JPWO2018207928A1 - イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascI。
(1)配列表の配列番号8に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号8に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号18又は67に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号18又は67に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[2]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドからアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascJ。
(1)配列表の配列番号9に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号9に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドからAscIタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号19に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号19に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[3]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascK。
(1)配列表の配列番号10に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号10に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号20に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号20に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[4]上記[1]〜[3]に記載の遺伝子ascI、ascJ及びascKのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体(ただし、ヒトを除く)。
[5]さらに遺伝子ascF、ascE、ascD、ascB及びascCのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、上記[4]に記載の形質転換体。
[6]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascGを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascGのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
(1)配列表の配列番号6に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号6に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[7]上記[6]に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。上記[6]に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体の製造方法。
[8]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascFを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascFのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
(1)配列表の配列番号5に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号5に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[9]上記[8]に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンAを得る工程を含む、イリシコリンAの製造方法。上記[8]に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンA類縁体、イリシコリンA前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、イリシコリンA類縁体、イリシコリンA前駆体及びその類縁体の製造方法。
[10]上記[1]に記載の遺伝子ascIを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascIのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
[11]上記[10]に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。上記[10]に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体の製造方法。
[12]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascF。
(1)配列表の配列番号5に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号5に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[13]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascG。
(1)配列表の配列番号6に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号6に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[14]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAからAscFタンパク質及びAscGタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascH。
(1)配列表の配列番号7に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号7に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAからAscFタンパク質及びAscGタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号17又は41に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号17又は41に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[15]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、LL−Z1272βからイリシコリンAを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascE。
(1)配列表の配列番号4に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号4に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)LL−Z1272βからイリシコリンAを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号14又は38に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号14又は38に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[16]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、アセチルCoAからO−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascD。
(1)配列表の配列番号3に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号3に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)アセチルCoAからO−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号13又は37に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号13又は37に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[17]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、O−オルセリン酸からイリシコリン酸Bを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascB。
(1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)O−オルセリン酸からイリシコリン酸Bを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号11又は35に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号11又は35に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[18]下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリン酸BからLL−Z1272βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascC。
(1)配列表の配列番号2に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号2に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリン酸BからLL−Z1272βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号12又は36に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号12又は36に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
[19][12]〜[18]に記載の遺伝子ascF、ascG、ascH、ascE、ascD、ascB及びascCのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体(ただし、ヒトを除く)。
[20][19]に記載の形質転換体を用いて、イリシコリンAを得る工程を含む、イリシコリンAの製造方法。
[21][19]に記載の形質転換体を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
[22][19]に記載の形質転換体を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。
[23]下記(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、[1]〜[3]及び[12]〜[18]のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有する、AscAタンパク質。
(a)配列表の配列番号66に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号66に記載のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
(c)配列表の配列番号66に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
[24]下記(A)〜(D)のいずれかの塩基配列であって、[1]〜[3]及び[12]〜[18]のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascA。
(A)[23]に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(B)配列表の配列番号65に記載の塩基配列
(C)配列表の配列番号65に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(D)配列表の配列番号65に記載の塩基配列からなる遺伝子と80%以上の配列同一性を有する塩基配列
[25][1]〜[3]及び[12]〜[18]のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、[23]に記載のAscAタンパク質又は[24]に記載の遺伝子ascAの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法。
[26]イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンAからなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、[25]に記載の方法。
[27][24]に記載の遺伝子ascAの発現が増強するように形質転換された形質転換体(ただし、ヒトを除く)。
[28]前記形質転換体は、宿主生物がアクレモニウム(Acremonium)属微生物である、[27]に記載の形質転換体。
[29][1]〜[3]及び[12]〜[18]のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、[23]に記載のAscAタンパク質又は[24]に記載の遺伝子ascAの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
[30][27]〜[28]のいずれか1項に記載の形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
[31]イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンAからなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、[29]又は[30]に記載の方法。
本明細書における「イソプレノイド」は、通常知られているとおりのイソプレンを構成単位とする化合物であれば特に限定されず、例えば、イリシコリン酸B(グリフォリン酸)、イリシコリン酸A、イリシコリンB(LL−Z1272β)、イリシコリンA(LL−Z1272α)、イリシコリンAエポキシド、イリシコリンC、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンAエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ただし、本明細書では、主として、アスコフラノン、イリシコリンA及びアスコクロリン並びにこれらの誘導体のことを「イソプレノイド」とよぶ場合がある。また、イリシコリンAエポキシド、イリシコリンCを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリンAエポキシド、ヒドロキシイリシコリンAエポキシド、アスコフラノールを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリン酸B、イリシコリン酸A、イリシコリンBを「イリシコリンA前駆体」とよぶ場合がある。
本発明の一態様の遺伝子ascBは、o−オルセリン酸からイリシコリン酸Bを生成する反応を触媒する活性を有する酵素(以下、「酵素(1)」ともよぶ。)のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
遺伝子ascB、ascC、ascD、ascE、ascF、ascG、ascH、ascI、ascJascK及びascA(以下、これらを総称して「酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子」とよぶ場合がある。)は、上記した酵素活性を有する酵素(1)乃至(11)が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子が生物体内で発現することにより酵素(1)乃至(11)が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が本来の機能や活性、特に酵素活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が生産されることを包含する。
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子は、例えば、イリシコリンA、アスコフラノン、アスコクロリンなどのイソプレノイドの生産能がある生物種や酵素(1)乃至(11)の発現が見られる生物種などに由来する。酵素(1)乃至(11)の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられる。微生物の中でも糸状菌はアスコクロリン生産能又はアスコフラノン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。アスコクロリンやアスコクロリン類縁体の生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ネオネクトリア属糸状菌、フザリウム属(Fusarium)糸状菌、シリンドロカルポン属(Cylindrocarpon)糸状菌、バーティシリウム属(Verticillium)糸状菌、ネクトリア属(Nectria)糸状菌、シリンドロクラジウム属(Cylindrocladium)糸状菌、コレトトリカム属(Colletotrichum)糸状菌、セファロスポリウム属(Cephalosporium)糸状菌、ニグロサブラム属(Nigrosabulum)糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナム(Verticillium hemipterigenum)、コレトトリカム・ニコチアナエ(Colletotrichum nicotianae)などが挙げられる。アスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ペシロマイセス属(Paecilomyces)糸状菌、バーティシリウム属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイ、ペシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。また、イリシコリンA生産能を有する糸状菌の具体例としては、トリコデルマ属糸状菌が挙げられ、より具体的にはトリコデルマ・リーゼイが挙げられる。なお、上記のアスコクロリン生産能を有する糸状菌及びアスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例は、イリシコリンA生産能を有する糸状菌の具体例であり得る。
酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を含む組換えベクター(組換え体DNA)が導入された形質転換体を作製できる。酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子の取得方法や、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子の塩基配列、酵素(1)乃至(11)のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を含む組換えベクター(組換え体DNA)は、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子のいずれかを含むPCR増幅産物と各種ベクターとを、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子のいずれかを含むDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むDNA断片と、インバースPCRにより増幅したプラスミド由来のDNA断片とを、In−Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社製)などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したDNAコンストラクトを作製し、次いで酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を含むDNAコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子−ターミネーターからなるDNA断片及び該DNA断片を含む組換えベクターをDNAコンストラクトと総称してよぶ。
「ノックアウト」とは、遺伝子の一部若しくは全部を欠損させること、変異導入若しくは遺伝子に任意の配列を挿入させること、その遺伝子の発現に必要なプロモーターを欠損させることなどにより、その遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を失わせることを意味する。厳密にいえばその遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を完全には失っていない、つまり、その遺伝子がコードするタンパク質が機能発現している可能性があっても、その機能発現を大部分失っている限り、本明細書でいう「ノックアウト」に含み得る。なお、本明細書中で「ノックアウト生物」のことを、「破壊株」や「欠損株」などとよぶ場合がある。
宿主生物としては、酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を含むDNAコンストラクト又は酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子を含むDNAコンストラクトによる形質転換により、酵素(1)乃至(11)を生産することやイソプレノイドを生産することができる生物であれば特に限定されず、例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、ネオネクトリア属微生物、フザリウム属微生物、エシェリキア(Escherichia)属微生物、サッカロマイセス(Saccharomyces)属微生物、ピキア(Pichia)属微生物、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属微生物、ジゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属微生物、トリコデルマ(Trichoderuma)属微生物、ペニシリウム(Penicillium)属微生物、クモノスカビ(Rhizopus)属微生物、アカパンカビ(Neurospora)属微生物、ムコール(Mucor)属微生物、ネオサルトリア(Neosartorya)属微生物、ビッソクラミス(Byssochlamys)属微生物、タラロミセス(Talaromyces)属微生物、アジェロミセス(Ajellomyces)属微生物、パラコッシディオイデス(Paracoccidioides)属微生物、アンシノカルプス(Uncinocarpus)属微生物、コッシディオイデス(Coccidioides)属微生物、アルフロデルマ(Arthroderma)属微生物、トリコフィトン(Trichophyton)属微生物、エクソフィラ(Exophiala)属微生物、カプロニア(Capronia)属微生物、クラドフィアロフォラ(Cladophialophora)属微生物、マクロホミナ(Macrophomina)属微生物、レプトスファエリア(Leptosphaeria)属微生物、ビポラリス(Bipolaris)属微生物、ドチストローマ(Dothistroma)属微生物、ピレノフォラ(Pyrenophora)属微生物、ネオフシコッカム(Neofusicoccum)属微生物、セトスファエリア(Setosphaeria)属微生物、バウドイニア(Baudoinia)属微生物、ガエウマノミセス(Gaeumannomyces)属微生物、マルッソニナ(Marssonina)属微生物、スファエルリナ(Sphaerulina)属微生物、スクレロチニア(Sclerotinia)属微生物、マグナポルセ(Magnaporthe)属微生物、ヴェルチシリウム(Verticillium)属微生物、シュードセルコスポラ(Pseudocercospora)属微生物、コレトトリカム(Colletotrichum)属微生物、オフィオストーマ(Ophiostoma)属微生物、メタルヒジウム(Metarhizium)属微生物、スポロスリックス(Sporothrix)属微生物、ソルダリア(Sordaria)属微生物、アラビドプシス(Arabidopsis)属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。イリシコリンA、アスコクロリン、アスコフラノンなどのイソプレノイドの生産能が認められる糸状菌や酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子をゲノムDNA上に有する糸状菌であってもよい。
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の酵素(1)乃至(11)をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号1〜10及び65に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ascB、ascC、ascD、ascE、ascF、ascG、ascH、ascI、ascJ、ascK及びascAが挙げられる。なお、AscB、AscC、AscD、AscE、AscF、AscG、AscH、AscI、AscJ、AscK及びAscAタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号11〜20及び66として示す。
形質転換体の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ascA、ascB、ascC、ascD、ascE、ascF、ascG、ascH、ascI、ascJ及びascKのいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体(以下、「形質転換体(1)」ともよぶ。)である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現したAscA、AscB、AscC、AscD、AscE、AscF、AscG、AscH、AscI、AscJ及び/又はAscKの作用によって宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンA、アスコクロリン又はアスコフラノンを検出可能の量又はそれ以上の量で生産することができる。
ノックアウト生物の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンとアスコフラノンの両方を産生するような、遺伝子ascB、ascC、ascD、ascE、ascF、ascG及びascIを有する野生型生物から、遺伝子ascGをノックアウトして得られる、ノックアウト生物(以下、「ノックアウト生物(1)」ともよぶ。)である。このようなノックアウト生物は、アスコクロリンの生合成に関与する酵素であるAscGタンパク質を発現しないので、アスコクロリンに代えてアスコフラノン又はアスコフラノン前駆体のみを生産することができ、例えば、野生型生物に比べて、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体を大量に生産する可能性がある。
本発明の一態様の製造方法は、形質転換体(1)又は形質転換体(2)を宿主細胞に適した条件で培養することにより、イリシコリンA、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンA、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。
本発明の一態様の方法は、ascB〜ascKのいずれか1つ以上の遺伝子、あるいは、アスコクロリン生合成遺伝子及び/又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、AscAタンパク質又は遺伝子ascAの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法である。本発明の別の一態様の方法は、アスコクロリン生合成遺伝子及び/又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、AscAタンパク質又は遺伝子ascAの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。本発明の別の一態様の方法は、遺伝子ascAの発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。
本発明の一態様の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法を利用して得られたアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンAなどのイソプレノイドは、抗原虫活性、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用など種々の生理活性を有することが期待できる機能性生体物質であるとともに、その特徴を活かして、医薬品、医薬部外品などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
アスコフラノン産生菌であるアクレモニウム・スクレロティゲナム(Acremonium sclerotigenum F−1392株;J.Antibiot.70:304−307(2016)、該文献の全記載はここに開示として援用される)を用いて、アスコフラノンの産生量が400倍以上異なる2つの培養サンプルを取得した。
麹菌アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae NRRC4239株)のpyrG破壊株/ku70破壊株に、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号15〜18の遺伝子ascB、ascC、ascD及びascEのいずれかを含む発現カセットを導入した。
As−DBCE株と同様にして、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号22〜24の遺伝子ascF、ascG及びascHのいずれかを含む発現カセットを順次導入することで、AscF発現カセットを導入したAs−DBCEF株;AscF及びAscGの発現カセットを導入したAs−DBCEFG株;及び、AscF、AscG及びAscHの発現カセットを導入したAs−DBCEFGH株を作製した。これらの株を上記と同様にして培養し、HPLC解析を行った。
アスペルギルス・ソーヤ NRRC4239株のpyrG破壊株に対し、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号22〜24の遺伝子ascF、ascG及びascHの発現カセットのいずれかを導入したAs−F株、As−G株及びAs−H株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ptef−asc遺伝子−Talp−pyrG3をpUC19に挿入したプラスミドDNAを形質転換用DNAとして用いた。
(1)野生株反応液:野生株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(2)As−F反応液:As−F株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(3)As−FG反応液:As−F株の粗酵素液、As−G株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(4)As−FGH反応液:As−F株の粗酵素液、As−G株の粗酵素液、As−H株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
上記のin vitro解析により、As−F反応液ではm/z値423のピークが確認されたため、アスペルギルス・ソーヤ NRRC4239株で発現させたAscFの粗酵素液による反応生成物はジヒドロキシ化されたイリシコリンA(図6参照)であることが予測された。しかしながらホソノらの文献(J Antibiot (Tokyo). 2009 Oct;62(10):571−4. 、該文献の全記載はここに開示として援用される)によると、アクレモニウム属微生物において、イリシコリンAエポキシド(m/z値405)が蓄積していることが明らかとなっており、よって本来のAscF反応生成物はイリシコリンAエポキシドであると考えられた。つまり、アスペルギルス・ソーヤ NRRC4239株では、内在性のエポキシドヒドロラーゼによってイリシコリンAエポキシドが開環し、ジヒドロキシル化されたイリシコリンAが生成している可能性が考えられた。そこで、As−DBCEF株において、アスペルギルス・ソーヤ由来のエポキシドヒドロラーゼをコードすると予測される遺伝子のうち、最も発現量の高いエポキシドヒドロラーゼ遺伝子(配列番号42)を欠損させたAs−DBCEF−ΔEH株を作製した。As−DBCEF−ΔEH株を上記と同様に培養し、HPLC解析を行ったところ、As−DBCEF株では見られなかった新たなピークが確認された。また、MS解析により、該ピークはエポキシド化合物に相当するm/z値を有していることがわかった。よって、AscFはイリシコリンAのエポキシ化反応を触媒することがわかった。
図6に示すとおり、イリシコリンAエポキシドによりアスコフラノンが生合成されるためには、一原子酸素添加反応が必要であると想定し、この反応にはAscF以外の別のシトクロムP450モノオキシゲナーゼが関与していると予測した。そこで、上記のRNAシーケンス解析の結果を用いて、アスコフラノン高生産サンプルにおいて高発現しているP450遺伝子を探索した。その結果、アスコフラノン高生産サンプルにおいて、AscFの約6割の発現量を有し、かつ、低生産サンプルではほとんど発現していないP450遺伝子を新たに見出した。また、該P450遺伝子の隣接する2つの遺伝子も同様にアスコフラノン高生産サンプルでのみ高発現していることがわかり、これら3つの遺伝子がクラスターを形成していることが示唆された(図7を参照)。該P450遺伝子に隣接する2つの遺伝子のコードするタンパク質について、blast検索やPfamによるドメイン検索を行った結果、一方は機能未知のタンパク質であり、もう一方はデヒドロゲナーゼであることがわかった。
上記にようにして見出した3つの遺伝子、P450遺伝子(配列番号8)、機能未知遺伝子(配列番号9)及びデヒドロゲナーゼ遺伝子(配列番号10)を、それぞれascI、ascJ及びascKと名付けた。また、これらの遺伝子がそれぞれコードするAscIタンパク質(配列番号18)、AscJタンパク質(配列番号19)及びAscKタンパク質(配列番号20)がアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるかをin vitro解析で確認することにした。
(1)As−F反応液:As−F株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(2)As−FI反応液:As−F株の粗酵素液、As−I株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(3)As−FIJ反応液:As−F株の粗酵素液、As−I株の粗酵素液、As−J株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(4)As−FIK反応液:As−F株の粗酵素液、As−I株の粗酵素液、As−K株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(5)As−FJK反応液:As−F株の粗酵素液、As−J株の粗酵素液、As−K株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(6)As−IJK反応液:As−I株の粗酵素液、As−J株の粗酵素液、As−K株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
(7)As−FIJK反応液:As−F株の粗酵素液、As−G株の粗酵素液、As−H株の粗酵素液、イリシコリンAの標準品、1mM NADPH、1mM NADH、1mM ATP及び3mM MgCl2の混合液
上記と同様にして、配列番号8〜10の遺伝子ascI、ascJ、ascK及び配列番号43のA.sojae NBRC4239株由来P450レダクターゼ遺伝子をそれぞれ含む発現カセットを、pyrGマーカーリサイクリング後のAs−DBCEF株に順次導入することで、AscI及びP450レダクターゼの発現カセットを導入したAs−DBCEFIred株;AscI、AscJ、AscK及びP450レダクターゼの発現カセットを導入したAs−DBCEFIJKred株をそれぞれ作製した。これらの株を5%(w/v)NaClを添加したGPY培地で培養し、上記と同様にしてHPLC解析を行った。
以上の結果より、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成経路はイリシコリンAエポキシドまで共通の経路を辿っており、AscI及びAscGは同じ基質を競合していることがわかった。よって、ascGの破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、アスコクロリンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンAエポキシドもアスコフラノン生産に利用することができ、よってアスコフラノンの生産性が向上することが考えられた。一方、ascIの破壊株ではアスコクロリンのみを生産するようになり、アスコフラノンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンAエポキシドもアスコクロリン生産に利用することができ、よってアスコクロリンの生産性が向上することが考えられた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムのascG破壊株及びascI破壊株を作製し、上記仮説を検証することにした。
次に、ku70破壊株を取得するべく、以下のようにしてku70破壊株作製用DNA断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ku70のORF(配列番号45)の上流約3kbのDNA断片(5’ku70)、ku70のORFの207塩基目から下流約2.3kbのDNA断片(3’ku70)、pyrGマーカーをリサイクリングするための3’ku70の下流約1kbのDNA断片(LO)、pyrG遺伝子(配列番号46)を増幅した。次に、増幅させた各DNA断片をIn fusion反応により連結することで、5’ku70−LO−pyrG−3’ku70からなるku70破壊株作製用DNA断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のpyrG破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト−PEG法によりku70破壊株作製用DNA断片を導入することでku70破壊株を作製した。なお、PEG処理後のプロトプラストは再生用寒天培地(3.5% Czapek−Dox broth、1.2M ソルビトール、0.1% trace element、2% Agar)上に重層し、30℃で約5日間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーPCRにより目的のku70破壊株を選抜した。
取得したku70破壊株の分生子を回収し、5×105〜1×106個の分生子1mg/Lの5FOAを含む寒天培地(3.5% Czapeck borth、20mM ウラシル、20mM ウリジン、1.5% Agar)上にスプレッドすることでpyrGマーカーのリサイクリングを行い、ku70/pyrG二重破壊株を取得した。
次に、ascG破壊株を取得するべく、以下のようにしてascG破壊株作製用DNA断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ascGのORFの400塩基目から上流約2kbのDNA断片(5’ascG)、ascGのORFの下流約2.5kbのDNA断片(3’ascG)、pyrGマーカーをリサイクリングするための5’ascGの上流約0.9kbのDNA断片(LO2)、pyrG遺伝子(配列番号46)を増幅した。次に、増幅させた各DNA断片をIn fusion反応により連結することで、5’ascG−pyrG−LO2−3’ascGからなるascG破壊株作製用DNA断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のku70/pyrG二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト−PEG法によりascG破壊株作製用DNA断片を導入することでascG破壊株を作製した。なお、PEG処理後のプロトプラストは再生用寒天培地(3.5% Czapek−Dox broth、1.2M ソルビトール、0.1% trace element、2% Agar)上に重層し、30℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーPCRにより目的のascG破壊株を選抜した。
次に、ascI破壊株を取得するべく、以下のようにしてascI破壊株作製用DNA断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ascIのORFの上流約2kbのDNA断片(5’ascI)、ascIのORFの905塩基目から下流約1.5kbのDNA断片(3’ascI)、pyrG遺伝子(配列番号46)を増幅した。次に、増幅させた各DNA断片をIn fusion反応により連結することで、5’ascI−pyrG−3’ascIからなるascI破壊株作製用DNA断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のku70/pyrG二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト−PEG法によりascI破壊株作製用DNA断片を導入することでascI破壊株を作製した。なお、PEG処理後のプロトプラストは再生用寒天培地(3.5% Czapek−Dox broth、1.2M ソルビトール、0.1% trace element、2% Agar)上に重層し、30℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーPCRにより目的のascI破壊株を選抜した。
次に、ascF破壊株を取得するべく、以下のようにしてascF破壊株作製用DNA断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ascFのORFの上流約1.5kbのDNA断片(5’ascF)、ascFのORFの下流約2kbのDNA断片(3’ascF)、pyrGマーカーをリサイクリングするための3’ascFの下流約1.5kbのDNA断片(LO3)、pyrG遺伝子(配列番号46)を増幅した。次に、増幅させた各DNA断片をIn fusion反応により連結することで、5’ascF−LO3−pyrG−3’ascFからなるascF破壊株作製用DNA断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムF−1392株のku70/pyrG二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト−PEG法によりascF破壊株作製用DNA断片を導入することでascF破壊株を作製した。なお、PEG処理後のプロトプラストは再生用寒天培地(3.5% Czapek−Dox broth、1.2M ソルビトール、0.1% trace element、2% Agar)上に重層し、30℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーPCRにより目的のascF破壊株を選抜した。
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の配列番号11〜14のAscB〜AscEのアミノ酸配列を基に、Blast検索した結果、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)においても配列番号47〜50のAscB〜AscEホモログ(配列同一性はそれぞれ47%、53%、52%、66%)を有しており、さらにこれらをコードするascB〜AscE遺伝子はゲノム上で隣接していることがわかった。このことから、配列番号47〜50もまたイリシコリンAの生合成酵素であることが予測された。そこで、NITEより購入したトリコデルマ・リーゼイNBRC31329株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号51及び52のプライマーを用いてPCRを行うことで、配列番号53のascC遺伝子(Tr−ascC)をクローニングした。なお、配列番号53のTr−ascC遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号48のAscCタンパク質をコードしていると考えられた。
NITEより購入したトリコデルマ・リーゼイNBRC31329株のゲノムを鋳型とし、配列番号55及び56のプライマーを用いてPCRを行うことで、配列番号57のascD遺伝子(Tr−ascD)をクローニングした。同様にして、配列番号58及び59のプライマーを用いて、配列番号60のascB遺伝子(Tr−ascB)をクローニングした。配列番号57のTr−ascD遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号49のAscDタンパク質をコードしていると考えられた。
配列番号50のAscEをコードし、麹菌用にコドン改変した人工合成遺伝子(配列番号61)を、上記と同様にIn−Fusion反応により連結することで、5’arm−Ptef−Tr−ascE−Talp−pyrG−3’armの形質転換用DNAを調製した。次に、上記で作製したAs−DBC株(アクレモニウム由来ascD、ascB、ascCの発現カセットを1コピーずつ挿入した株)のpyrGマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用DNAの5’arm−Ptef−Tr−ascE−Talp−pyrG−3’armを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のascD、ascB、ascC、さらにトリコデルマ由来のascEを含む発現カセットをそれぞれ1コピーずつ挿入したAs−DBC−Tr−E株を取得した。
アスコフラノン生合成経路はイリシコリンAエポキシドからAscI、AscJ及びAscKの順に反応することでアスコフラノンが生合成されると予測されたが、AscIの生成産物及びAscJの生成産物が未同定であった。そこで、上記で作製したascG破壊株のpyrGマーカーをリサイクリングした株を親株としてascG破壊株/ascJ破壊株を作製したところ、ascG破壊株では見られなかった新たなピークが検出された。このAscI生成産物であると考えられる化合物を精製し、NMR解析を行ったところ、図16に示す構造を有する新規な化合物(ヒドロキシイリシコリンAエポキシド)であることがわかった。また、このAscI生成産物に対し、AscJを反応させたところ、アスコフラノールが生成することがわかった。さらに、AscI生成産物に対し、AscJ及びAscKを反応させたところ、アスコフラノンが生成することがわかった。以上より、イリシコリンAエポキシド以降のアスコフラノン生合成経路は図16で示すとおりであることがわかった。
前述のとおり、ascG破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、野生株よりもアスコフラノンの生産性が向上した。しかしながら、図13で示したとおり、ascG破壊株では、溶出時間38.5分あたりに蓄積している化合物があり、この化合物はイリシコリンAエポキシドであることがわかった。つまり、ascG破壊株ではAscIの反応が律速になっているためにイリシコリンAエポキシドが蓄積していると予測された。そこで、ascG破壊株において、配列番号8のascI遺伝子を配列番号62のアクレモニウム由来のtef1プロモーター及び配列番号63のアクレモニウム由来のtef1ターミネーターを用いて高発現させた株(ΔascG−I株)を作製し、アスコフラノン高生産培地中で、28℃、4日間、Biott社製の100ml培養装置(Bio Jr.8)を用いて400rpm、0.5vvmの条件で培養した。
blastp検索の結果、Neonectria ditissimaは、配列番号11〜17のアクレモニウム由来のAscB〜Hと60%以上の配列同一性を有するAscB〜Hのホモログ(配列番号35〜41)をコードする遺伝子をゲノム上に有していることがわかった。また、公開されているデータベース上の遺伝子配列は完全にアセンブルされている状態ではないが、少なくともAscB、AscC、AscE及びAscFをコードしている4つの遺伝子は隣接して存在しており、さらに、AscG及びAscHをコードしている2つの遺伝子も隣接して存在していることから、クラスターを形成していることが考えられた。加えて、tblastnによる検索の結果、AscHをコードしている遺伝子の約0.4kb上流にはアクレモニウム由来のascA遺伝子と50%以上の配列同一性を有する遺伝子配列が存在していることがわかった。これらのことから、ネオネクトリア由来のAscB〜Hのホモログ(配列番号35〜41)はアスコクロリン生合成酵素であることが考えられた。
表1のクラスターに存在する転写因子をコードする遺伝子ascAがアスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子の発現を制御しているのかを以下のとおりに検証した。
上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナム F−1392株のpyrG破壊株に対し、AscA強制発現ベクターを導入することでAscA強制発現株を作製した。
[配列番号1]ascB
[配列番号2]ascC
[配列番号3]ascD
[配列番号4]ascE
[配列番号5]ascF
[配列番号6]ascG
[配列番号7]ascH
[配列番号8]ascI
[配列番号9]ascJ
[配列番号10]ascK
[配列番号11]AscBタンパク質
[配列番号12]AscCタンパク質
[配列番号13]AscDタンパク質
[配列番号14]AscEタンパク質
[配列番号15]AscFタンパク質
[配列番号16]AscGタンパク質
[配列番号17]AscHタンパク質
[配列番号18]AscIタンパク質
[配列番号19]AscJタンパク質
[配列番号20]AscKタンパク質
[配列番号21]コドン改変ascB
[配列番号22]コドン改変ascC
[配列番号23]コドン改変ascD
[配列番号24]コドン改変ascE
[配列番号25]Ptef
[配列番号26]Talp
[配列番号27]pyrG
[配列番号28]コドン改変ascF
[配列番号29]コドン改変ascG
[配列番号30]コドン改変ascH
[配列番号31]Ptef−Fw
[配列番号32]Ptef−Rv
[配列番号33]ascD−Fw
[配列番号34]ascD−Rv
[配列番号35]Nd−AscBタンパク質
[配列番号36]Nd−AscCタンパク質
[配列番号37]Nd−AscDタンパク質
[配列番号38]Nd−AscEタンパク質
[配列番号39]Nd−AscFタンパク質
[配列番号40]Nd−AscGタンパク質
[配列番号41]Nd−AscHタンパク質
[配列番号42]A.sojae由来エポキシドヒドロラーゼ遺伝子
[配列番号43]A.sojae由来P450レダクターゼ遺伝子
[配列番号44]Ttef
[配列番号45]ku70
[配列番号46]pyrG
[配列番号47]Tr−AscBタンパク質
[配列番号48]Tr−AscCタンパク質
[配列番号49]Tr−AscDタンパク質
[配列番号50]Tr−AscEタンパク質
[配列番号51]Tr−ascC−Fw
[配列番号52]Tr−ascC−Rv
[配列番号53]Tr−ascC
[配列番号54]pyrG3
[配列番号55]Tr−ascD−Fw
[配列番号56]Tr−ascC−Rv
[配列番号57]Tr−ascD
[配列番号58]Tr−ascB−Fw
[配列番号59]Tr−ascB−Rv
[配列番号60]Tr−ascB
[配列番号61]コドン改変Tr−ascE
[配列番号62]アクレモニウム由来Ptef
[配列番号63]アクレモニウム由来Ttef
[配列番号64]Nd−ascG
[配列番号65]ascA
[配列番号66]AscAタンパク質
[配列番号67]Nd−AscIタンパク質
Claims (14)
- 下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascI。
(1)配列表の配列番号8に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号8に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号18又は67に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号18又は67に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列 - 下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドからAscIタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascJ。
(1)配列表の配列番号9に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号9に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドからAscIタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号19に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号19に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列 - 下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascK。
(1)配列表の配列番号10に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号10に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号20に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号20に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列 - 請求項1〜3に記載の遺伝子ascI、ascJ及びascKのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体(ただし、ヒトを除く)。
- 請求項1〜3に記載の遺伝子ascI、ascJ及びascKのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、さらに遺伝子ascF、ascE、ascD、ascB及びascCのいずれか1つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体(ただし、ヒトを除く)。
- 下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascGを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascGのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
(1)配列表の配列番号6又は64に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号6又は64に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号16又は40に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列 - 請求項6に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。
- 下記(1)〜(5)のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ascFを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascFのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
(1)配列表の配列番号5に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(2)配列番号5に記載の塩基配列からなる遺伝子と60%以上の配列同一性を有する塩基配列
(3)イリシコリンAのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(5)配列番号15又は39に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列 - 請求項8に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンAを得る工程を含む、イリシコリンAの製造方法。
- 請求項1に記載の遺伝子ascIを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ascIのノックアウト生物(ただし、ヒトを除く)。
- 請求項10に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
- 請求項6に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体の製造方法。
- 請求項8に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンA類縁体、イリシコリンA前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、イリシコリンA類縁体、イリシコリンA前駆体及びその類縁体の製造方法。
- 請求項10に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体の製造方法。
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