃＦ及びＡｓｃＩの両方ともが反応液中に存在するときにのみ検出された。つまり、このｍ／ｚ値４３９のピークは、イリシコリンＡを基質としてＡｓｃＦ及びＡｓｃＩが順に反応して生成した化合物（の加水分解産物）に由来すると考えられ、ｍ／ｚ値の差と、ＡｓｃＩがＰ４５０であることとから考慮すると、ＡｓｃＩは一原子酸素添加酵素（モノオキシゲナーゼ）として機能していることが強く示唆された。

以上より、図１１に示すとおり、イリシコリンＡを基質として、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫが反応することにより、アスコフラノンが生成されることがわかった。

（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫ発現形質転換体の作製）
上記と同様にして、配列番号８～１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及び配列番号４３のＡ．ｓｏｊａｅ ＮＢＲＣ４２３９株由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子をそれぞれ含む発現カセットを、ｐｙｒＧマーカーリサイクリング後のＡｓ－ＤＢＣＥＦ株に順次導入することで、ＡｓｃＩ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株；ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株をそれぞれ作製した。これらの株を５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。

なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ ３μｍ カラム（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）用いて解析を行った。結果を図１２に示す。

図１２に示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株では見られなかったｍ／ｚ値４１９のアスコフラノンに相当するピークが確認された。また、該ピークはアスコフラノン標準品のピークと溶出時間が一致した。これにより、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫはアスコフラノンの生合成遺伝子であることがわかった。

したがって、図６で予想したとおり、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成については、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ及びＡｓｃＦまでの反応は両者で共通しており、イリシコリンＡエポキシド以降の反応が異なっていることがわかった。具体的には、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＩが反応した場合はアスコフラノン生合成へ、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＧが反応した場合はアスコクロリン生合成へつながることがわかった（図１１を参照）。よって、アクレモニウム・スクレロティゲナムのようなアスコフラノン及びアスコクロリンの両方を生産するような株において、aｓｃＧ破壊株ではアスコフラノンのみを高生産することができ、ａｓｃＩ破壊株ではアスコクロリンのみを高生産することができるようになる。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株の作製）
以上の結果より、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成経路はイリシコリンＡエポキシドまで共通の経路を辿っており、ＡｓｃＩ及びＡｓｃＧは同じ基質を競合していることがわかった。よって、ａｓｃＧの破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、アスコクロリンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンＡエポキシドもアスコフラノン生産に利用することができ、よってアスコフラノンの生産性が向上することが考えられた。一方、ａｓｃＩの破壊株ではアスコクロリンのみを生産するようになり、アスコフラノンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンＡエポキシドもアスコクロリン生産に利用することができ、よってアスコクロリンの生産性が向上することが考えられた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムのａｓｃＧ破壊株及びａｓｃＩ破壊株を作製し、上記仮説を検証することにした。

アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株において各種ａｓｃ破壊株を取得するにあたり、まずはｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株を作製することにした。アクレモニウム・スクレロティゲナムをはじめとする糸状菌は一般的に相同組み換え効率が非常に低く、破壊株を取得することが困難である。よって、糸状菌においては、非相同組み換えによる遺伝子の挿入に関与するＫｕ７０等の機能を欠損させることで相同組み換え効率を向上させる方法がしばしば使用される。ｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株の作製は、（１）ｐｙｒＧ破壊株の取得、（２）ｐｙｒＧマーカーによるｋｕ７０破壊株の取得、（３）ｐｙｒＧマーカーリサイクリングによるｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株の取得、の手順で行うことにした。

まずはｐｙｒＧ破壊株を取得するべく、次のとおりにｐｙｒＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ ＯＲＦの上流約３ｋｂのＤＮＡ断片（５’ｐｙｒＧ）、ｐｙｒＧ ＯＲＦの１４７塩基目から下流約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（３’ｐｙｒＧ）、Ｔｔｅｆ（配列番号４４）を増幅した。ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇｒ）はＬｉｎｅａｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を鋳型としてＰＣＲを行い増幅させた。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ｐｙｒＧ－ｈｙｇｒ－Ｔｔｅｆ－３’ｐｙｒＧからなるｐｙｒＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。

次に、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のプロトプラストをサイトロギアの文献（ＣＹＴＯＬＯＧＩＡ，８２（３）：３１７－３２０，ＪＵＮ ２０１７、該文献の全記載はここに開示として援用される）に記載の方法に従い調製した。そして、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）により、５’ｐｙｒＧ－ｈｙｇｒ－Ｔｔｅｆ－３’ｐｙｒＧを導入することでｐｙｒＧ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｃｋ ｂｏｒｔｈ、１．２ Ｍ ソルビトール、２０ｍＭ ウラシル、２０ｍＭ ウリジン、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、２５℃で一晩培養した後、２ｍｇ／Ｌの５ＦＯＡ及び１００ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む再生用寒天培地（０．７％ Ａｇａｒ）５ｍＬをさらに重層して、３０℃で２～３週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のｐｙｒＧ破壊株を選抜した。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０破壊株の作製）
次に、ｋｕ７０破壊株を取得するべく、以下のようにしてｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｋｕ７０のＯＲＦ（配列番号４５）の上流約３ｋｂのＤＮＡ断片（５’ｋｕ７０）、ｋｕ７０のＯＲＦの２０７塩基目から下流約２．３ｋｂのＤＮＡ断片（３’ｋｕ７０）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための３’ｋｕ７０の下流約１ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ｋｕ７０－ＬＯ－ｐｙｒＧ－３’ｋｕ７０からなるｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでｋｕ７０破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ ソルビトール、０．１％ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約５日間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のｋｕ７０破壊株を選抜した。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株の作製）
取得したｋｕ７０破壊株の分生子を回収し、５×１０^５～１×１０^６個の分生子１ｍｇ／Ｌの５ＦＯＡを含む寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｃｋ ｂｏｒｔｈ、２０ｍＭ ウラシル、２０ｍＭ ウリジン、１．５％ Ａｇａｒ）上にスプレッドすることでｐｙｒＧマーカーのリサイクリングを行い、ｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株を取得した。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の作製及びアスコフラノン生産性の解析）
次に、ａｓｃＧ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＧのＯＲＦの４００塩基目から上流約２ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＧ）、ａｓｃＧのＯＲＦの下流約２．５ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＧ）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための５’ａｓｃＧの上流約０．９ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ２）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＧ－ｐｙｒＧ－ＬＯ２－３’ａｓｃＧからなるａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＧ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ ソルビトール、０．１％ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＧ破壊株を選抜した。

アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＧ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。結果を図１３に示す。

図１３で示すとおり、ａｓｃＧ破壊株ではアスコクロリンのピークが消え、アスコフラノンのみを生産することがわかった。また、菌体あたりのアスコフラノンの生産量は野生株より高いことがわかった。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃI破壊株の作製及びアスコクロリン生産性の解析）
次に、ａｓｃＩ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＩのＯＲＦの上流約２ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＩ）、ａｓｃＩのＯＲＦの９０５塩基目から下流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＩ）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＩ－ｐｙｒＧ－３’ａｓｃＩからなるａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＩ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ ソルビトール、０．１％ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＩ破壊株を選抜した。

アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＩ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、ａｓｃＩ破壊株ではアスコフラノンのピークが消え、アスコクロリンのみを生産することがわかった。また、菌体あたりのアスコクロリンの生産量は野生株より高いことがわかった。

（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＦ破壊株の作製及びイリシコリンＡ生産性の解析）
次に、ａｓｃＦ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＦのＯＲＦの上流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＦ）、ａｓｃＦのＯＲＦの下流約２ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＦ）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための３’ａｓｃＦの下流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ３）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＦ－ＬＯ３－ｐｙｒＧ－３’ａｓｃＦからなるａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＦ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ ソルビトール、０．１％ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＦ破壊株を選抜した。

アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＦ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、ａｓｃＦ破壊株ではイリシコリンＡが大量に蓄積されることが確認できた。

（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＣの機能解析）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の配列番号１１～１４のＡｓｃＢ～ＡｓｃＥのアミノ酸配列を基に、Ｂｌａｓｔ検索した結果、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）においても配列番号４７～５０のＡｓｃＢ～ＡｓｃＥホモログ（配列同一性はそれぞれ４７％、５３％、５２％、６６％）を有しており、さらにこれらをコードするａｓｃＢ～ＡｓｃＥ遺伝子はゲノム上で隣接していることがわかった。このことから、配列番号４７～５０もまたイリシコリンＡの生合成酵素であることが予測された。そこで、ＮＩＴＥより購入したトリコデルマ・リーゼイＮＢＲＣ３１３２９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５１及び５２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、配列番号５３のａｓｃＣ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＣ）をクローニングした。なお、配列番号５３のＴｒ－ａｓｃＣ遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号４８のＡｓｃＣタンパク質をコードしていると考えられた。

クローニングしたＴｒ－ａｓｃＣを上記と同様にして連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、上記で作製したアクレモニウム由来のａｓｃＤ遺伝子及びａｓｃＢ遺伝子が挿入されたＡｓ－ＤＢ株のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のａｓｃＤ及びａｓｃＢ、さらにトリコデルマ由来のａｓｃＣを含む発現カセットのそれぞれを１コピーずつ導入したＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株を取得した。

次に、ＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。

回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株では、Ａｓ－ＤＢＣ株のｍ／ｚ値のＬ－Ｚ１２７２βに相当する３５５のピークと同じ溶出位置に、新たなピークが検出された。このことから、予測どおり配列番号５３のＴｒ－ａｓｃＣ遺伝子はアクレモニウム由来のａｓｃＣ遺伝子と同じ機能を有していることがわかり、よってトリコデルマ由来の配列番号４７～５０はイリシコリンＡの生合成酵素であると考えられた。さらに、ネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）由来の配列番号３５～４１のＡｓｃＢ～ＡｓｃＨも、アクレモニウム由来のＡｓｃＢ～ＡｓｃＨとの配列同一性はすべて６０％以上であり、かつ、それぞれのコード遺伝子はゲノム上で隣接していることから、該酵素群はアスコクロリン生合成酵素であると考えられた。

（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＤ及びＡｓｃＢの機能解析）
ＮＩＴＥより購入したトリコデルマ・リーゼイＮＢＲＣ３１３２９株のゲノムを鋳型とし、配列番号５５及び５６のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、配列番号５７のａｓｃＤ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＤ）をクローニングした。同様にして、配列番号５８及び５９のプライマーを用いて、配列番号６０のａｓｃＢ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＢ）をクローニングした。配列番号５７のＴｒ－ａｓｃＤ遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号４９のＡｓｃＤタンパク質をコードしていると考えられた。

クローニングしたＴｒ－ａｓｃＤ及びＴｒ－ａｓｃＢを上記と同様にして連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ及び５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、麹菌アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、トリコデルマ由来のａｓｃＤを含む発現カセットを１コピーずつ導入したＡｓ－Ｔｒ－Ｄ株を取得した。さらに、Ａｓ－Ｔｒ－Ｄ株のｐｙｒＧをリサイクリングした株に対し、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、トリコデルマ由来のａｓｃＤ及びａｓｃＢを含む発現カセットをそれぞれ１コピーずつ導入したＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株を取得した。

次に、ＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株（トリコデルマ由来ａｓｃＤ及びａｓｃＢ遺伝子挿入株）及びＡｓ－ＤＢ株（アクレモニウム由来ａｓｃＤ及びａｓｃＢ遺伝子挿入株）を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。

回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株及びＡｓ－ＤＢ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析を行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液８０～９５％（１５ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ ３μｍ カラム（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析した。図１４の結果が示すとおり、Ａｓ－ＤＢ株と同様にＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株においても、親株では見られないピークが同じ溶出位置に検出された。このことから、予測どおりに配列番号５７及び６０のＴｒ－ａｓｃＤ遺伝子及びＴｒ－ａｓｃＢ遺伝子はアクレモニウム由来のａｓｃＤ遺伝子及びａｓｃＢ遺伝子と同じ機能を有していることがわかった。

（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＥの機能解析）
配列番号５０のＡｓｃＥをコードし、麹菌用にコドン改変した人工合成遺伝子（配列番号６１）を、上記と同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、上記で作製したＡｓ－ＤＢＣ株（アクレモニウム由来ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣの発現カセットを１コピーずつ挿入した株）のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、さらにトリコデルマ由来のａｓｃＥを含む発現カセットをそれぞれ１コピーずつ挿入したＡｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株を取得した。

次に、５％ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地にＡｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株及びＡｓ－ＤＢＣ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を上記と同様に回収し、アセトン抽出を行い、該アセトン抽出物のＨＰＬＣ解析を行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液８０～９５％（１５ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ ３μｍ カラム（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析した。図１５の結果が示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株では、イリシコリンＡ標準品と同じ溶出位置にＡｓ－ＤＢＣ株では確認されない新たなピークが検出された。このことから、トリコデルマ由来ＡｓｃＥもアクレモニウム由来ＡｓｃＥと同様に、ＬＬ－Ｚ１２７２βを基質とするハロゲナーゼであることがわかった。以上より、配列番号４７～５０のトリコデルマ由来ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ及びＡｓｃＥはイリシコリンＡ生合成酵素であることがわかった。

（アスコフラノン生合成経路の解析）
アスコフラノン生合成経路はイリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫの順に反応することでアスコフラノンが生合成されると予測されたが、ＡｓｃＩの生成産物及びＡｓｃＪの生成産物が未同定であった。そこで、上記で作製したａｓｃＧ破壊株のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株を親株としてａｓｃＧ破壊株／ａｓｃＪ破壊株を作製したところ、ａｓｃＧ破壊株では見られなかった新たなピークが検出された。このＡｓｃＩ生成産物であると考えられる化合物を精製し、ＮＭＲ解析を行ったところ、図１６に示す構造を有する新規な化合物（ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド）であることがわかった。また、このＡｓｃＩ生成産物に対し、ＡｓｃＪを反応させたところ、アスコフラノールが生成することがわかった。さらに、ＡｓｃＩ生成産物に対し、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫを反応させたところ、アスコフラノンが生成することがわかった。以上より、イリシコリンＡエポキシド以降のアスコフラノン生合成経路は図１６で示すとおりであることがわかった。

（ＡｓｃＩの強制発現によるアスコフラノンの高生産化）
前述のとおり、ａｓｃＧ破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、野生株よりもアスコフラノンの生産性が向上した。しかしながら、図１３で示したとおり、ａｓｃＧ破壊株では、溶出時間３８．５分あたりに蓄積している化合物があり、この化合物はイリシコリンＡエポキシドであることがわかった。つまり、ａｓｃＧ破壊株ではＡｓｃＩの反応が律速になっているためにイリシコリンＡエポキシドが蓄積していると予測された。そこで、ａｓｃＧ破壊株において、配列番号８のａｓｃＩ遺伝子を配列番号６２のアクレモニウム由来のｔｅｆ１プロモーター及び配列番号６３のアクレモニウム由来のｔｅｆ１ターミネーターを用いて高発現させた株（ΔａｓｃＧ－Ｉ株）を作製し、アスコフラノン高生産培地中で、２８℃、４日間、Ｂｉｏｔｔ社製の１００ｍｌ培養装置（Ｂｉｏ Ｊｒ．８）を用いて４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍの条件で培養した。

次いで培養後の１０ｍＬ培養液あたりの菌体を回収し、アセトン抽出後、ＨＰＬＣを行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ ３μｍ カラム（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析を行った。図１７の結果が示すとおり、ΔａｓｃＧ－Ｉ株ではａｓｃＧ破壊株（ΔａｓｃＧ）と比べて、イリシコリンＡエポキシドの蓄積量が減少し、アスコフラノンの生産量が大きく向上することがわかった。

（ネオネクトリア由来Ａｓｃホモログの機能解析）
ｂｌａｓｔｐ検索の結果、Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａは、配列番号１１～１７のアクレモニウム由来のＡｓｃＢ～Ｈと６０％以上の配列同一性を有するＡｓｃＢ～Ｈのホモログ（配列番号３５～４１）をコードする遺伝子をゲノム上に有していることがわかった。また、公開されているデータベース上の遺伝子配列は完全にアセンブルされている状態ではないが、少なくともＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ及びＡｓｃＦをコードしている４つの遺伝子は隣接して存在しており、さらに、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨをコードしている２つの遺伝子も隣接して存在していることから、クラスターを形成していることが考えられた。加えて、ｔｂｌａｓｔｎによる検索の結果、ＡｓｃＨをコードしている遺伝子の約０．４ｋｂ上流にはアクレモニウム由来のａｓｃＡ遺伝子と５０％以上の配列同一性を有する遺伝子配列が存在していることがわかった。これらのことから、ネオネクトリア由来のＡｓｃＢ～Ｈのホモログ（配列番号３５～４１）はアスコクロリン生合成酵素であることが考えられた。

テルペン環化酵素としての機能を有するＡｓｃＧは、既知ドメインを持たず、アスコクロリン生合成における特徴的な酵素であることから、配列番号４０のＡｓｃＧの機能を解析することで、配列番号３５～４１がアスコクロリン生合成酵素であるかどうかを判断できると考えた。そこで、上記で取得したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株において、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧを発現させることにより、アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＧの機能を相補できるかどうかを検証することにした。

まず、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の分生子を回収し、約１０^６個の分生子を５ＦＯＡ含有の寒天培地上で生育させることで、ｐｙｒＧマーカーのリサイクリングを行った。なお、ｐｙｒＧマーカーが除去されるときに、設計上ａｓｃＨ遺伝子も同時に破壊されるため、マーカーリサイクリング後の株はａｓｃＧ及びａｓｃＨの２重遺伝子破壊株（ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ株）となっている。この株に対し、ｐｙｒＧマーカーを用いて、配列番号６２のアクレモニウム由来のｔｅｆ１プロモーター及び配列番号６３のアクレモニウム由来のｔｅｆ１ターミネーターから構成される、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧの高発現カセットを導入した。なお、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧをコードする遺伝子配列Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子（配列番号６４）は人工遺伝子合成により取得した。

ａｓｃＧ及びａｓｃＨの２重遺伝子破壊株に対してＮｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させた株（ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ＋Ｎｄ－ａｓｃＧ株）を、上記と同様にしてアスコフラノン高生産培地で培養し、培養後の菌体のアセトン抽出液についてＨＰＬＣ解析を行った。図１８の結果が示すとおり、Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させた株では、アスコフラノンやイリシコリンＡエポキシドの生産量が低下し、Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させていない株では検出されなかった新たな化合物のピークが検出された。また、この化合物は上記のｉｎ ｖｉｔｒｏのＡｓ－ＦＧ反応液で特異的に確認されたｍ／ｚ値４０５の化合物（イリシコリンＣ）と同じ溶出位置で検出され、さらに質量分析（ＭＳ）の結果、この化合物のｍ／ｚ値は４０５であることがわかった。よって、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧは、アクレモニウム由来のＡｓｃＧと同様の機能を持つことが示された。

以上より、配列番号３５～４１のネオネクトリア由来のＡｓｃＢ～Ｈホモログはアスコクロリン生合成酵素であることがわかった。

なお、ネオネクトリア由来のＡｓｃＨホモログをコードしている遺伝子の約６ｋｂ上流にはアクレモニウム由来のＡｓｃＩ（配列番号１８）と５３％の配列同一性を有するＡｓｃＩホモログ（配列番号６７）であるＮｄ－ＡｓｃＩをコードする遺伝子が存在していることがわかった。このことはＮｅｏｎｅｃｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａにおいて、Ｎｄ－ＡｓｃＩをコードする遺伝子がＮｄ－ＡｓｃＡ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ及びＮｄ－ＡｓｃＨをコードする遺伝子とクラスターを形成していることを示唆しており、Ｎｄ－ＡｓｃＩはアスコクロリンやアスコクロリン中間体と関連のある化合物の生合成酵素である可能性が高い。つまり、配列番号６７のネオネクトリア由来ＡｓｃＩホモログはアクレモニウム由来ＡｓｃＩと同様の機能を持つことが考えられた。ただし、アクレモニウム由来のＡｓｃＪ（配列番号１９）及びＡｓｃＫ（配列番号２０）のホモログをコードする遺伝子は、Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａにおいて、Ｎｄ－ＡｓｃＩ、Ｎｄ－ＡｓｃＡ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ及びＮｄ－ＡｓｃＨをコードする遺伝子のクラスター領域付近には存在していなかった。

トリコデルマ由来、ネオネクトリア由来のＡｓｃホモログの結果を考慮すると、アクレモニウム由来Ａｓｃ酵素と同一性が高く、同じドメインを有しており、且つ、それらがゲノム上の近傍に位置し、クラスターを形成しているような場合は、アクレモニウム由来Ａｓｃ酵素と同様の機能を持つ可能性が高いことを示していると言える。

（ＡｓｃＡ強制発現ベクターの作製）
表１のクラスターに存在する転写因子をコードする遺伝子ａｓｃＡがアスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子の発現を制御しているのかを以下のとおりに検証した。

ＲＮＡシーケンスの結果より、遺伝子ａｓｃＡはアスコフラノン高生産培地において高発現していたことから、アスコクロリン生合成遺伝子群やアスコフラノン生合成遺伝子群を正に制御するのではないかと考えた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムにおいて、遺伝子ａｓｃＡを強制発現させることでアスコクロリンやアスコフラノンの生産が誘導されるかどうかを調べるため、下記のようにしてＡｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。

まず、アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号６２のｔｅｆ１遺伝子プロモーター（Ｐｔｅｆ）、配列番号６５の遺伝子ａｓｃＡ、配列番号４４のｔｅｆ１遺伝子ターミネーター（Ｔｔｅｆ）、配列番号４６のｐｙｒＧ遺伝子をクローニングし、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ反応によりそれぞれを連結することで、Ｐｔｅｆ－ａｓｃＡ－Ｔｔｅｆ－ｐｙｒＧのａｓｃＡ強制発現カセットがｐＵＣ１９に挿入されたａｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。

なお、配列番号６５の遺伝子ａｓｃＡはイントロンを含んでいる塩基配列であるが、ＲＮＡシーケンスの結果、遺伝子ａｓｃＡにコードされているＡｓｃＡタンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列からなることがわかった。

（ＡｓｃＡ強制発現株におけるアスコクロリン生産性及びアスコフラノン生産性の評価）
上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株に対し、ＡｓｃＡ強制発現ベクターを導入することでＡｓｃＡ強制発現株を作製した。

アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ－１３９２株（野生株）と、作製したＡｓｃＡ強制発現株とを、それぞれＧＰＹ液体培地中で４日間、３０℃で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。結果を図１９に示す。

図１９に示すとおり、野生株はＧＰＹ培地中ではアスコクロリン及びアスコフラノンを全く生産しなかった。それに対して、ＡｓｃＡ強制発現株ではアスコクロリン及びアスコフラノンの両方の生産が確認された。

これまで、野生株では限られた培地でしかアスコクロリン及びアスコフラノンが生産されず、僅かな培養条件の違いで生産量が大きく異なることが課題であった。しかし、ＡｓｃＡ強制発現株を使用すれば、所定の培養条件に設定せずとも、アスコクロリン及びアスコフラノンの生産が可能となり、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡといったイソプレノイドの安定的な工業生産が実現でき、産業上非常に有用である。

配列表に記載の配列は、以下のとおりである：
［配列番号１］ａｓｃＢ
［配列番号２］ａｓｃＣ
［配列番号３］ａｓｃＤ
［配列番号４］ａｓｃＥ
［配列番号５］ａｓｃＦ
［配列番号６］ａｓｃＧ
［配列番号７］ａｓｃＨ
［配列番号８］ａｓｃＩ
［配列番号９］ａｓｃＪ
［配列番号１０］ａｓｃＫ
［配列番号１１］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号１２］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号１３］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号１４］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号１５］ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号１６］ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号１７］ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号１８］ＡｓｃＩタンパク質
［配列番号１９］ＡｓｃＪタンパク質
［配列番号２０］ＡｓｃＫタンパク質
［配列番号２１］コドン改変ａｓｃＢ
［配列番号２２］コドン改変ａｓｃＣ
［配列番号２３］コドン改変ａｓｃＤ
［配列番号２４］コドン改変ａｓｃＥ
［配列番号２５］Ｐｔｅｆ
［配列番号２６］Ｔａｌｐ
［配列番号２７］ｐｙｒＧ
［配列番号２８］コドン改変ａｓｃＦ
［配列番号２９］コドン改変ａｓｃＧ
［配列番号３０］コドン改変ａｓｃＨ
［配列番号３１］Ｐｔｅｆ－Ｆｗ
［配列番号３２］Ｐｔｅｆ－Ｒｖ
［配列番号３３］ａｓｃＤ－Ｆｗ
［配列番号３４］ａｓｃＤ－Ｒｖ
［配列番号３５］Ｎｄ－ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号３６］Ｎｄ－ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号３７］Ｎｄ－ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号３８］Ｎｄ－ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号３９］Ｎｄ－ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号４０］Ｎｄ－ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号４１］Ｎｄ－ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号４２］Ａ．ｓｏｊａｅ由来エポキシドヒドロラーゼ遺伝子
［配列番号４３］Ａ．ｓｏｊａｅ由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子
［配列番号４４］Ｔｔｅｆ
［配列番号４５］ｋｕ７０
［配列番号４６］ｐｙｒＧ
［配列番号４７］Ｔｒ－ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号４８］Ｔｒ－ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号４９］Ｔｒ－ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号５０］Ｔｒ－ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号５１］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｆｗ
［配列番号５２］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｒｖ
［配列番号５３］Ｔｒ－ａｓｃＣ
［配列番号５４］ｐｙｒＧ３
［配列番号５５］Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｆｗ
［配列番号５６］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｒｖ
［配列番号５７］Ｔｒ－ａｓｃＤ
［配列番号５８］Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｆｗ
［配列番号５９］Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｒｖ
［配列番号６０］Ｔｒ－ａｓｃＢ
［配列番号６１］コドン改変Ｔｒ－ａｓｃＥ
［配列番号６２］アクレモニウム由来Ｐｔｅｆ
［配列番号６３］アクレモニウム由来Ｔｔｅｆ
［配列番号６４］Ｎｄ－ａｓｃＧ
［配列番号６５］ａｓｃＡ
［配列番号６６］ＡｓｃＡタンパク質
［配列番号６７］Ｎｄ－ＡｓｃＩタンパク質

本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを工業的規模で製造するために利用可能である。

Claims (2)

1. 遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物に由来する、遺伝子ａｓｃＧのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
2. 請求項１に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを生産する工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
   
   

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