KR102618015B1 - 스테비올 또는 이의 전구체의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테비올 또는 이의 전구체 생합성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 이용한 스테비올 또는 이의 전구체를 생산하는 재조합 균주 및 상기 효소 또는 재조합 균주를 이용한 스테비올 생산방법에 관한 것이다.

Description

스테비올 또는 이의 전구체의 생산{production of steviol and its precursors}
본 발명은 스테비올 또는 이의 전구체 생합성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 이용한 스테비올 또는 이의 전구체를 생산하는 재조합 균주 및 상기 효소 또는 재조합 균주를 이용한 스테비올 생산방법에 관한 것이다.
감미료는 식품, 음료, 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품 산물에 통합될 수 있거나 또는 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 가정용 대체물로 이용할 수 있다. 감미료는 예를 들어 수크로오스, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 및 꿀과 같은 천연 감미료들, 그리고 예를 들어 아스파르탐, 사카린 및 수크랄로오스(sucralose)와 같은 인공 감미료를 포함한다.
스테비아(Stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출할 수 있는 천연 감미료이다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품 및 블렌드에서 고감도 조미료로, 또는 단독으로 식탁 감미료로 시판된다.
스테비아 식물의 추출물들은 레바우디오시드 및 단맛에 기여하는 기타 스테비올을 함유하지만, 각 글리코시드의 양은 상이한 생산 일괄량 (batches)에 따라 흔히 변화한다. 기존의 시판 제품들은 주로 레바우디오시드 A이며, 적은 양의 레바우디오시드 C, D, 및 F와 같은 기타 글리코시들이 있다. 스테비아 추출물은 또한 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물에서 유도된 화합물과 같은 오염물질을 함유할 수 있다. 이러한 이취는 선택된 식품 시스템 또는 용도에 따라 대체로 문제가 될 수 있다.
스테비아 추출물의 조성물은 식물이 성장하는 토양 및 기후에 따라 매우 다양할 수 있다. 원료 식물, 기후 조건, 및 추출 공정에 따라, 상업적 제조 과정에서 레바우디오시드 A의 양은 총 스테비올 글리코시드 함량의 20 내지 97%로 다양하다고 보고된다. 또 다른 스테비올 글리코시드들이 스테비아 추출물 내에 다양한 양으로 존재한다.
스테비아 식물로부터의 스테비올 글리코시드의 회수 및 정제가 노동 집약적이고 비효율적인 것으로 밝혀지면서, RebD 및 RebM과 같은 고수율의 요망되는 스테비올 글리코시드를 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이 여전히 요구되고 있다. 또한, 상업적 용도를 위한 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 개선된 생산에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 스테비올 또는 이의 전구체 생합성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 이용한 스테비올을 생산하는 재조합 균주 및 상기 효소 또는 재조합 균주를 이용한 스테비올 생산방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질에 관한 것이며, 상기 효소 단백질은 Jungermannia subulata 유래 효소 단백질일 수 있다. 상기 효소 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상 또는 99%이상일 수 있다.
본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질은 ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS)와 ent-카우렌 신타제 (KS)의 두 가지 기능을 모두 가지는 이중 기능 효소(bifunctional enzyme) 단백질이다. 본 발명에 따른 이중 기능 효소는 channelling을 형성하여 두 가지 반응을 연속적으로 빠르게 일어나게 하는 장점이 있어, 효소를 이용하여 생산한 산물의 수율 및 생산속도 등을 향상시키는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 가지는 이중 기능 효소는 기질로부터 카우렌 생성까지 진행할 수 있다.
본 발명에 따른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 예를 들면 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 것이며, 상기 유전자의 핵산 서열의 동일성은 적어도 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상 또는 99%이상일 수 있다.
본 발명의 추가 일 예는, 본 발명에 따른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 작동 가능한 조절 서열에 연결되어 포함될 수 있으며, 상기 조절서열은 전사 프로모터 등을 포함한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터의 일 예는 도 1에 예시적으로 도시되어 있다.
또한, 본 발명의 일 예는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 균주는 (a) CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 스테비올 또는 이의 전구체를 생산하는 재조합 균주일 수 있으며, 상기 균주는 (b) GGPP 합성 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 또 따른 재조합 균주는 (a) CPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 유전자에 더하여, (c) 카우레노산 하이드록실라제 (KAH)를 암호화하는 유전자, (d) 카우렌 옥시다제 (KO)를 암호화하는 유전자, 및 (e) KO 및 KAH에 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR)를 암호화하는 유전자를 포함하는 스테비올를 생산하는 재조합 균주일 수 있다. 상기 균주는 (b) GGPP 합성 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질를 이용하여, 스테비올 및/또는 스테비올 전구체는, 재조합 숙주에서, 시험관내에서(즉, 효소적으로), 또는 전세포 생물전환에 의해 생성될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 또는 스테비올 전구체는 상기 조건 하에서 배양될 때 검출 가능한 농도로 축적된다. 본 발명에 따른 스테비올 및 이의 전구체를 제조하는 합성 경로를 간략히 반응식1에 표시한다. 또한, 상기 스테비올 합성 경로에 관여하는 효소를 살펴보면, Mevalonate에서 FPP(farnesyl pyrophosphate)를 거쳐 GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate)를 얻고, CDPS) copalyl diphosphate synthase를 이용하여 GGPP에서 CPP (copalyl pyrophosphate)를 얻고, (KS) kaurene synthase를 이용하여 CPP에서 카우렌을 얻고, (KO) kaurene oxidase를 이용하여 카우렌에서 카우레노익산을 얻고, (KAH) kaurenoic acid hydroylase을 이용하여 카우레노익산에서 스테비올을 얻는다.
[반응식 1]
본 발명에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 또는 스테비올 전구체는 검출이 불가능한 농도의 스테비아 식물-유래된 오염물질을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체내, 시험관내 또는 전체 세포 생물전환에 의해 생성된 스테비올 또는 스테비올 전구체 조성물은 특히 스테비아 식물로부터의 스테비아 추출물보다 적은 오염물질을 포함한다. 오염물질은 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물-유래 화합물을 포함한다.
효모를 이용하여 스테비올을 생산하는 경우, 스테비올은 효모 내에서 GGPP (geranyl geranyl pyrophosphate) 생성 이후 copalyl pyrophosphate (CPP) synthase에 의해 CPP (copalyl pyrophosphate)가 생성되고, 순차적으로 kaurene synthase (KS)에 의해 생성되는 카우렌(kaurene) 및 카우렌산(kaurenoic acid)을 거쳐 생합성된다. 따라서, 효모를 이용한 스테비올 생합성 과정에서 전구체인 카우렌의 생성은 중요하며, 카우렌의 생성을 위한 GGPP 생성과 카우렌 생성을 높이는 것도 또한 필요하다. 이에, 종래에 GGPP에서 CPP와 카우렌을 생성하는 효소를 모듈(module)로 제조하며, 더욱 바람직하게는 CDPS와 KS가 동시에 작용하여 카우렌을 생산할 수 있는 두 기능 효소를 사용하는 것이다.
카우렌은 효모 내 메발론산 대사경로(mevalonate pathway)를 통해 GGPP에서 CPP을 거쳐서 생합성이 가능하다. 이 과정에 작용하는 효소가 copalyl pyrophosphate synthase (CDPS) 및 Ent-kaurene synthase (KS)이며, 종래에는 Stevia rebaudiana 유래 KS (SrKS) 효소 및 CDPS (SrCDPS) 효소로 이루어진 2종 효소를 사용하여 제조하였다. 이 과정에 작용하는 효소가 copalyl pyrophosphate synthase (CDPS) 및 Ent-kaurene synthase (KS)이며, Stevia rebaudiana 유래 KS (SrKS) 효소 및 CDPS (SrCDPS) 효소 2종을 사용하여 제조하였다.
본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 이용하는 경우, 종래에 사용하는 스테비아 유래의 SrCDPS, SrKS에 비해 Kaurene 생성 및 스테비올 생성이 증가한다.
본 명세서에서, 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-1,2-바이오사이드, 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 스테비오사이드, 1,3-스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 B (RebB), 레바우디오사이드 C (RebC), 레바우디오사이드 D (RebD), 레바우디오사이드 E (RebE), 레바우디오사이드 F (RebF), 레바우디오사이드 M (RebM), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 레바우디오사이드 I (RebI), 둘코사이드 A, 디-글리코실화된 스테비올, 트리-글리코실화된 스테비올, 테트라-글리코실화된 스테비올, 펜타-글리코실화된 스테비올, 헥사-글리코실화된 스테비올, 헵타-글리코실화된 스테비올, 또는 이들의 이성질체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스테비올 전구체","스테비올 글리코시드 전구체" 및 "스테비올 전구체 화합물"은 스테비올 생합성 경로의 중간체 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 스테비올 전구체는 비제한적으로, 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP), ent-코팔릴-디포스페이트, 코팔릴-파이로포스페이트, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레노산, 및 스테비올을 포함한다. 바람직하게는, 상기 스테비올 전구체는 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate), CPP(copalyl pyrophosphate), 카우렌 및 카우레노익산(kaurnoic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 (a) CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 스테비올 또는 이의 전구체를 생산하는 재조합 균주 또는 일 수 있으며, 상기 (a) 및 (b) GGPP 합성 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 균주에서, 스테비올을 생성하기에 적합한 폴리펩티드는 KO, KAH, 및 CPR의 기능성 동족체(homolog)를 포함한다. 예를 들어, KO, KAH, 및 CPR의 기질 특이성을 변경시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 부위-지정된/논리적 돌연변이유발 접근법, 무작위 유도되는 진화 접근법 및 무작위 돌연변이유발/포화 기법이 효소의 활성 부위 부근에서 수행되는 조합법을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 벡터 및 제조합 숙주 세포에 포함된 (b) GGPP 합성 효소 단백질을 암호화하는 유전자, (c) 카우레노산 하이드록실라제 (KAH)를 암호화하는 유전자, (d) 카우렌 옥시다제 (KO)를 암호화하는 유전자, 및 (e) KO 및 KAH에 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR)를 암호화하는 유전자는, 본 기술 분야의 전문가에게 알려진 유전자를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, Geranylgeranyl pyrophosphate synthase을 암호화하는 유전자의 예는, BTS1로서, UniProtKB accession number Q12051을 갖는 Saccharomyces cerevisiae의 BTS1이고 (서열번호 15의 아미노산 서열), Geranylgeranyl pyrophosphate synthase를 암호화는 유전자의 예는 XdCrtE로서 UniProtKB accession number Q1L6K3을 갖는 Xanthophyllomyces dendrorhous crtE이고 (서열번호 16의 아미노산 서열), GGPP synthase를 암호화하는 유전자의 예는 ERG20F96C(DNA sequence of the GGPP synthase ERG20F96C from Saccharomyces cerevisiae)로서, 서열번호 17의 아미노산 서열에 의해 암호화되며, 구체적으로 참고문헌 Metabolic engineering 27 (2015) 65-75, Efficient diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase에 기재된 것이다.
구체적인 예시로서, 상기 (c), (d) 및 (e) 유전자는, S. rebaudiana 유래의 KO (SrKO) 및 KAH (SrKAH)와 Arabidopsis thaliana 유래와 S.cereviiae의 CPR (AtCPR, yCPR)을 사용할 수 있다. 구체적 사용 가능한 유전자로서, SrKO(stevia rebaudiana KO1, genebank accession number, Q6UQ67), SrKAH (stevia rebaudiana KA13H genebank accession number, Q0NZP1), AtCPR(arabidopsis thaliana CPR2, genebank accession number, Q9SUM3), 및 yCPR (Saccharomyces cerevisiae CPR1, gene bank accession number, P16603)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종이상일 수 있다.
상기 조절 영역의 선택은 비제한적으로 특정 배양 단계 동안의 효율, 선택성, 유도성, 요망되는 발현 수준, 및 우선적인 발현을 포함하는 여러 인자에 의해 좌우된다. 코딩 서열에 대한 조절 영역을 적절하게 선택하고 정위함에 의해 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 관례적인 것이다. 하나를 초과하는 조절 영역, 예컨대 인트론, 인핸서, 업스트림 활성화 영역, 전사 종결인자, 및 유도성 요소가 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
구체적으로, 스테비올 생합성 대사경로 내 카우렌 생합성을 위해, CDPS/KS 이외의 유전자들이 작동 가능한 프로모터, 예를 들면 GAL 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계된다. 설계된 유전자는 GGPP 합성 단계 관련 BTS1, XdCrtE, ERG20F96C 3종의 효소들을 조합하여 GGPP 생합성 모듈로서 GAL1 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계하였다. 구체적으로, BTS1은 Genbank accession number Q12051을 갖는 Saccharomyces cerevisiae의 BTS1이고, XdCrtE는 Genbank accession number A0A0C4MWV0을 갖는 Xanthophyllomyces dendrorhous crtE이고, ERG20F96C는 참고문헌 Metabolic engineering 27 (2015) 65-75, Efficient diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase에 기재된 것이다. 또한 카우렌 생성 단계 관련 Stevia rebaudiana 유래 KS (SrKS) 효소와 CPS (SrCDPS) 효소 2종과 CPS/KS 두 효소의 역할을 한번에 진행하는 Jungermannia subulata 유래의 이중 기능 효소 JsCDPS/KS 를 카우렌 생합성 모듈로써 GAL2 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계한다. 상기 제조된 벡터의 개열지도를 도 1에 나타낸다.
본원에 기재된 재조합 숙주는 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다. 상기 박테리아 세포는 에스체리치아 박테리아 세포, 예를 들어, 에스체리치아 콜라이 세포; 락토바실러스 박테리아 세포, 락토코커스 박테리아 세포, 코르네박테리움 박테리아 세포, 아세토박터 박테리아 세포, 아시네토박터 박테리아 세포, 또는 슈도모나스 박테리아 세포를 포함한다.
상기 진균류 세포는 효모 세포를 포함한다. 한 양태에서, 효모 세포는 사카로마아세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아쉬비아 고시피이(Ashbya gossypii), 사이베를린드네라 자디니이(Cyberlindnera jadinii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 잔토필로마이세스 덴드로르호우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 종으로부터의 세포이다.상 기 효모 세포는 사카로마이세테(Saccharomycete)이다. 한 양태에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애 종으로부터의 세포이다.
본 발명은 (a) 본원에 기재된 임의의 유전자가 발현되는 조건하에 배양 배지에서 본원에 기재된 재조합 숙주를 성장시키는 단계로서, 스테비올 또는 스테비올 전구체가 상기 숙주에 의해 합성되는 단계; 및/또는
(b) 선택적으로 스테비올 또는 스테비올 전구체를 정량화시키는 단계; 및/또는
(c) 선택적으로, 스테비올 또는 스테비올 전구체를 분리하는 단계를 포함하여, 스테비올 또는 스테비올 전구체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 숙주 세포의 배양은, 예를 들면 상기 재조합 숙주 세포가 효모인 경우, 재조합 효모를 YPD 배지에서 전배양을 한 다음, OD600에서 흡광도가 특정 값이 되게, 예를 들면 0.1 내지 0.2가 되게 YNB 액체배지에 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 5일 배양하여, 스테비올 또는 스테비올 전구체를 생산할 수 있다.
본 발명에 기재된 재조합 미생물에 의해 생성된 조성물은 식품에 혼입될 수 있다 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올은 다른 감미료, 예를 들어, 사카린, 덱스트로스, 수크로스, 푸룩토스, 에리트리톨, 아스파르탐, 수크랄로스, 모나틴, 또는 아세술팜 포타슘과 함께 식품에 혼입될 수 있다. 기타 감미료에 대한 스테비올 또는 스테비올의 중량비는 최종 식품에서 만족할 만한 맛에 도달하기 위해 필요에 따라 변화될 수 있다.
본 발명은 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 이용한 스테비올을 생산하는 재조합 균주 및 상기 효소 또는 재조합 균주를 이용한 스테비올 생산방법에 관한 것으로서, 스테비아 식물로부터의 제조하는 기술에 비해, RebD 및 RebM과 같은 고수율의 스테비올을 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이다.
도 1은 카우렌을 생합성하는 재조합 균주 제조를 위한 벡터의 개열 지도(cleavage map)이다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 예시적인 실시예 범위로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. GGPP에서부터 카우렌을 생산하는 이중 기능 효소의 탐색
스테비올을 생합성 과정의 중간체인 카우렌은, GGPP에서 CPP을 거쳐서 생성된다. CPP에서 카우렌을 생산하는 과정에 작용하는 효소가 copalyl pyrophosphate synthase (CDPS) 및 Ent-kaurene synthase (KS)로서 이것을 동시에 할 수 있는 두 기능(bifunctional) 효소를 탐색하였다. 두 가지 기능 효소의 탐색은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 공개된 정보를 바탕으로 기존에 기능이 확인되지 않은 효소들을 우선 선별하였다.
최종적으로 Jungermannia subulata 유래의 두 기능 효소인 CDPS/KS 효소(JsCDPS/KS)가 선별되었고, 해당 유전자에서의 신호서열을 제거하기 위해 plant network (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) 프로그램을 사용하여 N 말단의 신호서열(signal peptide)를 확인하고 제거하였다. 상기 신호서열 (N-말단의 105개 아미노산)이 제거된 효소의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타냈다.
Saccharomyces cerevisiae 코돈 최적화하여 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 Genescript(USA)에서 합성하였다. 합성된 유전자 서열은 CAI Calculator 2 서버를 이용하여 코돈 최적화된 유전자 서열을 재확인하였다.
실시예 2. 카우렌을 생합성하는 재조합 균주의 제조
실시예 1에서 선별된 JsCDPS/KS의 효소 활성 확인을 위해 S. cereviaise 에서의 카우렌 생합성을 확인하였다.
구체적으로, 도 1에서의 스테비올 생합성 대사경로 내 카우렌 생합성을 위해, CDPS/KS 이외의 유전자들이 GAL 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계되었다. 설계된 유전자는 GGPP 합성 단계 관련 BTS1, XdCrtE, ERG20F96C 3종의 효소들을 조합하여 GGPP 생합성 모듈로서 GAL1 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계하였다. 구체적으로, Geranylgeranyl pyrophosphate synthase을 암호화하는 BTS1은 UniProtKB accession number Q12051을 갖는 Saccharomyces cerevisiae의 BTS1이고, Geranylgeranyl pyrophosphate synthase를 암호화는 XdCrtE는 UniProtKB accession number Q1L6K3을 갖는 Xanthophyllomyces dendrorhous crtE이고, GGPP synthase를 암호화하는 ERG20F96C(DNA sequence of the GGPP synthase ERG20F96C from Saccharomyces cerevisiae)는 참고문헌 Metabolic engineering 27 (2015) 65-75, Efficient diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase에 기재된 것이다. 구체적으로, BTS1, XdCrtE, ERG20F96C 3종의 효소 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 15, 16 및 17에 각각 나타냈다.
또한 카우렌 생성 단계 관련 Stevia rebaudiana 유래 KS (SrKS) 효소와 CPS (SrCDPS) 효소 2종과 CPS/KS 두 효소의 역할을 한번에 진행하는 Jungermannia subulata 유래의 이중 기능 효소 JsCDPS/KS 를 카우렌 생합성 모듈로써 GAL2 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계하였다. 상기 제조된 벡터의 개열지도를 도 1에 나타냈다. 두 모듈의 유전자들을 조합하여 GGPP에서부터 카우렌까지 생합성 단계의 총 6개 조합을 설계하고 대장균-효모 셔틀 벡터인 pRS424로 클로닝되어 표 1의 pSYK 재조합 플라스미드 6종을 제작하였다.
재조합
플라스미드		 GGPP 생합성 모듈 카우렌 생합성 모듈
프로모터 유전자 프로모터 유전자 프로모터 유전자
pSYK1R ScGAL1 BTS1-ERG20 SmGAL2 SrCDPS ScGAL2 SrKS
pSYK2R ScGAL1 XdCrtE-ERG20 SmGAL2 SrCDPS ScGAL2 SrKS
pSYK3R ScGAL1 ERG20F96C SmGAL2 SrCDPS ScGAL2 SrKS
pSYK4 ScGAL1 BTS1-ERG20 - - ScGAL2 JsCDPS/KS
pSYK5 ScGAL1 XdCrtE-ERG20 - - ScGAL2 JsCDPS/KS
pSYK6 ScGAL1 ERG20F96C - - ScGAL2 JsCDPS/KS
Sc: Saccharomyces cerevisiae,
Sm: Saccharomyces mikatae
Sr: Stevia rebaudiana
Js: Jungermannia subulata
제조된 6종의 재조합 플라스미드 S. cerevisiae의 유전체로 삽입을 위해 SwaI(NEB)을 처리한 후 LiAc(Lithium acetate) 방법을 이용하여 S. cerevisiae CEN PK2-1c 균주에 형질전환하였다. 제조된 6종의 유전자 카세트들은 S. cerevisiae 유전체의 GAL7-GAL10-GAL1위치에 상동재조합 형태로 삽입되었으며, LEU 선별마커를 통해 6종의 유전자 카세트들이 삽입된 재조합 균주들을 선별하였다.
실시예 3. 재조합 균주의 배양
실시예 2에서 제조한, 카우렌을 생합성하는 재조합 효모의 배양은 표 2의 배지를 사용하여 배양하였다. 재조합 효모 균주의 배양은 고체배지에 배양한 뒤 표 2에 나타낸 배지 5 mL에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 9시간 전배양하였다. 전배양액의 세포들은 최종적으로 25 mL의 표 2 배지에 접종한 뒤 멸균된 2 mL 도데칸(dodecane)을 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 72시간 동안 진탕배양하였다. 이에 따라, Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양물과 배양 세포균체를 얻었다.
배지성분 사용조건 (g/L)
YNB(yeast nitrogene base) 6.7
MES 100 mM
Glucose 20
암모니아수 pH 6.0 조정
실시예 4. LC-MS를 이용한 중간체 물질의 정량분석
4-1: 중간체 확인을 위한 재조합 효모 배양
대사 산물로서 중간체 물질인 파네졸산(FPP), 게라닐게라닐산(GGPP) 등을 확인하기 위해서, 실시예 2에서 얻어진 6종의 카우렌 생합성 효모 균주를 36시간 배양하였다. 대수 증식기에서 배양 세포를 이용하여 중간체 생산을 확인하였다.
구체적으로, 중간체의 확인을 위해 배양한 균체액을 냉각시킨 식염수 용액 45mL에 상기 효모 배양액 5 mL을 섞고, 원심분리(5000 g, 10 min, 0) 하여 상등액을 빠르게 버리고 다시 냉각된 식염수 용액으로 세척하였다. 원심분리로 상등액을 제거하고 균체를 얼음에 보관한 후 추출공정에 사용하였다.
4-2: 재조합 효모 세포로부터 대사산물의 추출
대사산물의 추출을 위해, 95℃ water bath에서 가열한 70%((v/v) 에탄올 수용액을 1.5 mL 첨가하여 상기 균체를 잘 풀어준 다음, 3분 동안 95℃ bath에서 120 rpm으로 shaking하여 대사산물을 추출한 후, 얼음에 넣어 빠르게 식힌 다음 5분 동안 보관 후 원심분리(15000 g, 5분)하여 상등액을 얻었으며, 상기 상등액을 이용하여 LC-MS 분석을 실시하였다.
대사산물의 분석은 LC-MS 방법을 이용하는데 gemini-NX C18 150 mm X2mm, 3 um 110 A particale (Phenomenex) column을 이용하고, 이동상은 7.5 mM tributylamine(pH 4.95) 용액과 아세토나이트릴을 각각 이용하여 Gradient로 분석하였다. 상기 LC-MS 분석 조건을 하기 표 3에 나타냈다.
Time (min) Eluent B(%)
0 0
10 15
35 30
45 70
47 100
49 100
55 100
56 0
60 0
상기 GGPP 추출물의 LC-MS 분석을 통하여 재조합 효모 균체의 추출물에서 FPP와 GGPP의 존재를 확인하였다.
실시예 5. 효모 배양의 도데칸층 및 배양액과 균체로부터 카우렌 추출
5-1: 카우렌 생산 및 추출
재조합 균주의 배양 과정에서, 도데칸을 첨가하면서 재조합 효모를 배양하는 경우, 도데칸 층에 카우렌이 축적되므로, 도데칸 층에 존재하는 카우렌과 세포를 파쇄하고 헥산으로 추출한 세포 추출물에 포함된 카우렌의 함량을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 실시예 3과 동일한 방법으로 재조합 균주를 12시간 동안 배양하고 상기 배양액의 상층에 존재하는 도데칸 층 200 uL를 물이 포함되지 않도록 샘플을 확보하여, 도데칸 층의 카우렌의 생산량을 확인 실험에 사용하였다.
또한, 세포 배양액과 배양 세포로부터 카우렌을 확인하였다. 구체적으로, 배양 세포로부터의 카우렌 추출과정은 실시예 3에서 얻어진 3 mL의 Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양하여 얻어진 효모 배양물(전체 배양세포 포함)을 원심분리(13000 g, 5분)하여 균체를 회수하였다.
상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액 1mL을 400ul hexane 과 섞어서 2mL screw-capped tube에 옮긴 후 추출 과정을 거처 세포 배양액내에 존재하는 카우렌 양을 확인하는 실험에 사용하였다.
상기 원심 분리에서 회수한 균체는 물 1ml로 2회 씻은 후 0.5 mm입경을 갖는 glass bead 을 200 mg 양으로 넣고, 포화 염화나트륨 용액을 200 ul 첨가하였다. 그런 후에, Hexane을 400 ul 첨가하여 screw-capped tube 에 옮긴 후, 분당 6500회 bead-beating하여 카우렌을 추출하여 카우렌의 생산량을 확인 실험에 사용하였다.
5-2: GC-MS 분석을 통한 카우렌 정량
실시예 5-1에서 추출한 카우렌의 양은 GC-MS를 통하여 분석하였다. 구체적으로, GC-MS 분석은 실시예 5-1에서 얻어진, 세포 배양액의 도데칸 층에 포함된 시료, 상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액의 헥산 추출물 시료, 및 배양 세포의 추출물 시료를 분석하였다. 4 ul injection을 260℃에서 실시하였고, 분석용 컬럼은 30 m 0.24 um 0.25 um + 10 m EZ guard (Agilent CP9013)을 사용하고 유동상은 1 mL/min 의 속도로 헬륨가스를 사용하였고, GC-MS Gradient 조건은 다음 표 3고 같이 실행하였다.
온도 시간 비고
40 2 -
40 - 210 15.4 +11 / min
210 2 -
210 - 250 6.1 +6.5 / min
250 15 -
5-3: 재조합 효모 세포로부터 부산물 생성 확인
카우렌 생산과정은 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate), CPP(copalyl pyrophosphate) 의 중간체를 거치면서 이루어진다. 카우렌 생합성 과정에서 카우렌 생성은 5-1의 분석으로 확인하였다. 카우렌 생산 과정의 각 중간체가 가수분해되면 파네졸(FPP 가수분해산물) 및 게라닐게라니올(GGPP 가수분해 산물) 등의 부산물이 생성된다. 대사공학적으로 유도된 효모의 경우, 파네졸, 게라닐게라니올, 카우렌 등의 분포에 따라 대사과정의 방향성을 확인할 수 있다.
구체적으로, 실시예 3에서 배양한 세포 배양물 중에 파네졸, 게라닐게라니올, 및 카우렌 생성을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 5-1 및 5-2와 실질적으로 동일한 방법으로 세포 배양액의 도데칸 층에 포함된 시료, 상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액의 헥산 추출물 시료, 및 배양 세포의 추출물 시료를 GC-MS 방법으로 분석하였다.
상기 GC-MS 분석 결과로부터, 파네졸, 게라닐게라니올, 카우렌 등을 확인하였다. 구체적으로, 균체의 헥산 추출물에는 파네졸, 카우렌 및 스쿠알렌이 존재하고, 도데칸 층에는 파네졸, 카우린, 및 게라닐게라니올이 존재함을 확인하였다. 이 과정 중에 스쿠알렌(squalene)의 경우 균체의 헥산 추출물에만 존재하였다. 제작된 카우렌 생성 균주의 GC-MS 분석을 통하여 카우렌과 부산물의 생성을 탐색한 GC-MS 분석 결과를 하기 표 5에 기재하였다.
strain Average Titre(mg/L)
Product Average Standard deviation
S1 farnesol 26.870 4.306
geranylgeraniol 2.167 0.577
kaurene 0.059 0.008
S2 farnesol 19.797 5.030
geranylgeraniol 3.967 0.670
kaurene 0.119 0.054
S3 farnesol 19.407 1.897
geranylgeraniol 6.523 6.088
kaurene 0.170 0.126
S4 farnesol 17.007 13.655
geranylgeraniol 0.760 0.518
kaurene 0.160 0.024
S5 farnesol 29.790 9.685
geranylgeraniol 4.470 0.695
kaurene 1.267 0.540
S6 farnesol 28.183 4.476
geranylgeraniol 10.030 1.015
kaurene 0.794 0.102
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 재조합 효모 배양액의 도데칸 층을 GC-MS로 분석한 결과. 파네졸 생성량이 25~30 mg/L임을 확인하였으며, 게라닐게라니올의 생성량은 편차가 심하였다. 이는 세포 내에 존재하는 FPP 농도의 차이에 의해 나타나고 GGPP의 경우 geranylgeraniol과 연관되어 차이를 보이고 GGPP 생합성 모듈로서 ERG20F96C의 경우 XdCrtE-ERG20, BTS1-ERG20 보다 생성량이 많았다.
카우렌 농도의 경우, Stevia rebaudiana 유래의 CDPS와 KS의 조합에서 생성량이 낮았고, 이중기능(bifunctional) 효소를 사용한 조합의 경우 높게 나타났다. CDPS, KS의 유전자 모듈에서 작용하여 카우렌 생산된 평균치는 Stevia rebaudiana 유래의 SrCDPS, SrKS의 경우 0.116이고, 이끼류(Jungermannia subulata) 유래인 JsCDPS/KS의 경우 0.740 mg/L의 생산량 평균치를 보였다. 이를 보면 이끼류 유래의 JsCDPS/KS의 경우 광범위하게 카우렌으로 전환할 수 있는 능력을 가진 것을 확인하였다.
실시예 6. 스테비올 생산균주를 이용한 스테비올 생산
6-1: 스테비올 생산균주의 제조
카우렌 생산균주인 S6와 S9 균주를 선별하여, 스테비올 생산을 위해서, 카우렌 산화효소(kaurene oxidase, KO)와 카우렌산 수산화효소(Ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase, KAH) 및 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR)를 포함한 총 3가지 효소 유전자를 도입하여 스테비올 생산용 재조합 효소를 제조하였으며, 이를 S6-steviol로 명명하였다. 문헌 상으로 확인된 S. rebaudiana 유래의 KO (SrKO) 및 KAH (SrKAH)와 Arabidopsis thaliana 유래와 S.cereviiae의 CPR (AtCPR, yCPR)을 사용하였다.
구체적으로, KO, KAH, 및 CPR 유전자의 재조합 효모내로 도입은 상동 재조합방식으로 도입하였는데, 효모의 DPP(diphosphate phosphatase)1 위치에 유전자를 도입하도록 상동유전자 부분을 결합한 형태로 SrKAH와 AtCPR의 유전자 발현 카세트와 SrKO와 yCPR 유전자를 각각 하나의 모듈로 제조하고, 유전자 내에 hygromycin 내성인자인 Hph(hygromycin B phosphotransferase)를 도입하여 발현 카세트를 포함하여 DPPF1, DPPF2, DPPF3, DPPF4를 제작하였다. 각각의 유전자 덩어리는 pBluescipt SK에 서브클로닝 하였고, 유전자서열분석을 통하여 유전자가 정상적으로 발현할 수 있는 형태을 확인하였다. 확인된 유전자 카세트를 PCR을 통해서 증폭하고, 증폭된 각각의 유전자 발현 카세트들은, LiAc 형질전환방법을 이용하여, 실시예 2의 재조합 효모에 형질전환하였다. 구체적으로 DPPF1, DPPF2, DPPF3, 및 DPPF4는 하기 표 6에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 증폭 반응을 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 72℃에서 4분의 반응을 30회 반복하여 확보하였다. 상기 제조된 DPPF1, DPPF2, DPPF3, DPPF4의 핵산서열은 각각 서열번호 3 내지 6에 나타냈다.
명명 핵산서열 (5'->3') 서열번호
유전자 DPPF1의 정방향 프라이머 CGCCGAGGGTATTTTACTTCC 7
유전자 DPPF1의 역방향 프라이머 GCACTCGAAACTTCAGGTTC 8
유전자 DPPF2의 정방향 프라이머 GGTGTTATCGTTGCTGGTGG 9
유전자 DPPF2의 역방향 프라이머 GATAGTACTAGAGACACATATTC 10
유전자 DPPF3의 정방향 프라이머 GGCACTGGTCACTCTTTTGG 11
유전자 DPPF3의 역방향 프라이머 CTGTCCTTGCCTGGTGGG 12
유전자 DPPF4의 정방향 프라이머 CTCTCGCCGCTCGCCATC 13
유전자 DPPF4의 역방향 프라이머 CAACCGGCTCTTTGTCAACAG 14
효모에 도입된 유전자는 효모 내에서 In vivo assembly 과정으로 조립 되고, 최종적으로 DPP1 유전자 자리에 상동재조합 과정에 의해 효모 유전체 내로 삽입되었다. KAH/CPR 조합 카세트가 도입된 형질전환 균주는 Hygromycin (200 mg/L)에 내성을 바탕으로 선별하여, KO, KAH, 및 CPR 유전자가 도입된 효모균주를 확보하였다.
6-2: 재조합 효모균주의 배양 및 스테비올 생산
KO, KAH 및 CPR 유전자가 도입된 형질전환 균주(S6-steviol)을 3 mL YPD 배지에서 전배양 후, 초기 OD600가 0.1~0.2가 되도록 조정하여 50 mL YPD (50 g/L glucose) 플라스크에서 온도 30°C 및 250 rpm에서 본배양을 수행하였다. 본 배양의 샘플링은 72시간 배양 후 OD600를 측정 후 5 mL씩 취하여 분주하였다. 상기 배양된 스테비올 생산 균주의 OD600를 측정하여 균주별로 생장 정도를 확인하였다.
상기 스테비올 생산 균주의 배양액 5 mL로부터 세포추출물을 추출하여 스테비올이 생산되었는지 확인하였다. 구체적으로, 스테비올의 추출방법은 CSH (Cold Spring Harbor)에서 제작한 LC-MS 분석을 위한 효모로부터의 추출물 분리 방법으로써, 세포 배양물에서 원심분리를 하여 세포를 회수하고, MeOH:ACN:H2O (2:2:1) 용매를 사용하여 세포를 희석하고, -70°C에서 30분간 정치한 뒤 상온에서 30분 동안 교반하여 스테비올 추출을 진행하였다.
추출된 샘플은 여과 후에 Gradient HPLC를 통해 분석하였다. 스테비올 표준물질과 비교하여, 상기 추출물로부터 스테비올이 동일한 머무름값(retention time, RT)을 가지는 물질을 확인할 수 있었고, 배양시간의 증가에 따라 스테비올 의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 최종적으로 S6-steviol 균주에서 생산되는 스테비올의 생산량은 0.67 ± 0.22(mg/L)이었다.
<110> SAMYANG CORPORATION <120> production of steviol and their precursors <130> DPP20184721KR <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 782 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JS CDPS/KS enzyme of Jungermannia subulata <400> 1 Met Ser Phe Glu Lys Ser Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Pro Asn Gly 1 5 10 15 Arg Ser Lys Pro Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Gly Lys Glu Ala Glu Glu 20 25 30 Ile Lys Gln Trp Ile Glu Glu Ile Arg Ala Met Met Gly Ser Met Thr 35 40 45 Asp Gly Glu Ile Thr Asn Ser Pro Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Leu 50 55 60 Val Pro Ala Leu Asp Gly Ser Asp Gly Pro Gln Phe Pro Lys Ser Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ile Ile Glu Asn Gln Phe Ser Asp Gly Ser Trp Gly Asp Arg 85 90 95 Gly Tyr Phe Ser Tyr Tyr Asp Arg Val Cys Asn Thr Leu Ala Cys Ile 100 105 110 Ile Ala Leu Lys Thr Trp Lys Thr Gly Ser Ala Ala Val Glu Lys Gly 115 120 125 Val Glu Phe Ile Gln Lys Asn Leu Gln Ala Met Glu Thr Glu Glu Asp 130 135 140 Ala His Met Met Ile Gly Phe Glu Ile Val Phe Pro Ala Leu Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Ala Lys Ser Leu Asp Leu Asp Leu Pro Phe Asp Ala Pro Ile Ile 165 170 175 Ala Lys Ile Ser Ala Glu Arg Glu Lys Lys Leu Ala Lys Ile Pro Met 180 185 190 Asp Ile Leu His Lys Val Pro Thr Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly 195 200 205 Phe His Glu Glu Leu Asp Trp Glu Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Glu 210 215 220 Asp Gly Ser Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ser Thr Ala Ala Cys Leu Leu 225 230 235 240 His Thr Lys Asp Glu Lys Ala Leu Ser Tyr Leu Thr Ser Leu Leu Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asn Ala Val Pro Asn Val Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu 260 265 270 His Met Trp Thr Val Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Ile Asp Arg Tyr 275 280 285 Phe Glu Lys Glu Ile Lys Asp Ser Leu Asp Tyr Val Tyr Lys Tyr Tyr 290 295 300 Lys Ser Val Gly Ile Gly Trp Ala Arg Gly Ser Val Val Gln Asp Leu 305 310 315 320 Asp Asp Thr Ala Met Gly Phe Arg Leu Leu Arg Gln Asn Gly Tyr Asp 325 330 335 Val Asn Glu Asp Val Phe Arg Gln Phe Lys Gly Lys Glu Ser Glu Phe 340 345 350 Phe Cys Phe Ala Gly Gln Ser Gly Gln Ala Val Thr Gly Leu Phe Asn 355 360 365 Phe Tyr Arg 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Tyr Asn Thr Leu Asn Ala Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu 580 585 590 Ala Gln Gly Arg Asp Ile Gly Gln His Leu Gln Lys Ile Trp Leu Arg 595 600 605 Trp Leu Glu Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Trp Thr Ala Ser Ser Phe 610 615 620 Ser Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Met Lys Asn Ala Leu Pro Ser Ile Ala 625 630 635 640 Leu Glu Pro Ile Val Leu Cys Thr Leu Phe Phe Leu Gly Glu Pro Leu 645 650 655 Ser Asp Glu Phe Val Gly Asp Ser Gln Lys Leu Arg Leu Met Glu Leu 660 665 670 Thr Asn Arg Val Gly Arg Leu Leu Asn Asp Ser Gln Gly Trp Lys Arg 675 680 685 Glu Asp Ser Gln Asn Lys Pro Asn Ser Val Ser Ile Leu Leu Arg Glu 690 695 700 Asn Pro Gly Trp Thr Glu Glu Glu Ala Ile Ala Asn Val Arg Ser Thr 705 710 715 720 Val Glu Glu Ser Met Leu Glu Leu Val Arg Ala Val His Gln Arg Ser 725 730 735 Pro Ile Pro Asn Ser Ile Arg Gln Leu His Phe Asn Met Ala Arg Ile 740 745 750 Met His Leu Phe Tyr Gln Lys Thr Asp Gly Phe Thr Asp Arg Ser Ala 755 760 765 Met Ala Lys Lys Leu Lys Lys Val Leu Phe Gln Pro Val Val 770 775 780 <210> 2 <211> 2349 <212> 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780 gctgttccaa atgtttaccc agttgatttg tttgaacata tgtggacagt tgatagattg 840 caaagattgg gtatcgatag atacttcgaa aaggaaatca aagattcttt agattatgtt 900 tacaaatatt acaaatcagt tggtattggt tgggctagag gttctgttgt tcaagatttg 960 gatgatactg caatgggttt cagattgttg agacaaaacg gttacgatgt taacgaagat 1020 gtttttagac aattcaaagg taaagaatca gaatttttct gttttgctgg tcaatctggt 1080 caagcagtta ctggtttgtt taatttctac agagctactc aaacaagatt tcctggtgaa 1140 tctttgttag ctacaggtga acattttgca agaggtttct tggttgaaag acatgaaaag 1200 aatgaatgtt tcgataagtg gatcatcact aaagatttgc caggtgaagt tgaatatgct 1260 ttggcaacac cttggtactg ttcattgcca agattggaaa ctgaatctta tttgtcacat 1320 tacggtacag atgatatttg gatcggtaaa tctttgtaca gaatgccatt cgttaacaac 1380 gaaacatttt tggctttggc aaaggctgat ttcaatttgt gtcaagctaa gcatcaagaa 1440 gatttgcaaa acatcacaag atggtcagaa gattgtggtt tcggtaaatt atcttttgct 1500 agacaaaagg ctattgaagg tgttttctct gctgcttgta ttttgccagg tccagaatta 1560 tctccagcta gattggtttg ggcacaaaat tgtgttttga ctacagttgt tgatgattac 1620 tttgatgttg gtggtacatt accagatatg agaagatttt tggaagcctt taaagaatgg 1680 aatccatctt tgatggatgg tactgctgaa gaagctcaaa tcgtttttaa tggtttgtac 1740 aacacattga acgctatgac tcaagaaggt acattagcac aaggtagaga tattggtcaa 1800 catttgcaaa agatttggtt aagatggttg gaatcatgtt tgactgaagc tgaatggaca 1860 gcatcttcat tttctccatc atttgatgaa tacatgaaga acgctttacc atctattgca 1920 ttggaaccta ttgttttgtg tactttgttt ttcttgggtg aaccattatc agatgaattt 1980 gttggtgact ctcaaaaatt gagattgatg gaattgacaa acagagttgg tagattgttg 2040 aacgattcac aaggttggaa gagagaagat tctcaaaata agccaaattc tgtttcaatt 2100 ttgttgagag aaaacccagg ttggactgaa gaagaagcta ttgctaatgt tagatcaaca 2160 gttgaagaat ctatgttaga attggttaga gcagttcatc aaagatcacc aatcccaaat 2220 tctatcagac aattacattt caacatggct agaatcatgc atttgtttta ccaaaagact 2280 gatggtttta cagatagatc agctatggct aagaaattga agaaagtttt atttcaacca 2340 gttgtttaa 2349 <210> 3 <211> 5530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPPF1 polynucleotide sequence <400> 3 cgccgagggt attttacttc 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ttttctccat cttcaactgc 1740 attcgctttg atgcaaacaa aggatgaaaa gtgtttgcaa tatttgacta acatcgttac 1800 aaagtttaat ggtggtgttc caaatgttta cccagttgat ttgttcgaac atatttgggt 1860 tgttgataga ttgcaaagat taggtatcgc aagatacttc aagtctgaaa ttaaagattg 1920 tgttgaatac atcaataagt actggactaa aaatggtatt tgttgggcta gaaacactca 1980 tgttcaagat attgatgata cagcaatggg ttttagagtt ttgagagcac atggttatga 2040 tgttacacca gatgttttta gacaattcga aaaggatggt aaatttgttt gttttgcagg 2100 tcaatcaact caagctgtta caggcatgtt caatgtttac agagcatctc aaatgttgtt 2160 tccaggtgaa agaattttag aagatgctaa gaaattttct tacaactact taaaggaaaa 2220 gcaatctact aatgaattgt tagataaatg gattattgct aaagatttgc caggtgaagt 2280 tggttatgca ttagatattc cttggtacgc ttctttgcca agattagaaa caagatacta 2340 cttggaacaa tatggtggtg aagatgatgt ttggatcggt aaaactttat acagaatggg 2400 ttacgtttca aacaacacat acttggaaat ggcaaaattg gattacaaca actacgttgc 2460 tgttttgcaa ttagaatggt acactatcca acaatggtac gttgatattg gtatcgaaaa 2520 gttcgaatct gataacatca aatcagtttt ggtttcttat 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caagataacg tttgtttgac acgattacat tattcgtcga catctttttt 2040 cagcctgtcg tggtagcaat ttgaggagta ttattaattg aataggttca ttttgcgctc 2100 gcataaacag ttttcgtcag ggacagtatg ttggaatgag tggtaattaa tggtgacatg 2160 acatgttata gcaataacct tgatgtttac atcgtagttt aatgtacacc ccgcgaattc 2220 gttcaagtag gagtgcacca attgcaaagg gaaaagctga atgggcagtt cgaatagcgc 2280 gaacaaaaat cacgatctgg gtgggtgtgg gtgtattgga ttataggaag ccacgcgctc 2340 aacctggaat tacaggaagc tggtaatttt ttgggtttgc aatcatcacc atctgcacgt 2400 tgttataatg tcccgtgtct atatatatcc attgacggta ttctattttt ttgctattga 2460 aatgagcgtt ttttgttact acaattggtt ttacagacgg aattttccct atttgtttcg 2520 tcccattttt ccttttctca ttgttctcat atcttaaaaa ggtcctttct tcataatcaa 2580 tgctttcttt tacttaatat tttacttgca ttcagtgaat tttaatacat attcctctag 2640 tcttgcaaaa tcgatttaga atcaagatac cagcctaaaa atgaatgagc agtagctcct 2700 caagctccac gtctatgata gacttgatgg ccgcgataat taagggggaa ccagtgattg 2760 ttagtgaccc ggctaatgcg agtgcatacg aatcagtagc ggctgaactg tcatctatgt 2820 tgatcgagaa 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gaatatgtgt ctctagtact atcataaaaa acacgctttt 120 tcagttcgag tttatcatta tcaatactgc catttcaaag aatacgtaaa taattaatag 180 tagtgatttt cctaacttta tttagtcaaa aaattagcct tttaattctg ctgtaacccg 240 tacatgccca aaataggggg cgggttacac agaatatata acatcgtagg tgtctgggtg 300 aacagtttat tcctggcatc cactaaatat aatggagccc gctttttaag ctggcatcca 360 gaaaaaaaaa gaatcccagc accaaaatat tgttttcttc accaaccatc agttcatagg 420 tccattctct tagcgcaact acagagaaca ggggcacaaa caggcaaaaa acgggcacaa 480 cctcaatgga gtgatgcaac ctgcctggag taaatgatga cacaaggcaa ttgacccacg 540 catgtatcta tctcattttc ttacaccttc tattaccttc tgctctctct gatttggaaa 600 aagctgaaaa aaaaggttga aaccagttcc ctgaaattat tcccctactt gactaataag 660 tatataaaga cggtaggtat tgattgtaat tctgtaaatc tatttcttaa acttcttaaa 720 ttctactttt atagttagtc ttttttttag ttttaaaaca ccaagaactt agtttcgaat 780 aaacacacat aaacaaacaa aatgacttct catggtggtc aaactaatcc aacaaatttg 840 attattgata ctacaaagga aagaatacaa aaattgttta aaaatgttga aatttctgtt 900 tcttcttatg atacagcatg ggttgctatg 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<223> Reverse PCR primer for DPPF4 polynucleotide sequence <400> 14 caaccggctc tttgtcaaca g 21 <210> 15 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of eranylgeranyl pyrophosphate synthase (BTS1) of Saccharomyces cerevisiae <400> 15 Met Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn Asp Pro Val Trp Ser 1 5 10 15 Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ile Ser Lys Pro Tyr Asn His Ile Leu Leu 20 25 30 Lys Pro Gly Lys Asn Phe Arg Leu Asn Leu Ile Val Gln Ile Asn Arg 35 40 45 Val Met Asn Leu Pro Lys Asp Gln Leu Ala Ile Val Ser Gln Ile Val 50 55 60 Glu Leu Leu His Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn 65 70 75 80 Ala Pro Leu Arg Arg Gly Gln Thr Thr Ser His Leu Ile Phe Gly Val 85 90 95 Pro Ser Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Met Tyr Phe Arg Ala Met Gln 100 105 110 Leu Val Ser Gln Leu Thr Thr Lys Glu Pro Leu Tyr His Asn Leu Ile 115 120 125 Thr Ile Phe Asn Glu Glu Leu Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Leu 130 135 140 Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Phe Leu Pro Glu Ile Ile Pro Thr Gln Glu 145 150 155 160 Met Tyr Leu Asn Met Val Met Asn Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Leu 165 170 175 Thr Leu Arg Leu Met Glu Ala Leu Ser Pro Ser Ser His His Gly His 180 185 190 Ser Leu Val Pro Phe Ile Asn Leu Leu Gly Ile Ile Tyr Gln Ile Arg 195 200 205 Asp Asp Tyr Leu Asn Leu Lys Asp Phe Gln Met Ser Ser Glu Lys Gly 210 215 220 Phe Ala Glu Asp Ile Thr Glu Gly Lys Leu Ser Phe Pro Ile Val His 225 230 235 240 Ala Leu Asn Phe Thr Lys Thr Lys Gly Gln Thr Glu Gln His Asn Glu 245 250 255 Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu 260 265 270 Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr 275 280 285 Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu 290 295 300 Asn Lys Tyr Leu Pro Asp Leu Ala Ser His Ser Asp Thr Ala Thr Asn 305 310 315 320 Leu His Asp Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu 325 330 335 <210> 16 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGDP synthase (crtE) of Xanthophyllomyces dendrorhous <400> 16 Met Asp Tyr Ala Asn Ile Leu Thr Ala Ile Pro Leu Glu Phe Thr Pro 1 5 10 15 Gln Asp Asp Ile Val Leu Leu Glu Pro Tyr His Tyr Leu Gly Lys Asn 20 25 30 Pro Gly Lys Glu Ile Arg Ser Gln Leu Ile Glu Ala Phe Asn Tyr Trp 35 40 45 Leu Asp Val Lys Lys Glu Asp Leu Glu Val Ile Gln Asn Val Val Gly 50 55 60 Met Leu His Thr Ala Ser Leu Leu Met Asp Asp Val Glu Asp Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Arg Arg Gly Ser Pro Val Ala His Leu Ile Tyr Gly Ile Pro 85 90 95 Gln Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Ala Tyr Gln Glu 100 105 110 Ile Phe Lys Leu Arg Pro Thr Pro Ile Pro Met Pro Val Ile Pro Pro 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Leu Gln Ser Ser Val Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Ser Glu Asn Gly Gly Thr Ser Thr Pro Asn Ser Gln Ile 145 150 155 160 Pro Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Leu Asp Lys Val Ile Thr Asp Glu Met 165 170 175 Leu Ser Leu His Arg Gly Gln Gly Leu Glu Leu Phe Trp Arg Asp Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Val Lys Met Val Leu Gly Lys 195 200 205 Thr Gly Gly Leu Phe Arg Ile Ala Val Arg Leu Met Met Ala Lys Ser 210 215 220 Glu Cys Asp Ile Asp Phe Val Gln Leu Val Asn Leu Ile Ser Ile Tyr 225 230 235 240 Phe Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Ser Glu Tyr Ala 245 250 255 His Asn Lys Asn Phe Ala Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe 260 265 270 Pro Thr Ile His Ser Ile His Ala Asn Pro Ser Ser Arg Leu Val Ile 275 280 285 Asn Thr Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ser Pro Glu Ile Leu His His Cys 290 295 300 Val Asn Tyr Met Arg Thr Glu Thr His Ser Phe Glu Tyr Thr Gln Glu 305 310 315 320 Val Leu Asn Thr Leu Ser Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Gly Arg Leu 325 330 335 Gln Gly Glu Phe Ala Glu Ala Asn Ser Lys Ile Asp Leu Gly Asp Val 340 345 350 Glu Ser Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asn Val Lys Leu Glu Ala Ile Leu 355 360 365 Lys Lys Leu Ala Asp Ile Pro Leu 370 375 <210> 17 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GGPP synthase ERG20F96C from Saccharomyces cerevisiae <400> 17 Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe 1 5 10 15 Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met 20 25 30 Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr 35 40 45 Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala 50 55 60 Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Cys 85 90 95 Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp 115 120 125 Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe 130 135 140 Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val 145 150 155 160 Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro 165 170 175 Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe 180 185 190 Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala 195 200 205 Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln 210 215 220 Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp 225 230 235 240 Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly 245 250 255 Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu 260 265 270 Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly 275 280 285 Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp 290 295 300 Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys 305 310 315 320 Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys 325 330 335 Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys 340 345 350

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고,
    ent-카우렌 옥시다제 (KO) 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 및 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 재조합 숙주세포;
    상기 재조합 숙주세포의 균체; 상기 재조합 숙주 세포의 배양물; 또는 상기 재조합 숙주 세포의 배양물에서 얻어지는 추출물을 포함하는,
    스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 이끼류에서 유래된 것인, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화되는 것인, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포는 스테비올 글리코사이드 또는 이의 전구체를 생산하는 것인, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포는 게라닐게라닐 파이로포스페이트 (GGPP) 신타제를 암호화하는 유전자를 추가로 포함하는 것인, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 숙주가 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함하는, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 진균류 세포가 효모 세포인, 스테비올 글리코시드 생산용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제5항에 있어서, 상기 전구체는 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate), CPP(copalyl pyrophosphate), 카우렌 및 카우레노익산(kaurnoic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
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