KR102114493B1 - 스테비올 글리코시드의 재조합 생산 - Google Patents

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Abstract

UDP-글리코실 전이효소 (UGTs)를 인코드하는 재조합 유전자를 발현시키도록 조작된 재조합 미생물, 식물, 식물 세포를 개시한다. 이러한 미생물, 식물, 또는 식물 세포는 식품 제품 및 식이 보충제에 천연 감미료로 이용할 수 있는 스테비올 글리코시드, 예를 들어 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 D를 생산할 수 있다.

Description

스테비올 글리코시드의 재조합 생산{RECOMBINANT PRODUCTION OF STEVIOL GLYCOSIDES}
관련 출원의 참조 연계
본 출원은 2011년 8월 8일에 출원된 미국 출원 번호 제61/521,084호; 2011년 8월 8일에 출원된 미국 출원 번호 제61/521,203호; 2011년 8월 8일에 출원된 미국 출원 번호 제61/521,051호; 2011년 8월 15일에 출원된 미국 출원 번호 제61/523,487호; 2011년 12월 7일에 출원된 미국 출원 번호 제61/567,929호; 및 제2012년 2월 27일에 출원된 미국 출원 번호 제61/603,639호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 모두는 이들 전체 내용을 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 출원은 스테비올(steviol) 글리코시드의 재조합 생산에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포들과 같은 재조합 숙주들에 의한 스테비올 글리코시드, 예를 들어 레바우디오시드 D (rebaudioside D)의 생산에 관한 것이다. 본 출원은 또한 스테비올 글리코시드를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 출원은 또한 스쿠알렌 경로의 테르페노이드(terpenoid) 전구물질의 생합성과정을 변조함으로써 테르페노이드 생산을 위한 기술 및 방법에 관한 것이다.
감미료는 식품, 음료, 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품 산물에 통합될 수 있거나 또는 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 가정용 대체물로 이용할 수 있다. 감미료는 예를 들어 수크로오스, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 및 꿀과 같은 천연 감미료들, 그리고 예를 들어 아스파르탐, 사카린 및 수크랄로오스(sucralose)와 같은 인공 감미료를 포함한다. 스테비아(Stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 단리하고 추출할 수 있는 천연 감미료이다. 스테비아는 스테비아 추출물의 상업적 생산을 위해 남미 및 아시에에서 흔히 자란다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품에서 고감도 조미료로서, 그리고 블렌드로 또는 단독으로 식탁 감미료로서 시판된다.
스테비아 식물의 추출물들은 레바우디오시드 및 단맛에 기여하는 기타 스테비올 글리코시드를 함유하지만, 각 글리코시드의 양은 상이한 생산 일괄량 (batches)에 따라 흔히 변화한다. 기존의 시판 제품들은 주로 레바우디오시드 A이며, 적은 양의 레바우디오시드 C, D, 및 F와 같은 기타 글리코시드들이 있다. 스테비아 추출물은 또한 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물에서 유도된 화합물과 같은 오염물질을 함유할 수 있다. 이러한 이취는 선택된 식품 시스템 또는 용도에 따라 대체로 문제가 될 수 있다. 잠재적인 오염물질로는 색소, 지질, 단백질, 석탄산(phenolics), 사카라이드, 스파튤에놀(spathulenol) 및 기타 세스키테르펜, 라단 디테르펜(labdane diterpenes), 모노테르펜(monoterpenes), 데카논산, 8,11,14-에이코사트리에논산, 2-메틸옥타데칸, 펜타코산, 옥타코산, 테트라코산, 옥타데카놀, 스티그마테롤, β-시토스테롤, α- 및β-아미린, 루페올, β-아미린 아세테이트, 펜타시클릭 트리테르펜, 센타우레딘, 퀘르시틴, 에피-알파-카디놀, 카로필렌 및 유도체들, 베타-피넨, 베타-시토스테롤, 및 기베렐린(gibberellin)을 포함한다.
요약
본 출원은 유전자의 발현에 의해 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A(dulcoside A)와 같은 스테비올 글리코시드를 생산하는 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하는 재조합 숙주, 예를 들어 미생물, 식물, 또는 식물 세포를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 EUGT11, 우리딘 5'-디포스포(UDP) 글리코실 전이효소(transferase)는 단독으로 쓰이거나 또는 하나 이상의 다른 UDP 글리코실 전이효소, 예를 들어 UGT74G1, UGT76G1, UGT85C2, 및 UGT91D2e와 조합으로 사용되어 재조합 숙주내 또는 시험관내 (in vitro) 시스템을 이용하여 레바우디오시드 D의 생산 및 축적을 가능케 한다. 본원에 기재된 바와 같이, EUGT11은 레바우디오시드 D 생산에 중요한 단계인 강한 1,2-19-O-글루코오스 글리코실화 활성을 갖는다.
전형적으로, 스테비오시드 및 레바우디오시드 A는 시판되는 스테비아 추출물의 대표적인 화합물들이다. 스테비오시드는 레바우디오시드 A에 비해 보다 쓴맛이며 낮은 감미를 갖는다고 보고되고 있다. 스테비아 추출물의 조성물은 식물이 성장하는 토양 및 기후에 따라 매우 다양할 수 있다. 원료 식물, 기후 조건, 및 추출 공정에 따라, 상업적 제조 과정에서 레바우디오시드 A의 양은 총 스테비올 글리코시드 함량의 20 내지 97%로 다양하다고 보고된다. 또 다른 스테비올 글리코시드들이 스테비아 추출물 내에 다양한 양으로 존재한다. 예를 들어, 레바우디오시드 B는 통상적으로 1-2% 미만으로 존재하는 반면, 레바우디오시드 C는 7-15% 만큼 높은 수준으로 존재할 수 있다. 레바우디오시드 D는 통상적으로 2% 이하의 수준으로 존재하고, 레바우디오시드 F는 통상적으로 총 스테비올 글리코시드의 3.5% 이하로 조성물에 존재한다. 미량의 스테비올 글리코시드는 스테비아 추출물의 향미 프로필에 영향을 준다. 또한, 레바우디오시드 D 및 다른 고도로 글리코실화된 스테비올 글리코시드는 레바우디오시드 A 보다 고품질의 감미료로 여겨진다. 보통, 본원에 기재된 재조합 숙주들 및 방법들은 예컨데 많은 고성능 감미료에 비해 우수한 기능성이나 감각적 성질을 갖는 무칼로리 감미료와 같은 용도의 레바우디오시드 D의 증가양을 보유하는 스테비올 글리코시드 조성물 생산에 특히 유용하다.
한 측면에서, 본 출원은 서열 번호:152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 보유하는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다.
본 출원은 또한 루부소시드의 19-O-글루코오스의 C-2'에 제2 당 모이어티(moiety)를 전달하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다. 본 출원은 또한 스테비오시드 19-O-글루코오스의 C-2'에 제2 당 모이어티를 전달하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 문헌은 루부소시드의 19-O-글루코오스의 C-2' 및 루부소시드의 13-O-글루코오스의 C-2'에 제2 당 모이어티를 전달하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다.
본 문헌은 또한 레바우디오시드 D를 생산하기 위해 레바우디오시드 A의 19-O-글루코오스의 C-2'에 제2 당 모이어티를 전달하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 하며, 여기서 폴리펩디드의 촉매 속도는 반응을 상응하는 조건하에 수행할 때 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 91D2e 폴리펩티드보다 최소 20배 이상 (예를 들어, 25 또는 30배 빠름) 빠르다.
본원에 기재된 임의의 재조합 숙주에서, 폴리펩티드는 서열 번호:152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성)을 가질 수 있다. 폴리펩티드는 서열 번호 152에 제시된 아미노산을 가질 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주들은 또한 서열 번호:3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 UGT85C 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함할 수 있다. UGT85C 폴리펩티드는 서열 번호:3의 잔기 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444 및 471에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주는 또한 서열 번호:7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 UGT76G 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함할 수 있다. UGT76G 폴리펩티드는 서열 번호:7의 잔기 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주는 또한 UGT74G1 폴리펩티드를 인코드하는 유전자 (예를 들어, 재조합 유전자)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주는 또한 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드를 인코드하는 유전자 (예를 들어, 재조합 유전자)를 포함할 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5의 206, 207, 또는 343 위치에서 변이를 가질 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 또한 서열 번호:5의 211 및 286 위치에서 변이를 가질 수 있다 (예를 들어, L211M 및 V286A, UGT91D2e-b로 언급됨). UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5, 10, 12, 76, 78, 또는 95에 제시된 아미노산을 가질 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주는 또한 (i) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자; (ii) 이중기능의 코파릴 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드 하는 유전자, 또는 코파릴 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (iii) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; 및 (iv) 스테비올 합성효소를 인코드 하는 유전자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (i), (ii), (iii) 및 (iv)의 각 유전자는 재조합 유전자일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주는 또한 (v) 절두된 (truncated) HMG-CoA를 인코드하는 유전자; (vi) CRP를 인코드하는 유전자; (vii) 람노오스 합성효소를 인코드하는 유전자; (viii) UDP-글루코오스 탈수소효소를 인코드하는 유전자; 및 (ix) UDP-글루쿠론산 탈카르복실화효소(decarboxylase)를 인코드하는 유전자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), 또는 (ix) 중 적어도 하나의 유전자는 재조합 유전자일 수 있다.
게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소는 서열 번호:121-128에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 코파릴 디포스페이트 합성효소는 서열 번호:129-131에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 카우렌 합성효소는 서열 번호:132-135에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 카우렌 산화효소는 서열 번호:138-141에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 스테비올 합성효소는 서열 번호:142-146에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
임의의 재조합 숙주들은 각각의 유전자가 발현되는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 루부소시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 스테비오시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-1,2-비오시드, 스테비올-1,3-비오시드, 1,3-스테비오시드 뿐만 아니라 기타 람노오실화되거나 자일로실화된 중간물질로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 스테비올 글리코시드 (예를 들어, 레바우디오시드 D)는 상기 조건하에서 배양하였을 때 배양 배지의 1 L 당 적어도 1 ㎎ (예를 들어, 적어도 10 ㎎/리터, 20 ㎎/리터, 100 ㎎/리터, 200 ㎎/리터, 300 ㎎/리터, 400 ㎎/리터, 500 ㎎/리터, 600 ㎎/리터, 또는 700 ㎎/리터, 또는 그 이상)까지 축적될 수 있다.
또한, 본 문헌은 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 유전자가 발현되는 조건하에서 배양 배지에 본원에 기재된 임의의 숙주를 성장시키고; 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드를 회수하는 것을 포함한다. 성장 단계는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 13-O-1,2-디글리코실화된 및/또는 19-O-1,2-디글리코실화된 스테비올-글리코시드 (예를 들어, 스테비오시드, 스테비올 1,2-비오시드, 레바우디오시드 D, 또는 레바우디오시드 E)일 수 있다. 예를 들어, 스테비올 글리코시드는 레바우디오시드 D 또는 레바우디오시드 E일 수 있다. 스테비올 글리코시드의 다른 예들은 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 F, 및 둘코시드 A를 포함할 수 있다.
본 문헌은 또한 재조합 숙주를 특징으로 한다. 숙주는 (i) UGT74G1를 인코드 하는 유전자; (ii) UGT85C2를 인코드하는 유전자; (iii) UGT76G1를 인코드하는 유전자; (iv) 루부소시드 또는 스테비오시드의 19-O-글루코오스의 C-2'에 제2 당 모이어티를 전달하는 능력을 갖는 글리코실 전이효소를 인코드하는 유전자; 및 (v) 선택적으로 UGT91D2e를 인코드하는 유전자를 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 유전자는 재조합 유전자이다. 일부 구체예에서, 각각의 유전자들은 재조합 유전자이다. 숙주는 각각의 유전자 (예를 들어, 재조합 유전자)가 발현되는 조건하에서 배양하였을 때, 적어도 하나 이상의 스테비올 글리코시드 (예를 들어, 레바우디오시드 D)를 생산할 수 있다. 또한, 숙주는 (a) 이중기능의 코파릴 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코파릴 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (b) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; (c) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; (d) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 문헌은 또한 본원에 기재된 임의의 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 특징으로 한다. 조성물은 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 오염물질의 수준이 감소된다.
또 다른 측면에서, 본 문헌은 본원에 기재된 임의의 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 특징으로 한다. 조성물은 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 레바우디오시드 D가 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 문헌은 스테비올 글리코시드 조성물의 생산 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 각각의 유전자가 발현되는 조건하에서, 배양 배지에서 본원에 기재된 숙주를 성장시키고; 및 숙주(예를 들어, 미생물)에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 회수하는 것을 포함한다. 조성물은 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F 및 둘코시드 A가 풍부하다. 숙주 (예를 들어, 미생물)에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비아 추출물에 비해 스테비아 식물에서 유도된 오염물질의 감소된 수준을 가질 수 있다.
본 문헌은 또한 스테비올 글리코시드 내의 19-O-글루코오스의 C-2' 또는 13-O-글루코오스의 C-2'로 제2 당 모이어티를 전달하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 스테비올 글리코시드에 제2 당 모이어티의 전달을 위한 적합한 반응 조건 하에서, 스테비올 글리코시드를 본원에 기재된 EUGT11 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 UGT91D2 폴리펩티드 (예를 들어, UGT91D2e-b) 및 UDP-당과 접촉시키는 것을 포함한다. 스테비올 글리코시드는 루부소시드일 수 있으며, 여기에서 제2 당 모이어티는 글루코오스이고, 및 스테비오시드는 제2 글루코오스 모이어티의 전달시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 스테비오시드일 수 있고, 여기에서 제2 당 모이어티는 글루코오스이며, 그리고 레바우디오시드 E는 제2 글루코오스 모이어티의 전달시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 레바우디오시드 A일 수 있고, 레바우디오시드 D는 제2 글루코오스 모이어티의 전달시 생산된다.
본원에 개시된 바와 같이 향상된 후속 스테비올 글리코시드 경로의 또 다른 양태에서, 수크로오스 합성효소의 재조합 생산을 위한 재료들 및 방법들을 제공하며, 세포 내에서 글리코실화 반응을 촉진의 목적으로 숙주 내에서 UDP-글루코오스의 생산을 증가, 특히 생체 내(in vivo)에서 UDP-글루코오스의 이용가능성을 증가시키기 위한 재료 및 방법, 및 세포 내에서 UDP 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 문헌은 또한 수크로오스 수송체 및 수크로오스 합성효소를 인코드하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 재조합 숙주를 제공하고, 여기에서 글루코실 전이효소로 하나 이상의 외인성 핵산을 발현시키면 숙주 내 UDP-글루코오스의 수준이 증가한다. 임의로, 하나 이상의 외인성 핵산은 SUS1 서열을 포함한다. 임의로, SUS1 서열은 코페아 아라비카(Coffea arabica)로부터 기인하거나, 또는 코페아 아라비카 SUS1 서열에 의해 인코드된 수크로오스 합성효소의 기능성 동족체를 인코드하나, 동일하게는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) SUS가 본원에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 본 발명의 재조합 숙주에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 서열 번호:180에 제시된 서열을 함유하는 폴리펩티드를 인코드하는 서열, 또는 그의 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 임의로 하나 이상의 외인성 핵산은 SUC1 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, SUS1 서열은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 기인하고, 또는 SUC1 서열은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUC1 서열에 의해 인코드된 수크로오스 수송체의 기능적 동족체를 인코드한다. 재조합 숙주에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 서열 번호:179에 제시된 서열을 함유하는 폴리펩티드를 인코드하는 서열, 또는 그의 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 숙주는 하나 이상의 외인성 핵산이 결여된 상응하는 숙주와 비교하여 볼 때 외부의 수크로오스를 분해하는 능력이 감소된다.
재조합 숙주는 사카로마이세테(Saccharomycete), 예를 들어 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 미생물일 수 있다. 대안으로, 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 대안적 구체예에서, 재조합 숙주는 식물 또는 식물 세포이다.
본 발명은 또한 세포 내에서 UDP-글루코오스 수준을 증가시키고 UDP 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 수크로오스 합성효소 서열 및 재조합 수크로오스 수송체 서열을 수크로오스 함유 배지에서 세포내에서 발현시키는 것을 포함하며, 여기에서 세포는 수크로오스 분해력이 부족하다.
본 발명은 재조합 수크로오스 합성효소 서열 및 재조합 수크로오스 수송체 서열을 수크로오스 함유 배지에서 세포내에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포내에서 글리코실화 반응을 촉진시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 발현은 세포내 감소된 UDP 수준 및 세포 내에서 글리코실화가 증가한 같은 세포내 증가된 UDP-글루코오스 수준을 가져온다.
UDP-글루코오스 수준을 증가시키거나 글리코실화를 촉진시키는 방법 중 하나에서, 세포는 바닐린 글루코시드를 생성하여 세포에 의한 바닐린 글루코시드 생산을 증가시킬 수 있고, 또는 스테비올 글리코시드를 생산하여 세포에 의한 스테비올 글리코시드 생산을 증가시킬 수 있다. 임의로, SUS1 서열은 A. thaliana, S. rebaudiana, 또는 코페아 아라비카(Coffea arabica) SUS1 서열 (예를 들어, 도.17, 서열 번호:175-177 참조)이거나, 또는 A. thaliana, S. rebaudiana, 또는 코페아 아라비카(Coffea arabica) SUS1 서열에 의해 인코드된 수크로오스 합성효소의 기능적 동족체를 인코드하는 서열이다. 재조합 수크로오스 합성효소 서열은 서열 번호:180에 제시된 서열을 함유하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산, 또는 그의 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 임의로 포함하며, 여기에서 임의로 재조합 수크로오스 수송체 서열은 SUC1 서열이거나, 또는 여기에서 임의로 SUC1 서열은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUC1 서열이거나, 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUC1 서열에 의해 인코드된 수크로오스 수송체의 기능적 동족체를 인코드하는 서열이며, 또는 여기에서 임의로 재조합 수크로오스 수송체 서열은 서열 번호:179에 제시된 서열을 함유하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 포함하거나, 또는 그의 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 방법에서, 숙주는 미생물, 예를 들어 사카로마이세테(Saccharomycete), 임의로 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 또는 숙주는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 또는 숙주는 식물 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하여 이들 유전자의 발현으로 디테르페노이드 (diterpenoids)를 생산하는 재조합 숙주, 예컨데 미생물을 제공한다. 이러한 유전자는 ent-코파일 디포스페이트 합성효소 (CDPS) (EC5.5.1.13)를 인코드하는 유전자, ent-카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, ent-카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자, 또는 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함한다. 상기 유전자 중 적어도 하나는 재조합 유전자이다. 숙주는 또한 식물 세포일 수 있다. 스테비아 식물에서 이들 유전자(들)의 발현은 식물 내에 증가된 스테비올 글리코시드 수준을 가져온다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 엽록체 수송 펩티드 서열이 결여된 CDPS 폴리펩티드 (EC5.5.1.13)을 인코드하는 재조합 유전자의 다수의 복사체체들을 더 포함한다. CDPS 폴리펩티드는 도 14에 제시된 절두된(truncated) CDPS 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 숙주는 KAH 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자의 다수의 복사체체들을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨데 KAH 폴리펩티드는 도 12에 제시된 KAH 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는다. 숙주는 또한 하나 이상의 다음을 포함할 수 있다: (i) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자; (ii) ent-카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; 및 (iii) ent-카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자. 숙주는 또한 하나 이상의 다음을 포함할 수 있다; (iv) 절두된 HMG-CoA를 인코드하는 유전자; (v) CPR을 인코드하는 유전자; (vi) 람노오스 합성효소를 인코드하는 유전자; (vii) UDP-글루코오스 탈수소효소를 인코드하는 유전자; 및 (viii) UDP-글루쿠론산 탈카르복실화효소를 인코드하는 유전자. 예를 들어, 2개 이상의 외인성 CRP들이 존재할 수 있다. 이러한 유전자들 중 하나 이상의 발현이 유도될 수 있다. 유전자 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), 및 (viii) 중 적어도 하나는 재조합 유전자일 수 있고, 일부 경우에, (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), 및 (viii)의 유전자 각각은 재조합 유전자이다. 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소는 서열 번호:127에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고; 카우렌 산화효소는 서열 번호:138에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고; CPR은 서열 번호:168에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고; CPR은 서열 번호:170에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고, 카우렌 합성효소는 서열 번호:156에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
한가지 측면에서, 본 문헌은 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 인코드하는 분리된 핵산을 특징으로 하며, 여기에서 폴리펩티드는 서열 번호:5의 211 및 286 위치에서 치환을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 211 위치에서 메티오닌 및 286 위치에서 알라닌을 포함할 수 있다.
한가지 측면에서, 본 문헌은 도 12c에 제시된 아미노산 서열 (서열 번호:164)과 적어도 80%의 동일성 (예를 들어, 최소한 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 폴리펩티드는 도 12c에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 문헌은 도 12c에 제시된 아미노산 서열 (서열 번호:164)과 적어도 80%의 동일성 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 영역을 포함하는 핵산 구조물을 특징으로 한다. 폴리펩티드는 도 12c에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 문헌은 또한 도 12c에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성 (예를 들어, 최소한 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성)을 갖는 KAH 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자 (예를 들어, 재조합 유전자의 다수의 복사체들)을 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다. 폴리펩티드는 도 12c에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 숙주는 사카로마이세테 (예를 들어, 사카로바이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli )과 같은 미생물일 수 있다. 숙주는 식물 또는 식물 세포 (예를 들어, 스테비아, 피스코미트렐라(Physcomitrella), 또는 담배 식물 또는 식물 세포)일 수 있다. 스테비아 식물 또는 식물 세포는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 식물 또는 식물 세포이다. 재조합 숙주는 각각의 유전자들이 발현되는 조건하에서 배양하였을 때 스테비올을 생산할 수 있다. 재조합 숙주는 또한 UGT74G1 폴리펩티드를 인코드하는 유전자; UGT85C2 폴리펩티드를 인코드하는 유전자; UGT76G1 폴리펩티드를 인코드하는 유전자; UGT91D2 폴리펩티드를 인코드하는 유전자; 및/또는 EUGT11 폴리펩티드를 인코드하는 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 숙주는 각각의 유전자들이 발현되는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 및/또는 둘코시드 A일 수 있다. 재조합 숙주는 또한 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다; 데옥시자일룰로오스 5-포스페이트 합성효소 (DXS)를 인코드하는 유전자; D-1-데옥시자일룰로오스 5-포스페이트 환원이성화효소 (reductoisomerase) (DXR)을 인코드하는 유전자; 4-디포스포씨티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소 (CMS)를 인코드하는 유전자; 4-디포스포씨티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 인산화효소 (kinase) (CMK)를 인코드하는 유전자; 4-디포스포씨티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-씨클로디포스페이트 합성효소 (MCS)를 인코드하는 유전자; 1-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소 (HDS)를 인코드하는 유전자; 및 1-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소 (HDR)을 인코드하는 유전자. 재조합 숙주는 또한 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다; 아세토아세틸-CoA 티올라제(thiolase)를 인코드하는 유전자; 절두된 HMG-CoA 환원효소를 인코드하는 유전자; 메발로네이트 인산화효소를 인코드하는 유전자; 포스포메발로네이트 인산화효소를 인코드하는 유전자; 및 메발로네이트 피로포스페이트 탈카르복실화효소를 인코드하는 유전자. 또 다른 측면에서, 본 문헌은 ent-카우렌 합성효소 (EC 4.2.3.19)를 인코드하는 유전자 및/또는 기베렐린 20-산화효소 (EC 1.14.11.12)를 인코드하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다. 이러한 숙주는 각각의 유전자가 발현되는 조건 하에서 배양했을 때 기베렐린 GA3을 생산한다.
본 문헌은 또한 도 13에 제시된 S. rebaudiana CPR 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 (예를 들어, 최소한 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성)을 갖는 CPR 폴리펩티드를 인코드하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 도 13에 제시된 S. rebaudiana CPR 아미노산 서열 (서열 번호: 169 및 170)을 보유한다.
본원에 기재된 임의의 숙주에서, 하나 이상의 유전자의 발현이 유도될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 숙주에서, 외인성 인산가수분해효소 (phosphatase)를 인코드하는 하나 이상의 유전자는 제거되거나, 외인성 인산가수분해효소 활성이 감소되도록 저해시킬 수 있다. 예를 들어, 효모 유전자 DPP1및/또는 LPP1은는 파르네실 피로포스페이트 (FPP)가 파르네졸(farnesol)로 분해되는 것이 감소하고, 게라닐게라닐피로포스페이트 (GGPP)가 게라닐게라니올 (GGOH)로 분해되는 것이 감소하는 것과 같이 방해되거나 제거될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같이 ERG9는 스쿠알렌 합성효소 (SQS)의 감소된 생산 및 테르페노이드 전구물질의 축적이 발생하도록 변형될 수 있다. 전구물질은 배양 배지로 분비되거나 분비되질 않을 수 있고, 테르페노이드 전구물질를 소정의 테르페노이드로 대사전환시킬 수 있는 효소에 대한 기질로서 차례로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 주요 측면은 다음을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 세포에 관한 것이다.
(i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 (promoter) 서열
(ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열
(iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)
(iv) 전사 종결 신호 (transcription termination signal),
여기서, 이종성 삽입체 서열은 하기 일반식 (I)을 가지며:
-X1-X2-X3-X4-X5-
여기서, X2는 X4의 4개 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적이고 헤어핀 2차 구조 성분을 형성하는 4개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서, X3은 임의적이고, 존재한다면 X2와 X4 사이에 헤어핀 루프를 형성하는데 관여하는 짝짓지않은 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 X1 및 X5는 개별적으로나 선택적으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 오픈 리딩 프레임은 발현할 때 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 또는 그의 생물학적 활성 단편을 인코드하고, 상기 단편은 100개 이상의 아미노산의 중첩 범위에서 상기 스쿠알렌 합성효소와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 세포는 산업적으로 주목되는 테르페노이드의 수율을 향상시키는데 유용하다. 따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의한 바와 같은 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하고, (c) 테르페노이드 생성 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 세포 배양액에서 스쿠알렌 경로를 통해 합성된 테르페노이드 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 본원에 정의된 유전적으로 변형된 구조를 포함하는 세포를 제공함으로써, 테르페노이드 전구물질의 축적이 향상된다 (예를 들어, 도 20 참조).
따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 상기 전구물질을 스쿠알렌 합성효소 경로의 효소와 접촉시키고, (b) 테르페노이드 생성물을 회수하는 것을 포함하는, 파르네실-피로포스페이트 (FPP), 이소펜테닐-피로포스페이트 (IPP), 디메틸알릴-피로포스페이트 (DMAPP), 게라닐-피로포스페이트 (GPP) 및/또는 게라닐게라닐-피로포스페이트 (GGPP)로 구성되는 군으로부터 선택된 테르페노이드 전구물질로부터 유도된 테르페노이드 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 리보오좀이 RNA에 결합하는 것을 적어도 부분적으로 구조적으로 방해함으로써 스쿠알렌 합성효소의 해독(translation)을 감소시킬 수 있다. 따라서, 한 가지 측면에서 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 기능성 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)의 해독율을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
유사하게, 또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 파르네실-피로포스페이트가 스쿠알렌으로 전환되는 것을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
도 20에 도시된 바와 같이, ERG9의 넉다운 (knocking down)은 스쿠알렌 합성효소에 전구물질의 생성을 야기한다. 따라서 한가지 측면에서, 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물의 축적을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
한가지 구체예에서 본 발명은 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP) 뿐만 아니라 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP)로부터 제조될 수 있는 다른 테르페노이드들의 생산에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 구체예에서, 상기 기재한 스쿠알렌 합성효소 (SQS) 생성의 감소는 FPP를 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP)로 전환시켜 GGPP의 생산을 증가시키게 되는 것을 나타내는, 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (GGPPS)의 활성을 증가시키는데 통합될 수 있다.
따라서, 한가지 구체예에서 본 발명은 i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 (promoter) 서열, (ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, (iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame), (iv) 전사 종결 신호 (transcription termination signal)을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 미생물 세포에 관한 것이며, 여기서 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의된 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함한다.
또한, 본 문헌은 상기 언급된 미생물 세포들 중 임의의 하나를 사용하는 것을 포함하는, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 생산 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 임의의 숙주들은 미생물 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae )와 같은 사카로마이세테, 또는 대장균(Escherichia coli)), 또는 식물 또는 식물 세포 (예를 들어, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)와 같은 스테비아, 피스코미트렐라, 또는 담배 식물 또는 식물 세포)일 수 있다.
다른 정의가 없는 한, 본원에 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 해당 기술분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 적합한 방법들 및 재료들을 하기에서 설명하지만, 본원에 설명된 것들에 유사한 또는 동등한 방법들 및 재료들이 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 기타 자료들은 이들 각각의 전문이 참고자료로서 통합된다. 충돌되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법들 및 예시들은 오로지 설명을 위한 것이며, 이에 제한하는 의도는 아니다. 본 발명의 기타 특징들과 장점들은 다음의 상세한 설명으로부터 자명할 것이다. 출원인은 특허법의 표준 관행에 따라, 통상적인 구절 "포함하는(comprising)", "기본적으로 구성된(consisting essentially of)", 또는 "구성된(consisting of)"을 이용하여 임의의 공개된 발명을 대안으로 청구하는 권리를 가진다.
도면의 간단한 설명
도 1은 다양한 스테비올 글리코시드의 화학적 구조이다.
도2A-D는 스테비올로부터 스테비올 글리코시드의 생합성을 위한 대표 경로를 나타낸다.
도 3은 EUGT11 및 UGT91D2e에 의한 19-O-1,2-디글리코실화 반응의 도식이다. 수치들은 액체 크로마토그래피-질량 분광계 (LC-MS) 크로마토그램으로부터 반응의 기질 또는 생성물의 평균 신호 강도이다.
도 4는 시험관 내에서 전사되고 해독된 UGT91D2e (서열 번호:5)(좌편) 또는 EUGT11 (서열 번호:152)(우편)을 이용하여 레바우디오시드 A (RebA)로부터 레바우디오시드 D (RebD)의 생산을 보여주는 LC-MS 크로마토그램을 포함한다. LC-MS는 스테비올 + 5글루코오스 (예를 들어 RebD), 스테비올 + 4글루코오스 (예를 들어 RebA) 등에 상응하는 특정 질량을 검출하도록 설정하였다. 각 '열'은 최고치에 따라 계산한다.
도 5는 UGT91D2e (좌편) 및 EUGT11 (우편)에 의한 루보소시드의 스테비오시드 및 2' 및 3' (RebE) 화합물의 전환을 보여주는 LC-MS 크로마토그램을 포함한다.
도 6 a 및 b는 UGT91D2e (서열 번호:5, 하부 라인)의 아미노산 서열과 EUGT11 (서열 번호:152, 상부 라인)의 아미노산 서열의 정렬(alignment)이다.
도 7은 EUGT11 (서열 번호:152)의 아미노산 서열, EUGT11을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:153), 및 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 EUGT11을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:154)를 포함한다.
도 8은 UGT85H2 및 UGT71G1를 갖는 UGT91D2e의 2차 구조 예측 얼라인먼트이다. 이차 구조 예측치는 월드와이드웹상의 cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/에서 네트서프피 (NetSurfP) 버전 1.1-단백질 표면 액세시빌리티 및 2차 구조 예측치 (Protein Surface Accessibility and Secondary Structure Predictions)로 상기 세가지 UGT들의 아미노산 서열을 실행시킴므로써 만들어졌다. 이것은 단백질 내에 알파 헬릭스들 (helices), 베타 시트들 (sheets) 및 코일들 (coils)의 존재 및 위치를 예측한다. 이들은 이어서 UGT91D2e 용으로 나타내도록 같이 명명되었다. 예를 들어, 제 1 N-말단 베타-시트는 Nβ1로 명명되었다. y축은 예측치의 확실성, 보다 높은 확신도를 나타내고, x축은 아미노산 위치를 나타낸다. 이러한 UGT들 간의 주요한 서열 동일성이 매우 낮음에도 불구하고, 2차 구조는 매우 높은 보존 정도를 나타낸다.
도 9는 UGT91D1 및 UGT91D2e의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다 (서열 번호:5).
도 10은 UGT91D2e의 이중 아미노산 치환 돌연변이들의 활성에 대한 막대 그래프이다. 색칠된 막대는 스테비오시드 생생물을 나타내고, 빈칸 막대는 1,2-비오시드 생성을 나타낸다.
도 11은 스테비올 글리코시드의 생합성을 위한 UDP-글루코오스 재생산의 도식이다. SUS는 수크로오스 합성효소; Steviol은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 기질; UGT는 UDP 글리코실 전이효소를 나타낸다.
도 12a는 본원에서 SrKAHe1로 설계된 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) KAH을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:163)이다.
도 12b는 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) KAHe1을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:165)이다.
도 12c는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana ) KAHe1의 아미노산 서열 (서열 번호:164)이다.
도 13 aa 내지 ac는 S. cerevisiae (NCP1 유전자로 인코드됨)(서열 번호:166), A. thaliana (ATR1으로 인코드되고, ATR2로 인코드됨)(서열 번호: 148 및 168), 및 S. rebaudiana (CPR7으로 인코드되고, CPR8로 인코드됨)(서열 번호:169 및 170)으로부터의 CPR 폴리펩티드들의 아미노산 서열들을 포함한다.
도 13 ba 내지 be는 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 ATR1 뉴클레오티드 서열 (수탁번호:CAA23011) (서열 번호:171); 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 ATR2 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:172); 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) CPR7 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:173); 및 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) CPR8 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:174)를 포함한다.
도 14 aa 및 ab는 지아 메이즈(Zea mays)로부터의 CDPS 폴리펩티드 (서열 번호:158)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:157)을 포함한다. 굵게 밑줄친 서열은 엽록체 수송 서열을 인코드하는 서열을 제거하기 위해 삭제될 수 있다.
도 14 ba 내지 bd는 지아 메이즈(Zea mays)로부터의 CDPS 폴리펩티드 (서열 번호:158)의 아미노산 서열을 포함한다. 굵게 밑줄친 서열은 엽록체 수송 서열을 제거하기 위해 삭제될 수 있다.
도 15a는 기베렐라 후지쿠로이(Gibberella fujikuroi)로부터의 이중기능성 CDPS-KS 폴리펩티드 (서열 번호:162)를 인코드하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:161)을 포함한다. 도 15b는 기베렐라 후지쿠로이(Gibberella fujikuroi)로부터의 이중기능성 CDPS-KS 폴리펩티드 (서열 번호:162)의 아미노산 서열을 포함한다
도 16은 S. cerevisiae 두 균주, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 카우렌 합성효소 (KS-5)(T7로 설계됨, 정사각형으로 표시됨)의 추가 과발현(overexpression)으로 증대된 EFSC1972 (T2로 설계됨) 및 증대된 EFSC1972의 성장 그래프이다. y축 상의 숫자는 세포 배양액의 OD600 값들을 나타내고, x축 상의 숫자는 30℃의 합성 완전 조건 배지에서의 성장 시간을 나타낸다.
도 17 a 내지 c는 A. thaliana, S. rebaudiana (글루타메이트 (E)에 S11을 교환한 돌연변이를 갖는 콘틱(contig) 10573 선별-ORF S11E, 굵은 소문자로 표시), 및 커피 (코페아 아라비카; Coffea arabica) 수크로오스 합성효소를 인코드하는 아미노산 서열을 포함한다 (각각 서열 번호:175, 176, 및 177).
도 18은 EUGT11 또는 빈 플라스미드 ("Empty")로 형질변형된 투과성 (permeabilized) S. cerevisiae에서의 rebD의 생산 막대 그래프이다. 세포는 기하급수적 성장 상태로 성장시켰고, PBS 완충용액으로 세척하고 이어서 트리톤 X-100 (PBS 중 0.3% 또는 0.5%)으로 30℃, 30분간 처리하였다. 투과 후, 세포는 PBS로 세척하고 100 μM RebA 및 300 μM UDP-글루코오스를 함유하는 반응 혼합물에 재현탁하였다. 반응은 30℃에서 20시간 동안 진행하였다.
도 19a는 A. thaliana UDP-글리코실 전이효소 UGT72E2의 아미노산 서열 (서열 번호:178)이다.
도 19b는 A. thaliana로부터의 수크로오스 수송체 SUC1의 아미노산 서열 (서열 번호:179)이다.
도 19c는 커피로부터의 수크로오스 합성효소의 아미노산 서열 (서열 번호:180)이다.
도 20은 ERG9의 위치를 나타내는, 효모에서의 이소프레노이드 경로의 도식이다.
도 21은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae ) Cyc1 프로모터 (서열 번호:185) 및 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae ) Kex2 프로모터 (서열 번호:186)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
도 22는 각각 ERG9 프로모터 또는 ERG9 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 5' 말단 내에서 유전체(genome) 서열의 일부분과 동종성인 두 영역, HR1 및 HR2를 포함하는 PCR 생성물이 도식이다. 또한, PCR 생성물 상에는 Cre 재조합효소(recombinase)로 이후 제거되기 위해 두개의 Lox 부위 사이에 삽입될 수 있는 항생성 마커, NatR이 있다. 또한, PCR 생성물은 야생형 ScKex2, 야생형 ScCyc1 중 하나와 같은 프로모터를 포함할 수 있고, 프로모터는 그의 3'-말단에 헤어핀 (서열 번호:181-184)과 같은 이종성 삽입체를 포함할 수 있다 (도 23 참조).
도 23은 해독 개시 부위에 인접한 상부 (화살표)에 헤어핀 스템루프(hairpin stemloop)를 갖는 프로모터 및 ORF의 도식, 및 야생형 S. cerevisiae Cyc1 프로모터 서열 및 이종성 삽입체 (서열 번호:187)가 없고 4개의 상이한 이종성 삽입체 (서열 번호:188-191)를 갖는 ERG9 OPR의 개시 ATG의 정렬이다. 75%는 ScCys1 프로모터에 이어 서열 번호:184를 포함하는 구조물 (서열 번호:191)을 나타내고; 50%는 ScCys1 프로모터에 이어 서열 번호:183을 포함하는 구조물 (서열 번호:190)을 나타내고; 20%는 ScCys1 프로모터에 이어 서열 번호:182를 포함하는 구조물 (서열 번호:189)을 나타내고; 5%는 ScCys1 프로모터에 이어 서열 번호:181을 포함하는 구조물 (서열 번호:188)을 나타낸다.
도 24는 숙주 게놈 (genome)의 ERG9 유전자 앞에 삽입된 상이한 프로모터 구조물에 의해 효모 균주에서 생산된 아모르파디엔을 나타내는 막대 그래프이다. CTRL-ADS는 변형이 없는 대조 균주를 나타낸다: ERG9-CYC1-100%는 ScCyC1 프로모터는 포함하고 삽입체는 포함하지 않은 구조물을 나타낸다; ERG9-CYC1-50%는 ScCyC1 프로모터에 이어 서열 번호:183을 포함하는 구조물 (서열 번호:190)을 나타낸다; ERG9-CYC1-20%는 ScCyC1 프로모터에 이어 서열 번호:182를 포함하는 구조물 (서열 번호:189)를 나타낸다; ERG9-CYC1-5%는 ScCyC1 프로모터에 이어 서열 번호:181을 포함하는 구조물 (서열 번호:188)을 나타낸다; ERG9-KEX2-100%는 SCKex2 프로모터를 포함하는 구조물을 나타낸다.
도 25 a 내지 e는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타 (Cnadida glabrata), 아쉬브야 고시피 (Ashbya gossypii), 시베르린드네라 자디니 (Cyberlindnera jadinii), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 무스 무스쿨러스 (Mus musculus), 및 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus)로부터의 스쿠알렌 합성효소 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 번호:192-202) 및 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergilus nidulans) 및 사카로마이세스 세레비시에 (S. cerevisiae )로부터의 게라닐게라닐 디포스페이드 합성효소 (GGPPS)의 아미노산 서열 (서열 번호: 203 및 167)을 포함한다.
도 26은 72시간 경과 후 ERG9-CYC1-5% 균주 및 ERG9-KEX2 균주에의서 게라닐게라니올 (GGOH) 축적량의 막대 그래프이다.
도 27은 UGT91D2e 및 EUGT11에 의한 RebF 생산을 위한 루부소시드의 자일로실화된 중간물질로의 전환을 보여주는 대표 크로마토그래프이다.
다양한 도면에서 유사한 참고 기호는 유사한 요소들을 가리킨다.
발명의 상세한 설명
본 문헌은 재조합 숙주들 예를 들어 식물 세포, 식물 또는 미생물이 스테비올 글리코시드들, 예를 들어 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A의 생합성에 유용한 폴리펩티드를 발현시키도록 개발할 수 있다는 발견에 근거한다. 본원에 기재된 재조합 숙주는 레바우디오시드 D 생산에 특히 유용하다. 이러한 숙주들은 스테비올 글리코시드 생산에 적합한 하나 이상의 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소를 발현시킬 수 있다. 다양한 미생물 새시(chassis)에서 이러한 생합성 폴리펩티드의 발현으로, 예를 들어 당, 글리세롤, CO2, H2, 및 태양광과 같은 에너지 및 탄소원으로부터 일관되고 재생가능한 방식으로 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있도록 한다. 일관된 맛 프로파일을 가진 감미료 조성물을 생산하기 위하여, 사전선택된 생합성 효소들을 숙주 안으로 통합시키고 적절한 수준에서 이들을 발현시킴으로써 재조합 숙주에 의해 생산된 각 스테비올 글리코시드의 비율을 맞출 수 있다. 또한, 재조합 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드의 농도는 스테비아 식물에서 생산되는 스테비올 글리코시드의 수준보다 더 높을 것으로 예상되며, 이는 이후 정제공정의 효율을 개선시킨다. 이러한 감미료 조성물들은 스테비아 추출물들에 존재하는 오염물질들의 양과 비교하여 식물 기반의 오염물질들을 아주 적게 포함하거나 포함하지 않는다.
이들 유전자 중 적어도 하나는 재조합 유전자, 용도에 따라 선별된 종 또는 균주에 따른 특정 재조합 유전자(들)이다. 스테비올 글리코시드 수율을 증가시키고, 에너지 및 탄소원이 스테비올 및 이의 글리코시드로 전환되는 효율을 개선시키고, 및/또는 세포 배양물 또는 식물로부터 생산성을 증대시키기 위하여 추가적인 유전자들 또는 생합석 모듈을 포함시킬 수 있다. 이러한 추가 생합성 모듈은 테르페노이드 전구물질들, 이소펜테닐 디포스페이트 및 디메틸알릴 디포스페이트에 관련된 유전자들을 포함한다. 추가적인 생합성 모듈은 테르펜 합성효소 및 테르펜 시클라아제(cyclase) 유전자, 예를 들어 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 및 코파릴 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자들을 포함하며; 이들 유전자는 내생성 유전자 또는 재조합 유전자일 수 있다.
I. 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들
A. 스테비올 생합성 폴리펩티드들
디테르펜 스테비올 및 다양한 스테비올 글리코시드를 포함하여 스테비아 추출물들에서 발견된 몇몇 화합물에 대한 화학 구조물들을 도 1에 나타내었다. CAS 번호는 하기 표 A에 나타낸다. Harriet Wallin, Food Agric.Org (2007)에 의해 제시된 스테비올 글리코시드 화학적 및 기술적 평가 (Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment) 69th JECFA 참조.
표 A
Figure 112014022593516-pct00001
미생물과 같은 숙주에서 특정 유전자의 발현은 숙주에서 스테비올 글리코시드를 합성하는 능력을 부여하는 것으로 밝혀져 왔다. 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 이러한 유전자 중 하나 이상은 숙주에 자연적으로 존재할 수 있다. 그러나, 전형적으로 이러한 유전자 중 하나 이상은 자연 상태에서 이들을 보유하지 않는 숙주로 형질도입시킨 재조합 유전자들이다.
스테비올을 생산하는 생화학적 경로는 스테비올 형성을 위해 게라닐게라닐 디포스페이트의 형성, (-) 코파릴 디포스페이트로 고리 형성, 이어서 산화 및 히드록실화(hydroxylation)를 포함한다. 따라서, 재조합 미생물에서 게라닐게라닐 디포스페이트의 스테비올로의 전환은 카우렌 합성효소 (KS)를 인코드하는 유전자, 카우렌 산화효소 (KO)를 인코드하는 유전자, 그리고 스테비올 합성효소 (KAH)를 인코드하는 유전자의 발현과 관련된다. 스테비올 합성효소는 또한 카우레논산 13-수산화효소(hydroxylase)로 공지되어 있다.
적합한 KS 폴리펩티드는 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 KS 효소들은 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana), 지아 메이즈 (Zea mays) 및 포풀루스 트리초카르파 (Populus trichocarpa), 및 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 표 1 및 서열 번호:132-135 및 156 참조. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 서열 번호:40-47 및 155에 제시되었다. 서열 번호:40-43에 제시된 뉴클레오티드 서열들은 효모에서 발현되도록 변형된 반면, 서열 번호:44-47에 제시된 뉴클레오티드 서열은 KS 폴리펩티드로 식별되어진 원천 유기체로부터 기인한다.
표 1
KS 클론( Clones )
Figure 112014022593516-pct00002
적합한 KO 폴리펩티드는 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 KO 효소들은 스테비아 레바우디아 (Stevia rebaudiana), 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 기베렐라 푸지코로이 (Giberella fujukoroi) 및 트라메테스 베르시콜라 (Trametes versicolor)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 표 2 및 서열 번호:138-141 참조. 이러한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 서열 번호:52-59에 제시한다. 서열 번호:52-55에 제시된 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형되었다. 서열 번호:56-59에 제시된 뉴클레오티드 서열은 KO 폴리펩티드로 식별된 공급원 유기체로부터 기인한다.
표 2
KO 클론
Figure 112014022593516-pct00003
적합한 KAH 폴리펩티드는 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 KAH 효소들은 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana), 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 비티스 비니페라 (Vitis vinifera) 및 메디카고 투룬쿨라타 (Medicago trunculata)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 표 3, 서열 번호:142-146; 미국 특허 공개 번호 제2008-0271205호; 미국 특허 공개 번호 제2008-0064063호 및 진뱅크 (Genbank) 수탁번호 gi 189098312 참조. 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터의 스테비올 합성은 CYP714A2로 분류된다. 이들 KAH 효소를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:60-69에 제시한다. 서열 번호:60-64에 제시된 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형된 반면, 폴리펩티드가 식별된 공급원 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:65-69에 제시한다.
표 3
KAH 클론
Figure 112014022593516-pct00004
또한, 본원에서 식별된 스테비아 레바우디아나로부터의 KAH 폴리펩티드는 재조합 숙주에 특히 유용하다. S. rebaudiana KAH (SrKAHe1) (서열 번호:164)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:163)은 도 12a에 제시한다. 효모에서 발현하도록 코돈-최적화된 S. rebaudiana KAH를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:165)은 도 12b에 제시한다. S. rebaudiana KAH의 아미노산 서열은 도 12c에 제시한다. S. rebaudiana KAH는 S. cerevisiae에서 발현될 때, 야마구치 등 (Yamaguchi et al.)의 미국 특허 공개 번호 제2008/0271205 A1호에 기재된 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 엔트-카우레논산 수산화효소와 비교하여 상당히 높은 스테비올 합성효소 활성을 보여준다. 도 12c에 제시된 S. rebaudiana KAH 폴리펩티드는 미국 특허 공개 번호 제2008/0271205호의 KAH에 대해 20% 미만의 동일성; 미국 특허 공개 번호 제2008/0064063호의 KHA에 대해 35% 미만의 동일성을 갖는다.
일부 구체예들에서, 재조합 미생물은 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 함유한다. 이러한 미생물은 통상적으로 씨토크롬(cytochrome) P450 환원효소 (CPR) 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 또한 함유하는데, 이는 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드들의 특정 조합은 외인성 CPR 폴리펩티드의 발현을 필요로하기 때문이다. 특히, 식물 기원의 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드의 활성은 외인성 CPR 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자의 통합에 의해 상당히 증가될 수 있다. 적합한 CPR 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 CPR 효소는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 및 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 표 4 및 서열 번호:147 및 148 참조. 이들 폴리펩티드들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:70, 71, 73 및 74에 제시한다. 서열 번호:70-72에 제시된 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형되었다. 폴리펩티드가 식별된 공급 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:73-75에 제시한다.
표 4
CPR 클론
Figure 112014022593516-pct00005
예를 들어, SrKAHe1로 인코드된 스테비올 합성효소는 유전자 NCP1 (YHR042W)로 인코드된 S. 세레비시에(S. cerevisiae)에 의해 활성화된다. 유전자 ATR2로 인코드된 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) CPR 또는 유전자 CPR8로 인코드된 S. 레바우디아나(S. rebaudiana) CPR이 동시 발현될 때, SrKAHe1로 인코드된 스테비올 합성효소의 보다 높은 활성화가 관찰된다. 도 13 aa 내지 ac는 (ATR1 및 ATR2 유전자로부터의) S. 세레비시에(S. cerevisiae), A. 안탈리아나(A. thaliana) 및 (CPR7 및 CPR8 유전자로부터의) S. 레바우디아나(S. rebaudiana) CPR 폴리펩티드 의 아미노산 서열을 포함한다 (서열 번호:166-170). 도 13 ba 내지 be는 A. 탈리아나(A. thaliana) 및 S. 레바우디아나(S. rebaudiana) CPR 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (서열 번호:171-174).
예를 들어, 효모 유전자 DPP1 및/또는 효모 유전자 LPP1은 파르네실 피로포스테이트 (FPP)의 파르네졸(farnesol)로의 분해가 감소되고, 게라닐게라닐피로포스페이트 (GGPP)의 게라닐게라니올 (GGOH)로의 분해가 감소되기 위해 방해되거나 제거될 수 있다. 대안으로, 이들 인코드된 단백질들의 발현이 변경되도록 인가수분해효소 (phophatase)를 인코드하는 내인성 유전자의 프로모터 (promoter) 또는 인핸서 (enhancer) 성분들을 변형할 수 있다. 동종의 재조합 방법이 내인성 유전자를 방해하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, "유전자 치환(gene replacement)" 벡터(vector)는 선택가능한 마커 유전자를 포함하도록 하는 방법으로 구성될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 동종의 재조합을 중개하기에 충분한 길이의 유전자 부위에서 5' 및 3' 말단 모두에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 선택가능한 마커는 숙주 세포 영양요구성(auxotrophy)를 보충하고, 항생제 내성을 제공하고, 또는 색상 변화를 야기하는 임의의 수의 유전자들 중 하나일 수 있다. 유전자 치환 벡터의 선형 DNA 단편들을 당 업계에 공지된 바와 같은 방법들을 이용하여 세포에 도입시킨다 (하기 참조). 선형 단편의 유전체(genome)로의 통합 및 유전자의 분열은 선별 마커에 따라 결정될 수 있고, 예를 들어 Southern blot 분석법으로 입증할 수 있다. 선별에서 이들 사용에 뒤이어, 선별가능한 마커를 숙주 세포의 유전체로부터 Cre-lox 시스템에 의해 제거할 수 있다 (예를 들어, 고센 등; Gossen te al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 및 미국 특허 공개 번호 제20060014264호 참조). 다르게는, 유전자 치환 벡터는 임의의 내인성 유전자 프로모터 서열이 결여되고 아무것도 인코드하지 않은 분해된 유전자의 일부, 또는 유전자의 코딩 서열의 비활성 단편을 포함하는 것과 같은 방법으로 구성할 수 있다. "비활성 단편"은 유전자의 전장 (full-length) 코딩 서열로부터 생성된 단백질의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 0%)의 활성을 갖는 단백질을 인코드하는 유전자의 단편이다. 상기 유전자의 이러한 부분은 알려지지 않은 프로모터 서열이 상기 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되나, 종결 코돈 및 전사 종결 서열은 상기 유전자 서열의 일부분에 작동 가능하게 연결되는 방법으로 백터에 삽입된다. 이 벡터는 이후 유전자 서열의 일부로 선형화되고, 세포안으로 형질변환된다. 단일 동종 재조합의 방법에 의해, 상기 선형화된 벡터는 이후 유전자의 내인성 상응체(counterpart)로 통합된다.
재조합 미생물에서 이들 유전자의 발현으로 게라닐게라닐 디포스페이트가 스테비올로 전환된다.
B. 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들
본원에 기재된 재조합 숙주는 스테비올을 스테비올 글리코시드로 전환시킬 수 있다. 이러한 숙주 (예를 들어, 미생물)은 UGTs로도 공지된 하나 이상의 UDP 글리코실 전이효소를 인코드하는 유전자를 포함한다. UGTs는 활성화된 뉴클레오티드 당으로부터 모노사카라이드 단위 (monosaccharides unit)를 수용체 잔기, 이 경우 스테비올 또는 스테비올 유도체의 -OH 또는 -COOH 잔기로 전달한다. UGPs는 서열 상동성에 근거하여 족(families) 및 아족(subfamilies)로 분류된다. 리 등 (Li et al.) J. Biol . Chem. 276:4338-4343(2001).
B. 1 루부소시드 생합성 폴리펩티드들
루부소시드의 생합성은 스테비올의 13-OH와 19-COOH의 글리코실화(glycosylation)와 관련있다. 도 2a 참조. 미생물과 같은 재조합 숙주에서 스테비올의 루부소시드로의 전환은 UGTs 85C2 및 74G1을 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 수행될 수 있고, 이들은 각각 스테비올의 13-OH 또는 19-COOH로 글루코오스 단위를 전달한다.
적합한 UGT85C2은 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올 13-OH 전이효소, 및 우리딘 5-디포스포 글루코실:스테비올-19-O-글루코시드 13-OH 전이효소로서 작용한다. 기능을 하는 UGT85C2 폴리펩티드들은 스테비올 및 스테비올-19-O-글루코시드 이외의 스테비올 글리코시드 기질들을 이용하는 글루코실 전이효소 반응들을 또한 촉매할 수 있다.
적합한 UGT74G1 폴리펩티드는 우리딘 5-디포스포 글루코실:스테비올 19-COOH 전이효소 및 우리딘 5'-디포스포 글루코실:스테비올-13-O-글루코시드 19-COOH 전이효소로서 기능을 한다. 기능을 하는 UGT74G1 폴리펩티드들은 스테비올 및 스테비올-13-O-글루코시드 이외의 스테비올 글리코시드 기질을 이용하거나, 또는 우리딘 디포스페이트 글루코오스 이외의 도너(donor)로부터 당 모이어티를 전달하는 글리코실 전이효소 반응을 또한 촉매할 수 있다.
기능을 하는 UGT74G1 및 기능을 하는 UGT85C2를 발현시키는 재조합 미생물은 스테비올이 배지에 공급원료로서 사용될 때 루부소시드 및 두가지 스테비올 모노시드 모두 (즉, 스테비올 13-O-모노글루코시드 및 스테비올 19-O-모노글루코시드)를 만들 수 있다. 이러한 유전자 중 하나 이상은 이 숙주안에 자연적으로 존재할 수 있다. 그러나, 전형적으로 이러한 유전자들은 이들을 자연적으로 보유하지 않는 숙주 (예를 들어, 미생물)로 형질전환된 재조합 유전자들이다.
본원에 이용된 것과 같이, 용어 재조합 숙주는 적어도 하나 이상의 통합된 DNA 서열에 의해 보강된 게놈을 갖는 숙주를 의미한다. 이러한 DNA 서열들은 자연적으로 존재하지 않는 유전자, RNA로 정상적으로 전사되지 않거나 단백질로 해독("발현된")되지 않는 DNA 서열, 및 비-재조합 숙주 안으로 도입되기를 바라는 기타 유전자들이나 DNA 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 재조합 숙주의 게놈은 전형적으로 하나 이상의 재조합 유전자의 안정적인 도입을 통하여 보강되는 것으로 인지할 것이다. 일반적으로, 도입된 DNA는 이 DNA의 수령체인 숙주에 원래 존재하는 것이 아니지만, 그러나 주어진 숙주로부터 DNA 분절을 단리시키고, 이어서 동일한 숙주 안으로 이 DNA의 하나 이상의 추가 복사체체들을 도입키시는 것, 예를 들어 유전자 산물의 생산을 증대시키거나 또는 유전자의 발현 패턴을 변경시키는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 일부 경우에서, 도입된 DNA, 예를 들어 상동성 재조합 또는 특정 부위 돌연변이생성에 의한 내생성 유전자나 DNA 서열을 변경 또는 심지어 대체할 수 있다. 적합한 재조합 숙주들은 미생물, 식물 세포, 및 식물을 포함한다.
용어 "재조합 유전자"는 동일하거나 유사한 유전자 또는 DNA 서열이 이미 이러한 숙주에 존재할 수 있는 것과 상관없이, 수령 숙주 안으로 도입되는 유전자 또는 DNA 서열을 의미한다. 본 내용 중에 "도입된(introduced)" 또는 "보강된(augmented)"은 인위적으로 도입된 또는 보강된다는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 재조합 유전자는 또다른 종으로부터 기인된 DNA 서열일 수도 있고, 또는 동일한 종으로부터 유래되거나 이에 존재하지만 재조합 숙주를 만들기 위해 재조합 방법들을 통하여 숙주 안으로 통합된 DNA 서열일 수 있다. 숙주 안으로 도입된 재조합 유전자는 형질변환되는 숙주에 정상적으로 존재하는 DNA 서열과 동일할 수 있고, 도입되어 이 DNA의 하나 이상의 추가적인 복사체들을 제공하고, 이로 인하여 상기 DNA의 유전자 산물의 과다 발현 또는 변형된 발현을 허용한다는 것을 인지할 것이다.
적합한 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 스테비아로부터 기인된 기능을 하는 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들을 인코드하는 유전자는 리치만 등(Richman, et al. Plant J. 41:56-67(2005))에 보고된다. S. rebaudiana UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들의 아미노산 서열은 서열 번호:1 및 3에 각각 제시한다. 효모에서 발현하도록 최적화된 UGT74G1 및 UGT85C2를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:2 및 4에 각각 제시한다. UGTs85C2, 91D2e, 74G1 및 76G1에 대해 DNA 2.0 코돈-최적화된 서열을 서열 번호: 82, 84, 83 및 85에 각각 제시한다. 또한 하기 "기능성 동족체" 섹션에 기재된 UGT85C2 및 UGT74G1 변이체 참조. 예를 들어, 65, 71, 270, 289 및 389 위치에서 치환을 포함하는 UGT85C2 폴리펩티드를 사용할 수 있다 (예를 들어, A65S, E71Q, T270M, Q289H, 및 A389V).
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 미생물이다. 재조합 미생물은 루부소시드를 생산하기 위하여 스테비올을 함유하는 배지에서 성장시킬 수 있다. 그러나, 또다른 구체예에서, 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 재조합 유전자, 예를 들어 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또한 KAH 유전자를 발현시킨다. 적합한 CDP 폴리펩티드는 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 CDPS 효소는 스테비아 레레바우디아나(Stevia rebaudiana), 스트렙토마이세스 클라불리게루스 (Streptomyses clavuligerus), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 지아 메이즈 (Zea mays) 및 아라비도프시스에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 표 5 및 서열 번호:129-131, 158, 및 160 참조. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 서열 번호:34-39, 157, 및 159에 제시한다. 서열 번호:34-36에 제시된 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형되었다. 폴리펩티드들이 식별된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:37-39에 제시한다.
일부 구체예에서, 변형되지 않은 폴리펩티드의 아미노산 말단에서 엽록체 수송 펩티드가 결여된 CDPS 폴리펩티드들은 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 14에 도시한 지아 메이즈(Zea mays) CDPS 코딩 서열의 5' 말단으로부터 첫번째 150개 뉴클레오티드들(서열 번호:157)은 제거될 수 있다. 이것은 엽록체 수송 펩티드를 인코드하는 도 14에 도시한 아미노산 서열 (서열 번호:158)의 아미노 말단 50개 잔기들은 제거하는 것이다. 절두된 CDPS 유전자는 새로운 ATG 해독 개시 부위와 맞게되고 프로모터, 통상적으로 항시성이거나 고도로 발현되는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 절두된 코딩 서열의 다수의 복사체체들이 미생물에 도입될 때, 프로모터로부터 CDPS 폴리펩티드의 발현은 엔트-카우렌 생합성쪽으로 중가된 탄소 유동을 야기한다.
표 5
CDPS 클론
Figure 112014022593516-pct00006
CDPS-KS 이중기능성 단백질 (서열 번호:136 및 137)도 이용될 수 있다. 표 6에 나타낸 CDPS-KS 이중기능성 효소를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 효모에서 발현되도록 변형되었다 (서열 번호:48 및 49 참조). 폴리펩티드들이 원래 식별된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열들은 서열 번호:50 및 51에 제시한다. 기베렐라 푸지쿠로이 (Gibberella fujikuroi)로부터의 이중기능성 효소 (서열 번호:162)도 이용될 수 있다. 기베렐라 푸지쿠로이 이중기능성 CDPS-KS 효소를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형되었다 (도 15a, 서열 번호:161 참조).
표 6
CDPS - KS 클론
Figure 112014022593516-pct00007
따라서, UGT74G1 및 UGT85C2 유전자 이외에도 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및 KAH 유전자를 포함하는 미생물은 원료 공급원으로서 스테비올을 사용할 필요없이 스테비올 모노시드 및 루부소시드 모두를 생산할 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 또한 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 (GGPPS)를 인코드하는 재조합 유전자를 발현시킨다. 적합한 GGPPS 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 GGPPS 효소에는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana), 기베렐라 푸지쿠로이 (Gibberella fujikuroi ), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 탈라씨오시라 슈도나나 (Thalassiosira pseudonana), 스트렙토마이세스 클라불리게루스 (Streptomyces clavuligerus), 술풀로부스 아시도칼다리우스 (Sulfulobus acidocaldarius), 시네초코커스 종(Synechococcus sp.) 및 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana )로부터 만들어진 것들을 포함한다. 표 7 및 서열 번호:121-128 참조. 이들 폴리펩티드들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:18-33에 제시한다. 서열 번호:18-25에 제시된 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 변형된 반면 폴리펩티드들이 식별된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:26-33에 제시한다.
표 7
GGPPS 클론
Figure 112014022593516-pct00008
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 또한 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관련된 재조합 유전자, 가령 하기 본원에서 논의되는 메틸에리트리톨 4-포스페이트 (MEP) 경로에 있는 유전자 또는 메발로네이트 (MEV) 경로에 있는 유전자를 더 발현시킬 수 있고/있거나, 감소된 인산가수분해효소(phosphatase) 활성을 갖고/갖거나, 본원에서 논의된 바와 같은 수크로오스 합성효소 (SUS)를 발현시킨다.
B. 2 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 D, 및 레바우디오시드 E 생합성 폴리펩티드들
레바우디오시드 A의 생합성은 아글리콘(aglycone) 스테비올의 글루코실화 (glucosylation)과 관련된다. 특히, 레바우디오시드 A는 13-O-스테비올모노시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 글루코실화, 스테비올-1,2-비오시드를 형성하는 스테비올모도시드의 13-O-글루코오스의 C-2'의 글루코실화, 스테비오시드를 형성하는 스테비올-1,2-비오시드의 C-19 카르복실의 글루코실화, 및 스테비오시드의 C-13-O-글루코오스의 C-3'의 글루코실화에 의해 형성될 수 있다. 각 글루코실화 반응이 일어나는 순서는 가변적일 수 있다. 도 2a 참조.
레바우디오시드 E 및/또는 레바우디오시드 D의 생합성은 아글리콘 스테비올의 글루코실화와 관련된다. 특히, 레바우디오시드 E는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 글루코실화, 스테비올-1,2-비오시드를 형성하는 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'의 글루코실화, 1,2-스테비오시드를 형성하는 1,2-비오시드의 C-19 카르복실의 글루코실화, 및 레바우디오시드 E를 형성하는 1,2-스테비오시드의 19-O-글루코오스의 C-2'의 글루코실화에 의해 형성될 수 있다. 레바우디오시드 D는 레바우디오시드 E의 C-13-O-글루코오스의 C-3'의 글루코실화에 의해 형성될 수 있다. 각 글루코실화 반응이 일어나는 순서는 가변적일 수 있다. 예를 들어, 19-O-글루코오스의 C-2'의 글루코실화는 상기 경로에서 마지막 단계일 수 있고, 레바우디오시드 A는 상기 경로에서 중간 물질일 수 있다. 도 2c 참조.
재조합 숙주에서 스테비올을 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 D, 및/또는 레바우디오시드 E로 전환시키는 것은 다음의 기능성 UGTs: EUG11, 74G1, 85C2, 및 76G1, 및 선택적으로 91D2의 발현에 의해 실현될 수 있는 것으로 발견되었다. 따라서, 스테비올을 원료공급원으로 사용할 때, 이들 4가지 또는 5가지 UGTs의 조합을 발현시키는 재조합 미생물은 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 D를 만들 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자들 중 하나 이상은 원래 자연상태에서 이들을 보유하지 않는 미생물로 형질변환된 재조합 유전자이다. 또한, SM12UGT로 본원에서 설계된 UGTs는 UGT91D2를 대체할 수 있다는 것을 발견하였다.
일부 구체예에서, 5개 미만 (예를 들어 1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 UGT는 숙주에서 발현된다. 예를 들어, 기능성 EUGT11을 발현시키는 재조합 미생물은 레레바우디오시드 A를 원료공급원으로 사용할 때 레바우디오시드 D를 만들 수 있다. 2개의 기능성 UGTs, EUGT11 및 76G1, 및 임의로 기능성 91D12를 발현시키는 재조합 미생물은 루부소시드 또는 1,2-스테비오시드를 원료공급원으로 사용할 때 레바우디오시드 D를 만들 수 있다. 또 다른 대안으로서, 3개의 기능성 UGTs, EUGT11, 74G1, 76G1, 및 임의로 91D2를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드를 공급할때 레바우디오시드 D를 만들 수 있다. 유사하게, 재조합 미생물에서 스테비올-19-O-글루코시드를 레바우디오시드 D로 전환시키는 것은 스테비올-19-O-글루코시드를 배지에 공급할때 UGTs:EUGT11, 85C2, 76G1, 및 임의로 91D2를 인코드하는 유전자의 발현에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자 중 하나 이상은 원래 자연상태에서 이들을 보유하지 않는 숙주에 형질변환된 재조합 유전자이다.
적합한 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 상기 언급된 것들을 포함한다. 적합한 UGT76G1은 수용체 분자, 스테비올 1,2-글리코시드의 C-13-O-글루코오스의 C-3'에 글루코오스 모이어티를 첨가한다. 따라서, UGT76G1은 예를 들어 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올 13-O-1,2 글루코시드 C-3' 글루코실 전이효소 및 우리딘5'-디포스포 글루코실:스테비올-19-O-글루코오스, 13-O-1,2 비오시드 C-3' 글루코실 전이효소로서 기능한다. 기능성 UGT76G1 폴리펩티드들은 또한 글루코오스 이외의 다른 당을 함유하는 스테비올 글리코시드 기질들, 예를 들어 스테비올 람노시드와 스테비올 자일로시드를 이용하는 글루코실 전이효소 반응을 촉매할 수 있다. 도 2a, 2B, 2C, 및 2D참조. 적합한 UGT76G1 폴리펩티드들은 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana)에 의해 만들어지고, 리치만 등(Richman, el al. Plant J. 41:56-67 (2005)에 보고된 것들을 포함한다. 스테비아 레바우디아나 UGT76G1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:7에 제시한다. 서열 번호:7의 UGT76G1 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현되도록 최적화되었으며, 서열 번호:8로 제시한다. 또한 "기능성 동족체" 섹션에 제시된 UGT76G1 변이체 참조.
적합한 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드들은 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'에 글루코오스 모이어티를 전달하는, 우리딘 5'-디포스포 글루코실:스테비올-13-O-글루코시드 전이효소 (또한 스테비올-13-모노글루코시드 1,2-글루코실라아제라고 언급됨)로 기능한다.
적합한 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드는 또한 스테비오시드를 생산하기 위해 수용체 분자, 루부소시드의 13-O-글루코오스의 C-2'에 글루코오스스 모이어티를 전달하는 우리딘 5'-디포스포 글루코실:루부소시드 전이효소로 기능한다. 또한, EUGT11 폴리펩티드는 19-O-1,2-디글리코실화된 루부소시드를 생산하기 위해 수용체 분자, 루부소시드의 19-O-글루코오스의 C-2'에 글루코오스 모이어티를 전달할 수 있다 (도 3의 화합물 2).
기능성 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드들은 또한 스테비올-13-O-글루코시드 및 루부소시드 이외의 스테비올 글리코시드 기질들을 이용하는 반응을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 기능성 EUGT11 폴리펩티드는 레바우디오시드 E를 생산하기 위해 19-O-글루코오스 잔기의 C-2'에 글루코오스 모이어티를 전달하는, 기질로서 스테비오시드를 이용할 수 있다 (도 3의 화합물 3 참조). 기능성 EUGT11 및 UGT91D2 폴리펩티드는 또한 레바우디오시드 D를 생산하기 위해 레바우디오시드 A의 19-O-글루코오스 잔기의 C-2'에 글루코오스 모이어티를 전달하는, 기질로서 레바우디오시드 A를 이용할 수 있다. 실시예에 제시된 바와 같이, 반응이 유사한 조건, 즉, 유사한 시간, 온도, 순도, 및 기질 농도 하에서 수행될 때 EUGT11은 레바우디오시드 A를 레바우디오시드 D로, UGT91D2e (서열 번호:5)의 상응하는 속도보다 적어도 20배 빠른 (예를 들어, 적어도 25배 또는 적어도 30배 빠름) 속도로 전환시킬 수 있다. 이와 같이, EUGT11은 유사한 조건 하에서 배양할 때 UGT91D2e 보다 많은 양의 RebD를 생산할 수 있다.
또한, 기능성 EUGT11은 기질로서 루부소시드 또는 스테비오시드와 상당한 C-2' 19-O-디글리코실화 (diglycosylation) 활성을 나타내는 반면, UGT91D2e는 이들 기질들과 검출가능한 디글리코실화 활성을 갖지 않는다. 따라서, 기능성 EUGT11은 스테비올 글리코시드 기질-특이성에서의 차이로 인해 UGT91D2e와 구분될 수 있다. 도 3은 EUGT11 및 UGT91D2e에 의해 실행되는 19-O-1,2 디글리코실화 반응의 도식 개요를 제공한다.
기능성 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드는 전형적으로 글루코오스 모이어티를 C-13 위치에서 1,3-결합된 글루코오스를 함유하는 스테비올 화합물로 전달하지 않으며, 즉 글루코오스 모이어티를 스테비올 1,3-비오시드 및 1,3-스테비오시드로의 전달이 발생하지 않는다.
기능성 EUGT11 및 UGT91D2 폴리펩티드는 우리딘 디포스페이트 글루코오스 이외의 도너로부터 당 모이어티를 전달할 수 있다. 예를 들어, 기능성 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드는 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'에 자일로오스 모이어티를 전달할 수 있는, 우리딘 5'-디포스포 D-자일로실:스테비올-13-O-글루코시드 전이효소로서 작용한다. 또 다른 예로서, 기능성 EUGT11 또는 UGT91D2 폴리펩티드는 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'에 람노오스 모이어티를 전달할 수 있는, 우리딘 5'-디포스포 L-람노실: 스테비올-13-O-글루코시드 전이효소로서 작용한다.
적합한 EUGT11 폴리펩티드들이 본원에 기재되었으며, 오리자 사티바 (Oryza sativa) (GendBank 수탁번호 AC133334)로부터의 EUGT11 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, EUGT11 폴리펩티드는 서열 번호:152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다 (도 7 참조). 서열 번호:152의 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:153에 제시한다. 서열 번호:154는 효모에서 발현되도록 코돈-최적화된 서열 번호:152의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다.
적합한 기능성 UGT91D2 폴리펩티드들은 본원에 개시된 것들, 예를 들어 UGT91D2e 및 UGT91D2m으로 지정된 폴리펩티드들을 포함한다. 스테비아 레바우디아나로부터의 예시적인 UGT91D2e 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:5에 제시한다. 서열 번호:6은 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 서열 번호:5의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:5의 폴리펩티드를 인코드하는 스테비아 레바우디아나 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:9에 제시한다. 스테비아 레바우디아나로부터의 예시적인 UGT91D2m 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:10 및 12에 제시하고, 각각 서열 번호:11 및 13에 제시된 핵산 서열에 의해 인코드된다. 또한, 서열 번호:5의 아미노산 잔기 206, 207, 및 343에서의 치환기를 포함하는 UGT91D2 변이체들이 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 UGT92D2e (서열 번호:5) G206R, Y207C, 및 W343R에 관계된 돌연변이를 갖는, 서열 번호:95에 제시된 아미노산 서열이 이용될 수 있다. 또한, 아미노산 잔기 211 및 286에서 치환기들을 포함하는 UGT91D2 변이체가 이용될 수 있다. 예를 들어, UGT91D2 변이체는 211 위치에서 류신을 대신해 메티오닌의 치환 및 서열 번호:5의 286 위치에서 발린을 대신해 알라닌의 치환 (UGT91D2e-b)을 포함할 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본원에서 SM12UGT로 지정된 UGTs는 UGT91D2를 대체할 수 있다. 적합한 기능성 SM12UGT 폴리펩티드는 이포모에아 푸르푸레아 (Ipomoea purpurea)(일본산 나팔꽃;Japanese morning glory)에 의해 만들어지고, 모리타 등 (Morita et al.) Plant J. 42,353-365 (2005)에 기재된 것들을 포함한다. 이포모에아 푸르푸레아 (I. purpurea) IP3GGT 폴리펩티드를 인코드하는 아미노산 서열은 서열 번호:76에 제시한다. 서열 번호:77은 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 서열 번호:76의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다. 또 다른 적합한 SM12UGT 폴리펩티드는 R25S 돌연변이를 갖는 Bp94B1 폴리펩티드이다. 오스마니 등 (Osmani et al.) Plant Phys.148:1295-1308 (2008) 및 스와다 등 (Swada et al.) J. Biol . Chem. 280:899-906 (2005) 참조. 벨리스 퍼레니스 (Bellis perennis)(붉은 데이지) UGT94B1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:78에 제시한다. 서열 번호:79는 효모에서 발현되도록 코돈 최적화된 서열 번호:78의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구체예에서, 재조합 미생물은 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 D를 생산하기 위하여 스테비올-13-O-글리코시드 또는 스테비올-19-O-글루코시드를 함유하는 배지에서 성장된다. 이러한 구체예에서, 미생물은 기능성 EUGT11, 기능성 UGT74G1, 기능성 UGT85C2, 기능성 UGT76G1, 및 임의의 기능성 UGT91D2를 인코드하는 유전자를 포함하고 발현시키고, 그리고 스테비올, 스테비올모노시드, 또는 루부소시드 중 하나 또는 둘 모두를 공급원료로 사용할 때 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 D를 축적할 수 있다.
다른 구체예에서, 재조합 미생물은 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 D를 생산하기 위하여 루부소시드를 함유하는 배지에서 성장된다. 이러한 구체예에서, 미생물은 기능성 EUGT11, 기능성 UGT76G1, 및 임의의 기능성 UGT91D2를 인코드하는 유전자를 포함하고 발현시키고, 그리고 루부소시드를 공급원료로 사용할 때 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 D를 생산할 수 있다.
다른 구체예에서, 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들어 EUGT11, UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, 및 임의의 기능성 UGT91D2 (예컨데 UGT91D2e)에 더하여 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및 KAH 유전자를 포함하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 함유할 필요없이 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 D, 및/또는 레레바우디오시드 E를 생산할 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 또한 스테비올 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 포함하고 발현시킨다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 또한 게라닐게라닐 디포스페이트, 엔트-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하여 그로인해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통해 증가된 유동을 제공하는 비-스테비올 경로의 발현에 침묵하는 구조물을 포함한다. 예를 들어, 에르고스테롤과 같은 스테롤 생산 경로를 위한 유동은 ERG9 유전자의 하향조절을 통해 감소될 수 있다. 하기 ERG9 섹션 및 실시예 24-25 참조. 기베렐린을 생성하는 세포에서, 기베렐린 생합성은 엔트-카우레논산의 스테비올로의 유동을 증가시키기 위해 하향조절될 수 있다. 카로티노이드-생성 미생물에서, 스테비올로의 유동은 하나 이상의 카로티노이드 생합성 유전자의 하향조절을 통해 증가될 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 미생물은 또한 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질의 생산에 관련된 재조합 유전자, 예를 들어 인가수분해효소 활성이 감소되고, 및/또한 본원에 언급된 바와 같은 SUS를 발현시키는 하기 논의되는 MEP 또는 MEV 경로에서의 유전자를 발현시킬 수 있다.
당 업계의 숙련자는 상이한 UGT 유전자들의 상대적 발현 수준을 변경시킴으로써, 재조합 숙주가 소정의 비율로 스테비올 글리코시드 산물을 특이적으로 생산하도록 만들 수 있다는 것을 인지할 것이다. 스테비올 생합성 유전자 및 스테비올 글리코시드 생합성 유전자의 전사 조절은 당 업자에게 공지된 기술들을 이용하여 전사 활성 및 억제의 조합을 통해 달성할 수 있다. 시험관 내 반응의 경우, 당업계의 숙련자는 상이한 수준의 UGT 효소들을 조합하여 첨가 또는 상이한 UGTS의 상대적 활성들에 영향을 주는 조건들을 조합하여 각 스테비올 글리코시드의 소정의 비율을 위한 생합성을 지시할 것임을 인지할 것이다. 당 업계의 숙련자는 레바우디오시드 D 또는 E의 보다 높은 비율, 또는 레바우디오시드 D 또는 E로 보다 효과적인 전환은 13-O-글루코시드 반응 (기질 레바우디오시드 A 및 스테비오시드)와 비교하여 19-O-글루코시드 반응 동안 보다 높은 활성을 갖는 디글리코실화 효소를 사용하여 수득될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 총 스테비올 글리코시드 양에 대해 적어도 3% 이상의 레바우디오시드 D, 예를 들어 적어도 4% 레바우디오시드 D, 적어도 5%의 레바우디오시드 D, 10 내지 20% 레바우디오시드 D, 20 내지 30%의 레바우디오시드 D, 30 내지 40%의 레바우디오시드 D, 40 내지 50%의 레바우디오시드 D, 50 내지 60%의 레바우디오시드 D, 60 내지 70%의 레바우디오시드 D, 70 내지 80%의 레바우디오시드 D를 갖는 레바우디오시드 D-풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 적어도 90%의 레바우디오시드 D, 예를 들어 90 내지 99%의 레바우디오시드 D를 갖는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2c에 도시한 것들, 예를 들어 스테비올 모노시드, 스테비올 글루코비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 E, 및 스테비오시드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 (예를 들어, 미생물)로부터 생산된 레바우디오시드 D-증가된 조성물은 또한 정제될 수 있고, 그렇게 정제된 레바우디오시드 D 또는 레바우디오시드 E는 이후 소정의 향미 시스템 또는 감미 조성물을 수득하기 위해 다른 스테비올 글리코시드, 향료 또는 감미료와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 재조합 숙주에 의해 생산된 레바우디오시드 D-풍부한 조성물은 상이한 재조합 숙주에 의해 생산된 레바우디오시드 A, C, 또는 F-풍부한 조성물, 스테비아 추출물로부터 정제된 레바우디오시드 A, F, 또는 C, 또는 시험관 내에서 생산된 레바우디오시드 A, F, 또는 C와 혼합될 수 있다.
일부 구체예에서, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 B, 스테비올 모노글루코시드, 스테비올-1,2-비오시드, 루부소시드, 스테비오시드, 또는 레바우디오시드 E는 적절한 UDP-당을 공급하는 동안 시험관 내 방법 및/또는 UDP-당의 재생을 위한 무-세포 (cell-free) 시스템을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 제위트 MC, 등 (Jewett MC, et al.) Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008); 마사다 S. 등 (Masada S. et al.) FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007) 참조. 일부 구체예에서, 수크로오스 및 수크로오스 생합성은 글리코실화 반응 동안 생성된 UDP로부터 UDP-글루코오스를 재생하기 위해 반응 용기에 제공될 수 있다. 도 11 참조. 수크로오스 생합성은 임의의 적합한 유기체로부터 기인될 수 있다. 예를 들어, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ), 또는 코페아 아라비카 (Coffea arabica )로부터의 수크로오스 합성효소 코딩 서열은 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 플라스미드로 클론되고, 미생물이나 식물과 같은 숙주 내에서 발현될 수 있다.
다수의 반응이 요구되는 형질전환은 함께, 또는 단계별로 수행될 수 있다. 예를 들어, 레바우디오시드 D는 강화된 추출물로서 시판되거나 또는 UDP-글루코오스 및 EUGT11의 화학량 또는 초과량을 첨가하는 생합성을 통해 생산된 레바우디오시드 A로부터 생산될 수 있다. 대안으로는, 레바우디오시드 D는 EUGT11 및 적합한 UGT76G1 효소를 사용하여 스테비오시드 및 레바우디오시드 A 용으로 강화된 스테비올 글리코시드 추출물로부터 생산될 수 있다. 일부 구체예에서 인산가수분해효소는 2차 생성물을 제거하고 반응 수율을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 시험관 내 반응을 위한 UGTs 및 기타 효소들은 가용성 형태 또는 고정형 형태로 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 레바우디오디스 A, 레바우디오디스 D, 또는 레바우디오디스 E는 식물 추출물로부터 유래된 스테비올 글리코시드의 혼합물을 포함하는, 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드와 같은 전구물질 분자를 함유하는 원재료(raw materials)에 공급되는 전세포 (whole cell)를 이용하여 생산될 수 있다. 원재료는 세포 성장 동안 또는 세포 성장 이후에 공급될 수 있다. 전세포는 현탁되거나 고정될 수 있다. 전세포는 알갱이(beads), 예를 들어 칼슘 또는 소듐 알긴산 알갱이로 포집될 수 있다. 전세포는 중공 섬유 (hollow fiber) 튜브 반응기 시스템에 연결될 수 있다. 전세포는 막형 반응기 (membrane reactor) 시스템 내에서 농축되고 포집될 수 있다. 전세포는 발효 배양액 또는 반응 완충용액 내에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 투과성 시약이 기질을 세포로 효과적으로 전달되기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 톨루엔과 같은 용매, 또는 트리톤-X (Triton-X)또는 트윈 (Tween)과 같은 유기세제로 투과가능하게 된다. 일부 구체예에서, 세포는 계면활성제, 예를 들어 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)와 같은 양이온성 계면활성제로 투과가능하게 된다. 일부 구체예에서, 세포는 전기천공법 (electroporation) 또는 경미한 삼투압 충격 (osmotic shock)과 같은 주기적인 기계 충격으로 투과된다. 세포는 하나의 재조합 UGT 또는 다수의 재조합 UGT를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 스테비오시드 및 RebA의 혼합물이 RebD로 효과적으로 전환되기 때문에 UGT76G1 및 EUGT11을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 전세포는 섹션 III A에 기재된 숙주 세포들이다. 일부 구체예에서, 전세포는 대장균 (E. coli)과 같은 그람-음성 세균이다. 일부 구체예에서, 전세포는 바실러스 (Bacillus)와 같은 그람-양성 세균이다. 일부 구체예에서, 전세포는 아스퍼질러스 (Aspergillus)와 같은 곰팡이종, 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 효모이다. 일부 구체예에서, 용어 "전세포 생촉매(whole cell biocatalysis)"는 전세포가 상기 기재된 바와 같이 성장하고 (예를 들어, 배지에서 및 선택적으로는 투과가능하게), RebA 또는 스테비오시드와 같은 기질이 제공되고 세포로부터의 효소를 이용하여 최종 산물로 형질전환되는 과정을 언급하는데 사용한다. 세포는 생세포이거나 아닐 수 있고, 생전환 반응 동안 성장하거나 안할 수 있다. 반대로, 발효의 경우 세포를 성장 배지에서 배양시키고 글루코오스와 같은 탄소 및 에너지원을 공급하며, 최종 산물은 생세포로 생산된다.
B.3 둘코시드 A 및 레바우디오시드 C 생합성 폴리펩티드들
레바우디오시드 C 및/또는 둘코시드 A의 생합성은 아글리콘 스테비올의 글루코실화 및 람노실화와 관련있다. 특히, 둘코시드 A는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 글루코실화, 1,2 람노비오시드를 형성하는 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'의 람노실화, 그리고 1,2-람노비오시드의 C-19 카르복실의 글루코실화드에 의해 형성될 수 있다. 레바우디오시드 C는 둘코시드 A의 C-13-O-글루코오스의 C-3'의 글루코실화에 의해 형성될 수 있다. 각 글리코실화 반응이 일어나는 순서는 가변적일 수 있다. 도 2b 참조.
재조합 숙주에서 스테비올의 둘코시드 A로의 전환은 다음의 기능성 UGTs:85C2, EUGT11 및/또는 91D2e, 및 74G1을 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 수행될 수 있음이 밝혀져 왔다. 따라서, 이들 3가지 또는 4가지 UGTs 및 람노오스 합성효소를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올을 제공할 때 둘코시드 A를 만들 수 있다. 대안으로, 두가지 UGTs, EUGT11 및 74G1, 및 람노오스 합성효소를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드 또는 스테비올-19-O-글루코시드스를 제공할 때 둘코시드 A를 만들 수 있다. 유사하게는, 재조합 미생물에서 스테비올의 레바우디오시드 C로의 전환은 스테비올을 배지로 공급할 때 UGTs 85C2, EUGT11, 74G1, 76G1, 임의로 91D2e, 및 람노오스 합성효소를 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 스테비올-13-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs EUGT11 및 또는 91D2e, 74G1 및 76G1 및 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어 질 수 있고, 스테비올-19-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs 85C2, EUGT11 및/또는, 91D2e 및 76G1, 및 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 또는 루부소시드가 공급될 때 UGTs EUGT11 및/또는 91D2e, 76G1 및 람노오스 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자의 하나 이상은 이들을 원래 자연적으로 보유하지 않은 미생물로 형질도입된 재조합 유전자이다.
적합한 EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 본원에서 논의된 기능성 UGT 폴리펩티드들을 포함한다. 람노오스 합성효소는 스테비올 화합물 수용체의 람노실화스에 대한 UDP-람노오스 도너 (donor)의 증가된 양을 제공한다. 적합한 람노오스 합성효소들은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들, 예를 들어 A. thaliana RHM2 유전자의 산물을 포함한다.
일부 구체예에서, UGT79B3 폴리펩티드는 UGT91D2 폴리펩티드를 대체한다. 적합한 UGT79B3 폴리펩티드는 시험관 내에서 스테비올 13-O-모노시드의 람노실화를 할 수 있는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. A. thaliana UGT79B3은 1,2-람노시드를 형성하기 위해 글리코실화된 화합물을 람노실화시킬 수 있다. 아라비도프시스 탈리아나 UGT79B3의 아미노산 서열은 서열 번호:150에 제시한다. 서열 번호:150의 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:151에 제시한다.
일부 구체예에서, 레바우디오시드 C는 적절한 UDP-당 및/또는 UDP-당 재생을 위한 무-세포 시스템을 공급하면서, 시험관 내 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들어, Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ 및 Swartz JR에 의한 "단백질 생산 및 합성 생물학을 위한 통합된 무-세포 대사 플랫폼 (An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology)" Molecular Systems Biology, 4, 아티클 220 (2008); 마사다 S 등 (Masada S et al,) FEBS Letters, Vol.581,2562-2566 (2007) 참조. 일부 구체예에서, 수크로오스 및 수크로오스 합성효소는 글리코실화 반응 동안 UDP로부터 UDP-글루코오스를 재생하기 위해 반응 용기에 제공할 수 있다. 도 11 참조. 수크로오스 합성효소는 임의의 적합한 유기체로부터 기인할 수 있다. 예를 들어, 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ), 또는 코페아 아라비카(Coffea arabica)로부터의 수크로오스 합성효소 코딩 서열은 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 플라스미드로 클론되고, 숙주 (예를 들어, 미생물 또는 식물) 내에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, RHM2 효소 (람노오스 합성효소)는 NADPH와 함께 제공되어 UDP-글루코오스로부터 UDP-람노오스를 생성할 수도 있다.
반응은 함께 실시하거나 또는 단계적으로 실시할 수 있다. 예를 들어, UDP-람노오스 및 EUGT11의 화학량론적 양의 추가에 이어서 UGT76G1의 첨가와, 그리고 과량의 또는 화학량론적 공급의 UDP-글루코오스를 첨가하여 루부소시드로부터 레바우디오시드 C를 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 인산가수분해효소 (phosphatase)가 2차 산물들을 제거하고 반응 수율을 개선시키기 위해 사용된다. 시험관 내 반응을 위해 UGTs 및 기타 효소들은 가용성 형태 또는 고정형 형태로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서 레바우디오시드 C, 둘코시드 A, 또는 기타 스테비올 람노시드들은 상기 언급한 바와 같은 전세포를 이용하여 생산할 수 있다. 세포는 하나의 재조합 UGT 또는 다수의 재조합 UGTs를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 스테비오시드 및 RebA의 혼합물이 RebD로 효과적으로 전환되도록 하는 UGT76G1 및 EUGT11를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 전세포는 섹션 III A에 기재된 숙주 세포들이다.
다른 구체예에서, 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들어 UGT85C2, UGT74G1, EUGT11 유전자, 임의적으로 UGT91D2e 유전자, 및 UGT76G1 유전자 이외에도 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및 KAH 유전자를 포함하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 포함시킬 필요없이 레바우디오시드 C를 생산할 수 있다. 또한, 재조합 숙주는 전형적으로 람노오스 합성효소를 인코드하는 내생성 또는 재조합 유전자를 발현시킨다. 이러한 유전자는 스테비올 화합물 수용체의 람노실화를 위한 증가된 양의 UDP-람노오스 도너를 제공하는데 유용하다. 적합한 람노오스 합성효소들은 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana )에 의해 만들어진 것들, 예를 들어 A. thaliana RHM2 유전자의 산물을 포함한다.
상이한 UGT 유전자의 상대적 발현 수준을 조절할 뿐만 아니라 UDP-람노오스의 이용성을 조절함으로써, 재조합 숙주를 원하는 비율의 스테비올 및 스테비올 글리코시드 산물들을 특이적으로 생산하도록 조작할 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 수 있을 것이다. 스테비올 생합성 유전자, 및 스테비올 글리코시드 생합성 유전자의 전사 조절은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있는 기술을 이용하여 전사 활성화 및 억제의 조합을 통하여 달성할 수 있다. 시험관 내 반응의 경우, 상이한 수준의 UGT 효소들을 조합하여 첨가하거나, 또는 상이한 UGTS의 상대적인 활성에 영향을 주는 조건들을 조합하여 첨가하는 것이 요망되는 비율의 각각의 스테비올 글리코시드를 얻기 위한 합성을 지시할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 또한 레바우디오시드 A 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트, 엔트-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하는 비-스테비올 경로의 발현을 침묵 또는 감소시키는 유전적 구조체를 더 포함하고, 이에 의해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 제공한다. 예를 들어, 스테롤 생산 경로, 예컨데 에르고스테롤의 유동은 ERG9 유전자를 하향조절시켜 감소시킬 수 있다. 하기 ERG9 섹션 및 실시예 24-25 참조. 기베렐린을 생산하는 세포들에서, 기베렐린 합성은 엔트-카우레논산에서 스테비올로의 유동을 증가시키기 위하여 하향조절될 수 있다. 카로티노이드 생산 유기체들의 경우, 하나 이상의 카로티노이드 생합성 유전자의 하향조절에 의해 스테비올로의 유동이 증가될 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질의 생산에 관련된 재조합 유전자들, 예를 들어 포스파타아제 활성을 감소시키고/또는 본원에 논의된 바와같이 SUS를 발현시키는 MEP 또는 MEV 경로에서의 유전자를 더 함유하고 발현시킨다.
일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 전체 스테비올 글리코시드의 적어도 15% 이상의 레바우디오시드 C, 가령 적어도 20%의 레바우디오시드 C, 30 내지 40%의 레바우디오시드 C, 40 내지 50%의 레바우디오시드 C, 50 내지 60%의 레바우디오시드 C, 60 내지 70%의 레바우디오시드 C, 70 내지 80%의 레바우디오시드 C, 80 내지 90%의 레바우디오시드 C를 갖는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 적어도 90%의 레바우디오시드 C, 가령 90-99%의 레바우디오시드 C를 함유하는 스테비올 글리코시드 조성물들을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2a 및 B에 나타낸 것들, 예를 들어 스테비올 모노시드, 스테비올 글루코비오시드, 스테비올 람노비오시드, 레바우디오시드 A, 및 둘코시드 A를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주에 의해 생산되는 레바우디오시드 C-풍부한 조성물은 더 정제될 수 있고, 그 뒤이렇게 정제된 레바우디오시드 C 또는 둘코시드 A를 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제, 또는 감미료들과 혼합하여 원하는 풍미계 또는 감미 조성물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물에 의해 생산된 레바우디오시드 C-풍부한 조성물은 상이한 재조합 미생물에 의해 생산된 레바우디오시드 A, F, 또는 D-풍부한 조성물, 또는 스테비아 추출물로부터 정제된 레바우디오시드 A, F, 또는 D, 또는 시험관에서 생산한 레바우디오시드 A, F, 또는 D와 복합될 수 있다.
B. 4 레바우디오시드 F 생합성 폴리펩티드들
레바우디오시드 F의 생합성은 아글리콘 스테비올의 글루코실화 및 자일로실화(xylosylation)와 관련있다. 특히, 레바우디오시드 F는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 글루코실화, 스테비올-1,2-자일로비오시드를 형성하는 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오스의 C-2'의 자일로실화, 1,2-스테비오자일로시드를 형성하는 1,2-자일로비오시드의 C-19 카르복실의 글루코실화, 및 레바우디오시드 F를 형성하기 위한 1,2-스테비오자일로시드의 C-13-O-글루코오스의 C-3'의 글루코실화에 의해 만들 수 있다. 각 글루코실화 반응이 일어나는 순서는 가변일 수 있다. 도 2d 참조.
재조합 숙주에서 스테비올의 레바우디오시드 F로의 전환은 내생성 또는 재조합적으로 발현된 UDP-글루코오스 탈수소효소와 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소와 함께, 다음의 기능성 UGTs:85C2, EUGT11 및/또는 91D2e, 74G1, 및 76G1을 인코드하는 유전자의 발현에 의해 이루어질 수 있음이 밝혀져 왔다. 따라서, 내인성 또는 재조합 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠론산 탈카르복실화효소와 함께 이들 4가지 또는 5가지의 UGTs를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올을 공급할때 레바우디오시드 F를 만들 수 있다. 대안으로는, 2가지 기능성 UGTs, EUGT11 또는 91D2e, 및 76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 루부소시드를 공급할 때 레바우디오시드 F를 만들 수 있다. 또 다른 대안으로서, 기능성 UGT76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 1,2 스테비오람노시드를 공급할 때 레바우디오시드 F를 만들 수 있다. 또 다른 대안으로서, 기능성 74G1, EUGT11 및/또는 91D2e, 76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드를 공급할 때 레바우디오시드 F를 만들 수 있다. 동일하게, 재조합 미생물에서 스테비올-19-O-글루코시드의 레바우디오시드 F로의 전환은 스테비올-19-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs85C2, EUGT11 및/또는 91D2e, 및 76G1을 인코드하는 유전자의 발현에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자 중 하나 이상은 이들을 자연적으로 보유하지 않은 미생물로 형질변환된 재조합 유전자이다.
적합한 EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 본원에서 논의된 기능성 UGT 폴리펩티드들을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 논의된 바와 같이 UGT79B3 폴리펩티드는 UGT91을 대체한다. UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-클루쿠로닌산 탈카르복실화효소는 스테비올 화합물 수용체의 자일로실화를 위한 증가된 양의 UDP-자일로오스 도너(donor)를 제공한다. 적합한 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소는 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 또는 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptcoccus neoformans)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 적합한 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소 폴리펩티드들은 각각 A. thaliana UGD1 유전자 및 UXS3 유전자에 의해 인코드될 수 있다. Oka 및 Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006) 참조.
일부 구체예에서, 레바우디오시드 F는 UDP-당의 재생을 위해 적합한 UDP-당 또는 무-세포 시스템을 공급하면서, 시험관 내 방법들을 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 제위트 MC 등 (Jewett MC,et. al) Molecular Systems Biology, Vol.4, 아티클 220 (2008); 마사다 S 등 (Masada S et al,) FEBS Letters, Vol.581, 2562-2566 (2007) 참조. 일부 구체예에서, 수크로오스 및 수크로오스 합성효소는 글리코실화 반응 동안 UDP로부터 UDP-글루코오스를 재생하기 위해 반응 용기에 제공될 수 있다. 도 11 참조. 수크로오스 합성효소는 임의의 적합한 유기체로부터 올 수 있다. 에를 들어, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana ), 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana ), 또는 코페아 아라비카(Coffea arabica)로부터의 수크로오스 합성효소 코딩 서열은 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 플라스미드로 복제되고, 그리고 숙주 (예를 들어, 미생물 또는 식물) 내에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 적합한 효소들, 예를 들어 아라비도프시스 탈리아나 UGD1 (UDP-글루코오스 탈수소효소) 및 UXS3 (UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소)를 NAD+보조인자(cofactor)와 함께 공급함으로써 UDP-글루코오스로부터 UDP-자일로오스를 생성할 수도 있다.
반응은 함께 실시하거나 또는 단계적으로 실시할 수 있다. 예를 들어, UDP-자일로오스 및 EUGT11의 화학량론적 양 만큼 첨가에 이어서 UGT76G1의 첨가 및 과량의 또는 화학량론적 UDP-글루코오스의 공급에 의해 루부소시드로부터 레바우디오시드 F를 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 포스파타아제가 2차 산물들을 제거하고 반응 수율을 개선시키기 위해 사용된다. 시험관 내 반응을 위해 UGTs 및 다른 효소들은 가용성 형태 또는 고정형 형태로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서 레바우디오시드 F 또는 다른 스테비올 자일로시드들은 상기 언급한 바와 같은 전세포를 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 세포는 스테비오시드 및 RebA의 혼합물이 RebD로 효과적으로 전환되는 것처럼 UGT76G1 및 EUGT11를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 전세포는 섹션 III A에 기재된 숙주 세포들이다
다른 구체예에서, 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들어 EUGT11, UGT85C2, UGT74G1, 임의의 UGT91D2, 및 UGT76G1 유전자 이외에도 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및 KAH 유전자를 포함하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 포함시킬 필요없이 레바우디오시드 F를 생산할 수 있다. 또한, 재조합 숙주는 전형적으로 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소를 인코드하는 내인성 또는 재조합 유전자를 발현시킨다. 이러한 유전자는 스테비올 화합물 수용체의 자일로실화를 위한 증가된 양의 UDP-자일로오스 도너(donor)를 제공하는데 유용하다. 적합한 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소들은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 적합한 UDP-글루코오스 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소 폴리펩티드는 각각 A. thaliana UGD1 유전자 및 UXS3 유전자에 의해 인코드될 수 있다. Oka 및 Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006) 참조.
상이한 UGT 유전자의 상대적 발현 수준을 조절할 뿐만 아니라 UDP-자일로오스의 유용성을 조절함으로써, 재조합 숙주를 원하는 비율의 스테비올 및 스테비올 글리코시드 산물들을 특이적으로 생산하도록 조작할 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 수 있을 것이다. 스테비올 생합성 유전자의 전사 조절은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있는 기술을 이용하여 전사 활성화 및 억제의 조합을 통하여 달성할 수 있다. 시험관 내 반응의 경우, 상이한 수준의 UGT 효소들을 조합하여 첨가하거나, 또는 상이한 UGTS의 상대적인 활성에 영향을 주는 조건들을 조합하여, 소정 비율의 각각의 스테비올 글리코시드를 얻기 위한 합성을 지시할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 또한 레바우디오시드 A 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트, 엔트-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하는 비-스테비올 경로의 발현을 침묵시키는 유전적 구조체를 더 포함하고, 이에 의해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 제공한다. 예를 들어, 스테롤 생산 경로, 예컨데 에르고스테롤의 유동은 ERG9 유전자를 하향조절시켜 감소시킬 수 있다. 하기 ERG9 섹션 및 실시예 24-25 참조. 기베렐린을 생산하는 세포들에서, 기베렐린 합성은 엔트-카우레논산에서 스테비올로의 유동을 증가시키시 위하여 하향조절될 수 있다. 카로티노이드 생산 유기체들의 경우, 하나 이상의 카로티노이드 생합성 유전자의 하향조절에 의해 스테비올로의 유동이 증가될 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 디테르펜 생합성에 관련된 재조합 유전자들, 예를 들어 하기 본원에 논의된 MEP 경로에서의 유전자를 더 함유하고 발현시킨다.
일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 유전자는 전체 스테비올 글리코시드 중량에 대해 적어도 4% 이상의 레바우디오시드 F, 예를 들어 적어도 5% 레바우디오시드 F, 적어도 6%의 레바우디오시드 F, 적어도 10-20%의 레바우디오시드 F, 적어도 20-30%의 레바우디오시드 F, 적어도 30-40%의 레바우디오시드 F, 적어도 40-50%의 레바우디오시드 F, 적어도 50-60%의 레바우디오시드 F, 적어도 60-70%의 레바우디오시드 F, 적어도 70-80%의 레바우디오시드 F를 함유하는 레바우디오시드 F-풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 적어도 90%의 레바우디오시드 F, 예를 들어 90-99%의 레바우디오시드 F를 함유하는 스테비올 글리코시드 조성물들을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2a 및 D에 나타낸 것들, 예를 들어 스테비올 모노시드, 스테비올 글루코비오시드, 스테비올 자일로비오시드, 레바우디오시드 A, 스테비오자일로시드, 루부소시드 및 스테비오시드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주에 의해 생산된 레바우디오시드 F-풍부한 조성물은 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제, 또는 감미료들과 혼합하여 소정의 풍미계 또는 감미 조성물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물에 의해 생산된 레바우디오시드 F-풍부한 조성물은 상이한 재조합 미생물에 의해 생산된 레바우디오시드 A, C, 또는 D-풍부한 조성물, 스테비아 추출물로부터 정제된 레바우디오시드 A, C, 또는 D, 또는 시험관 내에서 생산된 레바우디오A, C, 또는 D와 혼합될 수 있다.
C. 기타 폴리펩티드들
유전자의 발현으로 좀더 효과적인 또는 더 큰 규모의 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 생산을 도모할 수 있는 추가의 폴리펩티드들의 유전자가 또한 재조합 숙주 안으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포는 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 (GGPPS, GGPDS로도 언급됨)를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 또한 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 재조합 숙주는 람노오스 합성효소를 인코드하는 하나 이상의 유전자, 또는 UDP-글루코오스 탈수소효소 및/또는 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 예로는, 재조합 숙주는 엽록체 P450 환원효소 (CPR)을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 또한 포함할 수 있다. 재조합 CPR의 발현은 테르페노이드 생합성을 위한 보조인자로 유용한 NADPH를 재생하기 위해 NADP+의 순환을 촉진시킨다. NADHP 수준을 재생하기 위한 다른 방법들도 물론 사용될 수 있다. NADPH가 제한되는 환경에서; 균주들은 외인성 트랜스히드로제나제 (transhydrogenase) 유전자를 포함하기 위해 변형될 수도 있다. 예를 들어, 사우어 등. (Sauer et al.), J. Biol. Chem. 279:6613-6619(2004) 참조. 소정의 보조인자 수준을 증가시키기 위하여 NADH/NADPH의 비율을 감소시키거나 그렇지 않으면 변경시키는 다른 방법들은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
또 다른 예로는, 재조합 숙주는 MEP 경로 또는 메발로네이트 경로내의 하나 이상의 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 이들이 디테르펜 생합성 경로로 탄소 유동을 증가시킬 수 있고, 이 경로에 의해 생성된 이소펜테닐 디포스페이트 및 디메틸알릴 디포스페이트로부터 게라닐게라닐 디포스페이트를 생산하기 때문에 유용하다. 이렇게 생산된 게라닐게라닐 디포스페이트는 스테비올 생합성 폴리펩티드 및 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드의 발현으로 인하여 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성을 향해 가게 될 것이다.
또 다른 실시예로서, 재조합 숙주는 수크로오스 합성효소를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있으며, 추가적으로 원한다면 수크로오스 포함 유전자를 함유할 수 있다. 수크로오스 합성효소 반응은 발효 숙주 또는 전세포 생전환(bioconversion) 과정에서 UDP-글루코오스 풀(pool)을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 이것은 효과적인 글리코실화를 허용하여 글리코실화 동안 생산된 UDP로부터 UDP-글루코오스 및 수크로오스를 재생시킨다. 일부 유기체에서, 내인성 인베르타제(invertase)의 저해는 수크로오스의 분해를 방해하는데 잇점이 있다. 예를 들어, S.cerevisiae SUC2 인베르타제는 저해될 수 있다. 수크로오스 합성효소 (SUS)는 임의의 적합한 유기체로부터 기인할 수 있다. 예를 들어 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana), 또는 코페아 아라비카 (Coffea arabica)로부터, 그러나 이에 제한되지는 않는 수크로오스 합성효소 코딩 서열은 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 플라스미드로 복제되고, 숙주 (예를 들어, 미생물 또는 식물)에서 발현될 수 있다. 수크로오스 합성효소는 수크로오스 수송체 (예를 들어, A. thaiana SUC1 수송체 또는 그의 기능성 동족체) 및 하나 이상의 UGTs (예를 들어, 하나 이상의 UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, 및 UGT91D2e, EUGT11 또는 그들의 기능성 동족체들)을 조합하여 이러한 균주에서 발현될 수 있다. 수크로오스를 함유하는 배지에서 숙주를 배양하면 UDP- 글루코오스 뿐만 아니라 하나 이상의 글루코시드 (예를 들어, 스테비올 글리코시드들)의 생산을 촉진시킬 수 있다.
또한, 재조합 숙주는 본원에 논의된 바와 같이 감소된 인산가수분해효소(phosphatase) 활성을 가질 수 있다.
C. 1 MEP 생합성 폴리펩티드들
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 이소프레노이드 생합성을 위한 메틸에리트리톨 4-포스페이트 (MEP) 경로에 관련된 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 함유하다. MEP 경로의 효소들은 데옥시자일룰로오스 5-포스페이트 합성효소 (DXS), D-1-데옥시자일룰로오스 5-포스페이트 환원이성질화효소 (reductoisomerase; DXR), 4-디포스포씨티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소 (CMS), 4-디포스포씨티딜-2-메틸-D-에리트리톨 안산화효소(kinase;(CMK), 4-디포스포씨티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 (MCS), 1-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소 (HDS) 및 1-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소 (HDR)를 포함한다. 하나 이상의 DXS 유전자, DXR 유전자, CMS 유전자, CMK 유전자, MCS 유전자, HDS 유전자 및/또는 HDR 유전자는 재조합 미생물에서 통합될 수 있다. Rodriguez-Concepcion 및 Boronat, Plant Phys .130:1079-1089 (2002) 참조.
DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS 및/또는 HDR 폴리펩티드를 인코드하는 적합한 유전자는 대장균(E. coil ), 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ) 및 시네초코코스 레오폴리엔시스 (Synechococcus leopoliensis)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. DXR 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 예를 들어 미국 특허 번호 제7,335,815호에 기재되어 있다.
C. 2 메발로네이트 생합성 폴리펩티드들
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 이소프레노이드 생합성을 위한 메발로네이트 경로에 관련된 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 숙주 안으로 형질변환시키기에 적합한 유전자들은 메발로네이트 경로의 효소들, 예를 들어 절두된 3-히드록시-3-메틸-글루타릴 (HMG)-CoA 환원효소 (tHMG), 및/또는 메발로네이트 인산화효소를 인코드하는 유전자 (MK), 및/또는 포스포메발로네이트 인산화효소를 인코드하는 유전자 (PMK), 및/또는 메발로네이트 피로포스페이트 탈카르복실화효소를 인코드하는 유전자 (MPPD)를 인코드한다. 따라서, 하나 이상의 HMG-CoA 환원효소 유전자, MK 유전자, PMK 유전자, 및/또는 MPPD 유전자는 미생물과 같은 재조합 숙주에 통합될 수 있다.
메발로네이트 경로 폴리펩티드들을 인코드하는 적합한 유전자들은 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 폴리펩티드들은 대장균 (E.coil), 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 사카로바이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 키타사토스포라 그리세올라 (Kitasatospora griseola), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 드로소필라 메라노가스터 (Drosophila melanogaster), 갈루스 갈루스 (Gallus gallus), 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.)KO-3988, 니코티아나 아테누아타 (Nicotiana attenuata), 키타사토스포라 그리세올라 (Kitasatospora griseola), 헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 및 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 표 8 및 미국 특허 제7,183,089호,5,460,949호 및 5,306,862호 참조.
표 8
HMG CoA 환원효소 및 기타 메발로네이트 유전자의 공급원
Figure 112014022593516-pct00009
C. 3 수크로오스 합성효소 폴리펩티드들
수크로오스 합성효소 (SUS)는 UDP-당을 생성하는 기술로 이용될 수 있다. SUS (EC 2.4.1.13)은 수크로오스 및 UDP로부터 UDP-글루코오스와 프룩토오스의 생성을 촉매한다 (도 11). 따라서, UGTs의 반응으로 생성된 UDP는 수크로오스의 존재하에서 UDP-글루코오스로 전환될 수 있다. 예를 들어, 첸 등 (Chen et al.)(2001) J. Am . Chem . Soc . 123:8866-8867; 사오 등 (Shao et al.)(2003) Appl . Env. Microbiol . 69:5238-5242; 마사다 등 (Masada et al.)(2007) FEBS Lett. 581:2562-2566; 및 손 등 (Son et el.)(2009) J. Microbiol . Biotechnol. 19:709-712 참조.
수크로오스 합성효소는 UDP-글루코오스를 생성하고 UDP를 제거하는데 사용되어, 다양한 시스템에서 화합물들의 효과적인 글리코실화를 도모할 수 있게 한다. 예를 들어, 수크로오스를 이용하는 능력이 부족한 효모는 수크로오스 수송체 및 SUS를 도입함으로써 수크로오스에서 성장하도록 만들 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)는 효과적인 수크로오스 포획 시스템을 가지고 있지 않아, 수크로오스를 이용하기 위한 세포외 SUC2에 의존한다. 내인성 S. cerevisiae SUC2 인베르타제를 방해하고 재조합 SUS 발현을 조절하여 세포내 수크로오스는 대사 작용할 수 있으나, 세포외 수크로오스 대사작용할 수 없는 효모 균주를 나타낼 수 있다 (Riesmeier et al. (1992) EMBO J. 11:4705-4713). 균주는 cDNA 발현 라이브러리로 형질변환되고 수크로오스를 취하는 능력을 얻게된 형질변이체(transformants)의 선별에 의해 수크로오스 수송체를 단리하는데 사용되었다.
본원에 기재된 바와 같이, 생체내에서 재조합 수크로오스 합성효소와 수크로오스 수송체의 결합된 발현은 증가된 UDP-글루코오스 이용가능성 및 원치않는 UDP의 제거를 가져올 수 있다. 예를 들어, 재조합 수크로오스 합성효소, 수크로오스 수송체, 및 글리코실 전이효소의 기능적 발현은 자연적 수크로오스 분해 시스템 (S. cerevisiae의 경우에는 SUC2)의 제거와 함께 스테비올 글리코시드와 같은 글리코실화된 화합물을 증가 생산할 수 있는 세포를 생성하는데 이용될 수 있다. 이러한 보다 높은 글리코실화 성능은 적어도 (a) 보다 고효율로 UDP-글루코오스를 생산하는 높은 성능, 및 (b) 글리코실화 반응을 저해하는 UDP를 성장 배지로부터 제거하는 것으로 인한 것이다.
수크로오스 합성효소는 임의의 적합한 유기체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana), 또는 코페아 아라비카 (Coffea arabica)로부터의 수크로오스 합성효소 코딩 서열(예를 들어, 도 19A-19C, 서열 번호:178, 179, 및 180 참조)을 적합한 프로모터의 조절하에서 발현 플라스미드로 복제되고, 그리고 숙주 (예를 들어, 미생물 또는 식물) 내에서 발현될 수 있다. 본원의 실시예에 기재한 바와 같이, SUS 코딩 서열은 효모에 의해 세포외 수크로오스의 분해를 피하기 위해 SUC2 (수크로오스 가수분해 효소) 결여된 S.cerevisiae 균주에서 발현될 수 있다. 수크로오스 합성효소는 이러한 균주에서 수크로오스 수송체 (예를 들어, A. thaliana SUC1 수송체 또는 그의 기능성 동족체) 및 하나 이상의 UGTs (예를 들어, 하나 이상의 UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, EUGT11, 및 UGT91D2e, 또는 그들의 기능적 동족체들)과 조합하여 발현될 수 있다. 수크로오스가 함유된 배지에서 숙주를 배양하면 UDP-글루코오스 뿐만 아니라 하나 이상의 글루코시드 (예를 들어, 스테비올 글리코시드)의 생산을 촉진시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 수크로오스 합성효소 및 수크로오스 수송체가 특정 화합물 (예를 들어, 스테비올)의 생산을 위한 재조합인 숙주 세포에서 UGT와 함께 발현될 수 있음이 인지되어야 한다.
C. 4 ERG9 활성의 변조
본 발명의 목적은 스쿠알렌 경로의 테르페노이드 전구물질들의 축적을 증가하는 개념에 근거하여 테르페노이드를 생산하는 것이다. 테르페노이드의 비제한적인 예로는 헤미테르페노이드 (Hemiterpenoids), 1-이소프렌 유닛 (5개 탄소); 모노테르페노이드, 2 이소프렌 유닛 (10 C); 세스퀴테르페노이드, 3 이소프렌 유닛 (15 C); 디테르페노이드, 4 이소프렌 유닛 (20 C) (예를 들어, 징크고리드; ginkgolides); 트리테르페노이드, 6 이소프렌 유닛 (30 C); 테트라테르페노이드, 8 이소프렌 유닛 (40 C) (예를 들어 카로테노이드); 및 보다 큰 수의 이소프렌 유닛을 갖는 폴리테르페노이드 등이 있다.
헤미테르페노이드는 이소프렌, 프레놀 및 이소발레린산을 포함한다. 모노테르페노이드는 게라닐 피로포스페이트, 유칼립톨 (Eucalyptol), 리모넨 및 피넨을 포함한다. 세스퀴테르페노이드에는 파르네실 피로포스페이트, 아르테미시닌 (Artemisinin) 및 비사보롤 (Bisabolol)이 포함된다. 디테르페노이드는 게라닐게라닐 피로포스페이트, 스테비올, 레티놀 (Retinol), 레티날 (Retinal), 피톨 (Phytol), 텍솔 (Taxol), 포르스콜린 (Forskolin) 및 아피디콜린 (Aphidicolin)을 포함한다. 트리테르페노이드는 스쿠알렌 및 라노스테놀을 포함한다. 테트라테르페노이드에는 라이코펜 및 카로틴이 포함된다.
테르펜들은 몇몇 이소프렌 유닛의 결합으로 생성된 탄화수소물들이다. 테르페노이드들은 테르펜 유도체들로 생각할 수 있다. 용어 테르펜은 때때로 테르페노이드를 포함하여 광범위하게 사용된다. 단지 테르펜과 같이, 테르페노이드도 사용되는 이소프렌 유닛의 갯수에 따라 분류할 수 있다. 본 발명은 테르페노이드 및 특히 전구물질 파르네실-피로포스페이트 (FPP), 이소펜테닐-피로포스페이트 (IPP), 디메틸알릴-피로포스페이트 (DMAPP), 게라닐-피로포스페이트 (GPP) 및/또는 게라닐게라닐-피로포스페이트 (GGPP)로부터 스쿠알렌 경로를 통해 유도된 테르페노이드에 주목한다.
테르페노이들은 이소프렌, 프레놀 및 이소발레린산과 같으나 이에 제한되지 않는 헤미테르페노이드류의 테르페노이드들; 게라닐 피로포스페이트, 유칼립톨, 리모넨 및 피넨과 같으나 이에 제한되지 않는 모노테르페노이드류의 테르페노이드들; 파르네실 피로포스페이트, 아르테미시닌 및 비사모롤과 같으나 이에 제한되지 않는 세스퀴테르페노이드류의 테르페노이드들; 게라닐게라닐 피로포스페이트, 스테롤, 레티놀, 레티날, 피톨, 텍솔, 포르스콜린 및 아피디콜린과 같으나 이에 제한되지 않는 디테르페노이드류의 테르페노이드들; 라노스테롤과 같으나 이에 제한되지 않는 트리테르페노이드류의 테르페노이드들; 라이코펜 및 카로틴과 같으나 이에 제한되지 않는 테트라테르페노이류의 테르페노이드들로 이해된다.
한가지 구체예에서 본 발명은 게라닐게라닐-피로포스페이트 (GGPP)로부터 생합성된 테르페노이드의 생산에 관한 것이다. 특히 이러한 테르페노이드는 스테비올일 수 있다.
한가지 구체예에서 본 발명은 게라닐게라닐-피로포스페이트 (GGPP)로부터 생합성된 테르페노이드의 생산에 관한 것이다. 특히 이러한 테르페노이드는 스테비올일 수 있다.
세포
본 발명은 세포, 예를 들어 섹션 III에 기재되고, 도 22에 도시한 구조체를 포함하도록 변조된 임의의 숙주에 관한 것이다. 따라서, 주요 측면에서 본 발명은 (i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 (promoter) 서열, (ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 (heterologous) 삽입체 서열, (iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame), (iv) 전사 종결 신호 (transcription termination signal)을 포함하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이며,
여기에서, 이종성 삽입체 서열은 일반식 (I) -X1-X2-X3-X4-X5-을 갖고;
여기서, X2는 X4의 4개 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, X4의 4개 이상의 연속 뉴클레오티드로 헤어핀 2차 구조 성분을 형성할 수 있고, 여기서, X3은 임의적이고, 존재한다면 X2와 X4 사이에 헤어핀 루프를 형성하는데 관여된 뉴클레오티드를 포함하고, 및 여기서, X1 및 X5는 개별적으로나 임의적으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 또한
여기서, 오픈 리딩 프레임은 발현할 때 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21), 예를 들어 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)과 적어도 70%의 동일성을 보유하는 폴리펩티드 서열 또는 그의 생물학적 활성 단편을 인코드하고, 상기 단편은 100개 이상의 아미노산의 중첩 범위에서 상기 스쿠알렌 합성효소와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
이종성 삽입체 서열을 포함하는 상기 언급한 핵산 이외에도, 세포는 또한 하나 이상의 이종성 핵산 서열 (예를 들어, 섹션 I 의 임의의 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들을 인코드하는 핵산)을 포함할 수 있다. 한가지 바람직한 구체예에서, 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 포함한다.
이종성 삽입체 서열 ( Heterogous insert sequence )
이종성 삽입체 서열은 헤어핀 루프 (hairpin loop)를 갖는 헤이핀의 이차 구조 성분을 구성할 수 있다. 헤어핀 부분은 다른 하나와 서로 상보적이며 혼성화된 X2 및 X4 부분을 포함한다. X2 및 X4 부분은 루프-헤어핀 루프를 형성하는 뉴클레오티드를 포함하는 X3부분 측면에 있다. 용어 "상보적인 (complementary)"는 당 업계의 숙련자들은 5'말단으로부터 3' 말단까지 또는 그 반대로 카운팅하는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드를 서로 비교하는 두 개의 서열들을 의미하는 것으로 당 업계의 숙련자들에게 인지되고 있다.
이종성 삽입체 서열은 헤어핀이 완전할 수 있도록 충분히 길지만, 이종성 삽입체 서열에 바로옆 3'에 인프레임으로 존재하는 ORF의 제한된 전사를 허용할 만큼 충분히 짧다. 따라서, 한가지 구체예에서 이종성 삽입체 서열은 10 내지 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 30개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15 내지 25개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 17 내지 22개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18 내지 21개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18 내지 20개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 19개의 뉴클레오티드를 포함한다.
X2의 4개 이상의 뉴클레오티드의 연속 서열이 X4의 4개 이상의 뉴클레오티드의 연속 서열과 상보적인 한, X2 및 X4는 각각 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 바람직한 구체예에서 X2 및 X4는 동일한 수의 뉴클레오티드로 구성된다.
X2는 4 내지 25개 범위, 예를 들어 4 내지 20개의 범위, 예를 들어 4 내지 15개의 범위, 예를 들어 6 내지 12개의 범위, 8 내지 12개의 범위, 예를 들어 9 내지 11개의 범위의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
X4는 4 내지 25개의 범위, 예를 들어 4 내지 20개의 범위, 예를 들어 4 내지 15개의 범위, 예를 들어 6 내지 12개의 범위, 8 내지 12개의 범위, 예를 들어 9 내지 11개 범위의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
한가지 바람직한 구체예에서, X2는 X4의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 다시말해 X2의 모든 뉴클레오티드들이 X4의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 것이 바람직하다.
한가지 바람직한 구체예에서, X4는 X2의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 다시말해 X4의 모든 뉴클레오티드들이 X2의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 것이 바람직하다. 매우 바람직하게는, X2 및 X4는 동일한 수의 뉴클레오티드로 구성되고, 여기서 X2는 X2와 X4의 전체 길이에 걸쳐 X4와 상보적이다.
X3은 존재하지 않을 수도 있고, 다시 말해 X3는 0개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 또한, X3는 1 내지 5개의 범위, 예를 들어 1 내지 3개의 범위의 뉴클레오티드로 구성될 수도 있다.
X1은 존재하지 않을 수도 있고, 다시 말해 X1는 0개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 또한, X1는 1 내지 25개의 범위, 예를 들어 1 내지 20개의 범위, 1 내지 15개의 범위, 예를 들어 1 내지 10개의 범위, 1 내지 5개의 범위, 예를 들어 1 내지 3개 범위의 뉴클레오티드 범위로 구성될 수도 있다.
X5은 존재하지 않을 수도 있고, 다시 말해 X5는 0개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 또한, X5는 1 내지 5개의 범위, 예를 들어 1 내지 3개의 뉴클레오티드로 구성될 수도 있다.
서열은 상기 본원에서 정의한 요구사항을 충족하는 임의의 적합한 서열일 수 있다. 따라서, 이종성 삽입체 서열은 서열 번호:181, 서열 번호:182, 서열 번호:183, 및 서열 번호:184로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 삽입 서열은 서열 번호:181, 서열 번호:182, 서열 번호:183, 및 서열 번호:184로 구성되는 군으로부터 선택된다.
스쿠알렌 합성효소
스쿠알렌 합성효소 (SQS)는 스테롤의 생산을 이끄는 생합성 경로의 첫번째 헌신적(committed) 효소이다. 이것은 중간 프리스쿠알렌 피로포스페이트를 통하여 파르네실 피로포스페이트로부터 스쿠알렌의 합성을 촉매한다. 효소는 테르페노이드/이소프레노이드의 생합성에서 중요한 분기점(critical branch) 효소이고, 스테롤 경로를 통해 이소프렌 중간물질의 유동을 조절하는 것으로 간주된다. 상기 효소는 종종 파르네실-디페스페이트 파르네실 전이효소 (FDFT1)으로 언급된다.
SQS의 메커니즘은 파르네실 피로포스페이트의 2개 유닛을 스쿠알렌으로 전환시키는 것이다.
적어도 하나의 진핵생물이 기능적으로 유사한 효소를 보유하고 있다고 알려지긴 했지만, SQS는 진핵생물 또는 고등 유기체의 효소로 고려된다.
구조와 역학면으로 볼때, 스쿠알렌 합성효소는 많은 카로티노이드 화합물들의 전구물질인 파이토인의 정교화에서 많은 식물에서 유사한 역할을 수행하는 파이토인(phytoene) 합성효소와 거의 근접하게 닮았다.
높은 수준의 스쿠알렌 동일성은 첫번째 서열이 두번째 서열로부터 유도되는 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 두개의 정렬된 서열들 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로한다. 따라서, 기준 서열(reference sequence)에 대해 70%의 아미노산 서열을 공유하는 후보 서열(candidate sequence)은 다음의 정렬(alignment), 즉 후보 서열의 아미노산 70%가 기준 서열의 상응하는 아미노산과 동일한 것을 필요로 한다. 동일성은 섹션 D에 기재된 바와 같이 Clustal A 컴퓨터 얼라인먼트 프로그램과 같은 컴퓨터 분석법의 도움으로 결정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 디폴트 설정을 갖는 상기 프로그램을 이용하여, 쿼리(query) 및 기준 폴리펩티드의 성숙한(생활성된, bioactive) 부위를 정렬시킨다. 전체적으로 남아있는 잔기들의 개수를 카운트하고 기준 폴리펩티드의 길이에 따라 나눈다. ClustalW 알고리즘은 뉴클레오티드 서열을 정렬시키는데 동일하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열을 판별하는 것과 동일한 방법으로 계산할 수 있다.
한가지 중요한 구체예에서, 본 발명의 세포는 본원에서 정의한 바와 같이 스쿠알렌 합성효소를 위한 발현 시에 핵산 서열 코딩을 포함하며, 여기서 스쿠알렌 합성효소는 서열 번호:192, 서열 번호:193, 서열 번호:194, 서열 번호:195, 서열 번호:196, 서열 번호:197, 서열 번호:198, 서열 번호:199, 서열 번호:200, 서열 번호:201, 및 서열 번호:202로 구성되는 군으로부터 선택된 스쿠알렌 합성효소에 대해 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 적어도 100% 동일하다.
프로모터 ( promoter )
프로모터는 특정 유전자의 전사를 가능케하는 DNA의 부분이다. 프로모터는 그들이 조절하는 유전자 근처, 동일한 가닥 위에 및 전형적으로는 (전사 가닥의 5' 부위를 향하여) 상류쪽에 위치한다. 전사가 일어나기 위해서, RNA 중합효소 (polymerase)라 알려진, RNA를 합성하는 효소가 유전자 근처 DNA에 부착해야 한다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 채택하는 전사 인자 (transcription factors)라 불리는 단백질에 대해 확실한 개시 결합 부위를 제공하는 특이적 DNA 서열 및 반응 요소들을 포함한다. 이러한 전사 인자는 특정 프로모터에 부착하여 유전자 발현을 조절하는 뉴클레오티드에 상응하는 특정 활성제 (activator) 또는 억제제 (repressor) 서열을 포함한다.
세균에서, 프로모터는 RNA 중합효소 및 연합된 시그마 (sigma) 인자로 인식되는데, 이것은 차례로 프로모터가 가지고 있는 DNA 결합 부위 가까이에 결합하는 활성제 단백질에 의해 프로모터 DNA를 종종 데려온다. 진핵세포에서 이러한 과정은 좀더 복잡하고, 적어도 7가지의 상이한 인자들이 프로모터에 RNA 중합효소 II를 결합시키는데 필요하다. 프로모터는 다른 조절 부위들 (증폭자(enhancers), 사이렌서(silencers), 경계요소(boundary elements)/절연체(insulators))와 협력하여 주어진 유전자의 전사 수준을 지시할 수 있는 중요 성분들을 대표한다.
프로모터가 미확인의 오픈 리딩 프레임 (ORP)에 일반적으로 즉시 부착하는 것과 같이, 프로모터의 위치는 전사 개시 위치에 따라 지정되고, 여기서 RNA의 전사가 특정 유전자에 대해 개시한다 (다시 말해서, 상향 부위는 -1로부터 거꾸로 세어지는 음수이고, 예를 들어 -100은 상향으로 100번째 염기쌍의 위치이다).
프로모터 구성성분
Figure 112014022593516-pct00010
코어 프로모터 (core promoter)-전사를 적절히 개시하기 위해 필요한 프로모터의 최소한의 부분
Figure 112014022593516-pct00011
전사 개시 부위 (TSS)
Figure 112014022593516-pct00012
개시 부위의 상향 및/또는 하향쪽으로 대략 -35 염기쌍
Figure 112014022593516-pct00013
RNA 중합효소에 대한 결합 부위
Figure 112014022593516-pct00014
RNA 중합효소 I : 리보오좀 RNA를 인코드하는 유전자를 전사한다.
Figure 112014022593516-pct00015
RNA 중합효소 II : 메신저 RNA 및 특정 소핵 RNAs를 인코드하는 유전자를 전사한다.
Figure 112014022593516-pct00016
RNA 중합효소 III : tRNA 및 기타 소형 RNA를 인코드하는 유전자를 전사한다.
Figure 112014022593516-pct00017
일반적인 전사 인자 결합 부위들
Figure 112014038702683-pct00018
근거리 프로모터 (proximal promoter)-주요한 조절 인자 (regulatory elements)를 포함하는 경향이 있는 유전자의 상향부의 근거리 서열
Figure 112014022593516-pct00019
개시 부위의 상향으로 대략 -250 염기쌍
Figure 112014022593516-pct00020
특정 전사 인자 결합 부위
Figure 112014022593516-pct00021
원거리 프로모터 (distal promoter) - 추가적인 조절 인자들를 포함할 수 있는 상향부쪽의 원거리 서열, 종종 근거리 프로모터에 비해 다소 약한 영향력을 가짐.
Figure 112014022593516-pct00022
상향쪽의 기타 임의의 성분 (그러나 이들의 영향이 위치/방향에 독립적인 인헨서나 기타 조절 영역은 아님)
Figure 112014022593516-pct00023
특정 전사 인자 결합 부위
원핵세포 프로모터들
원핵세포에서, 프로모터는 전사 개시 부위로부터 상향쪽으로 -10 및 -35 부위에 2개의 단기 서열로 구성된다. 시그마(sigma) 인자는 프로모터에 결합하는 RNAP를 증대시키는데 도움을 줄 뿐만 아니라 RNAP 표적 특이 유전자가 전사되는데 도움을 준다.
-10에서의 서열은 프리브노 박스 (Pribnow box), 또는 -10 성분이라 명명되고, 대개 6개의 뉴클레오티드 TATAAT로 구성된다. 프리브노 박스는 원핵세포에서 전사를 개시하는데 필수적이다.
-35 (-35 성분)에서의 다른 서열은 대개 7개의 뉴클레오티드 TTGACAT로 구성된다. 이들의 존재로 매우 높은 전사율이 가능하다.
평균적으로 유지되는 상기 공통서열 (consensus sequence) 둘 모두는 대개의 프로모터 내에서 온전하게 발견되지 않는다. 평균적으로 각각의 공통 서열 내의 6개 염기쌍 중 오로지 3개만이 임의의 상기 프로모터로 발견된다. -10과 -35 두가지 모두에서 온전한 공통 서열을 갖는 것으로 지금까지 판명된 프로모터는 없으며; -10/-35 헥사머 (hexamer)의 완전한 보존을 갖는 인공 프로모터가 매우 높은 효율로 RNA 연쇄 개시를 촉진하는 것으로 밝혀지고 있다.
일부 프로모터는 -50 중심에 UP 서열 (공통 서열 5'-AAAWWTWTTTTNNNAAANNN-3': W=A 또는 T; N=임의의 염기)를 포함하고; -35 성분의 존재는 UP 성분-포함 프로모터로부터의 전사에 중요치 않게 보인다.
진핵세포 프로모터들
진핵세포 프로모터는 일반적으로 유전자 (ORF)의 상향쪽에 위치하고, 전사 개시 부위로부터 떨어져 수천염기들 (kilobases; kb)의 조절 성분을 가질 수 있다. 진핵세포에서, 전사 복합체는 DNA가 그자신에 도로 접혀 (fold back) 전사의 실제 부위로부터 멀리 떨어진 조절 서열의 배치를 허용할 수 있다. 많은 진핵세포 프로모터는 TATA 박스 (서열 TATAAA)를 포함하며, 그 결과 RNA 중합효소 전사 복합체의 형성을 돕는 TATA 결합 단백질에 결합한다. TATA 박스는 전형적으로 전사 개시 부위에 매우 근접하게 위치한다 (종종 50 염기쌍 이내).
본 발명의 세포는 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 프로모터 서열은 본 발명에 의해 한정되지 않으며, 선택한 숙주 세포에 적합한 임의의 프로모터일 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서 프로모터는 구성 또는 유도 프로모터이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 프로모터는 내인성 프로모터, PGK-1, GPD1, PGK1, ADH1, ADH2, PYK1, TPI1, PDC1, TEF1, TEF2, FBA1, GAL1-10, CUP1, MET2, MET14, MET25, CYC1, GAL1-S, GAL1-L, TEF1, ADH1, CAG, CMV 인간 UbiC, RSV, EF-1알파, SV40, Mt1, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, 프로게스테론 (progesterone), RU486 및 라파마이신-유도 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
전사 후 조절 ( Post - transcriptional regulation )
전사 후 조절은 RNA 수준, 즉 유전자의 전사와 해독 사이에서 유전자 발현의 조절이다.
조절의 첫 번째 경우는 전사 (전사 조절)인데, 여기서 염색질 배열 및 전사 인자들의 활성 때문에 유전자는 다르게 전사된다.
생성된 후에, 상이한 전사체 (transcripts)의 안정성 및 분포는 전사체의 다양한 단계 및 속도를 조절하는 RNA 결합 단백질 (RBP)에 의해 조절되며 (전사 후 조절); 선택적 슬라이싱 (alternative splicing), 핵 분해 (엑소좀; exosome), 프로세싱 (processing), 핵 방출 (3가지 선택적 경로), 저장이나 분해를 위해 DCP2-본체에서 격리 (sequestration), 및 궁극적으로는 해독과 같은 단계. 이러한 단백질은 전사체의 특정 서열이나 2차 구조, 통상적으로 전사체의 5' 및 3' UTR에서 결합하는 RNA 인식 모티브 (RRM) 덕분에 상기 단계들을 달성한다.
캡핑 (capping), 스플라이싱 (splicing), 폴리(A)꼬리 첨가, 서열-특이적 핵 방출 속도 및 다른 맥락에서는 RNA 전사물의 격리 (sequestration)를 조절하는 것은 진핵세포에서는 발생하나 원핵세포에서는 발생하지 않는다. 이러한 조절은 단백질 또는 전사체의 결과이고, 그로 인해 조절되고 특정 서열에 대해 친화성을 가질 수 있다.
캡핑 ( capping )
캡핑은 외래 RNA를 분해하는 5' 핵산말단 가수분해효소 (exonuclese)로부터 mRNA를 보호하는 5'-5' 결합에 의해 mRNA의 5' 말단을 3' 말단으로 바꾼다. 또한 이러한 캡은 리보솜 결합을 돕는다.
스플라이싱 ( splicing )
스플라이싱은 단백질을 생성할 수 있는 mRNA를 만들기 위해 RNA로 전사되는 인트론, 비코딩 영역을 제거한다. 인트론의 양면에 스플라이좀 (splicesomes)이 결합하고, 원으로 인트론을 루핑 (looping)하고 이어서 이것을 쪼갬으로써 세포에서 스플라이싱이 이루어진다. 이어서 엑손의 두 말단은 서로 결합된다.
아데닐산중합반응 ( Polyadenylation )
아데닐산 중합반응은 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 첨가하는 것으로, 다시 말해 폴리(A)는 다수의 아데노신 모노포스페이트로 구성된다. 폴리-A 서열은 3' 핵산말단 가수분해효소에 완충제로서 작용하여 mRNA의 반감기를 증가시킨다. 또한, 긴 폴리(A)꼬리는 해독을 증가시킬 수 있다. 따라서 폴리-A 꼬리는 최적의 해독 속도에 도달하기 위해 본 발명의 구조물의 해독을 더 조절하는데 이용될 수 있다.
진핵세포에서, 아데닐산중합반응은 해독을 위한 성숙한 전령 RNA (messenger RNA; mRNA)를 생성하는 과정의 일부이다.
폴리(A) 꼬리는 또한 핵 방출, 해독, 및 mRNA의 안정성에 중요하다.
한가지 구체예에서 본 발명의 세포의 핵산 서열은 상기 본원에 정의한 바와 같이 폴리아데닐/아데닐산 중합반응 서열을 더 포함하고, 바람직하게는 상기 폴리아데닐 1/아데닐산중합반응 서열의 5' 말단이 스쿠알렌 합성효소를 인코드하는 오픈 리딩 프레임과 같은 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 작동 가능하게 연결된다.
RNA 편집 ( editing )
RNA 편집은 RNA 분자내에 서열 다양성을 가져오는 과정으로, 효소에 의해 촉매된다. 이들 효소는 가수 탈아미노화 반응 (hydrolytic deamination)에 의해 mRNA 분자에서 특정 아데노신 잔기를 이노신으로 전환하는 아데노신 디아미나제 액팅 온 RNA (Adenosine Deaminase Action on RNA; ADAR) 효소를 포함한다. 3가지 ADAR 효소는 ADAR1, ADAR2 및 ADAR3로 복제되었지만, 처음 2개의 아류형만이 RNA 편집 활성을 갖는 것으로 보여진다. 글루타메이트 수용체 서브유닛들 GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, 및 GluR6 (이들은 AMPA 및 카이네이트 수용체의 구성성분임), 세로토닌2C 수용체, GABA-알파3 수용체 서브유닛, 트립토판 가수분해효소 TPH2, 간염 델타 바이러스 및 16% 이상의 마이크로 RNAs을 포함하는 RNA 편집 영향에 많은 mRNA들은 취약할 수 있다. ADAR 효소 이외에도, CDAR 효소들이 존재하며, 이들은 특정 RNA 분자에서 사이토신을 우라실로 전환시킨다. 이들 효소들은 'APOBEC'로 명명되고 22q13에서 유전적 유전자좌 (loci)를 가지고, 이것은 벨로카디오페이셜 (velocardiogacial) 신드롬이 발생하는 상염색체상 결손에 관계된 영역 (22q11)이며 정신병과 연관된다. RNA 편집 과정이 바이러스의 기능을 바꾸기 때문에, RNA 편집은 전염병에 관하여 광범위하게 연구되고 있다.
전사 후 조절 인자들
전사 후 조절 인자 (PRE)의 이용은 특정 적용에서 충분한 성능을 갖는 벡터를 수득하기 위해 종종 필요하다. 샴바크 등 (Schambach et al.)은 Gene Ther. (2006)13(7):641-5에서 레트로바이러스 및 렌티바이러스 유전자 전달 벡터의 3' 비해독된 부위로 우드척 (woodchuck) 간염 바이러스의 전사 후 조절 인자 (PRE)의 도입이 역가와 전이 유전자 발현 모두를 향상시킨다고 보고한다. PRE의 활성을 증대시키는 것은 이의 서열의 정확한 구조 및 이것이 도입되어지는 벡터와 세포의 정보에 따라 결정된다.
따라서, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 인자 (WPRE)와 같은 PRE의 이용은 유전자 치료 접근의 이용으로 볼때 본 발명의 세포의 제조에 유용할 수 있다.
따라서, 한가지 구체예에서 본원에 기재된 세포의 핵산 서열은 전사 후 조절 인자를 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, 전사 후 조절 인자는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 인자 (WPRE)이다.
말단 반복 서열 ( Terminal repeats )
숙주 DNA에 유전 서열을 삽입하기 위해, 바이러스는 종종 긴 말단 반복 서열 (LTR) 및 역말단 반복 서열 (ITR)을 포함하는 반복 서열 또는 말단 반복 서열이라 불리는 수천 번까지 반복된 DNA 서열을 종종 이용하며, 여기서 상기 반복 서열은 5' 및 3' 말단 반복 둘 모두일 수 있다. ITR들은 단일 가닥 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 중합효소 복합체에 의해 이중 가닥 DNA로 전환된 후에 핵 내에 연쇄체 (cocatamer) 형성을 돕는다. ITR 서열은 AAV와 같은 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV2로부터 유도될 수 있다.
한가지 구체예에서, 본원에 정의한 세포의 아미노산 서열 또는 벡터는 5' 말단 반복 서열 및 3' 말단 반복 서열을 포함한다.
한가지 구체예에서, 상기 5' 및 3' 말단 반복 서열은 역말단 반복 서열 (Inverted Terminal Repeats; ITR) 및 긴 말단 반복 서열 (Long Terminal Repeats; LTR)로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, 상기 5' 및 3' 말단 반복은 AAV 역말단 반복 서열(ITR)이다.
게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소
본 발명의 미생물 세포들은 바람직한 구체예에서 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (GGPPS)를 인코드하는 이종성 핵산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 표7 참조. GGPPS는 파르네실 피로포스페이트 (FPP) 한 분자를 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP) 한 분자로 전환시키는 화학 반응을 촉매하는 효소이다. GGPPS를 인코드하는 유전자는 예를 들어 메발로네이트 경로를 가지고 있는 유기체에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 사용된 GGPPS는 파르네실 피로포르페이트 (FPP) 분자의 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP) 분자로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 유용한 효소일 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용된 GGPPS는 다음의 반응을 촉매할 수 있는 임의의 효소일 수 있다;
(2E,6E)-파르네실 디포스페이트 + 이소펜테닐 디포스페이트
Figure 112014022593516-pct00024
디포스페이트 + 게라닐게닐 디포스페이트.
본 발명에 사용된 GGPPS는 EC2.5.1.29에 근거하여 분류된 효소라는 것은 바람직하다.
GGPPS는 세균, 곰팡이 또는 포유동물과 같이 다양한 원천으로부터의 GGPPS일 수 있다. GGPPS는 GGPPS의 임의의 종류, 예를 들어 GGPPS-1, GGPPS-2, GGPPS-3 또는 GGPPS-4일 수 있다. GGPPS는 야생형 GGPPS 또는 그의 기능적 동족체일 수 있다.
예를 들어, GGPPS는 S. acidicaldarius의 GGPPS-1 (서열 번호:126), A. nidulans의 GGPPS-2 (서열 번호:203), S. cerevisiae의 GGPPS-3 (서열 번호:167) 또는 M. musculus의 GGPPS-4 (서열 번호:123) 또는 상기 언급된 임의의 기능적 동족체일 수 있다.
상기 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산은 상기 GGPPS를 인코드하는 임의의 핵산 서열일 수 있다. 따라서, GGPPS가 야생형 단백질인 본 발명의 구체예에서는, 핵산 서열은 예를 들어 상기 단백질을 인코드하는 야생형 cDNA 서열일 수 있다. 하지만, 이종성 핵산이 임의의 특정 GGPPS를 인코드하는 핵산 서열이고, 이러한 핵산은 특정 미생물 세포에 맞체 코돈 최적화되는 것은 흔한 경우이다. 따라서, 예로서, 미생물 세포가 S. cerevisiae인 경우 GGPPS를 인코드하는 핵산은 S. cerevisiae에서 최적 발현을 위해 코돈 최적화되는 것이 바람직하다.
GGPPS의 기능적 동족체들은 바람직하게는 상기 언급한 활성을 갖고 기준 GGPPS의 서열과 적어도 70%의 아미노산 동일성을 공유하는 단백질이다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 섹션 "스쿠알렌 합성효소" 및 섹션 D에서 본원에 기재한다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 미생물과 같은 세포는 GGPPS를 인코드하는 핵산 서열 또는 그의 기능적 동족체를 포함하고, 여기서 상기 기능적 동족체는 서열 번호:123, 서열 번호:126, 서열 번호:167 및 서열 번호:203으로 구성되는 군으로부터 선택된 GGPPS에 대해 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99%, 예를 들어 적어도 99.5%, 예를 들어 적어도 99.6%, 예를 들어 적어도 99.7%, 예를 들어 적어도 99.8%, 예를 들어 적어도 99.9%, 예를 들어 적어도 100%의 동일성을 갖는다.
GGPPS를 인코드하는 상기 이종성 핵산 서열은 일반적으로 미생물 세포 내에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합한다. 미생물 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열은 프로모터 서열일 수 있고, 바람직하게는 상기 프로모터 서열은 특정 미생물 세포에 따라 선별된다. 프로모터는 섹션 "프로모터"에 상기 본원에서 기재된 임의의 프로모터일 수 있다.
벡터( Vectors )
벡터는 외부 유전 물질을 다른 세포에 전달하는 운반체로서 이용되는 DNA 분자이다. 벡터의 주요 유형에는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 (cosmids), 및 인공 염색체들이 있다. 모든 조작된 세포에 공통점은 복제 기점, 멀티클로닝 부위 (multicloning site), 및 선별 마커이다.
벡터 그 자체는 일반적으로 벡터의 "백본 (backbone)"으로 작용하는 삽입체 (전이유전자) 및 보다 큰 서열로 구성되는 DNA 서열이다. 유전 정보를 다른 세포에 전달하는 벡터의 목적은 통상적으로 표적 세포에 삽입체를 단리, 중복, 또는 발현시키는 것이다. 특별히 발현 벡터 (발현 구조체)라 불리는 벡터들은 표적 세포 내에서 전이유전자의 발현을 위한 것이고, 일반적으로 전이유전자의 발현을 유도하는 프로모터 서열을 갖는다. 전사 벡터라 불리는 단순 벡터는 오로지 전사될 수만 있고, 해독될 수는 없는데; 이들은 표적 세포에서 복제될 수 있으나 발현 벡터와는 다르데 발현되지 않는다. 전사 벡터는 그들의 삽입체를 증폭시키기 위해 사용된다.
표적 세포에 벡터를 삽입하는 것을 대개는 박테리아 세포의 형질변환, 진핵세포의 형질전환이라 부르나, 바이러스 벡터의 삽입은 종종 형질도입이라 부른다.
플라스미드
플라스미드 벡터는 숙주 세포에서 자동적으로 복제할 수 있는 이중-가닥의 일반적으로는 원형 DNA 서열이다. 플라스미드 벡터는 숙주 및 전이유전자 삽입체 내에서 플라스미드의 반-독립적인 복제를 허용하는 복제의 원물질을 최소단위로 구성된다. 일반적으로 현대 플라스미드는 좀 더 많은 주목할 만한 특징들을 가지고 있는데, 삽입체의 삽입을 위한 뉴클레오티드 오버행 (overhang)을 포함하는 "다중 클로닝 부위 (multiple cloning site)", 및 삽입체의 양면에 다중 제한 효소 일치 부위를 포함한다. 전사 벡터로서 이용되는 플라스미드의 경우, 플라스미드와 함께 세균을 배양하면 몇시간 내에 박테리아 내에 수백 또는 수천의 벡터 복제물들을 생성하고, 벡터는 박테리아로부터 추출할 수 있고, 다중 클로닝 자리는 수백배 또는 수천배 증폭된 삽입체를 제거하는 제한효소에 의해 절단될 수 있다. 이들 플라스미드 전사 벡터는 해독된 mRNA에서 아데닐산중합반응 서열 및 해독 종결 서열을 인코드하여, 전사 벡터로부터 단백질 발현을 불가능하게 만드는 중요 서열이 특징적으로 부족하다. 플라스미드는 교접/전달성 및 비-교접성 일 수 있고; 교접성 : 교접을 통해 DNA 전달을 매개하고 그에따라 개체의 세균 세포 사이에 빠르게 퍼지는 것으로, 예를 들어 F 플라스미드, 많은 R 및 일부 col 플라스미드가 포함되며; 비교접성 : 교접을 통해 DNA를 매개하지 않는 것으로, 예를 들어 많은 R 및 col 플라스미드가 포함된다.
바이러스 벡터들
바이러스 벡터는 일반적으로 비감염성으로 만들어졌으나 여전히 바이러스 프로모터와 전이유전자도 포함하고 있는 변형 바이러스 DNA 또는 RNA로 작용하고, 따라서 바이러스 프로모터를 통해 전이 유전자의 해독을 가능케하는, 유전적으로-조작된 바이러스들이다. 그러나, 바이러스 벡터는 감염성 서열이 부족한 경우가 많기 때문에, 이들은 헬퍼(helper) 바이러스 또는 대규모 형질주입을 위한 팩킹 라인을 필요로 한다. 바이러스 벡터는 종종 숙주 게놈에 삽입체를 영구적인 합체을 위해 설계하여, 따라서 전이유전자를 합체한 후에 숙주 게놈 내에서 뚜렷한 유전적 마커를 떠나게 된다. 예를 들어, 레트로바이러스는 바이러스 벡터가 숙주 게놈에 통합된 것을 검출할 수 있고 알아낼수 있는 삽입후에 특정 레트로바이러스 합체 패턴을 떠난다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포에 형질주입할 수 있는 바이러스 벡터에 관한 것으로, 이러한 세포는 배양될 수 있는, 예를 들어 효모 세포 또는 임의의 다른 적합한 진핵세포이다. 그 뒤, 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 이종성 삽입 서열을 포함하는 핵산을 갖는 상기 세포에 형질주입될 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV를 포함하는 레트로바이러스과로부터 유도된 벡터들로 구성되는 군으로부터 선텍된 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 바이러스 벡터일 수 있다.
또한 바이러스 벡터는 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 바큐로바이러스 (baculovirus), HSV, 코로나바이러스, 보빈 파필로마 (Bovine papilloma) 바이러스, Mo-MLV 및 아데노 관련 바이러스로 구성되는 군으로부터 선별될 수도 있다.
본 발명의 구체예에서, 미생물 세포는 이후 상기 이종성 핵산이 스쿠알렌 합성효소를 인코드하는 핵산을 또한 포함하는 벡터에 위치할 수 있는, GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산, 또는 상이한 벡터 상에 위치될 수 있는 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 포함한다. GGPPS를 인코드하는 상기 이종성 핵산은 상기 본원에 기재한 임의의 벡터에 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 미생물 세포는 HMCR을 인코드하는 이종성 핵산, 이후 상기 이종성 핵산이 스쿠알렌 합성효소를 인코드하는 핵산을 또한 포함하는 벡터 상에 위치될 수 있고, 또는 상이한 벡터에 위치될 수 있는 HMCR을 인코드하는 이종성 핵산을 포함한다. HMCR을 인코드하는 상기 이종성 핵산은 상기 본원에 기재된 임의의 벡터에 포함될 수 있다. 또한 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산 및 HMCR을 인코드하는 이종성 핵산이 동일하거나 또는 개별적인 벡터 상에 위치할 수 있다는 것도 본 발명에 속한다.
전사 ( Transcription )
전사는 모든 벡터에서 필수적인 구성요소로: 벡터의 전제가 삽입체를 다중복제 (발현 벡터가 이후 복제된 삽입체의 해독을 유도하기는 하지만)하는 것이다. 따라서, 안정한 발현은 일반적으로 벡터 내의 프로모터에 따른 안정한 전사에 의해 결정된다. 그러나, 발현 벡터는 다양한 발현 패턴: 항시성 (지속 발현) 또는 유도성 (특정 조건 또는 화학조건 하에서만 발현)을 갖는다. 이러한 발현은 상이한 프로모터 활성에 근거하지만, 전사 후 활성은 아니다. 따라서, 이들 두가지 상이한 유형의 발현 벡터들은 상이한 유형의 프로모터에 따라 달라진다.
바이러스 프로모터는 많은 세포계 (cell line) 및 유형에서 항시적인 전사를 정상적으로 확실하게 만들기 때문에 종종 플라스미드 및 바이러스 벡터내에서 항시적 발현에 유용하다.
유도성 발현은 유도 조건에 반응하는 프로모터에 좌우되며; 예를 들어 생쥐 유방 종양 바이러스 프로모터는 오로지 덱사메타손 첨가 후에 전사를 개시하고, 노랑초파리 열 충격 프로모터는 오로지 고온후에 개시한다. 전사는 mRNA의 합성이다. 유전 정보는 DNA로부터 RNA에 복제된다.
발현 ( Expression )
발현 벡터는 인코드하는 서열, 예를 들어 아데닌산 중합반응 꼬리 (상기 본원 참조)를 필요로 하는데: 핵산말단 가수분해효소 (exonuclease)로부터 mRNA를 보호하고 전사 및 해독 말단을 보장하는 전사된 전-mRNA의 말단에 아데닌산 중합반응 꼬리를 생성하며: mRNA 생성을 안정화한다.
UTR 최소 길이 : UTRs은 전사 또는 해독을 저지시킬 수 있는 특이적 성질들을 가지고 있고, 따라서 최적 발현 벡터에서 가장 짧은 UTRs이 인코드되거나 전혀 인코드되지 않는다.
코작 서열 (Kozak sequence) : 벡터는 mRNA의 해독을 위한 리보좀을 모으는 mRNA에서 코작 서열을 인코드해야 한다.
상기 조건은 원핵세포가 아닌 진핵세포에서 발현 벡터의 경우 필요하다.
현대의 벡터는 전이유전자 삽입체 및 (상기 언급한) 프로모터와 같은 백본외에도 추가적 특징들 예컨데 벡터가 숙주의 유전 DNA와 통합되는것을 확인할 수 있는 유전적 마커, 항생제 선별을 위한 항생성 저항 유전자, 및 정제를 위한 어피니트 택 (affinity tag)을 포함할 수 있다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 세포는 발현 벡터와 같은 벡터에 통합된 핵산 서열을 포함한다.
한가지 구체예에서 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드, 인공 염색체 및 바이어스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
플라스미드 벡터는 세균, 곰팡이 및 효모에서 유지되고 복제될 수 있어야 한다.
본 발명은 또한 플라스미드 및 코스미드 벡터 뿐만 아니라 인공 염색체 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
벡터가 기능적이고, 벡터가 본원에 기재한 바와같이 이종성 삽입 서열을 포함하는 핵산을 적어도 포함하는 것은 중요한 요소이다.
한가지 구체예에서 벡터는 곰팡이 및 포유동물 세포에서 기능이 있다.
한가지 구체예에서 본 발명은 상기 본원에 나타낸 바와 같은 벡터로 형질변환되거나 형질도입된 세포에 관한 것이다.
테르페노이드 생산 벙법
상기 본원에 언급한 바와 같이, 본 발명의 세포 (예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 산업적으로 관련된 테르페노이드의 수득률을 증대시키는데 유용하다.
본 발명의 세포는 따라서 테르페노이드 전구물질의 축적을 증가시키고, 이에따라 상기 (업스트림) 테르페노이드 전구물질의 효소적 전환으로부터 생성되는 테르페노이드 생성물의 수득율을 증가시키기 위해 다양한 단계별로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한가지 측면은 (a) 상기 본원에 정의한 바와 같은 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하고, (c) 테르페노이드 생성 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 세포 배양액에서 스쿠알렌 경로를 통해 합성된 테르페노이드 화합물의 생성 방법에 관한 것이다.
상기 본원에 정의된 유전적으로 변형된 구조체를 포함하는 세포를 제공함으로써, 테르페노이드 전구물질의 축적이 증대된다 (도 20).
따라서, 또다른 측면에서 본 발명은 파르네실-피로포스페이트 (FPP), 이소펜테닐-피로포스페이트 (IPP), 디메틸알릴-피로포스페이트 (DMAPP), 게라닐-피로포스페이트 (GPP) 및/또는 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP)로 구성되는 군으로부터선택된 테르페노이드 전구물질로부터 유도된 테르페노이드의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 상기 전구물질을 스쿠알렌 합성효소 경로의 효소와 접촉시키고, (b) 테르페노이드 생성물을 회수하는 것을 포함한다.
한가지 구체예에서 상기 본원에 나타낸 바와 같은 본 발명의 방법의 테르페노이드 (생성물)은 헤미테르페노이드, 모노테르펜, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 세스테르펜, 트리테르페노이드, 테트라테르페노이드 및 폴리테르페노이드로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가의 구체예에서 테르페노이드는 파르네실 포스페이트, 파르네솔, 게라닐게라닐, 게라닐게라니올, 이소프렌, 프레놀, 이소발레인산, 게라닐 피로포스페이트, 유칼립톨, 리모넨, 피넨, 파르네실 피로포스페이트, 아르테미신, 비사보롤, 게라닐게라닐 피로포스페이트, 레티놀, 레티날, 피톨, 텍솔, 포르스콜린, 아피디콜린, 라노스테롤, 라이코펜 및 카로틴으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
테르페노이드 생성물은 추가적인 정제 과정에서 개시점으로 이용될 수 있다. 따라서 한가지 구체예에서 상기 방법은 파르네솔을 생성하기 위한 파르네실 포스페이트의 디포스포릴화를 추가로 포함한다.
표적 산물 테르페노이드 화합물을 제조하는 공정에 사용되는 효소 또는 효소들은 테르페노이드 전구물질 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트의 "하향류에 위치"한 효소, 예를 들어 도 20의 스쿠알렌 경로에 도시된 테르페노이드 전구물질 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메닐알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트의 하향류에 위치한 효소들이 바람직하다. 표적 생성물 테르페노이드 제조 공정에 사용되는 효소는, 본 발명을 통해 수득된 전구물질의 축적에 근거하여, 디메틸알릴 전이효소 (EC 2.5.1.1), 이소프렌 합성효소 (EC4.2.3.27) 및 게라닐 전이효소 (EC 2.5.1.10)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 리보솜이 RNA에 결합하는 것을 적어도 부분적으로, 입체구조적으로 방해하여 스쿠알렌 합성효소의 해독을 감소시킴으로써 조절할 수 있다. 따라서, 한가지 측면에서 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하는 방법을 포함하는, 기능성 스쿠알렌 합성효소 (EC2.5.1.21)의 해독율을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
유사하게, 또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하고, (b) (a)의 세포를 배양하는 방법을 포함하는, 파르네실-pp의 스쿠알렌으로의 전환을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
도 20에 도시한 바와 같이, ERG9의 녹킹 다운 (knocking down)은 스쿠알렌 합성효소에 전구물질의 생성을 가져온다. 따라서 한가지 측면에서, 본 발명은 (a) 상기 본원에 정의된 세포를 제공하는 단계, (b) (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물의 축적을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
한가지 구체예에서, 상기 본원에 정의한 바와 같은 본 발명의 방법은 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 또는 게라닐게라닐-피로포스페이트 화합물을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 회수된 화합물은 소정의 테르페노이드 생성 화합물을 생산하기 위한 추가 공정에 이용될 수 있다. 추가 공정은 예를 들어 본 발명의 세포에 의한 테르페노이드 전구물질의 축적과 같이, 상기 본원에서 수행하고 나타낸 공정과 같이 적은 세포 배양액에서 실행할 수 있다. 대안으로, 회수된 전구물질은 소정의 생성물을 생산하기 위해 또다른 세포 배양액, 또는 무-세포 시스템에 첨가될 수 있다.
전구물질들이 매개물질들, 그러나 주로 안정성 매개물질인 것과 같이, 테르페노이드 생성물의 특정 내인성 생성물은 테르페노이드 전구물질 기질에 따라 발생할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포는 테르페노이드 전구물질의 축적 (본 발명의 세포 구조체) 및 소정의 테르페노이드 생성물을 위한 전체 또는 부분적으로 전체 후속 생합성 공정 모두를 수행할 수 있는 추가의 유전적 변형을 가질 수 있다.
따라서, 한가지 구체예에서 본 발명의 방법은 또한 스쿠알렌 경로를 통해 합성된 화합물을 회수하는 것을 포함하며, 상기 화합물은 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 또는 게라닐게라닐-피로포스페이트로부터 유도된 화합물이다. 가끔은, 본 발명의 세포를 배양할 때 스쿠알렌 합성효소 억제제 (inhibitor)를 포함하는 것이 이로울 수 있다. 스쿠알렌 합성효소의 화학적 억제제, 예를 들어 라파퀴스타트 (lapaquistat)는 당업계에 공지되어 있고, 심혈관 질환의 예방에서 콜레스테롤 수위를 감소시키는 방법과 같은 검사를 수행할 수 있다. 또한, 이런 효소의 변이체들이 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia)에 관계된 유전 부위일 수 있음도 제안되고 있다. 다른 스쿠알렌 합성효소 저해제로는 자라고진산 (zaragozic acid) 및 RPR107393들이 있다.
따라서, 한가지 구체예에서 상기 본원에 기재된 방법(들)의 배양 단계는 스쿠알렌 합성효소 억제제의 존재하에 수행한다.
본 발명의 세포는 특정 주요 테르페노이드 전구물질의 생산을 보다 증대시키기 위해 유전적으로 더욱 변형될 수 있다. 한가지 구체예에서, 세포는 포스포메발로네이트 인산화효소(kinase) (EC 2.7.4.2), 디포스포메발로네이트 탈카르복실화효소 (EC4.1.1.33), 4-히드록시-3-메틸부트-2-엔-1-닐 디포스페이트 합성효소 (EC 1.17.7.1), 4-히드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소 (EC 1.17.1.2), 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성화효소(isomerase) 1 (EC 5.3.3.2), 단쇄 Z-이소프레닐 디포스페이트 합성효소 (EC 2.5.1.68), 디메틸알릴 전이효소 (EC 2.5.1.1), 게라닐트랜스 전이효소 (EC 2.5.1.10) 및 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (EC 2.5.1.29)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성을 증대시키고/또는 과발현시키기 위해 추가적으로 유전적으로 변형된다.
본 발명의 한가지 구체예에서 상기 본원에 기재한 바와 같이, 미생물 세포는 상기 본원에 기재된 바와 같은 스쿠알렌 합성효소를 인코드하는 핵산 뿐만 아니라, GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산 모두를 포함한다. 이러한 미생물 세포는 테르페노이드 뿐만 아니라 테르페노이드 생합성에서 중간물질인 GGPP 제조에 특히 유용하다. 따라서, 한가지 측면에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 GGPP의 제조 방법에 관한 것이다; a. i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임, iv) 전사 종결 신호를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 미생물 세포를 제공하고, 여기서 상기 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의한 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며; b. a의 미생물 세포를 배양하고; c. GGPP를 회수한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, GGPPS가 생합성 경로에서 중간물질인 테르페노이드의 제조 방법에 관한 것이다; a. i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임, iv) 전사 종결 신호를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 상기 미생물 세포를 제공하고, 여기서 상기 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의한 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며; b. a의 미생물 세포를 배양하고; 및 c. 테르페노이드를 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 테르페노이드는 이것의 생합성 과정에서의 중간물질인 GGPP를 함유하는 섹션 "테르페노이드"에 상기 본원에 기재된 임의의 테르페노이드일 수 있고; 상기 미생물 세포는 섹션 "세포"에서 상기 본원에 기재된 임의의 미생물 세포일 수 있으고; 상기 프로모터는 섹션 "프로모터"에서 상기 본원에 기재된 임의의 프로모터와 같은 임의의 프로모터일 수 있고; 상기 이종성 삽입체 서열은 섹션 "이종성 삽입체 서열"에 상기 본원에 기재된 임의의 이종성 삽입 서열일 수 있고; 상기 오픈 리딩 프레임은 섹션 "스쿠알렌 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 스쿠알렌 합성효소를 인코드하고; 그리고 상기 GGPPS는 섹션 "게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 GGPPS일 수 있다.
본 구체예에서 상기 미생물 세포는 또한 상기 테르페노이드의 생합성 경로에 관여된 하나 이상의 효소를 인코드하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 임의로 포함할 수도 있다.
한가지 특정 측면에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 스테비올 제조 방법에 관한 것이다; a. i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임, iv) 전사 종결 신호를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 미생물 세포를 제공하고, 여기서 상기 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의한 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며; b. a의 미생물 세포를 배양하고; c. 스테비올을 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 미생물 세포는 섹션 "세포"에서 상기 본원에 기재된 임의의 미생물 세포일 수 있으며; 상기 프로모터는 섹션 "프로모터"에서 상기 본원에 기재된 임의의 프로모터와 같은 임의의 프로모터일 수 있고; 상기 이종성 삽입체 서열은 섹션 "이종성 삽입체 서열"에 상기 본원에 기재된 임의의 이종성 삽입체 서열일 수 있고; 상기 오픈 리딩 프레임은 섹션 "스쿠알렌 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 스쿠알렌 합성효소를 인코드하고; 그리고 상기 GGPPS는 섹션 "게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 GGPPS일 수 있다.
본 구체예에서 상기 미생물 세포는 또한 상기 스테비올의 생합성 경로에 관여된 하나 이상의 효소를 인코드하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 임의로 포함할 수도 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, GGPP가 생합성 경로에서 중간물질인 테르페노이드의 제조 방법에 관한 것이다; a. i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임, iv) 전사 종결 신호를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 미생물 세포를 제공하고, 여기서 상기 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의한 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 HMCR의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 HMCR를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며; b. a의 미생물 세포를 배양하고; c. 테르페노이드를 회수하고, 여기서 상기 테르페노이드는 이것의 생합성 과정에서의 중간물질인 GGPP를 함유하는 섹션 "테르페노이드"에 상기 본원에 기재된 임의의 테르페노이드일 수 있고; 상기 미생물 세포는 섹션 "세포"에서 상기 본원에 기재된 임의의 미생물 세포일 수 있고; 상기 프로모터는 섹션 "프로모터"에서 상기 본원에 기재된 임의의 프로모터와 같은 임의의 프로모터일 수 있고; 상기 이종성 삽입체 서열은 섹션 "이종성 삽입 서열"에 상기 본원에 기재된 임의의 이종성 삽입체 서열일 수 있고; 상기 오픈 리딩 프레임은 섹션 "스쿠알렌 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 스쿠알렌 합성효소를 인코드하고; 그리고 상기 GGPPS는 섹션 "게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 GGPPS일 수 있고, 상기 HMCR은 섹션 "HMCR"에서 상기 본원에 기제된 임의의 HMCR일 수 있다.
본 구체예에서 상기 미생물 세포는 또한 상기 테르페노이드의 생합성 경로에 관여된 하나 이상의 효소를 인코드하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 선택적으로 포함할 수도 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 스테비올의 제조 방법에 관한 것이다; a. i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열, ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열, iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임, iv) 전사 종결 신호를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 미생물 세포를 제공하고, 여기서 상기 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 상기 본원에 정의한 바와 같고, 상기 미생물 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 더 포함하며; b. a의 미생물 세포를 배양하고; c. 스테비올을 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 미생물 세포는 섹션 "세포"에서 상기 본원에 기재된 임의의 미생물 세포일 수 있으며; 상기 프로모터는 섹션 "프로모터"에서 상기 본원에 기재된 임의의 프로모터와 같은 임의의 프로모터일 수 있고; 상기 이종성 삽입 서열은 섹션 "이종성 삽입 서열"에 상기 본원에 기재된 임의의 이종성 삽입 서열일 수 있고; 상기 오픈 리딩 프레임은 섹션 "스쿠알렌 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 스쿠알렌 합성효소를 인코드하고; 그리고 상기 GGPPS는 섹션 "게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소"에서 상기 본원에 기재된 임의의 GGPPS일 수 있고, 상기 HMCR은 섹션 "HMCR"에서 상기 본원에 기제된 임의의 HMCR일 수 있다.
본 구체예에서 상기 미생물 세포는 또한 상기 스테비올의 생합성 경로에 관여된 하나 이상의 효소를 인코드하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 임의로 포함할 수도 있다.
한가지 구체예에서 세포는 아세토아세틸 CoA 티올로오스, HMG-CoA 환원효소 또는 그의 촉매 도매인 (domain), HMG-CoA 합성효소, 메발로네이트 인산화효소, 포스포메발로네이트 인산화효소, 포스포메발로네이트 탈카르복실화효소, 이소펜테닐 피로포스페이트 이성화효소, 파르네실 피로포스페이트 합성효소, D-1-디옥시자일룰오스 5-포스페이트 합성효소, 및 1-디옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 환원이성화효소 (reductoisomerase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성을 증대시키고/또는 과발현시키기 위해 추가적으로 유전적 변형된다.
본 발명의 방법 중 한가지 구체예에서, 세포는 ERG9 오픈 리딩 프레임에 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 방법 중 또 다른 구체예에서, 세포는 ERG9[델타]::HIS3 결손/삽입 대립유전자를 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 방법에서 화합물을 회수하는 단계는 세포 배양 배지로부터 상기 화합물을 정제하는 것을 더 포함한다.
D. 기능성 동족체들 ( Homologs )
상기 기재된 폴리펩티드의 기능성 동족체들은 또한 재조합 숙주에서 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산에 이용하는데 적합하다. 기능성 동족체는 기준 폴리펩티드에 대해 서열 유사성을 보유하고, 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생화학 또는 생리학적 기능(들)을 실행하는 폴리펩티드이다. 기능성 동족체와 기준 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드일 수 있고, 서열 유사성은 수렴성 (convergent) 또는 분기성 (divergnt) 진화 발생때문에 나타날 수 있다. 이로인해, 기능성 동족체들은 호몰로그 (homologs), 또는 오르톨로그 (orthologs), 또는 파라로그 (paralogs)로 때로 명명되기도 한다. 자연적으로 생성되는 기능성 동족체의 변이체들, 예를 들어 야생형 코딩 서열의 돌연변이체에 의해 인코드된 폴리펩티드들은 자체가 기능성 동족체들일 수 있다. 기능성 동족체는 또한 폴리펩티드의 코딩 서열의 특정 부위 돌연변이 생성을 통하여 만들어질 수 있고, 또는 상이한 자연적-발생 폴리펩티드들의 코딩 서열로부터 도메인의 조합 ("도메인 교환 (swapping)")에 의해 만들어질 수도 있다. 본원에 설명된 기능성 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 유전자를 변형시키는 기술들은 공지되어 있으며, 그중에서도 특히, 지향된 진화 기술, 특정 부위 돌연변이 생성 기술 및 무작위 돌연변이 생성 기술들을 포함하며, 또한 폴리펩티드의 특이적인 활성을 증가시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 발현 수준들을 변경시키고, 세포 이하의 위치를 변경시키고, 또는 원하는 방식으로 폴리펩티드:폴리펩티드 상호 작용들을 변경시키는데 유용하다. 이러한 변형된 폴리펩티드들은 기능성 동족체라 간주한다. 용어 "기능성 동족체"는 때로는 기능적으로 동종성인 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 적용된다.
기능성 동족체들은 뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열 배열의 분석에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들의 데이터베이스에 쿼리 (query)를 실행함으로써 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들의 동족체를 확인할 수 있다. 서열 분석법으로는 GGPPS, CDPS, KS, KO 또는 KAH 아미노산 서열을 기준 서열로 이용하여 비-여분 (nonreductant) 데이타베이스의 블라스트 (BLAST), 리시프로칼 블라스트 (Reciprocal BLAST), 또는 PSI-블라스트 분석법등이 있다. 일부 경우들에서 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열로부터 유추한다. 데이터베이스에서 40% 이상의 서열 동일성을 보유하는 이들 폴리펩티드는 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드로서 적합성에 대한추가 평가에 후보들이다. 아미노산 서열 유사성은 보존성 아미노산 치환기들, 예를 들어 하나의 소수성 잔기를 또다른 소수성 잔기로 치환 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기로 치환하는 것을 허용한다. 바람직한 경우, 더 평가할 후보 물질의 수를 줄이기 위하여 이러한 후보의 수작업 검사를 실행할 수 있다. 수작업 검사는 스테비올 생합성 폴리펩티드들에 존재하는 도메인, 예컨데 보존된 기능성 도메인들을 가지고 있는 것으로 보이는 후보물질을 선택함으로써 실행할 수 있다.
보존된 영역들은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열내에 반복된 서열이며, 일부 2차 구조 (예를 들어, 헬릭스 및 베타 시트)를 형성하고, 양전하 또는 음전하를 띤 도메인을 확립하고, 또는 단백질 모티프 또는 도메인을 나타내는 영역을 파악함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 월드 와이드 웹 상에 다양한 단백질 모티프와 도메인에 대한 연속 서열을 설명하는 Pfam 웹 사이트, sanger.ac.uk/Software/Pfam/ 및 pfam.janelia.org/ 참조. Pfam 데이터베이스에 포함된 정보는 숀햄머 등 (Sonnhammer et al.), Nucl . Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al. Proteins , 28:405-420 (1997); 및 바트만 등 (Bateman et al.), Nuc . Acids Res., 27:260-262 (1999)에 설명된다. 보존된 영역들은 밀접하게 관련된 종으로부터 동일한 또는 관련된 폴리펩티드의 서열들을 배열함으로써 또한 결정할 수 있다. 밀접하게 관련된 종은 바람직하게는 동일한 과(family)의 것이다. 일부 구체예들에서, 두 가지 상이한 종으로부터의 서열들을 배열하는 것이 적합하다.
전형적으로, 적어도 약 40%의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드들은 보존된 영역들을 확인하는데 유용하다. 관련 폴리펩티드의 보존된 영역들은 적어도 45%의 아미노산 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성)을 나타낸다. 일부 구체예에서, 보존된 영역은 적어도 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
예를 들어, 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드를 생산하는데 적합한 폴리펩티드들은 EUGT11, UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C, 및 UGT76G의 기능성 동족체들이다. 이러한 동족체들은 EUGT11 (서열 번호:152), UGT91D2e (서열 번호:5), UGT91D2m (서열 번호:10), UGT85C (서열 번호:3), 또는 UGT76G (서열 번호:7)의 아미노산 서열과 90%이상 (예를 들어 적어도 95% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는다. EUGT11, UGT91D2, UGT85C, 및 UGT76G 폴리펩티드들의 변이체들은 전형적으로 1차 아미노산 서열 내에 10개 이하의 아미노산 치환, 예를 들어 7개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 보존성 아미노산 치환, 또는 1 내지 5개 사이의 치환을 보유한다. 그러나, 일부 구체예에서 EUGT11, UGT91D2, UGT85C, 및 UGT76G 폴리펩티드들의 변이체들은 10개 이상의 아미노산 치환 (예를 들어, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 10 내지 20, 10 내지 35, 20 내지 30, 또는 25 내지 35의 아미노산 치환)을 보유할 수 있다. 치환기들은 보존성일 수 있으며, 또는 일부 구체예들에서 비-보존성일 수 있다. UGT91D2e 폴리펩티드에서 비-보존성 변환의 비제한적인 예는 글리신에서 아르기닌으로 그리고 트립토판에서 아르기닌으로의 변화를 포함한다. UGT76G 폴리펩티드에서 비보존성 치환기의 비제한적인 예로는 발린에서 글루타민산으로, 글리신에서 글루타민산으로, 글루타민에서 알라닌으로, 그리고 세린에서 프롤린으로의 치환기를 포함한다. UGT85C 폴리펩티드에서 변환의 비제한적 예로는 히스티딘에서 아스파르트산으로, 프롤린에서 세린으로, 리신에서 트레오닌으로, 그리고 트레오닌에서 아르기닌으로의 변화를 포함한다.
일부 구체예에서, 유용한 UGT91D2 동족체는 이 폴리펩티드의 영역들에서 예측된 루프의 밖에 아미노산 치환 (예를 들어, 보존성 아미노산 치환)을 보유할 수 있고, 예를 들어 잔기 20-26, 39-43, 88-95, 121-124, 142-158, 185-198, 및 203-214는 서열 번호:5의 N-말단 도메인에서 예측된 루프이며 잔기 381-386은 C-말단 도메인에서 예측된 루프이다. 예를 들어, 유용한 UGT91D2 동족체는 서열 번호:5의 잔기 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, 또는 387-473에서 적어도 하나의 아미노산 치환기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, UGT91D2 동족체는 서열 번호:5의 잔기 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, 및 438로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 아미노산 치환가를 포함할 수 있다. 예를 들어, UGT91D2 기능성 동족체는 하나 이상의 잔기 206, 207, 및 343에서 아미노산 치환기를 보유할 수 있는데, 예를 들어 서열 번호:5의 잔기 206에서 아르기닌을, 잔기 207에서 시스테인을, 그리고 잔기 343에서 아르기닌을 보유할 수 있다. 서열 번호:95 참조. UGT91D2의 또 다른 기능성 동족체는 하나 이상의 다음을 보유할 수 있다: 서열 번호:5의 잔기 30에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 93에서 프롤린 또는 글루타민, 잔기 99에서 세린 또는 발린, 잔기 122에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 140에서 히스티딘 또는 티로신, 잔기 142에서 세린 또는 시스테인, 잔기 148에서 알라닌 또는 트레오닌, 잔기 152에서 메티오닌, 잔기 153에서 알라닌, 잔기 156에서 알라닌 또는 세린, 잔기 162에서 글리신, 잔기 195에서 류신 또는 메티오닌, 잔기 196에서 글루타민산, 잔기 199에서 라이신 또는 글루타민산, 잔기 211에 류신 또는 메티오닌, 잔기 213에서 류신, 잔기 221에서 세린 또는 페닐알라닌, 잔기 253에서 발린 또는 이소류신, 잔기 286에서 발린 또는 알라닌, 잔기 427에서 라이신 또는 아스파라진, 잔기 438에서 알라닌, 및 잔기 462에서 알라닌 또는 트레오닌 모두를 보유할 수 있다. 또다른 구체예에서, UGT91D2 기능성 동족체는 잔기 211에서 메티오닌 및 잔기 286에서 알라닌 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 유용한 UGT85C 동족체는 서열 번호:3의 잔기 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, 및 471에서 하나 이상의 아미노산 치환기를 포함할 수 있다. 유용한 UGT85C 동족체의 비제한적인 예에는 (서열 번호:3에 대해) 잔기 65에서 치환 (예를 들어, 잔기 65에서 세린)을 보유하는 폴리펩티드들, 잔기 15 (잔기 15에서 류신), 270 (예를 들어, 잔기 270에서 메티오닌, 아르기닌, 또는 알라닌), 418 (예를 들어, 잔기 418에서 발린), 440 (예를 들어, 잔기 440에서 아스파르트산), 또는 441 (잔기 441에서 아스파라긴)과 조합하여 잔기 65에서; 잔기 13 (예를 들어, 잔기 13에서 페닐알라닌), 15, 60 (예를 들어, 잔기 60에서 아스파르트산), 270, 289 (예를 들어, 잔기 289에서 히스티딘), 및 418; 잔기 13, 60, 및 270에서 치환; 잔기 60 및 87에서 치환 (예를 들어 잔기 87에서 페닐알라닌); 잔기 65, 71에서 치환 (예를 들어, 잔기 71에서 글루타민), 220 (예를 들어, 잔기 220에서 트레오닌), 243 (예를 들어, 잔기 243에서 트립토판), 및 270; 잔기 65, 71, 220, 243, 270, 및 441에서 치환; 잔기 65, 71, 220, 389에서 치환 (예를 들어, 잔기 389에서 발린), 및 394 (예를 들어, 잔기 394에서 발린); 잔기 65, 71, 270, 및 289에서 치환; 잔기 220, 243, 270, 및 334에서 치환 (예를 들어, 잔기 334에서 세린); 또는 잔기 270 및 289에서 치환기를 보유할 수 있다. 다음의 아미노산 변이들은 85C2 폴리펩티드의 활성 감소를 나타내지 않는다: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, I87F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, 및 H441N. 활성 유전자로 보여지는 추가의 변이체들에는 K9E, K10R, Q21H, M27V, L91P, Y298C, K350T, H368R, G420R, L431P, R444G, 및 M471T들이 있다. 일부 구체예에서, UGT85C2는 잔기 65 (예를 들어, 세린), 71 (글루타민), 270 (메티오닌), 289 (히스티딘), 및 389 (발린)에서 치환기를 함유한다.
인간의 MDM2 단백질의 첫번째 158 아미노산이 N-말단에서 프레임안에 융합된 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) UGTs 74G1, 76G1 및 91D2e의 아미노산 서열, 및 합성된 PMI 펩티드의 4개의 반복서열 (4 X TSFAEYWNLLSP, 서열 번호:86)이 N-말단에서 프레임안에 융합된 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) UGT85C2는 서열 번호:90, 88, 94, 및 92에 각각 제시하고; 융합 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 대해서는 서열 번호 89, 92, 93, 및 95에 제시한다.
일부 구체예에서, 유용한 UGT76G 동족체는 서열 번호:7의 잔기 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 하나 이상의 아미노산 치환기를 포함할 수 있다. 유용한 UGT76G 동족체의 비제한적인 예에는 (서열 번호:7에 대해서) 잔기 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 및 291; 잔기 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 및 291; 또는 잔기 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 치환기를 보유하는 폴리펩티드들이다. 표 9 참조.
표 9
Figure 112014022593516-pct00025
예를 들어, EUGT11 또는 UGT91D2e의 기질 특이성을 변경시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특정 부위/합리적인 돌연변이 생성 방법들, 무작위 지향된 진화 접근법들 그리고 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이때 랜덤 돌연변이 생성/포화 기술은 효소의 활성 부위 부근에서 실시한다. 예를 들어 Saarah A. Osmani, et al. Phytochemistry 70 (2009) 325-347 참조.
후보 서열은 전형적으로 기준 서열 길이의 80% 내지 200%의 길이, 예를 들어 기준 서열 길이의 82%, 85%, 87%, 89%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%의 길이를 보유한다. 기능적 동족체 폴리펩티드는 전형적으로 기준 서열 길이의 95% 내지 105%, 예를 들어 기준 서열 길이의 90%, 93%, 95%, 97%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120%, 또는 이들 사이의 임의의 범위를 보유한다. 기준 핵산 또는 폴리펩티드에 비교하여 임의의 후보 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성 비율은 다음과 같이 결정할 수 있다. 기준 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)은 컴퓨터 프로그램 Clustal W (버전 1.83, 디폴트 매개변수)을 이용하여 하나 이상의 후보 서열에 정렬되고, 이로써 이들의 전장에 걸쳐 핵산 또는 폴리펩티드 서열들의 배열이 허용된다 (글로벌 얼라인먼트). 첸나 등 (Chenna et al)., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500(2003).
Clustal W는 기준 서열과 하나 이상의 후보 서열들 사이에 가장 잘 매치하는 것을 계산하고, 그리고 동일성, 유사성 및 상이성을 결정할 수 있도록 이들을 배열한다. 기준 서열, 후보 서열 또는 이 둘 모두에 하나 이상의 잔기의 갭을 삽입하여 서열 배열을 최대화시킬 수 있다. 핵산 서열들의 신속한 쌍을 이루는 (pairwise) 배열을 위하여, 다음의 디폴트 매개변수를 이용한다: 단어 크기 2; 창 크기: 4; 득점 방법 : %; 상부 대각선의 수 : 4; 및 갭 패널티 : 5. 핵산 서열들의 다중 배열을 위하여 다음의 매개변수를 이용한다 : 갭 개방 패널티 :10.0; 갭 연장 패널티 : 5.0; 그리고 무게 변이 : 있음. 단백질 서열들의 신속한 쌍을 이루는 배열을 위하여, 다음의 매개 변수를 사용한다 : 단어 크기 : 1; 창 크기 : 5; 득점 방법 : %; 상부 대각선의 수 : 5; 갭 패널티 : 3. 단백질 서열들의 다중 배열을 위하여 다음의 매개변수를 이용한다 : 무게 매트릭스 : 블로섬 (blosum); 갭 개방 패널티 : 10.0; 갭 연장 패널티 : 0.05; 친수성 갭 : 온 (on); 친수성 잔기 : Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, 및 Lys 잔기; 잔기-특이적 갭 패널티 : 온 (on). Clustal W 결과는 월드 와이드 웹 상의 Baylor College of Medicine Search Launcher 사이트 (searchlauncher.bcm.tmcedu/multi-align/multi-align.html) 및 월드 와이드 웹상의 European Bioinformatics Institute 사이트에서 실행할 수 있다.
기준 서열에 대해 후보 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성 비율을 측정하기 위하여, 이 서열들은 Clustal W를 이용하여 배열되고, 배열에서 동일한 매치 수를 기준 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱한다. 동일성 값의 비율은 가장 근접한 소수 첫째 자리로 정한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13 및 78.14는 78.1로 버림 정하고, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 올림 정한다.
기능성 UGTs는 효소에 의해 실행되는 글루코실화 또는 기타 효소 활성에 관여하지 않는 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, 따라서 이러한 폴리펩티드는 상기의 경우보다 달리 더 길어질 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, EUGT11 폴리펩티드는 아미노 또는 카르복시 말단에 첨가되는 정제 태그 (예를 들어, HIS 태그 또는 GST 태그), 엽록체 수송 펩티드, 미토콘드리아 수송 펩티드, 녹말체 (amyloplast) 펩티드, 신호 펩티드, 또는 분비 태그를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, EUGT11 폴리펩티드는 리포터 (reporter)로서 기능성 아미노산 서열, 예를 들어 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질을 포함한다.
II . 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 핵산
본원에 기재된 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자는 폴리펩티드 발현에 적합한 하나 이상의 조절 영역에 센스 방향 (sense orientation)으로 작동 가능하게 연결된, 상기 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함한다. 많은 미생물이 폴리시스트론(polycitronic) mRNA로부터 다수의 유전자 산물을 발현시킬 수 있기 때문에, 바람직한 경우 이들 미생물의 단일 조절 영역의 제어하에 다수의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 코딩 서열 및 조절 영역은 조절 영역과 코딩 서열이 이 서열의 전사 또는 해독을 조절하는데 유효하도록 위치되었을 때, 작동 가능하도록 연결되는 것으로 간주한다. 전형적으로, 코딩 서열의 해독 리딩 프레임의 해독 개시 부위는 모노시스트론(monocitronic) 유전자의 조절 영역의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 하향부 사이에 위치한다.
많은 경우에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 코딩 서열은 재조합 숙주이외의 종에서 확인되며, 즉, 이종 기원의 핵산이다. 따라서, 재조합 숙주가 미생물인 경우, 이 코딩 서열은 다른 원핵 또는 진핵 미생물, 식물들 또는 동물들로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일부 경우에서 코딩 서열은 이 숙주에 고유한 서열로 해당 유기체로 재도입된다. 고유 서열은 외인성 핵산, 예를 들어 재조합 핵산 구조체에서 고유 서열의 측면에 비-고유 조절 서열들에 연결된 비-천연 서열들의 존재로인해 자연적으로 발생하는 서열과 흔히 구별할 수 있다. 또한, 안정적으로 형질전환된 외인성 핵산은 고유 서열이 발견되는 위치 이외의 다른 위치에 전형적으로 통합된다.
"조절 영역"은 전사 또는 해독 개시 및 속도, 및 전사 또는 해독 산물의 안정성 및/또는 운동성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열들을 보유하는 핵산은 의미한다. 조절 영역들은 프로모터 서열들, 인헨서 서열들, 반응 요소들, 단백질 인지 부위들, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비해독 영역 (UTRs), 전사 개시 부위, 종결 서열, 아데닌산중합반응 서열, 인트론, 및 이외 조합들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조절 영역은 전형적으로 적어도 하나의 코어(기저) 프로모터를 포함한다. 조절 영역은 적어도 하나의 조절 인자, 예를 들어 인헨서 서열, 상향부 인자 또는 상향부 활성화 영역 (UAR)을 또한 포함할 수 있다. 조절 영역은 이 조절 영역이 서열의 전사 또는 해독을 조절하는데 유효하도록 조절 영역과 코딩 서열을 위치시킴으로써, 코딩 서열에 작동 가능하도록 연결된다. 예를 들어, 코딩 서열 및 프로모터 서열이 작동 가능하도록 연결되기 위하여, 코딩 서열의 해독 리딩 프레임의 해독 개시 부위는 프로모터의 하향부 1 내지 50 뉴클레오티드 사이에 일반적으로 배치한다. 그러나, 조절 영역은 해독 개시 부위의 상향부 약 5,000개 뉴클레오티드 만큼의 위치, 또는 전사 개시 부위의 상향부 약 2,000개 뉴클레오티드 만큼의 위치에 있을 수 있다.
포함되는 조절 영역들의 선택은 효율성, 선택권, 유도성, 원하는 발현 수준 및 특정 배양 단계에서 선호되는 발현을 포함하는 몇 가지 인자들에 따라 달라지나, 이에 한정되진 않는다. 코딩 서열에 관계되는 조절 영역들을 적절하게 선택하고 배치함으로써, 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 일상적인 것이다. 하나 이상의 조절 영역, 예컨데 인트론, 인헨서, 상향부 활성화 영역, 전사 종결제, 및 유도성 인자가 존재할 수 있음을 인지할 것이다.
하나 이상의 유전자를 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드 생산과 별개의 측면에 유용한 "모듈"로 재조합 핵산 구조체에 통합될 수 있다. 모듈에서 다수의 유전자의 복합, 특히 폴리시스트론 모듈은 다양한 종에서 이 모듈의 이용을 촉진시킨다. 예를 들어, 스테비올 생합성 유전자 클러스터, 또는 UGT 유전자 클러스터는 폴리시스트론 모듈에서 복합되어, 적합한 조절 영역의 삽입 후, 이 모듈은 광범위한 다양한 종으로 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, UGT 유전자 클러스터는 UGT 모듈을 형성하기 위하여 별도 조절 영역에 각 UGT 코딩 서열이 작동 가능하게 연결되도록 복합될 수 있다. 이러한 모듈은 모노시스트론 발현이 필수적이거나 또는 바람직한 종들에서 이용할 수 있다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산에 유용한 유전자 이외에도, 재조합 구조체는 전형적으로 복제 원천, 및 적절한 종에서 이 구조체의 유지를 위한 하나 이상의 선택가능한 마카들을 또한 포함할 수 있다.
유전자 코드의 축중 (degeneracy)로 인하여, 특정 폴리펩티드를 다수의 핵산이 인코드할 수 있는데, 예를 들어 많은 아미노산의 경우 해당 아미노산의 코돈으로 작용하는 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)이 있음을 인지할 것이다. 따라서, 주어진 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에서 코돈은 해당 숙주 (예를 들어, 미생물)의 적합한 코돈 편향표를 이용하여 특정 숙주에서 최적의 발현을 얻을 수 있도록 변형시킬 수 있다. 서열 번호:18-25, 34-36, 40-43, 48-49, 52-55, 60-64, 70-72, 및 154는 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성을 위하여 특정 효소를 인코드하고, 효모에서 발현이 증가되도록 변형된 뉴클레오티드 서열을 제시한다. 단리된 핵산들로서, 이러한 변형된 서열들은 정제된 분자들로 존재할 수 있고, 재조합 핵산 구조체들을 위한 모듈을 구성하는데 이용하기 위하여 벡터 또는 바이러스로 통합시킬 수 있다.
일부 경우에서, 대사 중간생성물을 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 쪽으로 돌리기 위하여 내생성 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 억제하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산을 더 증가시키기 위하여, 스쿠알렌 에폭시다제를 하향조절함으로써, 효모 균주에서 스테롤의 합성을 하향조절하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 예로써, 특정 내생성 유전자 산물, 예를 들어 본원에 언급한 바와같이 2차 대사 물질로부터 글루코오스 모이어티를 제거하는 당가수분해효소들, 또는 인가수분해효소의 분해 기능을 억제시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 예로써, 스테비올 글리코시드의 수송에 관여하는 막 수송체의 발현을 억제시켜, 당화된 스테비오시드들의 분비가 억제될 수 있다. 이러한 조절은 미생물의 배양동안 원하는 기간에 스테비올 글리코시드의 분비를 억제시키고, 이로써 수득시 글리코시드 산물(들)의 수율을 증가시키는데 유익할 수 있다. 이러한 경우들에서, 폴리펩티드 또는 유전자 산물의 발현을 억제하는 핵산은 균주내로 형질전환된 재조합 구조체에 포함될 수 있다. 대안으로, 기능을 억제하는 것이 바람직한 유전자에서 돌연변이체를 만드는데 돌연변이 생성을 이용할 수 있다.
III . 숙주
A. 미생물
많은 원핵생물 및 진핵생물이 본원에 기재된 재조합 미생물, 예를 들어, 그람-음성 박테리아, 효모 및 곰팡이를 구성하는데 적합하다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산 균주로 사용하도록 선택한 종 및 균주는 우선 생산 유전자가 이 균주에 내생성인지, 유전자가 존재하지 않는지를 판단하기 위하여 분석한다. 균주에 내생성 대응 부분이 존재하지 않는 유전자는 하나 이상의 재조합 구조체에 통합되고, 그 다음 빠진 기능(들)을 공급하기 위하여 균주안으로 이들 구조체들을 형질전환시킨다.
예시적인 원핵 및 진핵 종들은 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 기타 다른 종들이 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 적합한 종들은 아가리쿠스 (Agaricus), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 바실러스 (Bacillus), 칸디다 (Candida), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 에쉬리치아 (Escherichia), 푸사리움/기베렐라 (Fusarium/Gibberella), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 레티포루스 (Laetiporus), 렌티누스 (Lentinus), 파피아 (Phaffia), 파네로차에테 (Phanerochaete), 피치아 (Pichia), 피스코미트렐라 (Physcomitrella), 로도투루라 (Rhodoturula), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 스파셀로마 (Sphaceloma), 산토필로마이세스 (Xanthophyllomyces), 및 야로위아 (Yarrowia)로 구성된 군으로부터 선택된 속 (genus)일 수 있다. 이러한 속으로부터 선택된 예시적은 종은 렌티누스 티그리누스 (Lentinus tigrinus), 레티포루스 술푸레우스 (Laetiporus sulphureus), 파네로차에테 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens), 로도투루라 글루티니스 (Rhodoturula glutinis) 32, 로도투루라 무시라기노사 (Rhodoturula mucilaginosa), 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma) UBV-AX, 산토필로미세스 덴드로우스 (Xanthophyllomyces dendrorhous), 푸사리움 푸지쿠로이/기베렐라 푸지코로이 (Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi), 칸디다 유틸리스 (Candida utilis), 및 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 포함한다. 일부 구체예에서, 미생물은 아스코미세테 (Ascomycete), 예를 들어 기베레라 푸지코로이 (Gibberella fujikuroi), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger) 또는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 미생물은 원핵생물, 예컨데 대장균 (Escherichia coli), 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides), 또는 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus)일 수 있다. 특정 미생물은 관심 유전자를 고처리량 (high throughput) 방식으로 스크리닝하고 테스트하는데 이용하는 것이 적합하며, 원하는 생산성 또는 성장 특징을 가진 기타 다른 미생물은 스테비올 글리코시드를 대규모로 생산하는데 이용할 수 있음을 인지할 것이다.
사카로마이세스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae )
사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)는 합성 생물학에서 광범위하게 이용되는 새시 (chassis) 유기체이고, 재조합 미생물 플랫폼으로 이용할 수 있다. S. cerevisiae에 이용할 수 있는 돌연변이체의 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 기타 정보가 있어, 생성물 수율을 증대시키기 위한 다양한 모듈의 합리적인 기획이 가능하다. 재조합 미생물을 만드는 방법들은 공지되어 있다.
다수의 공지된 프로모터들을 이용하여 스테비올 생합성 유전자 클러스터를 효모에서 발현시킬 수 있다. 테르펜을 과다 생산하는 균주들은 공지되어 있으며, 이를 이용하여 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생산에 이용할 수 있는 게라닐게라닐 디포스페이트의 양을 증가시킬 수 있다.
아스퍼질러스 종 ( Aspergillu s spp .)
아스퍼질러스 종, 예를 들어 아스퍼질러스 오리제 (A. oryzae), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger), 및 아스퍼질러스 소제 (A. sojae)는 식품 생산에 광범위하게 이용되는 미생물이며, 재조합 미생물 플랫폼으로 또한 이용할 수 있다. 뉴클레오티드 서열들은 아스퍼질러스 니듈란스 (A. nidulans), 아스퍼질러스 푸미가투스 (A. fumigatus), 아스퍼질러스 오리제 (A. oryzae), 아스퍼질러스 플래버스 (A. flavus), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger), 및 아스퍼질러스 테레우스 (A. terreus)의 게놈으로 이용가능하여, 유동을 증대시키고, 그리고 생성물 수율을 증가시키기 위하여 내생성 경로의 합리적인 기획 및 변형이 가능하다. 아스퍼질러스 뿐만 아니라 전사에 관계된 (transcriptomic) 연구와 단백질에 관계된 (proteomics) 연구를 위하여 대사적 모델을 개발해왔다. 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)는 많은 식품 성분들, 예를 들어 시트르산 및 글루코닌산의 산업적 생산을 위해 배양되고, 따라서 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)는 스테비올 및 스테비올 글리코시드와 같은 식품 성분의 생산에 일반적으로 적합하다.
대장균 ( Escherichia coli )
합성 생물학에서 광범위하게 이용되는 또 다른 플랫폼 유기체인 대장균은 재조합 미생물 플랫폼으로 또한 이용할 수 있다. 사카로마이세스 (Saccharomyces )와 유사하게, 대장균에 이용가능한 돌연변이체의 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 기타 정보들이 있고, 이는 생산물 수율을 증대시키기 위하여 다양한 모듈의 합리적인 설계가 가능하다. 사카로마이세스 (Saccharomyces )에 대해 상기에서 기재한 바와 유사한 방법들을 이용하여 재조합 대장균 미생물을 만들 수 있다.
아가리쿠스 ( Agaricus ), 기베렐라 ( Gibberella ), 및 파네로차에테 ( Phanerochaete ) 종
아가리쿠스(Agaricus), 기베렐라(Gibberella), 및 파네로차에테(Phanerochaete) 종은 이들이 배양물에서 다량의 기베렐린을 생산하는 것으로 공지되어 있기 때문에 유용할 수 있다. 따라서, 다량의 스테비올 및 스테비올 글리코시드를 생산하기 위한 테르펜 전구물질들은 이미 내생성 유전자에 의해 생산된다. 따라서, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드를 위한 재조합 유전자를 포함하는 모듈은 메발로네이트 또는 MEP 경로 유전자의 도입 필요없이 이러한 유전자들로부터의 종으로 도입될 수 있다.
아르쿨라 아데니니보란스 ( Arxula adeninivorans ) ( 블라스토보트리스 아데니니보란스 ; Blastobotrys adeniniborans )
아르쿨라 아데니니보란스는 일반적인지 않은 생화학적 특성들을 가진 이형성(dimorphic) 효모이다 (필라멘트를 형성하면서 자라는 시작을 지나 42℃ 온도까지 빵효모 (baker's yeast)와 같은 출아(budding) 효모의 모습으로 자란다). 이것은 광범위한 기질에서 자랄 수 있고 질산염을 합성할 수 있다. 천연 플라스틱을 생성할 수 있는 균주의 생성 또는 환경 샘플에서 에스트로겐을 위한 바이오센서의 개발에 성공적으로 적용되고 있다.
야로위아 리폴리티카 ( Yarrowia lipolytica )
야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)는 광범위한 기질에서 성장할 수 있는 이형성 효모 (아르쿨라 아데니니보란스 참조)이다. 이것은 산업 활용면에서 매우 강력하나, 아직 시판되는 재조합 생성물이 없다.
로도박터 종 ( Rhodobacter spp .)
로도박터 (Rhodobacter spp.)는 재조합 미생물 플렛폼으로 이용할 수 있다. 대장균과 유사하게, 이용가능한 돌연변이체 라이브러리 뿐만 아니라 적합한 플라스미드 벡터들이 있어, 생성물 수율을 증대시키기 위한 다양한 모듈의 합리적인 설계가 가능하다. 카로테노이드 및 CoQ10의 생산 증가를 위하여, 로도박터의 막세균 종의 이소프레노이드 경로들이 조작되었다. 미국 특허 공개 번호 제20050003474호 및 제20040078846호 참조. 대장균에 대해 상기 기재한 것과 유사한 방법을 이용하여 재조합 로도박터 미생물을 만들 수 있다.
칸디다 보이디니 ( Candida boidinii )
칸디다 보이디니 (Candida boidinii)는 (메탄올에서 성장할 수 있는) 메틸로트로픽 (methrlotrophic) 효모이다. 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 다른 메틸로트로픽 종과 같이, 이것은 이종성 단백질 생산에 탁월한 플랫폼을 제공한다. 저장된 외래 단백질의 많은 양의 수득율이 보고되고 있다. 컴퓨터활용 방법, IPRO은 칸디다 보이디니 자일로오즈 환원효소의 보조인자 특이성을 NADPH로부터 NADH로으로 실험적으로 변환시키는 돌연변이체를 최근에 예측하였다.
한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha ) ( 피치아 안구스타 ; Pichia angusta )
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 또 다른 메틸로트로픽 효모 (칸디다 보이디니(Candida boidinii) 참조)이다. 이것은 광범위한 또 다른 기질에서도 보다 많이 성장할 수 있다; 이것은 고온-내성이며 질산염을 동화시킬 수 있다 (클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 참조). 이것은 B 형 간염 백신, 인슐린 및 C형 간염의 치료를 위한 인터페론 알파-2a의 생산, 더 나아가 기술적 효소 범위에 활용되고 있다.
클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis )
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)는 케피어 (kefir)의 생산에 일반적으로 활용되는 효모이다. 이것은 몇몇 당들, 가장 중요하게는 우유 및 유청에 존재하는 락토오스에서 성장할 수 있다. 이것은 치즈 생산을 위한 치모신 (chymosin; 대개 소 위장에 존재하는 효소)의 생성을 위한 다른 것들과 함께 성공적으로 활용되고 있다. 생산은 40,000L 크기의 발효조에서 수행한다.
피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris )
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메틸로트로픽 효모 (칸디다 보이디니(Candida boidinii) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 참조). 이것은 외래 단백질의 생산을 위한 효과적인 플랫폼을 제공한다. 플랫폼 성분은 키트로 사용가능하며, 단백질 생산을 위해 학문적으로 광범위하게 이용된다. 복합 인간 N-글리칸 (효모 글리칸은 인간에서 발견되는 글리칸과 유사하나 동일하지는 않음)을 생산할 수 있는 균주들이 조작되고 있다.
피스코미트렐라 종 ( Physcomitrella spp .)
현탁 배양물에서 성장시켰을 때 피스코미트렐라(Physcomitrella)이끼는 효모 또는 기타 곰팡이 배양물과 유사한 특징을 갖는다. 이 속은 식물 2차 대사물의 생산에 중요한 유형의 세포가 되며, 다른 유형의 세포들에서는 생산하기 어렵다.
B. 식물 세포 또는 식물
일부 구체예에서, 본원에 기재된 핵산 및 폴리펩티드는 식물 또는 식물 세포로 도입시켜 다른 것들과 비례하여 특이적 스테비올 글리코시드의 생산을 위하여 전체적인 스테비올 글리코시드 생산을 증가시키거나 또는 풍부하게 한다. 따라서, 숙주는 본원에 기재된 적어도 하나의 재조합 유전자를 포함하는 식물 또는 식물 세포일 수 있다. 식물 또는 식물 세포는 이의 게놈으로 통합된 재조합 유전자를 가지게 함으로써 형질전환 시킬 수 있는데, 즉, 안정적으로 형질전환시킬 수 있다. 안정적으로 형질전환된 세포들은 전형적으로 각 세포 분할과 함께 도입된 핵산을 보유한다. 재조합 유전자가 이의 게놈에 통합되지 않도록 식물 또는 식물 세포는 또한 일시적으로 형질변환시킬 수도 있다. 일시적으로 형질전환된 세포들은 각 세포 분할시 도입된 핵산의 전부 또는 일부분을 대개 상실하여, 도입된 핵산이 충분한 횟수의 세포 분할 후 자녀 세포에서는 탐지될 수 없다. 일시적으로 형질변환된 그리고 안정적으로 형질변환된 이식 유전자 식물들과 식물 세포들은 모두 본원에 기재된 방법에 유용할 것이다.
본원에 기재된 방법에 사용된 이식유전자 식물 세포는 온전한 식물의 일부 또는 전부분을 구성할 수 있다. 이러한 식물은 성장실, 온실이나 들판에서 고려되는 종에 적합한 방식으로 성장시킬 수 있다. 이식 유전자 식물은 특정 목적에 맞게 자라게 할 수 있는데, 예를 들어 재조합 핵산을 다른 계통으로 도입시키기 위하여, 재조합 핵산을 다른 종으로 이전시키기 위하여, 또는 기타 원하는 형질에 대해 추가 선별을 위하여 자라게 할 수 있다. 대안으로, 이식 유전자 식물은 이러한 기술에 순응하는 이들 종에 대해 무성 증식시킬 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 이식유전자 식물은 후손이 이식유전자를 물려받는다면 초기 이식유전자 식물의 후손이라고 또한 할 수 있다. 이식유전자 식물에 의해 생산된 종자는 핵산 구조체에 대해 동형성(homozygous) 종자를 얻기 위하여 성장시키고, 자가수분시키다 (selfed) (또는 교배 및 자가수분시킨다).
이식유전자 식물은 현탁 배양액 또는 조직 또는 기관 배양액에서 성장시킬 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 고체 및/또는 액체 조직 배양 기술을 이용할 수 있다. 고체 배지를 이용할 때, 이식유전자 식물 세포를 배지에 바로 위치시키거나 또는 필터 위에 둔 뒤, 다시 배지와 접촉하도록 위치시킨다. 액체 배지를 이용할 때, 이식유전자 식물 세포는 부유 장치 (flotation device), 예를 들어 액체 배지와 접촉되는 다공질 막 위에 둘 수 있다.
일시적으로 형질변환된 식물 세포들을 이용할 때, 리포터(reporter) 활성을 보유한 리포터 폴리펩티드를 인코드하는 리포터 서열은 형질변환 과정에 포함될 수 있고, 리포터 활성 또는 발현에 대한 분석은 형질변환 후 적합한 시기에 실행할 수 있다. 분석을 실행하는 적합한 시기는 형질변환 후, 전형적으로 약 1-21 일, 예를 들어 약 1-14일, 약 1-7일, 또는 약 1-3일에 실행한다. 일시적 분석의 사용은 상이한 종들에서 신속한 분석에 특히 편리하고, 또는 이종기원의 폴리펩티드의 발현이 특히 수령(recipient) 세포들에서 이전에 확인되지 않은 경우, 이종 기원의 폴리펩티드의 발현을 확인하기 위하여 실행한다.
핵산을 외떡잎식물과 쌍떡잎식물로 도입시키는 기술들은 당업계에 공지되어 있으며, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질변환, 바이러스 벡터-매개된 형질변환, 전기천공 및 입자 총 형질변환 (particle gun ransformation), 미국 특허 제5,538,880호; 제5,204,253호; 제6,329,571호; 및 제6,013,863호를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포 또는 배양된 조직을 형질변환의 수령 조직으로 이용할 경우, 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있는 기술을 이용함으로써 식물들을 형질전환된 배양물로부터 재생시킬 수 있다.
이식유전자 식물들의 집단은 이식유전자의 발현에 의해 부여되는 형질 또는 표현형을 보유한 집단의 구성원들에 대해 스크리닝하거나 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어, 단일 형질변환의 후손 집단은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드 또는 핵산의 소정의 발현 수준을 보유하는 이들 식물들에 대하여 스크리닝할 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법들을 이용하여 발현 수준들을 확인할 수 있다. 상기 방법으로는 서던 분석 (Southern analysis) 또는 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 PCR 증폭; 노던 블랏 (Nothern blots), S1 RNAase 보호, 프라이머-연장, 또는 RNA 전사체 검출을 위한 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보솜 활성 검출을 위한 효소 분석; 및 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블랏 (Weathern blots), 면역침전, 및 폴리펩티드들을 탐지하기 위한 효소-관련 면역분석 등이 있다. 기타 기술, 예를 들어 in situ 혼성화, 효소 착색, 및 면역착색 또한 폴리펩티드를 및/또는 핵산의 존재 또는 발현을 검출하는데 이용할 수 있다. 언급된 모든 기술들을 실시하는 방법은 공지되어 있다. 대안으로서, 독립 형질변환을 포함하는 식물 집단은 원하는 형질, 예를 들어 스테비올 글리코시드의 생산, 또는 스테비올 글리코시드의 조절된 생합성을 보유하는 식물들에 대해 스크리닝할 수 있다. 선별 및/또는 스크리닝은 하나 이상의 세대 및/또는 하나 이상의 지리적 위치에서 수행할 수 있다. 일부 경우에서, 이식유전자 식물들은 이식유전자 식물에서 원하는 표현형을 유도하거나 또는 달리 필요한 표현형을 만드는데 필요한 조건들 하에서 성장시키고 선별할 수 있다. 또한, 선별 및/또는 스크리닝은 식물에 의해 발현되리라 기대되는 표현형의 특정 발달 단계 동안에 적용시킬 수 있다. 선별 및/또는 스크리닝은 이식유전자가 없는 대조군 식물과 비교하여 스테비올 글리코시드 수준이 통계학적으로 유의적으로 차이가 있는 이들 이식유전자 식물들을 선택하기 위하여 실시할 수 있다.
본원에 기재된 핵산, 재조합 유전자, 및 구조체들은 다수의 외떡잎식물과 쌍떡잎식물 및 식물 세포계를 형질변환시키는데 이용할 수 있다. 적합한 외떡잎식물의 예는 곡물 수확물, 예를 들어 쌀, 호밀, 수수, 기장, 밀, 옥수수, 및 보리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식물은 비-곡물 외떡잎식물일 수 있는데, 예를 들어 아스파라거스, 바나나, 또는 양파일 수 있다. 식물은 또한 쌍떡잎식물, 예를 들어 스테비아 (스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)), 대두, 목화, 해바라기, 완두콩, 제라늄, 시금치, 또는 담배일 수 있다. 일부 경우에서, 식물은 페닐 포스페이트 생산의 전구물질 경로들, 예를 들어 세포질 및 미토콘드리아에서 전형적으로 볼 수 있는 메발로네이트 경로를 포함할 수 있다. 비-메발로네이트 경로는 식물 색소체들에서 좀더 흔하게 볼수 있다. [듀베이 등 (Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637-646]. 당업자는 리더 서열들의 사용을 통하여 적절한 기관들에 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드의 발현을 표적화시킬 수 있어, 식물 세포의 원하는 위치에서 스테비올 글리코시드 생합성이 일어나도록 할 수 있다. 당업자는 예컨데 바람직한 경우 식물의 잎에서 합성을 지시하기 위해 적절한 프로모터를 이용할 것이다. 발현은 또한 바람직한 경우 조직 배양물, 예를 들어 캘러스 배양물 (callus culture) 또는 모상근 배양물 (hairy root culture)에서 일어날 수 있다.
한가지 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드는 전체적인 스테비올 글리코시드 생합성이 증가되거나 또는 전체적인 스테비올 글리코시드 생합성 반응이 증가하고 또는 스테비올 글리코시드 조성물이 하나 이상의 특이적 스테비올 글리코시드(예를 들어, 레바우디오시드 D)에 대해 선택적으로 풍부해지도록 스테비아 (예를 들어, 스테비아 레바우디아나 ((Stevia rebaudiana)))로 도입된다. 예를 들어, 하나 이상의 재조합 유전자는 EUGT11 효소 (예를 들어, 서열 번호:152 또는 그의 기능적 동족체)를 단독으로 또는 하나 이상의 다음과 조합하여 발현하도록 스테비아에 도입시킬 수 있다: UGT91D2e와 같은 UGT91D 효소 (예를 들어, 서열 번호:5 또는 그의 기능적 동족체), UGT91D2m (예를 들어, 서열 번호:10); 섹션 "기능적 동족체"에 기재된 변이체와 같은 UGT85C 효소, 섹션 "기능적 동족체"에 기재된 변이체와 같은 UGT76G1 효소, 또는 UGT74G1 효소. 핵산 구조체는 전형적으로 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 작동 가능하도록 연결된 적합한 프로모터 (예를 들어, 35S, e35S, 또는 ssRUBISCO 프로모터)를 포함한다. 핵산은 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질변환; 원형질체로의 전기영동-매개된 유전자 이동; 또는 입자 투하에 의해 스테비아로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 사인 등 (Singh, et al.), Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Sugar, Tuber and Fiber, Edited by Chittaranjan Kole and Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115 참조. 스테비아 잎에서 유도된 캘루스의 과립 투하의 경우, 매개변수들은 다음과 같을 수 있다: 6cm 거리, 1100 psi He 압력, 금입자, 및 1회 투하.
스테비아 식물은 상기 Singh, et al., 2008,에 기재된 바와 같이 체세포 배형성에 의해 재생될 수 있다. 특히, 잎 분절들 (대략 1-2 cm 길이)은 5 내지 6주 시험관에서 성장시킨 식물로부터 제거하고, B5 비타민, 30g 수크로오스 및 3g 겔라이트 (Gelite)가 보강된 MS 배지에서 배양하였다 (향축 다운). 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)을 6-벤질 아데닌 (BA), 키네틴 (KN), 또는 제틴과 복합하여 사용될 수 있다. 배발생 전 물질 (proembryogenic)은 계대배양 (subculture) 8주 후에 나타난다. 계대 배양 2-3주 이내에, 체세포 배는 배양물 표면에 나타날 것이다. 배 (embryos)는 2,4-D, a-나프탈렌아세트산 (NAA), 또는 인돌부틸산 (IBA)와 복합하여 BA를 함유하는 배지에서 성숙될 수 있다. 발아하여 묘목을 이루는 성숙 체세포 배는 칼리 (calli)로부터 잘라낼 수 있다. 묘목이 3-4주에 도달 한 후, 묘목은 질석 (vermiculite)이 담긴 포트로 옮길 수 있고, 환경 순응을 위하여 성장실에서 6-8주 성장시키고, 온실로 옮길 수 있다.
한가지 구체예에서, 스테비올 글리코시드는 쌀에서 생산된다. 쌀과 옥수수는 예를 들어 아그로박테리움-매개된 형질 변환과 같은 기술을 이용하여 바로 형질 변환시킬 수 있다. 이원체 (binary) 벡터 시스템은 외떡잎식물로 아그로박테리움 외인성 유전자 도입에 흔히 이용되된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,215,051호 및 6,329,571호 참조. 이원체 (binary) 벡터 시스템에서, 한개 벡터는 관심 유전자 (예를 들어, 본원에 기재된 UGT)을 포함하는 T-DNA 영역을 함유하고, 다른 벡터는 vir 영역을 함유하는 무력화된 (disarmed) Ti 플라스미드이다. 공통-통합된 벡터 및 이동가능한 벡터를 또한 이용할 수 있다. 형질변환될 조직의 유형 및 전처리, 이용되는 아그로박테리움 균주, 접종 기간, 아그로박테리움에 의한 과다성장 및 괴사 방지는 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다. 쌀의 미성숙 배 세포들은 이원체 벡터들을 이용한 아그로박테리움으로의 형질변환을 위하여 준비될 수 있다. 이용되는 배양 배지에 페놀계 화합물을 보충한다. 대안으로, 형질변환은 진공 침투(vaccume infiltration)을 이용하여 식물에서 실행할 수 있다. 예를 들어, WO 2000037663, WO 2000063400, 및 WO 2001012828 참조.
IV . 스테비올 글리코시드 생산 방법
본원에 기재된 재조합 숙주들은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법에 이용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 숙주가 미생물인 경우, 상기 방법은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드 생합성 유전자가 발현되는 조건들하에서 배양 배지에 재조합 미생물을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 재조합 미생물은 유가식 배양 (fed batch) 또는 연속 공정에서 성장시킬 수 있다. 전형적으로, 재조합 미생물은 원하는 기간 동안 정해진 온도에서 발효기에서 성장한다. 방법에 이용되는 특정 미생물에 따라, 다른 재조합 유전자, 예를 들어 이소펜테닐 생합성 유전자 및 테르펜 합성효소와 시클라아제 유전자가 또한 존재하고, 발현될 수 있다. 기질 및 중간생성물, 예를 들어 이소펜테닐 디포스페이트, 디메틸알릴 디포스페이트, 게라닐게라닐 디포스페이트, 카우렌 및 카우레논산의 수준들은 공개된 방법들에 따라 분석용 배양 배지로부터 시료를 추출하여 측정할 수 있다.
재조합 미생물을 원하는 기간 동안 배양물에서 성장시킨 후, 스테비올 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술을 이용하여 배양물로부터 회수할 수 있다. 일부 구체예에서, 투과성 작용제 (permeabilizing agent)는 공급원료가 숙주로 들어가고 생성물이 밖으로 나오는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 재조합 숙주가 식물 또는 식물 세포들인 경우, 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술들을 이용하여 식물 조직으로부터 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 추출할 수 있다. 예를 들어, 배양된 미생물 또는 식물 조직의 미정제 용해물을 원심분리시켜 상청액을 수득할 수 있다. 이후, 생성된 상청액을 크로마토그래피 컬럼, 예컨데 C-18 컬럼에 실행시키고, 물로 세척하여 친수성 화합물을 제거하고, 메탄올과 같은 용매를 이용하여 관심 화합물(들)을 용리시킨다. 이어서 화합물(들)은 제조용(preparative) HPLC에 의해 추가 정제될 수 있다. WO 2009/140394 참조.
생성된 스테비올 글리코시드 (예를 들어, 레바우디오시드 D)의 양은 약 1mg/L 내지 약 1500 mg/L, 예를 들어, 약 1 내지 약 10 mg/L, 약 3 내지 약 10 mg/L, 약 5 내지 약 20 mg/L, 약 10 내지 약 50 mg/L, 약 10 내지 약 100 mg/L, 약 25 내지 약 500 mg/L, 약 100 내지 약 1,500 mg/L, 또는 약 200 내지 약 1,000 mg/L일 수 있다. 일반적으로, 배양시간이 길면 더 많은 양의 생성물을 얻을 수 있다. 따라서, 재조합 미생물은 1일부터 7일까지, 1일부터 5일까지, 3일부터 5일까지, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일 동안 배양할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 유전자와 모듈은 단일 미생물보다는 2가지 이상의 재조합 미생물에 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 다수의 재조합 미생물이 이용될 때, 이들은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드를 생산하기 위하여 혼합 배양액에서 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 제 1 미생물은 스테비올을 생산하기 위한 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하고, 제 2 미생물은 스테비올 글리코시드 생합성 유전자를 포함할 수 있다. 대안으로, 2가지 이상의 미생물 각각이 별도의 배양 배지에서 성장될 수 있고, 제1 배양 배지의 산물, 예를 들어 스테비올을 제 2 배양 배지로 도입하여, 후속 중간 생성물로 전환시키고, 또는 레바우디오시드 A와 같은 최종 산물로 전환시킬 수 있다. 제 2 또는 최종 미생물에 의해 생산된 생성물을 이어 회수한다. 일부 구체예에서, 재조합 미생물은 배양 배지 이외의 영양 원천을 사용하고, 발효기 이외의 시스템을 이용하여 성장시킬 수 있음을 또한 인지할 것이다.
스테비올 글리코시드는 상이한 식품 시스템에서 동일한 성능을 필수적으로 가지고 있진 않다. 따라서, 선택된 스테비올 글리코시드 조성물로 합성이 지시하는 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 본원에 기재된 재조합 숙주들은 특이적 스테비올 글리코시드(레바우디오시드 D)에 대해 선택적으로 풍부하고, 일관된 맛 프로파일을 보유하는 조성물을 생산할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 미생물, 식물, 및 식물 세포는 주어진 식품 산물에 바람직한 단맛 프로파일에 부합되도록 조작된, 그리고 배취(batch)로부터 배취로 일관된 각 스테비올 글리코시드 비율을 보유하는 조성물의 생산을 용이하게 할 수 있다. 본원에 기재된 미생물은 스테비아 추출물들에서 볼 수 있는 원치않는 식물 부산물을 생성하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 미생물에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비아 식물로부터 유도된 조성물과는 구별된다.
V. 식품 제품
본원에 기재된 방법들에 의해 수득한 스테비올 및 스테비올 글리코시드는 식품 제품들, 규정식 보충물 및 감미료 조성물을 만드는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드, 예를 들어 레바우디오시드 A 또는 레바우디오시드 D는 식품 제품들, 예를 들어 아이스크림, 탄산음료, 과일 쥬스, 요거트, 구운 제품, 츄잉검, 단단하고 부드러운 캔디, 및 소스 등에 포함될 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 비-식품 제품들, 예를 들어 약제품들, 의학 제품들, 규정식 보충물 및 영양 보충물에 또한 포함될 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글루코시드는 또한 농업 산업 및 애완동물 산업 둘 모두를 위한 동물 사료 제품에 포함될 수 있다. 대안으로, 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드의 혼합물은 재조합 미생물을 별도로 배양하거나 또는 상이한 식물들/식물세포들을 성장시키고, 특이적 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 각각 생산하고, 각 미생물 또는 식물/식물 세포로부터 실질적으로 순수한 형태로 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 회수하고, 그 뒤 원하는 비율의 각 화합물을 포함하는 혼합물을 수득하기 위하여 이 화합물들을 복합시켜 만들 수 있다. 본원에 기재된 재조합 미생물, 식물, 및 식물 세포는 현재 스테비아 제품들과 비교하여 좀더 정확하고 일관된 혼합물의 수득을 허용한다. 또 다른 대안에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 다른 감미료들, 예를 들어 사카린, 덱스트로오스, 수크로오스, 푸락토오스, 에리트리톨, 아스파르탐, 수크랄로오스, 모나틴, 또는 아세술팜 칼륨과 함께 식품 제품에 통합될 수 있다. 기타 감미료들에 대하여 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 중량비는 최종 식품 산물에서 만족할 만한 맛에 도달하기 위해 바람직하게 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2007/0128311호 참조. 일부 구체예에서 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 풍미 조절제로서 풍미료 (예를 들어, 시트러스)와 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 레바우디오시드 C는 단맛 강화제 또는 단맛 조절물질로 이용할 수 있는데, 특히 탄수화물계 감미료들에서 이용하여 식품 제품 내의 당의 양을 줄일 수 있게 된다.
본원에 기재된 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생산된 조성물은 식품 제품들에 통합될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비올 글리코시드 및 식품 제품의 유형에 따라 건중량에 대해 약 20 mg 스테비올 글리코시드/kg 식품 제품 내지 약 1800 mg 스테비올 글리코시드/kg 식품 제품의 양으로 식품 제품에 통합될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식물kg 당 최대 500 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 디저트, 차가운 과자류 (예를 들어, 아이스크림), 유제품 (예를 들어, 요거트), 또은 음료 (예를 들어, 탄산 음료)에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식품 kg 당 최대 300 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 구운 제품 (예를 들어, 비스킷)에 통합될 수 있다. 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식품 kg 당 최대 1000 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 소스 (예를 들어, 초콜릿 시럽) 또는 식물 제품 (예를 들어, 피클)에 통합될 수 있다. 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식품 kg 당 최대 160 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 빵에 통합될 수 있다. 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식품 kg 당 최대 1600 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 단단한 또는 부드러운 사탕에 통합될 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 으해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 대해 식품 kg 당 최대 1000 mg의 스테비올 글리코시드를 포함하도록 가공된 과일 제품 (예를 들어, 과일 쥬스, 과일 필링, 잼 및 젤리)에 통합될 수 있다.
예를 들어, 상기 스테비올 글리코시드 조성물은 90-99% 레바우디오시드 A와 검출불가능한 양의 스테비아 식물-유도된 오염물질들을 함유할 수 있고, 건중량에 대해 25-1600 mg/kg, 예를 들어 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 레바우디오시드 B를 함유하는 레바우디오시드 B-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 레바우디오시드 B의 양은 건중량에 대해 25-1600 mg/kg, 예를 들어 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 레바우디오시드 B-풍부한 조성물은 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 15% 이상의 레바우디오시드 C를 함유하는 레바우디오시드 C-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 레바우디오시드 C의 양은 건중량에 대해 20-600 mg/kg, 예를 들어 100-600 mg/kg, 20-100 mg/kg, 20-95 mg/kg, 20-250 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 레바우디오시드 C-풍부한 조성물은 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 레바우디오시드 D를 함유하는 레바우디오시드 D-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 레바우디오시드 D의 양은 건중량에 대해 25-1600 mg/kg, 예를 들어 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 레바우디오시드 D-풍부한 조성물을 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 레바우디오시드 E를 함유하는 레바우디오시드 E-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 레바우디오시드 E의 양은 건중량에 대해 25-1600 mg/kg, 예를 들어 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 레바우디오시드 E-풍부한 조성물을 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 4% 이상의 레바우디오시드 F를 함유하는 레바우디오시드 F-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 레바우디오시드 F의 양은 건중량에 대해 25-1000 mg/kg, 예를 들어 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 레바우디오시드 F가 풍부한 조성물을 스테비아 식물에서 유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 4% 이상의 둘코시드 A를 함유하는 둘코시드 A-풍부한 조성물일 수 있고, 제품 중의 둘코시드 A의 양은 건중량에 대해 25-1000 mg/kg, 예를 들어 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 둘코시드 A-풍부한 조성물을 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 13-0-글루코오스 또는 19-O-글루코오스 두 위치에서 모두 자일로실화된 루부소시드가 풍부한 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 4% 이상의 자일로실화된 루부소시드를 함유할 수 있고, 제품 중의 자일로실화된 루부소시드 화합물의 양은 건중량에 대해 25-1000 mg/kg, 예를 들어 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 자일로실화된 루부소시드-풍부한 조성물을 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 13-0-글루코오스 또는 19-O-글루코오스 두 위치에서 모두 람노실화된 화합물, 또는 하나의 람노오즈와 다수의 글루코오스를 함유하는 화합물 (예를 들어, 스테비올 13-O-1,3-디글리코시드-1,2-람노시드)이 풍부한 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 4% 이상의 람노실화된 화합물을 함유할 수고, 제품 중의 람노실화된 화합물의 양은 건중량에 대해 25-1000 mg/kg, 예를 들어 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 제품에 통합될 수 있다. 전형적으로, 람노실화된 화합물-풍부한 조성물을 스테비아 식물-유도된 검출불가능한 양의 오염물질을 함유한다.
일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 탁상용 감미료 또는 "cup-for-cup" 제품에 통합된다. 이러한 제품들은 전형적으로 하나 이상의 벌크제, 예를 들어 당업계에 공지되어 있는 말토덱스트린을 이용하여 적절한 단맛 수준으로 희석시킬 수 있다. 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 또는 람노실화되거나 자일로실화된 화합물이 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물은 식탁용으로 건중량에 대해 제품의 kg 당 10,000부터 30,000 mg 까지의 스테비올 글리코시드를 한 봉지에 포장할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시는 다음의 항들에 관한 것이다:
1. 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포,
여기서 이종성 삽입체 서열은 다음의 일반식 (I)를 가지며:
-X1-X2-X3-X4-X5-
여기서 X2는 X4의 4개 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 4개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 X3은 뉴클레오티드를 포함하지 않거나, 또는 헤어핀 루프를 형성하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 X1 및 X5는 각각 개별적으로 뉴클레오티드가 없거나, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 오픈 리딩 프레임은 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)를 인코드한다.
2. 항목 1에 따른 재조합 숙주, 상기 핵산은 5'에서 3' 순서로 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 여기서 이종성 삽입체 서열 및 오픈 리딩 프레임은 항 1에 정의한 바와 같다.
3. 다음을 포함하는 상기 핵산을 포함하는 세포,
i) 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열
ii) 작동 가능하게 연결된 이종성 삽입체 서열
iii) 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임
iv) 전사 종결 신호,
여기서 이종성 삽입체 서열은 다음의 일반식 (I)를 가지며,
-X1-X2-X3-X4-X5-
여기서 X2는 X4의 4개 이상의 연속 핵산과 상보적이고, 헤어핀 2차 구조를 형성하는 4개 이상의 연속 핵산을 포함하고, 여기서 X3은 짝짓지 않은 핵산을 포함하여 X2와 X4 사이에 헤어핀 루프를 형성하고, 여기서 X1 및 X5는 각각 및 임의로 하나 이상의 핵산을 포함하고,
또한, 여기서 발현할 때 오픈 리딩 프레임은 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)과 적어도 70%의 동일성을 보유하는 폴리펩티드 서열 또는 그의 생물학적 활성 단편을 인코드하고, 상기 단편은 100개 이상의 아미노산의 중첩 범위에서 상기 스쿠알렌 합성효소와 적어도 70%의 서열 동일성을 보유한다.
4. 항 1 내지 3 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 이종성 삽입체 서열은 10-50개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 10-30개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15 내지 25개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 17 내지 22개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18 내지 21개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18 내지 20개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 19개의 뉴클레오티드를 포함한다.
5. 항 1 내지 4 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X2와 X4는 동일한 수의 뉴클레오티드로 구성된다.
6. 항 1 내지 5 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 모든 X2는 4 내지 25개 범위, 예를 들어 4 내지 20개 범위, 4 내지 15개 범위, 예를 들어 6 내지 12개 범위, 8 내지 12개 범위, 예를 들어 9 내지 11개 범위의 뉴클레오티드로 구성된다.
7. 항 1 내지 6 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 모든 X4는 4 내지 25개 범위, 예를 들어 4 내지 20개 범위, 4 내지 15개 범위, 예를 들어 6 내지 12개 범위, 8 내지 12개 범위, 예를 들어 9 내지 11개 범위의 뉴클레오티드로 구성된다.
8. 항 1 내지 7 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X2는 X4의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
9. 항 1 내지 8 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X4는 X2의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
10. 항 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X3은 존재하지 않고, 다시 말해서 X3은 0개의 뉴클레오티드로 구성된다.
11. 항 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X3은 1 내지 5개 범위, 예를 들어 1 내지 3개 범위의 뉴클레오티드로 구성된다.
12. 항 1 내지 11 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X1은 존재하지 않고, 다시 말해서 X1은 0개의 뉴클레오티드로 구성된다.
13. 항 1 내지 11 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X1은 1 내지 25개 범위, 예를 들어 1 내지 20개 범위, 1 내지 15개 범위, 예를 들어 1 내지 10개 범위, 1 내지 5개 범위, 예를 들어 1 내지 3개 범위의 뉴클레오티드로 구성된다.
14. 항 1 내지 13 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X5는 존재하지 않고, 다시 말해서 X5는 0개의 뉴클레오티드로 구성된다.
15. 항 1 내지 11 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 X5는 1 내지 5개 범위, 예를 들어 1 내지 3개 범위의 뉴클레오티드로 구성된다.
16. 항 1 내지 15 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 이종성 삽입체 서열은 서열 번호:181, 서열 번호:182, 서열 번호:183 및 서열 번호:184로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
17. 항 1 내지 16 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 이종성 삽입체 서열은 서열 번호:181, 서열 번호:182, 서열 번호:183 및 서열 번호:184로 구성되는 군으로부터 선택된다.
18. 항 1 내지 17 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 스쿠알렌 합성효소는 서열 번호:192, 서열 번호:193, 서열 번호:194, 서열 번호:195, 서열 번호:196, 서열 번호:197, 서열 번호:198, 서열 번호:199, 서열 번호:200, 서열 번호:201, 및 서열 번호:202로 구성되는 군으로부터 선택된 스쿠알렌 합성효소에 대해 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%의 동일성을 갖는다.
19. 항 1 내지 18 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 상기 프로모터는 구성 또는 유도성 프로모터이다.
20. 항 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 상기 프로모터는 내인성 프로모터, GPD1, PGK1, ADH1, ADH2, PYK1, TPI1, PDC1, TEF1, TEF2, FBA1, GAL1-10, CUP1, MET2, MET14, MET25, CYC1, GAL1-S, GAL1-L, TEF1, ADH1, CAG, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, MX1, 프로게스트론, RU486 및 라파마이신-유도성 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
21. 항 1 내지 20 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 핵산 서열은 폴리아데닐 서열을 더 포함한다.
22. 항 21에 따른 세포, 여기서 상기 폴리아데닐 서열의 5'말단이 항 1의 핵산의 3' 말단에 작동 가능하게 연결된다.
23. 항 1 내지 22 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 핵산 서열은 전사 후 조절 인자를 더 포함한다.
24. 항 23의 세포, 여기서 상기 전사 후 조절 인자는 우드척 (Woodchuck) 간염 바이러스 전사 후 조절 인자 (WPRE)이다.
25. 항 1 내지 24 중 임의의 세포, 여기서 핵산은 5' 말단 반복 서열 및 3' 말단 반복 서열을 포함한다.
26. 항 25의 세포, 여기서 5' 및 3' 말단 반복 서열은 역 말단 반복서열 [ITR] 및 장쇄 말단 반복 서열 [LTR]로부터 선택된다.
27. 항 1 내지 26 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 핵산 서열은 벡터 내로 통합된다.
28. 항 27의 세포, 여기서 벡터는 발현 벡터이다.
29. 항 27의 세포, 여기서 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드, 인공 염색체 및 바이러스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
30. 항 29의 세포, 여기서 플라스미드 벡터는 세균, 곰팡이 및 효모에서 유지되고 복제될 수 있다.
31. 항 29의 세포, 여기서 바이러스 벡터는 렌티바이러스, HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV를 포함하는 레트로바이러스과로부터 유도된 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
32. 항 31의 세포, 여기서 바이러스 벡터는 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 바쿨로바이러스, HSV, 코로나바이러스, 보빈 파필로마 바이러스, Mo-MLV 및 아데노 관련 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된다.
33. 항 27 내지 32 중 임의의 세포, 여기서 상기 벡터는 포유동물 세포에서 기능이 있다.
34. 상기 항들 중 임의의 세포, 여기서 세포는 항 27 내지 33 중 임의의 벡터로 형질변환되거나 형질도입된다.
35. 항 1 내지 34 중 임의의 세포, 여기서 상기 세포는 진핵생물 세포이다.
36. 항 1 내지 34 중 임의의 세포, 여기서 상기 세포는 원핵생물 세포이다.
37. 항 35의 세포, 여기서 상기 세포는 효모 및 아스퍼질러스와 같은 곰팡이 (fungi) 세포; 클로렐라 및 프로토테카 (prototheca)와 같은 미세조류; 식물 세포; 및 포유동물 세포, 예를 들어, 인간, 고양이과, 원숭이과, 개과, 쥐과, 쥐 (rat), 생쥐 (mouse) 및 토끼과 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.
38. 항목 37의 세포, 여기서 효모는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae ), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolitica), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 아쉬브야 고시피 (Ashbya gossypii), 시베르린드네라 자디니 (Cyberlindnera jadinii), 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
39. 항 37의 세포, 여기서 세포는 CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, BHK 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.
40. 항 36의 세포, 여기서 상기 세포는 대장균 (E. coil ), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas) 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)이다.
41. 항 35 내지 40 중 임의의 세포, 여기서 상기 원핵 세포, 또는 상기 곰팡이 세포는 메발로네이트 독립 경로의 효소의 적어도 일부분을 발현시키기 위해 유전적으로 변형된다.
42. 항 1 내지 41 중 임의의 하나에 따른 세포, 여기서 세포는 상기 세포에서 GGPPS의 발현을 지시하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 GGPPS를 인코드하는 이종성 핵산을 추가로 포함한다.
43. 항 42에 따른 세포, 여기서 상기 GGPPS는 서열 번호:126, 서열 번호:123, 서열 번호:203, 서열 번호:167로 구성된 군으로부터 선택되고, 그의 기능적 동족체가 상기 언급한 임의의 것과 적어도 75%의 서열 동일성을 공유한다.
43. (a) 항 1 내지 42 중 임의의 하나의 세포를 제공하고,
(b) (a)의 세포를 배양하고,
(c) 테르페노이드 생성 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 세포 배양액에서 스쿠알렌 경로를 통해 합성된 테르페노이드 화합물을 생산하는 방법.
44. (a) 스쿠알렌 합성효소 경로의 효소와 상기 전구물질을 접촉시키고,
(b) 테르페노이드 생성물을 회수하는 것을 포함하는,
파르네실-피로포스페이트 (FPP), 이소펜테닐-피로포스테이트 (IPP), 디메틸알릴-피로포스페이트 (DMAPP), 게라닐-피로포스페이트 (GPP) 및/또는 게라닐게라닐-피로포스페이트 (GGPP)로 구성되는 군으로부터 선택된 테르페노이드 전구물질로부터 유도된 테르페노이드 생산 방법.
45. 항 44 및 45 중 임의의 방법, 여기서 테르페노이드 생성물은 헤미테르페노이드, 모노테르펜, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 세스테르펜, 트리테르페노이드, 테트라테르페노이드 및 폴리테르페노이드로 구성되는 군으로부터 선택된다.
46. 항 44의 방법, 여기서 테르페노이드는 파르네실 포스페이트, 파르네솔, 게라닐게라닐, 게라닐게라니올, 이소프렌, 프레놀, 이소발레인산, 게라닐 피로포스페이트, 유칼립톨, 리모넨, 피넨, 파르네실 피로포스페이트, 아르테미시닌, 비사보롤, 게라닐게라닐 피로포스페이트, 레티놀, 레티날, 파이톨, 텍솔, 포르스콜린, 아피디콜린, 라노스테롤, 라이코펜 및 카로틴으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
47. 항 46의 방법, 여기서 상기 방법은 파르네솔을 생산하기 위하여 파르네실 포스페이트를 디포스포릴화하는 것을 더 포함한다.
48. 항 44의 방법, 여기서 스쿠알렌 합성효소 경로의 효소는 디메틸알릴 전이효소 (EC 2.5.1.1), 이소프렌 합성효소 (EC 4.2.3.27), 및 게라닐트랜스 전이효소 (EC 2.5.1.10)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
49. (a) 항 1 내지 42 중 임의의 하나의 세포를 제공하고,
(b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 기능성 스쿠알렌 합성효소 (EC 2.5.1.21)의 해독 속도를 감소시키는 방법.
50. (a) 항 1 내지 42 중 임의의 하나의 세포를 제공하고,
(b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 파르네실-피로포스페이트의 스쿠알렌으로의 전환을 감소시키는 방법.
51. (a) 항 1 내지 42 중 임의의 하나의 세포를 제공하고,
(b) (a)의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 화합물의 축적을 증대시키는 방법.
52. 항 51의 방법, 여기서 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 또는 게라닐게라닐-피로포스페이트 화합물을 회수하는 것을 더 포함한다.
53. 항 51 및 52 중 임의의 하나의 방법, 여기서 상기 파르네실-피로포스페이트, 이소펜테닐-피로포스페이트, 디메틸알릴-피로포스페이트, 게라닐-피로포스페이트 및 게라닐게라닐-피로포스페이트로부터 유도된, 스쿠알렌 경로를 통해 합성된 화합물을 회수하는 것을 더 포함한다.
54. 항 43 내지 53 중 임의의 방법, 여기서 세포를 배양하는 단계가 스쿠알렌 합성효소 억제제의 존재하에 수행된다.
55. 항 43 내지 54 중 임의의 방법, 여기서 세포는 포스포메발로네이트 인산화효소 (kinase) (EC 2.7.4.2), 디포스포메발로네이트 탈카르복실화효소 (EC 4.1.1.33), 4-히드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 합성효소 (EC 1.17.7.1), 4-히드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 환원효소 (EC 1.17.1.2), 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성화효소 1 (EC 5.3.3.2), 단쇄 Z-이소프레닐 디포스페이트 합성효소 (EC 2.5.1.68), 디메틸알릴 전이효소 (EC 2.5.1.1), 게라닐트랜스 전이효소 (EC 2.5.1.10) 및 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (EC 2.5.1.29)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성을 증대시키고/또는 과발현시키기 위하여 추가로 유전적으로 변형된다.
56. 항 43 내지 55 중 임의의 방법, 여기서 세포는 아세토아세틸 CoA 티올로오스, HMG-CoA 환원효소 또는 그의 촉매 도매인 (domain), HMG-CoA 합성효소, 메발로네이트 인산화효소, 포스페메발로네이트 인산화효소, 포스포메발로네이트 탈카르복실화효소, 이소펜테닐 피로포스페이트 이소머자아제, 파르네실 피로포스페이트 합성효소, D-1-디옥시자일룰오스 5-포스페이트 합성효소, 및 1-디옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 환원이성화효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성을 증대시키고/또는 과발현시키기 위하여 추가로 유전적으로 변형된다.
57. 항 43 내지 56 중 임의의 방법, 상기 세포는 ERG9 오픈 리딩 프레임에서 돌연변이체를 포함한다.
58. 항 43 내지 57 중 임의의 방법, 상기 세포는 ERG9[델타]::HIS3 결손/삽입 대립유전자를 포함한다.
59. 항 43 내지 58 중 임의의 방법, 상기 화합물이 회수 단계는 세포 배양 배지로부터 상기 화합물의 정제방법을 포함한다.
VI . 실시예
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 자세히 설명할 것이며, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 영역을 한정하지 않는다. 본원에 기재된 실시예에서, 하기 LC-MS 방법은 스테비올 글리코시드 및 그들이 검출되지 않는다면 스테비올 경로 중간물질을 분석하는데 이용하였다.
1)스테비올 글리코시드의 분석
LC-MS 분석법은 가열된 전자분사 이온 (HESI) 공급원을 가진 TSQ Quantum Access (써모피셔 사이언티픽) 삼중 쿼드로폴 질량 분광기에 연결된 페노미넥스® 키네텍스 (Phenomenex® kinetex) C18 컬럼 (150X2.1 mm, 2.6 ㎛ 입자크기, 100 Å 기공크기)로 제작한 어질런트 (Agilent) 1200 시리즈 HPLC 시스템 (어질런트 테크놀로지스, 윌밍톤, DE, USA)를 사용하여 수행하였다. 용리는 용리제 B (0.1% 포름산 함유 MeCN) 및 용리제 A (0.1% 포름산 함유 물)의 이동상을 이용하여, 10%에서 40%의 B를 0.0분에서 1.0 분으로 증가, 40%에서 50%의 B를 1.0분에서 6.5분으로 증가, 50%에서 100%의 B를 6.5분에서 7.0분으로 구배를 증가시키고, 최종적으로 세척 및 재평형 (re-equilibration)시킴으로써 실행하였다. 스테비올 글리코시드는 하기의 m/z-자동측정기를 갖는 정모드 (positive mode)에서 SIM (단일 이온 모니터링; Single Ion Monitering)을 사용하여 검출하였다.
Figure 112014022593516-pct00028
스테비올 글리코시드의 수준은 LGC 표준으로부터 진정 (authentic) 기준으로 획득한 검정 곡선 (calibration curve)과 비교하여 정량화하였다. 예를 들어, 0.5 내지 100 μM 레바우디오시드 A의 표준 용액을 검정 곡선을 만드는데 통상적으로 이용하였다.
2) 스테비올 및 엔트 - 카우레논산의 분석
스테비올 및 엔트-카우레논산의 LC-MS 분석은 상기 기재된 시스템에서 수행하였다. 분리를 위해서, 써모 사이언스 하이퍼실 골드(Thermo Science Hypersil Gold) (C-18, 3μm, 100x2.1mm)컬럼을 사용하였고, 20mM 암모늄 아세테이트 수용액을 용리제 A로, 아세토니트릴을 용리제 B로 사용하였다. 구배 조건은 20%→55% B, 0.0분에서 1.0분, 55%→100% B, 1.0분에서 7.0분 및 최종적으로 세척 및 재평형화였다. 유속은 0.5 mL/분이고, 컬럼 온도는 30℃였다. 스테비올 및 엔트-카우레논산은 하기의 m/z-자동측정기를 갖는 음성 모드에서 SIM (단일 이온 모니터링)을 이용하여 검출하였다.
Figure 112014022593516-pct00029
3) UDP -글루코오스의 HPLC 정량
UDP-글루코오스의 정량을 위하여, 워터스 엑스브리지 BEH 아미드 (2.5 μm, 3.0X50mm) 컬럼 (Waters XBridge BEH amid column)이 장착된 어질런트 1200 시리즈 (Agilent 1200 Series) HPLC 시스템을 사용하였다. 용리제 A는 10mM의 암모늄 아세테이트 수용액 (pH9.0)을, 용리제 B는 아세토니트릴을 사용하였다. 구배 조건은 95% B 고정에서 0.0 분부터 0.5분, 95%부터 50% B 감소시키면서 0.5분-4.5분, 50% B 고정에서 4.5분에서 6.8분 및 최종적으로 95% B 로 재평형시켰다. 유속은 0.9mL/분이고 컬럼 온도는 20℃였다. UDP-글루코오스는 UV262nm 흡광도로 검출하였다.
UDP-글루코오스의 양은 시판되는 표준 (예를 들어, 시그마 알드리치, Sigma Aldrich)으로 수득된 보정 곡선과 비교하여 정량화하였다.
실시예 1- EUGT11 의 판별
15개의 유전자를 RebA 1,2-글리코실화 활성에 대해 실험하였다. 표 10 참조.
표 10
Figure 112014022593516-pct00030
이들 유전자들의 시험관 내 전사 및 해독을 수행하였고, 생성된 UGTs를 RebA 및 UDP-글루코오스와 함께 배양시켰다. 배양 후, 반응물을 LC-MS로 분석하였다. EUGT11(쌀, AC133334, 서열 번호:152)를 함유하는 반응 혼합물에서 상당량의 RebA가 RebD로 전환된 것이 나타났다. 도 4의 LC-MS 크로마토그램 참조. 도 4의 좌측 패널에 도시한 바와 같이, RebA를 공급원료로 사용하였을 때 UGT91D2e가 미량의 RebD를 생성하였다. 도 4의 우측 패널에 도시한 바와 같이, RebA를 공급원료로 사용하였을 때 EUGT11은 상당량의 RebD를 생성하였다. 생성된 RebD의 양의 예비 정량화는 RebA에서 RebD로의 전환에서 EUGT11이 UGT91D2e보다 대략 30배 이상으로 효과적이라는 것을 나타낸다.
EUGT11을 추가 특성화시키고, UGT91D2e와의 양적 비교를 위해, EUGT11를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:153, 비-코돈 최적화됨, 도 7)을 N-말단 HIS-태그(tag)를 함유하는 하나와, N-말단 GST-태그를 함유하는 하나로된 2개의 대장균 발현 벡터에서 복제시켰다. EUGT11은 두 시스템을 이용하여 발현되었고, 정제되었다. 정제된 효소를 UDP-글루코오스와 함께 배양시켰을 때, RebA, RebD가 생산되었다.
실시예 2 - EUGT11 반응의 판별
EUGT11은 시험관 내에서 전사 및 해독을 통해 생성하였고, RebD 경로에서 다양한 기질들과 함께 배양시켰다. 시험관 내에서 전사되고 해독된 UGT91D2e를 이용하여 동일한 실험들을 수행하였다. 도 3은 EUGT11 및 UGT91D2e로 수행한 19-O-1,2-디글리코실화 반응의 도식도를 보여준다. 화합물 1 내지 3은 질량 및 예상 보유 시간에 의해서만 식별하였다. 도 3에 표시한 숫자는 LC-MS 크로마토그램으로부터 얻은 검출된 스테비올 글리코시드의 평균 최고점을 나타내고, 이것이 정량적인 것은 아니지만, 두 효소의 활성을 비교하는데 사용될 수 있다. EUGT11 및 UGT91D2e는 기질로서 스테비올을 사용할 수 없었다. 두 효소 모두 스테비올 19-O-모노글루코시드 (SMG)을 화합물 1로 전환시킬 수 있었고, EUGT11은 UGT91D2e 보다 19SMG를 화합물 1로 전환시키는데 10배 이상 효과적이였다.
두 효소 모두 대등한 활성으로 루부소시드를 스테비오시드로 변환시킬 수 있었으나, 오로지 EUGT11만이 루부소시드를 화합물 2와 화합물 3(RebE)으로 변환시킬 수 있는 활성을 가졌다. 도 5 참조. 도 5의 좌측 패널은 루부소시드의 스테비오시드로의 전환의 LC-MS 그로마토그램을 포함한다. 도 5의 우측 패널은 루부소시드의 스테비오시드로, 화합물 2로, 및 화합물 3 (Reb E)로의 전환의 크로마토그램을 포함한다. 루부소시드의 화합물 3으로의 전환은 스테비올의 19- 및 13-위치에서 2개의 연속적인 1,2-O-글리코실화를 필요로 한다. UGT91D2e는 한가지 실험에서 미량의 화합물 3 (Reb E)를 생성할 수 있는 반면, EUGT11은 상당량의 화합물 3를 생성할 수 있었다.
두 효소 모두 RebA를 RebD로 전환시킬 수 있다. 그러나, EUGT11이 RebA의 RebD로의 전환에서 대략 30배 정도 더 효과적이었다. 전체적으로, 루부소시드가 스테비오시드로 전환되는 경우를 제외하고는, (유사한 시간, 농도, 온도, 및 효소의 순도를 갖는) 모든 반응에서 EUGT11이 UGT91D2e에 비해 많은 생성물을 생산하는 것으로 보인다.
실시예 3 - 효모에서 EUGT11 의 발현
EUGT11을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 코돈-최적화시키고 (서열 번호:154), 모두 4개의 UGTs (UGT91D2e, UGT74G1, UGT76G1, 및 UGT85C2)를 인코드하는 핵산으로 효모에서 형질변환시켰다. 생성된 효모 균주를 스테비올을 함유하는 배지에서 성장시키고, 축적된 스테비올 글리코시드는 LC-MS로 분석하였다. EUGT11은 RebD의 생산을 위해 요구되었다. 다른 실험들에서, RebD 생성물은 UGT91D2e, UGT74G1, UGT76G1, 및 UGT85C2로 관찰되어 왔다.
실시예 4 - 19-O-1,2- 디글리코실화된 스테비올 글리코시드에서 UGT 활성
EUGT11에 의해 생성된 19-O-1,2-디글리코실화된 스테비올 글리코시드는 RebD로 전환되기 위해서 추가의 글리코실화 반응이 필요하다. 하기의 실험들은 다른 UGTs가 기질로서 이들 중간물질을 이용할 수 있는지를 결정하기 위해 수행되었다.
한가지 실험에서, 화합물 1은 UDP-글루코오스 존재하에 EUGT11 또는 UGT91D2e 중 하나에 의해 19-SMG로부터 시험관 내에서 생성되었다. 샘플을 가열한 후, UGT85C2 및 UDP-글루코오스를 첨가하였다. LC-MS로 샘플을 분석하고, 화합물 2를 검출하였다. 상기 실험은 UGT85C2가 기질로서 화합물 1을 사용할 수 있음을 나타내었다.
또 다른 실험에서, 화합물 2를 UGT91D2e 및 UDP-글루코오스와 함께 배양시켰다. 반응물은 LC-MS로 분석하였다. UGT91D2e는 화합물 2를 화합물 3 (Reb E)으로 전환시킬 수 없었다. 화합물 2를 EUGT11 및 UDP-글루코오스와 배양시키면 화합물 3을 생성하였다. UGT76G1은 RebD를 생성하기 위한 기질로서 RebE를 이용할 수 있었다.
상기는 스테비올 글리코시드의 19-O-1,2-디글리코실화 반응이 후속 효소가 19-O-1,2-디글리코실화된 중간물질을 대사작용할 수 있음에 따라 RebD의 생성동안 임의의 시간에서 발생할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5 - EUGT11 및 UGT91D2e 서열의 비교
EUGT11의 아미노산 서열 (서열 번호:152, 도 7) 및 UGT91D2e의 아미노산 서열 (서열 번호:5)는 FASTA 알고리즘을 이용하여 배열하였다 (피어슨 및 리프만 (Pearson 및 Lipman), Proc . Natl . Acad . Sci ., 85:2444-2448 (1998)). 도 6 a 및 b 참조. EUGT11 및 UGT91D2e는 457 아미노산에 걸쳐 42.7% 동일하다.
실시예 6 - UGT91D2e 의 19-1,2- 디글리코실화 활성의 변형
많은 UGTs의 경우 결정 구조물 (crystal structure)이 이용가능하다. 일반적으로, UGT의 N-말단 절반이 기질과 결합하는데 주로 관여되는 반면, C-말단 절반은 UDP-당 도너(donor)와 결합하는데 관여된다.
결정화된 UGTs의 2차 구조에 대해 UGT91D2e의 2차 구조를 모델화시킨 것은 도 8에 도시한 바와 같이 1차 구조가 매우 많이 분할되었음에도 불구하고 보존된 패턴의 2차 구조를 나타낸다. UGT71G1 및 UGT85H2의 결정 구조물 (예를 들어, H. Shao et al, The Plant Cell November 2005 vol. 17 no 11 3141-3154 및 L. Li et al., J Mol Biol. 2007 370(5):951-63) 참조)이 보고되고 있다. 공지된 루프, 알파-헬릭스 및 베타-시트는 도 8의 UGT91D2e 상에 표시한다. 이들 UGTs의 1차 구조 수준에서의의 동종성이 상당히 낮음에도 불구하고, 2차 구조는 보존되는 것으로 보이는데, 이것은 UGT85H2 및 UGT71G1 내의 이러한 아미노산의 위치를 기준으로 UGT91D2e에 결합하는 기질에 관여된 아미노산의 위치를 고려하는 예상을 가능케 한다
기질 결합에 관여하는 일반적인 부위는 UGT91D2e 상에 중첩 (superimposed)되었고, UGT91D1과는 상이한 22개의 아미노산과 일치하는 것을 광범위하게 보여준다 (진뱅크 수탁 번호 단백질 수탁 번호 AAR06918, GI:37993665). UGT91D1은 스테비아에서 고도로 발현되며, 기능성 UGT로 간주된다. 그러나, 이것의 기질은 스테비올 글리코시드가 아니다. 이것은 UGT91D1이 UGT91D2e와 상이한 22개의 아미노산으로 규정할 수 있는 다양한 기질을 가지고 있음을 시사한다. 도 9는 UGT91D1 및 UGT91D2e의 아미노산 서열의 정렬 (alignment)이다. 박스는 기질 결합에 관여된다고 보고된 부위를 나타낸다. 진회색으로 강조된 아미노산은 UGT91D1 및 UGT91D2e 사이에서 22개의 아미노산의 차이를 나타낸다. 별표는 분해된 결정 구조를 가진 UGTs에 기질 결합에 관여되는 것으로 보여지는 아미노산을 표시한다 (하나의 특정 아미노산 아래의 추가 별표들은 하나 초과의 구조-분해된 UGT를 갖는 것으로 보여지는 기질 결합을 의미한다). 두 가지 UGT91s 사이에 22개 아미노산의 차이 간의 강한 상관 관계가 있으며, 이는 기질 결합에 관여된 것으로 공지된 부위, 및 결정 구조-분해된 UGTs에서 기질 결합에 관여된 실제 아미노산들이 있다. 이는 두가지 UGT91s 사이의 22개 아미노산의 차이가 기질 결합에 관여됨을 제안한다.
91D2e에서 변경된 모든 22개 아미노산을 pGEX-4T1 벡터로부터 XJb Autolysis 대장균 균주에서 발현시켰다. 효소의 활성을 평가하기 위해, 2가지 기질을 공급하는 실험을 시험관 내 및 생체내에서 수행하였다. 대부분의 돌연변이체는 야생형에 비해 낮은 활성을 가졌지만, 5개의 돌연변이체는 향상된 활성을 보였다. 시험관 내에서 전사 및 해독 (IVT)에 의해 이것을 재생산하였고, C583A, C631A 및 T857C는 야생형 UGT91D2e 보다 대략 3배 더 높은 스테비오시드-형성 활성을 보인 반면, C662t 및 A1313C는 대략적으로 2배의 스테비오시드-형성 활성 (뉴클레오티드 넘버링)을 갖는 것을 나타내었다. 이러한 변화는 L195M, L211M, V286A; 및 221F 및 E438A에 각각 대응하는 아미노산 돌연변이체를 야기한다. 기질에 따라 다르게 증가된 활성에서, C583A 및 C631A는 기질로서 13-SMG를 사용하면 거의 10배의 증가를 보이고, 기질로서 루부소시드를 사용하면 약 3배의 증가를 보이는 반면, T857C는 기질로서 13-SMG나 루부소시드를 사용하면 3배의 증가를 보였다.
이들 돌연변이체가 첨가되었는지 조사하기 위해, 이중 돌연변이체의 범위를 만들고 활성을 분석하였다 (도 10). 이들 특정의 실험에서, 야생형 활성 수준이 그 전의 네가지 실험보다 높게 관찰되었으나; 돌연변이체의 상대적 활성들은 동일하게 유지되었다. 4 UGTs (UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, 및 UGT91D2e)를 발현시키는 많은 S. serevisiae 균주에서 루부소시드가 축적되는 것과 같이, 스테비오시드-형성 활성이 스테비올 글리코시드 생산을 증가시키는데 보다 중요할 수 있다. 상기와 같이, 이중 돌연변이체 C631A/T857C (뉴클레오티드 넘버링)은 유용할 수 있다. 상기 돌연변이체는 UGT91D2e-b로 명명하였고, 이는 아미노산 변형물 L211M 및 V286A를 포함한다. 본 실험에서는 S. cerevisiae-발현된 UGT91D2e-돌연변이체를 이용하여 시험관 내에서 재생산하였다.
UGT91D2e의 19-1,2-디글리코실화 활성을 향상시키기 위해서, UGT91D2e 및 UGT91D1 사이에 22개 아미노산 차이의 UGT91D2e의 직접 포화된 돌연변이유발 스크리닝 (directed saturated mutagenic screen)을 수행하였다. 진아트 (GeneArt's ®) (Life Technologies, Calsbad, CA) 부위-포화 돌연변이유발을 각각의 돌연변이체를 함유하는 라이브러리를 얻기 위해 사용하였다. 라이브러리는 GST 융합 단백질로서 91D2e의 돌연변이형을 발현하는 pGEX4T1 세균성 발현 플라스미드의 BamHI 및 NotI 부위에 클론시켜, 그 결과 새로운 라이브러리 (Lib#116)을 만들었다. Lib#116은 418개의 예견된 돌연변이체 (다시말해서, 각 자리에서 19개의 상이한 아미노산을 갖는 22 위치들)를 함유하는 약 1600개 클론을 생성하기 위해 XJbAutolysis 대장균 균주 (ZymoResearch, Orange, CA)에서 형질변환되었다. 91D2e (EPCS1314), 91D2e-b (EPSC1888) 또는 EUGT11 (EPSC1744)의 GST-태그된 버전을 발현시키는 다른 플라스미드 뿐만 아니라 공 pGEX4T1 (PSB12) 또한 형질변환시켰다.
LC - MS 에 의한 스크리닝 ( screening )
UGT91D2e의 대략 1600개의 돌연변이체 클론을 분석하기 위하여, 대장균 형질변환체를 96-웰 포멧 (96-well format)에서, 30℃로 암피실린 (100 ㎎/l) 및 클로르암페니콜 (33 ㎎/l)을 함유하는 NZCYM 1㎖ 내에서 하룻밤동안 성장시켰다. 다음 날, 각 배양액 150 ㎕을 암피실린 (100 ㎎/l), 클로르암페니콜 (33 ㎎/l), 아라비노오스 3 mM, IPTG 0.1 mM 및 에탄올 2% v/v를 함유하는 NZCYM 3 ㎖에서, 24-웰 포멧으로 배양시키고, 20 ℃ 및 약 20시간 동안 200rpm에서 배양시켰다. 그 다음날, 세포를 원심분리하고, 침전물 (pellets)을 10 mM 트리스-HCL pH 8, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 및 콤플리트 미니 단백질분해효소 (complete mini protease) 억제제 EDTA-프리 (3 정제/100 ㎖)(호프만-라 로쉬 (Hoffmann-La-Roche, Basel, Switzerland))를 함유하는 용해 완충액 (lysis buffer) 100 ㎕에 재현탁시키고, 세포 용해를 촉진시키기 위해 적어도 15분 동안 -80℃에서 냉동시켰다. 침전물들을 실온에서 해동시키고, 50 ㎕의 DNase 혼합물 (H20 내의 1.4 ㎎/㎖ (~80000u/㎖) 1 ㎕), 1.2 ㎕의 MgCl2 500mM 및 47.8㎕의 4XPBS 완충용액)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 5분동안 500 rpm에서 진탕하여 게놈 DNA가 분해되도록 한다. 플레이트를 4℃에서 4000rpm으로 30분 동안 원심분리하고, 6 ㎕의 용해물을 기질로서 루부소시드 또는 레바우디오시드 A를 사용하는 GST-91D2e-b에 기재한 바와 같이 시험관 내 반응에서의 UGT에 사용하였다. 각각의 경우에서, 생성된 화합물, 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D (rebD)는 LC-MS로 측정하였다. 결과를 대응하는 대조군 (91D2e, 91D2e-b, EUGT11 및 공 플라스미드)를 발현시키는 용해물에 의해 생성된 스테비오시드 또는 rebD와 비교하여 분석하였다. 91D2e-b를 발현시키는 것들과 동일하거나 보다 높은 활성을 보이는 클론들을 1차 선별자 (primary hits)로 선별하였다.
1600 클론들의 절반과 상응하는 대조군들을 루부소시드 및 레바우디오시드 A를 글리코실화하기 위한 이들의 능력에 대해 분석하였다. 스테비오시드 및 RebD는 LC-MS에 의해 정량화하였다. 이용된 조건하에서, 천연 UGT91D2e를 발현시키는 클론으로부터의 용해물은 두가지 기질 모두에서 단지 기본 수준의 활성 (대략 0.5 μM 스테비오시드 및 1μM RebD)을 보이는 반면, UGT91D2e-b를 발현시키는 클론은 지속적으로 향상된 생성물 생성 (＞10 μM 스테비오시드; ＞1.5 μM RebD)를 나타낸다. EUGT11을 발현시키는 클론은 특히 기질로서 RebA를 이용하면 보다 향상된 수준의 활성을 항시적으로 나타낸다. 스크리닝에서 1차 선별자로서 고려되는 클론들의 컷오프 (cutoff)는 일반적으로 두 생성물 모두에서 1.5 μM로 설정하였으나, 일부 경우에서는 각각의 독립적인 분석에 따라 조정하였다.
실시예 7 - EUGT11 동족체들
EUGT11 단백질 서열을 이용하여 NCBI nr 데이터베이스의 Blastp 검색은 14가지 식물 종으로부터 대략 79가지 가능한 UGT 동족체를 나타낸다 (이들 중 하나가 스테비아 UGT91D1, 보존된 UGT 영역에서 EUGT11와 대략 67%의 동일성 그러나 전체적으로는 45% 이하). 보존된 영역에서 90% 이상의 동일성을 갖는 동족체는 옥수수, 대두, 아라비도프시스 (Arabidopsis), 포도, 및 수수로부터 확인하였다. 아미노산 수준에서, 전장의 EUGT11 동족체의 전체 동종성은 단지 28 내지 68%이였다.
이안돌리노 등 (Iandolino et al., Plant Mol Biol Reporter 22, 269-278, 2004)에 의해 기술된 방법, 제작사의 지시에 따른 RNeasy Plant 미니 키트 (Qiagen), 또는 제작사의 지시에 따른 신속한 RNA 프로 그린 키트 (MP 바이오메디칼스)를 이용하여 RNA를 식물 원료로부터 추출하였다. cDNA는 제작사의 지시에 따라 어피니티스크립트 (AfinityScript) QPCR cDNA 합성 키트 (아질런트)에 의해 생성하였다. 게놈 DNA는 제작사의 지시에 따라 FastDNA 키트 (MP 바이오케미칼스)를 이용하여 추출하였다. PCR은 Dream Taq 중합효소 (페르멘타스, Fermentas) 또는 Phusion 중합효소 (뉴잉글랜드 바이오랩스; New England Biolabs)를 이용하여 cDNA에 대해 수행하였고, 일련의 프라이머는 동족체를 증폭시키기 위해 설계하였다.
PCR-반응물은 SyberSafe-함유 아가로오즈 TAE 겔에서 전기영동법으로 분석하였다. DNA는 트랜스 일루미네이터에서 자외선-방사선조사 (UV-irradiation)에 의해 가시화되었다. 정확한 크기의 밴드를 잘라내고, 제작사의 설명에 따라 회전 컬럼을 통해 정제하고, 그리고 TOPO-Zero 블런트 (Phusion 중합효소-생산 제품) 또는 TOPO-TA (Dream Taq-생산 제품) 안에서 클론시켰다. PCR 산물을 함유하는 TOPO-벡터는 대장균 DH5Bα 안으로 형질변환시키고, 적절한 선별 항생제를 함유하는 LB-아가 플레이트에 플레이팅하였다. 생존 콜로니들로부터 DNA를 추출하고 서열화하였다. 정확한 서열을 갖는 유전자는 Sbfl 및 AscI를 갖는 제한 효소로 잘라내고, 유사하게 분해된 IVT8 벡터 안에서 클론시키고 대장균 안에서 형질전환시켰다. PCR은 시험관 내 전사 및 해독을 위해 필요한 유전자 및 인접 영역 (flanking regions)을 증폭시키기 위해 모든 복제된 유전자들을 대상으로 수행하였다. 제작사의 지시에 따라 프로메가 (Promega) L5540, TNT T7 Quick for PCR DNA 키트를 이용하여 시험관 내 전사 및 해독에 의한 PCR 생성물로부터 단백질을 생산하였다. 단백질의 생산은 35S-메티오닌을 통합하고, 이어서 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 타이푼 포스포르-이메이져 (Typhoon phosphor-imager)에서 가시화시켜 측정하였다.
활성 분석은 각각의 시험관 내 반응물의 총 20% (부피에 대해), 0.1 mM 루부소시드 또는 RebA, 5% DMSO, 100 mM Tris-HCl pH 7.0, 0.01 유닛 Fast 알칼린 포스파타제 (페르멘타스, Fermentas), 및 0.3 mM UDP-글루코오스 (최종 농도)로 설정하였다. 30 ℃에서 1시간 동안 배양시킨 후, 상기 기재한 바와 같이 스테비오시드 및 RebD의 생성에 대해 샘플을 LC-MS로 분석하였다. UGT91D2e 및 UGT91D2e-b (실시예 6에 기재한 이중 돌연변이체)를 EUGT11과 마찬가지로 양성 대조군으로서 사용하였다. 초기 분석 조건하에서, 클론 P 64B (표 11 참조)은 루부소시드 및 RebA를 이용하여 미량의 생성물을 생산하였다. 표 11은 UGTs의 전체 길이에 대해 EUGT11과 비교한 아미노산 수준에서의 % 동일성을 나열하였고, 범위는 28-58%이다. 동종성의 높은 값 (96-100%)은 서열의 보다 짧은 스트레치를 통해 관찰되었고, 이는 식물 UGTs의 보존된 도메인이 보다 많음을 나타낼 수 있다.
표 11
복제된 EUGT 동족체의 목록 및 EUGT11 에 대한 그들의 아미노산 % 동일성
Figure 112014022593516-pct00031
실시예 8 - Reb -D의 무-세포 ( cell - free ) 생촉매적 생산
무-세포 접근 방법은 RebA, 스테비오시드 또는 스테비올 글리코시드 혼합물을 RebD로 효소적으로 전환시키는 시험관 내 시스템이다. 이 시스템은 UDP-글루코오스의 화학량론적 양을 필요로 하고, 그에따라 수크로오스 합성효소를 이용하여 UDP 및 수크로오스로부터 UDP-글루코오스 재생산에 이용할 수 있다. 추가적으로, 수크로오스 합성효소는 반응동안 생성된 UDP를 제거하고, 이는 글리코실화 반응동안 관찰된 생성물 억제를 완화시킴으로써 글리코실화된 산물로의 전환을 향상시킨다. WO 제2011/153378호 참조.
효소 발현 및 정제
UGT91D2e-b (실시예 6에 기재) 및 EUGT11은 RebD를 수득하는 RebA의 글리코실화를 촉매하는 핵심 효소이다. 이들 UGTs을 세균 (대장균)에서 발현시켰으나, 당 업계의 숙련자는 상이한 방법 및 숙주 (예를 들어, 바실러스 종과 같은 다른 세균, 피치아 종 또는 사카로마이세스 종과 같은 효모, 다른 곰팡이 (예를 들어, 아스퍼질러스), 또는 다른 유기체)를 이용하여 이러한 단백질을 또한 제조할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 단백질은 시험관 내 전사 및 해독에 의해서, 또는 단백질 합성에 의해 생산할 수 있다.
UGT91D2e-b 및 EUGT11 유전자를 pET30a 또는 pGEX4T1 플라스미드 내에서 복제시켰다. 생성된 벡터는 XJb (DE3) Autolysis 대장균 균주 (ZymoResearch, Ornage, CA) 안에서 형질변환되었다. 초기에는, 대장균 형질변이체를 NZCYM 배지에서 30℃에서 하룻밤동안 성장시키고, 이후 3 mM 아라비노오스와 0.1 mM의 IPTG와 함께 배양시키고, 30℃에서 하룻밤 더 배양시켰다. 상응하는 융합 단백질은 포함 6HIS-또는 GST-태그 및 표준 방법을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제 하였다. 당업계의 숙련자들은 겔 여과 또는 다른 크로마토그래피 기법과 같은 기타 단백질 정제 방법, 예를들어, 황산 암모늄 침전/분별 결정화와 함께 또한 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. EUGT11이 초기 조건을 이용하여 잘 발현시키는 반면, UGT91D2e-b는 30 ℃로부터 20℃로 하룻밤 발현의 온도를 낮추고, 발현 배지에 2%의 에탄올을 추가하는 것을 포함하는, 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 기본 과정에 몇 가지 수정이 필요하다. 일반적으로 2-4 ㎎/L의 용해성 GST-EUGT11 및 400-800 ㎍/L의 GST-UGT91D2e-b을 상기 방법으로 정제하였다.
EUGT11 의 안정성
반응은 RebA의 RebD로의 다양한 반응 조건하에서 EUGT11의 안정성을 탐구하기 위해 수행하였다. 반응 혼합물로부터 기질을 생략하기 위해, 기질을 첨가하기 전에 EUGT11를 다양한 시간 간격동안 예비 배양시켰다. 100 mM 트리스-염산 완충액에서 효소를 예비-배양시킨 후, 기질 (100 μM RebA) 및 기타 반응 성분 (300 μM UDP-글루코오스, 및 10 U/mL의 알칼리 포스파타아제 (Fermentas/써모 피셔, Waltham, MA))을 첨가하였다 (배양 시작한 후 0, 1, 4 또는 24 시간). 반응을 20 시간 동안 진행시킨 후, 반응을 정지시키고, RebD 산물-형성을 측정하였다. 실험은 다양한 온도에서 반복하였다: 30℃, 32.7℃, 35.8℃ 및 37℃.
효소가 37℃에서 예비 배양되었을 때 EUGT11의 활성은 급속하게 감소되었는데, 배양 후 1 시간 후 대략 절반 정도의 활성에 도달하고, 4 시간 후에는 거의 활성이 갖지 않았다. 30℃에서, 활성은 4 시간 후 및 24 시간 후에도 크게 감소하지 않고, 활성의 대략 3분의 1은 남아있었다. 이것은 EUGT11이 열에 불안정하다는 것을 제안한다.
EUGT11의 열 안정성을 평가하고 스테비올 글리코실화 경로에 있는 다른 UGTs 와 비교하기 위해서, 단백질의 변성 온도를 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정하였다. 변성 온도, TD를 추정하기 위한 DSC 써모그램 (thermograms)의 사용은 예를 들어, E. Freire in Methods in Molecular Biology 1995,Vol.40 191-218에 기재되어 있다. DSC는 6HIS-정제된 EUGT11을 이용하여, 39℃의 겉보기 온도 TD 측정하여 수행하였고; GST-정제된 91D2e-b가 사용되었을 때 측정된 TD는 79℃였다. 참조를 위해, 6HIS-정제된 UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2을 사용하였을 때 측정된 TD는 모든 경우에 86℃였다. 당업자는 효소 고정화 또는 열 보호제의 첨가가 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 반응물에 첨가할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 열 보호제의 비 제한적인 예로는 트레할로스, 글리세롤, 황산 암모늄, 베타인, 트리메틸아민 옥시드, 및 단백질이 있다.
효소 반응 속도론 ( kinetics )
EUGT11 및 91D2e-b의 반응 속도 매개변수를 결정하기 위해 일련의 실험들을 수행하였다. 두가지 효소 모두의 경우, 100 μM의 RebA, 300 μM UDP-글루코오스, 및 10 U/mL의 알칼리 포스파타아제 (Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA)을 반응에 사용 하였다. EUGT11의 경우, 반응은 100 mM 트리스-염산, pH 7, 및 2 %의 효소를 사용하여 37℃에서 실시하였다. 91D2e-b의 경우, 반응은 20 mM의 헤페스(Hepes)- 수산화 나트륨, pH 7.6, 20%의 효소 (부피에 대해)를 사용하여 30 ℃에서 실시하였다. 초기 속도 (V0)은 생성물 대 시간 플롯의 선형 범위로 계산하였다.
직선 구간을 먼저 조사하기 위해, 초기 시간-과정이 각 효소에 대해 수행 되었다. EUGT11은 100 μM RebA 및 300 μM의 UDP-글루코오스의 초기 농도에서 37℃, 48시간 동안 측정하였다. UGT91D2e-b는 200 μM RebA 및 600 μM의 UDP-글루코오스의 초기 농도에서 37℃, 24시간 동안 측정하였다. 이러한 범위-검색 연구에 기초하여, EUGT11의 경우에서 초기 10분, UGT91D2e-b에서 초기 20분이 생성물 형성에 관여하는 직선 범위에 있을거라 판단하였고, 따라서 각 반응의 초기 속도를 이들 간격으로 계산하였다. EUGT11의 경우, 측정된 RebA 농도는 30 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM 및 500 μM이었다. UDP-글루코오스의 농도는 RebA의 농도의 항상 3배였고, 배양은 37℃에서 수행하였다. 기질 농도의 함수로서 계산된 V0를 플로팅하여, 미카엘리스-멘텐 곡선 (Michaelis-Menten curve)를 생성하였다. V0의 역수와 [S]의 역수를 플로팅하여, y= 339.85x + 1.8644; R2 = 0.9759인 라인위버-버크 그래픽 (Lineweaver-Burk graphic)을 얻었다.
Vmax 및 KM 매개변수는 x 및 y 절편으로부터 계산된 곡선 적합 라인위버-버크 데이터로부터 결정하였다 (x=0, y=1/Vmaz) 및 (y=0, x=-1/KM). 추가적으로, 동일한 매개변수도 엑셀에서 SOLVER 함수를 사용하여 비선형 최소 제곱 회귀분석법 (non-linear least square regression)에 의해 계산하였다. EUGT11 및 RebA에 대한 두가지 방법으로 얻어진 결과를 본 실시예의 모든 반응속도 매개변수들과 함께 표 12에 나타낸다. 비선형 최소 제곱 적합도 방법 및 라인위버-버크 플롯 모두로부터 얻은 결과는 표 12에 나타낸다. Kcat은 분석에서 단백질의 대략적인 양으로 나눈 Vmax를 기반으로 계산한다.
표 12
기질로서 RebA 또는 UDP -글루코오스를 갖는, EUGT11 와 UGT91D2e -b의 반응 속도 매개변수의 비교
Figure 112014022593516-pct00032
글리코실화 반응에서 UDP-글루코오스 농도의 영향 뿐만 아니라 UDP-글루코오스에 대한 EUGT11의 친화성을 조사하기 위해, 유사한 반응속도 분석을 수행하였다. 과잉의 RebA (500 μM)를 유지하면서, UDP-글루코오스의 양을 증가 (20 μM, 50 μM, 100 μM, 및 200 μM)시키면서 EUGT11을 배양시켰다. 반응 속도 매개변수는 상기 전술한 바와 같이 계산하고, 표 12에 나타내었다.
UGT91D2e-b의 경우, RebA 농도는 50 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 및 500 μM이었다. UDP-글루코오스의 농도는 RebA의 농도의 항상 3배였고, 배양은 UGT91D2e-b에 대해 상기 전술한 반응 조건에서 30 ℃에서 수행하였다. 반응 속도 매개변수는 상기 전술한 바와 같이 계산하였고; 얻어진 반응 속도 매개변수는 표 12에 나타낸다. 추가적으로, UDP-글루코오스로 UGT91D2e-b의 반응 속도 매개변수를 결정하였다. UGT91D2e-b는 과잉의 RebA (1500 μM)를 유지하면서 UDP-글루코오스의 양을 증가 (30 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM)시키면서 배양하였다. 배양은 UGT91D2e-b를 위한 최적의 조건에서 30 ℃에서 실시하였다. 반응 속도 매개변수는 상기 전술한 바와 같이 계산하였고, 표 12에 나타낸다.
EUGT11 및 91D2e-b에 대한 반응 속도 매개변수를 비교함으로써, 91D2e-b의 UDP-글루코오스에 대한 KM이 EUGT11 보다 낮음에도 불구하고, 91D2e-b가 RebA에 대해 보다 낮은 Kcat를 갖고 보다 낮은 친화성 (보다 높은 KM)을 갖는다는 결론을 내렸다. UGT91D2e-b는 낮은 Kcat/KM을 갖는데, 이는 특정 기질 (Kcat) 및 효소-기질 결합의 강도 (KM)와 촉매의 속도에 대한 정보와 함께 촉매 효율의 측정치가 된다.
반응에서 제한 요인의 결정
EUGT11의 경우 상기 전술한 조건 하에서, 대략 25%의 반응된 RebA가 RebD로 형질전변되었다. 이러한 조건에서 제한 요인은 효소, UDP-글루코오스 또는 RebA 가 될 수 있었다. 실험은 이들 가능성 간을 구별하기 위해 설정하였다. 표준 분석은 4시간 동안 이들 과정을 실행하도록 하였다. 그 뒤, 여분의 RebA 기질, 여분의 효소, 여분의 UDP-글루코오스 또는 여분의 효소 및 UDP-글루코오스 중 하나를 첨가하였다. 여분의 효소를 첨가하면 약 50%의 전환의 상대적 증가를 가져오고, RebA 또는 UDP-글루코오스의 단독 첨가는 전환을 크게 증가시키지 않았으나, 효소 및 UDP-글루코오스의 동시 첨가는 전환을 약 2배 증가시켰다.
RebA의 RebD로의 전환 반응에서 알약정도량의 UDP-글루코오스 및 신선한 효소를 첨가하면 이러한 장점을 제한하는지 검토하기 위해 실험들을 수행하였다. 추가 효소 또는 효소와 UDP-글루코오스를 1, 6, 24, 및 28 시간 후에 첨가하였다. 여분의 EUGT11 및 UDP-글루코오스 모두를 첨가하는 경우, 70% 이상의 전환을 달성하였다. 다른 구성 요소는 변환에 큰 영향을 미치지 않았다. 이것은 EUGT11가 반응에 대한 주요한 제한 요인이지만, UDP-글루코오스도 제한되어 있음을 나타낸다. UDP-글루코오스가 RebA 보다 3배 더 높은 농도로 존재 하기 때문에, 이는 UDP-글루코오스가 적어도 EUGT11의 존재하에서 반응 혼합물 내에서 다소 불안정할 수 있다는 것을 나타낸다. 다르게는, 하기의 설명한 바와 같이, EUGT11은 UDP-글루코오스를 대사할 수 있다.
억제 연구
수크로오스, 프룩토오스, UDP, 생성물 (RebD) 및 보다 덜 순수한 스테비아 추출물 원재료 내의 불순물과 같은 요인들이 스테비올 글리코시드 기질의 RebD로의 전환의 정도를 억제하는지를 결정하기 위해 실험을 실시하였다. 표준 반응 혼합물에서, 과량의 잠재적 억제제 (수크로오스, 프룩토오스, UDP, RebD, 또는 스테비올 글리코시드의 시판 블렌드 (Steviva, 스테비아 브랜즈, Inc., Portland, OR)를 첨가하였다. 배양 후에, RebD 생산을 정량하였다. 시판 Steviva 혼합물 (약 60 % 1,2-스테비오시드, 30% RebA, 5% 루부소시드, 2%의 1,2-비오시드, 1% 미만의 RebD, RebC 및 기타, LC-SM로 모두 측정됨) 500 ㎍/㎖의 첨가로는 억제된 것을 발견하지 못했으나, 오히려 혼합물에 원래 첨가된 RebD (약 5μM)을 훨씬 넘어서 전체 RebD 생산이 (어떠한 첨가 없이도 약 30 μM로부터 약 60 μM로) 증가하였다. 시험한 분자로부터, 단지 UDP만이 사용된 농도 (500 μM)에서 RebD-생산에 대한 억제 효과를 나타내는 것을 LC-MS로 측정하였다. 생산된 RebD은 7 μM 미만이였다. 이러한 억제는 RebD 생산을 위한 생체내 또는 시험관 내 실험에서 효모에 의해 또는 수크로오스와 관련된 첨가된 SUS (수크로오스 합성효소)에 의해, UDP-글루코오스로 UDP-재순환 시스템을 포함시킴으로써 완화시킬 수 있다. 게다가, UDP-글루코오스를 보다 적은 양으로 실험하면 (300 μM), UDP-G를 제거하는 알칼리 포스파타아제의 첨가는 시험관 내 글리코실화에서 실질적으로 생산된 RebD의 양을 증가시키지 않고, 이는 생성된 UDP가 이들 농도에서 저해제가 아닐 수 있음을 제안한다.
RebA 대 정제되지 않은 ( crude ) 스테비올 글리코시드 혼합물
일부 실험에서, 정제되지 않은 스테비올 글리코시드 혼합물을 정제된 RebA 대신에 RebA의 공급원으로 사용하였다. 이러한 정제되지 않은 스테비올 글리코시드 혼합물은 RebA와 함께 높은 비율의 스테비오시드를 함유하고, UGT76G1을 반응에 포함시켰다. 시험관 내 반응은 기질로서 Steviva ® 혼합물 0.5g/l와 효소 (UGT76G1 및/또는 EUGT11)을 사용하여 상기 전술한 바와 같이 수행하였고, 30℃에서 배양시켰다. 스테비올 글리코시드의 존재는 LC-MS로 분석하였다.
UGT76G1만을 반응에 첨가했을 때, 스테비오시는 매우 효율적으로 RebA로 전환되었다. (4.02분에서 보유 시간 피크를 갖는) 비공지 펜타-글리코시드 또한 검출되었다. EUTG11만을 반응에 첨가했을 때, 다량의 RebE, RebA, RebD 및 (3.15 분에서 보유 시간 피크를 갖는) 비공지 스테비올-펜타글리코시드가 발견되었다. EUGT11 및 UGT76G1 모두를 반응에 첨가했을 때 스테비오시드 피크가 감소되었고, 거의 전체적으로 RebA 및 RebD로 전환되었다. 여기서는 미량의 비공지 스테비올-펜타글리코시드 (4.02분에서 피크)가 있었다. RebE은 검출되지 않았고, 제2의 비공지 스테비올-펜타글리코시드 (3.15분에서 피크)도 없었다. 이 결과는 EUGT11 및 UGT76G1를 함께 사용하는 경우 시험관 내에서 RebD 생산하기 위한 기질로서 스테비아 추출물의 사용이 가능하다는 것을 나타낸다.
비특이적 UDP -글루코오스 대사과정
EUGT11가 RebA의 RebD로의 전환에 독립적으로 UDP-글루코오스를 대사할 수 있는지를 결정하기 위해, GST-정제된 EUGT11를 RebA 기질의 존재 또는 부재하에서 배양시키고, UDP-글루코오스 사용량을 TR-FRET 트랜스크리너 (Transcreener®) 키트 (Bellbrook Labs.)를 사용하여 UDP 방출로 측정하였다. Transcreener ® 키트는 항체에 결합된 트레이서 (tracer) 분자에 근거한다. 트레이서 분자는 매우 민감하고 정량적인 방법으로 UDP 또는 ADP에 의해 대체된다. FP 키트는 항체에 결합된 Alexa633 트레이서를 포함한다. 트레이서는 UDP/ADP에 의해 대체된다. 대체된 트레이서는 자유롭게 회전하여 형광 편광을 감소시킨다. 따라서, UDP 생산은 편광 의 감소에 비례한다. FI 키트는 항체에 결합된 활성감소된(quenched) Alexa594 트레이서를 포함하고, 이는 IRDye® QC-1 활성감소제(quencher)에 접합되어 있다. 트레이서는 UDP/ADP에 의해 대체되어, 대체된 트레이서가 활성감소를 풀어, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, UDP 생산은 형광의 증가에 비례한다. TR-FRET 키트는 항체-TB 복합체에 결합된 HiLyte647 트레이서를 포함한다. UV 범위 (약 330nm)에서 테르븀(terbium) 복합물의 여기 (excitation)는 트레이서에 에너지를 전달하고, 시간 지연 후 더 높은 파장 (665nm)에서의 방출을 초래한다. 트레이서는 TR- FRET의 감소를 일으키는 UDP/ADP에 의해 대체된다.
측정된 UDP-글루코오스가 RebA 기질의 존재에 동일한 독립성이였다는 것을 관찰하였다. UDP 방출은 효소의 부재시에는 검출되지 않았다. 이것은 EUGT11에 의한 UDP-글루코오스의 비특이적 분해를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, RebD은 여전히 RebA가 첨가될 때 생성되었고, 이는 EUGT11이 비특이적 UDP-글루코오스 분해를 통해 RebA의 글리코실화를 우선적으로 촉매한다는 것을 제안한다.
RebA 또는 다른 명백한 글리코실화 기질의 부재하에서 글루코오스 분자의 역할을 찾기 위해 실험을 설정하였다. 이전의 모든 반응에서 하나의 공통 인자는 트리스 완충액 및/또는 미량의 글루타티온의 존재였고, 이둘 모두는 잠재적 글리코실화 부위를 포함하였다. 비특이적 UDP-글루코오스 소비에 대해 이들 분자의 효과는 RebA의 존재 또는 부재 하에서, 시험관 내 반응으로 GST-정제된 EUGT11 (글루타티온 함유) 및 HIS-정제된 효소 (글루타티온 비함유)를 이용하여 분석하였다. UDP-글루코오스의 사용량은 TR-FRET Transcreener® 키트를 사용하여, UDP-방출량으로 측정하였다. UDP 방출은 모든 경우에서 발생했으며, RebA의 존재에 영향받지 않았다. HIS-정제된 효소가 사용 된 경우, UDP 방출은 보다 느렸지만, RebA의 RebD로의 전환에서 전반적인 효소의 촉매 활성 또한 낮았고, 이는 적은 양의 활성 용해 효소가 검정에서 존재하는 것을 의미한다. 따라서, EUGT11에 의한 UDP-글루코오스 대사과정은 시험되는 조건하에서 기질의 존재와 무관하고, 반응에서 글루타티온의 존재와도 무관한 것을 나타낸다.
EUGT11에 의한 UDP-글루코오스 대사과정에서 트리스 (Tris)의 효과를 시험하기 위하여, GST-EUGT11를 두 경우 모두에 유사한 양의 단백질을 수득하는 트리스- 또는 유사한 PBS계 완충액을 사용하여 정제하였다. 트리스- 및 PBS-정제된 효소는 상기와 동일한 방식으로 RebA의 존재 또는 부재 하에서, 각각의 완충용액으로서 트리스 및 HEPES를 이용한 시험관 내 반응에 사용하였다. 두 조건 모두에서, UDP 방출은 RebA를 첨가하건 아니건, 반응에서 동일하였고, 이는 EUGT11에 의한 UDP-글루코오스의 대사 과정이 반응에서 RebA 및 트리스의 존재 모두와 무관하다는 것을 나타낸 것이다. 이는 검출된 UCP-방출이 어쩌면 EUGT11의 특성에 의해 발생된 인공물 (artifacts)일 수 있거나, 다르게는 EUGT11이 UDP-글루코오스를 가수분해시킬 수 있다는 것을 암시한다. EUGT11은 여전히 RebA의 RebD로의 전환에서 우선적으로 효과적이고, UDP-G의 손실은 하기 기재된 수크로오스 합성효소 회수 시스템의 도입으로 보상될 수 있다.
RebA 용해도
RebA의 용해도는 전-세포 (whole-cell)에 대한 접근 및 무-세포 (cell-free) 접근방식을 모두 사용할 수 있는 농도를 결정한다. 물로 RebA의 여러 가지 상이한 용액을 만들고, 며칠 동안 실온에서 방치하였다. 저장 24 시간 후, RebA는 50 mM 또는 그 이상의 농도에서 침전되었다. 25mM의 RebA가 4 ~ 5일 후에 침전되기 시작한 반면, 4 ℃에서 저장하면 10 mM 이하의 농도가 용액에 남아 있었다.
RebD 용해도
RebD의 용해도는 물로 RebD의 여러 가지 상이한 용액을 만들고, 30℃에서 72 시간 동안 배양시켜 분석하였다. RebD는 초기에는 1 mM 농도 이하에서 물에 용해되었으나, 0.5 mM 이하의 농도로 오랜 기간 동안 안정적인 것으로 나타났다. 당업자는 용해도가 pH, 온도, 또는 다른 매트릭스와 같은 임의의 여러개의 조건들에 의해 영향을 받을 수 있음을 인지할 것이다 .
수크로오스 합성효소
수크로오스 합성효소 (SUS)는 다른 작은 분자 글리코실화 동안 UDP 및 수크로오스 (도 11)로부터 UDP-글루코오스를 재생하는데 사용되어 왔다 (사야카 등, (Sayaka et al.), FEBS Letters 581 (2007)2562-2566). A. thaliana, S. rebaudiana 및 커피 (Coffea arabica)로부터의 3가지 SUS1 유전자들을 pGEX4T1E 대장균 발현 벡터 안에서 클로닝하였다 (도 17 a 내지 c 서열 참조). EUGT11에 대해 전술한 것들과 동일한 방법들을 이용하여, 약 0.8 ㎎/l의 GST-AtSUS1 (A. thaliana SUS1)를 정제하였다. GST-정제에 따른 CaSUS1 (Coffea arabica SUS1) 및 SrSUS1 (S. rebaudiana SUS1)의 초기 발현은 상당량의 단백질을 생산하지 않았음에도 불구하고, 웨스턴 블랏으로 분석했을 때 GST-SrSUS1의 존재가 확인되었다. GST-SrSUS1이 2 % 에탄올의 존재 하에 20℃에서 발현될 때, 약 50㎍/l 효소가 생산되었다.
정제된 GST-AtSUS1 및 GST-SrSUS1의 UDP-글루코오스 재생 활성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 시험관 내 분석법은 100mM 트리스-염산 pH=7.5 및 1 mM의 UDP (최종 농도)에서 실시하였다. 정제된 GST-AtSUS1 ~2.4 ㎍, GST-SrSUS1 ~0.15 ㎍, 또는 시판 BSA (뉴 잉글랜드 바이오 랩스, Ipswich, MA) ~1.5 ㎍도 첨가하였다. 반응은 수크로오스 ~ 200 mM 존재 또는 부재 하에서 수행하고, 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. UDP-글루코오스 생성물은 분석 섹션에서 기재한 바와 같이 HPLC 로 측정하였다. 수크로오스가 존재할 때, AtSUS1은 ~0.8 mM의 UDP-글루코오스를 생산하였다. SrSUS1 또는 음성 대조군 (BSA)을 사용하였을 때, UDP-글루코오스가 관찰되지 않았다. SrSUS1에 대해 관찰된 활성 부족은 정제된 효소의 낮은 품질과 농도 때문이라 설명할 수 있다. AtSUS1에 의한 UDP-글루코오스 생산은 수크로오스 의존적이며, 따라서, AtSUS1는 저분자 글리코실화반응 동안 EUGT1 또는 다른 UGTs 의해 사용되는 UDP-글루코오스를 재생성하기 위한 결합 반응에 사용될 수 있다는 결론을 얻었다 (상기 도 11 참조).
SUS은 도 11에 도시된 바와 같이 수크로오스 및 UDP로부터 UDP-글루코오스와 프룩토오스 형성을 촉매한다. 이러한 UDP-글루코오스는 이후 RebD를 생성하기 위한 RebA의 글리코실화 동안 EUGT11에 의해 이용될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이 ~200 mM의 수크로오스, 1 mM의 UDP, 100 μM의 RebA, ~1.6 ㎍의 정제된 GST-AtSUS1 및 ~0.8 ㎍의 GST-EUGT11을 첨가하므로써 시험관 내에서 분석을 수행하였다. RebD 생성물의 형성은 LC-MS로 평가하였다. AtSUS, EUGT11, 수크로오스 및 UDP를 RebA와 혼합하였을 때, 81±5 μM의 RebD이 형성되었다. 반응은 AtSUS, EUGT11 및 수크로오스의 존재에 의존적이였다. 전환 속도는 외부적으로 제공된 UDP-글루코오스를 사용하여 이전에 관찰된 것과 유사하였다. 이것은 AtSUS가 EUGT11에 의한 RebD-형성을 위한 UDP-글루코오스를 재생하는데 사용될 수 있음을 보여준다 .
실시예 9 : RebD 의 전-세포 생촉매 생산
본 실시예에서, RebA 또는 다른 스테비올 글리코시드로부터 RebD의 생산에서 전-세포 생촉매 시스템을 이용하기 위한 요인들인 몇몇 매개변수들을 연구하였다. 세포막을 관통하는 원재료의 성능 및 UDP-글루코오스의 유효성이 이러한 두가지 요인들이다. 투과성 작용제 (permeabilizing agent) 뿐만 아니라 RebD 생산에 가장 도움을 줄 수 있는 시스템을 확인하기 위해 상이한 세포 유형에 대해서도 연구하였다.
투과성 작용제 ( permeabilizing agent )
몇가지 상이한 투과성 작용제 (permeabilizing agent)가 일반적으로 세포막을 통과할 수 없는 다양한 화합물의 세포 내 효소 전환을 가능케 하는 것으로 알려져 왔다 (Chow 및 Palecek, Biotechnol Prog . 2004 3-4월,20(2):449 -56). 몇가지 경우에서, 이러한 접근법은 세포의 부분적인 용해와 유사하고, 효모의 경우에서는 종종 세제에 의한 세포막의 제거 및 저분자로 투과할 수 있는 나머지 세포벽의 내부 효소의 캡슐화에 의존한다. 이들 방법에 공통점은 투과성 작용제에 노출시킨 뒤에 기질 첨가 전에 세포를 침전시키기 위한 원심분리 단계로 이어진다. 예를 들어, Flores et al .,Enzyme Microb . Technol .,16, pp. 340-346(1994); Presecki & Vasic-Racki,Biotechnology Letters, 27,pp.1835-1839(2005) 참조. Yu et al ., J Ind Microbiol Biotechnol, 34, 151-156(2007); Chow 및 Palecek, Cells . Biotechol. Prog .,20,pp.449-456 (2004); Fernandez et al.,Journal of Bacteriology, 152,pp.1255-1264 (1982); Kondo et al .,Enzyme and microbial technology,27, pp. 806-811(2000); Abraham and Bhat,J Ind Microbiol Biotechnol, 35, pp. 799-804(2008); Liu et al .,: Journal of bioscience and bioengineering,89,pp.554-558(2000); 및 Gietz and Schiestl, Nature Protocols, 2, pp. 31-34 (2007)는 효모에서의 투과가능성 고려함. Naglak and Wang,Biotechnology and Bioengineering, 39, pp. 732-740 (1991); Alakomi et al.,Applied and environmental Microbiology, 66, pp. 2001-2005(2000); 및 Fowler and Zabin, Journal of bacteriology, 92, pp. 353-357(1966)는 세균에서의 투과성 고려함. 본 실시예에서 기재한 바와 같이, 세포가 생존을 유지하고 따라서 새로이 UDP-글루코오스 생합성을 유지할 수 있는지를 측정하였다.
대장균 (E.coil) 및 효모에서 투과성에 대한 조건을 수립하기 위해 실험을 수행하였다. 상이한 농도/조합의 투과성 작용제; S. cerevisiae 투과용으로는 톨루엔, 클로로포름 및 에탄올을, 대장균 투과용으로는 구아니딘, 젖산, DMSO 및/또는 트리톤 X-100을 성장 세포 (S. cerevisiae 또는 대장균)에 처리하였다. RebA 및 다른 가능한 기질들의 고농도에 대한 둘 모두의 모델 유기체의 내성을 또한 평가하였다. 투과성은 배지 (원료공급 실험)을 함유하는 RebA에서 배양시킨 후 EUGT11-발현 유기체로부터 생성된 RebD의 양에 의해 측정하였다. 효소 활성은 세포 용균에 의해 투과성 작용제에 노출시킨 전후에 모니터링하였고, 시험관 내 분석에서 방출된 UGTs의 활성을 분석하였다.
효모에서, 시험한 어떠한 투과성 조건도 검출된 기본 이상의 RebD의 증가 (즉, 원료공급에 사용된 RebA 스톡에 오염 RebD 수준이 존재)를 가져오는 것은 없었다. 이것은 시험 조건 하에서 효모 세포는 RebA에 불투과성으로 남아있고/있거나 용매로 인해 야기된 감소된 세포 생존력이 EUGT11 활성의 감소를 야기한다는 것을 또한 나타내는 것이다.
대장균에서, 시험한 어떠한 조건도 세포의 투과성 및 이후의 기본 수준 이상의 RebD 생산을 가져오는 것은 없었다. RebD의 검출가능한 수준은 EUGT11을 발현시키는 균주로부터의 용균제를 시험관 내 반응에 사용하였을 때 측정하여 (데이터 비공지), EUGT11 효소가 모든 투과 처리 후에도 (활성 수준이 달라짐에도 불구하고) 존재하고 활성이 있는 것을 나타내었다. 심각하게 생존력을 감소시키는 0.2 M의 구아니딘 및 0.5% 트리톤-X 100을 갖는 배양물을 처리하는 것을 제외하고는, 투과 처리는 세포 생존에 영향을 아주 조금 주거나 또는 거의 주지 않았다.
S. cerevisiae는 또한 트리톤 X-100, N-라우릴 사르코신 (LS), 또는 리튬 아세테이트+폴리에틸렌 글리콜 (LiAc+PEG)를 이용하여 세포의 추가 성장을 허용하지 않는 투과 분석 실험에 이용되었다. 즉, 이러한 조건 하에서, 투과는 효소 및 gDNA가 내부에 유지되기 위한 벽으로서 세포벽이 남아있긴 하지만 세포막이 제거됨에 따라 세포가 생존할 수 없게 만든다. 이러한 방법에서, UDP-글루코오스가 상기 기재한 바와 같이 보충되거나 또는 같이 회수될 수 있다. 순수하게 시험관 내 접근방법에 대한 투과의 장점은 각각의 효소를 따로 생산하고 단리 할 필요가 없다는 것이다.
N-라우릴 사르코신을 처리하면 EUGT11가 불활성화되고, LiAc/PEG를 적용하였을 때 RebD에서 적은 증가만이 검출되었다 (데이터 비공지). 그러나, 트리톤 X-100 0.3% 또는 0.5%을 처리하면 EUGT11의 활성을 유지하면서 기본 수준 이상으로 RebD의 양을 증가시켰다 (도 18 참조). 트리톤 X-100 분석을 위해, 하룻밤 배양물을 PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 6 OD600 유닛에 상응하는 세포를 각각 0.3% 또는 0.5% 트리톤 X-100 함유 PBS로 재현탁하였다. 처리된 세포를 볼텍싱하고 (vortexed), 30℃에서 30분간 배양시켰다. 처리 후에, 세포를 PBS 완충액으로 세척하였다. GST-EUGT11에 대해 기술한 바와 같이, 5 OD600 유닛에 상응하는 세포를 시험관 내 분석에 사용하였고, 0.6 OD600 유닛은 반응 완충액에 재현탁시키고, LS 처리된 시료에 대해 기재한 바와 같이 30℃에서 하룻밤동안 배양시켰다. 미처리 시료는 대조군으로 사용하였다.
EUGT11를 발현시키는 형질전이체로부터의 용균제는 세포를 처리하지 않거나 또는 LiAC/PEG나 트리톤 X100으로 처리 한 후에 RebA 일부를 RebD (반응물에서 8 내지 50 μM이 측정됨)로 전환시킬 수 있었다. 그러나, LS로 처리된 세포 침전물의 용균제에서는 RebD가 측정되지 않았다. 투과가능하나 용해되지 않은 세포는 0.3% 또는 0.5%의 트리톤 X100으로 처리할 때 RebD 일부 (1.4 내지 1.5μM 측정됨)를 생성할 수 있는 반면(도 18), LS 또는 LiAC/PEG로 처리한 시료에서는 RebD가 확인되지 않았다. 이러한 결과는 RebD가 전-세포를 이용하고 투과성 작용제로 트리톤 X100을 이용하여 RebA로부터 생촉매적으로 생성될 수 있음을 보여준다.
실시예 10 - 코돈 최적화된 UGT 서열의 분석
UGT91d2e, 74G1, 76G1 및 85C2에 대한 최적의 코딩 서열은 진아트 (GeneArt)레겐스부르크, 독일) (서열 번호:6, 2, 8, 및 4, 각각) 또는 DNA 2.0 (멘로파크 (MenloPark), CA)(서열 번호:84, 83, 85, 및 82, 각각)에 의해 공급된 두 가지 방법을 이용하여 효모 발현을 위해 설계되고 합성되었다. UGT91d2e, 74G1, 76G1 및 85C2의 아미노산 서열 (서열 번호:5, 1, 7, 및 3, 각각)은 변경하지 않았다.
야생형, DNA 2.0 및 진아트 (GeneArt) 서열은 스테비올 글리코시드 경로에서 기질에 따른 반응성을 비교하기 위해 시험관 내 활성에 대해 분석하였다. UGTs는 많은 복사체체 (2μ) 벡터에 삽입되고 강한 구성 프로모터 (GPD1) (벡터 P423-GPD, P424-GPD, P425-GPD 및 P426-GPD)로부터 발현시켰다. 플라스미드는 (WO2011/153378의 실시예 3에 기재된) 범용 Watchmaker 균주, EFSC301로 개별적으로 형질변환시키고, 동일양의 세포로부터 제조된 세포 용해물 (8 OD 유닛)을 이용하여 분석을 수행하였다. 효소 반응에 대하여, 6 μL의 각 세포 용해물을 UGT74G1 및 UGT85C2 클론을 테스트하기 위해서는 0.25 mM의 스테비올 (최종 농도)와 함께 30 μL 반응물로 배양시켰고, 76G1 및 91D2e UGTs를 테스트하기 위해서는 0.25mM 13-SMG (13SMG) (최종 농도)와 함께 배양시켰다. 분석은 30℃에서 24시간 동안 실시하였다. LC -MS 분석 전에, 100 % DMSO의 1 볼륨을 각 반응액에 첨가하고, 시료를 16000g에서 원심분리하고, 상청액을 분석하였다.
진아트 (GeneArt)-최적화된 유전자 발현시키는 용해물은 시험조건 하에서 UGT 활성을 보다 높은 수준으로 제공하였다. 야생형 효소의 백분율로 표현된, 진아트 (GeneArt) 용해물은 UGT74G1에 대해 야생형과 동일한 활성, UGT76G1에 대해 170% 활성, UGT85C2에 대해 340%의 활성 및 UGT91D2e에 대해 130%의 활성을 보인다. S. cerevisiae에서 발현시킬 때, UGT85C2를 사용하면 Reb-A 및 Reb-D의 생산을 위한 세포의 전체적인 유동과 생산성을 향상시킬 수 있다.
코돈-최적화된 UGT85C2가 19-SMG 축적을 감소시키고 루부소시드 및 보다 많이 글리코실화된 스테비올 글리코시드 생산을 증가시킬 수 있는지에 대해 확인하기 위한 추가의 실험들을 실행하였다. 19-SMG 및 루부소시드의 생산은 야생형 UGT74G1를 발현시키는 S. cerevisiae 균주 BY4741 뿐만 아니라 강한 구성 프로모터 (GPD1) 하에서 많은 복사체 (2μ) 벡터 (벡터 P426-GPD 및 P423-GPD, 각각)로부터 코돈-최적화된 UGT85C2의 스테비올-공급 실험으로 분석하였다. (세포 제거없이) 전체 배양 샘플을 전체 글리코시드 수준과 동일 부피의 DMSO에 취하고 가열하였다. 보고된 세포 내 농축은 세포를 침전시키고, 취한 원 배양 샘플 부피에 대해 50% DMSO에 재현탁시킨 뒤, 가열함으로써 수득하였다. 이후 "전체" 글리코시드 수준 및 표준화된 세포 내 수준을 LC-MS를 사용하여 측정하였다. 야생형 UGT74G1 및 야생형 UGT85C2를 이용하여, 약 13.5 μM의 루부소시드가 약 7 μM의 최대 표준화된 세포 내 농도를 갖는 총합으로 생성되었다. 반대로, 야생형 UGT74G1 및 코돈-최적화된 UGT85C2를 사용할 때에는, 최대 26 μM의 루부소시드가 생성되었거나, 야생형 UGT85C2를 사용하여 생산된 것의 약 두 배가 생산되었다. 또한, 루부소시드의 최대 표준화된 세포 내 농도는 야생형 UGT85C2를 사용하여 생산한 것의 약 두 배로 13 μM였다. 19-SMG의 세포 내 농도는 야생형 UGT85C2를 사용한 최대 35 μM로부터 코돈-최적화된 UGT85C2를 사용한 19 μM로 크게 감소하였다. 결과적으로, 코돈-최적화된 UGT85C2로는 약 10 μM 미만의 전체 19-SMG가 측정되었다. 이것은 더 많은 19-SMG가 루부소시드로 전환하는 것을 나타내고, 야생형 UGT85C2가 장애물임을 확신하게 한다.
다양성 스크리닝을 하는 과정에서, UGT85C2의 또 다른 동족체를 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) DNA를 클로닝하는 동안 발견하였다. 동족체는 다음의 보존된 아미노산 다형성의 조합을 가지고 있다 (수탁 번호:AY345978.1에 제시된 야생형 S. rebaudiana UGT85C 코딩 서열의 아미노산 번호와 관계된) : A65S, E71Q, T270M, Q289H, 및 A389V. UGT85C2 D37라 명명된 클론은 PCR 제품 (PCR DNA 키트 용 TNT®T7 Quick, 프로메가)의 시험 관내 전사-해독의 결합을 통해 발현시켰다. 발현 산물은 분석을 24시간 동안 배양시킨다는 것을 제외하고는 WO/2011/153378에 기재된 바와 같이, 수크로오스 수용체로서 스테비올 (0.5 mM)를 사용하여 글리코실화 활성에 대해 분석하였다. 야생형 UGT85C2 대조군 분석과 비교하여, D37 효소는 약 30 % 높은 글리코실화 활성을 갖는 것으로 보인다.
실시예 11 - 새로운 S. rebaudiana KAH 의 식별
부분 서열 (GenBank 수탁 번호 BG521726)은 스테비아 (Stevia ) KAH와 일부 동종성을 갖는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) EST 데이터 베이스에서 확인되었다. 부분 서열은 CLC 주요 워크벤치 (workbench) 소프트웨어를 사용하여 미가공 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana ) 피로시퀀싱 판독 (pyrosequencing reads)에 대해 블라스트하였다. 부분 서열의 말단과 부분적으로 중첩된 판독이 식별되고, 부분 서열의 길이를 증가시키는데 사용되었다. 이것은 서열이 개시- 및 종결 코돈 모두에 포함될 때까지 여러번 이루어졌다. 미가공 피로시퀀싱 판독에 대한 완전한 서열을 블라스팅 (blasting)시킴으로써 도입될 수 있는 틀이동 돌연변이 (frameshift mutation) 및 뉴클레오티드 치환에 대해 완전한 서열을 분석하였다. 생성된 서열은 SrKAHe1로 지정하였다. 도 12 참조.
SrKAHe1로 인코드된 KAH의 활성은 엔트-카우레논산을 스테비올로 전환시키는 스테비올 합성효소를 제외하고는, 효모 2차 대사산물 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 및 파르네실 피로포스페이트 (FPP)로부터 스테비올-19-O-모노시드로의 전체 생합성 경로를 구성하는 효소를 인코드하는 유전자를 발현시키는, S. cerevisiae 기본 균주 CEN.PK 111-61A로 생체 내에서 측정하였다.
간략하게는, S. cerevisiae 균주 CEN.PK 111-61A는 염색체상에서 통합된 유전자 복사체들로부터 아스퍼질러스 니둘란스 ( Aspergillus nidulans ) GGPPS, 150nt 절두된 지아 메이즈 (Zea mays ) CDPS (새로운 개시 코돈을 가짐. 하기 참조), 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana ) KS, 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana) KO 및 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana ) UGT74G1를 발현시키기 위해 TPI1 및 GPD1 효모 프로모터 구동 전사로 변형시켰다. 이들 유전자 모두를 발현시키는 CEN.PK 111-61A 효모 균주는 EFSC2386로 지정하였다. 따라서, 균주 EFSC2386은 다음의 통합된 유전자를 포함한다: 아스퍼질러스 니둘란스 ( Aspergillus nidulans ) 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (GGPPS); 지아 메이즈 (Zea mays ) 엔트-코파릴 디포스페이트 합성효소 (CDPS); 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana ) 엔트-카우렌 합성효소 (KS), 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana ) 엔트-카우렌 산화 효소 (KO) 및 스테비아 레바우디아나 (S. rebaudiana ) UGT74G1; 스테비올 합성효소 (KAH)없이 IPP 및 FPP로부터 스테비올-19-O-모노시드로의 경로와 함께 사용.
(에피좀 발현 플라스미드로부터) 상이한 스테비올 합성효소의 발현은 다양한 CPRs의 발현과 함께 균주 EFSC2386을 조합하여 시험하였고, 스테비올-19-O-모노시드의 생산은 배양 샘플 추출물을 LC-MS 분석하여 검출하였다. CRPs를 인코드하는 핵산은 p426 GPD 기본 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입시키는 반면, 스테비올 합성효소를 인코드하는 핵산은 p415 TEF 기본 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입시켰다 (문베르크 등 (Munberg et al.)의 p4XX 기본 플라스미드 시리즈. Gene 156(1995), 119-122). 기능성 스테비올 합성 효소가 존재할 때, 스테비올-19-O-모노시드의 생산이 발생한다.
균주 EFSC2386에서 에피좀 발현 플라스미드로부터 발현되는 KAHs는 "indKAH " (쿠마르 등 (Kumar et al.), 수탁번호 DQ398871; 리자 등 (Reeja et al.), 수탁 번호 EU722415); "KAH1" (브랜들 등 (Brandle et al.)의 S. rebaudiana 스테비올 합성효소, 미국 특허 공개번호 제2008/0064063 A1); " KAH3 " (야마구치 등 (Yamaguchi et al.)의 A. thaliana 스테비올 합성효소, 미국 특허 공개번호 제2008/0271205 A1); " SrKAHe1 " (상기 기재한 바와 같은 S. rebaudiana cDNA로부터 클론된 S. rebaudiana 스테비올 합성효소); 및 "DNA2.0.SrKAHe1" (S. rebaudiana 스테비올 합성효소를 인코드하는 코돈 최적화된 서열 (DNA2.0) 도 12b 참조)이다.
균주 EFSC2386에서 에피좀 발현 플라스미드로부터 발현된 CPRs은 "CPR1" (S. rebaudiana NADPH 의존성 시토크롬 P450 환원효소 (쿠마르 등,. 수탁 번호 DQ269454); "ATR1" (A. thaliana CPR, 수탁 번호 CAA23011, 도 13 참조); "ATR2" (A. thaliana CPR, 수탁 번호 CAA46815, 도 13 참조); "CPR7" (S. rebaudiana CPR, 도 13 참조. CPR7은 "CPR1"과 유사함 ); "CPR8" (S. rebaudiana CPR, 아르테미시아 안누아 (Artemisia annua) CPR과 유사함. 도 13 참조) 및 "CPR4"(S. cerevisiae NCP1 (수탁 번호 YHR042W), 도 13 참조)이다.
표 13은 스테비올 합성효소 및 CPRs의 다양한 조합으로 인한 균주 EFSC2386에서의 스테비올-19-O-모노시드의 수준 (μM)을 제공한다.
표 13
19- SMG 생성물
Figure 112014022593516-pct00033
오직 KAH3 및 SrKAHe1로 인코드된 스테비올 합성효소만이 사카로마이세스 세레비시에 (S. cerevisiae)에서 발현되었을 때 활성을 가졌다. 스테비올 합성효소를 인코드하는 DNA2.0. 스테비올 합성효소를 인코드하는 코돈 최적화된 SrKAHe1서열은, 이들 각각이 최적 CPRs와 공동 발현되었을때, 코돈 최적화된 KAH3와 비교하여 상당히 높은 대략 1자리수 만큼의 스테비올-19-O-모노시드 축적 수준을 가져왔다. 본 실시예에 제시한 실험에서, KAH1 및 ATR2 CPR의 조합은 스테비올-19-O-모노시드의 생성을 초래하지 않았다.
실시예 12 - CPRS 및 KO 의 페어링 ( pairing )
본 실시예에서 언급한 CEN.PK S. cerevisiae EFSC2386 균주 및 CPRs는 실시예 11에 설명되어 있다 ("S. rebaudiana KAH의 식별"). EFSC2386은 다음의 통합된 유전자를 포함한다: 아스퍼질러스 니둘란스 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성효소 (GGPPS); 지아 메이즈 엔트-코파릴 디포스페이트 합성효소 (CDPS); 스테비아 레바우디아나 엔트-카우렌 합성효소 (KS), 및 스테비아 레바우디아나 엔트-카우렌 산화 효소 (KO). 이 균주는 LC-MS 분석에 의해 검출 가능한 엔트-카우레논산을 생성한다.
시토크롬 P450 환원효소 (CPRs)의 집단을 발현시키고, 균주 EFSC2386에서 시험하였다; "CPR1" (S. rebaudiana NADPH 의존성 시토크롬 P450 환원효소, 쿠마르 등,. 수탁 번호 DQ269454); "ATR1" (A. thaliana CPR, 수탁 번호 CAA23011); "ATR2 "(A. thaliana CPR, 수탁 번호 CAA46815)"; "CPR7" (S. rebaudiana CPR, CPR7은 "CPR1"과 유사함 ); "CPR8" (S. rebaudiana CPR, 아르테미시아 안누아 CPR과 유사함) 및 "CPR4"(S. cerevisiae NCP1 (수탁 번호 YHR042W).
S. cerevisiae의 내인성 천연 CPR (표 14에서 CPR4로 언급)의 과발현, 및 특히 A. thaliana CPRs 중 하나, 즉 ATR2의 과발현은 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana) 카우렌 산화효소 (표 14에서 기호 KO1으로 명명)의 바람직한 활성을 제공하고, 엔트-카우레논산의 증가된 축적을 가져온다. 표 14를 보면, 이것은 LC-MS 크로마토그램에서 엔트-카우레논산 피크의 곡선 아래 면적 (area under curve, AUC)를 나타낸다. KO1은 CPRs의 추가적인 과발현이 없는 엔트-카우레논산 생성 효모 대조 균주이다.
표 14
KO -1과 상이한 시토크롬 P450 환원 효소의 효과
Figure 112014022593516-pct00034
실시예 13 - 스테비올 경로에서 KS -5 및 KS -1의 평가
효모 균주 EFSC1972는 IPP/FPP로부터 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) GGPPS (내부 이름 GGPPS-10), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana) KS (KS1, 서열 번호:133), 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) KAH (KAH-3, 서열 번호:144), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana) KO (KO1, 서열 번호:138), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana) CPR (CPR-1, 서열 번호:147), 전체길이의 지아 메이즈 (Zea mays ) CDPS (CDPS-5, 서열 번호:158), 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) UGT74G1 (서열 번호:1) 및 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) UGT85C2 (서열 번호:3)을 인코드하는 통합된 유전자 복사체들에 의해 발현된 루부소시드로의 생합성 경로를 가지는 CEN.PK 111-61A S. cerevisiae 균주이다. 또한, EFSC1972은 내인성 프로모터를 구리 유도성 프로모터 CUP1로 치환함으로써 ERG9 유전자의 발현이 하향 조절되게 한다.
EFSC1972이 TEF1 프로모터로부터 스테비아 레바우디아나 SrKAHe1을 발현시키는 CEN/ARS-기반 플라스미드로 형질변환되고, 동시에 시네초코코서 종 (Cynechococcus spp) GGPPS (GGPPS-7) 및 GPD 프로모터로부터의 지아 메이즈 (Zea mays) CDPS의 절두된 유형 (절두된 CDPS-5)를 발현시키는 2μ-기반 플라스미드로 형질변화된 경우, 루부소시드 (및 19-SMG)의 성장-손상된 S. cerevisiae 생산자가 초래된다. 이 균주는 하기 문헌에서 "강화된 (enhanced) EFSC1972"로 언급한다. 느린 성장 속도가 유독성 경로 중간물질 엔트-코파릴 디포스페이트의 축적으로 인해 야기되는 것인지 확인하기 위해서, 카우렌 합성효소 (KS) 유전자의 집단을 "강화된 EFSC1972" 균주에서 발현시켰고, 그 뒤 성장 및 스테비올 글리코시드 생성물을 평가하였다.
A. thaliana KS (KS5)의 발현은 "강화된 EFSC1972" 균주의 향상된 성장 및 스테비올 글리코시드 생산을 가져온다. 도 16 참조. 강화된 EFSC1972에서 스테비아 레바우디아나 카우렌 합성효소 (KS-1)를 추가적으로 과발현시키는 것으로는 성장동안 동일한 긍적적 효과를 달성할 수 없었다 (데이터 미공지).
실시예 14 - 효모 균주 EFSC1859
사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주 EFSC1859는 게놈에 통합되고 강한 구성 GPD1 및 TPI 프로모터로부터 발현된 GGPPS-10, CDPS-5, KS-1, KO-1, KAH-3, CPR-1 및 UGT74G1 코딩 서열을 포함한다. 표 15 참조. 또한, 효모 ERG9 유전자의 내인성 프로모터는 ERG9 스쿠알렌 합성효소의 하향 조절을 위해 구리 유도성 프로모터 CUP1로 대체되었다. 표준 효모 성장 배지에서, 구리농도가 상기 배지에서 낮기 때문에 ERG9 유전자는 매우 낮은 수준으로 전사된다. 이 균주에서 에르고스테롤 생산이 감소하면 이소프레노이드 생합성에 이용가능한 이소프렌 유닛의 양이 증가하게 된다. 또한, 균주 EFSC1859도 GPD1 프로모터를 사용하여 2마이크론의 다중복제 벡터로부터 UGT85C2를 발현시킨다. EFSC1859는 루부소시드 및 스테비올 19-O-글리코시드를 생산한다.
지아 메이즈 (Zea mays ) CDPS DNA는 엽록체 신호 펩타이드와 함께 또는 없이 GPD 프로모터를 사용하여 2마이크론의 다중 복제 플라스미드로부터 발현되었다. 지아 메이즈 CDPS의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 도 14에 제시한다. 엽록체 신호 펩티드는 1-150개의 뉴클레오타이드에 의해 인코드되고, 아미노산 서열의 잔기 1 내지 50에 대응한다.
표 15
Figure 112014022593516-pct00035
EFSC1859 + 옥수수 전장 (full-length) CDPS 플라스미드, 및 EFSC + 옥수수 절두된 CDPS 플라스미드를 4 % 글루코오스와 함께 선택적 효모 배지에서 성장시켰다. 루부소시드 및 19-SMG 생산은 생산 수준을 추정하기 위하여 LC-MS로 측정하였다. 색소체 리더 서열의 제거는 야생형 서열과 비교하여 스테비올 글리코시드의 생산을 증가되는 것으로 나타나지 않았고, 이것은 CDPS 수송 펩티드가 스테비올 글리코시드 생합성의 손실을 초래하지 않고 제거될 수 있음을 나타낸다.
실시예 15 - 효모 균주 EFSC1923
사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)균주 CEN.PK 111- 61A는 다양한 유기체로부터 스테비올 글리코시드 경로 효소의 도입에 의한 스테비올 글리코시드를 생산하기 위해 변형되었다. 변형 균주는 EFSC1923로 지정되었다.
균주 EFSC1923는 S. cerevisiae PRP5-YBR238C 유전자간 영역 (intergenic region) 내에 아스퍼질러스 니둘란스 GGPP 합성효소 유전자 발현 카세트, MPT5- YGL176C 유전자간 영역 내에 지아 메이즈 전장 CDPS 및 스테비아 레바우디아나 CPR 유전자 발현 카세트, ECM3-YOR093C 유전자간 영역 내에 스테비아 레바우디아나 카우렌 합성효소 및 CDPS-1 유전자 발현 카세트, KIN1-INO2 유전자간 영역 내에 아라비도프시스 탈리아나 KAH 및 스테비아 레바우디아나 KO 유전자 발현 카세트, MGA1-YGR250C 유전자간 영역 내에 스테비아 레바우디아나 UGT74G1 유전자 발현 카세트 및 TRP1 유전자 ORF을 대체함으로써 통합된 스테비아 레바우디아나 UGT85C2 유전자 발현 카세트를 포함한다. 표 15 참조. 또한, 효모 ERG9 유전자의 내인성 프로모터는 구리 유도성 프로모터 CUP1로 대체하였다.
균주 EFSC1923은 4% 글루코오스 함유 선택적 효모 배지에서 약 5μM의 스테비올 글리코시드, 스테비올 19-O-모노시드를 생산하였다.
실시예 16 - 효모 균주 EFSC1923 에서 절두된 옥수수 CDPS 의 발현
표 15에 나타낸 지아 메이즈 (Zea mays ) CDP 합성효소 코딩 서열 (서열 번호:157, 도 14 참조)의 5' 말단에서 150개 뉴클레오티드를 삭제하고, 남아있는 코딩 서열을 새로운 해독 개시 ATG에 제공하고, 절두된 서열은 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)) EFSC1923 내의 다중복사체체 플라스미드 p423GPD의 GPD1 프로모터와 작동 가능하게 연결시켰다. 플라스미드 p423GPD는 문베르크, D 등.(Mumberg D et al.), Gene, 156:119-122(1995)에 기재되어 있다. EFSC1923 및 EFSC1923 + p423GPD-Z.m.tCDPS는 4 %의 글루코오스를 함유하는 선택적 효모 배지에서 96 시간 동안 성장시켰다. 이러한 조건하에서 EFSC1923 + p423GPD-Z.m.tCDPS (절두된 지아 메이즈 CDPS)에 의해 생성된 스테비올 19-O-모노시드의 양은 플라스미드 없이 EFSC1923에 의해 생성된 것보다 약 2.5배 더 많았다.
표 15로부터의 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ) KAH 코딩 서열은 GPD1 프로모터의 제어하에, 다중 복제 플리스미드 설계된 p426GPD에 삽입되었다. 플라스미드 p426GPD는 뭄베르크, D 등., Gene, 156:119-122(1995)에 기재되어 있다. EFSC1923 +p426GPD-A.t.KAH, 및 플라스미드가 결여된 EFSC1923에 의해 생성된 스테비올 19-0-모노시드의 양 사이에 큰 차이는 관찰되지 않았다.
EFSC1923는 p423GPD- Z.m.tCDPS 및 p426 p426GPD-A.t.KAH 모두로 형질변환되었다. 놀랍게도, 두 플라스미드 (즉, 절두된 지아 메이즈 CDPS 및 아라비도프시스 KAH)를 포함하는 EFSC1923에 의해 이러한 조건에서 생산된 스테비올 19-O-모노시드의 양은 EFSC1923 단독으로 생산된 양보다 6배 이상 더 많았다.
기베렐라 푸지쿠로이 (Gibberella fujikuroi)로부터의 이중기능성 CDPS-KS (NCBI 수탁 번호:Q9UVY5.1, 도 15)을 복제하고, 절두된 CDPS-5와 비교하였다. 이중기능성 기베렐라 CDPS-KS는 GPD 프로모터로 2μ의 플라스미드에서 복제되었고, GPD 프로모터로부터의 기반-플라스미드 2μ로부터 아라비도프시스 탈리아나 KAH-3을 EFSC1923에서 발현시키는 플라스미드로 형질변환시켰다. 쉐이크 플라스크 (shake flask) 연구에서, 상기 이중기능성 CDPS-KS는 KAH-3 단독으로 한 균주 EFSC1923 보다 스테비올 19-O-모노시드 생산에서 약 5.8배 더 활성이 있었다. 그러나, 시험 조건 하에서 KAH-3 및 절두된 CDPS 조합보다 덜 최적인것으로 밝혀졌다. 따라서, KS-5 및 절두된 CDPS로 추가 균주를 구성하였다.
실시예 17 - 중간물질의 독성
게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP), 엔트-코파릴 디포스페이트 (CDP) 또는 엔트-카우렌 생성물이 S. cerevisiae의 활력에 미치는 영향은 실험실용 S. cerevisiae 균주 CEN.PK 조건에서 시네초코코스 종 (Cynechococcus spp) GGPPS 단독 (GGPP 생산), GGPPS와 50 아미노산 N-말단 절두된 지아 메이즈 (Zea mays) CDPS (실시예 16) 함께 (CDP 생산), 또는 GGPPS, 절두된 CDPS 및 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 카우렌 합성효소 (KS5) 함께 (엔트-카우렌 생산) 발현시킴으로써 조사하였다. 유전자는 절두된 CDPS 및 KS5의 전사를 추진하는 GPD 프로모터로 2 μ의 플라스미드로부터 발현시킨 반면, GGPPS의 전사는 ADH1 프로모터로 진행하였다. 이들 플라스미드들의 다양한 조합 (GGPPS 단독; GGPPS+절두된 CDPS; 또는 GGPPS+절두된 CDPS+KS5) 또는 유전자 삽입 없는 플라스미드로 형질변환된 S. cerevisiae의 성장을 관찰하였다. GGPP 생산, 특히 CDP 생산은 최종 생성물로서 생산될 때 S. cerevisiae에 독성이 있었다. 흥미로운 것은, 엔트-카우렌은 본 실시예에서 생산된 양에서 효모에 독성을 나타내지 않았다.
실시예 18 - 내인성 인산가수분해효소 ( phosphatase ) 활성의 저해
효모 유전자 DPP1 및 LPP1은 FPP 및 GGPP를 각각 파르네솔 및 게라닐게라니올로 분해할 수 있는 인산가수분해효소 (phosphatase)를 인코드한다. DPP1을 인코드하는 유전자가 스테비올 글리코시드 생산에 효과가 있는지를 결정하기 위해, DPP1을 인코드하는 유전자를 균주 EFSC1923에서 삭제하였다 (실시예 15에 기재). 이러한 dpp1 돌연변이 균주는 엽록체 수송 서열이 결여된 Z. mays CDPS (실시예 16)를 발현시키는 플라스미드로 추가로 형질변환되고, 크고 작은 형질전환체들이 생성되었다. "큰 콜로니(colony)" 유형의 균주는 "작은 콜로니" 유형 및 비삭제된 DPP1 균주에 비해 시험 조건하에서 40% 더 많은 19-SMG를 생산하였다. 이러한 결과는 DPP1의 삭제가 스테비올 글리코시드 생산에 긍정적인 효과를 가질 수 있고, 그에따라 효모에서 프레닐 피로포스페이트의 분해가 스테비올 글리코시드 생산에 부정적으로 영향을 줄 수 있음을 나타낸다.
실시예 19 - 저해된 SUC2 유전자를 이용하여 글루코오스로부터 바닐린 글루코시드를 생산하는 유전적으로 안정한 효모 리포터 균주의 작제
글루코오스로부터 바닐린 글루코시드를 생산하는 효모 균주는 브로카도 등 (Brochado et al.) ((2010) Microbial Cell Factories 9:84-98)이 기재한 바와 같이 기본적으로 만들었지만, 효모 TPI1 프로모터에 의해 조절된 대장균 EntD PPTase를 발현 카세트의 효모 게놈에서 ECM3 내부 유전자좌 (locus) 영역에서 추가 통합 (하센 등 (Hansen et al.,(2009) Appl. Environ. Microbiol. 75(9):2765 - 2774에 기재됨)되고, 코딩 서열을 MET15 발현 카세트로 교체시킴으로써 SUC2가 저해되고, 코딩 서열을 프레오마이신에 저항성을 부여하는 Tn5ble 발현 카세트로 교체함으로써 LEU2가 저해되었다는 차이가 있다 (균주 VG4). 생성된 효모 균주는 V28라 명명했다. 이 균주는 또한 도 19에 제시한 아미노산 서열 (서열 번호:178)을 함유하는 재조합 A. thaliana UDP-글리코실 전이효소 (UGT72E2, Genbank 수탁 번호: Q9LVR1)을 인코드한다.
실시예 20 - 바닐린 글루코시드를 이미 생합성한 효모에서 수크로오스 수송체 및 수크로오스 합성효소의 발현
아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana )로부터의 수크로오스 수송체 SUC1는 프루브-리딩 (proof reading) PCR 중합효소를 사용하여, A. thaliana로부터 제조한 cDNA로부터 PCR 증폭하여 단리하였다. 생성된 PCR 단편은 SpeI 및 EcoRI로 제한 효소 분해시켜 전달시키고, 강한 TEF 프로모터로부터 발현 될 수 있는 유전자로부터 적은 수의 대응하는 복사체 효모 발현 벡터 p416-TEF (CEN-ARS 기반 벡터)에 삽입시켰다. 생성된 플라스미드는 pVAN192라 명명하였다. 인코딩된 수크로오스 수송체의 서열은 도 19b에 제시한다 (진뱅크 수탁 번호 AEE35247, 서열 번호:179).
코페아 아라비카 (Coffea arabica )로부터의 수크로오스 합성효소 SUS1 (수탁 번호 CAJ32596)은 프루프 리딩 PCR 중합효소를 사용하여 C. arabica로부터 제조된 cDNA로부터 PCR 증폭에 의해 단리하였다. PCR 단편은 SpeI 및 SalI로 제한 효소 분해시켜 전달시키고, 강한 GPD 프로모터로부터 발현될 수 있는 유전자로부터 많은 수의 효모 발현 벡터 p425-TEF (2 μM 기반 벡터)로 상응하는 부위에 삽입시켰다. 생성된 플라스미드는 pMUS55라 명명하였다. 인코딩된 수크로오스 합성효소의 서열은 도 19c에 제시한다 (GenBank 수탁 번호 CAJ32596, 서열 번호:180).
pVAN192 및 pMUS55는 리튬 아세테이트 형질 변환 프로토콜을 이용하여 유전적 형질변환에 의해 효모 균주 V28에 도입시켜, 효모 균주 V28::pVAN192::pMUS55를 생성하였다. 대조 균주는 빈 플라스미드 p146-TEF 및 P425-GPD로 V28를 형질변환시켜 만들었다.
이들 두 가지 효모 균주를 2% 글루코오스와 2% 수크로오스를 보강하고 pH 5.0으로 조정한 방향족 아미노산 비함유 SC (합성 완료) 성장 배지를 이용하여, 500 ㎖의 삼각 플라스크에서 200 ㎖ 배양물로 성장시켰다. 배지는 30℃에서 72 시간 동안, 적당한 회전 (150 rpm)하에 배양시켰다. 샘플을 72 시간에서 취하고, 바닐린 글루코시드의 함량을 측정하였다. 하기 표에서 알 수 있는 바와 같이, (빈 플라스미드 p416-TEF 및 p425-GPD를 함유하는) 대조 균주에서 VG 생산량은 330 ㎎/L 의 VG인 반면, 수크로오스 합성효소 및 수크로오스 수송체를 발현하는 효모 균주 V28::pVAN192::pMUS55는 VG 생산에서 34.8% 증가에 해당하는 445㎎/L의 VG를 생산하였다.
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이것은 글루코실 전이효소와 함께 수크로오스 합성효소 및 수크로오스 수송체를 공동 발현시키면 저분자 아글리콘을 글리코실화시킬 수 있는 능력이 증가되고, 글리코실화된 아글리콘의 농도가 현저하게 증가하였음을 나타낸다. 이러한 경우, 바닐린 글루코실화가 상당히 향상될 수 있어 최종 산물인 바닐린-O-β-글루코시드의 역가가 상당히 증가하는 결과를 나타내었다.
실시예 21 - 개선된 스테비올 글리코시드 생산 균주
사카로마이세스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae ) EFSC2763 의 균주 작제
EFSC2763 효모 균주는 3가지 영양요구 변경, 즉 URA3, LEU2 및 HIS3의 결손을 포함하는 야생형 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)) 균주로부터 유도된다. 균주의 게놈은 안정화되어 있어, 일반적인 이배체 (diploid) 또는 반수체 (haploid) 효모 균주로서 사용될 수 있다. EFSC2763은 4개의 DNA 구조체의 게놈 통합에 의해 스테비올 글리코시드 생산 균주로 변환될 수 있다. 각 구조체는 동종 재조합으로 효모 게놈에 도입된 다수의 유전자를 포함한다. 또한, 제 1 및 2 구조체는 동종 재조합에 의해 합쳐졌다.
제 1 구조체는 유전자 8개를 포함하고, DPP1 유전자좌에 삽입되어 DPP1를 저해하거나 부분적으로 삭제한다 (실시예 18 참조). 삽입된 DNA는 다음을 포함한다: NatMX 유전자 (선택 마커)를 발현시키고 뒤이어 A. gossypii로부터의 TEF 종결제(terminator)가 따르는 A. gossypii TEF 프로모터; 천연 효모 GPD1 프로모터로부터 발현되고 천연 천연 효모 CYC1 종결제가 따르는 진아트 (GeneArt) 코돈 최적화된 S. rebaudiana UGT85C2 (실시예 10 참조); TDH1 프로모터를 이용하여 발현되고 천연 효모 TPI1 종결제가 따르는 S. rebaudiana CPR-8 (도 13 참조); PDC1 프로모터로부터 발현되고 천연 효모 FBA1 종결제가 따르는 A. tnaliana 카우렌 합성효소 (KS-5, 실시예 13, 서열 번호:156 참조); TEF2 프로모터를 이용하여 발현되고 천연 효모 PFI1 종결제가 따르는 시네초코코스 종 (Cynechococcus spp .) GGPPS (GGPPS-7); TEF1 프로모터로부터 발현되고 ENO2 종결제가 따르는 DNA2.0 코돈 최적화된 S. rebaudiana KAHe1 (실시예 11, 서열 번호:165 참조); FBA1 프로모터를 이용하여 발현되고 천연 효모 TDH2 종결제가 뒤이어 따르는 S. rebaudiana KO-1; 및 PGK1 프로모터를 이용하여 발현되고 뒤이어 천연 효모 ADH2 종결제가 따르는 지아 메이즈 (Zea mays ) 절두된 CDPS (실시예 14 참조).
제 2 구조체는 YPRCΔ15 유전자좌에 삽입되었고, 다음을 포함한다: KanMX 유전자 (선택 마커)를 먼저 발현시키고 뒤이어 A. gossypii로부터의 TEF 종결제가 따르는 A. gossypii으로부터의 천연 효모 TEF 프로모터; PGK1 프로모터로부터 발현되고 뒤이어 효모 ADH2 종결제가 따르는 진아트 (GeneArt) 코돈 최적화돈 A. thaliana ATR2 (도 13 ba 내지 be 참조); TPI1 프로모터로부터 발현되고 뒤이어 효모 TDH1 종결제가 따르는 S. rebaudiana UGT74G1; TEF1 프로모터로부터 발현되고 뒤이어 효모 ENO2 종결제가 따르는 진아트 (GeneArt) 코돈 최적화된 S. rebaudiana UGT76G1; GPD1 프로모터로부터 발현되고 뒤이어 효모 CYC1 종결제가 따르는 S. rebaudiana UGT91D2e-b (예 : 6 참조).
제 1 및 제 2 구조물은 정합 (mating) 및 분화 (dissection)에 의해 동일한 포자 클론으로 결합되었다. 이 효모 균주는 이후 두가지 후속 실험에서 제 3 및 제 4 구조체로 형질변환되었다.
제 3 구조체는 유전자 PRP5 및 YBR238C 사이에 통합되었고, 다음을 포함하였다: K. lactis LEU2 유전자를 발현시키고 뒤이어 A. gossypii으로부터의 TEF 종결제가 따르는 A. gossypii으로부터의 TEF 프로모터, DNA2.0 최적화된 S. rebaudiana KAHe1를 발현시키고 뒤이어 CYC1 종결제가 따르는 GPD1 프로모터, 및 지아 메이즈 (Zea mays ) 절두된 CDPS를 발현시키는 TPI1 프로모터. 제 4 구조체는 유전자 ECM3 과 YOR093C 사이의 게놈에 통합되었고, 다음을 포함하는 발현 카세트가 통합되었다: K. pneumooniae hph 유전자를 발현시키고 뒤이어 A. gossypii으로부터의 TEF 종결제가 따르는 A. gossypii으로부터의 TEF 프로모터, GPD1 프로모터로부터 발현되고 뒤이어 CYC1 종결제가 따르는 시네초코코스 종 (Cynechococcus spp .) GGPPS, 및 A. thaliana 카우렌 합성효소를 발현시키는 TPI1 프로모터. 사용된 4가지 유전 마커들은 이후 제거되었다.
세포 및 배양액에서 총 스테비올 글리코시드의 DMSO 추출에 이어 LC- MS 분석에서 나타내듯이, EFSC2772는 3 ㎖의 SC (합성 완료) 배지에서 30℃로 딥-웰 플레이트에서 320 RMP 혼합하면서 4일 동안 성장시킨 후, 40-50 μM 또는 2-3 μM/OD600 레바우디오시드 A를 생산한다.
사카로마이세스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae) EFSC2772 의 균주 작제
EFSC2772는 유전자 마커를 제거하지 않은 것을 제외하고는 균주 2763과 매우 유사하며, 형질변환시킨 두개의 플라스미드 p413TEF (HIS3 마커 함유한 공개 도메인 CEN/ARS 셔틀 플라스미드)와 p416-TEF (URA3 마커 함유한 공개 도메인 CEN/ARS 셔틀 플라스미드)의 도입으로 자가영양체로 만들었고, EFSC2772라 지정하였다.
세포 및 배양액으로부터 총 스테비올 글리코시드의 DMSO 추출에 이어 LC- MS 분석에서 나타나듯이, EFSC2772는 딥-웰 플레이트에서 성장한 후 2763과 유사한 수준의 레바우디오시드 A를 생산한다. 기본 배지 (합성 완성 배지)에서 16시간 가량 성장상태로 배양시키고, 뒤이어 탄소원으로 유용한 글루코오스 및 미량 금속, 비타민, 염, 효모 질산 염기 (YNB) 및/또는 아미노산 공급원이 결합된 에너지 공급원을 100시간 가량 공급하면서 2L (반응 부피) 발효조에서 호기성 유가배양 (fed-batch)을 시킴으로써 높은 광학 밀도와 높은 역가를 얻게 되었다. pH를 5 부근에 유지시키고, 설정 온도는 30℃였다. LC-MS로 입증한 바와 같이, 결합된 세포 및 세포외 생성물 농도는 두 가지 상이한 실험에서 920 내지 1600 ㎎/L 사이의 Reb-A, 및 약 300-320 ㎎/L의 Reb-D이였고, 보다 높은 역가 결과물을 수득할 때 배양액에서 약 700 ㎎/L의 Reb-A를 검출하였다. 또한 큰 피크는 Reb-B에서 나타났고, 당업자는 UGT74G1의 추가 복사체들이나 UGT74G1의 상향조절 (upregulation)이 RevB의 RebA로의 전환을 더욱 증가시킬 것이라는 것을 인지할 것이다.
균주 EFSC2743은 독립영양성 (prototrophy)을 부여하는 두개의 플라스미드는 없고, TEF 프로모터로부터 EUGT11를 발현시키는 p416 (CEN/ARS)-기반 플라스미드를 첨가한다를 것을 제외하고는, 상기와 유사한 방식으로 제작하였다. 이 균주는 상기와 같이 유가식 발효조에서 성장시켰다. 이 균주는 총 920 ㎎/L의 RebD 양을 생산하였고, 또한 약 9:1의 RebA 대 RebD의 비율을 보였다. 약 360㎎/L의 RebD가 배양액에서 발견되었다.
실시예 22 - UDP -글루코오스 용량
실시예 21에서, 효모가 1mM의 스테비올, 예를 들어 RebD, RebB, 및 RebA를 완전히 글리코실화할 수 있음을 보였다. 유사하게, 사카로마이세스 균주는 60 mM 만큼의 다른 저분자 생산물 만큼을 글시코실화할 수 있다 (데이터 미공지). 그러나, 천연 효모 UDP-글루코오스 재생 시스템의 글리코실화의 한계점은 알려지지 않거나, 또는 UDP-글루코오스 풀 (pool)을 재보충하는 비율은 세포벽 합성을 위해 필요했다. 따라서, UDP-글루코오스 생산이 증가하면 효모에서 글리코실화 속도가 증가될 수 있는지를 조사하기 위해 실험을 설계하였다. suc2 결손 돌연변이체는 수크로오스 수송체, UGT74G1 및 A. thaliana SUS를 인코드하는 A. thaliana suc1 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질변환시켰다. UGT74G1는 스테비올을 스테비올 19-O-모노글리코시드 (19-SMG)로 빠르게 글리코실화시킬 수 있다. 형질변이체는 류신, 히스티딘 및 우라실이 결핍된 SC 배지 4 ㎖를 함유하는 13 ㎖의 배양관에서 하룻밤동안 예비성장시켰다. 다음 날, 2 OD600 유닛에 상응하는 세포를 원심분리시키고, 2% 수크로오스 및 100 μM의 스테비올을 함유하는 새로운 배지 2 ㎖에서 재현탁하였다. 배양액을 배양관에서 30℃로 3일 동안 진탕시켰다. 1시간, 3시간, 6시간, 21시간 및 46시간 후에, 분액 (aliquots)를 취하였다. 배양액의 100 ㎕ 분액을 원심분리시키고, 동량의 DMSO를 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱시키고, 80℃에서 15분간 가열하고, 원심분리한 뒤, 19-SMG 성분을 LC-MS로 분석하였다. 테스트 시점에서 야생형과 SUS1-추가된 균주 간의 스테비올의 글리코실화 속도 차이는 관찰되지 않았다. 이것은 UGT74G1에 의한 스테비올의 글리코실화가 효모에 의해 재생산되는 UDP-글루코오스보다 느린 속도로 진행되고, 여분의 UDP-글루코오스가 시험관 내에서 저분자 글리코실화의 높은 역가를 이루기 위해서 필요하지 않을 수도 있음을 제안한다. 그렇지만, 시험관 내에서 UDP-글루코오스를 회수하기 위한 SUS의 이용은 실시예 8에 도시하였고, 그에따라 생체내 시스템에서 SUS 사용은 UDP-글루코오스가 제한되어야 하는 경우 스테비올 글리코시드의 생산 속도를 증가시킬 것으로 예상된다.
실시예 23 - 글루코오스로부터 RebC 및 RebF 의 생체 내 생산
스테비올로부터 RebC 의 생산
이전의 실험들 (공개 번호 제WO/2011/153378호)은 재조합 발현된 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ) RHM2 (람노오스 합성효소, 유전자좌 태그 AT1G53500)이 UDP-글루코오스를 UDP-람노오스로 변환시킬 수 있다는 것을 보여주었다. UDP-람노오스는 UGT91D2e 및 스테비올-13-O-모노글루코시드와 함께 시험관 내에서 배양했을 때, 스테비올-13-O-글루코피라노실-1,2-람노시드를 생산하는데 이용될 수 있다.
모든 4 UGTs 및 RHM2를 효모에서 시험관내에서 발현시키고, 뒤이어 스테비올을 공급하므로써 스테비올로부터 RebC의 생산을 확인하기 위한 추가 실험을 실행하였다. EFSC301 균주 (MAT 알파, lys2ADE8 his3ura3leu2trp1)는 야생형 유전자 서열을 발현시키는 다음의 플라스미드로 형질전환시켰다: 야생형 UGT74G1를 발현시키는 p424GPD (수탁 번호:AY345982); 야생형 85C2를 발현시키는 p423GPD (수탁 번호:AY345978.1); 및 GPD 프로모터 하에서 야생형 UGT76G1 (수탁 번호:AY345974) 및 UGT91D2e를 발현시키는 p426GPD-파생 플라스미드. RHM2 또는 빈 p425GPD 대조 플라스미드 중 하나를 발현시키는 플라스미드 p425GPD는 UGTs로 동시 형질변환 (cotransformed)시켰다. 형질변환체들을 류신, 히스티딘, 트립토판 및 우라실이 결여된 SC 배지 2-3 ㎖를 함유하는 13 ㎖의 배양관에서 하룻밤동안 예비 성장시켰다. 다음날, 성장이 0.4 OD600 유닛에 도달한 후, 세포를 원심분리시키고, 25 μM의 스테비올을 함유하는 새로운 배지에 재현탁시키고, 배양관에서 30℃로 3일간 진탕시켰다. 100 μL의 배양액 분액을 원심분리시켰다. 동일 부피의 DMSO을 상기 샘플의 상층액에 첨가하는 반면, 50% DMSO 200 μL를 침전물에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 80 ℃에서 15분간 가열하고, 원심분리하고, 스테비올 글리코시드 함량을 LC-MS로 분석하였다. RebC는 RHM2 유전자가 UGTs와 동시 발현했을 때만 성장 배지 및 세포 추출물에서 발견되었다. RebA와 RebC가 거의 동일한 양으로 생산된 정량이 나타났다. 이것은 RHM2가 생체 내에서 상당량의 UDP-람노오스를 생산할 수 있고, UGT91D2e이 생체 내에서 효율적인 람노실화를 가능케 함을 보여준다. LC-MS를 통해 두가지의 상이한 화합물이 관찰되었는데, 이들은 각각 보유 시간 5.64 및 5.33분, 및 m/z비에 상응하는 1 글루코오스- 및 1 람노오스를 함유하는 스테비올 (스테비올-1,2 람노비오시드), 및 2 글루코오스- 및 1 람노오스를 함유하는 스테비올 (둘코시드 A)이다. 이것은 스테비올 글리코시드 경로에 잔존하는 UGTs가 람노실화된 중간물질을 수용할 수 있는, 즉 람노실화 단계가 마지막으로 발생할 필요가 없는 것을 제안한다.
또한, 임의의 데드-엔드 (dead-end) 반응이 레바우디오시드 C 경로에서 발생하는지 아닌지를 결정하기 위해 일련의 순차적 시험관 내 실험을 실시하였다. 도 2b 참조. 예를 들어, 루부소시드에 대한 UGT91D2e의 람노실화 활성 및 UGT76G1에 의한 RebC로 생성물의 이후 전환은 시험관 내 반응을 이용하여 증명하였다. 이 실험에서, 대장균에서 재조합식으로 발현되고 정제된 UGT91D2e 및 RHM2를 루부소시드, NADPH, NAD+ 및 UDP-글루코오스와 함께 하룻밤 배양시켰다. 이후 반응 혼합물을 끓여 효소를 변성시켰다. 반응물 분액을 UDP-글루코오스를 함유하는 UGT76G1의 효소 제제에 첨가 하였다. 루부소시드는 UGT91D2e 및 RHM2의 존재하에서 2-글루코오스 및 1-람노오스를 함유하는 스테비올에 상응하는 m/z를 갖는 화합물로 전환되었다. 이후, 이 화합물은 UGT76G1의 존재하에서 중간물질이 둘코시드 A를 나타내는 RebC로 전환되었다. 따라서, 본 실험은 UGT91D2e가 루부소시드를 람노실화할 수 있고, UGT76G1이 생성물을 RebC로 전환시킬 수 있음을 증명한다.
마찬가지로, UGT91D2e에 의한 13-SMG의 람노실화 (1 글루코오스 및 1 람노오스를 함유한 스테비올 화합물 형성) 및 UGT76G1에 의한 2 글루코오스 및 1 람노오스 함유 화합물의 이후 형성이 시험관 내 반응을 통해 알려졌다. 이 화합물은 특유의 보유 시간 (4.56 분)을 가지며, 스테비올 13-O-1,3-디글리코시드-1,2-람노시드가 될거라 생각된다. 또한, 이 화합물은 스테비올이 4가지 UGTs 및 RHM2를 발현시키는 효모에 공급될 때 관찰되었다.
현재 데이터로부터, UGT91D2e는 13-SMG 및 루부소시드를 람노실화할 수 있다는 것을 알았다. 또한, UGT74G1 및 UGT76G1이 13-SMG으로부터 UGT91D2e에 의해 생성된 람노실화된 화합물을 대사할 수 있음도 알았다. 이들 화합물을 나머지 UGT (전단계에 사용한 UGT에 따라 UGT74G1 또는 UGT76G1)와 따라 함께 배양했을 때, RebC이 형성된다. 이것은 UGT74G1 및 UGT76G1이 람노실화된 기질을 글리코실화시킬 수 있으므로 글리코실화 순서가 그리 중요치 않다는 것을 보여준다.
글루코오스로부터 RebC 의 생산
RHM2 및 UGTs76G1과 91D2e을 발현시키는 플라스미드를 안정한 루부소시드 생산주, EFSC1923 균주로 형질변환시켰다 (실시예 15 참조). 상기 효모는 게놈에 통합된 UGTs 85C2 (수탁 번호:AY345978.1) 및 74G1 (수탁 번호:AY345982) 뿐만 아니라 영양요구성 변형을 시킨 갖는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK 111-61A 유도체이다. 균주 EFSC1923 (실시예 15 참조)에서, ERG9에 의해 인코드되는 스쿠알렌 합성 효소의 발현은 내인성 프로모터를 CUP1 구리-유도성 프로모터로 대체함으로써 하향조절하였다. 또한, 균주 EFSC1923는 S. cerevisiae PRP5-YBR238C 유전자간 영역에서 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) GGPP 합성효소 (GGPPS-10) 발현 카세트 (cassette), MPT5-YGL176C 유전자간 영역에서 지아 메이즈 (Zea mays ) 전장 CDPS (CDPS-5) 및 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana ) CPR (CPR-1) 유전자 발현 카세트, ECM3-YOR093C 유전자간 영역에서 스테비아 레바우디아나 카우렌 합성효소 및 CDPS (KS-1/CDPS-1) 유전자 발현 카세트, KIN1-INO2 유전자간 영역에서 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ) KAH (KHA-3) 및 스테비아 레바우디아나 KO (KO-1) 유전자 발현 카세트, MGA1-YGR250C 유전자간 영역에서 스테비아 레바우디아나 UGT74G1 유전자 발현 카세트 및 TRP1 유전자 ORF20 대체에 의해 통합된 스테비아 레바우디아나 UGT85C2 유전자 발현 카세트를 포함한다. 삽입된 스테비올 경로 유전자는 공개 PCT WO/2011/153378의 표 11에 기재되어 있다.
EFSC1923 균주는 GPD 프로모터를 이용하여 야생형 UGT74G1 및 UGT85C2 서열을 발현시키는 p423GPD-파생 플라스미드 및 GPD 프로모터의 조절하에서 야생형 UGT76G1 (수탁 번호:AY345974) 및 UGT91D2e (서열 번호:5 참조)를 발현시키는 p426GPD-파생 플라스미드로 형질변환시켰다. 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) RHM2를 발현시키는 플라스미드 p425GPD (효소 유전자좌 태그 AT1G53500) 또는 빈 p425GPD 대조 플라스미드를 동시-형질변환시켰다. 형질변환체들을 류신, 히스티딘 및 우라실이 결여된 SC 배지 2-3 ㎖를 함유하는 13 ㎖ 배양관에서 하룻밤동안 예비 성장시켰다. 다음날, 배양액이 0.4 유닛의 OD600에 도달했을 때, 원심분리시키고, 새로운 배지에 재현탁시키고, 배양관에서 30℃로 3일간 진탕시켰다. 배양액 100 μL를 원심분리시키고, 동일 부피의 DMSO를 상층액에 첨가한 반면, 침전물에는 50% DMSO 200 μL를 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 80 ℃에서 15분간 가열하고, 원심분리하고, 스테비올 글리코시드 함량을 LC-MS로 분석하였다.
상기 균주의 배지 및 정규화된 세포내 함량 분석으로 RebC의 생성을 확인하였다. LC-MS로 검출한 결과 약 8 μM의 RebC 및 4 μM의 RebA가 생성되었다. 또한, 스테비올 공급 이후에 생성된 중간물질은 본 실험에서는 검출되지 않았다. RebC의 축적은 RHM2의 발현에 절대적으로 의존적이였다. 본 실시예는 글루코오스로부터 RebC의 신규 생합성을 보여준다.
스테비올 및 글루코오스로부터 기타 스테비올 글리코시드의 생산
상기 기재된 동일한 GPD-기반 플라스미드를 사용하여, UGT74G1 및 UGT85C2 을 포함하는 안정한 스테비올 생산 균주 EFSC1923을 RebB 생산에 필요한 UGTs ( UGT76G1 및 UGT91D2e/EUGT11), RebE 생산에 필요한 UGTs (UGT91D2e/EUGT11) 및 둘코시드 A 생산에 필요한 UGTs (RHM2, UGT91D2e/EUGT11)로 형질변환시켰다. 높은 디글리코실화 활성을 갖는것으로 밝혀진 야생형 EUGT11 (NCBI:NP_001051007)을 본 실험을 위해 p424GPD에 클로닝하였다. 형질변환체들을 류신, 히스티딘, 트립토판 및 우라실이 결여된 SC 배지 2-3 ㎖를 함유하는 13 ㎖ 배양관에서 하룻밤동안 예비 성장시켰다. 다음날, 성장이 0.4 OD600 유닛에 도달한 후, 세포를 원심분리시키고, 25 μM 스테비올을 함유하는 새로운 배지 (글루코오스 실험은 제외)에 재현탁시키고, 배양관에서 30℃로 3일간 진탕하였다. 배양액 분액 100 μL를 원심분리시키고, 동일 부피의 DMSO를 샘플의 상층액에 첨가한 반면, 침전물에는 50% DMSO 200 μL를 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 80 ℃에서 15분간 가열하고, 원심분리하고, 스테비올 글리코시드 함량을 LC-MS로 분석하였다. LC-MS 분석으로 글루코오스 또는 스테비올로부터 S. cerevisiae에서 RebB, RebE 및 둘코시드 A의 생체내 생산을 확인하였다. 예를 들어, 도 2a 및 2B 참조. 스테비올 글리코시드의 높은 농도는 스테비올-공급에 따라 관찰되었다 (크로마토그램으로 판단함).
EUGT11 를 이용한 RebF 경로 중간물질의 특징
UGT91D2e 및 EUGT11의 자일로실화 특성들을 시험관내에서 비교하였다. 당-도너(donor)로서 UDP-자일로오스를 사용함으로써, UGT91D2e는 RebF 생합성에서 핵심 중간물질을 형성하는 스테비올-13-O-모노글루코시드를 자일로실화하는 것은 이미 알려진 바 있다 (공개 번호 WO/2011/153378). EUGT11 및 UGT91D2e을 사용하는 유사한 시험관내 실험들은 이들 UGTs가 루부소시드를 자일로실화할 수 있음을 나타내었다. UGT91D2e를 사용할 때, LC-MS 분석은 글루코오스 분자 2개와 자일로오스 분자 1개를 함유한 스테비올에 상응하는 m/z 비를 갖는 새로운 피크를 나타낸다. 도 26 참조. 보유 시간의 이동때문에, 상기 피크는 13-0-글루코오스에 대한 자일로실화된 루부소시드에 상응한다고 생각된다. EUGT11를 사용하는 경우, LC-MS 분석은 2 글루코오스와 1 자일로오스를 함유하는 스테비올에 상응하는 m/z 비를 갖고, 보유 시간 3.99 및 4.39분에서 두개의 새로운 유사한 크기의 피크를 나타낸다. 이들 생성물은 대부분 두 부위 13-O-글루코오스 또는 19-O-글루코오스 중 하나에서 자일로실화된 루부소시드에 상응한다.
글루코오스로부터 RebF 의 생산
RebF의 생체 내 생산은 UDP-자일로오스의 생산을 위한 아라비도프시스로부터의 UGD1 (UDP-글루코오스 탈수소효소) 및 USX3 (UDP-글루쿠론산 탈카르복실화효소)의 클로닝을 필요로한다. UGD1 및 UXS3을 2개의 발현 카세트를 포함하는 P425-GPD로부터 파생된 많은 복사체 (2μ) 벡터에 삽입하고, 강한 구성 프로모터들 (각각 TPI1 및 GPD1)로부터 발현시켰다. 플라스미드는 플라스미드 RebA 생산 균주 EFSC2763로 형질변환되고(실시예 21에 기재됨), 선택 배지 (류신 결손 SC)에서 3일 동안 배양하였다. LC-MS 결과는 3 글루코오스와 1 자일로오스를 함유하고 (시판 RebF 표준물질에 근거하여) RebF라 식별된 스테비올에 상응하는 m/z 비에서 보유 시간 4.13분에서 새로운 피크 뿐만 아니라, 2 글루코오스와 1 자일로오스 (상기와 같은)를 함유한 스테비올에 상응하는 m/z 비에서 다른 새로운 피크의 존재를 명확하게 나타내며, 이는 UGT91D2e가 생체내에서 자일로실화를 수행할 수 있음을 나타낸다. 이들 피크는 음성 대조군에서는 보이지 않았다.
실시예 24 - 이종 ( heterologous ) 삽입체를 이용한 스쿠알렌 합성효소 (ERG9) 하향 조절의 효과
사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모에서, 메발로네이트 경로는 스쿠알렌을 위한 생합성 경로에서 다수의 이소프레노이드 포스페이트 중간물질들을 생성한다 (도 20 참조). 효모에서의 스쿠알렌 합성효소는 ERG9이다. 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 스쿠알렌 합성효소에 대한 진뱅크 (GenBank) 수탁 번호: P29704.2; 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 스쿠알렌 합성효소에 대한 P36596; 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 스쿠알렌 합성효소에 대한 Q9Y753; 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata) 스쿠알렌 합성효소에 대한 Q9HGZ6; 아쉬브야 고시피 (Ashbya gossypii) 스쿠알렌 합성효소에 대한 Q752X9; 시베르린드네라 자디니 (Cyberlindnera jadinii) 스쿠알렌 합성효소에 대한 O74165; 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 스쿠알렌 합성효소에 대한 P78589; 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 라노스테롤 합성효소에 대한 P38604; 호모 사피엔스 (Homo sapiens) 스쿠알렌 합성효소에 대한 P37268; 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) 스쿠알렌 합성효소에 대한 P53798; 및 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) 스쿠알렌 합성효소에 대한 Q02769 참조. 도 25 a 내지 e (서열 번호:192-202 참조).
ERG9 유전자의 5' UTR 에 스템루프 ( stemloop ) 구조의 도입
야생형 ERG9 프로모터 영역은 상동 재조합에 의해 CYC1 프로모터 서열 및5'UTR 서열로 대체되었다. 5'UTR 영역은 스템루프 (stemloop) 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 서열 번호:181-183 참조. 서열 번호:184도 사용할 수 있는 또 다른 서열이다.
서열번호:181 (이종 삽입체 1) : TGAATTCGTTAACGAATTC
서열번호:182 (이종 삽입체 2) : TGAATTCGTTAACGAACTC
서열번호:183 (이종 삽입체 3) : TGAATTCGTTAACGAAGTC
서열번호:184 (이종 삽입체 4) : TGAATTCGTTAACGAAATT
특정 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, stemloop는 AUG의 5'-3' 지시된 리보오좀 스캐닝을 부분적으로 차단하여 전사체의 해독을 감소시킬 수 있다. 효모 균주의 성장에 영향을 주지 않고 FPP 수준을 향상시키기에 충분한 ERG9 전사체 해독을 감소시키는 스템루프를 찾기 위해, 상이한 정도로 염기짝 형성이 된 스템루프들을 시험하였다.
(동종성 재조합을 위한) ERG9 프로모터 상부 서열을 포함하는 DNA 단편, 항생물질 (Nourseothricin)에 내성을 부여하는 유전자 (NatR)에 대한 발현 카세트, CYC1 프로모터 (서열 번호:185, 도 21), 스템루프 구조를 포함한 5' UTR 서열, 및 (동종성 재조합을 위한) ERG9 ORF 서열을 PCR로 생성하였다. CYC1 프로모터 또는 KEX2 프로모터 (서열 번호:186)중 하나를 포함하나 스템루프는 포함하지 않는 DNA 단편도 대조군으로서 생성하였다. 재조합을 위한 근접 (flanking) ERG9 서열 뿐만 아니라 스템루프 구조도 PCR 올리고 (oligos)를 통해 도입되었다. 동종성 재조합을 위한 구조체의 개요는 도 22에 도시한다. DNA 단편은 항생물질 함유 배양 플레이트 상에서 이후에 선택된 S.cerevisiae 숙주 균주에 형질변환되었다. 천연 ERG9 프로모터와 CYC1 프로모터가 성공적으로 교환된 클론 및 스템루프 함유 5'UTR 서열을 식별하였다. 스템-루프 영역의 개요 및 서열은 도 23에 제공한다. 5%로 식별된 서열은 서열 번호:181을 함유한 이종성 삽입체와 상응하고; 20%로 식별된 서열은 서열 번호:182을 함유한 이종성 삽입체와 상응하고, 그리고 50%로 식별된 서열은 서열 번호:183을 함유한 이종성 삽입체와 상응한다.
FPP 축적의 평가 (신장 효과)
아모르파-4,11-디엔 (amorpha-4,11-diene) 합성효소 (ADS) 유전자는 식물 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua)에서 FPP 한분자를 아모르파-4-11-디엔으로 전환하는 화학반응을 촉매한다. 유전자는 S. cerevisiae에서 기능을 하고 효과적이며, ERG9 유전자의 이종성 5'UTR에 도입된 스템루프 구조를 갖는 균주에서 FPP의 축적을 간접적으로 평가하는데 이용될 수 있다. ADS (진뱅크 수탁 번호: AAF61439)를 인코드하는 S. cerevisiae 코돈 최적화된 핵산을 PGK1 프로모터의 제어하에서 다수의 복사체 플라스미드 (2μ)에 클로닝시키고, 야생형에 형질변환시켜, S.cerevisiae 균주를 작제계하였다. (로 등 (Ro et al.), 2006. Nature 440(7086):940-943; 파라다이스 등 (Paradise et al.) Biotechnol Bioeng . 2008.6.1.100(2):371-8; 뉴먼 등 (Newman et al.) Biotechnol Bioeng .95 (4):684 - 691)에 기재된 바와 같이, 아모르파-4,11-디엔 생성물을 측정하고 표준 화합물 카리오필렌 (caryophyllene)과 비교하였다.
화학 약품
도데칸 (dodecane) 및 카리오필렌은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 합성 복합 (SC) 배지의 형성을 위한 복합 공급 혼합물은 포르메디움 (Formedium, UK)로부터 구입하였다. 기타 모든 화학 약품은 시그마-알드리치로부터 구입하였다.
효모 배양
작제된 효모 균주를 우라실이 결손된 2% 글루코오스 SC에서 성장시켰다. 배양액을 30 ℃에서 하룻밤 동안 성장시킨 뒤, 25 ㎖ SC 배지를 포함한 250 ㎖ 쉐이크 플라스크에 본 배양액을 접종하고, 600nm 에서 0.1의 광학밀도까지 성장시켰다. 본 배양액을 30℃에서 72시간 동안 성장시켰다. 매우 낮은 농도의 아모르파디엔이 수용액으로부터 휘발되기 때문에, 생성된 아모르파디엔의 휘발을 막고 유지시키기 위해 각 배양 플라스크에 2.5㎖의 도데칸을 첨가했다. 10 ㎕의 도데칸 층을 샘플링하고 GC-MS로 정량화하기 위해 100배의 에틸 아세테이트에 희석하였다.
아모르파디엔의 GC - MS 분석
GC-MS는 효모 배양물로부터 아모르파디엔 생성을 측정하는데 사용하였다. 샘플을 다음의 방법을 이용하여 분석하였다: GC 오븐 온도 프로그램을 80℃에서 2분간 사용하고, 뒤이어 1분당 30℃ 간격으로 160℃까지, 이어 1분당 3℃ 간격으로 170℃까지, 최종적으로는 1분당 30℃ 간격으로 300℃까지 램핑(ramping)시키고 최종 2분동안 유지시켰다. 주입기 (injector) 및 MS 사중극자 (quadrupole) 검출기 온도는 각각 250℃ 및 150℃였다. 1μL를 스플릿-레스 (split-less) 모드로 주입하였다. MS는 전체 스캔 (full-scan) 모드로 작동하였다. 아모르파디엔 농도는 총 이온을 이용하여 카리오필렌 표준 곡선을 사용하여 (-)-트랜 카리오필렌 당량으로 산출하였다.
서열 번호:181에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 이종성 삽입체를 사용하였을 경우, 삽입체가 없거나 서열 번호:182 및 183에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 삽입체 중 한가지와 비교하여 아모르파디엔의 증가된 생산 (2.5배)을 상이한 프로모터 구조물을 포함하는 상이한 균주의 분석으로 확인하였다. 도 24 참조. 서열 번호:181에 제시된 이종성 삽입체는 가장 안정된 2차 구조를 갖는다. 비교를 위해 변형되지 않은 ERG9을 갖는 야생형 효모를 또한 분석하였고 (도 24: CTRL-ADS), 상기 균주는 아모르파디엔의 보다 낮은 생산을 보였다. 반대로, 매우 약한 프로모터 ScKex2를 포함하는 구조체는 보다 높은 수준의 아모르파디엔 (6배)를 나타내었다.
실시예 25 - GGPP 생산에서 스쿠알렌 합성효소 ( ERG9 ) 하향 조절 및 GGPPS 과발현의 효과 분석
GGPP 축적의 평가
S.cerevisiae는 GGPPS (BTS1)를 함유한다. BTS1 외에도 S.cerevisiae에서 기능이 있고 효율적인 몇몇 이종성 GGPPS 효소들이 있다. 기능성 GGPPS가 S.cerevisiae에서 과발현되면, S.cerevisiae 효소 DPP1 및 LPP1에 의해 게라닐게라니올 (GGOH)로 전환될 수 있는 GGPP의 축적을 초래한다. GGOH는 효모 배양 배지로 부분적으로 방출된다. GGOH는 GC-MS로 측정할 수 있고, 이것의 축적은 기질로서 GGPP를 사용하는 효소로 유용한 GGPP의 가능한 풀(pool)를 평가하기 위해 간적접으로 사용될 수 있다.
네 가지 상이한 GGPPSs (GGPPS-1 (S. acidicaldarius, 표 7 참조), GGPPS-2 ( A.nidulans, 도 25 a 내지 e, 서열 번호:203 ), GGPPS-3 (S. cerevisiae, BTS1, 도 25 a 내지 e, 서열 번호: 167), 및 GGPPS-4 (M. musculus, 도 7 참조)를 분석하였다. GGPPS-1, GGPPS-2, 및 GGPPS-4를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 S. cerevisiae 코돈 최적화되었다. GGPPS 폴리펩티드를 인코드하는 모든 핵산은 PGK1 프로모터의 제어하에 다수의 복사체 플라스미드 (2μ)에 클로닝되고, 두 개의 상이한 ERG9 하향된 조절 균주: KEX2-ERG9 및 CYC1 (5%)- ERG9로 형질변환되었다 (실시예 24 참조).
작제된 효모 균주를 우라실이 결손된 2% 글루코오스 SC에서 성장시켰다. 합성 복합 (SC) 배지의 형성을 위한 복합 공급 혼합물은 포르메디움 (Formedium, UK)로부터 구입하였다. 기타 모든 화학 약품은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 광학 밀도 측정은 OD 600nm에서 진행하였다. 배양액을 30℃에서 하룻밤 동안 성장시킨 뒤, 25 ㎖ SC 배지를 포함한 250 ㎖의 언배플드(unbaffled) 배양 플라스크에 접종하고, 600nm에서 0.1의 광학밀도까지 성장시켰다. 본 배지를 30℃에서 72시간 동안 성장시켰다.
GGOH 축적을 측정하기 위해, 효모 세포 (침전물)과 효모 배양 배지 (상층액)을 따로 추출한 뒤, GC-MS에 의한 분석 전에 결합시켰다. 상층액은 1:1 비율의 헥산으로 추출하였다. 펠릿은 우선 20%의 KOH 및 50%의 에탄올을 함유하는 용액으로 비누화시키고, 용균 세포는 최종적으로 1:1 비율의 핵산으로 추출하였다. GC 오븐 온도 프로그램은 80℃에서 2분 동안 사용하였고, 뒤이어 1분당 30℃로 160℃까지, 이후에는 1분당 3℃로 170℃까지, 최종적으로 1분당 30℃로 300℃까지 램핑시키고, 최종 2분 동안 유지시켰다. 주입기 (injector) 및 MS 사중극자 (quadrupole) 검출기 온도는 각각 250℃ 및 150℃였다. 2㎕를 스플릿-레스 (split-less) 모드로 주입하였다. MS는 전체 스캔 모드로 작동하였다.
GGPPS가 CYC1 (5%)-ERG9 균주 또는 KEX2-ERG9 균주에서 과발현되었을 때, GGPPS가 발현되지 않은 대조군과 비교하여 4가지 모든 GGPPS 폴리펩티드는 GGOH (GGPP) 생성이 상당히 증가한 것으로 관찰되었다. 특히, CYC1 (5%)-ERG9 균주는 KEX2-ERG9 균주 보다 2-4배 높은 GGOH (GGPP) 축적을 나타냈다. 결과는 도 26에 도시한다.
기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 설명하고 있지만, 상기 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하지 않으며, 첨부한 청구 범위에 의해 본 발명의 범위가 정의됨을 이해해야 할 것이다. 다른 측면, 장점, 및 변경은 하기의 청구의 범위내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Evolva SA Houghton-Larsen, Jens Hicks, Paula M Naesby, Michael Ostergaard Tange, Thomas Hansen, Jorgen Dalgaard Mikkelsen, Michael Halkjaer Hansen, Esben Simon, Ernesto Tavares, Sabina <120> Recombinant Production of Steviol Glycosides <130> 13-1234-WO-KR <150> 61/521,084 <151> 2011-08-08 <150> 61/521,203 <151> 2011-08-08 <150> 61/521,051 <151> 2011-08-08 <150> 61/523,487 <151> 2011-08-15 <150> 61/567,929 <151> 2011-12-07 <150> 61/603,639 <151> 2012-02-27 <150> PCT/US2012/050021 <151> 2012-08-08 <160> 205 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 1 Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys 20 25 30 Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His 35 40 45 Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile 50 55 60 Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp 100 105 110 Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile 115 120 125 Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val 130 135 140 Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu 145 150 155 160 Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu 165 170 175 Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser 180 185 190 Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val 195 200 205 Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr 210 215 220 Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met 225 230 235 240 Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu 245 250 255 Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro 260 265 270 Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly 275 280 285 Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val 290 295 300 Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu 305 310 315 320 Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp 325 330 335 Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val 340 345 350 Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val 355 360 365 Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys 370 375 380 Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu 385 390 395 400 Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile 405 410 415 Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp 420 425 430 Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn 435 440 445 Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala 450 455 460 <210> 2 <211> 1383 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 2 atggcagagc aacaaaagat caaaaagtca cctcacgtct tacttattcc atttcctctg 60 caaggacata tcaacccatt catacaattt gggaaaagat tgattagtaa 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85 90 95 Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp 100 105 110 Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile 115 120 125 Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu 130 135 140 Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu 145 150 155 160 Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr 165 170 175 Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu 180 185 190 Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu 195 200 205 Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His 210 215 220 Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu 225 230 235 240 Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu 245 250 255 Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu 260 265 270 His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu 275 280 285 Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr 290 295 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ctaatgtttg gtcaccctct aatcatgcta 1140 ccgatttttg gggaccaacc tctgaatgct cgattactgg aggacaaaca ggtgggaatc 1200 gagataccaa gaaatgagga agatggttgc ttgaccaagg agtcggttgc tagatcactg 1260 aggtccgttg ttgtggaaaa agaaggggag atctacaagg cgaacgcgag ggagctgagt 1320 aaaatctata acgacactaa ggttgaaaaa gaatatgtaa gccaattcgt agactatttg 1380 gaaaagaata cgcgtgcggt tgccatcgat catgagagtt aa 1422 <210> 12 <211> 473 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 12 Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val 1 5 10 15 Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Phe Leu Gln 20 25 30 Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser 35 40 45 Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile 50 55 60 Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Gln Tyr Leu Lys 85 90 95 Lys Ala Val Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln 100 105 110 His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Phe Thr 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cttccacgtg tccaagagct gccggaggat 240 gcagaggcga ccactgacgt ccaccctgaa gatattcaat atctcaagaa ggctgttgat 300 ggtcttcaac cggaggtcac ccggtttcta gaacaacact ctccggactg gattatttat 360 gattttactc actactggtt gccatccatc gcggctagcc tcggtatctc acgagcctac 420 ttctgcgtca tcactccatg gaccattgct tatttggcac cctcatctga cgccatgata 480 aatgattcag atggtcgaac cacggttgag gatctcacga caccgcccaa gtggtttccc 540 tttccgacca aagtatgctg gcggaagcat gatcttgccc gaatggagcc ttacgaagct 600 ccagggatat ctgatggata ccgtatgggg atggttttta agggatctga ttgtttgctt 660 ttcaaatgtt accatgagtt tggaactcaa tggctacctc ttttggagac actacaccaa 720 gtaccggtgg ttccggtggg attactgccg ccggaaatac ccggagacga gaaagatgaa 780 acatgggtgt caatcaagaa atggctcgat ggtaaacaaa aaggcagtgt ggtgtacgtt 840 gcattaggaa gcgaggcttt ggtgagccaa accgaggttg ttgagttagc attgggtctc 900 gagctttctg ggttgccatt tgtttgggct tatagaaaac caaaaggtcc cgcgaagtca 960 gactcggtgg agttgccaga cgggttcgtg gaacgaactc gtgaccgtgg gttggtctgg 1020 acgagttggg cacctcagtt acgaatactg agccatgagt cggtttgtgg tttcttgact 1080 cattgtggtt ctggatcaat tgtggaaggg ctaatgtttg gtcaccctct aatcatgcta 1140 ccgctttttg gggaccaacc tctgaatgct cgattactgg aggacaaaca ggtgggaatc 1200 gagataccaa gaaatgagga agatggttgc ttgaccaagg agtcggttgc tagatcactg 1260 aggtccgttg ttgtggaaaa cgaaggggag atctacaagg cgaacgcgag ggagctgagt 1320 aaaatctata acgacactaa ggtggaaaaa gaatatgtaa gccaattcgt agactatttg 1380 gaaaagaatg cgcgtgcggt tgccatcgat catgagagtt aa 1422 <210> 14 <211> 485 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 14 Met Tyr Asn Val Thr Tyr His Gln Asn Ser Lys Ala Met Ala Thr Ser 1 5 10 15 Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val Ala Thr Phe Pro 20 25 30 Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Phe Leu Gln Leu Ser Lys Leu 35 40 45 Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser Thr Thr Arg Asn 50 55 60 Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile Asn Val Val Gln 65 70 75 80 Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp Ala Glu Ala Thr 85 90 95 Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Gln Tyr Leu Lys Lys Ala Val 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 atgcacttag caccacgtag agtccctaga ggtagaagat caccacctga cagagttcct 60 gaaagacaag gtgccttggg tagaagacgt ggagctggct ctactggctg tgcccgtgct 120 gctgctggtg ttcaccgtag aagaggagga ggcgaggctg atccatcagc tgctgtgcat 180 agaggctggc aagccggtgg tggcaccggt ttgcctgatg aggtggtgtc taccgcagcc 240 gccttagaaa tgtttcatgc ttttgcttta atccatgatg atatcatgga tgatagtgca 300 actagaagag gctccccaac tgttcacaga gccctagctg atcgtttagg cgctgctctg 360 gacccagatc aggccggtca actaggagtt tctactgcta tcttggttgg agatctggct 420 ttgacatggt ccgatgaatt gttatacgct ccattgactc cacatagact ggcagcagta 480 ctaccattgg taacagctat gagagctgaa accgttcatg gccaatatct tgatataact 540 agtgctagaa gacctgggac cgatacttct cttgcattga gaatagccag atataagaca 600 gcagcttaca caatggaacg tccactgcac attggtgcag ccctggctgg ggcaagacca 660 gaactattag cagggctttc agcatacgcc ttgccagctg gagaagcctt ccaattggca 720 gatgacctgc taggcgtctt cggtgatcca agacgtacag ggaaacctga cctagatgat 780 cttagaggtg gaaagcatac tgtcttagtc gccttggcaa gagaacatgc cactccagaa 840 cagagacaca cattggatac attattgggt acaccaggtc ttgatagaca aggcgcttca 900 agactaagat gcgtattggt agcaactggt gcaagagccg aagccgaaag acttattaca 960 gagagaagag atcaagcatt aactgcattg aacgcattaa cactgccacc tcctttagct 1020 gaggcattag caagattgac attagggtct acagctcatc ctgcctaa 1068 <210> 23 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 atgtcatatt tcgataacta cttcaatgag atagttaatt ccgtgaacga catcattaag 60 tcttacatct ctggcgacgt accaaaacta tacgaagcct cctaccattt gtttacatca 120 ggaggaaaga gactaagacc attgatcctt acaatttctt ctgatctttt cggtggacag 180 agagaaagag catactatgc tggcgcagca atcgaagttt tgcacacatt cactttggtt 240 cacgatgata tcatggatca agataacatt cgtagaggtc ttcctactgt acatgtcaag 300 tatggcctac ctttggccat tttagctggt gacttattgc atgcaaaagc ctttcaattg 360 ttgactcagg cattgagagg tctaccatct gaaactatca tcaaggcgtt tgatatcttt 420 acaagatcta tcattatcat atcagaaggt caagctgtcg atatggaatt cgaagataga 480 attgatatca aggaacaaga gtatttggat atgatatctc gtaaaaccgc tgccttattc 540 tcagcttctt cttccattgg ggcgttgata gctggagcta atgataacga tgtgagatta 600 atgtccgatt tcggtacaaa tcttgggatc gcatttcaaa ttgtagatga tatacttggt 660 ttaacagctg atgaaaaaga gctaggaaaa cctgttttca gtgatatcag agaaggtaaa 720 aagaccatat tagtcattaa gactttagaa ttgtgtaagg aagacgagaa aaagattgtg 780 ttaaaagcgc taggcaacaa gtcagcatca aaggaagagt tgatgagttc tgctgacata 840 atcaaaaagt actcattgga ttacgcctac aacttagctg agaaatacta caaaaacgcc 900 atcgattctc taaatcaagt ttcaagtaaa agtgatattc cagggaaggc attgaaatat 960 cttgctgaat tcaccatcag aagacgtaag taa 993 <210> 24 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 atggtcgcac aaactttcaa cctggatacc tacttatccc aaagacaaca acaagttgaa 60 gaggccctaa gtgctgctct tgtgccagct tatcctgaga gaatatacga agctatgaga 120 tactccctcc tggcaggtgg caaaagatta agacctatct tatgtttagc tgcttgcgaa 180 ttggcaggtg gttctgttga 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900 gatgtgacaa agtcttccaa agagttggga aaaacagctg gtaaagattt gattgccgac 960 aaattgacct accctaagat tatggggcta gaaaaatcaa gagaatttgc cgagaaactc 1020 aatagagagg cgcgtgatca actgttgggt ttcgattctg ataaagttgc accactctta 1080 gccttagcca actacatcgc ttacagacaa aactaa 1116 <210> 26 <211> 1086 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 26 atggctcttg taaatcccac agctttgttc tatggaacct ccataagaac cagacccaca 60 aacttgctca acccgaccca aaaacttcga cccgtttcct cgtcttcttt gccttccttc 120 tcttcagttt ctgcaatctt gacggaaaaa caccaatcaa acccatcaga aaacaataac 180 ttgcaaaccc atctcgaaac accattcaat ttcgactctt acatgctgga gaaagtaaac 240 atggtgaatg aagctctgga cgcctcggtt ccactcaaag acccgataaa gatccatgaa 300 tccatgcggt actcccttct agctggcggg aaacgcatcc gaccgatgat gtgcatcgcc 360 gcttgcgaaa tagtcggagg caacatatta aacgccatgc cagctgcatg cgcggtcgag 420 atgattcaca ccatgtcact agttcatgac gaccttccat gcatggataa cgacgacttc 480 cgacgtggaa aaccaataag ccacaaggtg tacggtgaag aaatggcggt tctaaccggg 540 gacgcgttac tctcattatc cttcgaacat atcgcgaccg cgacaaaagg cgtatccaaa 600 gacaggatcg tccgagccat tggtgaactc gcaaggtccg ttggctcgga gggtttggtc 660 gccggtcagg tggttgatat tttatccgaa ggggctgatg ttgggttaga ccacttggag 720 tatattcata tacacaagac tgcaatgttg cttgagagct cggtcgtgat cggcgcgatc 780 atgggcggtg ggtctgacca acagatcgaa aagttgcgaa agtttgcgag atcgattggt 840 ttgttgtttc aggtggtaga tgatattctt gatgtcacaa agtcgactga ggaattgggg 900 aaaacggcgg gaaaagattt gctgacggac aagacaacgt atccgaagtt gttggggatc 960 gaaaaatcga gagaatttgc ggagaaatta aacaaggaag cgcaagaaca attgtcgggg 1020 tttgatcgcc gcaaggcggc tccgttaatt gcccttgcta attacaatgc ttataggcaa 1080 aactga 1086 <210> 27 <211> 1029 <212> DNA <213> Gibberella fujikuroi <400> 27 atggctgaac aacagatctc caaccttctt tcaatgtttg atgcttctca cgcaagccag 60 aagttggaga ttacggttca gatgatggat acctaccatt acagagaaac tcctccagac 120 tcttcctctt cagaaggcgg ttccttatct cgctatgatg agcgacgggt ctcccttccg 180 ctctctcaca atgcagcctc cccagacata gtctcccagt tatgcttctc aacagctatg 240 agctcggagc tcaatcacag gtggaagtca cagcgcctca aggttgctga 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<211> 1020 <212> DNA <213> Thalassiosira pseudonana <400> 29 atggctcgtt tctacttcct gaacgctctc ctcatggtga tttctttaca aagcaccacg 60 gcattcaccc cggcaaaact cgcctaccca acaaccacca ctgcattaaa cgttgcctct 120 gccgaaacat catttagcct cgatgaatac ctagcctcca aaatcggacc cattgaatca 180 gctctcgagg catctgtcaa atctcgcatt cctcaaactg acaagatatg cgagtctatg 240 gcatactcac tcatggctgg aggaaagcgt atccgtcccg ttttgtgcat tgctgcttgt 300 gaaatgtttg ggggaagtca agatgtggct atgccgacgg ctgtggcttt ggagatgatt 360 catactatga gtcttattca tgacgatttg ccttcaatgg acaacgatga tctccgacga 420 ggaaagccaa ctaatcatgt tgtctttgga gaggatgttg ctattcttgc tggggattct 480 cttctcagta cgtcttttga acatgttgcc cgtgaaacca aaggagtgtc agctgaaaag 540 attgtagatg ttatcgctcg cctcgggaag tctgtgggtg cagagggtct tgctggtgga 600 caggttatgg atcttgagtg tgaggcgaag ccaggaacta ccctcgacga tctcaagtgg 660 attcacattc acaaaactgc cactcttctt caagtggcag tggcatcagg tgctgttctt 720 ggaggggcca caccagagga ggttgctgct tgtgaactgt tcgcaatgaa tattggactt 780 gccttccagg tcgctgatga tattttggac gtgacggcat cgagtgagga tcttggcaaa 840 actgctggaa aggatgaagc cacagataag acaacttatc ctaagctttt gggattggag 900 gagagtaagg catacgctcg acaactcata gacgaagcaa aggaatcttt ggctcctttc 960 ggtgatcgtg ctgctccatt gttggcaatt gccgacttta tcattgatcg aaagaactag 1020 <210> 30 <211> 1068 <212> DNA <213> Streptomyces clavuligerus <400> 30 atgcacctgg ctccccgccg agtaccgcgc ggccgtcgaa gcccacctga ccgcgttcct 60 gaacgccaag gagcgctcgg ccgccgccgg ggggccggtt ccacaggatg tgcccgcgct 120 gctgcgggag ttcatcggcg ccgggggggg ggggaagcgg atccgtccgc tgctgtgcat 180 cgcggctggc aggccggcgg cggaacagga ctgccggacg aggtggtgtc cacagcggcg 240 gcgctggaga tgttccacgc gttcgcgctg atccacgacg acatcatgga tgactccgcg 300 accaggcgcg gcagcccgac ggtgcaccgg gcactcgccg accggctcgg cgccgctctc 360 gaccccgacc aagccggaca actgggggtg agcacggcga tcctcgtcgg ggacctcgcc 420 ctgacctggt cggacgaact gctgtacgct cccctgaccc cccaccggct ggccgcggta 480 ctgcccctgg tcacggccat gcgcgcggaa acggtccacg gccagtacct ggacatcacc 540 tccgcccgcc ggcccggcac ggacacctca ctggcgctgc gaatcgcgcg ctacaaaacc 600 gctgcttaca ccatggaacg ccccctgcac atcggagcag cgctcgccgg cgcacgaccg 660 gaactcctgg cagggctcag cgcctacgcg ctgccggcgg gcgaggcatt ccagctcgcc 720 gacgacctcc tgggagtgtt cggcgatcca cggagaaccg gcaaacccga cctcgacgac 780 ctccgcggcg gcaagcacac cgtcctcgtg gccctcgccc gggaacacgc cacacctgaa 840 cagcggcaca ccctggacac cctgctcggc acaccaggcc tcgaccggca gggcgcgtcc 900 cggctgcgct gcgtcctcgt cgccaccggg gcccgggcgg aagccgaacg cctgatcacc 960 gaacggcgcg accaggccct caccgcgctc aacgccctga cactgccccc accgctcgcc 1020 gaggcactcg cccgcctcac cctcgggagt accgcacacc cggcctga 1068 <210> 31 <211> 993 <212> DNA <213> Sulfulobus acidicaldarius <400> 31 atgagttact ttgacaacta ttttaatgag attgttaatt ctgtaaacga cattattaag 60 agctatatat ctggagatgt tcctaaacta tatgaagcct catatcattt gtttacatct 120 ggaggtaaga ggttaagacc attaatctta actatatcat cagatttatt cggaggacag 180 agagaaagag cttattatgc aggtgcagct attgaagttc ttcatacttt tacgcttgtg 240 catgatgata ttatggatca agataatatc agaagagggt tacccacagt ccacgtgaaa 300 tacggcttac ccttagcaat attagctggg gatttactac atgcaaaggc ttttcagctc 360 ttaacccagg ctcttagagg tttgccaagt gaaaccataa ttaaggcttt cgatattttc 420 actcgttcaa taataattat atccgaagga caggcagtag atatggaatt tgaggacaga 480 attgatataa aggagcagga ataccttgac atgatctcac gtaagacagc tgcattattc 540 tcggcatcct caagtatagg cgcacttatt gctggtgcta atgataatga tgtaagactg 600 atgtctgatt tcggtacgaa tctaggtatt gcatttcaga ttgttgacga tatcttaggt 660 ctaacagcag acgaaaagga acttggaaag cctgttttta gtgatattag ggagggtaaa 720 aagactatac ttgtaataaa aacactggag ctttgtaaag aggacgagaa gaagattgtc 780 ctaaaggcgt taggtaataa gtcagcctca aaagaagaat taatgagctc agcagatata 840 attaagaaat actctttaga ttatgcatac aatttagcag agaaatatta taaaaatgct 900 atagactctt taaatcaagt ctcctctaag agtgatatac ctggaaaggc tttaaaatat 960 ctagctgaat ttacgataag aaggagaaaa taa 993 <210> 32 <211> 894 <212> DNA <213> Synechococcus sp. <400> 32 ttggttgccc aaaccttcaa cctggacacc tacttgagcc aacgccagca acaggtggaa 60 gaggcgcttt ctgcggcatt ggttcccgcc tatccggagc gcatttacga 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ttgttgtttc aggtggttga tgatatcttg 900 gatgtgacga aatcgtcgaa agagttaggg aaaactgctg ggaaagattt gattgctgat 960 aagttgacgt atcctaagat tatgggtttg gagaaatcga gagagtttgc tgagaaattg 1020 aatagagagg ctcgtgatca gcttttaggg tttgattctg ataaggttgc tcctttgttg 1080 gctttggcta attacattgc ctatagacag aactga 1116 <210> 34 <211> 2364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 atgaaaaccg ggtttatctc accagcaaca gtatttcatc acagaatctc accagcgacc 60 actttcagac atcacttatc acctgctact acaaactcta caggcattgt cgccttaaga 120 gacatcaact tcagatgtaa agcagtttct aaagagtact ctgatctgtt gcagaaagat 180 gaggcttctt tcacaaaatg ggacgatgac aaggtgaaag atcatcttga taccaacaaa 240 aacttatacc caaatgatga gattaaggaa tttgttgaat cagtaaaggc tatgttcggt 300 agtatgaatg acggggagat aaacgtctct gcatacgata ctgcatgggt tgctttggtt 360 caagatgtcg atggatcagg tagtcctcag ttcccttctt ctttagaatg gattgccaac 420 aatcaattgt cagatggatc atggggagat catttgctgt tctcagctca cgatagaatc 480 atcaacacat tagcatgcgt tattgcactt acaagttgga atgttcatcc ttctaagtgt 540 gaaaaaggtt tgaattttct gagagaaaac atttgcaaat tagaagatga aaacgcagaa 600 catatgccaa ttggttttga agtaacattc ccatcactaa ttgatatcgc gaaaaagttg 660 aacattgaag tacctgagga tactccagca cttaaagaga tctacgcacg tagagatatc 720 aagttaacta agatcccaat ggaagttctt cacaaggtac ctactacttt gttacattct 780 ttggaaggaa tgcctgattt ggagtgggaa aaactgttaa agctacaatg taaagatggt 840 agtttcttgt tttccccatc tagtaccgca ttcgccctaa tgcaaacaaa agatgagaaa 900 tgcttacagt atctaacaaa tatcgtcact aagttcaacg gtggcgtgcc taatgtgtac 960 ccagtcgatt tgtttgaaca tatttgggtt gttgatagac tgcagagatt ggggattgcc 1020 agatacttca aatcagagat aaaagattgt gtagagtata tcaataagta ctggaccaaa 1080 aatggaattt gttgggctag aaatactcac gttcaagata tcgatgatac agccatggga 1140 ttcagagtgt tgagagcgca cggttatgac gtcactccag atgtttttag acaatttgaa 1200 aaagatggta aattcgtttg ctttgcaggg caatcaacac aagccgtgac aggaatgttt 1260 aacgtttaca gagcctctca aatgttgttc ccaggggaga gaattttgga agatgccaaa 1320 aagttctctt 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gctttgagat cacacgccgc agcaggtaca ccagtaccag gaaaagtctg gcacgcttcc 600 gagactttgg gcttgagtac cgaagctgct tctcacttgc aaccagccca aggtataatc 660 ggtggctctg ctgctgccac agcaacatgg ctaaccaggg ttgcaccatc tcaacagtca 720 gattctgcca gaagatacct tgaggaatta caacacagat actctggccc agttccttcc 780 attaccccta tcacatactt cgaaagagca tggttattga acaattttgc agcagccggt 840 gttccttgtg aggctccagc tgctttgttg gattccttag aagcagcact tacaccacaa 900 ggtgctcctg ctggagcagg attgcctcca gatgctgatg atacagccgc tgtgttgctt 960 gcattggcaa cacatgggag aggtagaaga ccagaagtac tgatggatta caggactgac 1020 gggtatttcc aatgctttat tggggaaagg actccatcaa tttcaacaaa cgctcacgta 1080 ttggaaacat tagggcatca tgtggcccaa catccacaag atagagccag atacggatca 1140 gccatggata ccgcatcagc ttggctgctg gcagctcaaa agcaagatgg ctcttggtta 1200 gataaatggc atgcctcacc atactacgct actgtttgtt gcacacaagc cctagccgct 1260 catgcaagtc ctgcaactgc accagctaga cagagagctg tcagatgggt tttagccaca 1320 caaagatccg atggcggttg gggtctatgg cattcaactg ttgaagagac tgcttatgcc 1380 ttacagatct 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ccaacaacag cctgtccaga cgatgatggt tctataggta tctcaccagc agctacagcc 600 gcctggagag cccaggctgt gaccagaggc tcaactcctc aagtgggcag agctgacgca 660 tacttacaaa tggcttcaag agcaacgaga tcaggcatag aaggagtctt ccctaatgtt 720 tggcctataa acgtattcga accatgctgg tcactgtaca ctctccatct tgccggtctg 780 ttcgcccatc cagcactggc tgaggctgta agagttatcg ttgctcaact tgaagcaaga 840 ttgggagtgc atggcctcgg accagcttta cattttgctg ccgacgctga tgatactgca 900 gttgccttat gcgttctgca tttggctggc agagatcctg cagttgacgc attgagacat 960 tttgaaattg gtgagctctt tgttacattc ccaggagaga gaaatgctag tgtctctacg 1020 aacattcacg ctcttcatgc tttgagattg ttaggtaaac cagctgccgg agcaagtgca 1080 tacgtcgaag caaatagaaa tccacatggt ttgtgggaca acgaaaaatg gcacgtttca 1140 tggctttatc caactgcaca cgccgttgca gctctagctc aaggcaagcc tcaatggaga 1200 gatgaaagag cactagccgc tctactacaa gctcaaagag atgatggtgg ttggggagct 1260 ggtagaggat ccactttcga ggaaaccgcc tacgctcttt tcgctttaca cgttatggac 1320 ggatctgagg aagccacagg cagaagaaga atcgctcaag tcgtcgcaag agccttagaa 1380 tggatgctag 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ccatatctcc 2340 aaggtgttcg agattgtaat atga 2364 <210> 38 <211> 1584 <212> DNA <213> Streptomyces clavuligerus <400> 38 ttgcccgacg cgcatgatgc ccctccgcct cagatacgac agcggaccct tgtcgatgag 60 gcgacgcaac tcctcacgga gtcggccgag gacgcctggg gtgaggtgtc cgtgtccgag 120 tacgaaacgg cgcggctggt ggcccacgcc acctggctcg gcggtcacgc cacacgggtg 180 gccttcctgc tggagcggca gcatgaggac ggctcgtggg gcccgcccgg cgggtaccgt 240 ctcgtaccca cgctgagtgc cgtacacgcc ctgctcacct gtctggcgtc tcccgcgcag 300 gaccacggag tgcctcatga ccggctcctg cgcgcagttg acgcgggcct gacggcactg 360 cgtcgtcttg ggacgagcga cagcccgccg gacaccattg cggtcgaact ggtcataccc 420 tcgctccttg agggcatcca gcacctcctg gacccggcgc acccgcattc ccgacccgct 480 ttttcgcaac accgcggcag cctcgtctgc cccgggggcc tcgacggccg cacgctgggg 540 gccttgcgct cccacgccgc agccggcaca cctgtcccgg gcaaggtgtg gcacgcctcg 600 gaaaccttgg ggctatcgac cgaggcagcc tcccaccttc aacccgccca gggcatcatc 660 ggtggctccg ccgccgcgac agcaacatgg ctcaccaggg tcgccccgtc gcaacagagc 720 gacagcgcac ggcgctacct ggaagaactc 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<211> 1551 <212> DNA <213> Bradyrhizobium japonicum <400> 39 gtgaacgcgc tgtccgaaca tatcctttcc gaattgcgcc gcctgctgag cgaaatgagc 60 gatggcggca gcgtcggtcc gtccgtctac gacacggcgc aggcgctgcg cttccacggc 120 aacgtcaccg gtcggcagga cgcatacgcg tggctcatcg cgcagcaaca ggccgacggc 180 ggatggggaa gcgcggactt cccgctgttc cgccatgcgc ccacgtgggc ggcgttactg 240 gcattgcagc gtgccgatcc tcttcccgga gctgcggacg cagtccagac tgcaacgagg 300 ttcctccagc gccagcccga tccctacgca catgcggtgc cagaagacgc gccgatcggc 360 gcggagctga tcctgccgca gttttgcggt gaggccgcat ggttgctggg tggcgtagcg 420 tttccgcgcc atcctgcgct gttgccattg cggcaagcgt gcctggtcaa gctgggggcg 480 gtggcgatgt tgccgagcgg ccatccgttg ctacactcct gggaagcctg ggggacgtcg 540 ccgaccaccg catgcccgga tgacgacggc agcatcggca tcagtccggc ggccaccgcc 600 gcgtggcgtg cccaggccgt gacacggggg agcacgccgc aggtcgggcg cgccgatgcg 660 tatctgcaga tggcatcgcg ggcgacgcgc agcggcatcg aaggtgtctt tcccaacgtc 720 tggccgatca atgtgttcga gccatgctgg tcgctgtaca ccctgcatct ggccgggctt 780 ttcgcgcatc ccgcgctcgc ggaggcggtt cgcgtgatcg tcgcgcagct cgaggcccgt 840 ctgggcgtgc acggtctggg cccggccttg cacttcgcgg ctgatgcgga cgacaccgcc 900 gttgcgttgt gcgtcctgca ccttgcaggc cgtgacccgg cggtcgatgc gttgcgccat 960 ttcgaaatcg gcgagctgtt cgtcaccttc cccggcgaac gcaatgcctc ggtgtcgacc 1020 aacattcatg ccctgcatgc gttgcgactg ttgggaaagc ccgccgcggg cgccagcgcg 1080 tacgtcgagg ccaatcgcaa cccgcacggt ctatgggaca acgaaaaatg gcacgtttcg 1140 tggctgtatc ccaccgcgca tgcggtcgct gcgctggcgc aaggcaagcc ccagtggcga 1200 gatgagcgcg cgctggcggc gctgctgcag gcgcagcgcg acgacggtgg ctggggcgcg 1260 ggtcgcgggt ccacgttcga ggaaaccgcc tatgcgctgt ttgcgttgca cgtgatggat 1320 gggagcgaag aggcgacagg gcgccggcgc atcgcgcagg tggtggcgcg tgcgctggag 1380 tggatgctcg cccgccatgc ggcgcatgga ttgccgcaga cgccgctgtg gatcggcaag 1440 gaactgtatt gccccactcg ggtcgtgcgc gtggccgaac tcgccgggtt gtggctggcg 1500 cttcgttggg ggcggcgcgt cctggccgag ggggcaggag cggcgccatg a 1551 <210> 40 <211> 2355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 atgaatttga gtttgtgtat agcatctcca ctattgacca aatctaatag accagctgct 60 ttatcagcaa ttcatacagc tagtacatcc catggtggcc aaaccaaccc tacgaatctg 120 ataatcgata cgaccaagga gagaatacaa aaacaattca aaaatgttga aatttcagtt 180 tcttcttatg atactgcgtg ggttgccatg gttccatcac ctaattctcc aaagtctcca 240 tgtttcccag aatgtttgaa ttggctgatt aacaaccagt tgaatgatgg atcttggggt 300 ttagtcaatc acacgcacaa tcacaaccat ccacttttga aagattcttt atcctcaact 360 ttggcttgca tcgtggccct aaagagatgg aacgtaggtg aggatcagat taacaagggg 420 cttagtttca ttgaatctaa cttggcttcc gcgactgaaa aatctcaacc atctccaata 480 ggattcgata tcatctttcc aggtctgtta gagtacgcca aaaatctaga tatcaactta 540 ctgtctaagc aaactgattt ctcactaatg ttacacaaga gagaattaga acaaaagaga 600 tgtcattcaa acgaaatgga tggttaccta gcttatatct ctgaaggtct tggtaatctt 660 tacgattgga atatggtgaa aaagtaccag atgaaaaatg gctcagtttt caattcccct 720 tctgcaactg cggcagcatt cattaaccat caaaatccag gatgcctgaa ctatttgaat 780 tcactactag acaaattcgg caacgcagtt ccaactgtat accctcacga 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cagctaggaa acctttgatg aagattcatg atgctaagat gagtagattc 540 aggccagaat acttgtatgg caaacaacca atgaccgcct tacattcatt agaggctttc 600 ataggcaaaa tcgacttcga taaggtaaga caccaccgta cccatgggtc tatgatgggt 660 tctccttcat ctaccgcagc ctacttaatg cacgcttcac aatgggatgg tgactcagag 720 gcttacctta gacacgtgat taaacacgca gcagggcagg gaactggtgc tgtaccatct 780 gctttcccat caacacattt tgagtcatct tggattctta ccacattgtt tagagctgga 840 ttttcagctt ctcatcttgc ctgtgatgag ttgaacaagt tggtcgagat acttgagggc 900 tcattcgaga aggaaggtgg ggcaatcggt tacgctccag ggtttcaagc agatgttgat 960 gatactgcta aaacaataag tacattagca gtccttggaa gagatgctac accaagacaa 1020 atgatcaagg tatttgaagc taatacacat tttagaacat accctggtga aagagatcct 1080 tctttgacag ctaattgtaa tgctctatca gccttactac accaaccaga tgcagcaatg 1140 tatggatctc aaattcaaaa gattaccaaa tttgtctgtg actattggtg gaagtctgat 1200 ggtaagatta aagataagtg gaacacttgc tacttgtacc catctgtctt attagttgag 1260 gttttggttg atcttgttag tttattggag cagggtaaat tgcctgatgt tttggatcaa 1320 gagcttcaat acagagtcgc catcacattg ttccaagcat gtttaaggcc attactagac 1380 caagatgccg aaggatcatg gaacaagtct atcgaagcca cagcctacgg catccttatc 1440 ctaactgaag ctaggagagt ttgtttcttc gacagattgt ctgagccatt gaatgaggca 1500 atccgtagag gtatcgcttt cgccgactct atgtctggaa ctgaagctca gttgaactac 1560 atttggatcg aaaaggttag ttacgcacct gcattattga ctaaatccta tttgttagca 1620 gcaagatggg ctgctaagtc tcctttaggc gcttccgtag gctcttcttt gtggactcca 1680 ccaagagaag gattggataa gcatgtcaga ttattccatc aagctgagtt attcagatcc 1740 cttccagaat gggaattaag agcctccatg attgaagcag ctttgttcac accacttcta 1800 agagcacata gactagacgt tttccctaga caagatgtag gtgaagacaa atatcttgat 1860 gtagttccat tcttttggac tgccgctaac aacagagata gaacttacgc ttccactcta 1920 ttcctttacg atatgtgttt tatcgcaatg ttaaacttcc agttagacga attcatggag 1980 gccacagccg gtatcttatt cagagatcat atggatgatt tgaggcaatt gattcatgat 2040 cttttggcag agaaaacttc cccaaagagt tctggtagaa gtagtcaggg cacaaaagat 2100 gctgactcag gtatagagga agacgtgtca atgtccgatt cagcttcaga ttcccaggat 2160 agaagtccag aatacgactt 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 atggcttcta gtacacttat ccaaaacaga tcatgtggcg tcacatcatc tatgtcaagt 60 tttcaaatct tcagaggtca accactaaga tttcctggca ctagaacccc agctgcagtt 120 caatgcttga aaaagaggag atgccttagg ccaaccgaat ccgtactaga atcatctcct 180 ggctctggtt catatagaat agtaactggc ccttctggaa ttaaccctag ttctaacggg 240 cacttgcaag agggttcctt gactcacagg ttaccaatac caatggaaaa atctatcgat 300 aacttccaat ctactctata tgtgtcagat atttggtctg aaacactaca gagaactgaa 360 tgtttgctac aagtaactga aaacgtccag atgaatgagt ggattgagga aattagaatg 420 tactttagaa atatgacttt aggtgaaatt tccatgtccc cttacgacac tgcttgggtg 480 gctagagttc cagcgttgga cggttctcat gggcctcaat tccacagatc tttgcaatgg 540 attatcgaca accaattacc agatggggac tggggcgaac cttctctttt cttgggttac 600 gatagagttt gtaatacttt agcctgtgtg attgcgttga aaacatgggg tgttggggca 660 caaaacgttg aaagaggaat tcagttccta caatctaaca tatacaagat ggaggaagat 720 gacgctaatc atatgccaat aggattcgaa atcgtattcc ctgctatgat ggaagatgcc 780 aaagcattag gtttggattt gccatacgat 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 atggatgctg tgacgggttt gttaactgtc ccagcaaccg ctataactat tggtggaact 60 gctgtagcat tggcggtagc gctaatcttt tggtacctga aatcctacac atcagctaga 120 agatcccaat caaatcatct tccaagagtg cctgaagtcc caggtgttcc attgttagga 180 aatctgttac aattgaagga gaaaaagcca tacatgactt ttacgagatg ggcagcgaca 240 tatggaccta tctatagtat caaaactggg gctacaagta tggttgtggt atcatctaat 300 gagatagcca aggaggcatt ggtgaccaga ttccaatcca tatctacaag gaacttatct 360 aaagccctga aagtacttac agcagataag acaatggtcg caatgtcaga ttatgatgat 420 tatcataaaa cagttaagag acacatactg accgccgtct tgggtcctaa tgcacagaaa 480 aagcatagaa ttcacagaga tatcatgatg gataacatat ctactcaact tcatgaattc 540 gtgaaaaaca acccagaaca ggaagaggta gaccttagaa aaatctttca atctgagtta 600 ttcggcttag ctatgagaca agccttagga aaggatgttg aaagtttgta cgttgaagac 660 ctgaaaatca ctatgaatag agacgaaatc tttcaagtcc ttgttgttga tccaatgatg 720 ggagcaatcg atgttgattg gagagacttc tttccatacc taaagtgggt cccaaacaaa 780 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 atggcatttt tctctatgat ttcaattttg ttgggatttg ttatttcttc tttcatcttc 60 atctttttct tcaaaaagtt acttagtttt agtaggaaaa acatgtcaga agtttctact 120 ttgccaagtg ttccagtagt gcctggtttt ccagttattg ggaatttgtt gcaactaaag 180 gagaaaaagc ctcataaaac tttcactaga tggtcagaga tatatggacc tatctactct 240 ataaagatgg gttcttcatc tcttattgta ttgaacagta cagaaactgc taaggaagca 300 atggtcacta gattttcatc aatatctacc agaaaattgt caaacgccct aacagttcta 360 acctgcgata agtctatggt cgccacttct gattatgatg acttccacaa attagttaag 420 agatgtttgc taaatggact tcttggtgct aatgctcaaa agagaaaaag acactacaga 480 gatgctttga ttgaaaatgt gagttccaag ctacatgcac acgctagaga tcatccacaa 540 gagccagtta actttagagc aattttcgaa cacgaattgt ttggtgtagc attaaagcaa 600 gccttcggta aagacgtaga atccatatac gtcaaggagt taggcgtaac attatcaaaa 660 gatgaaatct ttaaggtgct tgtacatgat atgatggagg gtgcaattga tgtagattgg 720 agagatttct tcccatattt gaaatggatc cctaataagt cttttgaagc taggatacaa 780 caaaagcaca agagaagact agctgttatg aacgcactta 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taacttctac 540 aagtggttca cagaaggcga cgataaaggt gaatggctga aaaagttaca atacggagta 600 tttggtttag gtaacagaca atatgaacat ttcaacaaga tcgctattgt agttgatgat 660 aaacttactg aaatgggagc caaaagatta gtaccagtag gattagggga tgatgatcag 720 tgtatagaag atgacttcac cgcctggaag gaattggtat ggccagaatt ggatcaactt 780 ttaagggacg aagatgatac ttctgtgact accccataca ctgcagccgt attggagtac 840 agagtggttt accatgataa accagcagac tcatatgctg aagatcaaac ccatacaaac 900 ggtcatgttg ttcatgatgc acagcatcct tcaagatcta atgtggcttt caaaaaggaa 960 ctacacacct ctcaatcaga taggtcttgt actcacttag aattcgatat ttctcacaca 1020 ggactgtctt acgaaactgg cgatcacgtt ggcgtttatt ccgagaactt gtccgaagtt 1080 gtcgatgaag cactaaaact gttagggtta tcaccagaca catacttctc agtccatgct 1140 gataaggagg atgggacacc tatcggtggt gcttcactac caccaccttt tcctccttgc 1200 acattgagag acgctctaac cagatacgca gatgtcttat cctcacctaa aaaggtagct 1260 ttgctggcat tggctgctca tgctagtgat cctagtgaag ccgataggtt aaagttcctg 1320 gcttcaccag ccggaaaaga tgaatatgca caatggatcg tcgccaacca acgttctttg 1380 ctagaagtga tgcaaagttt tccatctgcc aagcctccat taggtgtgtt cttcgcagca 1440 gtagctccac gtttacaacc aagatactac tctatcagtt catctcctaa gatgtctcct 1500 aacagaatac atgttacatg tgctttggtg tacgagacta ctccagcagg cagaattcac 1560 agaggattgt gttcaacctg gatgaaaaat gctgtccctt taacagagtc acctgattgc 1620 tctcaagcat ccattttcgt tagaacatca aatttcagac ttccagtgga tccaaaagtt 1680 ccagtcatta tgataggacc aggcactggt cttgccccat tcaggggctt tcttcaagag 1740 agattggcct tgaaggaatc tggtacagaa ttgggttctt ctatcttttt ctttggttgc 1800 cgtaatagaa aagttgactt tatctacgag gacgagctta acaattttgt tgagacagga 1860 gcattgtcag aattgatcgt cgcattttca agagaaggga ctgccaaaga gtacgttcag 1920 cacaagatga gtcaaaaagc ctccgatata tggaaacttc taagtgaagg tgcctatctt 1980 tatgtctgtg gcgatgcaaa gggcatggcc aaggatgtcc atagaactct gcatacaatt 2040 gttcaggaac aagggagtct ggattcttcc aaggctgaat tgtacgtcaa aaacttacag 2100 atgtctggaa gatacttaag agatgtttgg taa 2133 <210> 71 <211> 2079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 atgacttctg cactttatgc ctccgatctt ttcaaacaat tgaaaagtat catgggaacg 60 gattctttgt ccgatgatgt tgtattagtt attgctacaa cttctctggc actggttgct 120 ggtttcgttg tcttattgtg gaaaaagacc acggcagatc gttccggcga gctaaagcca 180 ctaatgatcc ctaagtctct gatggcgaaa gatgaggatg atgacttaga tctaggttct 240 ggaaaaacga gagtctctat cttcttcggc acacaaaccg gaacagccga aggattcgct 300 aaagcacttt cagaagagat caaagcaaga tacgaaaagg cggctgtaaa agtaatcgat 360 ttggatgatt acgctgccga tgatgaccaa tatgaggaaa agttgaaaaa ggaaacattg 420 gctttctttt gtgtagccac gtatggtgat ggtgaaccaa ccgataacgc cgcaagattc 480 tacaagtggt ttactgaaga gaacgaaaga gatatcaagt tgcagcaact tgcttacggc 540 gtttttgcct taggtaacag acaatacgag cactttaaca agataggtat tgtcttagat 600 gaagagttat gcaaaaaggg tgcgaagaga ttgattgaag tcggtttagg agatgatgat 660 caatctatcg aggatgactt taatgcatgg aaggaatctt tgtggtctga attagataag 720 ttacttaagg acgaagatga taaatccgtt gccactccat acacagccgt cattccagaa 780 tatagagtag ttactcatga tccaagattc acaacacaga 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ctccattcag aggtttctta 1680 caagagagaa tggccttaaa ggaggatggt gaagagttgg gatcttcttt gttgtttttc 1740 ggctgtagaa acagacaaat ggatttcatc tacgaagatg aactgaataa ctttgtagat 1800 caaggagtta tttcagagtt gataatggct ttttctagag aaggtgctca gaaggagtac 1860 gtccaacaca aaatgatgga aaaggccgca caagtttggg acttaatcaa agaggaaggc 1920 tatctatatg tctgtggtga tgcaaagggt atggcaagag atgttcacag aacacttcat 1980 actatagtcc aggaacagga aggcgttagt tcttctgaag cggaagcaat tgtgaaaaag 2040 ttacaaacag agggaagata cttgagagat gtgtggtaa 2079 <210> 72 <211> 2142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 atggcagaat tagatacact tgatatagta gtattaggtg ttatcttttt gggtactgtg 60 gcatacttta ctaagggtaa attgtggggt gttaccaagg atccatacgc taacggattc 120 gctgcaggtg gtgcttccaa gcctggcaga actagaaaca tcgtcgaagc tatggaggaa 180 tcaggtaaaa actgtgttgt tttctacggc agtcaaacag gtacagcgga ggattacgca 240 tcaagacttg caaaggaagg aaagtccaga ttcggtttga acactatgat cgccgatcta 300 gaagattatg 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tggcgctcac cgcatcggtg aagctggtga gggtgatgat 600 ggtgctggta ccatggaaga ggacttcttg gcctggaagg atcccatgtg ggaagccctc 660 gctaagaaaa tgggactgga agagcgtgaa gcagtctacg agcctatttt tgccattaac 720 gaacgcgacg acctgactcc tgaagccaat gaagtgtatc tcggtgagcc caacaagctg 780 catctcgaag gcaccgccaa gggaccattc aactctcaca acccctacat tgcccctatc 840 gctgaatctt atgagttgtt ctccgccaag gacagaaact gcctccacat ggaaattgac 900 atcagcggtt ctaacctcaa gtacgaaact ggagaccata ttgctatctg gcctaccaac 960 cctggtgagg aggtcaacaa attcctggat attctcgacc tctctggaaa gcagcacagc 1020 gttgtcactg tcaaggctct cgagcctacc gccaaggttc ctttccccaa ccctacaacc 1080 tacgatgcca ttctgcgata ccacctcgag atctgcgctc ctgtttcacg tcaattcgtc 1140 tctactctcg ccgcatttgc tcccaacgat gatatcaagg ctgagatgaa ccgccttggc 1200 agcgataagg attatttcca cgagaagact ggcccgcatt actacaacat tgcccgtttc 1260 cttgccagcg tcagcaaggg cgagaagtgg accaaaatcc cgttctctgc cttcatcgag 1320 ggtctcacca agctccagcc ccgttactac tccatttctt cctcgtctct ggttcagccc 1380 aagaaaatct cgatcactgc cgtcgttgaa tcccagcaga ttcctggccg ggatgatcct 1440 ttccgtggtg ttgctacaaa ctatcttttt gccctaaagc aaaagcagaa cggtgacccc 1500 aaccctgcac cttttggtca gagctacgag cttacaggcc cccgcaataa gtatgatggc 1560 atccacgttc ctgtccatgt tcgtcactcc aacttcaagc tcccctcgga ccccggtaag 1620 cccatcatca tgattggtcc tggtactggt gtcgctccct tccgcggttt cgtgcaggag 1680 cgtgctaagc aagcccgtga tggtgttgag gttggaaaga cactcttgtt ctttggttgc 1740 cgaaagtcaa ccgaggattt catgtaccaa aaggagtggc aggaatacaa ggaggctctt 1800 ggcgataagt ttgaaatgat caccgccttt tctcgagagg gctccaagaa ggtttatgtt 1860 cagcaccgac ttaaggagcg atctaaggag gtcagcgatc tgctctccca gaaggcttat 1920 ttctatgtct gcggtgatgc agcccacatg gcccgcgagg tcaataccgt cttggcacaa 1980 atcattgccg agggacgtgg ggtgtctgag gccaagggcg aggagatcgt gaagaacatg 2040 agatcagcga accaatacca ggtatgtagt gactttgtta ctcttcactg caaagaaacc 2100 acatatgcta actcagaatt acaggaggat gtttggtcat ag 2142 <210> 76 <211> 459 <212> PRT <213> Ipomoea purpurea <400> 76 Met Gly Ser Gln Ala Thr Thr Tyr His Met Ala Met Tyr Pro Trp Phe 1 5 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tccagaagcc agtcttgtta 720 gccggtccag ctttgccagt cccatccaaa tccactatgg aacaaaagtg gtcagattgg 780 ttggggaaat tcaaggaagg ctccgtcatc tactgtgctt tcgggtctga atgtacattg 840 agaaaggaca aatttcagga acttttatgg ggtttggaat tgacaggaat gcctttcttc 900 gctgctctga agccaccttt tgagactgag tctgttgagg ctgctatccc tgaggaacta 960 aaggaaaaga ttcagggaag aggtatagta catggagaat gggtacaaca acaattgttt 1020 cttcaacacc catctgtcgg gtgcttcgtt tctcactgcg gctgggcaag tttatctgaa 1080 gcccttgtta atgattgtca aatcgtgtta cttccacaag ttggcgatca gattatcaac 1140 gccagaataa tgtcagtatc acttaaagtg ggcgtggaag ttgaaaaggg tgaggaggac 1200 ggtgtctttt caagagaatc tgtgtgcaag gctgttaaag cagtaatgga tgaaaaatct 1260 gaaatcggta gagaagtcag aggtaatcat gataaactga ggggtttctt gatgaatgca 1320 gacttagatt caaagtacat ggattcattc aatcaaaagc tacaagattt gctaggttaa 1380 <210> 78 <211> 438 <212> PRT <213> Bellis perennis <400> 78 Met Asp Ser Lys Ile Asp Ser Lys Thr Phe Arg Val Val Met Leu Pro 1 5 10 15 Trp Leu Ala Tyr Ser His Ile Ser Ser Phe Leu Val Phe Ala Lys Arg 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His Ile Trp Ile Met Lys Trp Leu Asp Lys Lys Glu Glu Ser Ser 245 250 255 Val Val Phe Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Ile Leu Ser Asp Asn Glu 260 265 270 Ile Glu Asp Ile Ala Tyr Gly Leu Glu Leu Ser Gln Val Ser Phe Val 275 280 285 Trp Ala Ile Arg Ala Lys Thr Ser Ala Leu Asn Gly Phe Ile Asp Arg 290 295 300 Val Gly Asp Lys Gly Leu Val Ile Asp Lys Trp Val Pro Gln Ala Asn 305 310 315 320 Ile Leu Ser His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp 325 330 335 Ser Ser Thr Met Glu Ser Ile Arg Tyr Gly Val Pro Ile Ile Ala Met 340 345 350 Pro Met Gln Phe Asp Gln Pro Tyr Asn Ala Arg Leu Met Glu Thr Val 355 360 365 Gly Ala Gly Ile Glu Val Gly Arg Asp Gly Glu Gly Arg Leu Lys Arg 370 375 380 Glu Glu Ile Ala Ala Val Val Arg Lys Val Val Val Glu Asp Ser Gly 385 390 395 400 Glu Ser Ile Arg Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Glu Ile Met Lys Lys 405 410 415 Asn Met Glu Ala Glu Val Asp Gly Ile Val Ile Glu Asn Leu Val Lys 420 425 430 Leu Cys Glu Met Asn Asn 435 <210> 79 <211> 1317 <212> DNA <213> Bellis perennis 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aagtaagttt cgtttgggca ataagagcta agacttctgc cttaaatggc 900 ttcattgata gagtgggtga taaaggctta gtcatcgata aatgggttcc acaggctaac 960 atcttatctc actcttctac tggtggattc attagtcatt gcggttggtc atcaacaatg 1020 gaatctatta gatatggggt tcctattatc gccatgccaa tgcaattcga tcaaccttac 1080 aatgctaggt tgatggaaac tgttggtgca ggtatcgaag ttggcagaga tggcgaaggt 1140 agattgaaaa gagaagagat tgctgccgtg gttagaaagg tcgttgttga agattctggg 1200 gaatccataa gggagaaggc aaaggaattg ggagaaatca tgaaaaaaaa catggaggcc 1260 gaagtagatg gtatagtgat tgaaaatcta gttaagctat gtgagatgaa caattaa 1317 <210> 80 <211> 2490 <212> DNA <213> Zea mays <400> 80 atggttttgt cttcttcttg tactacagta ccacacttat cttcattagc tgtcgtgcaa 60 cttggtcctt ggagcagtag gattaaaaag aaaaccgata ctgttgcagt accagccgct 120 gcaggaaggt ggagaagggc cttggctaga gcacagcaca catcagaatc cgcagctgtc 180 gcaaagggca gcagtttgac ccctatagtg agaactgacg ctgagtcaag gagaacaaga 240 tggccaaccg atgacgatga cgccgaacct ttagtggatg agatcagggc aatgcttact 300 tccatgtctg atggtgacat ttccgtgagc gcatacgata 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cgctgccgat 2040 agcgtgtgca atggtagttc tgcagtagaa caagagggat caagaatggt ccatgataaa 2100 cagacctgtc tattattggc tagaatgatc gaaatttctg ccggtagggc agctggtgaa 2160 gcagccagtg aggacggcga tagaagaata attcaattaa caggctccat ctgcgacagt 2220 cttaagcaaa aaatgctagt ttcacaggac cctgaaaaaa atgaagagat gatgtctcac 2280 gtggatgacg aattgaagtt gaggattaga gagttcgttc aatatttgct tagactaggt 2340 gaaaaaaaga ctggatctag cgaaaccagg caaacatttt taagtatagt gaaatcatgt 2400 tactatgctg ctcattgccc acctcatgtc gttgatagac acattagtag agtgattttc 2460 gagccagtaa gtgccgcaaa gtaaccgcgg 2490 <210> 81 <211> 827 <212> PRT <213> Zea mays <400> 81 Met Val Leu Ser Ser Ser Cys Thr Thr Val Pro His Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ala Val Val Gln Leu Gly Pro Trp Ser Ser Arg Ile Lys Lys Lys Thr 20 25 30 Asp Thr Val Ala Val Pro Ala Ala Ala Gly Arg Trp Arg Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Arg Ala Gln His Thr Ser Glu Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly Ser 50 55 60 Ser Leu Thr Pro Ile Val Arg Thr Asp Ala Glu Ser Arg Arg Thr Arg 65 70 75 80 Trp Pro Thr Asp Asp Asp Asp 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catcccaata agagagagtt tactgaggtc aatagaaacc 300 aactttttgg atcgtttcat tgacttggtc acaaaacttc cagacccacc aacttgcata 360 atctctgatg gctttctgtc agtgtttact atcgacgctg ccaaaaagtt gggtatccca 420 gttatgatgt actggactct tgctgcatgc ggtttcatgg gtttctatca catccattct 480 cttatcgaaa agggttttgc tccactgaaa gatgcatcat acttaaccaa cggctacctg 540 gatactgtta ttgactgggt accaggtatg gaaggtataa gacttaaaga ttttcctttg 600 gattggtcta cagaccttaa tgataaagta ttgatgttta ctacagaagc tccacaaaga 660 tctcataagg tttcacatca tatctttcac acctttgatg aattggaacc atcaatcatc 720 aaaaccttgt ctctaagata caatcatatc tacactattg gtccattaca attacttcta 780 gatcaaattc ctgaagagaa aaagcaaact ggtattacat ccttacacgg ctactcttta 840 gtgaaagagg aaccagaatg ttttcaatgg ctacaaagta aagagcctaa ttctgtggtc 900 tacgtcaact tcggaagtac aacagtcatg tccttggaag atatgactga atttggttgg 960 ggccttgcta attcaaatca ttactttcta tggattatca ggtccaattt ggtaataggg 1020 gaaaacgccg tattacctcc agaattggag gaacacatca aaaagagagg tttcattgct 1080 tcctggtgtt ctcaggaaaa ggtattgaaa catccttctg ttggtggttt ccttactcat 1140 tgcggttggg gctctacaat cgaatcacta agtgcaggag ttccaatgat ttgttggcca 1200 tattcatggg accaacttac aaattgtagg tatatctgta aagagtggga agttggatta 1260 gaaatgggaa caaaggttaa acgtgatgaa gtgaaaagat tggttcagga gttgatgggg 1320 gaaggtggcc acaagatgag aaacaaggcc aaagattgga aggaaaaagc cagaattgct 1380 attgctccta acgggtcatc ctctctaaac attgataaga tggtcaaaga gattacagtc 1440 ttagccagaa actaagtcga c 1461 <210> 83 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 actagtaaaa tggcagagca acaaaagatc aaaaagtcac ctcacgtctt acttattcca 60 tttcctctgc aaggacatat caacccattc atacaatttg ggaaaagatt gattagtaag 120 ggtgtaaaga caacactggt aaccactatc cacactttga attctactct gaaccactca 180 aatactacta ctacaagtat agaaattcaa gctatatcag acggatgcga tgagggtggc 240 tttatgtctg ccggtgaatc ttacttggaa acattcaagc aagtgggatc caagtctctg 300 gccgatctaa tcaaaaagtt acagagtgaa ggcaccacaa ttgacgccat aatctacgat 360 tctatgacag agtgggtttt agacgttgct atcgaatttg gtattgatgg aggttccttt 420 ttcacacaag catgtgttgt gaattctcta tactaccatg tgcataaagg gttaatctct 480 ttaccattgg gtgaaactgt ttcagttcca ggttttccag tgttacaacg ttgggaaacc 540 ccattgatct tacaaaatca tgaacaaata caatcacctt ggtcccagat gttgtttggt 600 caattcgcta acatcgatca agcaagatgg gtctttacta attcattcta taagttagag 660 gaagaggtaa ttgaatggac taggaagatc tggaatttga aagtcattgg tccaacattg 720 ccatcaatgt atttggacaa aagacttgat gatgataaag ataatggttt caatttgtac 780 aaggctaatc atcacgaatg tatgaattgg ctggatgaca aaccaaagga atcagttgta 840 tatgttgctt tcggctctct tgttaaacat ggtccagaac aagttgagga gattacaaga 900 gcacttatag actctgacgt aaactttttg tgggtcatta agcacaaaga ggaggggaaa 960 ctgccagaaa acctttctga agtgataaag accggaaaag gtctaatcgt tgcttggtgt 1020 aaacaattgg atgttttagc tcatgaatct gtaggctgtt ttgtaacaca ttgcggattc 1080 aactctacac tagaagccat ttccttaggc gtacctgtcg ttgcaatgcc tcagttctcc 1140 gatcagacaa ccaacgctaa acttttggac gaaatactag gggtgggtgt cagagttaaa 1200 gcagacgaga atggtatcgt cagaagaggg aacctagctt catgtatcaa aatgatcatg 1260 gaagaggaaa gaggagttat cataaggaaa aacgcagtta agtggaagga tcttgcaaag 1320 gttgccgtcc atgaaggcgg ctcttcagat aatgatattg ttgaatttgt gtccgaacta 1380 atcaaagcct aagtcgac 1398 <210> 84 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 actagtaaaa tggctacatc tgattctatt gttgatgaca ggaagcagtt gcatgtggct 60 actttccctt ggcttgcttt cggtcatata ctgccttacc tacaactatc aaaactgata 120 gctgaaaaag gacataaagt gtcattcctt tcaacaacta gaaacattca aagattatct 180 tcccacatat caccattgat taacgtcgtt caattgacac ttccaagagt acaggaatta 240 ccagaagatg ctgaagctac aacagatgtg catcctgaag atatccctta cttgaaaaag 300 gcatccgatg gattacagcc tgaggtcact agattccttg agcaacacag tccagattgg 360 atcatatacg actacactca ctattggttg ccttcaattg cagcatcact aggcatttct 420 agggcacatt tcagtgtaac cacaccttgg gccattgctt acatgggtcc atccgctgat 480 gctatgatta acggcagtga tggtagaact accgttgaag atttgacaac cccaccaaag 540 tggtttccat ttccaactaa 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gctattgatc atgaatccta agtcgac 1437 <210> 85 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 actagtaaaa tggaaaacaa gaccgaaaca acagttagac gtaggcgtag aatcattctg 60 tttccagtac cttttcaagg gcacatcaat ccaatactac aactagccaa cgttttgtac 120 tctaaaggtt tttctattac aatctttcac accaatttca acaaaccaaa aacatccaat 180 tacccacatt tcacattcag attcatactt gataatgatc cacaagatga acgtatttca 240 aacttaccta cccacggtcc tttagctgga atgagaattc caatcatcaa tgaacatggt 300 gccgatgagc ttagaagaga attagagtta cttatgttgg catccgaaga ggacgaggaa 360 gtctcttgtc tgattactga cgctctatgg tactttgccc aatctgtggc tgatagtttg 420 aatttgagga gattggtact aatgacatcc agtctgttta actttcacgc tcatgttagt 480 ttaccacaat ttgacgaatt gggatacttg gaccctgatg acaagactag gttagaggaa 540 caggcctctg gttttcctat gttgaaagtc aaagatatca agtctgccta ttctaattgg 600 caaatcttga aagagatctt aggaaagatg atcaaacaga caaaggcttc atctggagtg 660 atttggaaca gtttcaaaga gttagaagag tctgaattgg agactgtaat cagagaaatt 720 ccagcacctt cattcctgat accattacca aaacatttga ctgcttcctc ttcctctttg 780 ttggatcatg acagaacagt ttttcaatgg ttggaccaac aaccacctag ttctgttttg 840 tacgtgtcat ttggtagtac ttctgaagtc gatgaaaagg acttccttga aatcgcaaga 900 ggcttagtcg atagtaagca gtcattcctt tgggtcgtgc gtccaggttt cgtgaaaggc 960 tcaacatggg tcgaaccact tccagatggt tttctaggcg aaagaggtag aatagtcaaa 1020 tgggttcctc aacaggaagt tttagctcat ggcgctattg gggcattctg gactcattcc 1080 ggatggaatt caactttaga atcagtatgc gaaggggtac ctatgatctt ttcagatttt 1140 ggtcttgatc aaccactgaa cgcaagatac atgtctgatg ttttgaaagt gggtgtatat 1200 ctagaaaatg gctgggaaag gggtgaaata gctaatgcaa taagacgtgt tatggttgat 1260 gaagaggggg agtatatcag acaaaacgca agagtgctga agcaaaaggc cgacgtttct 1320 ctaatgaagg gaggctcttc atacgaatcc ttagaatctc ttgtttccta catttcatca 1380 ctgtaagtcg ac 1392 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Thr Ser Phe Ala Glu Tyr Trp Asn Leu Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 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tcctttggat tggtctacag accttaatga taaagtattg 780 atgtttacta cagaagctcc acaaagatct cataaggttt cacatcatat ctttcacacc 840 tttgatgaat tggaaccatc aatcatcaaa accttgtctc taagatacaa tcatatctac 900 actattggtc cattacaatt acttctagat caaattcctg aagagaaaaa gcaaactggt 960 attacatcct tacacggcta ctctttagtg aaagaggaac cagaatgttt tcaatggcta 1020 caaagtaaag agcctaattc tgtggtctac gtcaacttcg gaagtacaac agtcatgtcc 1080 ttggaagata tgactgaatt tggttggggc cttgctaatt caaatcatta ctttctatgg 1140 attatcaggt ccaatttggt aataggggaa aacgccgtat tacctccaga attggaggaa 1200 cacatcaaaa agagaggttt cattgcttcc tggtgttctc aggaaaaggt attgaaacat 1260 ccttctgttg gtggtttcct tactcattgc ggttggggct ctacaatcga atcactaagt 1320 gcaggagttc caatgatttg ttggccatat tcatgggacc aacttacaaa ttgtaggtat 1380 atctgtaaag agtgggaagt tggattagaa atgggaacaa aggttaaacg tgatgaagtg 1440 aaaagattgg ttcaggagtt gatgggggaa ggtggccaca agatgagaaa caaggccaaa 1500 gattggaagg aaaaagccag aattgctatt gctcctaacg ggtcatcctc tctaaacatt 1560 gataagatgg tcaaagagat tacagtctta 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ttatactatg aaagaggttc ttttttatct tggccagtat 180 attatgacta aacgattata tgatgagaag caacaacata ttgtatattg ttcaaatgat 240 cttctaggag atttgtttgg cgtgccaagc ttctctgtga aagagcacag gaaaatatat 300 accatgatct acaggaactt ggtagtagtc aatcagcagg aatcatcgga ctcaggtaca 360 tctgtgagtg agaacaggtg tcaccttgaa ggtgggagtg atcaaaagga ccttgtacaa 420 gagcttcagg aagagaaacc ttcatcttca catttggttt ctagaccatc taccggtggt 480 agcggatcct ctggaggcag tgctagtaaa atggcagagc aacaaaagat caaaaagtca 540 cctcacgtct tacttattcc atttcctctg caaggacata tcaacccatt catacaattt 600 gggaaaagat tgattagtaa gggtgtaaag acaacactgg taaccactat ccacactttg 660 aattctactc tgaaccactc aaatactact actacaagta tagaaattca agctatatca 720 gacggatgcg atgagggtgg ctttatgtct gccggtgaat cttacttgga aacattcaag 780 caagtgggat ccaagtctct ggccgatcta atcaaaaagt tacagagtga aggcaccaca 840 attgacgcca taatctacga ttctatgaca gagtgggttt tagacgttgc tatcgaattt 900 ggtattgatg gaggttcctt tttcacacaa gcatgtgttg tgaattctct atactaccat 960 gtgcataaag ggttaatctc tttaccattg ggtgaaactg tttcagttcc aggttttcca 1020 gtgttacaac gttgggaaac cccattgatc ttacaaaatc atgaacaaat acaatcacct 1080 tggtcccaga tgttgtttgg tcaattcgct aacatcgatc aagcaagatg ggtctttact 1140 aattcattct ataagttaga ggaagaggta attgaatgga ctaggaagat ctggaatttg 1200 aaagtcattg gtccaacatt gccatcaatg tatttggaca aaagacttga tgatgataaa 1260 gataatggtt tcaatttgta caaggctaat catcacgaat gtatgaattg gctggatgac 1320 aaaccaaagg aatcagttgt atatgttgct ttcggctctc ttgttaaaca tggtccagaa 1380 caagttgagg agattacaag agcacttata gactctgacg taaacttttt gtgggtcatt 1440 aagcacaaag aggaggggaa actgccagaa aacctttctg aagtgataaa gaccggaaaa 1500 ggtctaatcg ttgcttggtg taaacaattg gatgttttag ctcatgaatc tgtaggctgt 1560 tttgtaacac attgcggatt caactctaca ctagaagcca tttccttagg cgtacctgtc 1620 gttgcaatgc ctcagttctc cgatcagaca accaacgcta aacttttgga cgaaatacta 1680 ggggtgggtg tcagagttaa agcagacgag aatggtatcg tcagaagagg gaacctagct 1740 tcatgtatca aaatgatcat ggaagaggaa agaggagtta tcataaggaa aaacgcagtt 1800 aagtggaagg atcttgcaaa ggttgccgtc 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cctggggcaa tgttgtgaaa tgcctatcgg gtacgtccaa 660 gtgccagtag gtgtcgctgg acctttattg ttaaatggtg gggaattcat ggttccaatg 720 gctacaactg aaggctgtct tgtagcttcc actaatagag gttgtaaagc catatgctta 780 tcaggtggtg ccactgccat attgctaaaa gatggtatga caagagcccc agtagtgaga 840 ttcgccacag ctgagagagc ttcacaacta aagttttact tggaagatgg tgtcaatttc 900 gatacattgt ctgttgtctt taacaaaagt tcaagatttg ccagattgca aaacatccaa 960 tgctcaattg ccggtaaaaa cttgtacatt aggtttactt gctccacagg cgacgccatg 1020 ggtatgaaca tggtttcaaa aggagtacaa aatgtattag actttttaca aaatgatttt 1080 cctgatatgg acgtaattgg gatctcttgg aagttctgct ctgacaaaaa gccaacagct 1140 gtcaactgga ttgagggcag aggaaagtct gtcgttttcc aggccgtaat taccaaaaag 1200 gtggttagaa agtctgcact gaaccctcaa acttgcacat gtagaacttt gacctgttta 1260 agaccattat tggttctgct acttctggtt ttgctagtgg acttaatgca tatgcttcat 1320 atcgtgtctg ccgtgttcat cgctaccggt caagatccag ctcagaatat cgaatctagt 1380 cactgtatca ctatgatgga ggctgtcaac aatggtaagg atttgcacgt taatgttacg 1440 atgccatcta tagaagttgg cacggtggga ggtggcactc agctagcctc tcaatcagcc 1500 tgtttgaact tgcttggtgt aaagggtgcc tgtatagaat ccccaggatc aaacgcccag 1560 ttgttagcta gaatcgttgc tggttctgtt ctggcaggcg aattaagttt gatgtcagct 1620 ataagtgctg ggcaactagt taaatctcat atgaaataca ataggtctag tagagatatg 1680 tcagcaatag cttctaaggt ctaa 1704 <210> 112 <211> 567 <212> PRT <213> Artemisia annua <400> 112 Met Asp Leu Arg Arg Lys Leu Pro Pro Lys Pro Pro Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Lys Gln Pro Ser His Arg Ser His Ser Pro Thr Pro Ile Pro Lys 20 25 30 Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Thr Phe Phe 35 40 45 Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg 50 55 60 Asp Lys Ile Arg Ser Gly Thr Pro Leu His Val Val Thr Leu Thr Glu 65 70 75 80 Leu Ser Ala Ile Val Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly 85 90 95 Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Thr Ser Arg Glu Asn Glu 100 105 110 Gln Leu Asn Asn Asp Asp His Asn Val Val Ser Thr Asn Asn Val Leu 115 120 125 Ser Asp Arg Arg Leu Val Tyr Asp Tyr Gly Phe Asp Val Thr Gly 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ttctacagca acatttccct 720 tcaatggaaa tcctagccct aagtggtaat tactgtaccg acaaaaagcc atctgctgta 780 aattggattg atggcagagg taaatcagtg gttgcagaag ccactttatt ggctgatgtt 840 gtcgaagata ctctgaaatg tacagtcgat tctttggtat ccttgaatat cgacaaaaac 900 cttgttgggt cagctatggc tggttctgtt ggaggtttta acgcccaggc tgcaaacgct 960 gtggcagcca ttttcattgc aaccggtcaa gatcctgctc aagtggtaga aagttcaatg 1020 tgtatcacta caatgtccaa ggtaggtaac gatctattga tctctgtgac catgccttct 1080 atcgaggtcg gggtcgtggg aggagggact ggtcttgctg cccaaagagg atgcttagag 1140 ttaatagggt gcggaggccc atctaaggag tctcctggta ctaatgccca acttctaagt 1200 agagttgttg cagctggcgt tttatcagcc gaactttcct tgatgtccgg actggcagca 1260 ggtcatctat tgtcagcaca tatgagattg aacagaaaga agaaataa 1308 <210> 114 <211> 435 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 114 Met Phe Arg Arg Ala Ile Leu Leu Gly Cys Ser Ala Ala Lys Thr Pro 1 5 10 15 Trp Ser Glu Cys Ser Asn Ala Gln Leu Val Asp Ala Val Lys Ser Arg 20 25 30 Lys Ile Ser Phe Tyr Gly Leu Glu Gln Ala Leu Glu Pro Asp Tyr Arg 35 40 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atgcaatccc tggacaaaaa ctttagacac ttatcaagac aacagaagtt acaacagcta 60 gttgataaac aatggctatc agaggaacaa ttcaatattc tacttaacca cccacttatt 120 gatgaagagg tagcaaactc attgatagaa aatgtcatcg cacagggcgc actgcctgtt 180 ggtttactac caaatatcat cgttgatgac aaagcatacg tcgtgcctat gatggtggaa 240 gagccatctg ttgttgccgc tgcttcatac ggcgctaaat tggtgaacca aacaggtggt 300 ttcaaaaccg tgtcctcaga acgtatcatg ataggtcaaa tagtatttga tggagtcgat 360 gataccgaga aactgtctgc agatatcaag gctcttgaaa aacaaatcca tcagattgca 420 gatgaggctt acccttctat taaggccaga ggtggaggct atcaaaggat cgccatcgat 480 acattcccag aacaacagtt gctttcattg aaggttttcg ttgatactaa ggatgctatg 540 ggcgctaata tgttaaacac aatcctagaa gcaatcacag cctttttgaa aaacgaattc 600 ccacaatctg atatcttgat gtctatcctt tccaaccacg caacagccag tgttgtcaag 660 gtccagggtg aaatagacgt taaggatttg gcaagaggag aacgtactgg agaagaggtc 720 gctaagagaa tggaaagagc atctgtgtta gctcaagtgg acattcatag agcagcaaca 780 cacaataagg gtgttatgaa tggcattcat gctgtagtct tggctacagg taatgatact 840 agaggtgcag aagcctctgc tcacgcttac gcttccaaag acggtcaata tagagggata 900 gctacatgga gatacgatca agagagacaa aggttaatag gaactataga agttccaatg 960 actctggcca ttgttggtgg cggtaccaag gtactgccta ttgctaaggc ctctttagaa 1020 ctgttaaacg tagaaagtgc ccaagagttg ggacatgttg tcgctgccgt tggactagct 1080 caaaacttcg ctgcatgtag agctttggtt tccgaaggta ttcaacaagg gcatatgtct 1140 ttgcaataca agtctttagc catcgtagtc ggggctaagg gcgatgaaat tgctcaggta 1200 gccgaagcac taaagcaaga gccaagagca aacactcaag ttgcagagag aattttgcaa 1260 gatttgagaa gtcaacaata a 1281 <210> 116 <211> 426 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 116 Met Gln Ser Leu Asp Lys Asn Phe Arg His Leu Ser Arg Gln Gln Lys 1 5 10 15 Leu Gln Gln Leu Val Asp Lys Gln Trp Leu Ser Glu Glu Gln Phe Asn 20 25 30 Ile Leu Leu Asn His Pro Leu Ile Asp Glu Glu Val Ala Asn Ser Leu 35 40 45 Ile Glu Asn Val Ile Ala Gln Gly Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Pro 50 55 60 Asn Ile Ile Val Asp Asp Lys Ala Tyr Val Val Pro Met Met Val Glu 65 70 75 80 Glu Pro Ser Val Val Ala Ala Ala Ser Tyr Gly Ala Lys Leu Val 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acttggtata 240 gcaaccaatt tccttattga tggcaaggat tatctaatcc ctatggctat agaggaacca 300 tcagtagttg cagctgcttc taacgcagct agaatggcca gagagtctgg cgggtttaca 360 actgattaca cagggtccct gatgattggt caaattcaag tcacaaaact gttgaatcca 420 aatgcagcta agttcgaagt tctacgtcaa aaagacgaaa tcatagaaag agcaaatgag 480 tgtgatccaa tgttggtgaa tttgggcggt ggatgtaaag atatagaagc aagggtgatc 540 gatacaatca tgggtaagat gctaattgtt catctgatcg ttgatgttaa agacgctatg 600 ggtgcaaatg ctgtcaacac tatgtgtgaa aaagttgctc ctttcatcga acgtattact 660 gggggaaagg tctatcttag aatcatttcc aacttggctg catatagact tgctagagca 720 aaggccgttt ttgacaaaga cgttattggc ggagaggagg ttgtagaagg gatcatgctt 780 gcatacgcct tcgctgccgc tgacccattt cgttgcgcca cccacaataa gggtatcatg 840 aatggcatat cagccttaat gatcgctaca ggaaacgact ttagagccat tgaagcagga 900 gctcattcct atgctgcaat aggtggatac aaaccactaa ctacctacga agttgataga 960 aaaggtaatc tagtaggcac aattgaaata cctatggcag taggcgtgat tggtggtgca 1020 accaaagtca acccactagc caagatctct cttaagatac taggagtgaa cactgctgaa 1080 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aagattgtct ttactgcgta gaaaggatga gatcatagaa 420 ttagccaata ggaaggacca acttctgaat tcattgggcg gtggttgcag agacatagag 480 gtgcatacat ttgccgatac tccaagagga ccaatgcttg tagcacacct tattgtcgat 540 gtgcgtgatg ccatgggagc taatactgtt aacactatgg ctgaagcagt agcacctctg 600 atggaagcca taacaggtgg ccaggtaaga ttgagaatcc tttccaattt ggctgatctt 660 agattggcca gagcccaagt gagaatcact cctcagcaat tggaaactgc cgaattctca 720 ggtgaggcag taattgaggg tatcttggac gcatatgctt ttgccgctgt ggacccttac 780 agagccgcta cccacaacaa aggcataatg aacggtatcg atcctttgat cgtcgctaca 840 ggaaatgatt ggagagctgt tgaggcagga gctcatgcat acgcttgtag atccggacat 900 tacggttcat taacaacatg ggaaaaagat aacaatggac acttggtcgg gacattggaa 960 atgcctatgc cagttggttt agttgggggt gctacaaaaa cccatcctct tgctcaattg 1020 tctttgagga tacttggtgt caaaactgct caagcactag ccgaaattgc cgttgctgtt 1080 ggtttggcac aaaacttggg tgcaatgcgt gctttagcta cagaaggcat ccaaagagga 1140 catatggctc tacacgctag aaacattgca gttgttgcag gagccagagg tgatgaggtt 1200 gattgggtgg ctagacaact tgtcgaatat catgatgtca gagcagacag ggctgtggca 1260 ttactgaaac agaagagagg tcaataa 1287 <210> 120 <211> 428 <212> PRT <213> Pseudomonas mevalonii <400> 120 Met Ser Leu Asp Ser Arg Leu Pro Ala Phe Arg Asn Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ala Arg Leu Asp His Ile Gly Gln Leu Leu Gly Leu Ser His Asp Asp 20 25 30 Val Ser Leu Leu Ala Asn Ala Gly Ala Leu Pro Met Asp Ile Ala Asn 35 40 45 Gly Met Ile Glu Asn Val Ile Gly Thr Phe Glu Leu Pro Tyr Ala Val 50 55 60 Ala Ser Asn Phe Gln Ile Asn Gly Arg Asp Val Leu Val Pro Leu Val 65 70 75 80 Val Glu Glu Pro Ser Ile Val Ala Ala Ala Ser Tyr Met Ala Lys Leu 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Gly Gly Phe Thr Thr Ser Ser Ser Ala Pro Leu Met 100 105 110 His Ala Gln Val Gln Ile Val Gly Ile Gln Asp Pro Leu Asn Ala Arg 115 120 125 Leu Ser Leu Leu Arg Arg Lys Asp Glu Ile Ile Glu Leu Ala Asn Arg 130 135 140 Lys Asp Gln Leu Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Cys Arg Asp Ile Glu 145 150 155 160 Val His Thr Phe Ala Asp Thr Pro Arg Gly Pro Met Leu Val Ala His 165 170 175 Leu Ile Val Asp Val Arg Asp Ala 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Gibberella fujikuroi <400> 122 Met Ala Glu Gln Gln Ile Ser Asn Leu Leu Ser Met Phe Asp Ala Ser 1 5 10 15 His Ala Ser Gln Lys Leu Glu Ile Thr Val Gln Met Met Asp Thr Tyr 20 25 30 His Tyr Arg Glu Thr Pro Pro Asp Ser Ser Ser Ser Glu Gly Gly Ser 35 40 45 Leu Ser Arg Tyr Asp Glu Arg Arg Val Ser Leu Pro Leu Ser His Asn 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Asp Ile Val Ser Gln Leu Cys Phe Ser Thr Ala Met 65 70 75 80 Ser Ser Glu Leu Asn His Arg Trp Lys Ser Gln Arg Leu Lys Val Ala 85 90 95 Asp Ser Pro Tyr Asn Tyr Ile Leu Thr Leu Pro Ser Lys Gly Ile Arg 100 105 110 Gly Ala Phe Ile Asp Ser Leu Asn Val Trp Leu Glu Val Pro Glu Asp 115 120 125 Glu Thr Ser Val Ile Lys Glu Val Ile Gly Met Leu His Asn Ser Ser 130 135 140 Leu Ile Ile Asp Asp Phe Gln Asp Asn Ser Pro Leu Arg Arg Gly Lys 145 150 155 160 Pro Ser Thr His Thr Val Phe Gly Pro Ala Gln Ala Ile Asn Thr Ala 165 170 175 Thr Tyr Val Ile Val Lys Ala Ile Glu Lys Ile Gln Asp Ile Val Gly 180 185 190 His Asp Ala Leu Ala Asp Val Thr Gly Thr Ile Thr Thr Ile Phe Gln 195 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Saccharomyces cerevisiae <400> 166 Met Pro Phe Gly Ile Asp Asn Thr Asp Phe Thr Val Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Val Leu Ala Val Leu Leu Tyr Val Lys Arg Asn Ser Ile Lys Glu Leu 20 25 30 Leu Met Ser Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala Val Ser Ser Gly Asn Arg 35 40 45 Asp Ile Ala Gln Val Val Thr Glu Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Val Leu 50 55 60 Tyr Ala Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr Ala Lys Lys Phe Ser 65 70 75 80 Lys Glu Leu Val Ala Lys Phe Asn Leu Asn Val Met Cys Ala Asp Val 85 90 95 Glu Asn Tyr Asp Phe Glu Ser Leu Asn Asp Val Pro Val Ile Val Ser 100 105 110 Ile Phe Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Gly Asp Phe Pro Asp Gly Ala Val 115 120 125 Asn Phe Glu Asp Phe Ile Cys Asn Ala Glu Ala Gly Ala Leu Ser Asn 130 135 140 Leu Arg Tyr Asn Met Phe Gly Leu Gly Asn Ser Thr Tyr Glu Phe Phe 145 150 155 160 Asn Gly Ala Ala Lys Lys Ala Glu Lys His Leu Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ile Arg Leu Gly Lys Leu Gly Glu Ala Asp Asp Gly Ala Gly Thr Thr 180 185 190 Asp Glu Asp Tyr Met Ala Trp Lys Asp Ser Ile Leu Glu Val Leu Lys 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gtgtagccac gtatggtgat ggtgaaccaa ccgataacgc cgcaagattc 480 tacaagtggt ttactgaaga gaacgaaaga gatatcaagt tgcagcaact tgcttacggc 540 gtttttgcct taggtaacag acaatacgag cactttaaca agataggtat tgtcttagat 600 gaagagttat gcaaaaaggg tgcgaagaga ttgattgaag tcggtttagg agatgatgat 660 caatctatcg aggatgactt taatgcatgg aaggaatctt tgtggtctga attagataag 720 ttacttaagg acgaagatga taaatccgtt gccactccat acacagccgt cattccagaa 780 tatagagtag ttactcatga tccaagattc acaacacaga aatcaatgga aagtaatgtg 840 gctaatggta atactaccat cgatattcat catccatgta gagtagacgt tgcagttcaa 900 aaggaattgc acactcatga atcagacaga tcttgcatac atcttgaatt tgatatatca 960 cgtactggta tcacttacga aacaggtgat cacgtgggtg tctacgctga aaaccatgtt 1020 gaaattgtag aggaagctgg aaagttgttg ggccatagtt tagatcttgt tttctcaatt 1080 catgccgata aagaggatgg ctcaccacta gaaagtgcag tgcctccacc atttccagga 1140 ccatgcaccc taggtaccgg tttagctcgt tacgcggatc tgttaaatcc tccacgtaaa 1200 tcagctctag tggccttggc tgcgtacgcc acagaacctt ctgaggcaga aaaactgaaa 1260 catctaactt caccagatgg taaggatgaa tactcacaat ggatagtagc tagtcaacgt 1320 tctttactag aagttatggc tgctttccca tccgctaaac ctcctttggg tgttttcttc 1380 gccgcaatag cgcctagact gcaaccaaga tactattcaa tttcatcctc acctagactg 1440 gcaccatcaa gagttcatgt cacatccgct ttagtgtacg gtccaactcc tactggtaga 1500 atccataagg gcgtttgttc aacatggatg aaaaacgcgg ttccagcaga gaagtctcac 1560 gaatgttctg gtgctccaat ctttatcaga gcctccaact tcaaactgcc ttccaatcct 1620 tctactccta ttgtcatggt cggtcctggt acaggtcttg ctccattcag aggtttctta 1680 caagagagaa tggccttaaa ggaggatggt gaagagttgg gatcttcttt gttgtttttc 1740 ggctgtagaa acagacaaat ggatttcatc tacgaagatg aactgaataa ctttgtagat 1800 caaggagtta tttcagagtt gataatggct ttttctagag aaggtgctca gaaggagtac 1860 gtccaacaca aaatgatgga aaaggccgca caagtttggg acttaatcaa agaggaaggc 1920 tatctatatg tctgtggtga tgcaaagggt atggcaagag atgttcacag aacacttcat 1980 actatagtcc aggaacagga aggcgttagt tcttctgaag cggaagcaat tgtgaaaaag 2040 ttacaaacag agggaagata cttgagagat gtgtggtaa 2079 <210> 172 <211> 2139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis thaliana sequence that has been codon optimized for yeast <400> 172 atgtcttcct cttcctcttc cagtacctct atgattgatt tgatggctgc tattattaaa 60 ggtgaaccag ttatcgtctc cgacccagca aatgcctctg cttatgaatc agttgctgca 120 gaattgtctt caatgttgat cgaaaacaga caattcgcca tgatcgtaac tacatcaatc 180 gctgttttga tcggttgtat tgtcatgttg gtatggagaa gatccggtag tggtaattct 240 aaaagagtcg aacctttgaa accattagta attaagccaa gagaagaaga aatagatgac 300 ggtagaaaga aagttacaat atttttcggt acccaaactg gtacagctga aggttttgca 360 aaagccttag gtgaagaagc taaggcaaga tacgaaaaga ctagattcaa gatagtcgat 420 ttggatgact atgccgctga tgacgatgaa tacgaagaaa agttgaagaa agaagatgtt 480 gcatttttct ttttggcaac ctatggtgac ggtgaaccaa ctgacaatgc agccagattc 540 tacaaatggt ttacagaggg taatgatcgt ggtgaatggt tgaaaaactt aaagtacggt 600 gttttcggtt tgggtaacag acaatacgaa catttcaaca aagttgcaaa ggttgtcgac 660 gatattttgg tcgaacaagg tgctcaaaga ttagtccaag taggtttggg tgacgatgac 720 caatgtatag aagatgactt tactgcctgg agagaagctt tgtggcctga attagacaca 780 atcttgagag aagaaggtga caccgccgtt gctaccccat atactgctgc agtattagaa 840 tacagagttt ccatccatga tagtgaagac gcaaagttta atgatatcac tttggccaat 900 ggtaacggtt atacagtttt cgatgcacaa cacccttaca aagctaacgt tgcagtcaag 960 agagaattac atacaccaga atccgacaga agttgtatac acttggaatt tgatatcgct 1020 ggttccggtt taaccatgaa gttgggtgac catgtaggtg ttttatgcga caatttgtct 1080 gaaactgttg atgaagcatt gagattgttg gatatgtccc ctgacactta ttttagtttg 1140 cacgctgaaa aagaagatgg tacaccaatt tccagttctt taccacctcc attccctcca 1200 tgtaacttaa gaacagcctt gaccagatac gcttgcttgt tatcatcccc taaaaagtcc 1260 gccttggttg ctttagccgc tcatgctagt gatcctactg aagcagaaag attgaaacac 1320 ttagcatctc cagccggtaa agatgaatat tcaaagtggg tagttgaatc tcaaagatca 1380 ttgttagaag ttatggcaga atttccatct gccaagcctc cattaggtgt cttctttgct 1440 ggtgtagcac ctagattgca accaagattc tactcaatca gttcttcacc taagatcgct 1500 gaaactagaa ttcatgttac atgtgcatta gtctacgaaa agatgccaac cggtagaatt 1560 cacaagggtg tatgctctac ttggatgaaa aatgctgttc cttacgaaaa atcagaaaag 1620 ttgttcttag gtagaccaat cttcgtaaga caatcaaact tcaagttgcc ttctgattca 1680 aaggttccaa taatcatgat aggtcctggt acaggtttag ccccattcag aggtttcttg 1740 caagaaagat tggctttagt tgaatctggt gtcgaattag gtccttcagt tttgttcttt 1800 ggttgtagaa acagaagaat ggatttcatc tatgaagaag aattgcaaag attcgtcgaa 1860 tctggtgcat tggccgaatt atctgtagct ttttcaagag aaggtccaac taaggaatac 1920 gttcaacata agatgatgga taaggcatcc gacatatgga acatgatcag tcaaggtgct 1980 tatttgtacg tttgcggtga cgcaaagggt atggccagag atgtccatag atctttgcac 2040 acaattgctc aagaacaagg ttccatggat agtaccaaag ctgaaggttt cgtaaagaac 2100 ttacaaactt ccggtagata cttgagagat gtctggtga 2139 <210> 173 <211> 2130 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 173 atgcaatcgg aatccgttga agcatcgacg attgatttga tgactgctgt tttgaaggac 60 acagtgatcg atacagcgaa cgcatctgat aacggagact caaagatgcc gccggcgttg 120 gcgatgatgt tcgaaattcg tgatctgttg ctgattttga ctacgtcagt tgctgttttg 180 gtcggatgtt tcgttgtttt ggtgtggaag agatcgtccg ggaagaagtc cggcaaggaa 240 ttggagccgc cgaagatcgt tgtgccgaag aggcggctgg agcaggaggt tgatgatggt 300 aagaagaagg ttacgatttt cttcggaaca caaactggaa cggctgaagg tttcgctaag 360 gcacttttcg aagaagcgaa agcgcgatat gaaaaggcag cgtttaaagt gattgatttg 420 gatgattatg ctgctgattt ggatgagtat gcagagaagc tgaagaagga aacatatgct 480 ttcttcttct tggctacata tggagatggt gagccaactg ataatgctgc caaattttat 540 aaatggttta ctgagggaga cgagaaaggc gtttggcttc aaaaacttca atatggagta 600 tttggtcttg gcaacagaca atatgaacat ttcaacaaga ttggaatagt ggttgatgat 660 ggtctcaccg agcagggtgc aaaacgcatt gttcccgttg gtcttggaga cgacgatcaa 720 tcaattgaag acgatttttc ggcatggaaa gagttagtgt ggcccgaatt ggatctattg 780 cttcgcgatg aagatgacaa agctgctgca actccttaca cagctgcaat ccctgaatac 840 cgcgtcgtat ttcatgacaa acccgatgcg ttttctgatg atcatactca aaccaatggt 900 catgctgttc atgatgctca acatccatgc agatccaatg tggctgttaa aaaagagctt 960 catactcctg aatccgatcg ttcatgcaca catcttgaat ttgacatttc tcacactgga 1020 ttatcttatg aaactgggga tcatgttggt gtatactgtg aaaacctaat tgaagtagtg 1080 gaagaagctg ggaaattgtt aggattatca acagatactt atttctcgtt acatattgat 1140 aacgaagatg gttcaccact tggtggacct tcattacaac ctccttttcc tccttgtact 1200 ttaagaaaag cattgactaa ttatgcagat ctgttaagct ctcccaaaaa gtcaactttg 1260 cttgctctag ctgctcatgc ttccgatccc actgaagctg atcgtttaag atttcttgca 1320 tctcgcgagg gcaaggatga atatgctgaa tgggttgttg caaaccaaag aagtcttctt 1380 gaagtcatgg aagctttccc gtcagctaga ccgccacttg gtgttttctt tgcagcggtt 1440 gcaccgcgtt tacagcctcg ttactactct atttcttcct ccccaaagat ggaaccaaac 1500 aggattcatg ttacttgcgc gttggtttat gaaaaaactc ccgcaggtcg tatccacaaa 1560 ggaatctgct caacctggat gaagaacgct gtacctttga ccgaaagtca agattgcagt 1620 tgggcaccga tttttgttag aacatcaaac ttcagacttc caattgaccc gaaagtcccg 1680 gttatcatga ttggtcctgg aaccgggttg gctccattta ggggttttct tcaagaaaga 1740 ttggctctta aagaatccgg aaccgaactc gggtcatcta ttttattctt cggttgtaga 1800 aaccgcaaag tggattacat atatgagaat gaactcaaca actttgttga aaatggtgcg 1860 ctttctgagc ttgatgttgc tttctcccgc gatggcccga cgaaagaata cgtgcaacat 1920 aaaatgaccc aaaaggcttc tgaaatatgg aatatgcttt ctgagggagc atatttatat 1980 gtatgtggtg atgctaaagg catggctaaa gatgtacacc gtacacttca caccattgtg 2040 caagaacagg gaagtttgga ctcgtctaaa gcggagttgt atgtgaagaa tctacaaatg 2100 tcaggaagat acctccgtga tgtttggtaa 2130 <210> 174 <211> 2124 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 174 atgcaatcta actccgtgaa gatttcgccg cttgatctgg taactgcgct gtttagcggc 60 aaggttttgg acacatcgaa cgcatcggaa tcgggagaat ctgctatgct gccgactata 120 gcgatgatta tggagaatcg tgagctgttg atgatactca caacgtcggt tgctgtattg 180 atcggatgcg ttgtcgtttt ggtgtggcgg agatcgtcta cgaagaagtc ggcgttggag 240 ccaccggtga ttgtggttcc gaagagagtg caagaggagg aagttgatga tggtaagaag 300 aaagttacgg ttttcttcgg cacccaaact ggaacagctg aaggcttcgc taaggcactt 360 gttgaggaag ctaaagctcg atatgaaaag gctgtcttta aagtaattga tttggatgat 420 tatgctgctg atgacgatga gtatgaggag aaactaaaga aagaatcttt ggcctttttc 480 tttttggcta cgtatggaga tggtgagcca acagataatg ctgccagatt ttataaatgg 540 tttactgagg gagatgcgaa aggagaatgg cttaataagc ttcaatatgg agtatttggt 600 ttgggtaaca gacaatatga acattttaac aagatcgcaa aagtggttga tgatggtctt 660 gtagaacagg gtgcaaagcg tcttgttcct gttggacttg gagatgatga tcaatgtatt 720 gaagatgact tcaccgcatg gaaagagtta gtatggccgg agttggatca attacttcgt 780 gatgaggatg acacaactgt tgctactcca tacacagctg ctgttgcaga atatcgcgtt 840 gtttttcatg aaaaaccaga cgcgctttct gaagattata gttatacaaa tggccatgct 900 gttcatgatg ctcaacatcc atgcagatcc aacgtggctg tcaaaaagga acttcatagt 960 cctgaatctg accggtcttg cactcatctt gaatttgaca tctcgaacac cggactatca 1020 tatgaaactg gggaccatgt tggagtttac tgtgaaaact tgagtgaagt tgtgaatgat 1080 gctgaaagat tagtaggatt accaccagac acttactcct ccatccacac tgatagtgaa 1140 gacgggtcgc cacttggcgg agcctcattg ccgcctcctt tcccgccatg cactttaagg 1200 aaagcattga cgtgttatgc tgatgttttg agttctccca agaagtcggc tttgcttgca 1260 ctagctgctc atgccaccga tcccagtgaa gctgatagat tgaaatttct tgcatccccc 1320 gccggaaagg atgaatattc tcaatggata gttgcaagcc aaagaagtct ccttgaagtc 1380 atggaagcat tcccgtcagc taagccttca cttggtgttt tctttgcatc tgttgccccg 1440 cgcttacaac caagatacta ctctatttct tcctcaccca agatggcacc ggataggatt 1500 catgttacat gtgcattagt ctatgagaaa acacctgcag gccgcatcca caaaggagtt 1560 tgttcaactt ggatgaagaa cgcagtgcct atgaccgaga gtcaagattg cagttgggcc 1620 ccaatatacg tccgaacatc caatttcaga ctaccatctg accctaaggt cccggttatc 1680 atgattggac ctggcactgg tttggctcct tttagaggtt tccttcaaga gcggttagct 1740 ttaaaggaag ccggaactga cctcggttta tccattttat tcttcggatg taggaatcgc 1800 aaagtggatt tcatatatga aaacgagctt aacaactttg tggagactgg tgctctttct 1860 gagcttattg ttgctttctc ccgtgaaggc ccgactaagg aatatgtgca acacaagatg 1920 agtgagaagg cttcggatat ctggaacttg ctttctgaag gagcatattt atacgtatgt 1980 ggtgatgcca aaggcatggc caaagatgta catcgaaccc tccacacaat tgtgcaagaa 2040 cagggatctc ttgactcgtc aaaggcagaa ctctacgtga agaatctaca aatgtcagga 2100 agatacctcc gtgacgtttg gtaa 2124 <210> 175 <211> 2427 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 175 atggcaaacg ctgaacgtat gataacgcgc gtccacagcc aacgtgagcg tttgaacgaa 60 acgcttgttt ctgagagaaa cgaagtcctt gccttgcttt ccagggttga agccaaaggt 120 aaaggtattt tacaacaaaa ccagatcatt gctgaattcg aagctttgcc tgaacaaacc 180 cggaagaaac ttgaaggtgg tcctttcttt gaccttctca aatccactca ggaagcaatt 240 gtgttgccac catgggttgc tctagctgtg aggccaaggc ctggtgtttg ggaatactta 300 cgagtcaatc tccatgctct tgtcgttgaa gaactccaac ctgctgagtt tcttcatttc 360 aaggaagaac tcgttgatgg agttaagaat ggtaatttca ctcttgagct tgatttcgag 420 ccattcaatg cgtctatccc tcgtccaaca ctccacaaat acattggaaa tggtgttgac 480 ttccttaacc gtcatttatc ggctaagctc ttccatgaca aggagagttt gcttccattg 540 cttaagttcc ttcgtcttca cagccaccag ggcaagaacc tgatgttgag cgagaagatt 600 cagaacctca acactctgca acacaccttg aggaaagcag aagagtatct agcagagctt 660 aagtccgaaa cactgtatga agagtttgag gccaagtttg aggagattgg tcttgagagg 720 ggatggggag acaatgcaga gcgtgtcctt gacatgatac gtcttctttt ggaccttctt 780 gaggcgcctg atccttgcac tcttgagact tttcttggaa gagtaccaat ggtgttcaac 840 gttgtgatcc tctctccaca tggttacttt gctcaggaca atgttcttgg ttaccctgac 900 actggtggac aggttgttta cattcttgat caagttcgtg ctctggagat agagatgctt 960 caacgtatta agcaacaagg actcaacatt aaaccaagga ttctcattct aactcgactt 1020 ctacctgatg cggtaggaac tacatgcggt gaacgtctcg agagagttta tgattctgag 1080 tactgtgata ttcttcgtgt gcccttcaga acagagaagg gtattgttcg caaatggatc 1140 tcaaggttcg aagtctggcc atatctagag acttacaccg aggatgctgc ggttgagcta 1200 tcgaaagaat tgaatggcaa gcctgacctt atcattggta actacagtga tggaaatctt 1260 gttgcttctt tattggctca caaacttggt gtcactcagt gtaccattgc tcatgctctt 1320 gagaaaacaa agtacccgga ttctgatatc tactggaaga agcttgacga caagtaccat 1380 ttctcatgcc agttcactgc ggatattttc gcaatgaacc acactgattt catcatcact 1440 agtactttcc aagaaattgc tggaagcaaa gaaactgttg ggcagtatga aagccacaca 1500 gcctttactc ttcccggatt gtatcgagtt gttcacggga ttgatgtgtt tgatcccaag 1560 ttcaacattg tctctcctgg tgctgatatg agcatctact tcccttacac agaggagaag 1620 cgtagattga ctaagttcca ctctgagatc gaggagctcc tctacagcga tgttgagaac 1680 aaagagcact tatgtgtgct caaggacaag aagaagccga ttctcttcac aatggctagg 1740 cttgatcgtg tcaagaactt gtcaggtctt gttgagtggt acgggaagaa cacccgcttg 1800 cgtgagctag ctaacttggt tgttgttgga ggagacagga ggaaagagtc aaaggacaat 1860 gaagagaaag cagagatgaa gaaaatgtat gatctcattg aggaatacaa gctaaacggt 1920 cagttcaggt ggatctcctc tcagatggac cgggtaagga acggtgagct gtaccggtac 1980 atctgtgaca ccaagggtgc ttttgtccaa cctgcattat atgaagcctt tgggttaact 2040 gttgtggagg ctatgacttg tggtttaccg actttcgcca cttgcaaagg tggtccagct 2100 gagatcattg tgcacggtaa atcgggtttc cacattgacc cttaccatgg tgatcaggct 2160 gctgatactc ttgctgattt cttcaccaag tgtaaggagg atccatctca ctgggatgag 2220 atctcaaaag gagggcttca gaggattgag gagaaataca cttggcaaat ctattcacag 2280 aggctcttga cattgactgg tgtgtatgga ttctggaagc atgtctcgaa ccttgaccgt 2340 cttgaggctc gccgttacct tgaaatgttc tatgcattga agtatcgccc attggctcag 2400 gctgttcctc ttgcacaaga tgattga 2427 <210> 176 <211> 2421 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 176 atggcggaac gtgtactcac tcgtgttcac gaacttcgtg agcgtctcga ttcaactctc 60 gcaactcatc gtaatgaaat cctcttgttt ctttcaagga ttgaaagcca tggaaaagga 120 atattgaagc ctcatcaagt tatgactgaa tttgaagcta tctgcaaaga agatcagagc 180 aaactctctg atggtgcttt ttatgaagtt cttaaatgca cacaggaagc aatagtgcaa 240 cctccatggg ttgcactcgc gatccgtctt cgacccggtg tttgggaata tgttagagtc 300 aatgttaatg ttttggtggt tgaagaatta agtgttcctg aatatcttca cttcaaagaa 360 gaattggtta atggaacatc gaatggcaac ttcgtgttgg aactggattt tgaacctttt 420 accgcatcgt ttcctcgacc aactttaacc aagtctattg gtaatggtgt tgagtttcta 480 aacagacatt tatctgctaa aatgtttcat gataaggata gcatgcaccc tcttcttgat 540 ttcctacgga ctcaccacta taagggaaag acaatgatgt tgaatgatag aatccaaaac 600 ctcaatgctc tacaatcggt gttgcgaaag gcgtcagagt acttatcaac actcgacgcg 660 gcaacaccgt actctcagtt tgaacataag tttcaagaaa tcgggttgga gagaggttgg 720 ggtgataaag cggaggtcgt aatggagatg atccacatgc ttctagacct tctagaagca 780 cccgacgcat gcacactcga gaagtttctc ggaagaatcc caatggtttt caatgttgtc 840 attctttcgc ctcatggcta cttcgcgcaa gaaaatgtgt tgggatatcc cgacactggc 900 ggtcaggttg tttacatctt ggatcaagtt cccgctctgg aacgcgagat gctcaaaagg 960 attaaggagc aaggactcga tatcattcct cgtatattga ttgttacgag gcttcttcct 1020 gacgcggttg ggaccacatg cgggcaacgt ttagagaaag tgtttggagc cgaacactcg 1080 catattcttc gggtcccgtt tagaaccgaa aagggtattc ttcgtaaatg gatctctcgt 1140 tttgaggtgt ggccttacat cgagactttc accgaggatg ttgctaaaga agttacagca 1200 gagttgcaag caaaaccaga tttgatcatt ggaaactata gtgaaggaaa tttggttgca 1260 tctttgctag ctcacaagtt gggtgtcact cagtgtacca ttgctcatgc tttggagaaa 1320 actaaatacc cggattctga tatctactgg aagaactttg aggagaaata tcatttctct 1380 tcgcagttta ccgctgatct tatcgctatg aaccataccg acttcatcat caccagtact 1440 ttccaagaaa ttgctggaag taaggacacg gttggacagt acgagagtca taccgcgttc 1500 acaatgccgg gattgtatcg ggtggttcac gggatcgatg tttttgaccc caaattcaat 1560 attgtttcac ccggggccga tatgggaatt tactactcgt ataccgagaa agaaaagagg 1620 ctcactgcgc ttcaccctga aatcgatgaa cttctcttta gttccgtcga aaacgaagaa 1680 cacttatgtg tgttgaagga taagagtaaa ccaatcttgt tcacaatggc gcgattggat 1740 aatgtgaaga atttaaccgg actggttgaa tggtacgcta aaaacgaccg ccttcgtgag 1800 ctcgtgaacc tcgtggtcgt cggtggtgac cgaaggaaag agtcgaaaga tcttgaagag 1860 caagctcaga tgaagaagat gcatgaactt atcgaaacct acaaactcaa cggtcagttc 1920 aggtggatat cctcacaaat gaaccgcgtg aggaacggtg agttgtatcg cgttattgct 1980 gacacgcgag gtgcgtttat ccagcctgcg ttttacgagg cgtttgggtt gacggttgtg 2040 gaggccatga cttgtggcct gccgacattc gcgacacttc atggtgggcc cgctgagatt 2100 attgttcacg ggaaatccgg gttccatatt gacccgtatc acggtgacca ggtcaccgag 2160 ttgctggtca atttctttga gaaaactaaa caagacccgg gtcattggga ggccatttcc 2220 aagggtggtc tgcaacgtat tcaggagaaa tacacgtggc agatttattc agataggttg 2280 ttgacgcttg ccggagttta tggattctgg aagcatgtgt cgaagcttga caggctcgag 2340 atccgtcgtt atcttgaaat gttttacgcg ctcaagtatc gcaaactggc tgaatctgtt 2400 ccattggctg ttgatgagtg a 2421 <210> 177 <211> 2421 <212> DNA <213> Coffea arabica <400> 177 atggccgaac gtgttctgac ccgtgttcac agcctccgcg aacgccttga tgctactttg 60 gctgcccacc gcaacgatgt tttgctgttt atgtcgaggc ttgaaaccca tgggaaaggg 120 atcctgaaac cccaccaact tttggctgag tttgaagaaa ttaacaagga tggtaaacaa 180 aaaattcatg atcatgcctt tgaagaagtc ctgaagtcca cacaggaagc aattgtgttg 240 cccccctggg ttgcacttgc tattcgtctc agacctggtg tctgggagta tgttcgagtc 300 aatgtccatg cactcgttgt tgaggagtta accgtgccag agtacctgca tttcaaggaa 360 gaactcgttg atggaagcaa aaatgggaat tttgttttgg aactggactt cgaaccattt 420 acagcctctt ttcccaagcc aactctaact aagtacatag gcgacggagt tgagttcctc 480 aacaggcacc tctctgccaa aatgttccat gacaaggaga gcatggcccc tctccttgat 540 tttctccgtg ttcaccaata caagggcaag acaatgatgc ttaacgacag gatcaaggac 600 cttaacactc tccaagcagt tctgaggaag gcagaggagt acctaacaac actctctgca 660 gatacaccat actctgaatt cgagcacaaa ttccaagaaa ttggactgga gagaggttgg 720 ggtgatactg ctgagcgtgt cttggaaatg atctgcatgc ttctggatct tctgggggct 780 cctgactcgt gcacactaga gaaattccta gggagaatcc ctatggtatt caatgttgtt 840 attctttccc cccatggata ctttgcccag gaaaacgtat tgggttatcc tgataccggt 900 ggccaggttg tttacatatt ggatcaagtt cctgccttgg agcgtgagat gctgaagagg 960 ataaaggaac aaggacttga tgtcaagcca cgcattctaa ttataactag gctgcttcct 1020 gatgcccctg gaaccacttg tggtcaacgg cttgagaaag tatatggatc agagtactcc 1080 catatactca gagtcccctt cagaactgag aagggagttg ttcgcaaatg gatctctcgc 1140 tttgaagttt ggccctacat ggaaacattt actgaggatg ttgcaaaaga agtcactgca 1200 gaattacagg caaagccaga tttggttatt ggtaactaca gtgagggtaa ccttgttgcc 1260 tccttgcttg ctcacaagtt aggtgtaaca cagtgtacca ttgctcatgc tttggaaaaa 1320 accaagtatc ctgattctga tatttatttg agcaaatttg atgaaaagta ccacttctca 1380 tgtcagttca ctgcggatct tatcgcaatg aaccatacag atttcattat cactagcact 1440 ttccaagaaa tagctggaag caaggacact gttgggcaat atgaaagcca tatggccttc 1500 acaatgccag gattatacag agttgtacat ggcattgatg tttttgatcc aaaattcaac 1560 attgtctcac ctggagctga tacaaacctc tacttcccac acacagagaa ggaaaagaga 1620 ttgacatctt tccatcctga aattgaggag ttgcttttca gcgatgtgga gaatgaggaa 1680 cacctatgtg tgctaaaaga caaaaagaag cctatcttat tcaccatggc aagactggat 1740 cgcgtaaaga atttgacagg gcttgttgaa ttgtatgcta agaacccaaa actaagggaa 1800 ttggtcaatc ttgtcgtggt tggtggagac cgaaggaagg aatccaaaga tttggaagaa 1860 caagctgaga tgaagaaaat gtattcattg atagaaactt acaacttgaa cggccaattc 1920 agatggattt cttctcagat gaacagggtt agaaatggtg aactctatcg gtacattgct 1980 gacaccaggg gagcattcgt gcaacctgca ttttatgagg catttgggtt gactgtggtc 2040 gaggccatga catgtggttt gccaacattt gcaaccaacc atggtggtcc tgctgagatc 2100 attattcatg ggaaatctgg tttccacatt gatccatacc atggtgagca ggtcagcgag 2160 ctccttgcca atttctttga aaggtgcaag aaagagcctt cttactggga caccatttca 2220 gccggtggct tgaagcgtat ccaggaaaag tacacctggc aaatttactc agatcggttg 2280 ctgacgctgg ctggagttta tggattctgg aaatgtgttt ccaagcttga tcgccaggag 2340 atccgccgtt atctggaaat gttttatgct ctcaagtatc gcaagttggc tgaagctgtt 2400 ccattggctg ttgatcagta a 2421 <210> 178 <211> 481 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 178 Met His Ile Thr Lys Pro His Ala Ala Met Phe Ser Ser Pro Gly Met 1 5 10 15 Gly His Val Ile Pro Val Ile Glu Leu Gly Lys Arg Leu Ser Ala Asn 20 25 30 Asn Gly Phe His Val Thr Val Phe Val Leu Glu Thr Asp Ala Ala Ser 35 40 45 Ala Gln Ser Lys Phe Leu Asn Ser Thr Gly Val Asp Ile Val Lys Leu 50 55 60 Pro Ser Pro Asp Ile Tyr Gly Leu Val Asp Pro Asp Asp 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Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser Thr Thr Arg Asn 50 55 60 Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile Asn Val Val Gln 65 70 75 80 Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp Ala Glu Ala Thr 85 90 95 Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Gln Tyr Leu Lys Lys Ala Val Asp 100 105 110 Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln His Ser Pro Asp 115 120 125 Trp Ile Ile Tyr Asp Phe Thr His Tyr Trp Leu Pro Ser Ile Ala Ala 130 135 140 Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Phe Cys Val Ile Thr Pro Trp Thr 145 150 155 160 Ile Ala Tyr Leu Ala Pro Ser Ser Asp Ala Met Ile Asn Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro Lys Trp Phe Pro 180 185 190 Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu Ala Arg Met Glu 195 200 205 Pro Tyr Glu Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg Met Gly Met Val 210 215 220 Phe Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Phe Lys Cys Tyr His Glu Phe Gly 225 230 235 240 Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln Val Pro Val Val 245 250 255 Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp Glu Lys Asp Glu 260 265 270 Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ser 275 280 285 Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Leu Val Ser Gln Thr Glu 290 295 300 Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Leu Pro Phe Val 305 310 315 320 Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser Asp Ser Val Glu 325 330 335 Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg Gly Leu Val Trp 340 345 350 Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His Glu Ser Val Cys 355 360 365 Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val Glu Gly Leu Met 370 375 380 Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Cys Asp Gln Pro Leu 385 390 395 400 Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile Glu Ile Pro Arg 405 410 415 Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val Ala Arg Ser Leu 420 425 430 Arg Ser Val Val Val Glu Asn Glu Gly Glu Ile Tyr Lys Ala Asn Ala 435 440 445 Arg Ala Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val Glu Lys Glu Tyr 450 455 460 Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala Arg Ala Val Ala 465 470 475 480 Ile Asp His Glu Ser 485 <210> 205 <211> 1673 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 205 gctggccaaa tgtacaacgt tacttatcat caaaattcaa aagcaatggc taccagtgac 60 tccatagttg acgaccgtaa gcagcttcat gttgcgacgt tcccatggct tgctttcggt 120 cacatcctcc ctttccttca gctttcgaaa ttgatagctg aaaagggtca caaagtctcg 180 tttctttcta ccaccagaaa cattcaacgt ctctcttctc atatctcgcc actcataaat 240 gttgttcaac tcacacttcc acgtgtccaa gagctgccgg aggatgcaga ggcgaccact 300 gacgtccacc ctgaagatat tcaatatctc aagaaggctg ttgatggtct tcaaccggag 360 gtcacccggt ttctagaaca acactctccg gactggatta tttatgattt tactcactac 420 tggttgccat ccatcgcggc tagcctcggt atctcacgag cctacttctg cgtcatcact 480 ccatggacca ttgcttattt ggcaccctca tctgacgcca tgataaatga ttcagatggt 540 cgaaccacgg ttgaggatct cacgacaccg cccaagtggt ttccctttcc gaccaaagta 600 tgctggcgga agcatgatct tgcccgaatg gagccttacg aagctccggg gatatctgat 660 ggataccgta tggggatggt ttttaaggga tctgattgtt tgcttttcaa atgttaccat 720 gagtttggaa ctcaatggct acctcttttg gagacactac accaagtacc ggtggttccg 780 gtgggattac tgccgccgga aatacccgga gacgagaaag atgaaacatg ggtgtcaatc 840 aagaaatggc tcgatggtaa acaaaaaggc agtgtggtgt acgttgcatt aggaagcgag 900 gctttggtga gccaaaccga ggttgttgag ttagcattgg gtctcgagct ttctgggttg 960 ccatttgttt gggcttatag aaaaccaaaa ggtcccgcga agtcagactc ggtggagttg 1020 ccagacgggt tcgtggaacg aactcgtgac cgtgggttgg tctggacgag ttgggcacct 1080 cagttacgaa tactgagcca cgagtcagtt tgtggtttct tgactcattg tggttctgga 1140 tcaattgtgg aagggctaat gtttggtcac cctctaatca tgctaccgat tttttgtgac 1200 caacctctga atgctcgatt actggaggac aaacaggtgg gaatcgagat accaagaaat 1260 gaggaagatg gttgcttgac caaggagtcg gttgctagat cactgaggtc cgttgttgtg 1320 gaaaacgaag gggagatcta caaggcgaac gcgagggcgc tgagtaaaat ctataacgac 1380 actaaggtgg aaaaagaata tgtaagccaa ttcgtagact atttggaaaa gaatgcgcgt 1440 gcggttgcca tcgatcatga gagttaacta tatcatcaag tatgtgtgag ttgttgggtt 1500 tcttttggaa agattcaaat gaaatgttgg aattgctaaa tatgttggta gaatcgatcg 1560 agtcttagga ggtgtcctag ttaattgttt taagctacta tattaataag ttgttattgt 1620 aaggctattt aaagccaaat tatgtgatga ataaagcaat tgattccagc cgt 1673

Claims (36)

  1. 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물을 포함하는 개시 조성물과,
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드:
    (a) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 스테비올 13-O-모노시드를 람노실화시킬 수 있고 서열 번호: 150에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족(family)의 폴리펩티드;
    (d) C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족(family)의 폴리펩티드; 및
    (e) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드,
    여기서 상기 폴리펩티드 중 하나 이상이 재조합 폴리펩티드임,
    그리고 하나 이상의 UDP-당을, 하나 이상의 UDP-당으로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달에 적합한 반응 조건 하에서 접촉시키고,
    이로 인하여 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 단계를 포함하는,
    표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스, UDP-람노오스, 또는 UDP-자일로오즈인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 표적 스테비올 글리코시드는 스테비올-1,2-비오시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 표적 스테비올 글리코시드는 스테비올-1,2-비오시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 및 이의 조합을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비올-1,2-비오시드, 스테비오시드, 또는 레바우디오시드 B 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 A는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (b) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드 또는 스테비올-1,2-비오시드 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 B는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (c) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비올-1,2-비오시드, 또는 스테비오시드 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 E는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (d) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비올-1,2-비오시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 또는 레바우디오시드 E 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 D는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (e) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비올-1,2-람노비오시드 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스 및 UDP-람노오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    스테비올 13-O-모노시드를 람노실화시킬 수 있고 서열 번호: 150에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    둘코시드 A는 하나 이상의 UDP-글루코오스 및 UDP-람노오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (f) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비올-1,2-람노비오시드, 또는 둘코시드 A 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스 및 UDP-람노오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    스테비올 13-O-모노시드를 람노실화시킬 수 있고 서열 번호: 150에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 C는 하나 이상의 UDP-글루코오스 및 UDP-람노오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (g) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 1,2-스테비올자일로시드, 또는 스테비올-1,2-자일로비오시드 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스 및 UDP-자일로오즈이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    UDP-글루코오스 탈수소효소 (UGD1) 폴리펩티드; 및
    UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소 (UXS3) 폴리펩티드, 그리고
    레바우디오시드 F는 하나 이상의 UDP-글루코오스 및 UDP-자일로오즈로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (h) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    스테비올-1,2-비오시드는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되거나;
    (i) 전구물질 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 스테비올-1,2-비오시드, 또는 루부소시드, 또는 이의 혼합물이고, 하나 이상의 UDP-당은 UDP-글루코오스이고,
    스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드 또는 이의 혼합물을, 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고:
    C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드;
    C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 그리고
    스테비오시드는 하나 이상의 UDP-글루코오스로부터 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물로의 하나 이상의 당 모이어티의 전달 시 생산되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물은 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 시험관내 (in vitro) 방법이고, 하나 이상의 UDP-당을 공급하는 단계 또는 하나 이상의 UDP-당의 재생산을 위하여 무-세포 (cell-free) 시스템을 공급하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 시험관내 방법은 효소 시험관내 방법 또는 전-세포 시험관내 방법인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법은 하나 이상의 UDP-당 및 전-세포에 대한 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질을 포함하는, 스테비아(Stevia) 추출물을 포함하는 원재료를 공급하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법에서 사용된 전-세포가 외부의 수크로오스를 분해하는 능력이 감소된, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법에서 사용된 전-세포는 서열 번호: 175 내지 177 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되거나 서열 번호: 180에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 수크로오스 합성효소 (SUS) 폴리펩티드, 서열 번호: 179에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 수크로오스 수송체 폴리펩티드, 람노오스 합성효소 (RHM2) 폴리펩티드, UDP-글루코오스 탈수소효소 (UGD1) 폴리펩티드, 또는 UDP-글루쿠로닌산 탈카르복실화효소 (UXS3) 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 유전자를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) RHM2 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) RHM2 폴리펩티드를 포함하고;
    (b) UGD1 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UGD1 폴리펩티드 또는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) UGD1 폴리펩티드를 포함하고;
    (c) UXS3 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UXS3 폴리펩티드 또는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) UXS3 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (a) 수크로오스 수송체 폴리펩티드는 서열 번호: 179에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 수크로오스 수송체 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되고;
    (b) SUS 폴리펩티드는 서열 번호: 175 내지 177 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나 서열 번호: 180에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되고;
    (c) RHM2 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) RHM2 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되고;
    (d) UDP-글루코오스 탈수소효소 (UGD1) 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UGD1 폴리펩티드 또는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) UGD1 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되고;
    (e) UXS3 폴리펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UXS3 폴리펩티드 또는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) UXS3 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 숙주 세포에서 생산되는, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 시험관내 방법을 포함하는 전-세포의 내인성 수크로오스 인베르타제(invertase)는 방해된, 방법.
  15. 제9항에 있어서, 세포 성장 동안 또는 후에 원재료를 공급하는 것을 더 포함하는, 방법.
  16. 제9항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법에서 사용된 전-세포는
    (a) 현탁되거나 고정되거나;
    (b) 칼슘 또는 소듐 알긴산 알갱이로 포집되거나;
    (c) 중공 섬유 (hollow fiber) 튜브 반응기 시스템에 연결되거나;
    (d) 막형 반응기 (membrane reactor) 시스템 내에서 농축되고 포집되거나;
    (e) 발효 배양액 또는 반응 완충용액 내에 있는, 방법.
  17. 제9항에 있어서, 투과성 시약을 사용함으로써 전-세포를 투과성화하는 것을 더 포함하고, 투과성 시약은 용매, 세제, 계면활성제, 기계 충격, 전기천공법 (electroporation) 또는 삼투압 충격 (osmotic shock)인, 방법.
  18. 제9항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법에서 사용된 전-세포는 식물 세포; 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속(genus) 유래의 진균 세포 (fungal cell) 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타 (Cnadida glabrata), 아쉬브야 고시피 (Ashbya gossypii), 시베르린드네라 자디니 (Cyberlindnera jadinii), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 아르쿨라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans), 산토필로미세스 덴드로우스 (Xanthophyllomyces dendrorhous), 또는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 종 유래의 효모 세포 유래의 진균 세포; 조류 세포; 또는 대장균(Escherichia coli) 종 또는 바실러스 (Bacillus) 속 유래의 박테리아 세포인, 방법.
  19. 제9항에 있어서, 전-세포 시험관내 방법에서 사용된 전-세포는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 종 유래의 효모 세포인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 포스파타아제를 더 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    (a) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있는 폴리펩티드는
    (i) 서열 번호: 5의 잔기 206에서 아르기닌을, 잔기 207에서 시스테인을, 그리고 잔기 343에서 아르기닌을 갖는 폴리펩티드;
    (ii) 서열 번호: 5의 잔기 30에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 93에서 프롤린 또는 글루타민, 잔기 99에서 세린 또는 발린, 잔기 122에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 140에서 히스티딘 또는 티로신, 잔기 142에서 세린 또는 시스테인, 잔기 148에서 알라닌 또는 트레오닌, 잔기 152에서 메티오닌, 잔기 153에서 알라닌, 잔기 156에서 알라닌 또는 세린, 잔기 162에서 글리신, 잔기 195에서 류신 또는 메티오닌, 잔기 196에서 글루타민산, 잔기 199에서 라이신 또는 글루타민산, 잔기 211에 류신 또는 메티오닌, 잔기 213에서 류신, 잔기 221에서 세린 또는 페닐알라닌, 잔기 253에서 발린 또는 이소류신, 잔기 286에서 발린 또는 알라닌, 잔기 427에서 라이신 또는 아스파라진, 잔기 438에서 알라닌, 및 잔기 462에서 알라닌 또는 트레오닌을 갖는 폴리펩티드;
    (iii) 서열 번호: 5의 잔기 211에서 메티오닌 및 잔기 286에서 알라닌을 갖는 폴리펩티드; 또는
    (iv) 서열 번호: 10, 12, 76, 78 또는 95에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하고;
    (b) C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있는 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 잔기에서 K9E, K10R, V13F, F15L, Q21H, M27V, H60D, A65S, E71Q, I87F, L91P, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, Y298C, L334S, K350T, H368R, A389V, I394V, P397S, E418V, G420R, L431P, G440D, H441N, R444G, 및 M471T로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함하고;
    (c) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있는 폴리펩티드는 서열 번호: 7의 잔기에서 M29I, V74E, V87G, L91P, G116E, A123T, Q125A, I126L, T130A, V145M, C192S, S193A, F194Y, M196N, K198Q, K199I, Y200L, Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, P266Q, S273P, R274S, G284T, T285S, L330V, G331A, 및 L346I로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  22. 삭제
  23. 제1항에 있어서, 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 개시 조성물로부터 단리하는 것을 더 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단리 단계는
    (a) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 개시 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 개시 조성물의 액상을 개시 조성물의 고체상으로부터 분리하여 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
    (c) 패킹된 컬럼에서 흡착 수지 (adsorbent resins)를 제공하는 것을 포함하는 하나 이상의 흡착 수지를 제공하는 단계; 및
    (d) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물의 적어도 일부를 수득하기 위해 단계 (b)의 상청액을 하나 이상의 흡착 수지와 접촉시킴으로써, 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 단리하는 단계를 포함하거나;
    (a) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 개시 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 개시 조성물의 액상을 개시 조성물의 고체상으로부터 분리하여 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
    (c) 하나 이상의 이온 교환 또는 역상 크로마토그래피 컬럼을 제공하는 단계; 및
    (d) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물의 적어도 일부를 수득하기 위해 단계 (b)의 상청액을 하나 이상의 이온 교환 또는 역상 크로마토그래피 컬럼과 접촉시킴으로써, 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 단리하는 단계를 포함하거나;
    (a) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 개시 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 개시 조성물의 액상을 개시 조성물의 고체상으로부터 분리하여 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
    (c) 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 결정화하거나 추출함으로써, 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 개시 조성물로부터 생산된 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 회수하는 것을 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 회수된 표적 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비아 식물로부터의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 생산된 표적 스테비올 글리코시드가 풍부하고 식물에서 유도된 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 성분의 감소된 수준을 갖는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 스테비올은 식물에서 유도되거나 합성된 스테비올인, 방법.
  28. 스테비올, 전구물질 스테비올 글리코시드, 또는 이의 혼합물을 포함하는 개시 조성물과,
    전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 152에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드:
    (a) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C2'을 베타 1,2 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 스테비올 13-O-모노시드를 람노실화시킬 수 있고 서열 번호: 150에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) C-19 카르복실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT74G1 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT74 족의 폴리펩티드;
    (d) C-13 히드록실기에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드를 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 UGT85C2 폴리펩티드를 포함하는 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실 전이효소 (UGT) UGT85 족의 폴리펩티드; 및
    (e) 전구물질 스테비올 글리코시드의 13-O-글루코오스, 19-O-글루코오스, 또는 13-O-글루코오스 및 19-O-글루코오스 모두의 C3'을 베타 1,3 글리코실화시킬 수 있고 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드,
    그리고 하나 이상의 UDP-당을, 제1 생촉매적 공정에서 스테비올 또는 전구물질 스테비올 글리코시드로의 당 모이어티의 전달에 적합한 반응 조건 하에서 접촉시켜서 중간 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 단계; 및
    제2 생촉매적 공정에서 중간 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 사용함으로써 표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 단계를 포함하는,
    표적 스테비올 글리코시드 또는 표적 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 스테비올은 식물에서 유도되거나 합성된 스테비올인, 방법.
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