KR102379608B1 - 개선된 스테비올 배당체 화합물 또는 이의 전구체의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체 생합성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 스테비올 생산 효소, 스테비올 배당체 생산 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물과, 상기 효소 또는 미생물을 이용한 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체의 생산용 조성물, 및 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 스테비올 배당체 화합물 또는 이의 전구체의 생산{Improved production of steviol glycoside and its precursors}

본 발명은 스테비올, 스테비올 전구체 또는 스테비올 배당체의 전구체 생합성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 스테비올 생산 효소 또는 스테비올 배당체 생산 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소 또는 미생물을 이용한 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체의 생산용 조성물, 및 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

감미료는 식품, 음료, 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품 산물에 통합될 수 있거나 또는 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 가정용 대체물로 이용할 수 있다. 감미료는 예를 들어 수크로오스, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 및 꿀과 같은 천연 감미료들, 그리고 예를 들어 아스파르탐, 사카린 및 수크랄로오스(sucralose)와 같은 인공 감미료를 포함한다.

스테비아(Stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출할 수 있는 천연 감미료이다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품 및 블렌드에서 고감도 조미료로, 또는 단독으로 식탁 감미료로 시판된다.

스테비아 식물의 추출물들은 레바우디오시드 및 단맛에 기여하는 기타 스테비올을 함유하지만, 각 글리코시드의 양은 상이한 생산 일괄량 (batches)에 따라 흔히 변화한다. 기존의 시판 제품들은 주로 레바우디오시드 A이며, 적은 양의 레바우디오시드 C, D, 및 F와 같은 기타 글리코시들이 있다. 스테비아 추출물은 또한 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물에서 유도된 화합물과 같은 오염물질을 함유할 수 있다. 이러한 이취는 선택된 식품 시스템 또는 용도에 따라 대체로 문제가 될 수 있다.

스테비아 추출물의 조성물은 식물이 성장하는 토양 및 기후에 따라 매우 다양할 수 있다. 원료 식물, 기후 조건, 및 추출 공정에 따라, 상업적 제조 과정에서 레바우디오시드 A의 양은 총 스테비올 글리코시드 함량의 20 내지 97%로 다양하다고 보고된다. 또 다른 스테비올 글리코시드들이 스테비아 추출물 내에 다양한 양으로 존재한다.

스테비아 식물로부터의 스테비올 글리코시드의 회수 및 정제가 노동 집약적이고 비효율적인 것으로 밝혀지면서, RebD 및 RebM과 같은 고수율의 요망되는 스테비올 글리코시드를 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이 여전히 요구되고 있다. 또한, 상업적 용도를 위한 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 개선된 생산에 대한 요구가 여전히 있다.

본 발명의 일 예는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 스테비올 생산 효소, 및 스테비올 배당체 생산 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물과, 상기 효소 또는 미생물을 이용한 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체의 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는 스테비올 전구체를 생산하는 효소, 스테비올 생산 효소, 및 스테비올 배당체 생산 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물과, 상기 효소 또는 미생물을 이용한 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예에 따라 효모를 이용하여 스테비올 전구체, 예컨대 카우렌을 생산하는 경우 하기 생합성 유전자 구조체를 포함할 수 있다:

(A) copalyl pyrophosphate (CPP) synthase를 이용하여 GGPP로부터 CPP의 생합성 및 kaurene synthase (KS)를 이용하여 CPP에서부터 카우렌(kaurene)의 생합성 구조체.

본 발명의 일 예에 따라 효모를 이용하여 스테비올을 생산하는 경우 하기 생합성 모듈을 포함할 수 있다:

(A) 카우렌의 생합성 구조체, 및

(B) Kaurene oxidase (KO)와 KO에 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR) 이용하여 카우렌으로부터 카우렌산(kaurenoic acid)의 생합성 및 Kaurenoic acid hydroxylase(KAH)와 CPR를 이용하여 카우렌산으로부터 스테비올의 생합성 구조체.

본 발명의 일 예에 따라 효모를 이용하여 스테비올 배당체를 생산하는 경우 하기 생합성 모듈을 포함할 수 있다:

(A) 카우렌의 생합성 구조체,

(B) 스테비올의 생합성 구조체, 및

(C) 스테비올에 글루코오스를 전달하는 효소를 이용하여 스테비올로부터 스테비올 배당체의 생합성 구조체.

상기 효모를 이용한 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체는 각각 (D) GGPP(geranyl geranyl pyrophosphate) synthase를 이용한 GGPP의 생합성 구조체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (D) GGPP의 생합성 구조체를 포함하는 경우, 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체와 개별 전사 프로모터에 의해서 조절될 수 있다.

상기 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체는 목적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산분자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다.

상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산분자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

이하, 효모를 이용한 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체에 관해 이하에서 자세히 기술하고자 한다.

본 발명의 일 예는 (A)카우렌(kaurene)의 생합성 유전자 구조체로서, copalyl pyrophosphate (CPP) synthase (CDPS, CPS)를 이용하여 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)로부터 CPP의 생합성 및 kaurene synthase (KS)를 이용하여 CPP에서부터 카우렌(kaurene)을 생성하는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질(bifunctional enzyme protein)과, 상기 이중 기능 효소 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되며, 상기 효소 단백질의 발현을 조절하는 조절 유전자를 포함한다. 상기 링커는 글리신(Glycine)이 1 내지 10개로 이루어지는 펩타이드 일 수 있으며, 예를 들면 3개 글리신, 4개 글리신, 5개 글리신, 6개 글리신, 또는 7개 글리신으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 상기 유전자에 삽입되는 경우 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 예를 들면 (GGT)가 1회 내지 10회 연결된 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 예를 들면 (GGT)가 3회 연결, 4회 연결, 5회 연결, 또는 6회 연결된 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 유전자와 조절 유전자는 융합 단백질로 발현되는 것이 바람직하며, 이 경우 번역단계에서 이중 기능 효소 단백질의 발현을 증가시킨다.

상기 효소의 기능적 발현을 향상시키기 위한 조절 유전자는, 대장균 유래의 말토오스 결합단백질(MBP), S. cerevisiae 유래의 CUP1, 또는 대장균 유래의 단백질 신장요소 (tsf)를 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 MBP 유전자의 일예는 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 서열 동일성이 90%이상, 95%이상, 97% 이상 또는 99%이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 CUP1 유전자의 일예는 서열번호 19의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 서열 동일성이 90%이상, 95%이상, 97% 이상 또는 99%이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 tsf 유전자의 일예는 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 서열 동일성이 90%이상, 95%이상, 97% 이상 또는 99%이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

상기 카우렌 생합성 유전자 구조체는 (D)GGPP 생합성 모듈을 추가로 포함할 수 있으며, 자세하게는 GGPP synthase를 이용하여 farnesyl pyrophosphate(FPP)로부터 GGPP를 합성하는 유전자 구조체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 GGPP synthase의 일 예는 BTS1 (서열번호 15), XdCrtE(서열번호 16), 및 ERG20^F96C (서열번호 17)로 이루어지는 군에서 선택된 단일 효소 또는 2개 효소단백질이 융합된 융합 단백질일 수 있으며, 2종 이상 효소의 융합 단백질로 생산하는 경우, 기능적 발현(soluble expression)을 증가하여 활성이 증가하는 장점이 있어 바람직하다.

예를 들면, GGPP synthase을 암호화하는 유전자의 예는, BTS1로서, UniProtKB accession number Q12051을 갖는 Saccharomyces cerevisiae의 BTS1이고 (서열번호 15의 아미노산 서열), Geranylgeranyl pyrophosphate synthase를 암호화는 유전자의 예는 XdCrtE로서 UniProtKB accession number Q1L6K3을 갖는 Xanthophyllomyces dendrorhous crtE이고 (서열번호 16의 아미노산 서열), GGPP synthase를 암호화하는 유전자의 예는 ERG20^F96C(DNA sequence of the GGPP synthase ERG20F96C from Saccharomyces cerevisiae)로서, 서열번호 17의 아미노산 서열에 의해 암호화되며, 구체적으로 참고문헌 Metabolic engineering 27 (2015) 65-75, Efficient diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase에 기재된 것이다.

본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질은 ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS)와 ent-카우렌 신타제 (KS)의 두 가지 기능을 모두 가지는 이중 기능 효소(bifunctional enzyme) 단백질이다. 본 발명에 따른 이중 기능 효소는 channelling을 형성하여 두 가지 반응을 연속적으로 빠르게 일어나게 하는 장점이 있어, 효소를 이용하여 생산한 산물의 수율 및 생산속도 등을 향상시키는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 가지는 이중 기능 효소는 기질로부터 카우렌 생성까지 진행할 수 있다. 본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 이용하는 경우, 종래에 사용하는 CDPS 및 KS의 두 가지 효소를 사용하는 것에 비해 Kaurene 생성 및 스테비올 생성이 증가한다.

본 발명에 따른 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질은 Jungermannia subulata 에서 유래되며, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질일 수 있다. 상기 효소 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상 또는 99%이상일 수 있다. 상기 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질은 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 염기서열에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 염기서열의 동일성은 적어도 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상 97% 또는 99%이상일 수 있다.

상기에서 용어 "상동성", "일치성" 또는 "동일성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열 또는 동일성 서열이 갖는 "% "으로 표시된다.

본 발명에 따른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 핵산분자에 관한 것이며, 예를 들면 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 것이며, 상기 유전자의 핵산 서열의 동일성은 적어도 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상 또는 99%이상일 수 있다.

상기 핵산분자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 전사 프로모터는 효모에서 유래된 GAL 프로모터일 수 있으며, 예를 들면 Saccharomyces cerevisiae 유래 GAL 프로모터 (예, ScGAL1), Saccharomyces mikatae 유래 GAL 프로모터 (예, SmGAL2), Saccharomyces eubayanus 유래 GAL 프로모터(예, SeGAL2), S. kudriavzevii 유래 GAL 프로모터(예, SkGAL1)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 예는 스테비올의 생합성 유전자 구조체로서,

(A)CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질(bifunctional enzyme protein)과 상기 이중 기능 효소 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되며, 상기 효소 단백질의 발현을 조절하는 조절 유전자를 포함하는 카우렌의 생합성 유전자 구조체, 및

(B) Kaurene oxidase (KO)와 KO에 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR) 이용하여 카우렌으로부터 카우렌산(kaurenoic acid)의 생합성 및 Kaurenoic acid hydroxylase(KAH)와 CPR를 이용하여 카우렌산으로부터 스테비올의 생합성 구조체를 포함한다.

상기 (A) 카우렌의 생합성 유전자 구조체에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 (B)스테비올의 생합성 유전자 구조체에 포함된 효를 암호화하 유전자는, KO, KAH, 및 CPR의 기능성 동족체(homolog)를 포함한다. 예를 들어, KO, KAH, 및 CPR의 기질 특이성을 변경시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 부위-지정된/논리적 돌연변이유발 접근법, 무작위 유도되는 진화 접근법 및 무작위 돌연변이유발/포화 기법이 효소의 활성 부위 부근에서 수행되는 조합법을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, S. rebaudiana 유래의 KO (SrKO) 및 KAH (SrKAH)와 Arabidopsis thaliana 유래와 S.cereviiae의 CPR (AtCPR, yCPR)을 사용할 수 있다. 구체적 사용 가능한 유전자로서, SrKO(stevia rebaudiana KO1, genbank accession number, Q6UQ67), SrKAH (stevia rebaudiana KA13H genebank accession number, Q0NZP1), AtCPR(arabidopsis thaliana CPR2, genbank accession number, Q9SUM3), 및 yCPR (Saccharomyces cerevisiae CPR1, genbank accession number, P16603)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종이상일 수 있다.

상기 조절 영역의 선택은 비제한적으로 특정 배양 단계 동안의 효율, 선택성, 유도성, 요망되는 발현 수준, 및 우선적인 발현을 포함하는 여러 인자에 의해 좌우된다. 코딩 서열에 대한 조절 영역을 적절하게 선택하고 정위함에 의해 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 관례적인 것이다. 하나를 초과하는 조절 영역, 예컨대 인트론, 인핸서, 업스트림 활성화 영역, 전사 종결인자, 및 유도성 요소가 존재할 수 있음이 이해될 것이다.

본 발명의 일 예는 스테비올 배당체, 예를 들면 스테비올-13 글루코시드의 생합성 유전자 구조체로서,

(A)CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질(bifunctional enzyme protein)과 상기 이중 기능 효소 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되며, 상기 효소 단백질의 발현을 조절하는 조절 유전자를 포함하는 카우렌의 생합성 유전자 구조체,

(B) Kaurene oxidase (KO)와 KO에 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR) 이용하여 카우렌으로부터 카우렌산(kaurenoic acid)의 생합성 및 Kaurenoic acid hydroxylase(KAH)와 CPR를 이용하여 카우렌산으로부터 스테비올의 생합성 구조체; 및

(C) 스테비올에 글루코오스를 전달하는 효소를 이용하여 스테비올로부터 스테비올 배당체의 생합성 구조체를 포함한다.

상기 효모를 이용한 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체는 각각 (D) GGPP(geranyl geranyl pyrophosphate) synthase를 이용한 GGPP의 생합성 구조체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (D) GGPP의 생합성 구조체를 포함하는 경우, 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체와 개별 전사 프로모터에 의해서 조절될 수 있다.

상기 스테비올에 글루코오스를 전달하는 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 예를 들면 스테비올의 13번 탄소에 글루코오스를 전달하는 UDP-glycosyltransferase 85C2 (UGT85C2)와 스테비올의 19번 탄소에 글루코오스를 전달하는 UDP-glycosyltransferase 74G1 (UGT74G1)를 포함한다. 구체적으로, UGT85C2 효소는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21의 아미노산 서열에 의해 암호화하는 서열 또는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. UGT74G1 효소는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21의 아미노산 서열에 의해 암호화하는 서열일 수 있다.

본 발명의 추가 일 예는, 상기 효모를 이용한 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체는 벡터에 도입되거나 숙주세포에 형질전환되어 이들 숙주세포를 이용하여 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 합성할 수 있다.

본 발명의 추가 일 예는, 상기 효모를 이용한 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 작동 가능한 조절 서열에 연결되어 포함될 수 있으며, 상기 조절서열은 전사 프로모터 등을 포함한다. 본 발명에 따른 카우렌 생합성 구조체를 포함하는 재조합 벡터의 일 예는 도 1에 예시적으로 도시되어 있다.

또한, 상기 효모를 이용한 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체를 포함하는 형질전환 세포에 관한 것이다. 상기 스테비올 전구체, 스테비올 또는 스테비올 배당체를 생합성 하는 유전자 구조체는 각각 별개 벡터 또는 하나의 벡터에 도입하여 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.

본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋다. 본원에 기재된 재조합 숙주는 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다. 상기 박테리아 세포는 에스체리치아 박테리아 세포, 예를 들어, 에스체리치아 콜라이 세포; 락토바실러스 박테리아 세포, 락토코커스 박테리아 세포, 코르네박테리움 박테리아 세포, 아세토박터 박테리아 세포, 아시네토박터 박테리아 세포, 또는 슈도모나스 박테리아 세포를 포함한다.

상기 진균류 세포는 효모 세포를 포함한다. 한 양태에서, 효모 세포는 사카로마아세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아쉬비아 고시피이(Ashbya gossypii), 사이베를린드네라 자디니이(Cyberlindnera jadinii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 잔토필로마이세스 덴드로르호우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 종으로부터의 세포이다.상 기 효모 세포는 사카로마이세테(Saccharomycete)이다. 한 양태에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애 종으로부터의 세포이다.

본 발명의 일 예에서, 본 발명에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 전구체, 스테비올, 또는 스테비올 배당체는 상기 조건 하에서 배양될 때 검출 가능한 농도로 축적된다. 본 발명에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올, 스테비올 배당체 또는 이들의 전구체는 스테비아 추출물보다 적은 오염물질을 포함한다. 상기 오염물질은 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물-유래 화합물을 포함한다.

본 발명에 따른 재조합 숙주 세포의 배양은, 예를 들면 상기 재조합 숙주 세포가 효모인 경우, 재조합 효모를 YPD 배지에서 전배양을 한 다음, OD₆₀₀에서 흡광도가 특정 값이 되게, 예를 들면 0.1 내지 0.2가 되게 YNB 액체배지에 접종하여 30 ℃ 온도에서 240 rpm으로 5일 배양하여, 스테비올 또는 스테비올 전구체를 생산할 수 있다.

본 발명에 기재된 재조합 미생물에 의해 생성된 조성물은 식품에 혼입될 수 있다 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올은 다른 감미료, 예를 들어, 사카린, 덱스트로스, 수크로스, 푸룩토스, 에리트리톨, 아스파르탐, 수크랄로스, 모나틴, 또는 아세술팜 포타슘과 함께 식품에 혼입될 수 있다. 기타 감미료에 대한 스테비올 또는 스테비올의 중량비는 최종 식품에서 만족할 만한 맛에 도달하기 위해 필요에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올 및 이의 배당체를 제조하는 합성 경로를 간략히 반응식 1에 표시한다. 구체적으로, 상기 스테비올 합성 경로에 관여하는 효소를 살펴보면, Mevalonate에서 FPP(farnesyl pyrophosphate)를 거쳐 GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate)를 얻고, CDPS) copalyl diphosphate synthase를 이용하여 GGPP에서 CPP (copalyl pyrophosphate)를 얻고, (KS) kaurene synthase를 이용하여 CPP에서 카우렌을 얻고, (KO) kaurene oxidase를 이용하여 카우렌에서 카우레노익산을 얻고, (KAH) kaurenoic acid hydroylase을 이용하여 카우레노익산에서 스테비올을 얻는다. 상기 스테비올에서 스테비올에 글루코오스를 전달하는 효소를 처리하여 스테비올 배당체를 제조한다.

[반응식 1]

본 명세서에서, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 배당체는 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-1,2-바이오사이드, 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 스테비오사이드, 1,3-스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 B (RebB), 레바우디오사이드 C (RebC), 레바우디오사이드 D (RebD), 레바우디오사이드 E (RebE), 레바우디오사이드 F (RebF), 레바우디오사이드 M (RebM), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 레바우디오사이드 I (RebI), 둘코사이드 A, 디-글리코실화된 스테비올, 트리-글리코실화된 스테비올, 테트라-글리코실화된 스테비올, 펜타-글리코실화된 스테비올, 헥사-글리코실화된 스테비올, 헵타-글리코실화된 스테비올, 또는 이들의 이성질체를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스테비올 전구체","스테비올 글리코시드 전구체" 및 "스테비올 전구체 화합물"은 스테비올 생합성 경로의 중간체 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 스테비올 전구체는 비제한적으로, 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP), ent-코팔릴-디포스페이트, 코팔릴-파이로포스페이트, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레노산, 및 스테비올을 포함한다. 바람직하게는, 상기 스테비올 전구체는 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate), CPP(copalyl pyrophosphate), 카우렌 및 카우레노익산(kaurnoic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 스테비올, 스테비올 전구체 또는 스테비올 배당체 생산용 조성물 또는 생산방법은, 스테비아 식물로부터의 제조하는 기술에 비해, 고수율의 스테비올을 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 카우렌을 생합성하는 재조합 균주 제조를 위한 벡터의 개열 지도(cleavage map)이다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 예시적인 실시예 범위로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: CDPS/KS 이중기능 효소 생산

1-1: GGPP에서부터 카우렌을 생산하는 이중 기능 효소의 탐색

스테비올을 생합성 과정의 중간체인 카우렌은, GGPP에서 CPP을 거쳐서 생성된다. CPP에서 카우렌을 생산하는 과정에 작용하는 효소가 copalyl pyrophosphate synthase (CDPS) 및 Ent-kaurene synthase (KS)로서 이것을 동시에 할 수 있는 두 기능(bifunctional) 효소를 탐색하였다. 두 가지 기능 효소의 탐색은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 공개된 정보를 바탕으로 기존에 기능이 확인되지 않은 효소들을 우선 선별하였다.

최종적으로 Jungermannia subulata 유래의 두 기능 효소인 CDPS/KS 효소(JsCDPS/KS)가 선별되었고, 해당 유전자에서의 신호서열을 제거하기 위해 plant network (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) 프로그램을 사용하여 N 말단의 신호서열(signal peptide)를 확인하고 제거하였다. 상기 신호서열 (N-말단의 105개 아미노산)이 제거된 효소의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타냈다.

Saccharomyces cerevisiae 코돈 최적화하여 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 Genescript(USA)에서 합성하였다. 합성된 유전자 서열은 CAI Calculator 2 서버를 이용하여 코돈 최적화된 유전자 서열을 재확인하였다.

1-2. 카우렌을 생합성하는 재조합 균주의 제조

실시예 1-1에서 선별된 JsCDPS/KS의 효소 활성 확인을 위해 S. cereviaise 에서의 카우렌 생합성을 확인하였다.

구체적으로, 도 1에서의 스테비올 생합성 대사경로 내 카우렌 생합성을 위해, CDPS/KS 이외의 유전자들이 GAL 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계되었다. 설계된 유전자는 GGPP 합성 단계 관련 BTS1, XdCrtE, ERG20^F96C 3종의 효소들을 조합하여 GGPP 생합성 모듈로서 GAL1 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계하였다. 구체적으로, Geranylgeranyl pyrophosphate synthase을 암호화하는 BTS1은 UniProtKB accession number Q12051을 갖는 Saccharomyces cerevisiae의 BTS1이고, Geranylgeranyl pyrophosphate synthase를 암호화는 XdCrtE는 UniProtKB accession number Q1L6K3을 갖는 Xanthophyllomyces dendrorhous crtE이고, GGPP synthase를 암호화하는 ERG20^F96C(DNA sequence of the GGPP synthase ERG20F96C from Saccharomyces cerevisiae)는 참고문헌 Metabolic engineering 27 (2015) 65-75, Efficient diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase에 기재된 것이다. 구체적으로, BTS1, XdCrtE, ERG20^F96C 3종의 효소 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 15, 16 및 17에 각각 나타냈다.

또한 카우렌 생성 단계 관련 Stevia rebaudiana 유래 KS (SrKS) 효소와 CPS (SrCDPS) 효소 2종과 CPS/KS 두 효소의 역할을 한번에 진행하는 Jungermannia subulata 유래의 이중 기능 효소 JsCDPS/KS 를 카우렌 생합성 모듈로서 GAL2 프로모터 조절 하에 발현되도록 설계하였다. 상기 제조된 벡터의 개열지도를 도 1에 나타냈다. 두 모듈의 유전자들을 조합하여 GGPP에서부터 카우렌까지 생합성 단계의 총 6개 조합을 설계하고 대장균-효모 셔틀 벡터인 pRS424로 클로닝되어 표 1의 pSYK 재조합 플라스미드 6종을 제작하였다.

재조합 플라스미드	GGPP 생합성 모듈		카우렌 생합성 모듈
	프로모터	유전자	프로모터	유전자	프로모터	유전자
pSYK1R	ScGAL1	BTS1-ERG20	SmGAL2	SrCDPS	ScGAL2	SrKS
pSYK2R	ScGAL1	XdCrtE-ERG20	SmGAL2	SrCDPS	ScGAL2	SrKS
pSYK3R	ScGAL1	ERG20F96C	SmGAL2	SrCDPS	ScGAL2	SrKS
pSYK4	ScGAL1	BTS1-ERG20	-	-	ScGAL2	JsCDPS/KS
pSYK5	ScGAL1	XdCrtE-ERG20	-	-	ScGAL2	JsCDPS/KS
pSYK6	ScGAL1	ERG20F96C	-	-	ScGAL2	JsCDPS/KS

c: Saccharomyces cerevisiae, Sm: Saccharomyces mikatae

Sr: Stevia rebaudiana Js: Jungermannia subulata

제조된 6종의 재조합 플라스미드 S. cerevisiae의 유전체로 삽입을 위해 SwaI(NEB)을 처리한 후 LiAc(Lithium acetate) 방법을 이용하여 S. cerevisiae CEN PK2-1c 균주에 형질전환하였다. 제조된 6종의 유전자 카세트들은 S. cerevisiae 유전체의 GAL7-GAL10-GAL1위치에 상동재조합 형태로 삽입되었으며, LEU 선별마커를 통해 6종의 유전자 카세트들이 삽입된 재조합 균주들을 선별하였다.

1-3: 재조합 균주의 배양

실시예 1-2에서 제조한, 카우렌을 생합성하는 재조합 효모의 배양은 표 2의 배지를 사용하여 배양하였다. 재조합 효모 균주의 배양은 고체배지에 배양한 뒤 표 2에 나타낸 배지 5 mL에 접종하여 30 ℃ 온도에서 200 rpm으로 9시간 전배양하였다. 전배양액의 세포들은 최종적으로 25 mL의 표 2 배지에 접종한 뒤 멸균된 2 mL 도데칸(dodecane)을 첨가하여 30 ℃ 온도, 200 rpm에서 72시간 동안 진탕배양하였다. 이에 따라, Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양물과 배양 세포균체를 얻었다.

배지성분	사용조건 (g/L)
YNB(yeast nitrogene base)	6.7
MES	100 mM
Glucose	20
암모니아수	pH 6.0 조정

1-4: LC-MS를 이용한 중간체 물질의 정량분석

1-4-1: 중간체 확인을 위한 재조합 효모 배양

대사 산물로서 중간체 물질인 파네졸산(FPP), 게라닐게라닐산(GGPP) 등을 확인하기 위해서, 실시예 2에서 얻어진 6종의 카우렌 생합성 효모 균주를 36시간 배양하였다. 대수 증식기에서 배양 세포를 이용하여 중간체 생산을 확인하였다.

구체적으로, 중간체의 확인을 위해 배양한 균체액을 냉각시킨 식염수 용액 45mL에 상기 효모 배양액 5 mL을 섞고, 원심분리(5000 g, 10 min, 0) 하여 상등액을 빠르게 버리고 다시 냉각된 식염수 용액으로 세척하였다. 원심분리로 상등액을 제거하고 균체를 얼음에 보관한 후 추출공정에 사용하였다.

1-4-2: 재조합 효모 세포로부터 대사산물의 추출

대사산물의 추출을 위해, 95 ℃ 온도의 수조에서 가열한 70%((v/v) 에탄올 수용액을 1.5 mL 첨가하여 상기 균체를 잘 풀어준 다음, 3분 동안 95 ℃ 온도에서 120 rpm으로 shaking하여 대사산물을 추출한 후, 얼음에 넣어 빠르게 식힌 다음 5분 동안 보관 후 원심분리(15,000 g, 5분)하여 상등액을 얻었으며, 상기 상등액을 이용하여 LC-MS 분석을 실시하였다.

대사산물의 분석은 LC-MS 방법을 이용하는데 gemini-NX C18 150 mm X2mm, 3 um 110 A particale (Phenomenex) column을 이용하고, 이동상은 7.5 mM tributylamine(pH 4.95) 용액과 아세토나이트릴을 각각 이용하여 Gradient로 분석하였다. 상기 LC-MS 분석 조건을 하기 표 3에 나타냈다.

Time (min)	Eluent B(%)
0	0
10	15
35	30
45	70
47	100
49	100
55	100
56	0
60	0

상기 GGPP 추출물의 LC-MS 분석을 통하여 재조합 효모 균체의 추출물에서 FPP와 GGPP의 존재를 확인하였다.

1-5: 효모 배양에 따른 카우렌 생산 및 추출

재조합 균주의 배양 과정에서, 도데칸을 첨가하면서 재조합 효모를 배양하는 경우, 도데칸 층에 카우렌이 축적되므로, 도데칸 층에 존재하는 카우렌과 세포를 파쇄하고 헥산으로 추출한 세포 추출물에 포함된 카우렌의 함량을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 실시예 1-3과 동일한 방법으로 재조합 균주를 12시간 동안 배양하고 상기 배양액의 상층에 존재하는 도데칸 층 200 uL를 물이 포함되지 않도록 샘플을 확보하여, 도데칸 층의 카우렌의 생산량을 확인 실험에 사용하였다. 또한, 세포 배양액과 배양 세포로부터 카우렌을 확인하였다. 구체적으로, 배양 세포로부터의 카우렌 추출과정은 실시예 1-3에서 얻어진 3 mL의 Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양하여 얻어진 효모 배양물(전체 배양세포 포함)을 원심분리(13000 g, 5분)하여 균체를 회수하였다.

상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액 1mL을 400ul hexane 과 섞어서 2mL screw-capped tube에 옮긴 후 추출 과정을 거처 세포 배양액 내에 존재하는 카우렌 양을 확인하는 실험에 사용하였다.

상기 원심 분리에서 회수한 균체는 물 1ml로 2회 씻은 후 0.5 mm입경을 갖는 glass bead 을 200 mg 양으로 넣고, 포화 염화나트륨 용액을 200 ul 첨가하였다. 그런 후에, Hexane을 400 ul 첨가하여 screw-capped tube 에 옮긴 후, 분당 6,500회 bead-beating하여 카우렌을 추출하여 카우렌의 생산량을 확인 실험에 사용하였다.

1-6: GC-MS 분석을 통한 카우렌 정량

실시예 1-5에서 추출한 카우렌의 양은 GC-MS를 통하여 분석하였다. 구체적으로, GC-MS 분석은 실시예 1-5에서 얻어진, 세포 배양액의 도데칸 층에 포함된 시료, 상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액의 헥산 추출물 시료, 및 배양 세포의 추출물 시료를 분석하였다. 4 ul injection을 260 ℃ 온도에서 실시하였고, 분석용 컬럼은 30 m 0.24 um 0.25 um + 10 m EZ guard (Agilent CP9013)을 사용하고 유동상은 1 mL/min 의 속도로 헬륨가스를 사용하였고, GC-MS Gradient 조건은 다음 표 4과 같이 실행하였다.

온도	시간	비고
40	2	-
40 - 210	15.4	+11 / min
210	2	-
210 - 250	6.1	+6.5 / min
250	15	-

1-7: 재조합 효모 세포로부터 부산물 생성 확인

카우렌 생산과정은 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate), CPP(copalyl pyrophosphate) 의 중간체를 거치면서 이루어진다. 카우렌 생합성 과정에서 카우렌 생성은 실시예 1-5의 분석으로 확인하였다. 카우렌 생산 과정의 각 중간체가 가수분해되면 파네졸(FPP 가수분해산물) 및 게라닐게라니올(GGPP 가수분해 산물) 등의 부산물이 생성된다. 대사공학적으로 유도된 효모의 경우, 파네졸, 게라닐게라니올, 카우렌 등의 분포에 따라 대사과정의 방향성을 확인할 수 있다.

구체적으로, 실시예 1-3에서 배양한 세포 배양물 중에 파네졸, 게라닐게라니올, 및 카우렌 생성을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 1-5 및 1-6과 실질적으로 동일한 방법으로 세포 배양액의 도데칸 층에 포함된 시료, 상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액의 헥산 추출물 시료, 및 배양 세포의 추출물 시료를 GC-MS 방법으로 분석하였다.

상기 GC-MS 분석 결과로부터, 파네졸, 게라닐게라니올, 카우렌 등을 확인하였다. 구체적으로, 균체의 헥산 추출물에는 파네졸, 카우렌 및 스쿠알렌이 존재하고, 도데칸 층에는 파네졸, 카우린, 및 게라닐게라니올이 존재함을 확인하였다. 이 과정 중에 스쿠알렌(squalene)의 경우 균체의 헥산 추출물에만 존재하였다. 제작된 카우렌 생성 균주의 GC-MS 분석을 통하여 카우렌과 부산물의 생성을 탐색한 GC-MS 분석 결과를 하기 표 5에 기재하였다.

strain	Average Titer(mg/L)
	Product	Average	Standard deviation
S1	farnesol	26.870	4.306
	geranylgeraniol	2.167	0.577
	kaurene	0.059	0.008
S2	farnesol	19.797	5.030
	geranylgeraniol	3.967	0.670
	kaurene	0.119	0.054
S3	farnesol	19.407	1.897
	geranylgeraniol	6.523	6.088
	kaurene	0.170	0.126
S4	farnesol	17.007	13.655
	geranylgeraniol	0.760	0.518
	kaurene	0.160	0.024
S5	farnesol	29.790	9.685
	geranylgeraniol	4.470	0.695
	kaurene	1.267	0.540
S6	farnesol	28.183	4.476
	geranylgeraniol	10.030	1.015
	kaurene	0.794	0.102

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 재조합 효모 배양액의 도데칸 층을 GC-MS로 분석한 결과. 파네졸 생성량이 25~30 mg/L임을 확인하였으며, 게라닐게라니올의 생성량은 편차가 심하였다. 이는 세포 내에 존재하는 FPP 농도의 차이에 의해 나타나고 GGPP의 경우 geranylgeraniol과 연관되어 차이를 보이고 GGPP 생합성 모듈로서 ERG20^F96C의 경우 XdCrtE-ERG20, BTS1-ERG20 보다 생성량이 많았다.

카우렌 농도의 경우, Stevia rebaudiana 유래의 CDPS와 KS의 조합에서 생성량이 낮았고, 이중기능(bifunctional) 효소를 사용한 조합의 경우 높게 나타났다. CDPS, KS의 유전자 모듈에서 작용하여 카우렌 생산된 평균치는 Stevia rebaudiana 유래의 SrCDPS, SrKS의 경우 0.116이고, 이끼류(Jungermannia subulata) 유래인 JsCDPS/KS의 경우 0.740 mg/L의 생산량 평균치를 보였다. 이를 보면 이끼류 유래의 JsCDPS/KS의 경우 광범위하게 카우렌으로 전환할 수 있는 능력을 가진 것을 확인하였다.

실시예 2: 카우렌 생산용 유전자 구조체(gene construct) 제조

2-1: 유전자 카세트의 제조

실시예 1-2와 실질적으로 동일한 방법으로서, 실시예 1-1에서 얻은 Jungermannia subulata 유래의 CPS/KS (JsCPS/KS) 이중 기능 효소와 실시예 1-2에서 사용한 ERG20^F96C (서열번호 17의 아미노산 서열)을 GGPPS 효소로 이용하여 카우렌 생산용 유전자 구조체 S21을 제조하였으며, 다만, JsCPS/KS의 프로모터는 Saccharomyces eubayanus 유래의 GAL2 프로모터(SeGAL2)를 사용하고, ERG20^F96C의 프로모터는 S. kudriavzevii 유래의 GAL1 프로모터(SkGAL1)를 사용하였다.

또한, 상기 효소의 기능적 발현을 향상시키기 위해, MBP 유전자 (서열번호 18), CUP1 유전자(서열번호 19), 또는 tsf 유전자(서열번호 20) 를 깁슨 어셈블리 방법을 사용하여 JsCPS/KS와 연결하여, 동일한 GAL2 프로모터 하에 조절되도록 유전자 구조체 S22, S23 및 S24를 제조하였다. 유전자 구조체 S25는 MBP-JsCPS/KS에 ERG20^F96C 를 연결하여 동일한 GAL2 프로모터하에 조절되도록 제조하여 융합 단백질로 발현되도록 하였다.

유전자 구조체	구조체(A)				구조체(B)
	프로모터	조절서열	효소		프로모터	효소
S21	SeGAL2	-	JsCDPS/KS	-	SkGAL1	ERG20F96C
S22	SeGAL2	MBP	JsCDPS/KS	-	SkGAL1	ERG20F96C
S23	SeGAL2	CUP1	JsCDPS/KS	-	SkGAL1	ERG20F96C
S24	SeGAL2	tsf	JsCDPS/KS	-	SkGAL1	ERG20F96C
S25	SeGAL2	MBP	JsCDPS/KS	ERG20F96C	_	-

2-2: 재조합 균주를 이용한 카우렌 생산

각각의 설계된 6종의 카우렌 모듈들은 pRS415 E. coli/yeast 셔틀벡터로 클로닝 되어 각각 pSYK21, pSYK22, pSYK23, pSYK24 및 pSYK25 재조합 플라스미드가 제작되었다.

제작된 6종의 재조합 플라스미드는 LiAc/ssDNA 방법에 의해 S. cerevisiae CEN.PK2-1c 균주로 형질전환 되어 6종의 재조합 효모 균주(S21~S26)를 구축하였다.

상기 재조합 효모 균주들로부터 플라스크 배양을 통해 카우렌 생산을 시도하였다. 카우렌을 생산하는 재조합 균주들의 배양은 고체배지에 배양한 후에 상기 표 2에 나타낸 배지 5 mL에 접종하여 30 ℃ 온도에서 200 rpm으로 9시간 전배양하였다. 전배양액의 세포들은 최종적으로 25 mL의 표 2 배지에 접종한 뒤 멸균된 2 mL 도데칸(dodecane)을 첨가하여 30 ℃ 온도, 200 rpm에서 72시간 동안 진탕배양하였다. 이에 따라, Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양물과 배양 세포 균체를 얻었다.

구체적으로, 배양 세포로부터의 카우렌 추출과정은 Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양하여 얻어진 효모 배양물(전체 배양세포 포함)을 원심분리(13000 g, 5분)하여 균체를 회수하였다. 상기 세포 배양물의 원심분리에서 얻어진 배양 상등액 1mL을 400ul 헥산과 섞어서 2mL screw-capped tube에 옮긴 후 추출 과정을 거처 세포 배양액내에 존재하는 카우렌 양을 확인하는 실험에 사용하였다. 상기 원심 분리에서 회수한 균체는 물 1ml로 2회 씻은 후 0.5 mm입경을 갖는 유리 비드를 200 mg 양으로 넣고, 포화 염화나트륨 용액을 200 ul 첨가하였다. 그런 후에, 헥산을 400 ul 첨가하여 screw-capped tube 에 옮긴 후, 분당 6500회 bead-beating하여 카우렌을 추출하여 카우렌의 생산량을 확인 실험에 사용하였다.

2-3: 생산된 카우렌의 정량분석

상기 실시예 2-2에서 얻어진 Dodecane two phase(도데칸 층분리) 배양물과 배양 세포 균체를, 실시예 1-5의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 GC-MS 분석을 이용하여 카우렌을 정량하였다. 5종의 재조합 균주로부터 생산된 카우렌의 함량은 표 7에 정리되었다.

재조합 균주	카우렌 생산량 (mg/L)
S21	1.187 (±0.128)
S22	2.334 (±0.586)
S23	1.845 (±0.101)
S24	1.810 (±0.701)
S25	3.120 (±0.844)

효소의 기능적 발현을 향상시키기 위해, MBP, CUP1, 또는 tsf 유전자를 JsCPS/KS와 연결한 S22, S23, S24 균주 중에서, MBP가 융합된 카우렌 생합성 모듈을 가진 재조합 균주 S22가 가장 높고, 그 다음으로 CUP1이 융합된 카우렌 생합성 모듈을 가진 재조합 균주 S23 및 tsf가 융합된 카우렌 생합성 모듈을 가진 재조합 균주 S24 순으로 카우렌 생산량이 감소하였다. 또한, MBP가 융합된 카우렌 생합성 모듈을 가진 재조합 균주 S22와 균주 S25는, ERG20^F96C가 추가로 연결된 균주 S25가 더 높은 카우렌 생산량을 나타내어 ERG20^F96C가 별도 전사 프로모터 하에서 발현되는 것에 비해 JsCPS/KS와 하나의 융합 단백질로 발현하는 것이 더욱 바람직함을 확인하였다.

실시예 3. 스테비올 생산균주를 이용한 스테비올 생산

3-1: 스테비올 생산균주의 제조

실시예 1에서 얻어진 카우렌 생산균주인 S6와 S9 균주를 선별하여, 스테비올 생산을 위해서, 카우렌 산화효소(kaurene oxidase, KO)와 카우렌산 수산화효소(Ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase, KAH) 및 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase, CPR)를 포함한 총 3가지 효소 유전자를 도입하여 스테비올 생산용 재조합 효소를 제조하였으며, 이를 S6-steviol로 명명하였다. 문헌 상으로 확인된 S. rebaudiana 유래의 KO (SrKO) 및 KAH (SrKAH)와 Arabidopsis thaliana 유래와 S.cereviiae의 CPR (AtCPR, yCPR)을 사용하였다.

구체적으로, KO, KAH, 및 CPR 유전자의 재조합 효모내로 도입은 상동 재조합방식으로 도입하였는데, 효모의 DPP(diphosphate phosphatase)1 위치에 유전자를 도입하도록 상동유전자 부분을 결합한 형태로 SrKAH와 AtCPR의 유전자 발현 카세트와 SrKO와 yCPR 유전자를 각각 하나의 모듈로 제조하고, 유전자 내에 hygromycin 내성인자인 Hph(hygromycin B phosphotransferase)를 도입하여 발현 카세트를 포함하여 DPPF1, DPPF2, DPPF3, DPPF4를 제작하였다. 각각의 유전자 덩어리는 pBluescipt SK에 서브클로닝 하였고, 유전자서열분석을 통하여 유전자가 정상적으로 발현할 수 있는 형태을 확인하였다. 확인된 유전자 카세트를 PCR을 통해서 증폭하고, 증폭된 각각의 유전자 발현 카세트들은, LiAc 형질전환방법을 이용하여, 실시예 2의 재조합 효모에 형질전환하였다. 구체적으로 DPPF1, DPPF2, DPPF3, 및 DPPF4는 하기 표 8에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 증폭 반응을 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 4분의 반응을 30회 반복하여 확보하였다. 상기 제조된 DPPF1, DPPF2, DPPF3, DPPF4의 핵산서열은 각각 서열번호 3 내지 6에 나타냈다.

명명	핵산서열 (5'->3')	서열번호
DPPF1-F	CGCCGAGGGTATTTTACTTCC	7
DPPF1-R	GCACTCGAAACTTCAGGTTC	8
DPPF2의 정방향 프라이머	GGTGTTATCGTTGCTGGTGG	9
DPPF2의 역방향 프라이머	GATAGTACTAGAGACACATATTC	10
DPPF3의 정방향 프라이머	GGCACTGGTCACTCTTTTGG	11
DPPF3의 역방향 프라이머	CTGTCCTTGCCTGGTGGG	12
DPPF4의 정방향 프라이머	CTCTCGCCGCTCGCCATC	13
DPPF4의 역방향 프라이머	CAACCGGCTCTTTGTCAACAG	14

효모에 도입된 유전자는 효모 내에서 In vivo assembly 과정으로 조립 되고, 최종적으로 DPP1 유전자 자리에 상동재조합 과정에 의해 효모 유전체 내로 삽입되었다. KAH/CPR 조합 카세트가 도입된 형질전환 균주는 Hygromycin (200 mg/L)에 내성을 바탕으로 선별하여, KO, KAH, 및 CPR 유전자가 도입된 효모균주를 확보하였다.

3-2: 재조합 효모균주의 배양 및 스테비올 생산

KO, KAH 및 CPR 유전자가 도입된 형질전환 균주(S6-steviol)을 3 mL YPD 배지에서 전배양 후, 초기 OD₆₀₀가 0.1~0.2가 되도록 조정하여 50 mL YPD (50 g/L glucose) 플라스크에서 온도 30°C 및 250 rpm에서 본배양을 수행하였다. 본 배양의 샘플링은 72시간 배양 후 OD600를 측정 후 5 mL씩 취하여 분주하였다. 상기 배양된 스테비올 생산 균주의 OD600를 측정하여 균주별로 생장 정도를 확인하였다.

상기 스테비올 생산 균주의 배양액 5 mL로부터 세포추출물을 추출하여 스테비올이 생산되었는지 확인하였다. 구체적으로, 스테비올의 추출방법은 CSH (Cold Spring Harbor)에서 제작한 LC-MS 분석을 위한 효모로부터의 추출물 분리 방법으로서, 세포 배양물에서 원심분리를 하여 세포를 회수하고, MeOH:ACN:H2O (2:2:1) 용매를 사용하여 세포를 희석하고, -70°C에서 30분간 정치한 뒤 상온에서 30분 동안 교반하여 스테비올 추출을 진행하였다.

추출된 샘플은 여과 후에 Gradient HPLC를 통해 분석하였다. 스테비올 표준물질과 비교하여, 상기 추출물로부터 스테비올이 동일한 머무름값(retention time, RT)을 가지는 물질을 확인할 수 있었고, 배양시간의 증가에 따라 스테비올 의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 최종적으로 S6-steviol 균주에서 생산되는 스테비올의 생산량은 0.67 ± 0.22(mg/L)이었다.

실시예 4: 스테비올 및 13-SMG의 생산

본 실시예에서는, 실시예 3에서 얻어진 스테비올 생산 균주에 스테비올 13번 탄소 위치에 글루코오스를 전달하는 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 스테비올 배당체인 13-SMG를 생산하였다.

구체적으로, CDPS/KS 이중 기능 효소에 더하여, 카우렌 옥시다제(KO), 카우렌산 하이드로실라제(KAH), KO와 KAH 전자를 전달하여 전자전달계를 완성하는 시토크롬 P450 환원효소(CPR) 및 스테비올 13번 탄소 위치에 글루코오스를 전달하는 UGT85C2 효소를 암호화하는 유전자 (서열번호 22)들이 포함된 4개의 재조합 플라스미드를 설계하였다 (pSYK32, pSYK34, pSYK35, pSYK36). 스테비올-13-글리코시드 생합성을 위한 2종의 재조합 플라스미드의 유전자 구성은 표 9에서 나타낸다.

각각의 유전자 발현 카세트들은 GRE3 유전자 위치에 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 유전체에 삽입되어, 또한, 상기 pSYK36 및 pSYK32을 도입한 S35 균주(지속발현)를 제조하고, 상기 pSYK35 및 pSYK34 플라즈미드를 도입한 S36 균주(유도발현)를 제조하였으며, 각 균주들의 유전자 정보는 표 10에 나타낸다.

재조합 플라스미드	유전자 발현유형	유전자 구성
pSYK32	지속발현	SrKO, SrKAH, UGT85C2, SrCPR8, Cyb5
pSYK34	유도발현	SrKO, SrKAH, UGT85C2, SrCPR8, Cyb5
pSYK35	유도발현	ERG20F96C, JsCPS/KS
pSYK36	지속발현	ERG20F96C, JsCPS/KS

재조합 균주	유전자 구성
S35(pSYK36 & pSYK32)	GRE3::P PGK1 >ERG20 F96C >T EBS1 -P TDH3 >JsCPS/KS>T NAT5 -P KlURA3 >KlURA3>T KlURA3 -P TEF2 >SrKO>T NAT1 -P ENO2 >SrKAH>T RPL41B -P GPD1 >UGT85C2>T RPL15A -P TEF1 >SrCPR8>T YHI9 -P TPI1 >CyB5>T IDP1
S36(pSYK35 & pSYK34)	GRE3::P GAL1 >ERG20 F96C >T EBS1 -P GAL2 >JsCPS/KS>T NAT5 -P KlURA3 >KlURA3>T KlURA3 -P SkGAL1 >SrKO>T NAT1 -P SeGAL2 >SrKAH>T RPL41B -P SbGAL2 >UGT85C2>T RPL15A -P SkGAL2 >SrCPR8>T YHI9 -P SmGAL2 >CyB5>T IDP1

상기 표 10에 나타낸 바와 같이, S35 균주의 경우 추가적인 유도물질 없이 생장함에 따라 도입된 유전자들이 발현되는 형태의 프로모터 조절 하에 존재하고, S36 균주의 경우에는 갈락토오스를 유도물질로 첨가한 후부터 도입된 유전자들이 발현되는 갈락토오스 대사관련 프로모터의 조절 하에 존재한다.

상기 플라즈미드가 도입된 형질전환 S35 균주 및 S36 균주를, 3 mL YPD 배지에서 전 배양 후, 초기 OD₆₀₀가 0.2가 되도록 조정하여 50 mL YPD (50 g/L glucose) 플라스크에서 온도 30℃ 및 250 rpm에서 본 배양을 수행하였다. 본 배양의 샘플링은 72시간 배양 후 OD₆₀₀를 측정 후 5 mL씩 취하여 분주하였다. 상기 배양된 스테비올 생산 균주의 OD₆₀₀를 측정하였으며 하기와 같은 균주 생장 속도를 확인하였다.

S35 균주 비생장 속도(Specific growth rate) = 0.172 ± 0.004 h^-1

S36 균주 비생장 속도(Specific growth rate) = 0.307 ± 0.006 h^-1

상기 재조합 균주의 배양물을 원심분리(4,000 rpm, 5분)를 수행하여 세포를 회수하여 스테비올 및 13-SMG 생산을 확인하였다. 생산된 스테비올 및 13-SMG는 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 5 uL injection을 40 ℃에서 수행하였고, 분석용 컬럼은 50 mm x 2 mm, 2.5 um 의 COSMOSIL C18을 사용하고 유동상은 0.4 mL/min의 속도로 표 11의 조건으로 분석을 수행하였다.

Method (A: 10 mM ammonium acetate, B: acetonitrile (AcN))
Time (min)	% Solvent B (AcN)
0	7
0.2	7
0.3	20
5	48
5.01	99
7	100
7.01	7
8	7

S35와 S36 균주는 스테비올과 13-SMG가 각각 0.017 mg/L, 0.1 mg/L와 0.002 mg/L, 17.3 mg/L 생산되었다.

균주	스테비올 (mg/L)	13-SMG (mg/L)
S35	0.017 (± 0.001)	0.1 (± 0.1)
S36	0.002 (± 0.001)	17.3 (± 2.7)

실시예 3에서 스테비올 생산에 사용된 CDPS/KS, KO, KAH 및 CPR을 도입하여 스테비올을 생산하였으며, 본 실시예에서는 스테비올 13번 탄소 위치에 글루코오스를 전달하는 UGT85C2를 추가로 도입하여 스테비올의 당화를 유도하여 13-SMG를 생성하였다. 생산 형태는 프로모터를 지속발현형태(S35)와 유도발현(S36)을 확인한 결과 유도 발현에 의하여 생성되는 13-SMG 의 양이 증가함을 확인하였다. 스테비올과 스테비올 배당체의 경우 숙주인 효모에서 생성되었을 때 균주에 영향을 줄 수 있어서 유도발현에 의해 생성되는 산물이 증가한다고 보여진다.

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Improved production of steviol glycoside and its precursors <130> DPP20193992KR <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 782 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JS CDPS/KS enzyme of Jungermannia subulata <400> 1 Met Ser Phe Glu Lys Ser Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Pro Asn Gly 1 5 10 15 Arg Ser Lys Pro Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Gly Lys Glu Ala Glu Glu 20 25 30 Ile Lys Gln Trp Ile Glu Glu Ile Arg Ala Met Met Gly Ser Met Thr 35 40 45 Asp Gly Glu Ile Thr Asn Ser Pro Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Leu 50 55 60 Val Pro Ala Leu Asp Gly Ser Asp Gly Pro Gln Phe Pro Lys Ser Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ile Ile Glu Asn Gln Phe Ser Asp Gly Ser Trp Gly Asp Arg 85 90 95 Gly Tyr Phe Ser Tyr Tyr Asp Arg Val Cys Asn Thr Leu Ala Cys Ile 100 105 110 Ile Ala Leu Lys Thr Trp Lys Thr Gly Ser Ala Ala Val Glu Lys Gly 115 120 125 Val Glu Phe Ile Gln Lys Asn Leu Gln Ala Met Glu Thr Glu Glu Asp 130 135 140 Ala His Met Met Ile Gly Phe Glu Ile Val Phe Pro Ala Leu Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Ala Lys Ser Leu Asp Leu Asp Leu Pro Phe Asp Ala Pro Ile Ile 165 170 175 Ala Lys Ile Ser Ala Glu Arg Glu Lys Lys Leu Ala Lys Ile Pro Met 180 185 190 Asp Ile Leu His Lys Val Pro Thr Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly 195 200 205 Phe His Glu Glu Leu Asp Trp Glu Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Glu 210 215 220 Asp Gly Ser Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ser Thr Ala Ala Cys Leu Leu 225 230 235 240 His Thr Lys Asp Glu Lys Ala Leu Ser Tyr Leu Thr Ser Leu Leu Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asn Ala Val Pro Asn Val Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu 260 265 270 His Met Trp Thr Val Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Ile Asp Arg Tyr 275 280 285 Phe Glu Lys Glu Ile Lys Asp Ser Leu Asp Tyr Val Tyr Lys Tyr Tyr 290 295 300 Lys Ser Val Gly Ile Gly Trp Ala Arg Gly Ser Val Val Gln Asp Leu 305 310 315 320 Asp Asp Thr Ala Met Gly Phe Arg Leu Leu Arg Gln Asn Gly Tyr Asp 325 330 335 Val Asn Glu Asp Val Phe Arg Gln Phe Lys Gly Lys Glu Ser Glu Phe 340 345 350 Phe Cys Phe Ala Gly Gln Ser Gly Gln Ala Val Thr Gly Leu Phe Asn 355 360 365 Phe Tyr Arg Ala Thr Gln Thr Arg Phe Pro Gly Glu Ser Leu Leu Ala 370 375 380 Thr Gly Glu His Phe Ala Arg Gly Phe Leu Val Glu Arg His Glu Lys 385 390 395 400 Asn Glu Cys Phe Asp Lys Trp Ile Ile Thr Lys Asp Leu Pro Gly Glu 405 410 415 Val Glu Tyr Ala Leu Ala Thr Pro Trp Tyr Cys Ser Leu Pro Arg Leu 420 425 430 Glu Thr Glu Ser Tyr Leu Ser His Tyr Gly Thr Asp Asp Ile Trp Ile 435 440 445 Gly Lys Ser Leu Tyr Arg Met Pro Phe Val Asn Asn Glu Thr Phe Leu 450 455 460 Ala Leu Ala Lys Ala Asp Phe Asn Leu Cys Gln Ala Lys His Gln Glu 465 470 475 480 Asp Leu Gln Asn Ile Thr Arg Trp Ser Glu Asp Cys Gly Phe Gly Lys 485 490 495 Leu Ser Phe Ala Arg Gln Lys Ala Ile Glu Gly Val Phe Ser Ala Ala 500 505 510 Cys Ile Leu Pro Gly Pro Glu Leu Ser Pro Ala Arg Leu Val Trp Ala 515 520 525 Gln Asn Cys Val Leu Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Phe Asp Val Gly 530 535 540 Gly Thr Leu Pro Asp Met Arg Arg Phe Leu Glu Ala Phe Lys Glu Trp 545 550 555 560 Asn Pro Ser Leu Met Asp Gly Thr Ala Glu Glu Ala Gln Ile Val Phe 565 570 575 Asn Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Ala Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu 580 585 590 Ala Gln Gly Arg Asp Ile Gly Gln His Leu Gln Lys Ile Trp Leu Arg 595 600 605 Trp Leu Glu Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Trp Thr Ala Ser Ser Phe 610 615 620 Ser Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Met Lys Asn Ala Leu Pro Ser Ile Ala 625 630 635 640 Leu Glu Pro Ile Val Leu Cys Thr Leu Phe Phe Leu Gly Glu Pro Leu 645 650 655 Ser Asp Glu Phe Val Gly Asp Ser Gln Lys Leu Arg Leu Met Glu Leu 660 665 670 Thr Asn Arg Val Gly Arg Leu Leu Asn Asp Ser Gln Gly Trp Lys Arg 675 680 685 Glu Asp Ser Gln Asn Lys Pro Asn Ser Val Ser Ile Leu Leu Arg Glu 690 695 700 Asn Pro Gly Trp Thr Glu Glu Glu Ala Ile Ala Asn Val Arg Ser Thr 705 710 715 720 Val Glu Glu Ser Met Leu Glu Leu Val Arg Ala Val His Gln Arg Ser 725 730 735 Pro Ile Pro Asn Ser Ile Arg Gln Leu His Phe Asn Met Ala Arg Ile 740 745 750 Met His Leu Phe Tyr Gln Lys Thr Asp Gly Phe Thr Asp Arg Ser Ala 755 760 765 Met Ala Lys Lys Leu Lys Lys Val Leu Phe Gln Pro Val Val 770 775 780 <210> 2 <211> 2349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JS CDPS/KS enzyme of Jungermannia subulata <400> 2 atgtcttttg aaaaatcagc tccaggttct gttgttgaac caaatggtag atcaaagcca 60 gatatatata aggataaggg taaagaagct gaagaaatca agcaatggat cgaagaaatc 120 agagcaatga tgggttcaat gactgatggt gaaattacaa attctccata cgatactgca 180 tgggttgctt tggttccagc tttagatggt tcagatggtc cacaatttcc aaaatcttta 240 caatggatca tcgaaaacca attttctgat ggttcatggg gtgacagagg ttacttctca 300 tactacgata gagtttgtaa cactttagca tgtatcatcg ctttgaagac ttggaagaca 360 ggttctgctg ctgttgaaaa gggtgttgag tttattcaaa agaatttgca agctatggaa 420 acagaagaag atgcacacat gatgatcggt ttcgaaatcg ttttcccagc tttgatttca 480 tacgcaaaat ctttggattt ggatttgcca ttcgatgcac caatcatcgc taaaatttca 540 gcagaaagag aaaagaaatt ggctaagatc ccaatggata ttttgcataa agttccaact 600 acattgttgc attctttaga aggtttccat gaagaattgg attgggaaaa attgttgaaa 660 ttacaatcag aagatggttc atttttgtgt tctccagctt caactgctgc atgtttgtta 720 catacaaagg atgaaaaagc attatcatat ttgacttctt tgttggatag attcaataac 780 gctgttccaa atgtttaccc agttgatttg tttgaacata tgtggacagt tgatagattg 840 caaagattgg gtatcgatag atacttcgaa aaggaaatca aagattcttt agattatgtt 900 tacaaatatt acaaatcagt tggtattggt tgggctagag gttctgttgt tcaagatttg 960 gatgatactg caatgggttt cagattgttg agacaaaacg gttacgatgt taacgaagat 1020 gtttttagac aattcaaagg taaagaatca gaatttttct gttttgctgg tcaatctggt 1080 caagcagtta ctggtttgtt taatttctac agagctactc aaacaagatt tcctggtgaa 1140 tctttgttag ctacaggtga acattttgca agaggtttct tggttgaaag acatgaaaag 1200 aatgaatgtt tcgataagtg gatcatcact aaagatttgc caggtgaagt tgaatatgct 1260 ttggcaacac cttggtactg ttcattgcca agattggaaa ctgaatctta tttgtcacat 1320 tacggtacag atgatatttg gatcggtaaa tctttgtaca gaatgccatt cgttaacaac 1380 gaaacatttt tggctttggc aaaggctgat ttcaatttgt gtcaagctaa gcatcaagaa 1440 gatttgcaaa acatcacaag atggtcagaa gattgtggtt tcggtaaatt atcttttgct 1500 agacaaaagg ctattgaagg tgttttctct gctgcttgta ttttgccagg tccagaatta 1560 tctccagcta gattggtttg ggcacaaaat tgtgttttga ctacagttgt tgatgattac 1620 tttgatgttg gtggtacatt accagatatg agaagatttt tggaagcctt taaagaatgg 1680 aatccatctt tgatggatgg tactgctgaa gaagctcaaa tcgtttttaa tggtttgtac 1740 aacacattga acgctatgac tcaagaaggt acattagcac aaggtagaga tattggtcaa 1800 catttgcaaa agatttggtt aagatggttg gaatcatgtt tgactgaagc tgaatggaca 1860 gcatcttcat tttctccatc atttgatgaa tacatgaaga acgctttacc atctattgca 1920 ttggaaccta ttgttttgtg tactttgttt ttcttgggtg aaccattatc agatgaattt 1980 gttggtgact ctcaaaaatt gagattgatg gaattgacaa acagagttgg tagattgttg 2040 aacgattcac aaggttggaa gagagaagat tctcaaaata agccaaattc tgtttcaatt 2100 ttgttgagag aaaacccagg ttggactgaa gaagaagcta ttgctaatgt tagatcaaca 2160 gttgaagaat ctatgttaga attggttaga gcagttcatc aaagatcacc aatcccaaat 2220 tctatcagac aattacattt caacatggct agaatcatgc atttgtttta ccaaaagact 2280 gatggtttta cagatagatc agctatggct aagaaattga agaaagtttt atttcaacca 2340 gttgtttaa 2349 <210> 3 <211> 5530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPPF1 polynucleotide sequence <400> 3 cgccgagggt attttacttc cgaatctcaa agaaaaaaat atgcttactg ttaatcctaa 60 aagaggtgac aatattcagc taaaactttc agagacttgc agttctcttc aaggcggtca 120 actttaacaa agaggtagca gattgttttc tttatttgtt cgctatttac aagtgaagaa 180 gcagctcttc ataaagggac aacacggctt atagcatttt ttacgaaaag tttgaccgtt 240 tagaacaaat atttaaaaac tagtactcga tttctggcgc agcaaaaata tagcattatg 300 tccgataaac acagttgtga tctgtcttgt gatcgcatac tctgcagata atcagttgaa 360 atagcagctt ttaagtgaga atcttattct tagtctacat cgttacattg tatcagtcac 420 aggtacggag agaaattata cttttcgatt tcattcaatg tagtttcttt tttacattaa 480 atatagtttt ccagtagtgc actattatta aggcgcttct gtttttagtc aacacttttt 540 cagatagtac ctttcaggtg gttagagtgc gatcccttta aaaaaaagta ttcgtcaacg 600 atgacagggt aaagaataaa tgcagcacgc ctggcgtata ctgctataat tgtacatcat 660 gttatcggcg ttgattctca attgtttggt gattagcttt tatatataga tagaaaccca 720 acgttggata acctcacgac taactttttt gtattttaga aataatttgt cgatcggttg 780 tatatttttg tcatatatta tctagaaacg ttagggaata aactgttatc tagggtccac 840 taacatacgc gcagttcgga aatcagcaaa catcacttaa aggacacctg ctataaactg 900 aattgtgtcc aatttttcga gtagttagca gttcaataaa gggcacgtta tcaattgtta 960 aaggcaaaga atcagaatta aatcatagca aacgaccaaa atgtcttgta aggcagtttc 1020 aaaggaatac tctgatttgt tacaaaagga tgaagcatct tttactaagt gggatgatga 1080 taaggttaag gatcatttgg atacaaataa gaatttgtat ccaaatgatg aaattaaaga 1140 atttgttgaa tcagttaaag caatgttcgg ttctatgaac gatggtgaaa ttaatgtttc 1200 tgcttacgat actgcatggg ttgctttggt tcaagatgtt gatggttcag gttctccaca 1260 atttccatct tcattggaat ggatcgcaaa caaccaatta tcagatggtt cttggggtga 1320 ccatttgtta ttttcagctc atgatagaat tattaacact ttggcatgtg ttattgcttt 1380 aacatcatgg aatgttcatc catctaagtg tgaaaagggt ttgaatttct tgagagaaaa 1440 tatttgtaaa ttggaagatg aaaatgcaga acacatgcct attggtttcg aagttacatt 1500 tccatctttg attgatattg ctaagaaatt gaacatcgaa gttccagaag atactccagc 1560 attgaaggaa atatatgcta gaagagatat taaattgaca aaaattccaa tggaagtttt 1620 gcataaagtt ccaactacat tgttgcattc tttggaaggt atgccagatt tggaatggga 1680 aaaattgttg aaattgcaat gcaaggatgg ttcattttta ttttctccat cttcaactgc 1740 attcgctttg atgcaaacaa aggatgaaaa gtgtttgcaa tatttgacta acatcgttac 1800 aaagtttaat ggtggtgttc caaatgttta cccagttgat ttgttcgaac atatttgggt 1860 tgttgataga ttgcaaagat taggtatcgc aagatacttc aagtctgaaa ttaaagattg 1920 tgttgaatac atcaataagt actggactaa aaatggtatt tgttgggcta gaaacactca 1980 tgttcaagat attgatgata cagcaatggg ttttagagtt ttgagagcac atggttatga 2040 tgttacacca gatgttttta gacaattcga aaaggatggt aaatttgttt gttttgcagg 2100 tcaatcaact caagctgtta caggcatgtt caatgtttac agagcatctc aaatgttgtt 2160 tccaggtgaa agaattttag aagatgctaa gaaattttct tacaactact taaaggaaaa 2220 gcaatctact aatgaattgt tagataaatg gattattgct aaagatttgc caggtgaagt 2280 tggttatgca ttagatattc cttggtacgc ttctttgcca agattagaaa caagatacta 2340 cttggaacaa tatggtggtg aagatgatgt ttggatcggt aaaactttat acagaatggg 2400 ttacgtttca aacaacacat acttggaaat ggcaaaattg gattacaaca actacgttgc 2460 tgttttgcaa ttagaatggt acactatcca acaatggtac gttgatattg gtatcgaaaa 2520 gttcgaatct gataacatca aatcagtttt ggtttcttat tacttagctg ctgcttctat 2580 tttcgaacca gaaagatcaa aggaaagaat tgcatgggct aaaactacaa ttttagttga 2640 taagatcact tcaatttttg attcttcaca atcttcaaag gaagatatta cagcttttat 2700 tgataagttt agaaataagt cttcttctaa gaaacattct attaatggtg aaccttggca 2760 tgaagttatg gttgctttga agaaaacttt gcatggtttt gcattggatg ctttaatgac 2820 acattcacaa gatattcatc cacaattaca tcaagcatgg gaaatgtggt tgactaaatt 2880 acaagatggt gttgatgtta cagcagaatt aatggttcaa atgattaata tgactgctgg 2940 tagatgggtt tctaaggaat tgttgacaca tccacaatac caaagattgt caactgttac 3000 aaattctgtt tgtcatgata ttactaaatt gcataacttc aaggaaaatt caactacagt 3060 tgattctaag gttcaagaat tggttcaatt agttttctct gatacaccag atgatttgga 3120 tcaagatatg aagcaaacat ttttgacagt tatgaaaact ttttactaca aagcatggtg 3180 tgatccaaat actattaacg atcatatctc aaaagttttc gaaatcgtta tataacaata 3240 agcgatttaa tctctaatta ttagttaaag ttttataagc atttttatgt aacgaaaaat 3300 aaattggttc atattattac tgcactgtca cttaccatgg aaagaccaga caagaagttg 3360 ccgacagtct gttgaattgg cctggttagg 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gaagctgatg atggtgcagg aactacagac gaagattaca tggcctggaa 4200 ggactccatc ctggaggttt tgaaagacga actgcatttg gacgaacagg aagccaagtt 4260 cacctctcaa ttccagtaca ctgtgttgaa cgaaatcact gactccatgt cgcttggtga 4320 accctctgct cactatttgc cctcgcatca gttgaaccgc aacgcagacg gcatccaatt 4380 gggtcccttc gatttgtctc aaccgtatat tgcacccatc gtgaaatctc gcgaactgtt 4440 ctcttccaat gaccgtaatt gcatccactc tgaatttgac ttgtccggct ctaacatcaa 4500 gtactccact ggtgaccatc ttgctgtttg gccttccaac ccattggaaa aggtcgaaca 4560 gttcttatcc atattcaacc tggaccctga aaccattttt gacttgaagc ccctggatcc 4620 caccgtcaaa gtgcccttcc caacgccaac tactattggc gctgctatta aacactattt 4680 ggaaattaca ggacctgtct ccagacaatt gttttcatct ttgattcagt tcgcccccaa 4740 cgctgacgtc aaggaaaaat tgactctgct ttcgaaagac aaggaccaat tcgccgtcga 4800 gataacctcc aaatatttca acatcgcaga tgctctgaaa tatttgtctg atggcgccaa 4860 atgggacacc gtacccatgc aattcttggt cgaatcagtt ccccaaatga ctcctcgtta 4920 ctactctatc tcttcctctt ctctgtctga aaagcaaacc gtccatgtca cctccattgt 4980 ggaaaacttt cctaacccag aattgcctga tgctcctcca gttgttggtg ttacgactaa 5040 cttgttaaga aacattcaat tggctcaaaa caatgttaac attgccgaaa ctaacctacc 5100 tgttcactac gatttaaatg gcccacgtaa acttttcgcc aattacaaat tgcccgtcca 5160 cgttcgtcgt tctaacttca gattgccttc caacccttcc accccagtta tcatgatcgg 5220 tccaggtacc ggtgttgccc cattccgtgg gtttatcaga gagcgtgtcg cgttcctcga 5280 atcacaaaag aagggcggta acaacgtttc gctaggtaag catatactgt tttatggatc 5340 ccgtaacact gatgatttct tgtaccagga cgaatggcca gaatacgcca aaaaattgga 5400 tggttcgttc gaaatggtcg tggcccattc caggttgcca aacaccaaaa aagtttatgt 5460 tcaagataaa ttaaaggatt acgaagacca agtatttgaa atgattaaca acggtgcatt 5520 tatctacgtc tgtggtgatg caaagggtat ggccaagggt gtgtcaaccg cattggttgg 5580 catcttatcc cgtggtaaat ccattaccac tgatgaagca acagagctaa tcaagatgct 5640 caagacttca ggtagatacc aagaagatgt ctggtaatca gcccactgat caagccttcg 5700 gcgcggttgt tcaaccacac gatctgtatc aaagaaaaat aagttagata accaaaaaaa 5760 aaaaaaattt catactcact ataagaaatc atacgcagtt caacttttgc ttttacatac 5820 aattttatct atatattcgt gcttctgcga tgtccttatt tatccgatga aggtatgtaa 5880 gaataaaaaa gaatatatac tccacatgac atacgaaata tacgtattta ttgttctgta 5940 tggaataaca gcgattacat aaagatgaca tgttacttct ttattcaaat taatcttgac 6000 gtgcaagggc ctgcttgtta tttcatcgga caatcccaac atcactttac acgaaagcct 6060 tagaagttta ttatttgttt taagttggac tatagtgatg taggtagttt cttaggaagc 6120 agttgagtag ctgatttttg agataagaac ctggtgtaat caatctataa acagcctaga 6180 atctttttaa gcaaatttac ttttacattt atctctatct tctttcttac aagaagttat 6240 tttcattaca aaaggacatt aaatacacta aattttcaat ctttacattg ttggaaagcc 6300 tcgttgtctt ttaagatttt ataagcattg attttttttt tcaataattt tccgttcccc 6360 ttaacacata ctatgtataa atgtcattga gtcatctcac tttagatcaa tattatgaaa 6420 tacagtgcaa cgaacttgaa gcgatacgtt ccatttatat ggatgacttt actgacttaa 6480 ctaaaagaaa gtctagctgg gataagcagc cacagattat attcgaaatt acgcttcgat 6540 ctgttgacaa agagccggtt g 6561 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for DPPF1 polynucleotide sequence <400> 7 cgccgagggt attttacttc c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for DPPF1 polynucleotide sequence <400> 8 gcactcgaaa cttcaggttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for DPPF2 polynucleotide sequence <400> 9 ggtgttatcg ttgctggtgg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for DPPF2 polynucleotide sequence <400> 10 gatagtacta gagacacata ttc 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for DPPF3 polynucleotide sequence <400> 11 ggcactggtc actcttttgg 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for DPPF3 polynucleotide sequence <400> 12 ctgtccttgc ctggtggg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for DPPF4 polynucleotide sequence <400> 13 ctctcgccgc tcgccatc 18 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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180 tgtttggatg gggcaccagg ttttaggttc gagacaattc cagacggtgt gtctcactct 240 cccgaagctt ctattccaat aagggaaagc ttgttgagat ctatcgaaac taactttttg 300 gatcgtttta tcgacttggt gacgaaatta ccagacccgc caacttgtat tatttctgat 360 ggctttttgt ccgtctttac tattgatgca gctaaaaagt tgggtattcc agtaatgatg 420 tattggactt tggctgcttg tggttttatg ggattctatc atattcattc tctgattgag 480 aagggttttg caccattgaa agatgcctct tacttgacta acggttacct tgataccgtc 540 attgattggg tcccaggtat ggaaggtatc agattgaagg attttccttt agattggtct 600 actgacttga acgataaggt cttgatgttt acaacggaag ctcctcaacg ttctcacaaa 660 gtatctcatc acattttcca tactttcgac gaattggaac ctagtataat aaaaactttg 720 tctctgagat ataatcatat ctataccatt ggaccattgc agttgttgtt ggatcagatt 780 ccagaggaaa aaaaacaaac tggaattact tctttgcacg gttactcctt ggttaaagaa 840 gaaccagaat gctttcagtg gttgcaatct aaggaaccga atagtgttgt ttatgttaac 900 tttggttcta ctacggttat gtctttggag gatatgacag agttcggatg gggtctcgca 960 aactctaatc actacttctt gtggatcata agaagtaatt tggttatagg tgaaaatgct 1020 gtgttgcccc ccgagctcga agaacatatt aaaaagagag gattcattgc ctcttggtgt 1080 tctcaagaga aagtgttgaa acatccatct gttggtggtt ttttgactca ctgtggttgg 1140 ggctctacta ttgaatcttt gtctgccggc gttcccatga tttgttggcc atattcttgg 1200 gatcaattga ccaattgccg ctacatctgc aaggaatggg aagtaggcct ggaaatgggt 1260 actaaggtaa aaagagacga ggttaaaaga ttggtacaag aattgatggg tgaagggggt 1320 cataagatgc gaaataaggc taaagattgg aaggaaaaag caagaatagc aatagcgcca 1380 aacggttcct cttctctaaa tatagataag atggtcaaag aaataaccgt gttggctagg 1440 aattaa 1446 <210> 23 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of UGT74G1 <400> 23 Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys 20 25 30 Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His 35 40 45 Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile 50 55 60 Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp 100 105 110 Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile 115 120 125 Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val 130 135 140 Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu 145 150 155 160 Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu 165 170 175 Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser 180 185 190 Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val 195 200 205 Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr 210 215 220 Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met 225 230 235 240 Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu 245 250 255 Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro 260 265 270 Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly 275 280 285 Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val 290 295 300 Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu 305 310 315 320 Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp 325 330 335 Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val 340 345 350 Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val 355 360 365 Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys 370 375 380 Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu 385 390 395 400 Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile 405 410 415 Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp 420 425 430 Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn 435 440 445 Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala 450 455 460

Claims (20)

1. Jungermannia subulata 에서 유래되며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 코파릴 디포스페이트 신타제 (copalyl diphosphate synthase, CDPS) / 카우렌 신타제 (kaurene synthase, KS) (CDPS/KS) 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및
   상기 CDPS/KS 이중 기능 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 직접 또는 링커를 통해 연결되며 상기 효소 단백질의 발현을 증가시키는, 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein, MBP), CUP1 및 tsf 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 함유하는 조절 유전자를 포함하고,
   제라닐제라닐 피로포스페이트 (geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP) 신타제 (GGPP synthase)를 이용하여 파네실 피로포스페이트 (farnesyl pyrophosphate, FPP)로부터 GGPP를 합성하는 유전자 구조체를 추가로 포함하고,
   상기 GGPP synthase는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 XdCrtE 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 ERG20^F96C로 이루어지는 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 융합 단백질인, 카우렌 생산용 유전자 구조체.
2. 제1항에 있어서, 코파릴 디포스페이트 신타제 (copalyl diphosphate synthase, CDPS) / 카우렌 신타제 (kaurene synthase, KS) (CDPS/KS) 이중 기능 효소 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 것인 카우렌 생산용 유전자 구조체.
3. 제1항에 있어서, 상기 조절 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein, MBP) 유전자, 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 CUP1 유전자 또는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 tsf 유전자인, 카우렌 생산용 유전자 구조체.
4. 제1항에 있어서, 효모 유래 GAL 프로모터를 추가로 포함하는, 카우렌 생산용 유전자 구조체.
5. 제1항에 따른 카우렌 생산용 유전자 구조체, 및
   카우렌으로부터 카우렌산 (kaurenoic acid)을 합성하는 카우렌 산화효소 (Kaurene oxidase, KO)의 암호화 유전자, 카우렌으로부터 스테비올을 합성하는 카우렌산 히드록시라제 (Kaurenoic acid hydroxylase, KAH) 및 시토크롬 P450 환원효소 (CPR)의 암호화 유전자를 포함하는, 스테비올의 생합성 유전자 구조체.
6. 제5항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체의 코파릴 디포스페이트 신타제 (copalyl diphosphate synthase, CDPS) / 카우렌 신타제 (kaurene synthase, KS) (CDPS/KS) 이중 기능 효소 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 스테비올의 생합성 유전자 구조체.
7. 제5항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체의 조절 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein, MBP) 유전자, 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 CUP1 유전자 또는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 tsf 유전자인, 스테비올의 생합성 유전자 구조체.
8. 제5항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체에 효모 유래 GAL 프로모터를 추가로 포함하는, 스테비올의 생합성 유전자 구조체.
9. 제5항에 있어서, 상기 카우렌 산화효소 (Kaurene oxidase, KO) 유전자는 S. rebaudiana 유래의 KO 유전자 (SrKO), 상기 카우렌산 히드록시라제 (Kaurenoic acid hydroxylase, KAH)는 S. rebaudiana 유래의 KAH 유전자(SrKAH), 또는
   상기 시토크롬 P450 환원효소 (CPR) 유전자는 Arabidopsis thaliana 유래 CPR 유전자 또는 S.cereviiae 유래 CPR 유전자 (yCPR)인 스테비올의 생합성 유전자 구조체.
10. 제1항에 따른 카우렌 생산용 유전자 구조체,
    카우렌으로부터 카우렌산(kaurenoic acid)를 합성하는 카우렌 산화효소 (Kaurene oxidase, KO) 암호화 유전자, 카우렌산으로부터 스테비올을 합성하는 카우렌산 히드록시라제 (Kaurenoic acid hydroxylase, KAH) 및 시토크롬 P450 환원효소(CPR) 암호화 유전자를 포함하는 스테비올의 생합성 유전자 구조체, 및
    스테비올에 글루코오스를 전달하는 효소의 암호화 유전자를 포함하는, 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
11. 제10항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체의 코파릴 디포스페이트 신타제 (copalyl diphosphate synthase, CDPS) / 카우렌 신타제 (kaurene synthase, KS) (CDPS/KS) 이중 기능 효소 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
12. 제10항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체의 조절 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein, MBP) 유전자, 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 CUP1 유전자 또는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 tsf 유전자인, 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
13. 제10항에 있어서, 상기 카우렌 생산용 유전자 구조체에 효모 유래 GAL 프로모터를 추가로 포함하는, 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
14. 제10항에 있어서, 상기 KO 유전자는 S. rebaudiana 유래의 카우렌 산화효소 (Kaurene oxidase, KO) 유전자 (SrKO), 상기 카우렌산 히드록시라제 (Kaurenoic acid hydroxylase, KAH) 유전자 (SrKAH), 또는
    상기 CPR 유전자는 Arabidopsis thaliana 유래 시토크롬 P450 환원효소 (CPR) 유전자 또는 S.cereviiae 유래 CPR 유전자 (yCPR)인 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
15. 제10항에 있어서, 상기 스테비올에 글루코오스를 전달하는 효소의 암호화 유전자는 UGT85C2 효소의 암호화 유전자인, 스테비올-배당체 생합성 유전자 구조체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구조체를 포함하는, 재조합 숙주세포.
17. 제16항에 있어서, 상기 재조합 숙주가 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함하는 재조합 숙주 세포.
18. 제17항에 있어서, 상기 진균류 세포가 효모 세포인 재조합 숙주 세포.
19. 제16항에 따른 재조합 숙주세포의 균체, 상기 재조합 숙주 세포의 배양물, 또는 상기 재조합 숙주 세포의 배양물에서 얻어지는 추출물을 포함하는, 스테비올 배당체 또는 이의 전구체 생산용 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 스테비올 전구체는 파네실 피로포스페이트 (farnesyl pyrophosphate, FPP), 제라닐제라닐 피로포스페이트 (geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP), 코파릴 피로포스페이트 (copalyl pyrophosphate, CPP), 카우렌 및 카우레노익산 (kaurnoic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.

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