WO2018207928A1 - イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 - Google Patents

イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 Download PDF

Info

Publication number
WO2018207928A1
WO2018207928A1 PCT/JP2018/018405 JP2018018405W WO2018207928A1 WO 2018207928 A1 WO2018207928 A1 WO 2018207928A1 JP 2018018405 W JP2018018405 W JP 2018018405W WO 2018207928 A1 WO2018207928 A1 WO 2018207928A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
seq
amino acid
sequence
base sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/018405
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
康子 荒木
靖智 篠原
Original Assignee
キッコーマン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キッコーマン株式会社 filed Critical キッコーマン株式会社
Priority to JP2019517726A priority Critical patent/JP7205829B2/ja
Priority to AU2018267167A priority patent/AU2018267167A1/en
Priority to US16/612,413 priority patent/US11306317B2/en
Priority to CN201880031210.3A priority patent/CN110770347A/zh
Priority to EP18798532.0A priority patent/EP3636762A4/en
Publication of WO2018207928A1 publication Critical patent/WO2018207928A1/ja
Priority to JP2022203306A priority patent/JP2023030077A/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a gene for synthesizing isoprenoids such as ascofuranone, ascochlorin, and iricicholine A, and a method for producing isoprenoids using the gene.
  • Ascochlorin and ascofuranone which are isoprenoid-based physiologically active substances, are known. Ascochlorin and ascofuranone are promising in the treatment and prevention of African sleeping sickness, which is a protozoal infection caused by protozoan trypanosomes mediated by, for example, the fly, by inhibiting the electron transport system and reducing the intracellular ATP concentration.
  • African sleeping sickness which is a protozoal infection caused by protozoan trypanosomes mediated by, for example, the fly, by inhibiting the electron transport system and reducing the intracellular ATP concentration.
  • Iricicolin A is known as an intermediate for biosynthesis of not only ascochlorin and ascofuranone but also other isoprenoids, and is a useful compound as a raw material thereof.
  • isoprenoids as the production method of ascofuranone and ascochlorin, culturing Ascochyta genus (Ascochyta) filamentous fungus, a method for separating collecting accumulated ascofuranone the hyphae are known (e.g., Patent Document 5 And 6, the entire description of which is incorporated herein by reference).
  • Ascochyta & Vicia was known as a production strain of ascofuranone (Ascochyta viciae) is correct, the entire disclosure of Acremonium sclerotinia Kye Nam (Acremonium sclerotigenum) is it is non-patent document 1 (The document Which is incorporated herein by reference).
  • isoprenoids such as ascochlorin, ascofuranone, and its intermediate Iricicolin A
  • isoprenoids such as ascochlorin, ascofuranone, and its intermediate Iricicolin A
  • it is necessary to isolate or breed wild strains that stably produce isoprenoids at high concentrations It is possible to construct a transformed strain in which a gene involved in the biosynthesis of isoprenoids is inserted.
  • little is known about wild strains that stably produce isoprenoids at high concentrations and there are still many unclear parts regarding the biosynthetic pathway of isoprenoids.
  • the problem to be solved by the present invention is that it is possible to stably produce isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin and their derivatives in a high yield as compared with the prior art. It is an object of the present invention to provide a method for producing an isoprenoid that enables the production of an isoprenoid.
  • Aspergillus is a kind of filamentous fungi (Aspergillus) by transforming introduced into a microorganism of the genus or acremonium (Acremonium) microorganisms, they succeeded in producing a transformed filamentous fungus overexpressing the proteins encoded by the genes. Furthermore, the inventors succeeded in producing knockout filamentous fungi of ascF, ascG and ascI of Acremonium microorganisms.
  • the transformed filamentous fungus can be cultured according to the usual method for culturing filamentous fungi, and the growth rate and the like thereof are not particularly different from those of the host organism. From these facts, it was found that isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin can be produced by using the above-described transformed filamentous fungi and knockout filamentous fungi.
  • ascochlorin can be biosynthesized by using a transformed filamentous fungus into which an aspergillus genus microorganism not having the gene ascA is introduced with 7 genes of genes ascB to ascH. .
  • the present invention is an invention that has been completed based on the above-described successful examples and knowledge.
  • genes [1] to [11], transformants, knockout organisms and production methods are provided.
  • a gene ascI comprising any one of the following base sequences (1) to (5), the base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a monoatomic oxygenation reaction of iricicholine A epoxide .
  • a base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing or a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence (2) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 A nucleotide sequence having a sequence identity of 60% or more (3) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a monoatomic oxygenation reaction of iricicholine A epoxide (4) described in SEQ ID NO: 18 or 67 Base sequence encoding amino acid sequence having 60% or more sequence identity with amino acid sequence (5) One or several amino acids of amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 67 have been deleted, substituted and / or added Base sequence encoding amino acid sequence [2] The base sequence of any one of the following (1) to (5), wherein Iricicoline A epoxide to Ascofuranol
  • the resulting reaction comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having activity
  • a base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions (2) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing ascofuranol from a compound produced by the reaction of an AscI protein from iricicholine A epoxide (60) 4) Base sequence encoding an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 (5) One or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 are deleted or substituted And / or a base sequence encoding the added amino acid sequence [3] is any one of the following base sequences (1) to (5): , Comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having activity to catalyze a reaction for generating a ascofuranone from ascor
  • nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions with a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence; (2) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 (3) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing ascofuranone from ascofuranol (4) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20 (5) encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 have been deleted, substituted and / or added Base sequence [4] Any one of genes ascI, ascJ and ascK described in [1] to [3] above or a combination thereof Gene Align is inserted, and expressing the inserted gene, transformants (except for human).
  • a base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing or a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions (2) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a cyclization reaction of iricicholine A epoxide (4) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 or 40 Nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 60% or more with (5) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 40 are deleted, substituted and / or added [7]
  • a method for producing ascofuranone comprising the step of obtaining ascofuranone using the knockout organism according to [6] above.
  • a method for producing an ascofuranone analog, an ascofuranone precursor, and an analog thereof comprising a step of obtaining an ascofuranone analog, an ascofuranone precursor, and an analog thereof using the knockout organism according to [6] above.
  • a wild sequence having a gene ascF which includes any one of the following base sequences (1) to (5), the base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing an epoxidation reaction of iricicholine
  • a base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions (2) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 And a base sequence having 60% or more sequence identity (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing an epoxidation reaction of iricicholine A (4) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 or 39; A base sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 60% or more (5) An amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 39 are deleted, substituted and / or added Encoding base sequence [9] A method for producing iricicholine A, comprising the step of obtaining iricicholine A using the knockout organism according to the above [8].
  • a method for producing iricicholine A analog, iricicholine A precursor and analogs thereof comprising the steps of obtaining iricicholine A analog, iricicholine A precursor and analogs thereof using the knockout organism according to the above [8].
  • a method for producing ascochlorin comprising the step of obtaining ascochlorin using the knockout organism according to [10] above. The production method of an ascochlorin analog, an ascochlorin precursor, and its analog including the process of obtaining an ascochlorin analog, an ascochlorin precursor, and its analog using the knockout organism as described in said [10].
  • genes [12] to [22], transformants and production methods are provided.
  • a gene ascF comprising the nucleotide sequence of any one of the following (1) to (5), which encodes an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing an epoxidation reaction of iricicholine A.
  • a base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions (2) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 And a base sequence having 60% or more sequence identity (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing an epoxidation reaction of iricicholine A (4) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 or 39; A base sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 60% or more (5) An amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 39 are deleted, substituted and / or added
  • the encoded base sequence [13] is any one of the following base sequences (1) to (5) and has an activity of catalyzing the cyclization reaction of iricicholine A epoxide Comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the unit, the gene
  • nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 60% or more with (5) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 40 are deleted, substituted and / or added [14]
  • an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing ascochlorin by dehydrogenation of a compound produced by the reaction of AscF protein and AscG protein from iricicholine A with 60% or more sequence identity (4) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 or 41 (5) 1 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 or 41
  • a base sequence encoding an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted and / or added [15] 1) to (5) be any of the nucleotide sequences of, comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having activity to catalyze a reaction for generating a Irishikorin A from LL-Z1272 ⁇ , gene ASCE.
  • nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions with a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence; (2) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (3) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing iricicholine A from LL-Z1272 ⁇ (4) described in SEQ ID NO: 14 or 38 (5) One or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 38 are deleted, substituted and / or added.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence [16] is a base sequence of any one of the following (1) to (5):
  • the reaction for forming comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having activity to catalyze a gene ASCD.
  • nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence; (2) a gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing O-orselic acid from acetyl CoA (4) SEQ ID NO: 13 or 37 (5) one or several amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 37 are deleted, substituted and / or added.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence [17] is any one of the following (1) to (5), wherein I-licericinic acid B is converted from O-orceric acid.
  • the reaction for forming comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having activity to catalyze a gene ASCB.
  • a gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (2) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (3) a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing LL-Z1272 ⁇ from iricicolic acid B.
  • SEQ ID NO: 12 or 36 (5) one or several amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 36 is deleted, substituted and / or added.
  • a method for producing iricicholine A comprising the step of obtaining iricicholine A using the transformant according to [19].
  • a method for producing ascochlorin comprising a step of obtaining ascochlorin using the transformant according to [19].
  • a method for producing ascofuranone comprising a step of obtaining ascofuranone using the transformant according to [19].
  • the following proteins, genes, transformants and methods [23] to [31] are provided.
  • the gene comprises any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and enhances the expression of any one or more of [1] to [3] and [12] to [18] An AscA protein having activity.
  • A a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein described in [23]
  • B a base sequence described in SEQ ID NO: 65 in the sequence listing
  • C complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 65 in the sequence listing
  • D A base sequence having a sequence identity of 80% or more with a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 65 of the Sequence Listing [25] [1] to In the filamentous fungus having any one or more genes of [3] and [12] to [18], by enhancing the expression of the AscA protein according to [23] or the gene ascA according to [24],
  • a method for increasing the production of isoprenoids by a filamentous fungus comprising the step of increasing the production of isoprenoids by the filamentous fungus.
  • high-yield isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin can be stably produced.
  • it is expected to produce isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin on an industrial scale.
  • FIG. 1 is a diagram showing an ascochlorin biosynthesis gene cluster predicted by transcriptome analysis.
  • FIG. 2 is a diagram showing the HPLC analysis results of the As-DBCE strain extract and the iricicholine A standard product as described in Examples described later.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of HPLC analysis of the respective extracts of As-DBCE strain, As-DBCEF strain, As-DBCEFG strain and As-DBCEEFGH strain as described in Examples described later.
  • FIG. 4A is a diagram showing the LC / MS analysis results of the reaction product when using a wild-type reaction solution and an As-F reaction solution, respectively, as described in Examples described later.
  • FIG. 1 is a diagram showing an ascochlorin biosynthesis gene cluster predicted by transcriptome analysis.
  • FIG. 2 is a diagram showing the HPLC analysis results of the As-DBCE strain extract and the iricicholine A standard product as described in Examples described later.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of HPLC analysis of
  • FIG. 4B is a diagram showing an LC / MS analysis result of a reaction product when using an As-F reaction solution and an As-FG reaction solution, respectively, as described in Examples described later.
  • FIG. 5 is a diagram showing the LC / MS analysis results of the reaction product when using an As-FG reaction solution and an As-FGH reaction solution, respectively, as described in Examples described later.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the relationship between each enzyme reaction and the reactants in the reaction system of iricicholine A and ascochlorin.
  • FIG. 7 is a diagram showing an ascofuranone biosynthetic gene cluster predicted by transcriptome analysis.
  • FIG. 8 shows an As-F reaction solution, As-FI reaction solution, As-FIJ reaction solution, As-FIK reaction solution, As-FJK reaction solution, As-IJK reaction as described in the examples described later.
  • FIG. 6 is a diagram showing LC / MS analysis results of a reaction product when using a solution and an As-FIJK reaction solution, respectively.
  • FIG. 9 is a diagram showing LC / MS analysis results and MS / MS analysis results of a reaction product when using an As-FIJK reaction solution as described in Examples described later.
  • FIG. 10 shows an As-F reaction solution, As-FI reaction solution, As-FIJ reaction solution, As-FIK reaction solution, As-FJK reaction solution, As-IJK reaction, as described in Examples described later.
  • FIG. 10 shows an As-F reaction solution, As-FI reaction solution, As-FIJ reaction solution, As-FIK reaction solution, As-FJK reaction solution, As-IJK reaction, as described in Examples described later.
  • FIG. 10 shows
  • FIG. 6 is a diagram showing LC / MS analysis results of a reaction product when using a solution and an As-FIJK reaction solution, respectively.
  • FIG. 11 is a diagram showing the relationship between each enzyme reaction and reactants in the reaction system of ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of HPLC analysis of the extracts of As-DBCEFIred strain and As-DBCEFIJKred strain as described in Examples described later.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of HPLC analysis of an extract of an ascG-disrupted strain of Acremonium sclerotigenum F-1392 as described in the Examples described later.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of HPLC analysis of As-Tr-DB strains and extracts of As-DB strains as described in Examples described later.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of HPLC analysis of As-DBC-Tr-E strains and extracts of As-DBC strains as described in Examples described later.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the relationship between each enzyme reaction and reactants in a reaction system from iricicholine A epoxide to ascofuranone.
  • FIG. 17 is a diagram showing HPLC analysis results of extracts of ⁇ ascG strain and ⁇ ascG-I strain as described in Examples described later.
  • FIG. 18 is a diagram showing the HPLC analysis results of extracts of AscG / ⁇ ascH strain, ⁇ ascG / ⁇ ascH + Nd-ascG strain, and As-FG reaction solution as described in Examples described later.
  • FIG. 19 is a diagram showing the HPLC analysis results of the respective extracts of the wild strain and the AscA forced expression strain as described in Examples described later.
  • the “isoprenoid” in the present specification is not particularly limited as long as it is a compound having isoprene as a structural unit as is generally known.
  • iricicolic acid B glyphoric acid
  • iricicolic acid A iricicolic acid A
  • iricicholine B LL— Z1272 ⁇
  • Iricicolin A LL-Z1272 ⁇
  • Iricicolin A epoxide Iricicolin C
  • Ascochlorin Hydroxyiricholine A epoxide, Ascofuranol, Ascofuranone and their derivatives.
  • ascofuranone, iricicholine A, ascochlorin, and derivatives thereof are sometimes referred to as “isoprenoids”.
  • iricicholine A epoxide and iricicholine C are referred to as “ascochlorin precursor”
  • iricicholine A epoxide, hydroxyiricicholine A epoxide and ascofuranol are referred to as “ascochlorin precursor”
  • iricicolic acid B, iricicolic acid A and iricicholine B It may be referred to as “A precursor”.
  • the term “derivative” refers to iricicolic acid B, iricicolic acid A, iricicholine B, iricicholine A, iricicholine A epoxide, iricicholine C by chemical synthesis, enzyme synthesis, fermentation, or a combination thereof. All modified compounds obtained via ascochlorin, hydroxyiricholine A epoxide, ascofuranol, ascofuranone and the like.
  • the “derivative” does not need to go through iricicolic acid B, iricicolic acid A, iricicholine B, iricicholine A, iricicholine A epoxide, iricicholine C, ascochlorin, hydroxyiricholine A epoxide, ascofuranol, ascofuranone, etc. , All compounds that have a structure similar to the above compounds, and those modified compounds that can be biosynthesized using any one of the enzymes described herein.
  • Ascofuranone, ascochlorin, iricicholine A, and their precursors are all meroterpenoid compounds in which a polyketide compound and a terpenoid compound are hybridized.
  • a polyketide synthase such as AscD
  • an isoprenoid compound such as C10, C15, and C20 is transferred by a prenyl transferase such as AscB.
  • AscB prenyl transferase
  • iridicolinic acid B analog compounds can be biosynthesized by changing the combination of AscD and AscB with altered substrate specificity or high identity but different substrate specificity.
  • Coretochlorin B is an analog similar to Iricicolin A, which has one shorter isoprene skeleton of Iricicolin A, ie, a C10 monoterpene structure, but it modifies AscD and specificity herein.
  • a compound in which the terpene part of Iricicolinic acid B has a monoterpene structure of C10 is obtained by combining the reactions of two enzymes, AscB and AscB having different substrate specificities, or an enzyme with high identity. Then, since it can be further synthesized by the reaction of AscC and AscE, it can be included in the “derivative” as used herein.
  • the gene ascB of one embodiment of the present invention is a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing iricicoline acid B from o-orceric acid (hereinafter also referred to as “enzyme (1)”). including.
  • the gene ascC of one embodiment of the present invention has a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing LL-Z1272 ⁇ from iricicolic acid B (hereinafter also referred to as “enzyme (2)”). Including.
  • the gene ascD of one embodiment of the present invention has a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing o-orselic acid from acetyl CoA (hereinafter also referred to as “enzyme (3)”). Including.
  • the gene ascE of one embodiment of the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme (hereinafter also referred to as “enzyme (4)”) having an activity of catalyzing a reaction for producing iricicholine A from LL-Z1272 ⁇ .
  • the enzyme (4) may be an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for generating iricicolic acid A from iricicolic acid B.
  • the gene ascF of one embodiment of the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing an epoxidation reaction of iricicholine A (hereinafter also referred to as “enzyme (5)”).
  • the gene ascG of one embodiment of the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing the cyclization reaction of iricicholine A epoxide (hereinafter also referred to as “enzyme (6)”).
  • enzyme (6) The compound produced from iricicholine A epoxide by the reaction using enzyme (6) is iricicholine C.
  • the gene ascH of one embodiment of the present invention is an enzyme having an activity that catalyzes a reaction for producing ascochlorin by dehydrogenation of a compound produced by the reaction of AscF protein and AscG protein from iricicholine A (hereinafter referred to as “enzyme (7)”. Also includes a base sequence encoding the amino acid sequence.
  • the gene ascI of one embodiment of the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence of an enzyme having an activity of catalyzing a monoatomic oxygenation reaction of iricicholine A epoxide (hereinafter also referred to as “enzyme (8)”).
  • the monoatomic oxygenation reaction of iricicholine A epoxide refers to a reaction in which a hydrogen atom (—H) of iricicholine A epoxide is substituted with a hydroxy group (—OH).
  • the compound produced from iricicholine A epoxide by the reaction using enzyme (8) is hydroxyiricicholine A epoxide.
  • genes ascJ and ascK of one embodiment of the present invention are enzymes having an activity of catalyzing a reaction for producing ascofuranone from a compound produced by the reaction of Asci protein from iricicholine A epoxide (hereinafter referred to as “enzyme (9)” and “ A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of enzyme (10).
  • enzyme (1) has a function similar to prenyl transferase; enzyme (2) has a function similar to oxidoreductase.
  • Enzyme (3) has a function similar to polyketide synthase; enzyme (4) has a function similar to halogenase; enzyme (5) has a function similar to p450 / p450 reductase as an epoxidase
  • Enzyme (6) has the same function as terpene cyclase;
  • Enzyme (7) has the same function as p450 as dehydrogenase;
  • Enzyme (8) has the same function as p450 as monooxygenase
  • Enzyme (9) has the same function as terpene cyclase; and Enzyme (10) is likely to have the same function as dehydrogenase.
  • enzyme (9) and enzyme (10) can synthesize ascofuranone from the reaction product of AscI protein by expressing both genes encoding these enzymes. .
  • one enzyme is referred to as “coupled” to the other enzyme.
  • enzyme (9) is an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing ascofuranol from hydroxyiricholine A epoxide.
  • the enzyme (10) can be said to be an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing ascofuranone from ascofuranol.
  • the AscA protein of one embodiment of the present invention is a protein having an activity of enhancing the expression of one or more genes among genes encoding enzymes (1) to (10).
  • the AscA protein enhances the expression of one or more genes among the genes encoding the enzymes (1) to (10), thereby promoting the biosynthesis of isoprenoids in the organism containing these genes. The production of isoprenoids by the organism is increased.
  • AscA protein can function as a positive transcription factor of the gene encoding enzymes (1) to (10).
  • the gene encoding the AscA protein can be included in the ascochlorin biosynthesis gene or the ascofuranone biosynthesis gene. Strictly speaking, the AscA protein is a transcription factor and is not an enzyme, but in this specification, the AscA protein is sometimes referred to as an enzyme for convenience, and may be referred to as “enzyme (11)”.
  • the amino acid sequence is not particularly limited.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11, 35 and 47 there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 12, 36 and There is an amino acid sequence shown in 48; as an embodiment of the enzyme (3) having the enzyme activity described above, there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13, 37 and 49; as an embodiment of the enzyme (4) having the enzyme activity described above
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 14, 38 and 50 there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 14, 38 and 50; as an embodiment of the enzyme (5) having the enzyme activity described above, there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 39; As one embodiment, there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16 and 40;
  • Enzymes having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 20 and 66 are all derived from Acremonium sclerotigenum , which is a kind of Acremonium filamentous fungus, and the AscA by the present inventors, respectively. , AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ and AscK proteins.
  • the base sequences of the genes encoding these enzymes are the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 and 65.
  • Enzymes having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 35 to 41 and 67 are all derived from Neonectoria ditissima , and the present inventors have made Nd-AscB, Nd-AscC, Nd-AscD, Nd- -Named AscE, Nd-AscF, Nd-AscG, Nd-AscH and Nd-AscI proteins.
  • the base sequence of the gene encoding Nd-AscG protein is the base sequence shown in SEQ ID NO: 64.
  • Enzymes having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 47 to 50 are all derived from Trichoderma reesei and have been provided by the present inventors as Tr-AscB, Tr-AscC, Tr-AscD and Tr-AscE, respectively. Named protein.
  • the base sequences of the genes encoding Tr-ascC, Tr-AscD and Tr-AscB proteins are the base sequences shown in SEQ ID NOs: 53, 57 and 60, respectively.
  • AscA, AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ and AscK proteins are encoded by genes encoding these enzymes present on the chromosomal DNA of the genera Acremonium, Neonectria or Trichoderma Is.
  • genes encoding these enzymes present on the chromosomal DNA of the genera Acremonium, Neonectria or Trichoderma Is When a gene existing on the chromosomal DNA of such an organism and a protein or enzyme encoded by the gene are referred to as “wild type gene”, “wild type protein” or “wild type enzyme”, respectively, in this specification There is.
  • the amino acid sequence of the wild-type enzyme lacks one to several amino acids. It may consist of an amino acid sequence having loss, substitution, addition and the like.
  • the range of “1 to several” in “deletion, substitution and addition of 1 to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but for example, the unit of 100 amino acids in the amino acid sequence is one unit. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 per unit, preferably It means about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
  • amino acid deletion means deletion or disappearance of an amino acid residue in the sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence is replaced with another amino acid residue.
  • Additional of amino acid means that a new amino acid residue is added to the sequence.
  • a specific embodiment of “deletion, substitution, addition of 1 to several amino acids” includes an embodiment in which one to several amino acids are replaced with another chemically similar amino acid.
  • a case where a certain hydrophobic amino acid is substituted with another hydrophobic amino acid a case where a certain polar amino acid is substituted with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of the basic amino acid having a positive charge include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of acidic amino acids having a negative charge include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequences having a deletion, substitution, addition, etc. of one to several amino acids in the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme include amino acid sequences having a certain sequence identity with the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme. For example, 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% with the amino acid sequence of the wild-type enzyme More preferred is an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more.
  • the method for obtaining the enzymes (1) to (11) is not particularly limited.
  • the transformant transformed so as to enhance the expression of the gene encoding the enzymes (1) to (11) is cultured, Next, a method including recovering the enzymes (1) to (11) in the culture is exemplified.
  • the means for recovering the enzymes (1) to (11) from the culture is not particularly limited.
  • the enzymes (1) to (11) can be obtained from the culture supernatant from which impurities have been removed by ammonium sulfate precipitation or the like according to a conventional method. And then isolating the enzymes (1) to (11) by using gel filtration chromatography or SDS-PAGE using the molecular weight of the enzymes (1) to (11) as an index be able to.
  • the theoretical molecular weights calculated from the constituent elements of AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ, AscK and AscA proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 20 and 66 are 37000, respectively. 120,000, 230000, 61000, 120,000, 31000, 61000, 57000, 42000, 32000, and 55000.
  • Gene encoding enzymes (1) to (11) The genes ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG, ascH, ascI, ascJaskK and ascA (hereinafter, these may be collectively referred to as “genes encoding enzymes (1) to (11)”). There is no particular limitation as long as it includes a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzymes (1) to (11) having the enzyme activity described above. Enzymes (1) to (11) are produced by expressing genes encoding enzymes (1) to (11) in the organism.
  • Gene expression in the present specification means that a protein or enzyme encoded by a gene is produced in a form having an original function or activity, particularly an enzyme activity, through transcription or translation. “Gene expression” refers to the high expression of a gene, that is, the insertion of a gene results in the production of a protein or enzyme encoded by the gene in excess of the amount originally expressed by the host organism. Is included.
  • the gene encoding the enzymes (1) to (11) may be a gene that can produce the enzymes (1) to (11) via splicing after transcription of the gene when introduced into the host organism.
  • the gene may be any gene that can produce enzymes (1) to (11) without splicing after transcription of the gene.
  • the gene encoding the enzymes (1) to (11) does not have to be completely identical to the gene originally possessed by the derived organism (that is, the wild type gene), and is a gene encoding the enzyme having the enzyme activity described above. As long as it is a DNA having a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method using a DNA having a base sequence of a wild-type gene as a probe. It means the base sequence of DNA obtained by using.
  • stringent conditions in the present specification is a condition in which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal.
  • the hybridization system used, the type of probe, and the sequence It depends on the length.
  • Such conditions can be determined by changing the hybridization temperature, washing temperature and salt concentration. For example, when a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the hybridization and washing temperature and, if necessary, lowering the washing salt concentration. If no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, raising the washing salt concentration.
  • hybridization is 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v), a nucleic acid hybridization blocking reagent (Boehringer Mannheim), Perform overnight (about 8-16 hours) using 0.1% (w / v) N-lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS. Washing is performed using 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, twice for 15 minutes. Do.
  • the temperature for performing hybridization and washing is 65 ° C or higher, preferably 68 ° C or higher.
  • Examples of the DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions include, for example, a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized, as described above. After hybridization at 40 to 75 ° C. in the presence of DNA obtained by hybridization under a gentle condition or 0.5 to 2.0 M NaCl, preferably 0.7 to 1.0 M After hybridization at 65 ° C. in the presence of NaCl, the filter was used at 65 ° C. using 0.1 to 1 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). Examples thereof include DNA that can be identified by washing.
  • Probe preparation and hybridization methods are described in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd-Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereinafter these documents are also referred to as “Reference Documents”, all of which are incorporated herein by reference), etc. Can be carried out in accordance with the method described in. In addition to the conditions such as the salt concentration and temperature of the buffer, those skilled in the art will consider other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. Conditions for obtaining a DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary base sequence can be appropriately set.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain sequence identity with a base sequence of a DNA having a base sequence of a wild-type gene used as a probe. 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably Examples thereof include DNA having 95% or more sequence identity.
  • the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is, for example, as follows: 1 to several, preferably 1 to 40, preferably 1 to 35, preferably 1 to 30, preferably 1 to 25, preferably 1 to 20, more preferably 1 per unit. 1 to 15, more preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, even more preferably 1, 2, 3, 4 or 5 base deletions, substitutions, Includes base sequences with additions and the like.
  • base deletion means that there is a deletion or disappearance in the base in the sequence
  • base replacement means that the base in the sequence is replaced with another base
  • Additional of a base means that a new base is added to be inserted.
  • the enzyme encoded by the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is 1 to several in the amino acid sequence of the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene. Although it is likely to be an enzyme having an amino acid sequence having deletion, substitution, addition, etc. of individual amino acids, it has the same activity as the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene.
  • the gene encoding the enzymes (1) to (11) has the same or similar amino acid sequence as the amino acid sequence of the enzyme encoded by the wild-type gene using the fact that there are several types of codons corresponding to one amino acid. May include a nucleotide sequence different from that of the wild-type gene. Examples of such a base sequence in which codon modification has been performed on the base sequence of the wild-type gene include the base sequences described in SEQ ID NOs: 21 to 24, 28 to 30, and 61.
  • the base sequence subjected to codon modification is preferably, for example, a base sequence subjected to codon modification so as to be easily expressed in a host organism.
  • the method for determining the sequence identity of the base sequence or amino acid sequence is not particularly limited.
  • the amino acid sequence of the protein or enzyme encoded by the wild type gene or the wild type gene and the target By using a program for aligning the base sequence and amino acid sequence to be calculated, and calculating the coincidence rate of both sequences.
  • Each of the above methods can be generally used for searching a sequence showing sequence identity from a database.
  • Genetyx network version version 12.0 As a means for determining the sequence identity of individual sequences, Genetyx network version version 12.0. A homology analysis of 1 (Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985, the entire description of which is incorporated herein by reference).
  • CDS or ORF region encoding a protein
  • genes encoding enzymes (1) to (11) include biological species capable of producing isoprenoids such as iricicholine A, ascofuranone and ascochlorin, and biological species in which the expression of enzymes (1) to (11) is observed. Derived from. Examples of the organism derived from the gene encoding the enzymes (1) to (11) include microorganisms. Among microorganisms, filamentous fungi are preferable because there are many bacterial species known to have ascochlorin-producing ability or ascofuranone-producing ability.
  • filamentous fungi capable of producing ascochlorin and ascochlorin analogues
  • Acremonium fungi Neonekutoria filamentous fungi of the genus, Fusarium (Fusarium) filamentous fungi, cylindroconical Cal Pont genus (Cylindrocarpon) filamentous fungus
  • Verticillium fungi Nectria fungi, Cylindrocladium fungi, Colletotrichum fungi, Cephalosporum fungi, Cephalosporum fungi Nigrosabulum
  • Acremonium sclerotigenum Neonectria ditisima, Vertisiriu -Time Hemiputarigenamu (Verticillium hemipterigenum), Colletotrichum-Nikochianae (Colletotrichum nicotianae) and the like.
  • filamentous fungi with ascofuranone producing ability examples include Trichoderma spp., More specifically, Trichoderma reesei.
  • the specific examples of the filamentous fungus having the ability to produce ascochlorin and the filamentous fungus having the ability to produce ascofuranone may be specific examples of the filamentous fungus having the ability to produce Iricicolin A.
  • the origin of the gene encoding the enzymes (1) to (11) is not particularly limited, but the enzymes (1) to (11) expressed in the transformant are inactivated by the growth conditions of the host organism. Without activity. Therefore, the organism derived from the gene encoding the enzymes (1) to (11) is a microorganism whose growth conditions approximate the host organism to be transformed by inserting the genes encoding the enzymes (1) to (11). Preferably there is.
  • the gene encoding the enzymes (1) to (11) can be inserted into various appropriate known vectors. Furthermore, this vector can be introduced into a suitable known host organism to produce a transformant into which a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding enzymes (1) to (11) has been introduced. Methods for obtaining genes encoding enzymes (1) to (11), nucleotide sequences of genes encoding enzymes (1) to (11), methods for obtaining amino acid sequence information of enzymes (1) to (11), various methods A method for producing a vector, a method for producing a transformant, and the like can be appropriately selected by those skilled in the art. Moreover, in this specification, a transformation and a transformant include a transduction and a transductant, respectively. An example of cloning of the genes encoding the enzymes (1) to (11) will be described later without limitation.
  • chromosomal DNA and mRNA can be extracted from microorganisms and various cells capable of producing the enzymes (1) to (11) by conventional methods, for example, methods described in the reference technical literature.
  • CDNA can be synthesized using the extracted mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • the gene encoding the enzymes (1) to (11) can be obtained by cloning using the chromosomal DNA or cDNA of the derived organism having the gene as a template.
  • the organism from which the genes encoding the enzymes (1) to (11) are derived is as described above, and specific examples include Acremonium sclerotigenum.
  • Acremonium sclerotigenum For example, culturing Acremonium sclerotigenum, removing moisture from the obtained bacterial cells, and physically pulverizing with a mortar etc. while cooling in liquid nitrogen to form fine powdered bacterial cell pieces Then, a chromosomal DNA fraction is extracted from the cell piece by a usual method.
  • a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen) can be used.
  • DNA is amplified by performing a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a synthetic primer complementary to the 5 ′ end sequence and the 3 ′ end sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the primer is not particularly limited as long as a DNA fragment containing the gene can be amplified.
  • DNA containing the target gene fragment can be amplified by appropriate PCR such as 5'RACE method or 3'RACE method, and these can be ligated to obtain DNA containing the full length target gene.
  • the method for obtaining the gene encoding the enzymes (1) to (11) is not particularly limited.
  • the enzymes (1) to (11) can be obtained using a chemical synthesis method without using a genetic engineering technique. It is possible to construct a gene to encode.
  • Confirmation of the base sequence in the amplification product amplified by PCR or the chemically synthesized gene can be performed, for example, as follows. First, a DNA whose sequence is to be confirmed is inserted into an appropriate vector according to a normal method to produce a recombinant DNA.
  • kits such as TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen); pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBluescript SK + (Stratagene)
  • plasmid vector DNA such as pYES2 / CT (manufactured by Invitrogen); commercially available bacteriophage vector DNA such as ⁇ EMBL3 (manufactured by Stratagene).
  • the recombinant DNA is used to transform a host organism, for example, E.
  • E. coli Escherichia coli
  • E. coli JM109 strain Tekara Bio
  • E. coli DH5 ⁇ strain Tekara Bio
  • the recombinant DNA contained in the obtained transformant is purified using QIAGEN Plasmid Mini Kit (manufactured by Qiagen).
  • the base sequence of each gene inserted into the recombinant DNA is determined by the dideoxy method (Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983, the entire description of which is incorporated herein by reference), etc. Do.
  • the sequence analysis apparatus used for determining the base sequence is not particularly limited. For example, Li-COR MODEL 4200L sequencer (manufactured by Aroka), 370 DNA sequence system (manufactured by PerkinElmer), CEQ2000XL DNA analysis system (manufactured by Beckman) ) And the like. Based on the determined base sequence, the translated protein, that is, the amino acid sequences of the enzymes (1) to (11) can be known.
  • a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding enzymes (1) to (11) comprises a PCR amplification product containing any of the genes encoding enzymes (1) to (11) and various vectors. It can be constructed by binding in a form that allows expression of the genes encoding the enzymes (1) to (11). For example, it can be constructed by excising a DNA fragment containing any of the genes encoding enzymes (1) to (11) with an appropriate restriction enzyme and ligating the DNA fragment with a plasmid cut with an appropriate restriction enzyme. it can.
  • a DNA fragment containing the gene having a sequence homologous to the plasmid added to both ends and a plasmid-derived DNA fragment amplified by inverse PCR are commercially available, such as In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). It can be obtained by ligation using a recombinant vector preparation kit.
  • a method for producing a transformant is not particularly limited, and examples thereof include a method of inserting into a host organism in such a manner that genes encoding enzymes (1) to (11) are expressed according to a conventional method. Specifically, a DNA construct is prepared by inserting any of the genes encoding enzymes (1) to (11) between an expression-inducing promoter and a terminator, and then the genes encoding enzymes (1) to (11) By transforming a host organism with a DNA construct containing, a transformant overexpressing the gene encoding the enzymes (1) to (11) can be obtained.
  • a DNA fragment comprising a gene-terminator encoding an expression-inducing promoter-enzymes (1) to (11) and a recombinant vector containing the DNA fragment, prepared for transforming a host organism, is a DNA.
  • a construct Collectively called a construct.
  • the method of inserting into the host organism in such a manner that the gene encoding the enzymes (1) to (11) is expressed is not particularly limited.
  • the gene can be directly added onto the chromosome of the host organism by using homologous recombination or non-homologous recombination.
  • a method of introducing into a host organism by ligation onto a plasmid vector is not particularly limited.
  • a DNA construct can be ligated and inserted into the genome of the host organism between sequences homologous to the upstream region and downstream region of the recombination site on the chromosome.
  • the high expression promoter is not particularly limited.
  • the promoter region of the translation elongation factor TEF1 gene (tef1) the promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy)
  • the alkaline protease gene (alp) promoter region the alkaline protease gene (alp) promoter region
  • gpd glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase
  • the method using non-homologous recombination does not require a homologous sequence, and may be inserted randomly in any region in the genome of the host organism and inserted in multiple copies.
  • the DNA construct used for transformation may be either linear or circular.
  • the high expression promoter is not particularly limited. For example, the promoter region of the translation elongation factor TEF1 gene (tef1), the promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy), the alkaline protease gene (alp) promoter region, glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase (gpd) promoter region and the like.
  • a DNA construct in a method using a vector, can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of a host organism by a conventional method, and the corresponding host organism can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing the enzymes (1) to (11) in the host organism.
  • pUC19 and a filamentous fungal system pSTA14 (Mol Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, the entire description of which is incorporated herein by reference) and filamentous fungal systems.
  • the DNA construct is preferably used after being introduced into the chromosome of the host organism, but other methods include autonomously replicating vectors (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995), The description can be used in a form that is not introduced into a chromosome by incorporating a DNA construct into (which is incorporated herein by reference).
  • the DNA construct may include a marker gene to allow selection of transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include genes that complement the auxotrophy of the host organism such as pyrG, pyrG3, niaD, and adeA; drug resistance genes for drugs such as pyrithiamine, hygromycin B, and oligomycin. It is done.
  • the DNA construct also contains a promoter, terminator, and other control sequences (eg, enhancer, polyadenylation sequence, etc.) that allow overexpression of the gene encoding enzymes (1) to (11) in the host organism. It is preferable.
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter and a constitutive promoter.
  • Examples thereof include a tef1 promoter, an alp promoter, an amy promoter, and a gpd promoter.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, and a tef1 terminator.
  • the expression control sequence of the gene encoding the enzymes (1) to (11) is such that the DNA fragment containing the gene encoding the inserted enzyme (1) to (11) has an expression control function. It is not always necessary to include sequences. Further, when transformation is performed by the co-transformation method, the DNA construct may not have a marker gene.
  • the DNA construct can be tagged for purification.
  • a linker sequence is appropriately connected upstream or downstream of the gene encoding enzymes (1) to (11), and a base sequence encoding histidine is connected by 6 codons or more to enable purification using a nickel column. can do.
  • the DNA construct may contain homologous sequences necessary for marker recycling.
  • the pyrG marker adds a sequence homologous to the sequence upstream of the insertion site (5 ′ homologous recombination region) downstream of the pyrG marker, or downstream of the insertion site (3 ′ homologous recombination region) upstream of the pyrG marker.
  • the pyrG marker can be removed on a medium containing 5-fluoroorotic acid (5FOA).
  • the length of the homologous sequence suitable for marker recycling is preferably 0.5 kb or more.
  • One aspect of the DNA construct is, for example, the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19, the Pef that is the tef1 gene promoter, the gene that encodes the enzymes (1) to (11), the Tef that is the tef1 gene terminator,
  • This is a DNA construct in which an alp gene terminator and a pyrG marker gene are linked.
  • DNA construct when inserting a gene by homologous recombination is as follows: 5 ′ homologous recombination sequence, tef1 gene promoter, gene encoding enzymes (1) to (11), alp gene terminator and pyrG marker gene, 3 ′ homology A DNA construct in which recombination sequences are linked.
  • a 5 ′ homologous recombination sequence when a gene is inserted by homologous recombination and the marker is recycled, a 5 ′ homologous recombination sequence, a tef1 gene promoter, a gene encoding enzymes (1) to (11), an alp gene terminator, It is a DNA construct in which a homologous sequence for marker recycling, a pyrG marker gene, and a 3 ′ homologous recombination sequence are linked.
  • the host organism is a filamentous fungus
  • a method known to those skilled in the art can be appropriately selected as a method for transformation into the filamentous fungus.
  • polyethylene glycol and calcium chloride are added.
  • the protoplast PEG method to be used for example, see Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-2222055, etc., the entire description of which is incorporated herein by reference
  • an appropriate medium is used according to the host organism to be used and the transformation marker gene. For example, when Aspergillus oryzae ( A.
  • regeneration of the transformant is, for example, 0.5 Czapek-Dox minimal medium (manufactured by Difco) containing 1% agar and 1.2 M sorbitol.
  • the promoter of the gene encoding the enzymes (1) to (11) that the host organism originally has on the chromosome is changed to a high expression promoter such as tef1 by using homologous recombination. It may be replaced. Also in this case, it is preferable to insert a transformation marker gene such as pyrG in addition to the high expression promoter.
  • a transformation marker gene such as pyrG
  • the upstream region of the gene encoding the enzymes (1) to (11) transformation marker gene—high
  • An expression cassette-transformation cassette comprising all or part of the gene encoding the enzymes (1) to (11) can be used.
  • the upstream region of the gene encoding the enzymes (1) to (11) and the whole or part of the gene encoding the enzymes (1) to (11) are used for homologous recombination.
  • a gene including a region in the middle from the start codon can be used as the whole or part of the gene encoding the enzymes (1) to (11).
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or more.
  • Confirmation that the transformant was produced is obtained by culturing the transformant under the conditions where the activities of the enzymes (1) to (11) are observed, and then the target product in the culture obtained after the culture, for example, Confirm that isoprenoids such as ascochlorin, iricicolin A, and ascofuranone are detected, or that the amount of the target product detected is greater than the amount of the target product in the culture of the host organism cultured under the same conditions. Can be performed.
  • confirmation that the transformant was produced was performed by extracting chromosomal DNA from the transformant, performing PCR using this as a template, and confirming that a PCR product that can be amplified is produced when transformation occurs. It may be done by doing. In this case, for example, PCR is performed with a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transformation marker gene to confirm that a product of the expected length is generated.
  • PCR is performed using a combination of a forward primer located upstream from the upstream homologous region used and a reverse primer located downstream from the used homologous region. It is preferable to confirm that a product of the expected length is produced when recombination occurs.
  • Knockout is a gene encoded by deleting part or all of a gene, introducing a mutation or inserting an arbitrary sequence into the gene, or deleting a promoter necessary for the expression of the gene. It means that functional expression of protein is lost. Strictly speaking, the functional expression of the protein encoded by the gene is not completely lost, that is, even if the protein encoded by the gene may be functionally expressed, the functional expression is largely lost. As long as it is included, it can be included in the “knockout” as used herein. In the present specification, the “knockout organism” is sometimes referred to as “destructive strain” or “deficient strain”.
  • the method for producing the knockout is not particularly limited.
  • the gene can be deleted by homologous recombination using the homologous recombination as shown in the following examples, or by genome editing techniques such as TALEN and CRISPR-Cas9. Any method may be used, such as causing deletion, insertion, or substitution.
  • a DNA construct when a gene is knocked out by homologous recombination is a DNA construct in which a 5 'homologous recombination sequence, a pyrG marker gene, and a 3' homologous recombination sequence are linked, but is not limited thereto.
  • DNA construct when a gene is inserted by homologous recombination and the marker is recycled is a DNA in which a 5 ′ homologous recombination sequence, a homologous sequence for marker recycling, a pyrG marker gene, and a 3 ′ homologous recombination sequence are linked.
  • a construct when a gene is inserted by homologous recombination and the marker is recycled is a DNA in which a 5 ′ homologous recombination sequence, a homologous sequence for marker recycling, a pyrG marker gene, and a 3 ′ homologous recombination sequence are linked.
  • enzymes (1) to (11) can be obtained by transformation with a DNA construct containing a gene encoding enzymes (1) to (11) or a DNA construct containing a gene encoding enzymes (1) to (11).
  • isoprenoids are not particularly limited, and examples include microorganisms and plants.
  • microorganisms include Aspergillus microorganisms, Acremonium microorganisms, Neonectria microorganisms, Fusarium a microorganism belonging to the genus, Escherichia (Escherichia) microorganism belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces) a microorganism belonging to the genus Pichia (Pichia) a microorganism belonging to the genus, Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) a microorganism belonging to the genus, Gigot Saccharomyces Seth (Zygo accharomyces) microorganism belonging to the genus Trichoderma (Trichoderuma) microorganism belonging to the genus, Penicillium (Penicillium) microorganism belonging to the genus, Rhizopus (Rhizopus) microorganism belonging to the genus, Neurospora cra
  • Filamentous fungi having the ability to produce isoprenoids such as iricicholine A, ascochlorin, and ascofuranone, and filamentous fungi having genes encoding enzymes (1) to (11) on genomic DNA may be used.
  • the host organism When the host organism does not have an ascochlorin biosynthesis gene or an ascofuranone biosynthesis gene, and is not capable of producing isoprenoid, it is transformed with a gene encoding enzymes (1) to (11). That is, a transformant obtained by introducing an ascochlorin biosynthetic gene or an ascofuranone biosynthetic gene and transforming so that the isoprenoid is heterologously expressed, for example, a transformed filamentous fungus, can also be used as a host organism. However, in any case, humans are excluded from the host organism.
  • Organisms that can produce isoprenoids include Acremonium filamentous fungi, Trichoderma spp., Fusarium spp., Cylindrocarpon spp., Verticillium spp., Nectria spp., Pecilomyces spp. More specifically, there may be mentioned Acremonium sclerotigenum, Neonectria ditisima, Trichoderma reesei, Pesilomyces barriotti, Verticillium hemiputarigenum and the like.
  • filamentous fungi Aspergillus oryzae, Aspergillus soya, Aspergillus niger ( A. niger), Aspergillus tamari ( A. tamarii ), Aspergillus awamori ( A. awamori), Aspergillus Usami (A.usami), Aspergillus kawachii (A.kawachii), such as Aspergillus microorganisms, such as Aspergillus saitoi (A.saitoi) is preferable.
  • filamentous fungi including Acremonium microorganisms and Aspergillus microorganisms tend to have a low homologous recombination frequency, they are involved in non-homologous recombination mechanisms when producing transformants by homologous recombination. It is preferable to use a transformed filamentous fungus in which a Ku gene such as Ku70 or Ku80 is suppressed.
  • Such suppression of the Ku gene can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • the Ku gene is disrupted using a Ku gene disruption vector, or an antisense expression vector for the Ku gene is used. This can be achieved by inactivating the Ku gene by an antisense RNA method to be used.
  • the transformed Aspergillus microorganism thus obtained has a significantly increased homologous recombination frequency compared to the original Aspergillus microorganism before genetic manipulation relating to suppression of the Ku gene. Specifically, it is elevated at least 2 times, preferably at least 5 times, preferably at least 10 times, preferably at least about 50 times.
  • the host organism is preferably a transformed filamentous fungus in which a marker gene such as pyrG is suppressed.
  • the marker gene to be suppressed can be appropriately set according to the marker gene included in the DNA construct.
  • genes encoding enzymes (1) to (11) derived from Acremonium sclerotigenum include genes asbB, ascC, ascD, ascE, and ascF having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 10 and 65, respectively. , AscG, ascH, ascI, ascJ, ascK and ascA.
  • the amino acid sequences of AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ, AscK, and AscA proteins are shown as SEQ ID NOs: 11 to 20 and 66, respectively.
  • a method for obtaining genes encoding enzymes (1) to (11) from organisms other than Acremonium sclerotigenum and Acremonium sclerotigenum is not particularly limited.
  • genes ascB, ascC, ascD, ascE, and ascF Based on the base sequences (SEQ ID NOs: 1 to 10 and 65) of ascG, ascH, ascI, ascJ and ascK, the genomic DNA of the target organism is searched for BLAST homology, and the genes ascA, asB, ascC, ascD, ascE, It can be obtained by specifying a gene having a base sequence having high sequence identity with the base sequences of ascF, ascG, ascH, ascI, ascJ, ascK and ascA.
  • amino acid sequences of the AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ, AscK, and AscA proteins have sequence identity. It can be obtained by specifying a protein having a high amino acid sequence and specifying a gene encoding the protein.
  • amino acid sequences having high sequence identity with the amino acid sequences of AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH and AscI proteins derived from Acremonium sclerotigenum include SEQ ID NOs: 35 to 41 derived from Neonectoria.
  • amino acid sequence of 67 amino acid sequences having high sequence identity with the amino acid sequences of AscB, AscC, AscD and AscE proteins derived from Acremonium sclerotigenum include amino acid sequences of SEQ ID NOs: 47 to 50 derived from Trichoderma .
  • a gene encoding enzymes (1) to (11) obtained from Acremonium sclerotigenum or a gene encoding an enzyme having sequence identity with enzymes (1) to (11) It can be transformed by introducing it into an arbitrary host cell such as a microorganism or Acremonium microorganism.
  • transformant One aspect of the transformant is a gene ascA, ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG, ascH, ascI, ascJ and ascK, or a combination thereof, with filamentous fungi or plants as host organisms And a transformant transformed to express the inserted gene (hereinafter also referred to as “transformant (1)”).
  • the host organism is an organism that can produce ascochlorin and ascofuranone, such as Acremonium and sclerotigenum
  • the inserted gene is constantly expressed higher than forced or endogenous expression. It is desirable that the condition is expressed in the later stage of the culture after cell growth.
  • Such transformants may or may not be substantially produced in the host organism by the action of expressed AscA, AscB, AscC, AscD, AscE, AscF, AscG, AscH, AscI, AscJ and / or AscK.
  • Trace amounts of Iricicolin A, Ascochlorin or Ascofuranone can be produced in detectable or higher amounts.
  • transformant (2) is a wild organism containing all or part of the genes ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG, ascH, ascI, ascJ, and ascK using a filamentous fungus or a plant as a host organism.
  • Type-derived biosynthetic gene cluster gene (including promoter sequences other than ORF) and DNA designed to highly or lowly express transcription factors that control transcription of the biosynthetic gene cluster such as AscA
  • AscA A transformant having a construct inserted therein and transformed so as to express the inserted gene (hereinafter also referred to as “transformant (2)”).
  • the host organism is an organism that can produce ascochlorin and ascofuranone, such as Acremonium and sclerotigenum
  • the inserted gene is constantly expressed higher than forced or endogenous expression. It is desirable that the condition is expressed in the later stage of the culture after cell growth.
  • Such a transformant is not substantially produced or produced in the host organism by culturing or growing under conditions suitable for the host organism or transformant by the action of a transcription factor having an altered expression level.
  • a very small amount of iricicholine A, ascochlorin, or ascofuranone can be produced in a detectable amount or more.
  • a specific embodiment of the transformant is a transformant using Aspergillus soya as a host organism, and the genes ascF, ascE, ascD, ascB and ascC are inserted in addition to the genes ascI, ascJ and ascK. And a transformant that expresses the inserted gene; in addition to the genes ascI, ascJ, and ascK, a transformant in which the gene ascF is inserted and expresses the inserted gene There is, but is not limited to this.
  • a specific embodiment of the transformant is a transformant having Acremonium sclerotigenum, Neolectria ditisima, Trichoderma reesei, etc. as a host organism, wherein any one or more genes of ascA to I are Although it is a transformant inserted and expressing the inserted gene, it is not limited to this.
  • knockout organism One aspect of the knockout organism is a gene from a wild-type organism having the genes ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG and ascI, which produces both ascochlorin and ascofuranone, such as Acremonium sclerotigenum.
  • a knockout organism (hereinafter also referred to as “knockout organism (1)”) obtained by knocking out ascG. Since such knockout organisms do not express AscG protein, an enzyme involved in biosynthesis of ascochlorin, they can only produce ascofuranone or ascofuranone precursor instead of ascochlorin. Compared to the above, there is a possibility of producing a large amount of ascofuranone or ascofuranone precursor.
  • knockout organism is a gene ascF from a wild-type organism having the genes ascB, ascC, ascD, ascE and ascF producing ascochlorin or ascochlorin precursors such as Acremonium sclerotigenum and Onectria ditisima.
  • knockout organism (2) By culturing or growing such knockout organisms under conditions suitable for wild-type organisms, there is a possibility of producing iricicholine A in a larger amount than wild-type organisms.
  • knockout organism (3) Another aspect of the knockout organism is a wild type organism having the genes ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG and ascI, which produce both ascochlorin and ascofuranone such as Acremonium sclerotigenum, or A knockout organism (hereinafter also referred to as “knockout organism (3)”) obtained by knocking out the gene ascI from a wild-type organism having genes ascB, ascC, ascD, ascE, ascF, ascG and ascI, such as Ditishima. is there.
  • knockout organism Another aspect of the knockout organism is that the gene aslicB, ascC, ascD, ascE, which produces an iricicholine A derivative, such as Trichoderma reesei, and the wild-type organism having a gene involved in biosynthesis after iricicholine A, iricicholine A or later A knockout organism (hereinafter also referred to as “knockout organism (4)”) obtained by knocking out a gene involved in biosynthesis.
  • knockout organism (4) A knockout organism obtained by knocking out a gene involved in biosynthesis.
  • the production method of one embodiment of the present invention includes at least a step of obtaining iricicholine A, ascochlorin, or ascofuranone by culturing the transformant (1) or the transformant (2) under conditions suitable for host cells. , Iricicholine A, ascochlorin or ascofuranone.
  • the method of allowing iricicholine A to act on the transformant is not particularly limited as long as it is a method in which iricicholine A and the transformant are brought into contact with each other so that ascochlorin or ascofuranone can be produced by the enzyme of the transformant.
  • a method for producing ascochlorin by culturing a transformant under a culture condition suitable for growth of the transformant using a medium containing iricicholine A and suitable for the growth of the transformant Etc.
  • the culture method is not particularly limited.
  • a solid culture method or a liquid culture method performed under aerated or non-aerated conditions can be used.
  • a precursor of iricicholine A, ascochlorin or ascofuranone such as LL-Z1272 ⁇ or iricicholine A is extracted from the transformant (1) or the transformant (2).
  • a method for producing iricicholine A, ascochlorin or ascofuranone, comprising at least a step of obtaining iricicholine A, ascochlorin or ascofuranone by allowing an enzyme to act.
  • the production method of another aspect of the present invention includes at least a step of obtaining an ascofuranone or an ascofuranone precursor by culturing the knockout organism (1) under conditions suitable for wild-type organisms. It is a manufacturing method of a precursor.
  • the production method of another aspect of the present invention includes at least a step of obtaining iricicholine A by culturing or growing the knockout organism (2) or (4) under conditions suitable for wild-type organisms. It is a manufacturing method.
  • the production method according to another aspect of the present invention includes at least a step of obtaining ascochlorin or an ascochlorin precursor by culturing or growing the knockout organism (3) under conditions suitable for wild-type organisms. Or it is a manufacturing method of an ascochlorin precursor.
  • the medium is a normal medium for culturing host organisms and wild-type organisms (hereinafter collectively referred to as “host organisms”), that is, carbon sources, nitrogen sources, minerals, and other nutrients in appropriate proportions. Any of a synthetic medium and a natural medium can be used.
  • the host organism or the like is an Acremonium microorganism or an Aspergillus microorganism, a GPY medium as described in Examples described later can be used, but is not particularly limited.
  • the culture conditions for transformants and knockout organisms may be culture conditions such as host organisms ordinarily known by those skilled in the art.
  • the host organism is a filamentous fungus such as Acremonium or Aspergillus
  • the initial pH of the medium is adjusted to 5 to 10
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C.
  • the culture time is several hours to several days, preferably 1 It can be appropriately set such as ⁇ 7 days, more preferably 2-4 days.
  • the culture means is not particularly limited, and aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture, and the like can be adopted, but culture is preferably performed under conditions that provide sufficient dissolved oxygen.
  • a culture medium and culture conditions for culturing Acremonium microorganisms or Aspergillus microorganisms shaking culture at 30 ° C. and 160 rpm for 3 to 5 days using a GPY medium described in Examples described later. Is mentioned.
  • the method for extracting a target product (isoprenoid) such as ascochlorin, ascofuranone, and iricicholine A from the culture after the culture is completed is not particularly limited.
  • a target product such as ascochlorin, ascofuranone, and iricicholine A
  • the cells recovered from the culture by filtration, centrifugation, or the like may be used as they are, or the cells recovered after drying and further crushed cells may be used.
  • the method for drying the cells is not particularly limited, and examples thereof include freeze drying, sun drying, hot air drying, vacuum drying, aeration drying, and reduced pressure drying.
  • the extraction solvent is not particularly limited as long as the target product can be dissolved.
  • organic solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, and acetone; hydrous organic solvents obtained by mixing these organic solvents and water; water, hot water, and Hot water etc. are mentioned.
  • the target product is extracted as appropriate while subjecting the cells to disruption.
  • a method of destroying bacterial cells using a disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, a dynomill, or a mortar
  • a cell cell wall using a cell wall lytic enzyme such as yatalase Method of dissolving
  • the cells may be subjected to cell disruption treatment such as a method of dissolving cells using a surfactant such as SDS or Triton X-100.
  • a surfactant such as SDS or Triton X-100.
  • the obtained extract is centrifuged, filtered, ultrafiltered, gel filtered, separated by solubility difference, solvent extraction, chromatography (adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography).
  • the target product can be purified by subjecting it to purification treatment such as reverse phase chromatography, crystallization, activated carbon treatment, membrane treatment, etc.
  • the method according to one embodiment of the present invention includes expressing AscA protein or gene ascA in a filamentous fungus having any one or more genes of ascB to ascK, or an ascochlorin biosynthesis gene and / or an ascofuranone biosynthesis gene. It is a method of increasing the production of isoprenoids by a filamentous fungus, including the step of increasing the production of isoprenoids by the filamentous fungus by enhancing.
  • the method of another aspect of the present invention includes the step of obtaining an isoprenoid by enhancing the expression of AscA protein or gene ascA in a filamentous fungus having an ascochlorin biosynthesis gene and / or an ascofuranone biosynthesis gene.
  • This is a method for producing an isoprenoid.
  • Another embodiment of the present invention is a method for producing an isoprenoid comprising a step of obtaining an isoprenoid by culturing a transformant transformed so that expression of the gene ascA is enhanced.
  • the means for enhancing the expression of AscA protein or gene ascA is not particularly limited.
  • a filamentous fungus to be used a transformant transformed so as to enhance the expression of gene ascA is used;
  • filamentous fungi having a chlorin biosynthetic gene and / or an ascofuranone biosynthetic gene to enhance the expression of the gene ascA inherent in the filamentous fungus by adjusting the culture conditions or introducing other transcription factors And the like.
  • Whether or not the production of isoprenoids by the filamentous fungus is increased is, for example, that of the filamentous fungus having an ascochlorin biosynthesis gene and / or an ascofuranone biosynthesis gene that does not take measures to enhance the expression of the AscA protein or the gene ascA. Confirmation is made by comparing the amount of isoprenoid produced and the amount of isoprenoid produced by a filamentous fungus having an ascochlorin biosynthetic gene and / or an ascofuranone biosynthetic gene with a means for enhancing the expression of the AscA protein or gene ascA be able to.
  • Isoprenoids such as ascochlorin, ascofuranone, and iricicholine A obtained using the gene, transformant, knockout organism, and production method of one embodiment of the present invention have antiprotozoal activity, antitumor activity, blood glucose lowering effect, blood It is a functional biological substance that can be expected to have various physiological activities such as an intermediate lipid lowering action, glycation-inhibiting action, antioxidant action, etc., and by utilizing its characteristics, it manufactures pharmaceuticals, quasi drugs, etc. and these products It can be used as a raw material.
  • RNA 6000 pico kit and Agilent 2100 bioanalyzer system both manufactured by Agilent.
  • RNA sequence analysis of the obtained cDNA library was performed as follows using a system of Thermo Fisher Scientific.
  • the obtained cDNA libraries were each diluted to 20 pmol / L, and the libraries were amplified by emulsion PCR using Ion OneTouch 2.
  • the amplified library was concentrated using Ion OneTouch ES, and RNA sequence analysis was performed using Ion PGM system.
  • Ion PGM Template OT2 200 Kit was used for Ion OneTouch 2
  • Ion PGM sequencing 200 Kit v2 was used for Ion PGM.
  • Ion PGM Ion 316 v2 chip was used for RNA sequencing.
  • the obtained sequence information was mapped to the genome sequence database of Acremonium sclerotigenum, and the difference in gene expression level between the two samples was analyzed.
  • the expression magnification between the high production sample and the low production sample is calculated. Calculated.
  • AscA to H were predicted to have the functions shown in Table 1.
  • AscA was considered to be a transcription factor
  • Ascfuranone biosynthesis involves AscB to H protein (SEQ ID NOs: 11 to 17) encoded by genes ascB to H (SEQ ID NOs: 1 to 7).
  • a promoter sequence of translation elongation factor gene tef1 Ptef (upstream 748 bp of tef1 gene, SEQ ID NO: 25) is used as a promoter, and alkaline protease gene alp
  • the terminator sequence Talp 800 bp downstream of the alp gene, SEQ ID NO: 26
  • a transformation marker gene pyrG (1,838 bp including upstream 407 bp, coding region 896 bp and downstream 5,35 bp, SEQ ID NO: 27) that complements uracil / uridine requirement was used.
  • 5 ′ homologous recombination sequence (5′arm), Ptef, asc gene, Talp, homologous sequence for marker recycling (homologous sequence with downstream gene; loop out region), pyrG, 3 ′ homologous recombination sequence (3′arm) ) was used as transformation DNA to perform pyrG marker recycling, and each asc gene expression cassette was inserted in the order of ascD, ascB, ascC, and ascE onto the chromosome of Aspergillus sojae.
  • In-Fusion HD HD Cloning Kit (Clontech) was used for ligation of each DNA.
  • each DNA fragment was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 31 and 32 and ascD using the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34, respectively.
  • 15 bp of a sequence homologous to Ptef is added to the 5 ′ end of the forward primer for gene ascD, it becomes possible to link Ptef and gene ascD by In fusion reaction.
  • GPY medium supplemented with 1% (w / v) NaCl (2% (w / v) glucose, 1% (w / v) polypeptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% % (W / v) monopotassium dihydrogen phosphate, 0.05% (w / v) magnesium sulfate heptahydrate) to As-D, As-DB, As-DBC and As-DBCE strains was inoculated and cultured at 30 ° C. for 4 days. After the cultured cells were collected on a filter paper, water was removed by suction filtration.
  • the collected cells were immersed in acetone overnight and filtered to obtain an acetone extract of As-DBCE strain.
  • the obtained acetone extract was concentrated to dryness, dissolved in methanol, and then subjected to HPLC analysis and MS analysis (negative mode).
  • a new strain that was not found in the host strain (NBRC4239 strain) was found in the As-D strain.
  • the peak was confirmed at the same elution position as the standard o-orceric acid.
  • a new peak that was not observed in the As-D strain was confirmed in the As-DB strain, and as a result of MS analysis, it was found that the m / z value of the peak was 371 corresponding to iricicolinic acid B.
  • TSKgel ODS-100V manufactured by TOSOH
  • TOSOH a mobile phase (1 ml / min) of methanol: water: acetic acid (450: 50: 10) and a particle diameter of 3 ⁇ m, 4.6 mm ⁇ 100 mm. Performed using an ODS column.
  • the pyrG3 gene is a selectable marker gene in which the promoter region in pyrG is modified to reduce the expression level in order to incorporate an arbitrary gene into a chromosome in multiple copies in a filamentous fungus.
  • the LC / MS analysis shows that the peak compound shows the same m / z value 389 (negative mode) as the iricicholine A standard product, and the LC / MS / MS analysis also shows the same peak pattern as the iricicholine A standard product.
  • iricicholine A was biosynthesized by the expressed AscD, AscB, AscC and AscE proteins.
  • the peak visible at the elution position of about 7 minutes matches the elution position with the peak confirmed in the As-DBC strain.
  • m / z of LL-Z1272 ⁇ It was found to agree with the value.
  • the AscF expression cassette was introduced by sequentially introducing an expression cassette containing any of the genes ascF, ascG and ascH of SEQ ID NOs: 22 to 24 whose codons were modified for the expression of Neisseria gonorrhoeae.
  • acetonitrile + 0.1% (v / v) formic acid is liquid A
  • water + 0.1% (v / v) formic acid is liquid B
  • liquid A is in a gradient of 40 to 100% (50 min).
  • the analysis was performed using an ODS column of L-column 2 ODS (particle size: 3 ⁇ m, 2.1 mm ⁇ 100 mm; manufactured by Chemical Substance Evaluation Research Corporation) at a flow rate of 0.25 ml / min.
  • As-F strain As-G strain into which aspergillus soja NRRC4239 strain pyrG-disrupted strain is introduced any of the expression cassettes of genes ascF, ascG and ascH of SEQ ID NOS: 22 to 24 whose codons have been modified for the expression of koji mold And As-H strains were produced.
  • plasmid DNA in which Ptef-asc gene-Talp-pyrG3 was inserted into pUC19 was used as DNA for transformation.
  • Aspergillus soja NRRC 4239 strain wild strain
  • As-F strain As-G strain
  • As-H strain were each cultured in GPY medium for 1 day, and after removing the water of the cultured cells, liquid nitrogen was used. The cells were frozen and the cells were crushed with a multi-bead shocker. By adding 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.0) to the crushed cells, the crude enzyme solutions of the wild strain, As-F strain, As-G strain and As-H strain were extracted.
  • reaction solutions (1) to (4) were prepared using the obtained crude enzyme solution (for 5 to 10 mg of bacterial cells):
  • Wild strain reaction solution crude enzyme solution of wild strain, standard product of iricicholine A, mixed solution of 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2
  • As-F reaction solution As-F strain Crude enzyme solution, standard product of iricicholine A, mixed solution of 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2
  • As-FG reaction solution crude enzyme solution of As-F strain, crude enzyme of As-G strain Solution, standard product of iricicholine A, mixed solution of 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2
  • As-FGH reaction solution crude enzyme solution of As-F strain, crude enzyme solution of As-G strain, Crude enzyme solution of As-H strain, standard
  • reaction solutions (1) to (4) were each reacted overnight at room temperature. Next, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was concentrated to dryness, and then subjected to LC / MS analysis.
  • LC analysis was performed using a column of L-column 2 ODS (particle size: 3 ⁇ m, 2.1 mm ⁇ 100 mm; manufactured by Chemical Substance Evaluation and Research Institute), acetonitrile + 0.1% (v / v) formic acid as liquid A, water + 0 .1% (v / v) formic acid was used as B solution, and the A analysis was performed at a flow rate of 0.25 ml / min under gradient conditions of 40% to 100% (50 min), and MS analysis was performed in negative mode.
  • FIG. 4A a new peak that was not visible in the wild-type reaction solution was confirmed at the m / z value 423 in the As-F reaction solution.
  • FIG. 4B a new peak that was not observed in the As-F reaction solution was confirmed at an m / z value of 405 in the As-FG reaction solution.
  • FIG. 5 a new peak that was not observed in the As-FG reaction solution or the As-FG reaction solution was confirmed at an m / z value of 403 in the As-FGH reaction solution.
  • the gene cluster predicted to be involved in ascofuranone biosynthesis was found to be an ascochlorin biosynthesis gene cluster.
  • a predicted biosynthesis scheme of ascochlorin is shown in FIG.
  • the biosynthetic pathway of ascochlorin was found to be completely different from the biosynthetic pathway of ascofuranone, although there was some overlap. From this, it was found that the product produced by the transformant into which the biosynthesis gene cluster of ascochlorin was introduced was ascochlorin and not ascofuranone.
  • As-I strain, As-J strain and As-K strain were prepared by introducing any of the expression cassettes of genes ascI, ascJ and ascK of SEQ ID NOs: 8 to 10 against the pyrG-disrupted strain of Aspergillus soja NRRC4239 strain .
  • plasmid DNA in which Ptef-asc gene-Talp-pyrG was inserted into pUC19 was used as DNA for transformation.
  • Each of the As-F strain, As-I strain, As-J strain and As-K strain was cultured in GPY medium for 1 day, and after removing the water from the cultured cells, it was frozen in liquid nitrogen, and multi-beads. The cells were crushed with a shocker. By adding 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to the crushed cells, crude enzyme solutions of As-F, As-I, As-J and As-K strains were extracted.
  • reaction solutions (1) to (7) were prepared using the obtained crude enzyme solution (for 5 to 7.5 mg of bacterial cells):
  • As-F reaction solution crude enzyme solution of As-F strain, standard product of iricholine A, mixed solution of 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2
  • As-FI reaction solution As-FI Crude enzyme solution of F strain, crude enzyme solution of As-I strain, standard product of iricicholine A, mixed solution of 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2
  • As-FIJ reaction solution As-F strain Crude enzyme solution, As-I strain crude enzyme solution, As-J strain crude enzyme solution, iricicholine A standard, 1 mM NADPH, 1 mM NADH, 1 mM ATP and 3 mM MgCl 2 mixed solution
  • As-FIK Reaction solution crude enzyme solution of As-F strain,
  • reaction solutions (1) to (7) were reacted at 30 ° C. for 1 hour. Next, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was concentrated to dryness, and then subjected to LC / MS analysis.
  • acetonitrile + 0.1% (v / v) formic acid is liquid A
  • water + 0.1% (v / v) formic acid is liquid B
  • liquid A is in a gradient of 40 to 100% (50 min).
  • the analysis was performed using a TSK-gel ODS-100V 3 ⁇ m column (4.6 mm ID ⁇ 150 mm) at a flow rate of 0.5 ml / min. The results are shown in FIG.
  • the ascG-disrupted strain can produce only ascofuranone at a high level, and the ascI-disrupted strain can produce only ascochlorin at a high level. Be able to produce.
  • the ascI-disrupted strain produces only ascochlorin, and iricicholine A epoxide, which should have been supplied to the biosynthesis pathway of ascofuranone, can also be used for ascochlorin production. It was thought that the property improved. Therefore, an ascG-disrupted strain and an ascl-disrupted strain of Acremonium sclerotigenum were prepared, and the above hypothesis was verified.
  • the ku70 / pyG double disruption strain was prepared by (1) obtaining a pyrG disruption strain, (2) obtaining a ku70 disruption strain using a pyrG marker, (3) obtaining a ku70 / purG double disruption strain by pyrG marker recycling, It was decided to do in the procedure.
  • a DNA fragment for preparing a pyrG-disrupted strain was prepared as follows. PCR is performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 as a template, a DNA fragment of about 3 kb upstream of the pyrG ORF (5'pyrG), and a DNA fragment of about 1.7 kb downstream from the 147th base of the pyrG ORF. (3'pyrG), Ttef (SEQ ID NO: 44) were amplified. The hygromycin resistance gene (hygr) was amplified by PCR using Linear Hygromycin Marker (Takara) as a template. Next, each amplified DNA fragment was ligated by In fusion reaction to prepare a DNA fragment for producing a pyrG-disrupted strain consisting of 5'pyrG-hygr-Tef-3'pyrG.
  • the protoplasts after PEG treatment were layered on a regenerating agar medium (3.5% Czapek bolt, 1.2 M sorbitol, 20 mM uracil, 20 mM uridine, 2% Agar) and cultured at 25 ° C. overnight. 5 mL of regeneration agar medium (0.7% Agar) containing 2 mg / L of 5FOA and 100 mg / L of hygromycin is further overlaid, cultured at 30 ° C. for 2 to 3 weeks, colony PCR after inoculating several times The target pyrG disruption strain was selected by the above.
  • a DNA fragment for producing a ku70-disrupted strain was prepared as follows. PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 as a template, and a DNA fragment (5'ku70) upstream of the KU70 ORF (SEQ ID NO: 45), downstream from the 207th base of the KU70 ORF.
  • the protoplasts after PEG treatment were layered on a regenerating agar medium (3.5% Czapek-Dox broth, 1.2 M sorbitol, 0.1% trace element, 2% Agar) and cultured at 30 ° C. for about 5 days.
  • the target ku70-disrupted strain was selected by colony PCR after planting several times.
  • an ascG-disrupted strain-producing DNA fragment was prepared as follows. PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 as a template, and a DNA fragment (5'ascG) upstream from base 400 of the ascG ORF, about 2.5 kb downstream of the ORF of ascG.
  • a DNA fragment (3′ascG), a DNA fragment (LO2) of about 0.9 kb upstream of 5′ascG for recycling the pyrG marker, and the pyrG gene (SEQ ID NO: 46) were amplified.
  • each amplified DNA fragment was ligated by In fusion reaction to prepare a DNA fragment for producing an ascG-disrupted strain consisting of 5′ascG-pyrG-LO2-3′ascG.
  • the ascG-disrupted strain was prepared by introducing the ascG-disrupted strain-producing DNA fragment into the ku70 / pyrG double-disrupted strain of the Acremonium sclerotigenum F-1392 strain prepared above by the protoplast-PEG method. did.
  • the protoplasts after PEG treatment were layered on a regenerating agar medium (3.5% Czapek-Dox broth, 1.2 M sorbitol, 0.1% trace element, 2% Agar) and cultured at 30 ° C. for about one week.
  • the target ascG-disrupted strain was selected by colony PCR after planting several times.
  • an ascl disruption strain DNA fragment was prepared as follows. PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 as a template, and a DNA fragment (5′ascI) upstream of the ORF of ascI, about 1.5 kb downstream from the 905th base of the ORF of ascI. A DNA fragment (3′ascI) and a pyrG gene (SEQ ID NO: 46) were amplified.
  • each amplified DNA fragment was ligated by an Infusion reaction to prepare a DNA fragment for producing an ascI-disrupted strain consisting of 5′ascI-pyrG-3′ascI.
  • the ascI-disrupted strain was prepared by introducing the ascI-disrupted strain-producing DNA fragment into the ku70 / pyrG double-disrupted strain of Acremonium sclerotigenum F-1392 prepared as described above by the protoplast-PEG method. did.
  • the protoplasts after PEG treatment were layered on a regenerating agar medium (3.5% Czapek-Dox broth, 1.2 M sorbitol, 0.1% trace element, 2% Agar) and cultured at 30 ° C. for about one week. Then, after planting several times, the target ascI-disrupted strain was selected by colony PCR.
  • Acremonium sclerotigenum F-1392 strain (wild strain) and the prepared ascI-disrupted strain were cultured in a GPY liquid medium for 3 days at 25 ° C. And inoculated at 180 rpm for 4 days at 180 rpm. Acetone extraction treatment was performed on 100 mg of cultured cells, and HPLC analysis was performed. As a result, it was found that in the ascI-disrupted strain, the ascofuranone peak disappeared and only ascochlorin was produced. Moreover, it turned out that the production amount of ascochlorin per microbial cell is higher than a wild strain.
  • an ascF-disrupted strain-producing DNA fragment was prepared as follows.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 as a template, and a DNA fragment of about 1.5 kb upstream of the ORF of ascF (5′ascF), a DNA fragment of about 2 kb downstream of the ORF of ascF (3 'ascF), a DNA fragment (LO3) of about 1.5 kb downstream of 3'ascF for recycling the pyrG marker, the pyrG gene (SEQ ID NO: 46) was amplified. Next, the amplified DNA fragments were ligated by an Infusion reaction to prepare a DNA fragment for producing an ascF-disrupted strain comprising 5′ascF-LO3-pyrG-3′ascF.
  • the ascF-disrupted strain was prepared by introducing a DNA fragment for preparing an ascF-disrupted strain into the ku70 / pyrG double-disrupted strain of the Acremonium sclerotigenum F-1392 strain prepared above by the protoplast-PEG method. did.
  • the protoplasts after PEG treatment were layered on a regenerating agar medium (3.5% Czapek-Dox broth, 1.2 M sorbitol, 0.1% trace element, 2% Agar) and cultured at 30 ° C. for about one week.
  • the target ascF-disrupted strain was selected by colony PCR after planting several times.
  • Acremonium sclerotigenum F-1392 strain (wild strain) and the prepared ascF-disrupted strain were cultured in a GPY liquid medium for 3 days at 25 ° C., and the preculture was added in an amount of 10% to a medium for high production of ascofuranone. And inoculated at 180 rpm for 4 days at 180 rpm. Acetone extraction treatment was performed on 100 mg of cultured cells, and HPLC analysis was performed. As a result, it was confirmed that a large amount of iricicholine A was accumulated in the ascF-disrupted strain.
  • Tr-ascC AscC gene of SEQ ID NO: 53
  • Tr-ascC was cloned by PCR using the genomic DNA of Trichoderma reesei NBRC31329 strain purchased from NITE as a template and the primers of SEQ ID NOs: 51 and 52.
  • the Tr-ascC gene of SEQ ID NO: 53 is a base sequence containing an intron, but as a result of intron prediction, it was considered to encode the AscC protein of SEQ ID NO: 48.
  • Tr-ascC was ligated in the same manner as described above to prepare a DNA for transformation of 5'arm-Pef-Tr-ascC-Talp-pyrG-3'arm.
  • the 5′arm-Ptef-Tr-ascC— of the DNA for transformation was transformed into the strain obtained by recycling the pyrG marker of the As-DB strain into which the ascD and ascB genes derived from acremonium were prepared.
  • Talp-pyrG-3'arm an As-DB-Tr-C strain into which each copy of an expression cassette containing ascD and ascB derived from Acremonium and further ascC derived from Trichoderma was introduced. I got it.
  • GPY medium 2% (w / v) glucose, 1% (w / v) polypeptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) dihydrogen phosphate 1
  • the As-DB-Tr-C strain was inoculated into potassium (0.05% (w / v) magnesium sulfate heptahydrate) and cultured at 30 ° C. for 4 days. After the cultured cells were collected on a filter paper, water was removed by suction filtration.
  • Tr-ascC gene of SEQ ID NO: 53 has the same function as the ascC gene derived from Acremonium, as expected, so that Trichoderma-derived SEQ ID NOs: 47 to 50 are biosynthesis enzymes of iricicholine A.
  • Neonekutoria-Ditishima Neonecrtria ditissima
  • AscB ⁇ AscH of SEQ ID NO: 35-41 from even sequence identity with AscB ⁇ ASCH from Acremonium is in all 60% or more, and each of the encoding genes genome Since it is adjacent in the above, it was considered that the enzyme group is an ascochlorin biosynthetic enzyme.
  • Tr-ascD The ascD gene (Tr-ascD) of SEQ ID NO: 57 was cloned by PCR using the genome of Trichoderma reesei NBRC31329 strain purchased from NITE as a template and the primers of SEQ ID NOs: 55 and 56.
  • the ascB gene (Tr-ascB) of SEQ ID NO: 60 was cloned using the primers of SEQ ID NOs: 58 and 59.
  • the Tr-ascD gene of SEQ ID NO: 57 is a nucleotide sequence containing an intron, but as a result of intron prediction, it was considered to encode the AscD protein of SEQ ID NO: 49.
  • Tr-ascD and Tr-ascB are ligated in the same manner as described above, so that 5'arm-Pef-Tr-ascD-Talp-loopout region-pyrG-3'arm and 5'arm-Ptef-Tr- DNA for transformation of ascB-Talp-loop out region-pyrG-3′arm was prepared.
  • the pyrG-disrupted strain / Ku70-disrupted strain of Aspergillus sojae is transformed using 5'arm-Ptef-Tr-ascD-Talp-loopout region-pyrG-3'arm for DNA for transformation.
  • an As-Tr-D strain into which an expression cassette containing ascoD derived from Trichoderma was introduced one by one was obtained. Furthermore, by transforming the As-Tr-D strain pyrG recycled with 5'arm-Ptef-Tr-ascB-Talp-loop out region-pyrG-3'arm, it is derived from Trichoderma As-Tr-DB strain was obtained in which one copy of each expression cassette containing ascD and ascB was introduced.
  • GPY medium (2% (w / v) glucose, 1% (w / v) polypeptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) dihydrogen phosphate 1 As-Tr-DB strain (trichoderma-derived ascD and ascB gene insertion strain) and As-DB strain (acremonium-derived ascD and ascB gene insertion) in potassium, 0.05% (w / v) magnesium sulfate heptahydrate) was inoculated and cultured at 30 ° C. for 4 days. After the cultured cells were collected on a filter paper, water was removed by suction filtration.
  • Tr-ascD gene and the Tr-ascB gene of SEQ ID NOs: 57 and 60 have the same functions as the ascD gene and ascB gene derived from Acremonium as expected.
  • the As-DBC-Tr-E strain and the As-DBC strain were inoculated into GPY medium supplemented with 5% NaCl, and cultured at 30 ° C. for 4 days.
  • the cultured cells were collected in the same manner as described above, extracted with acetone, and subjected to HPLC analysis of the acetone extract.
  • HPLC acetonitrile + 0.1% (v / v) formic acid is liquid A
  • water + 0.1% (v / v) formic acid is liquid B
  • liquid A is in a gradient of 80 to 95% (15 min).
  • Ascofuranone biosynthetic pathway was predicted to biosynthesize ascofuranone by reacting in the order of Iricicoline A epoxide, AscI, AscJ and AscK, but the product of AscI and the product of AscJ were unidentified. Therefore, when the ascG-disrupted strain / ascJ-disrupted strain was prepared using the ascG-disrupted strain as a parent strain and the ascG-disrupted strain as a parent strain, a new peak that was not found in the ascG-disrupted strain was detected.
  • a strain in which the ascI gene of SEQ ID NO: 8 was highly expressed using the acremonium-derived tef1 promoter of SEQ ID NO: 62 and the acremonium-derived tef1 terminator of SEQ ID NO: 63 was obtained. It was prepared and cultured in Ascofuranone high production medium at 28 ° C. for 4 days using a 100 ml culture apparatus (Bio Jr. 8) manufactured by Biott under the conditions of 400 rpm and 0.5 vvm.
  • Neontoria ditissima has a genome encoding a homologue of AscB to H (SEQ ID NO: 35 to 41) having 60% or more sequence identity with AscB to H derived from Acremonium of SEQ ID NOs: 11 to 17. It was found to have on.
  • the gene sequences on the public database are not completely assembled, at least four genes encoding AscB, AscC, AscE and AscF exist adjacently, and Since two genes encoding AscG and AscH are adjacent to each other, it was considered that a cluster was formed.
  • AscG having a function as a terpene cyclase has no known domain and is a characteristic enzyme in biosynthesis of ascochlorin
  • SEQ ID NO: 35 to 41 could be determined whether or not is an ascochlorin biosynthetic enzyme. Therefore, in the ascG-disrupted strain of Acremonium sclerotigenum F-1392 obtained as described above, the function of AscG derived from Acremonium sclerotigenum can be complemented by expressing AscG derived from Neonectria of SEQ ID NO: 40. I decided to verify that.
  • a high expression cassette of AscG derived from NeoNectria of SEQ ID NO: 40 comprising an acremonium-derived tef1 promoter of SEQ ID NO: 62 and an acremonium-derived tef1 terminator of SEQ ID NO: 63, is used. Introduced. Note that the gene sequence Nd-ascG gene (SEQ ID NO: 64) encoding AstecG derived from NeoNectria of SEQ ID NO: 40 was obtained by artificial gene synthesis.
  • a strain ( ⁇ ascG / ⁇ ascH + Nd-ascG strain) in which the Nd-ascG gene is expressed with respect to the double gene disrupted strain of ascG and ascH is cultured in an ascofuranone high production medium in the same manner as described above, and the cells after the cultivation HPLC analysis of the acetone extract of was performed.
  • the production amount of ascofuranone and iricicholine A epoxide was decreased in the strain expressing the Nd-ascG gene, and a new compound not detected in the strain not expressing the Nd-ascG gene. The peak was detected.
  • this compound was detected at the same elution position as the compound (iricicholine C) having an m / z value of 405, which was specifically confirmed in the above in vitro As-FG reaction solution, and as a result of mass spectrometry (MS), The m / z value of this compound was found to be 405. Therefore, it was shown that the Neoscria-derived AscG of SEQ ID NO: 40 has the same function as the Acremonium-derived AscG.
  • Nd-AscI which is an AscI homolog (SEQ ID NO: 67) having 53% sequence identity with Acremonium-derived AscI (SEQ ID NO: 18) upstream of the gene encoding the AscH homolog derived from Neonectria. It was found that the gene coding for exists. In this is Neonectria ditissima, suggests that the gene encoding the Nd-AscI form a Nd-AscA, gene clusters encoding Nd-ASCG and Nd-AscH, Nd-AscI is ascochlorin And is likely to be a biosynthetic enzyme of a compound related to an ascochlorin intermediate.
  • NeoNectria-derived AscI homologue of SEQ ID NO: 67 has the same function as Acremonium-derived AscI.
  • the gene encoding the homologue of AscJ from Acremonium (SEQ ID NO: 19) and ASCK (SEQ ID NO: 20), in Neonectria ditissima genes encoding Nd-AscI, Nd-AscA, the Nd-ASCG and Nd-ASCH It did not exist near the cluster region.
  • Asc homologues derived from Trichoderma and NeoNectria they are highly identical to Acremonium-derived Asc enzymes, have the same domain, and are located in the vicinity of the genome, forming clusters. In such a case, it can be said that the possibility of having the same function as the Acremonium-derived Asc enzyme is high.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium sclerotigenum F-1392 strain as a template, the tef1 gene promoter (Ptef) of SEQ ID NO: 62, the gene ascA of SEQ ID NO: 65, the tef1 gene terminator (Ttef) of SEQ ID NO: 44 Then, the pyrG gene of SEQ ID NO: 46 was cloned and ligated by In fusion reaction to prepare an ascA forced expression vector in which the asfA forced expression cassette of Ptef-ascA-Tef-pyrG was inserted into pUC19.
  • the gene ascA of SEQ ID NO: 65 is a base sequence containing an intron, but as a result of RNA sequencing, it was found that the AscA protein encoded by the gene ascA consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66.
  • An AscA forced expression strain was prepared by introducing an AscA forced expression vector into the pyrG disrupted strain of Acremonium sclerotigenum F-1392 strain prepared above.
  • the wild strain did not produce ascochlorin and ascofuranone at all in the GPY medium.
  • production of both ascochlorin and ascofuranone was confirmed in the AscA forced expression strain.
  • ascochlorin and ascofuranone were produced only in a limited medium in wild strains, and the production amount was greatly different due to slight differences in culture conditions.
  • AscA forced expression strain is used, ascochlorin and ascofuranone can be produced without setting the predetermined culture conditions, and stable industrial production of isoprenoids such as ascochlorin, ascofuranone, and iricicholine A is realized. Can be very useful industrially.
  • sequences listed in the sequence listing are as follows: [SEQ ID NO: 1] ascB [SEQ ID NO: 2] ascC [SEQ ID NO: 3] ascD [SEQ ID NO: 4] ascE [SEQ ID NO: 5] ascF [SEQ ID NO: 6] ascG [SEQ ID NO: 7] ascH [SEQ ID NO: 8] ascI [SEQ ID NO: 9] ascJ [SEQ ID NO: 10] ascK [SEQ ID NO: 11] AscB protein [SEQ ID NO: 12] AscC protein [SEQ ID NO: 13] AscD protein [SEQ ID NO: 14] AscE protein [SEQ ID NO: 15] AscF protein [SEQ ID NO: 16] AscG protein [SEQ ID NO: 17] AscH protein [ SEQ ID NO: 18] AscI protein [SEQ ID NO: 19] AscJ protein [SEQ ID NO: 20] AscK protein [SEQ ID NO: 21] codon-modified
  • the gene, transformant, knockout organism and production method which are one embodiment of the present invention can be used to produce isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin in large quantities. Therefore, the present invention can be used to produce isoprenoids such as ascofuranone, iricicholine A and ascochlorin on an industrial scale.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにそれらの誘導体といったイソプレノイドを高収量で生産することができることから、工業的規模でのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。上記課題は、アスコフラノン、イリシコリンＡもしくはアスコクロリンの生合成遺伝子によって形質転換された形質転換体もしくはこれらの遺伝子のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを得る工程を含む、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドの製造方法などによって解決される。

Description

イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１１日出願の日本特願２０１７－９４５０９号及び２０１８年１月１７日出願の日本特願２０１８－００５８８８号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
本発明は、アスコフラノン、アスコクロリン、イリシコリンＡといったイソプレノイドを合成するための遺伝子並びに該遺伝子を利用したイソプレノイドの製造方法に関する。
人口が密集した地域が点在する日本国を含む先進国及び開発途上国においては、ウイルスや原虫などによる感染症がたびたび問題となる。また、２型糖尿病、高コレステロール血症、癌及びこれらの疾患に起因する合併症などの生活習慣病は、医療費の増大及び労働力の低下などを招き、とりわけ日本国では深刻な問題となっている。
そこで、これらの疾患の治療や予防に対して有効とされる物質の開発が望まれている。そのような物質の一つとして、イソプレノイド系の生理活性物質であるアスコクロリン及びアスコフラノンが知られている。アスコクロリン及びアスコフラノンは、電子伝達系を阻害して細胞内ＡＴＰ濃度を低下することにより、例えば、ツエツエバエによって媒介される原虫トリパノソーマによる原虫感染症であるアフリカ睡眠病の治療や予防に際して有望視されている（例えば、下記特許文献１を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。
アフリカ睡眠病に罹患すると、感染初期に原虫が血流中で増殖する。慢性期に入ると中枢神経が侵されて、精神錯乱や全身の痙攣などの症状を呈し、最終的には嗜眠状態に陥って死に至る。アフリカ睡眠病によるアフリカでの死者は、年間１万人以上であり、潜在的に感染のリスクがある人口は７，０００万人以上といわれている。現在のところ、アフリカ睡眠病に対してワクチンによる予防方法はなく、その治療は薬剤療法に頼っている。しかし、アフリカ睡眠病に対して効果的な治療薬は副作用が強いなどの問題点がある。
そこで、アスコクロリンやアスコフラノンにより、トリパノソーマの電子伝達系を特異的に阻害することによる、アフリカ睡眠病の予防や治療が期待されている。原虫は哺乳類体内に侵入すると、主にグリコソーム内の解糖系でＡＴＰ合成を行い、これにはトリパノソーム・オルターネイティブ・オキシダーゼ（ＴＡＯ）が触媒するＮＡＤ＋の再生が必要であるところ、アスコクロリンやアスコフラノンはこのＴＡＯの働きを阻害する。感染した哺乳類はＴＡＯと同様の酵素を有していないことから、トリパノソーマを特異的に駆除することが可能となる。なお、特にアスコフラノン及びその誘導体は非常に低濃度であってもＴＡＯを阻害することが報告されている。
また、アスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの誘導体には、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用などが存在することが知られている（例えば、下記特許文献２を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。さらに、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成経路の中間体にあるイリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）もまた、高い抗原虫剤（下記特許文献３、該文献の全記載はここに開示として援用される）や、免疫抑制剤、リウマチ治療剤、抗癌剤、拒絶反応治療薬、抗ウイルス薬、抗Ｈ．ピロリ薬及び糖尿病治療薬等（下記特許文献４、該文献の全記載はここに開示として援用される）の作用に基づいて、新たな医薬品の有効成分として期待されている。さらに、イリシコリンＡはアスコクロリンやアスコフラノンのみならず他のイソプレノイドの生合成の中間体としても知られており、それらの原料としても有用な化合物である。
イソプレノイドのうち、アスコフラノンやアスコクロリンの製造方法としては、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）糸状菌を培養し、菌糸中に蓄積したアスコフラノンを分離採取する方法が知られている（例えば、下記特許文献５及び６を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。なお、アスコフラノンの生産株として知られていたアスコキタ・ビシア（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ　ｖｉｃｉａｅ）は、正しくは、アクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）であることが下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される）によって報告されている。
特開平０９－１６５３３２号公報 特開２００６－２１３６４４号公報 国際公開第２０１２／０６０３８７号 国際公開第２０１３／１８０１４０号 特公昭５６－２５３１０号公報 特公昭４５－９８３２号公報
Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）.　２０１６ Ｎｏｖ ２.　Ｒｅ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃｏｆｕｒａｎｏｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ ａｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ.
特許文献５及び６に記載の方法のような、アスコクロリンやアスコフラノンを生産することが知られている糸状菌を用いる方法によれば、これらの物質の収率は使用する糸状菌に大きく依存することになる。しかし、これまでに知られている微生物におけるアスコクロリンやアスコフラノンの含有量は工業的規模の生産量としては少ないこと、さらに該含有量は僅かな培養条件の違いで大きく異なってくることから、既存の方法では大量のアスコクロリンやアスコフラノンの安定生産が実現できないという問題がある。また、イリシコリンＡに至っては、大量に得るための製造方法についてこれまでに知られていない。
例えば、アスコクロリンやアスコフラノン及びその中間体であるイリシコリンＡといったイソプレノイドの大量生産を実現するためには、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株を単離又は育種することや生物工学技術を駆使してイソプレノイドの生合成に関与する遺伝子を挿入した形質転換株を構築することが考えられる。しかし、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株についてはこれまでにほとんど知られておらず、さらにイソプレノイドの生合成経路については不明な部分が依然として多い。
また、イソプレノイドのうち、アスコクロリン、アスコフラノン及びイリシコリンＡの生合成遺伝子についても、未だ不明な部分が多い。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにそれらの誘導体といったイソプレノイドを高収量で安定的に生産することができることから、工業的規模でのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）において、アスコクロリン及びイリシコリンＡの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＢ～遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子）に続いて、アスコフラノンの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＩ～遺伝子ａｓｃＫの３遺伝子）を特定することに成功した。
次に、本発明者らは、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで得られたＤＮＡコンストラクトを宿主生物として、糸状菌の一種であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物やアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物に導入して形質転換することによって、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。さらに、アクレモニウム属微生物のａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩのノックアウト糸状菌を作製することにも成功した。
上記形質転換糸状菌は、通常の糸状菌を培養する方法に準じて培養することができ、その増殖速度などについても宿主生物と格別相違がないものであった。これらのことより、上記形質転換糸状菌やノックアウト糸状菌を用いればアスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを生産し得ることがわかった。
一方で、アスコクロリン生合成遺伝子クラスターにある遺伝子ａｓｃＡは、転写因子であると考えられるため、遺伝子ａｓｃＡを導入して発現させなくとも、アスコクロリンの生合成には影響しないと考えられた。実際に、上記したとおり、遺伝子ａｓｃＡを有していないアスペルギルス属微生物に、遺伝子ａｓｃＢ～遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子を導入した形質転換糸状菌を用いれば、アスコクロリンを生合成し得ることがわかっている。
かかる事実があるにもかかわらず、本発明者らは、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子を有するアクレモニウム・スクレロティゲナムに遺伝子ａｓｃＡを導入することにより、遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。そして、驚くべきことに、この遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を用いることにより、アスコクロリンだけではなく、アスコフラノンもまた大量に生産することができることを見出した。
本発明は上記のような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明の一態様によれば、下記［１］～［１１］の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法が提供される。
［１］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＩ。
（１）配列表の配列番号８に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［２］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドからアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＪ。
（１）配列表の配列番号９に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［３］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＫ。
（１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１０に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号２０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号２０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［４］上記［１］～［３］に記載の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［５］さらに遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、上記［４］に記載の形質転換体。
［６］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＧのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［７］上記［６］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。上記［６］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体の製造方法。
［８］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＦのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［９］上記［８］に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。上記［８］に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体の製造方法。
［１０］上記［１］に記載の遺伝子ａｓｃＩを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＩのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
［１１］上記［１０］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。上記［１０］に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体の製造方法。
また、本発明の別の一態様において、下記［１２］～［２２］の遺伝子、形質転換体及び製造方法が提供される。
［１２］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦ。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１３］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧ。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１４］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＨ。
（１）配列表の配列番号７に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１７又は４１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１７又は４１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１５］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、ＬＬ－Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＥ。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）ＬＬ－Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１４又は３８に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１４又は３８に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１６］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、アセチルＣｏＡからＯ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＤ。
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）アセチルＣｏＡからＯ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１３又は３７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１３又は３７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１７］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、Ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＢ。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）Ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１１又は３５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１１又は３５に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１８］下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＣ。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１２又は３６に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１２又は３６に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［１９］［１２］～［１８］に記載の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［２０］［１９］に記載の形質転換体を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。
［２１］［１９］に記載の形質転換体を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
［２２］［１９］に記載の形質転換体を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。
また、本発明の別の一態様において、下記［２３］～［３１］のタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法が提供される。
［２３］下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有する、ＡｓｃＡタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
［２４］下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかの塩基配列であって、［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＡ。
（Ａ）［２３］に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列
（Ｃ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（Ｄ）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
［２５］［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、［２３］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法。
［２６］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［２５］に記載の方法。
［２７］［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［２８］前記形質転換体は、宿主生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物である、［２７］に記載の形質転換体。
［２９］［１］～［３］及び［１２］～［１８］のいずれか1つ以上の遺伝子を有する糸状菌において、［２３］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２４］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［３０］［２７］～［２８］のいずれか１項に記載の形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［３１］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［２９］又は［３０］に記載の方法。
本発明によれば、高収量のアスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを安定的に製造することができる。その結果、本発明によれば、工業的規模で、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを製造することが期待できる。
図１は、トランスクリプトーム解析により予測されたアスコクロリン生合成遺伝子クラスターを示した図である。 図２は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥ株抽出物及びイリシコリンＡ標準品のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図３は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥ株、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧ株及びＡｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図４Ａは、後述する実施例に記載されているとおりの、野生株反応液及びＡｓ－Ｆ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図４Ｂは、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液及びＡｓ－ＦＧ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図５は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＦＧ反応液及びＡｓ－ＦＧＨ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図６は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示したスキーム図である。 図７は、トランスクリプトーム解析により予測されたアスコフラノン生合成遺伝子クラスターを示した図である。 図８は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液、Ａｓ－ＦＩ反応液、Ａｓ－ＦＩＪ反応液、Ａｓ－ＦＩＫ反応液、Ａｓ－ＦＪＫ反応液、Ａｓ－ＩＪＫ反応液及びＡｓ－ＦＩＪＫ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図９は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液を用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果及びＭＳ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図１０は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｆ反応液、Ａｓ－ＦＩ反応液、Ａｓ－ＦＩＪ反応液、Ａｓ－ＦＩＫ反応液、Ａｓ－ＦＪＫ反応液、Ａｓ－ＩＪＫ反応液及びＡｓ－ＦＩＪＫ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。 図１１は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示した図である。 図１２は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株及びＡｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１３は、後述する実施例に記載されているとおりの、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１４は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－Ｔｒ－ＤＢ株及びＡｓ－ＤＢ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１５は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株及びＡｓ－ＤＢＣ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１６は、イリシコリンＡエポキシドからアスコフラノンに至る反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示したスキーム図である。 図１７は、後述する実施例に記載されているとおりの、ΔａｓｃＧ株及びΔａｓｃＧ－Ｉ株の抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１８は、後述する実施例に記載されているとおりの、ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ株及びΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ＋Ｎｄ－ａｓｃＧ株の抽出物並びにＡｓ－ＦＧ反応液のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。 図１９は、後述する実施例に記載されているとおりの、野生株及びＡｓｃＡ強制発現株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。
以下、本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。また、本発明の技術的範囲は、本明細書における、いかなる憶測や推論に拘泥されるわけではない。
（イソプレノイド）
本明細書における「イソプレノイド」は、通常知られているとおりのイソプレンを構成単位とする化合物であれば特に限定されず、例えば、イリシコリン酸Ｂ（グリフォリン酸）、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ（ＬＬ－Ｚ１２７２β）、イリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ただし、本明細書では、主として、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにこれらの誘導体のことを「イソプレノイド」とよぶ場合がある。また、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリンＡエポキシド、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノールを「アスコクロリン前駆体」、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢを「イリシコリンＡ前駆体」とよぶ場合がある。
本明細書でいう「誘導体」とは、化学合成法、酵素合成法、醗酵法又はそれらを組み合わせた方法などにより、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ、イリシコリンＡ、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノンなどを経由して取得された修飾化合物の全てを含む。ただし、「誘導体」には、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、イリシコリンＢ、イリシコリンＡ、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド、アスコフラノール、アスコフラノンなどを経由せずとも、本明細書記載の酵素のいずれか１つを用いて生合成され得る、上記化合物と類似構造を有する化合物、及びそれらの修飾化合物の全てを含む。アスコフラノン、アスコクロリン、イリシコリンＡやこれらの前駆体は全て、ポリケタチド化合物とテルペノイド化合物がハイブリッドしたメロテルペノイド化合物である。本明細書で示すように、メロテルペノイド化合物は、ＡｓｃＤのようなポリケチド・シンターゼによりポリケチド骨格が生合成された後に、ＡｓｃＢのようなプレニル・トランスフェラーゼによってＣ１０、Ｃ１５、Ｃ２０等のイソプレノイド化合物が転移されることで、ポリケタチド化合物とテルペノイド化合物がハイブリッドされることによって生合成される。つまり、基質特異性を改変した、又は同一性は高いが、基質特異性の異なるＡｓｃＤやＡｓｃＢの組み合わせを変えることにより、種々のイリシコリン酸Ｂ類縁体化合物が生合成され得る。一例として、コレトクロリンＢは、イリシコリンＡのイソプン骨格が１つ短い、つまりＣ１０のモノテルペン構造を有するイリシコリンＡに似た類縁化合物であるが、該化合物は、本明細書のＡｓｃＤ及び特異性を改変したＡｓｃＢ、又は基質特異性の異なるＡｓｃＢと同一性の高い酵素の２つ酵素の反応を組み合わせること、若しくは有機化学合成法によって、イリシコリン酸Ｂのテルペン部分がＣ１０のモノテルペン構造である化合物を取得した後に、さらにＡｓｃＣ、ＡｓｃＥの反応によって合成され得るため、本明細書でいう「誘導体」に含み得る。
（酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列）
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＢは、ｏ－オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（１）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＣは、イリシコリン酸ＢからＬＬ－Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（２）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＤは、アセチルＣｏＡからｏ－オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（３）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＥは、ＬＬ－Ｚ１２７２β からイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（４）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。酵素（４）は、イリシコリン酸Ｂからイリシコリン酸Ａを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であってもよい。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＦは、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（５）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＧは、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（６）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。酵素（６）を用いた反応によってイリシコリンＡエポキシドから生成される化合物はイリシコリンＣである。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＨは、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（７）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＩは、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（８）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応とは、イリシコリンＡエポキシドの水素原子（－Ｈ）をヒドロキシ基（－ＯＨ）に置換する反応をいう。酵素（８）を用いた反応によってイリシコリンＡエポキシドから生成される化合物はヒドロキシイリシコリンＡエポキシドである。
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＪ及びａｓｃＫは、イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、それぞれ「酵素（９）」及び「酵素（１０）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
本発明の技術的範囲はいかなる憶測や推論に拘泥されるわけではないが、酵素（１）はプレニル・トランスフェラーゼと同様の機能を有し；酵素（２）はオキシドリダクターゼと同様の機能を有し；酵素（３）はポリケチド・シンターゼと同様の機能を有し；酵素（４）はハロゲナーゼと同様の機能を有し；酵素（５）はエポキシダーゼとしてのｐ４５０／ｐ４５０リダクターゼと同様の機能を有し；酵素（６）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；酵素（７）はデヒドロゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（８）はモノオキシゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（９）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；及び酵素（１０）はデヒドロゲナーゼと同様の機能を有する蓋然性がある。ただし、後述する実施例に記載があるとおり、酵素（９）及び酵素（１０）は、これらの酵素をコードする遺伝子の両方が発現することにより、ＡｓｃＩタンパク質の反応物からアスコフラノンを合成し得る。本明細書では、具体的な作用機序にかかわらず、２種の酵素をコードする遺伝子が発現することにより特定の反応が生じる場合において、一方の酵素は他方の酵素と「共役する」とよぶ。ただし、酵素（９）は、ヒドロキシイリシコリンＡエポキシドからアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であるといえる。酵素（１０）は、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であるといえる。
本発明の一態様のＡｓｃＡタンパク質は、酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子のうち、1つ以上の遺伝子の発現を増強する活性を有する、タンパク質である。ＡｓｃＡタンパク質は、酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子のうち、1つ以上の遺伝子の発現を増強することによって、これらの遺伝子を含む生物体におけるイソプレノイドの生合成が促進し、もって該生物体によるイソプレノイドの産生が増大する。ＡｓｃＡタンパク質は酵素（１）～（１０）をコードする遺伝子の正の転写因子として機能し得る。なお、ＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子は、アスコクロリン生合成遺伝子又はアスコフラノン生合成遺伝子に含まれ得る。ＡｓｃＡタンパク質は、厳密には転写因子であり、酵素ではないが、本明細書では便宜上ＡｓｃＡタンパク質を酵素として捉え、「酵素（１１）」とよぶ場合がある。
酵素（１）乃至（１１）は、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。
例えば、上記した酵素活性を有する酵素（１）の一態様として配列番号１１、３５及び４７に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（２）の一態様として配列番号１２、３６及び４８に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（３）の一態様として配列番号１３、３７及び４９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（４）の一態様として配列番号１４、３８及び５０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（５）の一態様として配列番号１５及び３９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性する酵素（６）の一態様として配列番号１６及び４０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（７）の一態様として配列番号１７及び４１に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（８）の一態様として配列番号１８に示すアミノ酸配列；上記した酵素活性を有する酵素（９）の一態様として配列番号１９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（１０）の一態様として配列番号２０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（１１）の一態様として配列番号６６に示すアミノ酸配列がある。
配列番号１１～２０及び６６に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアクレモニウム属糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１～１０及び６５に示す塩基配列である。
配列番号３５～４１及び６７に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ　ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＮｄ－ＡｓｃＢ、Ｎｄ－ＡｓｃＣ、Ｎｄ－ＡｓｃＤ、Ｎｄ－ＡｓｃＥ、Ｎｄ－ＡｓｃＦ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ、Ｎｄ－ＡｓｃＨ及びＮｄ－ＡｓｃＩタンパク質と名付けられる。また、Ｎｄ－ＡｓｃＧタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号６４に示す塩基配列である。
配列番号４７～５０に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＴｒ－ＡｓｃＢ、Ｔｒ－ＡｓｃＣ、Ｔｒ－ＡｓｃＤ及びＴｒ－ＡｓｃＥタンパク質と名付けられる。また、Ｔｒ－ａｓｃＣ、Ｔｒ－ＡｓｃＤ及びＴｒ－ＡｓｃＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号５３、５７及び６０に示す塩基配列である。
ＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫタンパク質は、アクレモニウム属、ネオネクトリア属又はトリコデルマ属の染色体ＤＮＡ上に存在するこれらの酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質」や「野生型酵素」と本明細書ではよぶ場合がある。
酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列は、それぞれ上記した酵素（１）乃至（１１）の酵素活性を有するものであれば、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
酵素（１）乃至（１１）を入手する方法は特に限定されないが、例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養し、次いで培養物中の酵素（１）乃至（１１）を回収することを含む方法などが挙げられる。培養物中から酵素（１）乃至（１１）を回収する手段は特に限定されず、例えば、常法に従って、不純物を取り除いた培養物上清から、硫安沈殿などにより酵素（１）乃至（１１）を含むタンパク質濃縮液を得て、次いで酵素（１）乃至（１１）の分子量を指標としたゲルろ過クロマトグラフィーやＳＤＳ－ＰＡＧＥなどを用いることによって、酵素（１）乃至（１１）を単離することができる。なお、配列番号１１～２０及び６６に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質の構成元素から算出される理論分子量は、それぞれ３７０００、１２００００、２３００００、６１０００、１２００００、３１０００、６１０００、５７０００、４２０００、３２０００及び５５０００程度である。
（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子）
遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪａｓｃＫ及びａｓｃＡ（以下、これらを総称して「酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記した酵素活性を有する酵素（１）乃至（１１）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が生物体内で発現することにより酵素（１）乃至（１１）が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が本来の機能や活性、特に酵素活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が生産されることを包含する。
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由して酵素（１）乃至（１１）を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに酵素（１）乃至（１１）を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、上記した酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）　核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）　Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ　、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。該文献の全記載はここに開示として援用される）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から４０個、好ましくは１から３５個、好ましくは１から３０個、好ましくは１から２５個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４又は５個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ活性を有するものである。
また、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、配列番号２１～２４、２８～３０及び６１に記載の塩基配列などが挙げられる。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３、該文献の全記載はここに開示として援用される）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０、該文献の全記載はここに開示として援用される）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７、該文献の全記載はここに開示として援用される）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５、該文献の全記載はここに開示として援用される）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、例えば、イリシコリンＡ、アスコフラノン、アスコクロリンなどのイソプレノイドの生産能がある生物種や酵素（１）乃至（１１）の発現が見られる生物種などに由来する。酵素（１）乃至（１１）の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられる。微生物の中でも糸状菌はアスコクロリン生産能又はアスコフラノン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。アスコクロリンやアスコクロリン類縁体の生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ネオネクトリア属糸状菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）糸状菌、シリンドロカルポン属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）糸状菌、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）糸状菌、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）糸状菌、シリンドロクラジウム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ）糸状菌、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）糸状菌、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）糸状菌、ニグロサブラム属（Ｎｉｇｒｏｓａｂｕｌｕｍ）糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｇｅｎｕｍ）、コレトトリカム・ニコチアナエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）などが挙げられる。アスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）糸状菌、バーティシリウム属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイ、ペシロマイセス・バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｖａｒｉｏｔｉｉ）、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。また、イリシコリンＡ生産能を有する糸状菌の具体例としては、トリコデルマ属糸状菌が挙げられ、より具体的にはトリコデルマ・リーゼイが挙げられる。なお、上記のアスコクロリン生産能を有する糸状菌及びアスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例は、イリシコリンＡ生産能を有する糸状菌の具体例であり得る。
上記のとおり、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素（１）乃至（１１）は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
（遺伝子工学的手法による酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のクローニング）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の取得方法や、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の塩基配列、酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素（１）乃至（１１）の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどを挙げることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナムを培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
また、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を構築することが可能である。
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製する。
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３、該文献の全記載はここに開示として援用される）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ　４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ　ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素（１）乃至（１１）のアミノ酸配列を知り得る。
（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
（形質転換体の作製方法）
形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えまたは非相同組み換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
非相同組換えを利用する方法では、相同な配列を必要とせず、宿主生物のゲノム中の任意の領域にランダムに挿入され、多コピーで挿入されることもあり得る。形質転換に用いるＤＮＡコンストラクトは直鎖状であっても環状であってもどちらでも良い。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主生物中で酵素（１）乃至（１１）を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、該文献の全記載はここに開示として援用される）及び糸状菌の系などが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５）、該文献の全記載はここに開示として援用される）にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＧ３、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えばｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５’相同組み換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３’相同組み換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。
ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーターであるＰｔｅｆ、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ｔｅｆ１遺伝子ターミネーターであるＴｔｅｆやａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
相同組み換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１号公報に記載の実施例や図１を参照して、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の上流領域及び酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。糸状菌の場合、相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
形質転換体が作製されたことの確認は、酵素（１）乃至（１１）が有する活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物、例えば、アスコクロリン、イリシコリンＡ、アスコフラノンといったイソプレノイドが検出されること、又は検出された目的産物の量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物における目的産物の量よりも多いことを確認することにより行うことができる。
また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
（ノックアウト生物の作製方法）
「ノックアウト」とは、遺伝子の一部若しくは全部を欠損させること、変異導入若しくは遺伝子に任意の配列を挿入させること、その遺伝子の発現に必要なプロモーターを欠損させることなどにより、その遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を失わせることを意味する。厳密にいえばその遺伝子がコードするタンパク質の機能発現を完全には失っていない、つまり、その遺伝子がコードするタンパク質が機能発現している可能性があっても、その機能発現を大部分失っている限り、本明細書でいう「ノックアウト」に含み得る。なお、本明細書中で「ノックアウト生物」のことを、「破壊株」や「欠損株」などとよぶ場合がある。
ノックアウトの作製方法は特に限定されず、例えば、下記の実施例で示したような相同組み換えを用いて遺伝子の一部もしくは全部を欠損させること、又はＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのゲノム編集技術により遺伝子の欠失、挿入、置換を引き起こすことなど、どのような方法を用いても良い。相同組み換えにより遺伝子をノックアウトする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトであるが、これに限定されない。
相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトなどである。
（宿主生物）
宿主生物としては、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト又は酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素（１）乃至（１１）を生産することやイソプレノイドを生産することができる生物であれば特に限定されず、例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、ネオネクトリア属微生物、フザリウム属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。イリシコリンＡ、アスコクロリン、アスコフラノンなどのイソプレノイドの生産能が認められる糸状菌や酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌であってもよい。
宿主生物がアスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を有さないことなどにより、イソプレノイドの生産能が認められない場合は、酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子により形質転換する。すなわち、アスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を導入して、イソプレノイドを異種発現するように形質転換した形質転換体、例えば、形質転換糸状菌も宿主生物として利用可能である。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。
イソプレノイドの生産能が認められる生物としては、アクレモニウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、フザリウム属糸状菌、シリンドロカルポン属糸状菌、バーティシリウム属糸状菌、ネクトリア属糸状菌、ペシロマイセス属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイ、ペシロマイセス・バリオッティ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。
糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。
なお、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物をはじめとして糸状菌は相同組換え頻度が低い傾向にあることから、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのＫｕ遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。
このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができるが、例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用したＫｕ遺伝子を破壊することや、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって達成可能である。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物は、Ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。
また、宿主生物は、ｐｙｒＧなどのマーカー遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。抑制すべきマーカー遺伝子は、ＤＮＡコンストラクトに含めるマーカー遺伝子に応じて適宜設定できる。
（酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子の具体例）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１～１０及び６５に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及びａｓｃＡが挙げられる。なお、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１～２０及び６６として示す。
アクレモニウム・スクレロティゲナム及びアクレモニウム・スクレロティゲナム以外の生物から酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫの塩基配列（配列番号１～１０及び６５）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ａｓｃＡ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及びａｓｃＡの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１～２０及び６６）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ及びＡｓｃＩタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、ネオネクトリア属由来の配列番号３５～４１及び６７のアミノ酸配列；アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ及びＡｓｃＥタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、トリコデルマ由来の配列番号４７～５０のアミノ酸配列などが挙げられる。
アクレモニウム・スクレロティゲナムから得られた酵素（１）乃至（１１）をコードする遺伝子、又は酵素（１）乃至（１１）と配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物やアクレモニウム属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。
（形質転換体）
形質転換体の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＡ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（１）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現したＡｓｃＡ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及び／又はＡｓｃＫの作用によって宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを検出可能の量又はそれ以上の量で生産することができる。
形質転換体の別の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのすべて、又は一部を含む、野生型由来生合成遺伝子クラスター遺伝子（ＯＲＦ以外のプロモーター配列等も含む。）、及び、ＡｓｃＡのような該生合成遺伝子クラスターの転写を制御する転写因子を高発現又は低発現するように設計されたＤＮＡコンストラクトが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（２）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現量の変化した転写因子の作用によって、宿主生物又は形質転換体に適した条件で培養又は生育することにより、宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを検出可能の量又はそれ以上の量で生産することができる。
形質転換体の具体的な一態様は、アスペルギルス・ソーヤなどを宿主生物とする形質転換体であって、遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫに加えて、遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体；遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫに加えて、遺伝子ａｓｃＦが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体などであるが、これに限定されない。
形質転換体の具体的な一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナム、ネオネクトリア・ディティシマ、トリコデルマ・リーゼイなどを宿主生物とする形質転換体であって、ａｓｃＡ～Ｉのいずれか１つ以上の遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する形質転換体などであるが、これに限定されない。
（ノックアウト生物）
ノックアウト生物の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンとアスコフラノンの両方を産生するような、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＧをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（１）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物は、アスコクロリンの生合成に関与する酵素であるＡｓｃＧタンパク質を発現しないので、アスコクロリンに代えてアスコフラノン又はアスコフラノン前駆体のみを生産することができ、例えば、野生型生物に比べて、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体を大量に生産する可能性がある。
ノックアウト生物の別の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムやオネクトリア・ディティシマなどのアスコクロリン又はアスコクロリン前駆体を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ及びａｓｃＦを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＦをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（２）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物を野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、野生型生物に比べて、イリシコリンＡを大量に生産する可能性がある。
ノックアウト生物の別の一態様は、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリン及びアスコフラノンの両方を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物、又はオネクトリア・ディティシマなどの遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＩを有する野生型生物から、遺伝子ａｓｃＩをノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（３）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物はアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるＡｓｃＩタンパク質を発現しないので、アスコフラノンに代えてアスコクロリンのみを生産することができ、例えば、野生型生物に比べて、アスコクロリンを大量に生産する可能性がある。
ノックアウト生物の別の一態様は、トリコデルマ・リーゼイなどのイリシコリンＡ誘導体を産生する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ及びイリシコリンＡ以降の生合成に関与する遺伝子を有する野生型生物から、イリシコリンＡ以降の生合成に関与する遺伝子をノックアウトして得られる、ノックアウト生物（以下、「ノックアウト生物（４）」ともよぶ。）である。このようなノックアウト生物を野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、野生型生物に比べて、イリシコリンＡを大量に生産する可能性がある。
（製造方法）
本発明の一態様の製造方法は、形質転換体（１）又は形質転換体（２）を宿主細胞に適した条件で培養することにより、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。
本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ－Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ（ＬＬ－Ｚ１２７２α）等の、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）に作用させて、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。例えば、イリシコリンＡを形質転換体に作用させる方法は、イリシコリンＡと形質転換体とが接触して、形質転換体が有する酵素によってアスコクロリン又はアスコフラノンが生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、イリシコリンＡを含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、アスコクロリンを製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ－Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ等の、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）より抽出した酵素を作用させて、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ、アスコクロリン又はアスコフラノンの製造方法である。
本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（１）を野生型生物に適した条件で培養することにより、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体を得る工程を少なくとも含む、アスコフラノン又はアスコフラノン前駆体の製造方法である。
本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（２）又は（４）を、野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、イリシコリンＡを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡの製造方法である。
本発明の別の一態様の製造方法は、ノックアウト生物（３）を、野生型生物に適した条件で培養又は生育することにより、アスコクロリン又はアスコクロリン前駆体を得る工程を少なくとも含む、アスコクロリン又はアスコクロリン前駆体の製造方法である。
以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本発明の各態様の製造方法は下記記載に限定されない。
培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＧＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。
形質転換体やノックアウト生物（以下では、これらを総称して「形質転換体等」ともよぶ。）の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等がアクレモニウム属やアスペルギルス属などの糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＧＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。
培養終了後に培養物からアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡなどの目的産物（イソプレノイド）を抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
抽出溶媒は目的産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら目的産物を抽出する。
また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。
定性的分析又は定量的分析は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ、ＭＳ／ＭＳなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
本発明の各態様の製造方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
（方法）
本発明の一態様の方法は、ａｓｃＢ～ａｓｃＫのいずれか1つ以上の遺伝子、あるいは、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法である。本発明の別の一態様の方法は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。本発明の別の一態様の方法は、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。
ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段は特に限定されないが、例えば、使用する糸状菌として、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を用いること；遺伝子ａｓｃＡを含むアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌について、培養条件を調整することや他の転写因子を導入するなどして、該糸状菌が本来有する遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することなどの手段が挙げられる。
糸状菌によるイソプレノイドの産生が増大しているか否かは、例えば、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じていないアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量と、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じたアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量とを比較することにより確認することができる。
（用途）
本発明の一態様の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法を利用して得られたアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡなどのイソプレノイドは、抗原虫活性、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用など種々の生理活性を有することが期待できる機能性生体物質であるとともに、その特徴を活かして、医薬品、医薬部外品などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
（アスコクロリン生合成遺伝子の探索）
アスコフラノン産生菌であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ　Ｆ－１３９２株；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．７０：３０４－３０７（２０１６）、該文献の全記載はここに開示として援用される）を用いて、アスコフラノンの産生量が４００倍以上異なる２つの培養サンプルを取得した。
それらのサンプルから、５０～１００ｍｇの菌体を回収し、ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、標準プロトコールに従って全ＲＮＡを回収した。
回収した全ＲＮＡから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ｍＲＮＡ　ＤＩＲＥＣＴ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｍＲＮＡを単離し、トランスクリプトームライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）をＩｏｎ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ－ｓｅｑ　Ｋｉｔ　ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて構築した。
なお、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの品質及びトランスクリプトームライブラリーの濃度測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ　ＲＮＡ　６０００　ｐｉｃｏ　ｋｉｔ及びＡｇｉｌｅｎｔ　２１００　ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ（ともにＡｇｉｌｅｎ社製）を用いて確認した。
得られたｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡシーケンス解析をＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシステムを用いて以下のように行った。
得られたｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ／Ｌに希釈し、Ｉｏｎ　ＯｎｅＴｏｕｃｈ　２を用いてエマルジョンＰＣＲによってライブラリーの増幅を行った。増幅したライブラリーは、Ｉｏｎ　ＯｎｅＴｏｕｃｈ　ＥＳを用いて濃縮し、Ｉｏｎ　ＰＧＭ　ｓｙｓｔｅｍによってＲＮＡシーケンス解析を行った。Ｉｏｎ　ＯｎｅＴｏｕｃｈ　２にはＩｏｎ　ＰＧＭ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＯＴ２　２００　Ｋｉｔを用い、Ｉｏｎ　ＰＧＭにはＩｏｎ　ＰＧＭ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　２００　Ｋｉｔ　ｖ２を用いた。
ＲＮＡシーケンスにはＩｏｎ　ＰＧＭ　Ｉｏｎ　３１６　ｖ２チップを使用した。得られたシーケンス情報をアクレモニウム・スクレロティゲナムのゲノム配列データベースにマッピングし、２つのサンプル間における遺伝子の発現量の違いを解析した。
マッピングされたｃＤＮＡのリード数をそれぞれの遺伝子の長さで補正した値（ＲＰＫＭ：ｒｅａｄｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅａｄｓ）を基に、高生産サンプルと低生産サンプルとの間の発現倍率を計算した。
高生産サンプルの遺伝子のうち、低生産サンプルのものと比較して３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子の探索を行った結果、２遺伝子以上が連続しており、３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子が集中した唯一の領域を見出すことができた。これがアスコフラノン生合成遺伝子クラスターであると予測し、３００倍以上の倍率で高発現していた遺伝子をａｓｃＡ～Ｈと名付けた（図１を参照）。
また、それぞれの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、ＡｓｃＡ～Ｈは表１のような機能を持つことが予測された。このうち、ＡｓｃＡは、転写因子であると考えられたため、アスコフラノンの生合成には遺伝子ａｓｃＢ～Ｈ（配列番号１～７）がコードするＡｓｃＢ～Ｈタンパク質（配列番号１１～１７）が関与すると予想された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥ発現形質転換体の作製）
麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ ＮＲＲＣ４２３９株）のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号１５～１８の遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットを導入した。
具体的には、各ａｓｃ遺伝子を発現させるための発現カセットとして、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号２５）をプロモーターとして用い、及びアルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号２６）をターミネーターとして用いた。また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５,３５ｂｐを含む１，８３８ｂｐ、配列番号２７）を用いた。
例えば、ユーンらの文献（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００９ Ｍａｒ;８２（４）:６９１－７０１. ｄｏｉ: １０．１００７／ｓ００２５３－００８－１８１５－５. Ｅｐｕｂ ２００８ Ｄｅｃ ２４.　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｉｎｔｕｐｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ. 、該文献の全記載はここに開示として援用される）で報告されているように、形質転換に用いるＤＮＡ中に遺伝子挿入位置（相同組み換え領域）の上流又は下流の配列と相同な配列が含まれている場合、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含む培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることができ、何度もｐｙｒＧマーカーを使用すること（マーカーリサイクリング）が可能となる。よって、５’相同組み換え配列（５’ａｒｍ）、Ｐｔｅｆ、ａｓｃ遺伝子、Ｔａｌｐ、マーカーリサイクリング用相同配列（下流遺伝子との相同配列；ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ）、ｐｙｒＧ、３’相同組み換え配列（３’ａｒｍ）の順に連結したものを形質転換用ＤＮＡとして用いることでｐｙｒＧのマーカーリサイクルを行い、各ａｓｃ遺伝子の発現カセットをアスペルギルス・ソーヤの染色体上へａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥの順に挿入した。
また、それぞれのＤＮＡの連結にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号３１及び３２のプライマーを、ａｓｃＤは配列番号３３及び３４のプライマーを用いてＰＣＲによりそれぞれのＤＮＡ断片を増幅させた。このとき、遺伝子ａｓｃＤ用のフォワードプライマーには、５’末端にＰｔｅｆと相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとの連結が可能となる。
以上のようにして調製した５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを用いて、アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株を形質転換することで、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットのそれぞれを順に１コピーずつ導入したＡｓ－Ｄ株、Ａｓ－ＤＢ株、Ａｓ－ＤＢＣ株及びＡｓ－ＤＢＣＥ株を取得した。
次に、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－Ｄ株、Ａｓ－ＤＢ株、Ａｓ－ＤＢＣ株及びＡｓ－ＤＢＣＥ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－ＤＢＣＥ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析及びＭＳ解析（ネガティブモード）を行ったところ、Ａｓ－Ｄ株では宿主株（ＮＢＲＣ４２３９株）では見られなかった新たなピークがｏ－オルセリン酸の標準品と同じ溶出位置に確認された。また、Ａｓ－ＤＢ株ではＡｓ－Ｄ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はイリシコリン酸Ｂに相当する３７１であることがわかった。また、Ａｓ－ＤＢＣ株ではＡｓ－ＤＢ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はＬ－Ｚ１２７２βに相当する３５５であることがわかった。さらに、Ａｓ－ＤＢＣＥ株ではＡｓ－ＤＢＣ株では見られなかった新たなピークがわずかながら確認され、該ピークはイリシコリンＡ（ｉｌｉｃｉｃｏｌｉｎ　Ａ）標準品と同じ溶出位置に見られた（図２を参照）。
なお、図２のＨＰＬＣは、メタノール：水：酢酸（４５０：５０：１０）を移動相（１ｍｌ／ｍｉｎ）とし、粒子径３μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ（ＴＯＳＯＨ社製）のＯＤＳカラムを用いて実施した。
さらに、特願２０１７－２０６８０９号明細書に記載のｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号５４）を用いて、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ及びａｓｃＥをそれぞれ多コピーで導入したＡｓ－ＤＢＣＥ－ｍｕｌｔｉ－ｃｏｐｙ株では、イリシコリンＡが多く蓄積していることがわかった（図２を参照）。なお、ｐｙｒＧ３遺伝子は、糸状菌において、任意の遺伝子を多コピーで染色体に組み込むための、ｐｙｒＧ内のプロモーター領域を改変し、発現量を低下させた選択マーカー遺伝子である。
また、ＬＣ／ＭＳ解析により、該ピークの化合物がイリシコリンＡ標準品と同じｍ／ｚ値３８９（ｎｅｇａｔｉｖｅモード）を示すこと、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析においてもイリシコリンＡ標準品と同様のピークパターンを示したことから、発現したＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥタンパク質によって、イリシコリンＡが生合成されていることがわかった。なお、図２中で、約７分の溶出位置で見えているピークは、Ａｓ－ＤＢＣ株で確認されたピークと溶出位置が一致しており、ＭＳ解析の結果、ＬＬ－Ｚ１２７２βのｍ／ｚ値と一致していることがわかった。
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨ発現形質転換体の作製）
Ａｓ－ＤＢＣＥ株と同様にして、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２～２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのいずれかを含む発現カセットを順次導入することで、ＡｓｃＦ発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦ株；ＡｓｃＦ及びＡｓｃＧの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＧ株；及び、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株を作製した。これらの株を上記と同様にして培養し、ＨＰＬＣ解析を行った。
なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．２５ｍｌ/ｍｉｎで、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のＯＤＳカラムを用いて解析を行った。
図３に示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株ではＡｓ－ＤＢＣＥ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＧＨ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦＧ株では見られなかった新たなピークが確認された。
このことから、イリシコリンＡ以降は、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用して反応が進むことがわかった。
（粗酵素液を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析）
アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２～２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの発現カセットのいずれかを導入したＡｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ－ａｓｃ遺伝子－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３をｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。
アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株（野生株）、Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を加えることで野生株、Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｇ株及びＡｓ－Ｈ株の粗酵素液を抽出した。
得られた粗酵素液（菌体５～１０ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）～（４）を調製した：
（１）野生株反応液：野生株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（２）Ａｓ－Ｆ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（３）Ａｓ－ＦＧ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（４）Ａｓ－ＦＧＨ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
上記反応液（１）～（４）をそれぞれ室温で一晩反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。
ＬＣ解析は、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。
その結果、図４Ａに示すとおり、Ａｓ－Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３において野生株反応液では見えなかった新たなピークが確認された。また、図４Ｂに示すとおり、Ａｓ－ＦＧ反応液ではｍ／ｚ値４０５においてＡｓ－Ｆ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、図５に示すとおり、Ａｓ－ＦＧＨ反応液ではｍ／ｚ値４０３においてＡｓ－ＦＧ反応液やＡｓ－ＦＧ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ－ＦＧＨ反応液で確認されたピークはアスコクロリン標準品のピークと溶出時間が一致し、さらにアスコクロリンのｍ／ｚ値は４０３であることから、これらの結果よりイリシコリンＡからＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用することによりアスコクロリンが生合成されることがわかった。
以上のように、アスコフラノン生合成に関与すると予測した遺伝子クラスターは、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターであることがわかった。予想されるアスコクロリンの生合成スキームを図６に示す。図６に示すとおり、アスコクロリンの生合成経路は、アスコフラノンの生合成経路とは、一部重複があるものの、全く別異なものであることがわかった。このことより、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターを導入した形質転換体により生産されるものは、アスコクロリンであってアスコフラノンではないことがわかった。
（内在性エポキシドヒドロラーゼ遺伝子破壊株の解析）
上記のｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析により、Ａｓ－Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３のピークが確認されたため、アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株で発現させたＡｓｃＦの粗酵素液による反応生成物はジヒドロキシ化されたイリシコリンＡ（図６参照）であることが予測された。しかしながらホソノらの文献（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）. ２００９ Ｏｃｔ；６２（１０）:５７１－４. 、該文献の全記載はここに開示として援用される）によると、アクレモニウム属微生物において、イリシコリンＡエポキシド（ｍ／ｚ値４０５）が蓄積していることが明らかとなっており、よって本来のＡｓｃＦ反応生成物はイリシコリンＡエポキシドであると考えられた。つまり、アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株では、内在性のエポキシドヒドロラーゼによってイリシコリンＡエポキシドが開環し、ジヒドロキシル化されたイリシコリンＡが生成している可能性が考えられた。そこで、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株において、アスペルギルス・ソーヤ由来のエポキシドヒドロラーゼをコードすると予測される遺伝子のうち、最も発現量の高いエポキシドヒドロラーゼ遺伝子（配列番号４２）を欠損させたＡｓ－ＤＢＣＥＦ－ΔＥＨ株を作製した。Ａｓ－ＤＢＣＥＦ－ΔＥＨ株を上記と同様に培養し、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ－ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、ＭＳ解析により、該ピークはエポキシド化合物に相当するｍ／ｚ値を有していることがわかった。よって、ＡｓｃＦはイリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒することがわかった。
（アスコフラノン生合成遺伝子の探索）
図６に示すとおり、イリシコリンＡエポキシドによりアスコフラノンが生合成されるためには、一原子酸素添加反応が必要であると想定し、この反応にはＡｓｃＦ以外の別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが関与していると予測した。そこで、上記のＲＮＡシーケンス解析の結果を用いて、アスコフラノン高生産サンプルにおいて高発現しているＰ４５０遺伝子を探索した。その結果、アスコフラノン高生産サンプルにおいて、ＡｓｃＦの約６割の発現量を有し、かつ、低生産サンプルではほとんど発現していないＰ４５０遺伝子を新たに見出した。また、該Ｐ４５０遺伝子の隣接する２つの遺伝子も同様にアスコフラノン高生産サンプルでのみ高発現していることがわかり、これら３つの遺伝子がクラスターを形成していることが示唆された（図７を参照）。該Ｐ４５０遺伝子に隣接する２つの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、一方は機能未知のタンパク質であり、もう一方はデヒドロゲナーゼであることがわかった。
（粗酵素液を用いたアスコフラノン合成）
上記にようにして見出した３つの遺伝子、Ｐ４５０遺伝子（配列番号８）、機能未知遺伝子（配列番号９）及びデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１０）を、それぞれａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫと名付けた。また、これらの遺伝子がそれぞれコードするＡｓｃＩタンパク質（配列番号１８）、ＡｓｃＪタンパク質（配列番号１９）及びＡｓｃＫタンパク質（配列番号２０）がアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるかをｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析で確認することにした。
アスペルギルス・ソーヤ　ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、配列番号８～１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫの発現カセットのいずれかを導入したＡｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ－ａｓｃ遺伝子－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧをｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。
Ａｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を加えることでＡｓ－Ｆ株、Ａｓ－Ｉ株、Ａｓ－Ｊ株及びＡｓ－Ｋ株の粗酵素液を抽出した。
得られた粗酵素液（菌体５～７．５ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）～（７）を調製した：
（１）Ａｓ－Ｆ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（２）Ａｓ－ＦＩ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（３）Ａｓ－ＦＩＪ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（４）Ａｓ－ＦＩＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（５）Ａｓ－ＦＪＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（６）Ａｓ－ＩＪＫ反応液：Ａｓ－Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
（７）Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液：Ａｓ－Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ－Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ｍＭ　ＭｇＣｌ２の混合液
上記反応液（１）～（７）をそれぞれ３０℃で１時間反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。
ＬＣ解析は、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。ＬＣ／ＭＳ解析の結果を図８及び図１０に示し、ＭＳ／ＭＳ解析の結果を図９に示す。
その結果、図８に示すとおり、（７）Ａｓ－ＦＩＪＫ反応液でのみアスコフラノンに相当するｍ／ｚ値４１９のピークがアスコフラノン標準品と同じ溶出時間に検出された。さらに、（７）で検出されたｍ／ｚ値４１９のピークについて、コリジョンエネルギー４５ｅｖでＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、図９で示すようにアスコフラノン標準品と同様のフラグメンテーションパターンを示した。
また、図１０に示すとおり、（２）Ａｓ－ＦＩ反応液では、（１）Ａｓ－Ｆ反応液では見られなかったｍ／ｚ値４３９の新たなピークが検出され、さらに該ピークはＡｓｃＦ及びＡｓｃＩの両方ともが反応液中に存在するときにのみ検出された。つまり、このｍ／ｚ値４３９のピークは、イリシコリンＡを基質としてＡｓｃＦ及びＡｓｃＩが順に反応して生成した化合物（の加水分解産物）に由来すると考えられ、ｍ／ｚ値の差と、ＡｓｃＩがＰ４５０であることとから考慮すると、ＡｓｃＩは一原子酸素添加酵素（モノオキシゲナーゼ）として機能していることが強く示唆された。
以上より、図１１に示すとおり、イリシコリンＡを基質として、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫが反応することにより、アスコフラノンが生成されることがわかった。
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫ発現形質転換体の作製）
上記と同様にして、配列番号８～１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及び配列番号４３のＡ．ｓｏｊａｅ　ＮＢＲＣ４２３９株由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子をそれぞれ含む発現カセットを、ｐｙｒＧマーカーリサイクリング後のＡｓ－ＤＢＣＥＦ株に順次導入することで、ＡｓｃＩ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株；ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株をそれぞれ作製した。これらの株を５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。
なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ　３μｍ　カラム（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）用いて解析を行った。結果を図１２に示す。
図１２に示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株ではＡｓ－ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株では見られなかったｍ／ｚ値４１９のアスコフラノンに相当するピークが確認された。また、該ピークはアスコフラノン標準品のピークと溶出時間が一致した。これにより、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫはアスコフラノンの生合成遺伝子であることがわかった。
したがって、図６で予想したとおり、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成については、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ及びＡｓｃＦまでの反応は両者で共通しており、イリシコリンＡエポキシド以降の反応が異なっていることがわかった。具体的には、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＩが反応した場合はアスコフラノン生合成へ、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＧが反応した場合はアスコクロリン生合成へつながることがわかった（図１１を参照）。よって、アクレモニウム・スクレロティゲナムのようなアスコフラノン及びアスコクロリンの両方を生産するような株において、aｓｃＧ破壊株ではアスコフラノンのみを高生産することができ、ａｓｃＩ破壊株ではアスコクロリンのみを高生産することができるようになる。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株の作製）
以上の結果より、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成経路はイリシコリンＡエポキシドまで共通の経路を辿っており、ＡｓｃＩ及びＡｓｃＧは同じ基質を競合していることがわかった。よって、ａｓｃＧの破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、アスコクロリンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンＡエポキシドもアスコフラノン生産に利用することができ、よってアスコフラノンの生産性が向上することが考えられた。一方、ａｓｃＩの破壊株ではアスコクロリンのみを生産するようになり、アスコフラノンの生合成経路へ供給されるはずであったイリシコリンＡエポキシドもアスコクロリン生産に利用することができ、よってアスコクロリンの生産性が向上することが考えられた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムのａｓｃＧ破壊株及びａｓｃＩ破壊株を作製し、上記仮説を検証することにした。
アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株において各種ａｓｃ破壊株を取得するにあたり、まずはｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株を作製することにした。アクレモニウム・スクレロティゲナムをはじめとする糸状菌は一般的に相同組み換え効率が非常に低く、破壊株を取得することが困難である。よって、糸状菌においては、非相同組み換えによる遺伝子の挿入に関与するＫｕ７０等の機能を欠損させることで相同組み換え効率を向上させる方法がしばしば使用される。ｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株の作製は、（１）ｐｙｒＧ破壊株の取得、（２）ｐｙｒＧマーカーによるｋｕ７０破壊株の取得、（３）ｐｙｒＧマーカーリサイクリングによるｋｕ７０／ｐｒｙＧ二重破壊株の取得、の手順で行うことにした。
まずはｐｙｒＧ破壊株を取得するべく、次のとおりにｐｙｒＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ　ＯＲＦの上流約３ｋｂのＤＮＡ断片（５’ｐｙｒＧ）、ｐｙｒＧ　ＯＲＦの１４７塩基目から下流約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（３’ｐｙｒＧ）、Ｔｔｅｆ（配列番号４４）を増幅した。ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇｒ）はＬｉｎｅａｒ　Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を鋳型としてＰＣＲを行い増幅させた。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ｐｙｒＧ－ｈｙｇｒ－Ｔｔｅｆ－３’ｐｙｒＧからなるｐｙｒＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。
次に、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のプロトプラストをサイトロギアの文献（ＣＹＴＯＬＯＧＩＡ，８２（３）：３１７－３２０，ＪＵＮ　２０１７、該文献の全記載はここに開示として援用される）に記載の方法に従い調製した。そして、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）により、５’ｐｙｒＧ－ｈｙｇｒ－Ｔｔｅｆ－３’ｐｙｒＧを導入することでｐｙｒＧ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｃｋ　ｂｏｒｔｈ、１．２　Ｍ　ソルビトール、２０ｍＭ　ウラシル、２０ｍＭ　ウリジン、２％　Ａｇａｒ）上に重層し、２５℃で一晩培養した後、２ｍｇ／Ｌの５ＦＯＡ及び１００ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む再生用寒天培地（０．７％　Ａｇａｒ）５ｍＬをさらに重層して、３０℃で２～３週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のｐｙｒＧ破壊株を選抜した。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０破壊株の作製）
次に、ｋｕ７０破壊株を取得するべく、以下のようにしてｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｋｕ７０のＯＲＦ（配列番号４５）の上流約３ｋｂのＤＮＡ断片（５’ｋｕ７０）、ｋｕ７０のＯＲＦの２０７塩基目から下流約２．３ｋｂのＤＮＡ断片（３’ｋｕ７０）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための３’ｋｕ７０の下流約１ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ｋｕ７０－ＬＯ－ｐｙｒＧ－３’ｋｕ７０からなるｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりｋｕ７０破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでｋｕ７０破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ　ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ　ソルビトール、０．１％　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％　Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約５日間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のｋｕ７０破壊株を選抜した。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株の作製）
取得したｋｕ７０破壊株の分生子を回収し、５×１０５～１×１０６個の分生子１ｍｇ／Ｌの５ＦＯＡを含む寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｃｋ　ｂｏｒｔｈ、２０ｍＭ　ウラシル、２０ｍＭ　ウリジン、１．５％　Ａｇａｒ）上にスプレッドすることでｐｙｒＧマーカーのリサイクリングを行い、ｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株を取得した。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の作製及びアスコフラノン生産性の解析）
次に、ａｓｃＧ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＧのＯＲＦの４００塩基目から上流約２ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＧ）、ａｓｃＧのＯＲＦの下流約２．５ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＧ）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための５’ａｓｃＧの上流約０．９ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ２）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＧ－ｐｙｒＧ－ＬＯ２－３’ａｓｃＧからなるａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＧ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ　ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ　ソルビトール、０．１％　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％　Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＧ破壊株を選抜した。
アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＧ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。結果を図１３に示す。
図１３で示すとおり、ａｓｃＧ破壊株ではアスコクロリンのピークが消え、アスコフラノンのみを生産することがわかった。また、菌体あたりのアスコフラノンの生産量は野生株より高いことがわかった。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃI破壊株の作製及びアスコクロリン生産性の解析）
次に、ａｓｃＩ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＩのＯＲＦの上流約２ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＩ）、ａｓｃＩのＯＲＦの９０５塩基目から下流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＩ）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＩ－ｐｙｒＧ－３’ａｓｃＩからなるａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＩ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＩ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ　ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ　ソルビトール、０．１％　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％　Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＩ破壊株を選抜した。
アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＩ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、ａｓｃＩ破壊株ではアスコフラノンのピークが消え、アスコクロリンのみを生産することがわかった。また、菌体あたりのアスコクロリンの生産量は野生株より高いことがわかった。
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＦ破壊株の作製及びイリシコリンＡ生産性の解析）
次に、ａｓｃＦ破壊株を取得するべく、以下のようにしてａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ａｓｃＦのＯＲＦの上流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（５’ａｓｃＦ）、ａｓｃＦのＯＲＦの下流約２ｋｂのＤＮＡ断片（３’ａｓｃＦ）、ｐｙｒＧマーカーをリサイクリングするための３’ａｓｃＦの下流約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＬＯ３）、ｐｙｒＧ遺伝子（配列番号４６）を増幅した。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｓｃＦ－ＬＯ３－ｐｙｒＧ－３’ａｓｃＦからなるａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のｋｕ７０／ｐｙｒＧ二重破壊株に対し、同様にしてプロトプラスト－ＰＥＧ法によりａｓｃＦ破壊株作製用ＤＮＡ断片を導入することでａｓｃＦ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％　Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ　ｂｒｏｔｈ、１．２Ｍ　ソルビトール、０．１％　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、２％　Ａｇａｒ）上に重層し、３０℃で約一週間培養し、複数回植え継いだ後にコロニーＰＣＲにより目的のａｓｃＦ破壊株を選抜した。
アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株（野生株）と作製したａｓｃＦ破壊株をＧＰＹ液体培地中で３日間、２５℃で培養し、この前培養液を１０％量分、アスコフラノン高生産培地に植菌し、２８℃、４日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後の菌体１００ｍｇに対し、アセトン抽出処理を行い、ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、ａｓｃＦ破壊株ではイリシコリンＡが大量に蓄積されることが確認できた。
（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＣの機能解析）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の配列番号１１～１４のＡｓｃＢ～ＡｓｃＥのアミノ酸配列を基に、Ｂｌａｓｔ検索した結果、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）においても配列番号４７～５０のＡｓｃＢ～ＡｓｃＥホモログ（配列同一性はそれぞれ４７％、５３％、５２％、６６％）を有しており、さらにこれらをコードするａｓｃＢ～ＡｓｃＥ遺伝子はゲノム上で隣接していることがわかった。このことから、配列番号４７～５０もまたイリシコリンＡの生合成酵素であることが予測された。そこで、ＮＩＴＥより購入したトリコデルマ・リーゼイＮＢＲＣ３１３２９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５１及び５２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、配列番号５３のａｓｃＣ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＣ）をクローニングした。なお、配列番号５３のＴｒ－ａｓｃＣ遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号４８のＡｓｃＣタンパク質をコードしていると考えられた。
クローニングしたＴｒ－ａｓｃＣを上記と同様にして連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、上記で作製したアクレモニウム由来のａｓｃＤ遺伝子及びａｓｃＢ遺伝子が挿入されたＡｓ－ＤＢ株のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のａｓｃＤ及びａｓｃＢ、さらにトリコデルマ由来のａｓｃＣを含む発現カセットのそれぞれを１コピーずつ導入したＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株を取得した。
次に、ＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ－ＤＢ－Ｔｒ－Ｃ株では、Ａｓ－ＤＢＣ株のｍ／ｚ値のＬ－Ｚ１２７２βに相当する３５５のピークと同じ溶出位置に、新たなピークが検出された。このことから、予測どおり配列番号５３のＴｒ－ａｓｃＣ遺伝子はアクレモニウム由来のａｓｃＣ遺伝子と同じ機能を有していることがわかり、よってトリコデルマ由来の配列番号４７～５０はイリシコリンＡの生合成酵素であると考えられた。さらに、ネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ　ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）由来の配列番号３５～４１のＡｓｃＢ～ＡｓｃＨも、アクレモニウム由来のＡｓｃＢ～ＡｓｃＨとの配列同一性はすべて６０％以上であり、かつ、それぞれのコード遺伝子はゲノム上で隣接していることから、該酵素群はアスコクロリン生合成酵素であると考えられた。
（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＤ及びＡｓｃＢの機能解析）
ＮＩＴＥより購入したトリコデルマ・リーゼイＮＢＲＣ３１３２９株のゲノムを鋳型とし、配列番号５５及び５６のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、配列番号５７のａｓｃＤ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＤ）をクローニングした。同様にして、配列番号５８及び５９のプライマーを用いて、配列番号６０のａｓｃＢ遺伝子（Ｔｒ－ａｓｃＢ）をクローニングした。配列番号５７のＴｒ－ａｓｃＤ遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号４９のＡｓｃＤタンパク質をコードしていると考えられた。
クローニングしたＴｒ－ａｓｃＤ及びＴｒ－ａｓｃＢを上記と同様にして連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ　ｏｕｔ　ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍ及び５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ　ｏｕｔ　ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、麹菌アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ　ｏｕｔ　ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、トリコデルマ由来のａｓｃＤを含む発現カセットを１コピーずつ導入したＡｓ－Ｔｒ－Ｄ株を取得した。さらに、Ａｓ－Ｔｒ－Ｄ株のｐｙｒＧをリサイクリングした株に対し、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｔａｌｐ－ｌｏｏｐ　ｏｕｔ　ｒｅｇｉｏｎ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、トリコデルマ由来のａｓｃＤ及びａｓｃＢを含む発現カセットをそれぞれ１コピーずつ導入したＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株を取得した。
次に、ＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株（トリコデルマ由来ａｓｃＤ及びａｓｃＢ遺伝子挿入株）及びＡｓ－ＤＢ株（アクレモニウム由来ａｓｃＤ及びａｓｃＢ遺伝子挿入株）を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株及びＡｓ－ＤＢ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析を行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液８０～９５％（１５ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ　３μｍ　カラム（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析した。図１４の結果が示すとおり、Ａｓ－ＤＢ株と同様にＡｓ－Ｔｒ－ＤＢ株においても、親株では見られないピークが同じ溶出位置に検出された。このことから、予測どおりに配列番号５７及び６０のＴｒ－ａｓｃＤ遺伝子及びＴｒ－ａｓｃＢ遺伝子はアクレモニウム由来のａｓｃＤ遺伝子及びａｓｃＢ遺伝子と同じ機能を有していることがわかった。
（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＥの機能解析）
配列番号５０のＡｓｃＥをコードし、麹菌用にコドン改変した人工合成遺伝子（配列番号６１）を、上記と同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、上記で作製したＡｓ－ＤＢＣ株（アクレモニウム由来ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣの発現カセットを１コピーずつ挿入した株）のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ－Ｐｔｅｆ－Ｔｒ－ａｓｃＥ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－３’ａｒｍを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、さらにトリコデルマ由来のａｓｃＥを含む発現カセットをそれぞれ１コピーずつ挿入したＡｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株を取得した。
次に、５％ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地にＡｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株及びＡｓ－ＤＢＣ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を上記と同様に回収し、アセトン抽出を行い、該アセトン抽出物のＨＰＬＣ解析を行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液８０～９５％（１５ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ　３μｍ　カラム（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析した。図１５の結果が示すとおり、Ａｓ－ＤＢＣ－Ｔｒ－Ｅ株では、イリシコリンＡ標準品と同じ溶出位置にＡｓ－ＤＢＣ株では確認されない新たなピークが検出された。このことから、トリコデルマ由来ＡｓｃＥもアクレモニウム由来ＡｓｃＥと同様に、ＬＬ－Ｚ１２７２βを基質とするハロゲナーゼであることがわかった。以上より、配列番号４７～５０のトリコデルマ由来ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ及びＡｓｃＥはイリシコリンＡ生合成酵素であることがわかった。
（アスコフラノン生合成経路の解析）
アスコフラノン生合成経路はイリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫの順に反応することでアスコフラノンが生合成されると予測されたが、ＡｓｃＩの生成産物及びＡｓｃＪの生成産物が未同定であった。そこで、上記で作製したａｓｃＧ破壊株のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株を親株としてａｓｃＧ破壊株／ａｓｃＪ破壊株を作製したところ、ａｓｃＧ破壊株では見られなかった新たなピークが検出された。このＡｓｃＩ生成産物であると考えられる化合物を精製し、ＮＭＲ解析を行ったところ、図１６に示す構造を有する新規な化合物（ヒドロキシイリシコリンＡエポキシド）であることがわかった。また、このＡｓｃＩ生成産物に対し、ＡｓｃＪを反応させたところ、アスコフラノールが生成することがわかった。さらに、ＡｓｃＩ生成産物に対し、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫを反応させたところ、アスコフラノンが生成することがわかった。以上より、イリシコリンＡエポキシド以降のアスコフラノン生合成経路は図１６で示すとおりであることがわかった。
（ＡｓｃＩの強制発現によるアスコフラノンの高生産化）
前述のとおり、ａｓｃＧ破壊株ではアスコフラノンのみを生産するようになり、野生株よりもアスコフラノンの生産性が向上した。しかしながら、図１３で示したとおり、ａｓｃＧ破壊株では、溶出時間３８．５分あたりに蓄積している化合物があり、この化合物はイリシコリンＡエポキシドであることがわかった。つまり、ａｓｃＧ破壊株ではＡｓｃＩの反応が律速になっているためにイリシコリンＡエポキシドが蓄積していると予測された。そこで、ａｓｃＧ破壊株において、配列番号８のａｓｃＩ遺伝子を配列番号６２のアクレモニウム由来のｔｅｆ１プロモーター及び配列番号６３のアクレモニウム由来のｔｅｆ１ターミネーターを用いて高発現させた株（ΔａｓｃＧ－Ｉ株）を作製し、アスコフラノン高生産培地中で、２８℃、４日間、Ｂｉｏｔｔ社製の１００ｍｌ培養装置（Ｂｉｏ　Ｊｒ．８）を用いて４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍの条件で培養した。
次いで培養後の１０ｍＬ培養液あたりの菌体を回収し、アセトン抽出後、ＨＰＬＣを行った。なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０～１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ　３μｍ　カラム（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて解析を行った。図１７の結果が示すとおり、ΔａｓｃＧ－Ｉ株ではａｓｃＧ破壊株（ΔａｓｃＧ）と比べて、イリシコリンＡエポキシドの蓄積量が減少し、アスコフラノンの生産量が大きく向上することがわかった。
（ネオネクトリア由来Ａｓｃホモログの機能解析）
ｂｌａｓｔｐ検索の結果、Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ　ｄｉｔｉｓｓｉｍａは、配列番号１１～１７のアクレモニウム由来のＡｓｃＢ～Ｈと６０％以上の配列同一性を有するＡｓｃＢ～Ｈのホモログ（配列番号３５～４１）をコードする遺伝子をゲノム上に有していることがわかった。また、公開されているデータベース上の遺伝子配列は完全にアセンブルされている状態ではないが、少なくともＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ及びＡｓｃＦをコードしている４つの遺伝子は隣接して存在しており、さらに、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨをコードしている２つの遺伝子も隣接して存在していることから、クラスターを形成していることが考えられた。加えて、ｔｂｌａｓｔｎによる検索の結果、ＡｓｃＨをコードしている遺伝子の約０．４ｋｂ上流にはアクレモニウム由来のａｓｃＡ遺伝子と５０％以上の配列同一性を有する遺伝子配列が存在していることがわかった。これらのことから、ネオネクトリア由来のＡｓｃＢ～Ｈのホモログ（配列番号３５～４１）はアスコクロリン生合成酵素であることが考えられた。
テルペン環化酵素としての機能を有するＡｓｃＧは、既知ドメインを持たず、アスコクロリン生合成における特徴的な酵素であることから、配列番号４０のＡｓｃＧの機能を解析することで、配列番号３５～４１がアスコクロリン生合成酵素であるかどうかを判断できると考えた。そこで、上記で取得したアクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株において、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧを発現させることにより、アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＧの機能を相補できるかどうかを検証することにした。
まず、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ－１３９２株のａｓｃＧ破壊株の分生子を回収し、約１０６個の分生子を５ＦＯＡ含有の寒天培地上で生育させることで、ｐｙｒＧマーカーのリサイクリングを行った。なお、ｐｙｒＧマーカーが除去されるときに、設計上ａｓｃＨ遺伝子も同時に破壊されるため、マーカーリサイクリング後の株はａｓｃＧ及びａｓｃＨの２重遺伝子破壊株（ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ株）となっている。この株に対し、ｐｙｒＧマーカーを用いて、配列番号６２のアクレモニウム由来のｔｅｆ１プロモーター及び配列番号６３のアクレモニウム由来のｔｅｆ１ターミネーターから構成される、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧの高発現カセットを導入した。なお、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧをコードする遺伝子配列Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子（配列番号６４）は人工遺伝子合成により取得した。
ａｓｃＧ及びａｓｃＨの２重遺伝子破壊株に対してＮｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させた株（ΔａｓｃＧ／ΔａｓｃＨ＋Ｎｄ－ａｓｃＧ株）を、上記と同様にしてアスコフラノン高生産培地で培養し、培養後の菌体のアセトン抽出液についてＨＰＬＣ解析を行った。図１８の結果が示すとおり、Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させた株では、アスコフラノンやイリシコリンＡエポキシドの生産量が低下し、Ｎｄ－ａｓｃＧ遺伝子を発現させていない株では検出されなかった新たな化合物のピークが検出された。また、この化合物は上記のｉｎ　ｖｉｔｒｏのＡｓ－ＦＧ反応液で特異的に確認されたｍ／ｚ値４０５の化合物（イリシコリンＣ）と同じ溶出位置で検出され、さらに質量分析（ＭＳ）の結果、この化合物のｍ／ｚ値は４０５であることがわかった。よって、配列番号４０のネオネクトリア由来のＡｓｃＧは、アクレモニウム由来のＡｓｃＧと同様の機能を持つことが示された。
以上より、配列番号３５～４１のネオネクトリア由来のＡｓｃＢ～Ｈホモログはアスコクロリン生合成酵素であることがわかった。
なお、ネオネクトリア由来のＡｓｃＨホモログをコードしている遺伝子の約６ｋｂ上流にはアクレモニウム由来のＡｓｃＩ（配列番号１８）と５３％の配列同一性を有するＡｓｃＩホモログ（配列番号６７）であるＮｄ－ＡｓｃＩをコードする遺伝子が存在していることがわかった。このことはＮｅｏｎｅｃｔｒｉａ　ｄｉｔｉｓｓｉｍａにおいて、Ｎｄ－ＡｓｃＩをコードする遺伝子がＮｄ－ＡｓｃＡ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ及びＮｄ－ＡｓｃＨをコードする遺伝子とクラスターを形成していることを示唆しており、Ｎｄ－ＡｓｃＩはアスコクロリンやアスコクロリン中間体と関連のある化合物の生合成酵素である可能性が高い。つまり、配列番号６７のネオネクトリア由来ＡｓｃＩホモログはアクレモニウム由来ＡｓｃＩと同様の機能を持つことが考えられた。ただし、アクレモニウム由来のＡｓｃＪ（配列番号１９）及びＡｓｃＫ（配列番号２０）のホモログをコードする遺伝子は、Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ　ｄｉｔｉｓｓｉｍａにおいて、Ｎｄ－ＡｓｃＩ、Ｎｄ－ＡｓｃＡ、Ｎｄ－ＡｓｃＧ及びＮｄ－ＡｓｃＨをコードする遺伝子のクラスター領域付近には存在していなかった。
トリコデルマ由来、ネオネクトリア由来のＡｓｃホモログの結果を考慮すると、アクレモニウム由来Ａｓｃ酵素と同一性が高く、同じドメインを有しており、且つ、それらがゲノム上の近傍に位置し、クラスターを形成しているような場合は、アクレモニウム由来Ａｓｃ酵素と同様の機能を持つ可能性が高いことを示していると言える。
（ＡｓｃＡ強制発現ベクターの作製）
表１のクラスターに存在する転写因子をコードする遺伝子ａｓｃＡがアスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子の発現を制御しているのかを以下のとおりに検証した。
ＲＮＡシーケンスの結果より、遺伝子ａｓｃＡはアスコフラノン高生産培地において高発現していたことから、アスコクロリン生合成遺伝子群やアスコフラノン生合成遺伝子群を正に制御するのではないかと考えた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムにおいて、遺伝子ａｓｃＡを強制発現させることでアスコクロリンやアスコフラノンの生産が誘導されるかどうかを調べるため、下記のようにしてＡｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。
まず、アクレモニウム・スクレロティゲナム　Ｆ－１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号６２のｔｅｆ１遺伝子プロモーター（Ｐｔｅｆ）、配列番号６５の遺伝子ａｓｃＡ、配列番号４４のｔｅｆ１遺伝子ターミネーター（Ｔｔｅｆ）、配列番号４６のｐｙｒＧ遺伝子をクローニングし、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応によりそれぞれを連結することで、Ｐｔｅｆ－ａｓｃＡ－Ｔｔｅｆ－ｐｙｒＧのａｓｃＡ強制発現カセットがｐＵＣ１９に挿入されたａｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。
なお、配列番号６５の遺伝子ａｓｃＡはイントロンを含んでいる塩基配列であるが、ＲＮＡシーケンスの結果、遺伝子ａｓｃＡにコードされているＡｓｃＡタンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列からなることがわかった。
（ＡｓｃＡ強制発現株におけるアスコクロリン生産性及びアスコフラノン生産性の評価）
上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナム　Ｆ－１３９２株のｐｙｒＧ破壊株に対し、ＡｓｃＡ強制発現ベクターを導入することでＡｓｃＡ強制発現株を作製した。
アクレモニウム・スクレロティゲナム　Ｆ－１３９２株（野生株）と、作製したＡｓｃＡ強制発現株とを、それぞれＧＰＹ液体培地中で４日間、３０℃で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。結果を図１９に示す。
図１９に示すとおり、野生株はＧＰＹ培地中ではアスコクロリン及びアスコフラノンを全く生産しなかった。それに対して、ＡｓｃＡ強制発現株ではアスコクロリン及びアスコフラノンの両方の生産が確認された。
これまで、野生株では限られた培地でしかアスコクロリン及びアスコフラノンが生産されず、僅かな培養条件の違いで生産量が大きく異なることが課題であった。しかし、ＡｓｃＡ強制発現株を使用すれば、所定の培養条件に設定せずとも、アスコクロリン及びアスコフラノンの生産が可能となり、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡといったイソプレノイドの安定的な工業生産が実現でき、産業上非常に有用である。
配列表に記載の配列は、以下のとおりである：
［配列番号１］ａｓｃＢ
［配列番号２］ａｓｃＣ
［配列番号３］ａｓｃＤ
［配列番号４］ａｓｃＥ
［配列番号５］ａｓｃＦ
［配列番号６］ａｓｃＧ
［配列番号７］ａｓｃＨ
［配列番号８］ａｓｃＩ
［配列番号９］ａｓｃＪ
［配列番号１０］ａｓｃＫ
［配列番号１１］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号１２］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号１３］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号１４］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号１５］ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号１６］ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号１７］ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号１８］ＡｓｃＩタンパク質
［配列番号１９］ＡｓｃＪタンパク質
［配列番号２０］ＡｓｃＫタンパク質
［配列番号２１］コドン改変ａｓｃＢ
［配列番号２２］コドン改変ａｓｃＣ
［配列番号２３］コドン改変ａｓｃＤ
［配列番号２４］コドン改変ａｓｃＥ
［配列番号２５］Ｐｔｅｆ
［配列番号２６］Ｔａｌｐ
［配列番号２７］ｐｙｒＧ
［配列番号２８］コドン改変ａｓｃＦ
［配列番号２９］コドン改変ａｓｃＧ
［配列番号３０］コドン改変ａｓｃＨ
［配列番号３１］Ｐｔｅｆ－Ｆｗ
［配列番号３２］Ｐｔｅｆ－Ｒｖ
［配列番号３３］ａｓｃＤ－Ｆｗ
［配列番号３４］ａｓｃＤ－Ｒｖ
［配列番号３５］Ｎｄ－ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号３６］Ｎｄ－ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号３７］Ｎｄ－ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号３８］Ｎｄ－ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号３９］Ｎｄ－ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号４０］Ｎｄ－ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号４１］Ｎｄ－ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号４２］Ａ．ｓｏｊａｅ由来エポキシドヒドロラーゼ遺伝子
［配列番号４３］Ａ．ｓｏｊａｅ由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子
［配列番号４４］Ｔｔｅｆ
［配列番号４５］ｋｕ７０
［配列番号４６］ｐｙｒＧ
［配列番号４７］Ｔｒ－ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号４８］Ｔｒ－ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号４９］Ｔｒ－ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号５０］Ｔｒ－ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号５１］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｆｗ
［配列番号５２］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｒｖ
［配列番号５３］Ｔｒ－ａｓｃＣ
［配列番号５４］ｐｙｒＧ３
［配列番号５５］Ｔｒ－ａｓｃＤ－Ｆｗ
［配列番号５６］Ｔｒ－ａｓｃＣ－Ｒｖ
［配列番号５７］Ｔｒ－ａｓｃＤ
［配列番号５８］Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｆｗ
［配列番号５９］Ｔｒ－ａｓｃＢ－Ｒｖ
［配列番号６０］Ｔｒ－ａｓｃＢ
［配列番号６１］コドン改変Ｔｒ－ａｓｃＥ
［配列番号６２］アクレモニウム由来Ｐｔｅｆ
［配列番号６３］アクレモニウム由来Ｔｔｅｆ
［配列番号６４］Ｎｄ－ａｓｃＧ
［配列番号６５］ａｓｃＡ
［配列番号６６］ＡｓｃＡタンパク質
［配列番号６７］Ｎｄ－ＡｓｃＩタンパク質
本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン等のイソプレノイドを工業的規模で製造するために利用可能である。

Claims (14)

  1. 下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＩ。
    （１）配列表の配列番号８に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２）配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （４）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （５）配列番号１８又は６７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
  2. 下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＪ。
    （１）配列表の配列番号９に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２）配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （４）配列番号１９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （５）配列番号１９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
  3. 下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＫ。
    （１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２）配列番号１０に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）アスコフラノールからアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （４）配列番号２０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （５）配列番号２０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
  4. 請求項１～３に記載の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
  5. 請求項１～３に記載の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、さらに遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
  6. 下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＧのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
    （１）配列表の配列番号６又は６４に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２）配列番号６又は６４に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （４）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （５）配列番号１６又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
  7. 請求項６に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノンを得る工程を含む、アスコフラノンの製造方法。
  8. 下記（１）～（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＦのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
    （１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （４）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
    （５）配列番号１５又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
  9. 請求項８に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。
  10. 請求項１に記載の遺伝子ａｓｃＩを有する野生型生物に由来する、該遺伝子ａｓｃＩのノックアウト生物（ただし、ヒトを除く）。
  11. 請求項１０に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
  12. 請求項６に記載のノックアウト生物を用いて、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコフラノン類縁体、アスコフラノン前駆体及びその類縁体の製造方法。
  13. 請求項８に記載のノックアウト生物を用いて、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、イリシコリンＡ類縁体、イリシコリンＡ前駆体及びその類縁体の製造方法。
  14. 請求項１０に記載のノックアウト生物を用いて、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体を得る工程を含む、アスコクロリン類縁体、アスコクロリン前駆体及びその類縁体の製造方法。

     
PCT/JP2018/018405 2017-05-11 2018-05-11 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 WO2018207928A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019517726A JP7205829B2 (ja) 2017-05-11 2018-05-11 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体
AU2018267167A AU2018267167A1 (en) 2017-05-11 2018-05-11 Method of producing isoprenoids and proteins, genes, and transformants for the same
US16/612,413 US11306317B2 (en) 2017-05-11 2018-05-11 Method of producing isoprenoids and proteins, genes, and transformants for the same
CN201880031210.3A CN110770347A (zh) 2017-05-11 2018-05-11 类异戊二烯的制造方法以及用于该制造方法的蛋白质、基因和转化体
EP18798532.0A EP3636762A4 (en) 2017-05-11 2018-05-11 PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ISOPRENOIDS AND ASSOCIATED PROTEIN, GENE AND TRANSFORMER
JP2022203306A JP2023030077A (ja) 2017-05-11 2022-12-20 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017094509 2017-05-11
JP2017-094509 2017-05-11
JP2018005888 2018-01-17
JP2018-005888 2018-01-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018207928A1 true WO2018207928A1 (ja) 2018-11-15

Family

ID=64105318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/018405 WO2018207928A1 (ja) 2017-05-11 2018-05-11 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11306317B2 (ja)
EP (1) EP3636762A4 (ja)
JP (2) JP7205829B2 (ja)
CN (1) CN110770347A (ja)
AU (1) AU2018267167A1 (ja)
WO (1) WO2018207928A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019103400A (ja) * 2017-12-08 2019-06-27 キッコーマン株式会社 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113248590B (zh) * 2021-06-24 2021-09-10 天津奇云诺德生物医学有限公司 一种NT-proBNP蛋白抗原决定簇多肽及其应用
CN114940980B (zh) * 2022-06-02 2023-11-21 暨南大学 一类倍半萜聚酮合成基因及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5625310A (en) 1979-08-02 1981-03-11 Tokyo Shibaura Electric Co Package type generator facility
JPH0459832A (ja) 1990-06-29 1992-02-26 Takechi Kogyo Rubber Kk シリコーンゴムの接着方法
JPH09165332A (ja) 1995-12-15 1997-06-24 Tomoyoshi Hosokawa イソプレノイド系抗生物質を有効成分とする抗原虫剤
JP2006213644A (ja) 2005-02-03 2006-08-17 Nrl Pharma Inc Ａｐ−１活性阻害剤
JP2007222055A (ja) 2006-02-22 2007-09-06 Noda Inst For Scient Res 染色体領域欠失株の作製方法
JP2011239681A (ja) 2008-09-19 2011-12-01 Kikkoman Corp 麹菌アルカリプロテアーゼプロモーター
WO2012060387A1 (ja) 2010-11-01 2012-05-10 アリジェン製薬株式会社 新規ジヒドロキシベンゼン誘導体およびそれらを有効成分とする抗原虫剤
WO2013180140A1 (ja) 2012-05-29 2013-12-05 エヌエーアイ株式会社 ジヒドロオロト酸脱水素酵素阻害剤
JP2017206809A (ja) 2016-05-16 2017-11-24 エィ・ケィ・ケィ・エム株式会社 防災用倉庫

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS459832Y1 (ja) 1966-08-24 1970-05-07
US3873529A (en) * 1973-05-25 1975-03-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Novel antibiotic ascofuranone and process for the production thereof
JP4553569B2 (ja) * 2003-10-06 2010-09-29 アリジェン製薬株式会社 フェノール系誘導体を有効成分とするクリプトスポリジウム症の予防・治療剤
DE102009050072A1 (de) * 2009-10-20 2011-04-21 FW-Fernwärme-Technik GmbH Doppelrohrsystem
CN104059944B (zh) * 2014-07-02 2016-08-24 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5625310A (en) 1979-08-02 1981-03-11 Tokyo Shibaura Electric Co Package type generator facility
JPH0459832A (ja) 1990-06-29 1992-02-26 Takechi Kogyo Rubber Kk シリコーンゴムの接着方法
JPH09165332A (ja) 1995-12-15 1997-06-24 Tomoyoshi Hosokawa イソプレノイド系抗生物質を有効成分とする抗原虫剤
JP2006213644A (ja) 2005-02-03 2006-08-17 Nrl Pharma Inc Ａｐ−１活性阻害剤
JP2007222055A (ja) 2006-02-22 2007-09-06 Noda Inst For Scient Res 染色体領域欠失株の作製方法
JP2011239681A (ja) 2008-09-19 2011-12-01 Kikkoman Corp 麹菌アルカリプロテアーゼプロモーター
WO2012060387A1 (ja) 2010-11-01 2012-05-10 アリジェン製薬株式会社 新規ジヒドロキシベンゼン誘導体およびそれらを有効成分とする抗原虫剤
WO2013180140A1 (ja) 2012-05-29 2013-12-05 エヌエーアイ株式会社 ジヒドロオロト酸脱水素酵素阻害剤
JP2017206809A (ja) 2016-05-16 2017-11-24 エィ・ケィ・ケィ・エム株式会社 防災用倉庫

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"Re-identification of the ascofuranone-producing fungus Ascochyta viciae as Acremonium sclerotigenum", J ANTIBIOT (TOKYO, 2 November 2016 (2016-11-02)
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
CYTOLOGIA, vol. 82, no. 3, June 2017 (2017-06-01), pages 317 - 320
DATABASE Nucleotide 5 October 2015 (2015-10-05), GOMEZ-CORTECERO, A. ET AL.: "Definition: Neonectria ditissima strain R09/05 contig_126, whole genome shotgun sequence", XP055561617, Database accession no. LKCW01000126.1 *
HOSONO ET AL., J ANTIBIOT (TOKYO, vol. 62, no. 10, October 2009 (2009-10-01), pages 571 - 4
HOSONO, K. ET AL.: "LL-Z1272a epoxide, a precursor of ascochlorin produced by a mutant of Ascochyta viciae", THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, vol. 62, no. 10, 2009, pages 571 - 574, XP055561623 *
J. ANTIBIOT., vol. 70, 2016, pages 304 - 307
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 101, 1983, pages 20 - 78
MOL. GEN. GENET., vol. 218, 1989, pages 99 - 104
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
OKADA, M . ET AL.: "Combinatorial biosynthesis of (+)-daurichromenic acid and its halogenated analogue", ORGANIC LETTERS, vol. 19, no. 12, 2017, pages 3183 - 3186, XP055561629 *
OZEKI ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 59, 1995, pages 1133
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441
YOON ET AL., APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 82, no. 4, March 2009 (2009-03-01), pages 691 - 701
YU , D. ET AL.: "A specific cytochrome P450 hydroxy lase in herboxidiene biosynthesis", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 24, no. 18, 2014, pages 4511 - 4514, XP029053317 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019103400A (ja) * 2017-12-08 2019-06-27 キッコーマン株式会社 イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018267167A1 (en) 2019-12-12
JP7205829B2 (ja) 2023-01-17
JP2023030077A (ja) 2023-03-07
EP3636762A4 (en) 2021-01-13
US20200063143A1 (en) 2020-02-27
CN110770347A (zh) 2020-02-07
US11306317B2 (en) 2022-04-19
EP3636762A1 (en) 2020-04-15
JPWO2018207928A1 (ja) 2020-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11091787B2 (en) Methods and materials for biosynthesis of mogroside compounds
US11186855B2 (en) Transformed fungus having enhanced ergothioneine productivity and method for producing ergothioneine
JP2023030077A (ja) イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体
CN108138206B (zh) 麦角硒因的制造方法
US11248248B2 (en) Production of mogroside compounds in recombinant hosts
JP2005230008A (ja) 遺伝子組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる補酵素Ｑ１０製造の発酵方法
Galanopoulou et al. Purine utilization proteins in the Eurotiales: cellular compartmentalization, phylogenetic conservation and divergence
WO2019240243A1 (ja) セレノネインの製造方法
JP6830603B2 (ja) アスコクロリン及びイリシコリンａの製造方法
WO2020095864A1 (ja) 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法
JP2019103400A (ja) イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体
US11634718B2 (en) Production of macrocyclic ketones in recombinant hosts
WO2017103739A1 (en) Gene cluster for biosynthesis of austinoids
Kolaříková et al. Functional expression of amine oxidase from Aspergillus niger (AO-I) in Saccharomyces cerevisiae
Kim et al. Generation of an Arginine Auxotrophic Mutant of Colletotrichum acutatum as a Recipient Host for Insertional Mutagenesis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18798532

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019517726

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018267167

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20180511

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018798532

Country of ref document: EP

Effective date: 20191211