DE10201458A1

DE10201458A1 - Intermediate und Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg

Info

Publication number: DE10201458A1
Application number: DE10201458A
Authority: DE
Inventors: Petra Adam; Sabine Amslinger; Adelbert Bacher; Wolfgang Eisenreich; Stefan Hecht; Felix Rohdich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2002-10-17
Also published as: CA2443874A1; US20040176570A1; US20080318227A1; JP4068971B2; WO2002083720A3; EP1377663A2; JP2005505248A; AU2008229760A1; US7297509B2; WO2002083720A2; AU2002254984B2

Abstract

Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon für die effiziente Bildung eines biosynthetischen Produktes oder Intermediates des 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-abhängigen Biosynthesewegs, gekennzeichnet durch DOLLAR A (a) erste rekombinante Ausstattung mit einem Gen, funktionell für die Biosynthese von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat, ausgehend von 1-Deoxy-D-xylulose; DOLLAR A (b) Fähigkeit zur Aufnahme von 1-Deoxy-D-xylulose und DOLLAR A (c) zweite rekombinante Ausstattung(en) mit Gen(en), das (die) funktionell für die Umwandlung von besagtem 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in erforderliche(s) Stromab-Intermediat(en) oder Endprodukt(en) von besagtem Biosyntheseweg ist (sind). DOLLAR A Die Erfindung stellt weiterhin 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-disphosphat, ein neues Intermediat in dem Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat bereit.

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zellen, Zellkulturen oder ihre Bestandteile für die effiziente Bildung eines biosynthetischen Produktes oder Intermediates oder Enzyms des 1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-abhängigen Biosynthesewegs. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Vektoren zur Herstellung eben solcher. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf deren Nutzung zur Bildung oder Herstellung von Intermediaten oder Produkten oder Enzymen des besagten Biosynthesewegs sowie auf Enzyme und Intermediate. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf das Screenen nach Inhibitoren von Enzymen des besagten Biosynthesewegs.

Hintergrund der Erfindung

Das System der Biosynthesewege in jedem Organismus ist hoch stromlinienförmig, wobei einige wenige zentrale Hauptbiosynthesewege sich in eine große Zahl von peripheren Biosynthesewegen verzweigen. Die zentralen Hauptbiosynthesewege beinhalten Ausgangsmaterialien, die hoch integriert sind. Darum sind die zentralen oder Hauptbiosynthesewege hoch reguliert. Gleichzeitig sind sie entscheidend für jeden Versuch in den Stoffwechsel eines beliebigem Organismus einzugreifen, entweder durch einen Inhibitor oder durch Veränderung des Stoffwechsels.

Die Isoprenoidbiosynthesewege sind ein erstklassiges Beispiel für diese metabolische Organisation. Sie sind sehr lang und weit verzweigt, und führen zu ungefähr 30.000 Isoprenoid- oder Terpenoid-Verbindungen. Diese scheinen alle abgeleitet zu sein von Isopentenyldiphosphat (IPP) und Dimethylallyldiphosphat (DMAPP). Diese werden mittels zweier alternativer Hauptbiosynthesewege synthetisiert (zusammengefasst in Eisenreich et al., 2001).

Durch die klassischen Untersuchungen von Bloch, Cornforth, Lynen und Mitarbeitern wurden Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylalfylpyrophosphat (DMAPP) als Schlüs selintermediate der Biosynthese von Isoprenoiden über Mevalonsäure nachgewiesen. Jedoch synthetisieren viele Bakterien, pflanzliche Plastiden und das Protozoon Plasmodium falciparum IPP und DMAPP auf einem alternativen Biosyntheseweg über 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat. Die Entdeckung dieses Biosynthesewegs beruhte hauptsächlich auf dem Einbau von Isotopen- markierter 1-Deoxy-D-xylulose in die Isoprenoidseitenkette von Menachinonen aus Escherichia coli (Arigoni und Schwarz, 1999).

Der Mevalonat-unabhängige Biosyntheseweg wurde bis jetzt nur teilweise aufgeklärt (Fig. 1). Zum besseren Verständnis der einzelnen Aspekte dieser Erfindung soll der Biosyntheseweg kurz erläutert werden. Er kann in drei Teilabschnitte eingeteilt werden:

Im ersten Biosyntheseabschnitt, wie in Abb. 1 dargestellt, kondensiert Pyruvat (1) mit D- Glyzerinaldehyd-3-phosphat (2) zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP) (3). Anschließend wird DXP in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (MEP) (4) in einer zweistufigen Reaktion, bestehend aus einer Umlagerung und einer Reduktion, umgewandelt, wodurch das fünfzählige Kohlenstoff-Isoprenoidgrundgerüst gebildet wird.

Im anschließenden Abschnitt des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs (Abb. 1) wird MEP (4) zuerst mit CTP durch 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase zu 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (CDP-ME) (5) kondensiert (PCT/EP00/07548). CDP- ME (5) wird anschließend durch 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase ATP- abhängig phosphoryliert zu 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (CDP-MEP) (6). Dieses Intermediat wird anschließend durch 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat- Synthase in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat (cMEPP) (7) umgewandelt (PCT/EP00/07548). Diese drei enzymatischen Schritte bilden eine biosynthetische Einheit, welche das Isoprenoid-C5-Grundgerüst für den dritten Biosyntheseabschnitt aktivieren (Rohdich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11758-11763 (1999); Lüttgen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1062-1067 (2000); Herz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2486-2490 (2000)).

Bioinformatische Studien (Deutsche Patentanmeldung 100 27 821.3) sowie Studien mit Mutanten von Synechocystis sp. (Cunningham et al., 2000) und Escherichia coli (Campus et al., 2001; Altincicek et al., 2001) zeigen die Involvierung der lytB und gcpE Gene in den Isoprenoidbiosyntheseweg. Die Funktion und die durch die korrespondierenden Genprodukte katalysierten Reaktionen sind jedoch bis jetzt unbekannt.

Kürzlich wurde eine Kinase (XyIB) beschrieben, die die Umwandlung von 1-Deoxy-D-xylulose in 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in hohen Raten katalysiert (Wungsintaweekul et al., 2001).

Gene und Enzyme, die beteiligt sind in weiter stromab liegenden Reaktionen, wurden beschrieben. Die Genfunktionen, die Intermediate und die Mechanismen, die zu den Produkten führen, sind jedoch bis jetzt unbekannt.

Für zahlreiche pathogene Eubakterien sowie für den Malaria Parasiten Plasmodium falciparum sind die Enzyme, die in den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg involviert sind, essentiell. Die Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs können von pathogenen Eubakterien und Plasmodium falciparum nicht aus der Umgebung aufgenommen werden. Die Enzyme des alternativen Isoprenoidbiosynthesewegs kommen bei Säugern nicht vor, die ihre Isoprenoide und Terpenoide ausschließlich über den Mevalonat-Biosyntheseweg synthetisieren. Außerdem reduziert die eigentümliche Natur der Reaktionen in diesem Biosyntheseweg das Risiko von Überkreuzhemmungen mit anderen, vor allem Säugerenzymen.

Deswegen erscheinen die Enzyme des alternativen Isoprenoidbiosynthesewegs besonders geeignet als Targets für neuartige Agenzien gegen pathogene Mikroorganismen und Herbizide. Die Aufklärung der unbekannten Schritte und die Identifizierung dieser Targets, insbesondere der Gene und kodierten Enzyme dieser Biosynthesewege ist für diese Zielsetzung obligatorisch.

Eine weitere Ursache für das Interesse in den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg ergibt sich aus der Tatsache, dass Pathogene wie Mycobakterien, Plasmodien, Escherichia etc., die diesen Biosyntheseweg beschreiten, γδ T-Zellen aktivieren (Fournié und Bonneville, 1996). Darum fungieren γδ T-Zellen wahrscheinlich als erste Abwehrlinie gegen Infektionen durch solche Pathogene. Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs sind dabei ursächlich angesehen worden für die γδ T-Zellaktivierung (Jomaa et aL, 1999). Kürzlich wurde gezeigt, dass E. coli Stämme, die Fähigkeit γδ T-Zellen zu stimulieren, verlieren, wenn das dxr oder das gcpE Gen ausgeschaltet worden war (Altincicek et al., 2001).

Außerdem sind diese Biosynthesewege von großem biotechnologischen Interesse, da sie zu wertvollen Vitaminen und isoprenoiden oder terpenoiden Produkten führen.

Frühere Versuche zur Erreichung dieser Vorhaben waren an der geringen Umsatzrate der Biosynthese über diese Wege in Wild-Typ Zellen, die bis dahin untersucht wurden, gescheitert.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Gegenstand der Erfindung, Enzyme und Nukleinsäuren, die für solche Enzyme kodieren bereitzustellen sowie Intermediate für die Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat.

Überraschenderweise wurde entdeckt, daß das Intermediat bei der Umwandlung von 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat ist. Dieses Intermediat wird gebildet durch ein Enzym, welches kodiert wird durch gcpE, wie es im E. coli Genom benannt worden ist.

Das obige Intermediat wird umgewandelt in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat durch ein Enzym, welches kodiert wird durch lytB, wie es im E. coli Genom benannt worden ist. Das letztere Enzym bevorzugt als Reduktionsmittel NADH oder NADPH und FAD als Mediator. Weiterhin kann es durch Ionen ausgewählt aus Mangan, Eisen, Kobalt und Nickel stimuliert werden.

Mithilfe dieser Entdeckungen ist nun der dritte Abschnitt des trunkierten Mevalonat- unabhängigen Biosynthesewegs etabliert. Der Schlüssel zu diesen Entdeckungen ist das Intermediat 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner E-Form. Dies bestätigt das einzigartige Prinzip der Erfindung für Reaktionen, die hin- und wegführen von diesem Intermediat.

Weiterhin ist es ein Gegenstand der Erfindung, Zellen, Zellkulturen, Organismen und Teile hiervon für die effiziente Biosynthese von Produkten oder Intermediaten des Mevalonat unabhängigen Biosynthesewegs abhängig von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat Bildung ausgehend von 1-Deoxy-D-xylulose und/oder Glukose bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung weist ein neuartiges in vivo System vor, das benützt werden kann für die Strukturaufklärung von unbekannten Intermediaten und die Zuordnung von biologischen Funktionen von mutmaßlichen Genen oder kodierten Enzymen in dem alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg. Als ein Beispiel wurde die funktionelle Zuordnung des gcpE Gens (nun benannt als ispG) und von lytB (nun benannt als ispH) im Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg der Isoprenoidbiosynthese erreicht.

Im spezielleren besteht solches in vivo System aus rekombinanten Escherichia coli Stämmen mit Vektorkonstrukten, die Gene für die D-Xylulokinase (xyIB), und Gene der weiter stromab liegenden Schritte der Terpenoidbiosynthese wie dxs, dxr und/oder ispD, und/oder ispE, und/oder ispF, und/oder gcpE, und/oder lytB aus Escherichia coli und/oder einen Carotinoid- Gencluster aus Erwinia uredovora tragen und exprimieren.

In einem Aspekt der Erfindung können die gentechnisch veränderten Stämme gefüttert werden mit 1-Deoxy-D-xylulose, vor allem mit Isotopen-markierter 1-Deoxy-D-xylulose, die in hoher Umsatzrate in das übliche Intermediat des Mevalonat-unabhängigen Terpenoidbiosynthesewegs, 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat, und in weitere Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Terpenoidbiosynthesewegs wie 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat, 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat, 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphat umgewandelt wird.

Weiterhin kann Fütterung mit Glukose oder einem Intermediat der Glykolyse für die Umwandlung in solche weitere Intermediate dieses Stoffwechselwegs ausgeführt werden.

Solche Systeme sind nützlich für die Strukturaufklärung von bisher schwer fassbaren Intermediaten in den Biosynthesewegen, für in vivo Screenen nach neuartigen Antibiotika, Antimalaria, und Herbiziden, und als Plattform für die Biokonversion von exogener 1-Deoxy-D- xylulose in Intermediate und Produkte des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs der Terpenoidbiosynthese.

Solche Systeme können auch verwendet werden für das Screenen von chemischen Bibliotheken nach potenziellen Herbiziden, und/oder Antimalaria, und/oder antimikrobiellen Substanzen mittels der Detektion und Messung der Menge bestimmter Intermediate, die in vivo in Gegenwart und Abwesenheit von potenziellen Inhibitoren der Genprodukte der Mevalonat- unabhängigen Isoprenoid Biosyntheseweg-Gene, nämlich dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, gcpE und lytB gebildet werden.

Dieses System kann weiterhin benützt werden für die Herstellung von höheren Isoprenoiden (z. B. Isoprenoide mit 10, 15, 20, 30 oder 40 Kohlenstoffatomen) wie Carotine, α-Tocopherole oder Vitamine durch Antreiben der Biosynthese von Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat über den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg, z. B. unter Benützung von Glukose als Fütterungsmaterial. Weitere Fütterungsmaterialien, welche benützt werden können, sind Intermediate oder Produkte der Glykolyse wie Glyzerin-3-phosphat oder Pyruvat.

Weiterhin stellt die Erfindung neuartige Verbindungen der Formel I (siehe unten) bereit, insbesondere 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, sowie enzymatische und chemische Methoden zur Herstellung solcher Verbindungen. Wie hierin gezeigt, entsteht (E)-1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat ausgehend von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat mittels des GcpE-Genprodukts. Es ist weiterhin hierin gezeigt, daß (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat umgewandelt wird in Dimethylallyldiphosphat und Isopentenyldiphosphat mittels des LytB-Genprodukts.

Kurze Beschreibung der Abbildungen und Annexe

Abb. 1 Biosynthese beider Isoprenoid-Precursor, Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphat über den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg.

Abb. 2 Schema eines Escherichia coli in vivo Systems zur Herstellung von optional Isotopen- markierten Intermediaten biosynthetischer Wege wie die Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosynthese, Thiamin oder Pyridoxal Biosynthese, und für die Herstellung von höheren Terpenoiden wie Carotinoiden.

Abb. 3 ¹H NMR-Spektrum in D₂O (pH 6) erhalten gemäß Beispiel 25. * kennzeichnet Verunreinigungen.

Abb. 4 Herstellung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat gemäß Beispiel 24. Reagenzien und Bedingungen wie folgt: (a) DHP, PPTS, 25°C (2,5 h); (b) PH₃PCHCO₂Et, Toluol, Rückfluß (39 h); (c) (1) DIBAH, CH₂Cl₂, -78°C (3 h), (2) 1 M NaOH/H₂O; (d) p-TsCl, DMAP, CH₂Cl₂, 25°C (1 h); (e) ((CH₃CH₂CH₂CH₂)₄N)₃HP₂O₇, MeCN, 25°C (2 h); (f) HCl/H₂O pH 1,25°C (7 Min).

Abb. 5 Die durch das IspH(früher LytB)-Genprodukt katalysierte Reaktion.

Abb. 6 Die durch das IspG(früher GcpE)-Genprodukt katalysierte Reaktion.

Abb. 7 Chemische Herstellung von 3-Formyl-but-2-enyl-1-diphosphat (siehe Beispiel 42).
Annex A DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxr
Annex B: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxrispD
Annex C: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclo
Annex D: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCgcpE
Annex E: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScaro14
Annex F: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCcaro14
Annex G: DNA-Sequenz und zugehörige Aminosäuresequenz des ispG (früher gcpE) Gens aus Escherichia coli.
Annex H: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclogcpE
Annex I: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYClytBgcpE
Annex J: DNA und korrespondierendes Aminosäuresequenz des ispH (früher lytB) Gens aus Escherichia coli.
Annex K: DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclogcpElytB2.
Annex L: DNA und korrespondierendes Aminosäuresequenz des ispG (Fragment) Gens aus Arabidopsis thaliana.
Annex M: DNA und korrespondierendes Aminosäuresequenz des ispG Gens aus Arabidopsis thaliana.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat ist ein übliches Intermediat in dem alternativen Terpenoidbiosyntheseweg über 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Der letztere wird in Bakterien, bestimmten Protozoen und am bedeutsamsten auch in den Plastiden von Pflanzen beschritten, wo er verantwortlich ist für die Biosynthese einer großen Anzahl wertvoller terpenoider Produkte wie Naturgummi, Carotinoiden, Menthol, Menthon, Kampher oder Paclitaxel. Der Alternative Terpenoidbiosyntheseweg wird gegenwärtig intensiv untersucht. Aber bis jetzt sind nur die Anfangsschritte ausgehend von Glyzerinaldehyd-3-phosphat und Pyruvat über 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 4- Diphosphocytidyl-2C-Methyl-D-erythritol, 4-Diphosphocytidyl-2C-Methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat (Abb. 1) aufgeklärt.

Das Intermediat 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat ist von entscheidender Bedeutung für zahlreiche kommerzielle Anwendungen:

1. Es kann benützt werden als Schlüsselintermediat für kommerzielle Screeningmethoden in Bezug auf potentielle Inhibitoren der stromab liegenden Enzyme in der Biosynthese des alternativen Terpenoidbiosyntheseweg.
2. Es kann benützt werden als Schlüsselintermediat für die in vitro Herstellung von Terpenoiden oder von Intermediaten davon.
3. Es wird in vivo gebildet in der Biosynthese von Terpenoiden als ein enzymatisches Kondensationsprodukt von Glyzerinaldehyd-3-phosphat und Pyruvat. Die letzteren sind zentrale Intermediate des Stoffwechsels und obligatorische Ausgangsmaterialien für zahlreiche biosynthetische Wege. Deswegen ist es erforderlich, hohe Mengen an 1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat ausgehend von einer exogenen Quelle und somit unabhängigen von dem Vorrat an Glyzerinaldehyd-3-phosphat und Pyruvat in vivo zu erzeugen, um die Biosynthese von Terpenoiden oder Intermediaten davon in Mikroorganismen oder Zellkulturen kinetisch anzutreiben, die entweder natürlicherweise oder rekombinant ausgestattet sind mit dem Biosyntheseweg von Interesse, ohne den Basis-Intermediärstoffwechsel der Zellen zu beeinflussen.
4. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat kann hergestellt werden ausgehend von 1-Deoxy-D- xylulose durch die katalytische Aktion des xylB Genprodukts. Unter Verwendung von rekombinanten Stämmen, die das xylB Gen beinhalten, findet die Reaktion in vivo statt und exogene 1-Deoxy-D-xylulose wird in intrazellulares 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in hohen Raten umgewandelt.
5. 1-DXP kann ausgehend von Glukose durch die katalytische Funktion von glykolytischen Enzymen und DXP-Synthase hergestellt werden. Unter Benützung von rekombinanten Stämmen, die das dxs Gen beinhalten, läuft die Reaktion in vivo ab und exogene Glukose wird in intrazelluläres 1-DXP in hohen Raten umgewandelt.

Es ist ein Aspekt der Erfindung 1-Deoxy-D-xylulose als Precursor zu verwenden, um die Umsatzraten der Biosynthese von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-abhängigen Biosynthesewegen anzutreiben. 1-Deoxy-D-xylulose kann mittels vielfältiger publizierter Verfahren hergestellt werden (Blagg und Poulter, 1999; Backstrom et al., 1995; Kennedy et al., 1995; Piel und Boland, 1997; Shono et al., 1983; Giner, 1998).

Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung 1-Deoxy-D-xylulose in vielfältigen Isotopen- markierten Formen zu verwenden. Es kann durch radioaktive Isotope oder durch nicht- radioaktive Isotope von C (¹³C oder ¹⁴C), H (D oder T) oder O (¹⁷O oder ¹⁸O) in jeglicher Kombination markiert werden.

Isotopen-markierten 1-Deoxy-D-xylulose kann enzymatisch hergestellt werden unter Verwendung von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus Bacillus subtilis und kommerziell erhältlichen glykolytischen Enzymen und Phosphatase ausgehend von Isotopen- markierten Glukose und/oder Pyruvat (PCT/EP00/07548).

1-Deoxy-D-xylulose kann benützt werden als freie Säure oder als Salz, vorzugsweise als Alkali- (z. B. Lithium, Natrium, Kalium) Salz oder als Ammonium- oder Aminsalz.

Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, rekombinante Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon für die Bildung von biosynthetischen Produkten oder Intermediaten oder Enzymen oder für das Screenen nach antimikrobiellen Substanzen, Antimalaria oder Herbiziden zu verwenden.

Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung werden vielfältige Techniken aus Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanter DNA-Technologie verwendet, die umfassend beschrieben sind in Sambrook et al., Molecular cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; in DNA Cloning: A Practical Approach, Vol 1 and 2, 1985 (D N. Glover, ed.); in Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait, ed.), und in Transcription and Translation (Hames and Higgins, eds.).

Nukleinsäuren

Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuren, welche prokaryotische, protozoelle und Pflanzensequenzen und davon abgeleitete Sequenzen. Eine abgeleitete Sequenz bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz entsprechend einer Region dieser Sequenz oder Orthologen davon oder komplementär zu "Sequenz-konservativen" und "Funktions-konservativen" Varianten davon. Sequenzen können isoliert werden mittels gut bekannter Techniken oder sind kommerziell erhältlich (Clontech, Palto Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Alternativ können PCR-basierte Methoden benützt werden, um verwandte Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA zu amplifizieren.

Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen Purin- und Pyrimidin-enthaltende Polymere von beliebiger Menge, entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleotide oder gemischte Polyribo-Polydesoxyribonukleotide. Die Nukleinsäuren können direkt aus Zellen isoliert werden. Alternativ kann PCR benützt werden zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung unter Benutzung von chemisch synthetisierten Strängen oder genomischem Material als Matrize. Für die PCR benützte Primer können synthetisiert werden unter Benutzung der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Sequenzinformation oder ausgehend von der Datenbank und können weiterhin so konstruiert werden, dass nach Bedarf neue Restrik tionsstellen eingeführt werden, um den Einbau in einen gegebenen Vektor für die rekombinante Expression zu erleichtern.

Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können flankiert sein durch natürliche Regulationssequenzen oder können assoziiert sein mit heterologen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancern, Responselementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nichtkodierende Regionen und ähnlichem. Die Nukleinsäuren können auch modifiziert sein durch viele Maßnahmen entsprechend dem Stand der Forschung. Nicht- limitierende Beispiele für solche Modifikationen sind Methylierungen, "Caps", Substitution einer oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, und Internukleotidmodifikationen, wie z. B. diejenigen mit ungeladenen Verknüpfungen, (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.). Nukleinsäuren können eine oder mehrere zusätzliche kovalent verknüpfte Einheiten enthalten wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), Intercalatoren (z. B., Acridin, Psoralen, etc.), Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle, etc.) und Alkylatoren. Die Nukleinsäuren können abgeleitet werden durch Bildung einer Methyl- oder Ethylphosphotriesterbindung oder einer Alkylphosphoramidatbindung. Weiterhin können die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung auch modifiziert werden mit einer Markierung, welche ein direkt oder indirekt detektierbares Signal liefert. Exemplarische Markierungen schließen Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin und weiteres ein.

Vektoren

Die Erfindung stellt auch Nukleinsäurevektoren bereit, welche die offen gelegten Sequenzen oder Derivate davon umfassen. Eine große Zahl von Vektoren, einschließlich Plasmide und Pilzvektoren sind beschrieben worden für die Replikation und/oder Expression in einer Vielfalt von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten. Nicht-limittierende Beispiele umfassen pKK Plasmide (Clontech), pUC Plasmide, pET Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI) oder pRSET oder pREP (Invitrogen, San Diego, CA) und viele geeignete Wirtszellen unter Benutzung von gut bekannten Methoden. Rekombinante Klonierungsvektoren umfassen oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonierung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z. B. Antibiotikaresistenz und ein oder mehrere Expressionskassetten. Geeignete Wirtszellen können transformiert/transfiziert/infiziert werden je nach Bedarf durch eine geeignete Methode unter Einschluß von Elektroporation, CaCl₂-vermittelten DNA- Aufnahme, tungae Infektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil oder anderen etablierten Methoden.

Geeignete Wirte schließen Bakterien, Archaebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, Pflanzen, vorzugsweise Arabidopsis thaliana, Mentha piperita oder Taxus Arten und tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen ein. Von besonderer Bedeutung sind E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, SF9 Zellen, C129 Zellen, 293 Zellen, Neurospora, und CHO Zellen, COS Zellen, HeLa Zellen und immortalisierte myeloide und lymphoide Säugetierzellen. Bevorzugte Replikationssysteme schließen M13, ColE1, SV40, Baculovirus, Lambda, Adenovirus und ähnliches ein. Eine große Anzahl von Transkriptions-, Initiations- und Terminationsregulationsregionen sind isoliert worden und ihre Wirksamkeit in der Transkription und Translation heterologer Proteine in den verschiedenen Wirten ist gezeigt worden. Beispiele für diese Regionen, Methoden für die Isolierung, Art der Handhabung, etc. sind dem Fachmann bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen benützt werden als Quelle für die rekombinant produzierten Proteine.

Expressionssysteme

Vorteilhafterweise können Vektoren ein Transkriptionsregulationselement (d. h. einen Promoter) einschließen, der funktionell verknüpft ist mit dem Enzymanteil. Der Promoter kann nach Bedarf Operatorportionen und/oder Ribosomenbindungsstellen enthalten. Nicht-limitierende Beispiele für bakterielle Promotoren, welche mit E. coli kompatibel sind schließen ein: trc Promoter, β- Lactamase (Penicillinase)-Promoter, Lactosepromoter, Tryptophan (trp)-Promoter, Arabinose BAD Operon-Promoter, lambda-abgeleiteter P1-Promoter und N Gen Ribosomenbindungsstelle und den Hybriden Tac Promoter, der abgeleitet ist aus Sequenzen von trp und lac UV5 Promotoren. Nicht-limitierende Beispiele für Hefepromotoren umfassen 3- Phosphoglyceratkinasepromoter, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) Promoter, Galactokinase (GALI) Promoter, Galactoepimerase Promoter und Alkoholdehydrogenase (ADH) Promoter. Geeignete Promotoren für Säugerzellen umfassen ohne Limitierung virale Promotoren wie z. B. solche aus Simian Virus 40 (SV40), Rous sarcoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapilloma Virus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequenzen und Poly-A Additionssequenzen benötigen und Enhancersequenzen, welche die Expression erhöhen, können eingeschlossen werden. Sequenzen, welche die Amplifizierung von Genen verursachen, können ebenfalls wünschenswert sein. Weiterhin können Sequenzen eingeschlossen werden, welche die Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Zelle erleichtern unter Einschluß aber ohne Begrenzung auf Bakterien, Hefen und tierische Zellen, wie z. B. sekretorische Signalsequenzen und/oder Prohormon pro Region- Sequenzen.

Es ist ein bedeutsamer Aspekt der Erfindung, dass die gemeinsame rekombinante Ausstattung mit xylB und (einem) anderen Gen(en) des alternativen C5-Isoprenoidbiosyntheseweg und optional Genen für höhere Isoprenoide oder Terpenoide diese Biosynthesewege antreibt(en). Vorzugsweise wird xylB mit kompletten Sätzen von Genen kombiniert, um 1-Deoxy-D-xylulose- 5-phosphat in das gewünschte Intermediat oder Endprodukte umzuwandeln. Für Intermediate im C5-Isoprenoidbiosyntheseweg werden die Kombinationen, gegeben in Anspruch 76, bevorzugt.

Für die hierin erwähnten Gene wird die übliche E. coli Benennung verwendet. Andere Gene aus E. coli oder aus anderen Organismen (orthologe Gene) können auch verwendet werden, wenn sie die gleichen Funktionen (Funktions-konservative Gene) haben, insbesondere, wenn ihre Genprodukte die gleiche Reaktion katalysieren. Weiterhin können Deletions- oder Insertionsvarianten oder Fusionen von diesen Genen mit anderen Genen oder Nukleinsäuren benützt werden, so weit diese Varianten Funktions-konservativ sind. Die obigen Gene können von Bakterien, Protözoen oder von höheren oder niederen Pflanzen stammen.

Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die Funktion von gcpE, die direkt stromab von ispF erfolgt, bestimmt wurde. Unsere Entdeckungen zeigen, dass das gcpE Genprodukt involviert ist in die Bildung der neuartigen Verbindung 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat ausgehend von 2C-methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat. Darum benennen wir gcpE in ispG um.

In einem weiterem Aspekt der Erfindung wurde durch Vergleich mit den chemisch synthesierten (E)- und (Z)-Isomere von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat gezeigt, dass das Genprodukt von gcpE in die Bildung des E-Isomers von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat ausgehend von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat involviert ist. Darum bezieht sich die Erfindung weiterhin auch auf die (E)- und (Z)-Isomere von 1-Hydroxy-2-methyl- 2-butenyl-4-diphosphat sowie auf deren Salz und protonierte Formen.

Es ist eine weiterer, bedeutsamer Aspekt der Erfindung, daß die Funktion von lytB als direkt stromab von ispG bestimmt wurde. Deswegen benennen wir es in ispH um. Es ist unsere Entdeckung, daß ispH an der Umwandlung von (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat beteiligt ist.

Es versteht sich, daß "1-Hydroxy-2-methyl-butenyl-4-phosphat" bzw. "1-Hydroxy-2-methyl butenyl-4-diphosphat" freie Phosphor- bzw. Diphosphorsäuren beinhalten, und einzeln oder mehrfach protonierte Formen davon, d. h. Salze, die Salze eines beliebigen Kations (Na, K, NH₃, Li, Mg, Ca, Mn und Co eingeschlossen) sein können. Der Protonierungszustand der (Di)- Phosphate und Phosphatderivate oder deren konjugierten Säuren in wässriger Lösung hängt von dem pH-Wert der Lösung ab, wie es fachlich qualifizierten Personen bekannt ist. Dies gilt auch für andere Phosphate oder Phosphatderivate.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat erfolgreich in die lipidlösliche Fraktion von Capsicum annuum Chromoplasten eingebaut. Eine ¹⁴C-Markierung dieser Verbindung wurde in die Geranylgeraniol-, Phytoen- und Phytofluen- Fraktionen von C. annuum Chromoplasten eingebaut, was (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat als Intermediat des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs stromab von 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und stromauf von Isopentenyldiphosphat etabliert.

Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, daß xylB mit gcpE und optional anderen Genen des alternativen C5-Isoprenoidbiosynthesewegs und/oder der höheren Isoprenoidbiosynthesewege in Vektoren für rekombinante Technologie kombiniert werden kann.

Als Konsequenz unserer Entdeckungen bzgl. gcpE (nun ispG) folgt, dass das Gen lytB stromab von gcpE operabel ist, und somit die Aufgabe der Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat in IPP und/oder DMAPP hat. Darum ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, das Gen lytB mit xylB und optional weiteren Genen des gewöhnlichen C5- Isoprenoidbiosynthesewegs oder eines höheren Isoprenoidbiosynthesewegs zu kombinieren.

Unsere Entdeckung erlaubt die effiziente Bildung oder Herstellung von Intermediaten oder Produkten des Isoprenoidbiosynthesewegs mit jeglicher erforderlicher Markierung, insbesondere der folgenden Intermediate: 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat; 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat; 2C-methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat; 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat; Isopentenyldiphosphat; Dimethylallyldiphosphat.

Die Bildung der Endprodukte des Terpenoidbiosynthesewegs (z. B. β-Carotin, Zeaxanthin, Paclitaxel, Menthol, Menthon, Cannabinoide), sowie die Endprodukte von Thiamindiphosphat und Pyridoxalphosphat können angetrieben werden gemäß dem Verfahren der Erfindung.

Die Stämme, die die rekombinanten Plasmide beinhalten, können in konventionellen Kulturmedien kultiviert werden, vorzugsweise in Terrific-Broth Medium, bei 15 bis 40°C. Die E. coli Stämme werden bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,5 bis 5 mit 0,5 bis 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induziert. Nach Zugabe von 1-Deoxy-D-xylulose in einer Konzentration von 0,001 mM bis 1 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 30 mM, werden die Zellen für 30 Minuten bis 15 Stunden, vorzugsweise 1 bis 5 Stunden inkubiert.

Es wurde gefunden, dass das Verfahren zur Herstellung isoprenoider Intermediate oder Produkte mittels der gentechnisch veränderten Organismen der Erfindung angetrieben werden kann durch die Bereitstellung einer Quelle für CTP, z. B. Cytidin und/oder Uridin und/oder Cytosin und/oder Uracil und/oder Ribose und/oder Ribose-5-phosphat und/oder irgendeinem biosynthetischen Precursor für CTP in einer Konzentration von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,3 bis 1 mM, und/oder durch Bereitstellung einer Quelle mit Phosphorylierungsaktivität, z. B. Glyzerin-3-phosphat und/oder Phosphoenolpyruvat und/oder Ribose-5-phosphat in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM, und/oder anorganischem Phosphat und/oder anorganischem Pyrophosphat in einer Konzentration von 1 bis 500 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 100 mM und/oder irgendeinem organischem Phosphat und/oder Pyrophosphat, und/oder durch Bereitstellung einer Quelle für Reduktionsäquivalente, z. B. Laktat und/oder Succinat und/oder Glyzerin und/oder Glukose und/oder Lipide in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM. Ein besonders effizientes Herstellungsverfahren ist in den Ansprüchen 72 und 80 bis 84 beschrieben.

Dieses Verfahren kann mit großen Vorzügen für das Screenen nach Inhibitoren von involvierten Enzymen oder von stromab Enzymen benützt werden, abhängig von der Wahl des isoprenoiden Intermediates oder Produktes für die Detektion. Die Enzyme Dxr, IspD, IspE, IspF, IspG (früher GcpE) und LytB kommen nicht bei Tieren vor. Darum haben Inhibitoren gegen Dxr, IspD, IspE, IspF, IspG (früher GcpE) und LytB großen Wert als (a) Herbizide gegen Unkrautpflanzen oder Algen; (b) antibiotische Agenzien gegen pathogene Bakterien; (c) Agenzien gegen Protozoen wie Plasmodium falciparum, dem ursächlichen Malariapathogen.

Die Aktivität der besagten Enzyme kann detektiert werden (in Gegenwart oder Abwesenheit eines potenziellen Inhibitors) durch Messung entweder der Bildung eines Produktes oder des Verbrauchs eines Intermediates, vorzugsweise mittels DC, HPLC oder NMR.

Durch die Entdeckung, dass 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat ein Intermediat des Mevalonat-unabhängigen Terpenoidbiosynthesewegs ist, haben wir essenzielle Determinanten für die Struktur von Inhibitoren ermittelt. Nämlich, daß die Strukturen einer Untermenge von Inhibitoren ähnlich sein sollten zumindest einem Teilbereich der Ausgangsverbindung oder des Produktes oder des Übergangszustandes zwischen der Ausgangsverbindung, beispielsweise 2C-methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat, und des Produktes, beispielsweise 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat.

Diese Erfindung beinhaltet neuartige Verbindungen, oder deren Salze, mit folgender Formel I:

wobei R¹ und R² verschieden von einander sind und einer von R¹ und R² Wasserstoff ist und der andere ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂- O-PO(OH)₂, ist, und wobei A für -CH₂OH oder -CHO steht. Diese Verbindungen können Isotopen-markiert sein. In Formel I steht A vorzugsweise für -CH₂OH.

Von R¹ und R², ist R¹ vorzugsweise Wasserstoff und R² vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂-O-PO(OH)₂. In der Gruppe, bestehend aus -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂-O-PO(OH)₂, ist -CH₂-O-PO(OH)-O- PO(OH)₂ bevorzugt.

Falls eine Verbindung von Formel I ein Salz ist, kann es beispielsweise ein Lithium-, Kalium-, Magnesium-, Ammonium-, Mangansalz sein. Diese Salze können abgeleitet sein von einer einfach oder von einer mehrfach deprotonierten Form der (Di)-Phosphorsäureanteils.

Die neuartigen Verbindungen, die hier offen gelegt wurden, sind nützlich für zahlreiche Anwendungen, beispielsweise für das Screenen von Genen, Enzymen oder Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden oder Terpenoiden, entweder in vitro in Gegenwart eines Elektronendonors oder in vivo.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur chemischen Herstellung einer Verbindung mit der Formel I oder eines Salzes davon bereit:

wobei A -CH₂OH darstellt und R¹ und R² verschieden voneinander sind und einer von R¹ und R² Wasserstoff ist und der andere -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂, -CH₂-O-PO(OH)₂ oder -CH₂-OH durch folgende Schritte:

a) Umsetzung einer Verbindung mit der folgenden Formel (II):
wobei B eine Schutzgruppe in einer Verbindung mit den folgenden Formeln (III) oder (IV) ist:
durch ein Wittig- oder Horner-Reagenz, wobei die Gruppe D eine Vorstufengruppe, die reduktiv überführbar in eine -CH₂OH-Gruppe ist;
b) reduktiv Überführung der Gruppe D in eine CH₂-OH-Gruppe;
c) optional Überführung der CH₂-OH-Gruppe, erhalten in Schritt (b), in -CH₂-O-PO(OH)-O- PO(OH)₂ oder -CH₂-O-PO(O)₂ oder Salze davon in einer Art und Weise, die an sich bekannt ist;
d) optionale Umwandlung in ein erforderliches Salz;
e) Entfernung der Schutzgruppe B.

In dem obigen Verfahren kann besagte Schutzgruppe B eine beliebige Gruppe, die es erlaubt eine Hydroxylgruppe an der Position zu regenerieren, an der sie angeheftet ist. Besagte Schutzgruppe ist vorzugsweise stabil unter den Bedingungen des Schritts (a) bis (d). Besagte Schutzgruppe B wird entfernt in Schritt (e) des besagten Verfahrens, um eine Hydroxylgruppe zu generieren. Schutzgruppen für Hydroxylgruppen sind für fachlich qualifizierte Personen bekannt. Besagte Gruppe B kann zum Beispiel eine Azetalgruppe bilden zusammen mit dem verblieben Anteil der Verbindung mit den Formeln (II), (III) oder (IV). Azetale können hydrolysiert werden unter sauren Bedingungen. Vorzugsweise ist Gruppe B eine 2- Tetrahydropyranylgruppe.

In dem obigen Verfahren ist besagte Vorläufergruppe D reduktiv umwandelbar in eine -CH₂- OH-Gruppe. Gruppe D kann ein Derivat einer Carbonsäure sein. Beispiele für solch eine Gruppe beinhalten Alkoxycarbonyl- und Aminocarbonylgruppen. Besagte Aminocarbonylgruppen können an der Aminogruppe mit einer oder zwei Alkylgruppen substituiert. Vorzugsweise werden Alkoxycarbonylgruppen benützt. Die Alkylgruppe besagter Alkoxycarbonylgruppen oder besagte Alkylgruppen besagter Aminocaronylgruppen können lineare oder verzweigte Alkylgruppen sein, welche einfach oder mehrfach substituiert sein können. Bevorzugt sind C₁-C₆-Alkylgruppen wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- oder Hexylgruppen. Bevorzugt sind Methyl- oder Ethylgruppen. Das bevorzugste Beispiel für besagte Gruppe D ist eine Ethoxycaronylgruppe.

Besagte Verbindung der Formel (I) kann durch Schützen der Hydroxylgruppe von Hydroyazeton mit besagter Gruppe B hergestellt werden. Falls die Gruppe B eine Tetrahydropyranylgruppe ist, kann die Verbindung mit der Formel (II) ausgehend von Hydroxyazeton und 3,4-Dihydro-2H- Pyran hergestellt werde, vorzugsweise unter Verwendung von Tetrahydropyranylether als Katalysator. Eine spezifische Methode zur Herstellung von Azetonyltetrahydropyranylether ist in Beispiel 24 beschrieben.

In Schritt (a) des besagten Verfahrens wird die Verbindung mit der Formel (II) zu einer Verbindung mit der Formel (III) oder (IV) umgewandelt durch ein Wittig- oder Horner-Reagenz. Wittig-Reaktionen und -Reagenzien sind bekannt für fachlich qualifizierte Personen (siehe z. B. Watanabe et al., 1996 und hierin zitierte Referenzen). Übliche Wittig-Reagenzien, die benützt werden für das obige Verfahren, sind Methylen-Triphenylphosphorane, die an der Methylen- Gruppe substituiert sein können. Für das obige Verfahren dieser Erfindung wird ein Methylen- Triphenylphosphoran verwendet, welches mit der oben definierten Gruppe D an der Methylen- Gruppe substituiert ist. Solche Wittig-Reagenzien sind kommerziell erhältlich oder können hergestellt werden gemäß bekannten Methoden.

Das in Schritt (a) hergestellte Olefin kann gebildet werden aus einer Mischung aus cis/trans Isomeren mit den Formeln (III) oder (IV). Falls eines der besagten Isomere bevorzugt ist, kann es angereichert oder abgetrennt von dem anderen werden durch Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, vorzugsweise durch Chromatographie. Alternativ kann eine Abtrennung der besagten Isomere erfolgen nach einem der folgenden Schritte (b) bis (e).

In Schritt (b) des oben erwähnten Verfahrens wird die Gruppe D der Verbindung mit den Formeln (III) oder (IV) oder eine Mischung von besagten Verbindungen reduktiv in eine CH₂OH- Gruppe überführt. Verschiedene Methoden sind dem Fachmann bekannt, um diese Reduktion durchzuführen. Bedingungen werden so gewählt, daß die Gruppe D reduziert, während der Olefinteil nicht reduziert wird. Beispiele für verwendbare Reduktanten in diesem Schritt sind molekularer Wasserstoff oder Metallhydride. Beispiele für nützliche Metallhydride schließen Borhydride wie Natriumborhydrid, Aluminiumhydride wie Lithiumaluminiumhydrid oder Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAH), Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydride wie Natriumhydrid oder Calciumhydrid ein. Aluminiumhydride sind bervorzugt. Ein spezifisches Beispiel zur Durchführung von Schritt (b) ist in Beispiel (24) beschrieben.

Falls das benötigte Endprodukt des besagten Verfahrens eine Verbindung mit der Formel (I) ist, wobei R¹ oder R² -CH₂OH ist, kann die Verbindung oder Mischung der Verbindungen in Schritt (b) direkt dem Schritt (d) oder Schritt (e) unterworfen werden. Vorzugsweise ist sie Schritt (e) zu unterwerfen zur Entfernung der Schutzgruppe B. Falls das benötigte Endprodukt des besagten Verfahrens eine Verbindung mit der Formel (I) ist, wobei R¹ oder R² -CH₂-O-PO(OH)- O-PO(OH)₂ oder -CH₂-O-PO(OH)₂ ist, kann die Verbindung oder Mischung der Verbindungen in Schritt (b) dem Schritt (c) des besagten Verfahrens zur Umwandlung der -CH₂OH-Gruppe in Schritt (b) in eine -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ oder -CH₂-O-PO(OH)₂ unterworfen werden.

Schritt (c) kann auf verschiedene Weisen ausgeführt werden, welche der fachlich qualifizierten Person bekannt sind. Schritt (c) kann Substituierung der Hydroxyl-Gruppe der besagten -CH₂- OH-Gruppe, die in Schritt (b) durch eine Abgangsgruppe erhalten wurde, beinhalten. Schritt (c) kann Umwandlung besagter -CH₂-OH-Gruppe in eine -CH₂-Halogenidgruppe durch ein Halogenierungsreagenz. Ein Schwefel-, Sulfon- oder Phosphorsäurehalogenid kann als Halogenierungsreagenz verwendet werden. Tosylchlorid ist am meisten gebräuchlich. Besagte Halogenide können Fluoride, Chloride, Bromide oder Jodide, vorzugsweise Chloride sein. Die Verbindung, die besagte -CH₂-Halogenidgruppe trägt, wird bevorzugt isoliert. Besagte Abgangsgruppe kann auch durch Reaktion besagter -CH₂-OH-Gruppe, die in Schritt (b) erhalten wurde, mit einem Sulfonsäurehalogenid, vorzugsweise Tosylchlorid erzeugt werden.

Besagtes Intermediat mit besagter Abgangsgruppe kann dann zur Reaktion gebracht werden mit Phosphor- oder Diphosphorsäure oder einfach oder mehrfach deprotonierten Formen davon. Vorzugsweise wird ein Alkylammoniumsalz von Phosphor- oder Diphosphorsäure benützt, besser ein Tetraalkylammoniumsalz, am besten ein Tetra-Butylammoniumsalz. Ein polares, aprotisches Lösungsmittel wird für diese Reaktion bevorzugt. Vorzugsweise wird die Verbindung oder Mischung von Verbindungen, die erhalten wurden, gemäß Standardverfahren gereinigt. Ein spezifisches Beispiel zur Ausführung von Schritt (c) ist in Beispiel (24) beschrieben.

In Schritt (d) kann die in Schritt (c) erhaltene Verbindung oder Mischung von Verbindungen umgewandelt werden in ein benötigtes Salz. Methoden zur Ausführung von Schritt (d) sind gut bekannt. Solche Methoden können Einstellung des pH-Wertes einer wässrigen Lösung mit einer geeigneten Säure oder Salz zum erforderlichen Wert beinhalten.

In Schritt (e) wird die Schutzgruppe B einer Verbindung, die in einem der Schritte (b) bis (e) erhalten wurde, entfernt, um eine Verbindung mit der Formel (I) zu erhalten, wobei A -CH₂-OH ist. Die Methode zur Entfernung einer Schutzgruppe ist abhängig von dem Typ der Schutzgruppe. Solche Methode sind gut bekannt. Falls die Schutzgruppe ein Azetal bildet, kann die Entfernung besagter Schutzgruppe durch saure Hydrolyse erreicht werden.

Diese Erfindung stellt ein Protein in einer Form bereit, welche funktionell ist für die Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form, vorzugsweise in Gegenwart von NADH und/oder NADPH und/oder in Gegenwart von Co²⁺. Besagtes Enzym hat eine Sequenz, die kodiert wird durch das ispG (früher gcpE) Gen von E. coli oder einem funktions-konservativen Homolog von besagter Sequenz, d. h. besagtes Homolog ist fähig zur Bewerkstelligung der gleichen Reaktion wie besagtes Protein.

Diese Erfindung stellt weiterhin ein Protein bereit in einer Form, die funktionell ist für die enzymatische Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form, in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethyldiphosphat. Besagtes Protein benötigt vorzugsweise FAD und NAD(P)H für besagte Funktionalität. Weiterhin benötigt besagtes Protein ein Metallion, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Mangan-, Eisen-, Kobalt- oder Nickelionen. Besagtes Protein hat eine Sequenz, die kodiert wird durch das ispH (früher lytB) Gen von E. coli oder einem funktions-konservativem Homolog von besagter Sequenz.

Die obigen Proteine können pflanzliche Proteine, insbesondere von Arabidopsis thaliana, bakterielle Proteine, insbesondere von E. coli oder protozoelle Proteine, insbesondere von Plasmodium falciparum sein.

Die Erfindung stellt weiterhin eine gereinigte, isolierte Nukleinsäure bereit, die für eines der beiden der obigen Proteine kodiert mit oder ohne Introns. Weiterhin stellt die Erfindung einen DNA-Expressionsvektor bereit, der die Sequenz von besagten gereinigten, isolierten Nukleinsäuren enthält.

Die Erfindung stellt weiterhin Zellen, Zellkulturen, Organismen oder Teile davon bereit, die rekombinant versehen sind mit der Sequenz von besagten gereinigten, isolierten Nukleinsäuren oder mit besagtem DNA-Expressionsvektor, wobei besagte Zelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen, protozoellen, Pilz-, pflanzlichen und Säugerzellen. Besagte Zellen, Zellkulturen, Organismen oder davon können weiterhin ausgestattet mit mindestens einem der Gene ausgewählt aus der folgenden Gruppe sein: dxs, dxr, ispD (früher ygbP), ispE (früher ychB), ispF (früher ygbB) von E. coli oder einer Funktions-konservativem Homolog davon, oder einer Funktions-konservierter Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante von irgendeinem der obigen Gene.

Die Erfindung stellt weiterhin Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teile davon bereit, die transformiert oder transfiziert sind für eine erhöhte Bildungsrate von 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form, verglichen mit Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teilen davon ohne besagte Transformation oder Transfektion. Die Transformation oder Transfektion beinhaltet vorzugsweise die Ausstattung mit dem gcpE Gen aus E. coli oder mit einem Funktions-konservativen Homolog aus einem anderen Organismus, z. B. pflanzlichen oder protozoellen Organismus.

Die Erfindung stellt auch Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teile davon bereit, die transformiert oder transfiziert sind für eine erhöhte Bildungsrate für die Umwandlung von (E)-1- Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat verglichen mit Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teilen davon ohne besagte Transformation oder Transfektion. Die Transformation oder Transfektion beinhaltet vorzugsweise die Ausstattung mit dem lytB Gen aus E. coli oder mit einem Funktions-konservativen Homolog aus einem anderen Organismus, z. B. pflanzlichen oder protozoellen Organismus.

Die Erfindung stellt auch Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teile davon bereit, die transformiert oder transfiziert für ein erhöhtes Expressionslevel des Proteins von einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder des Proteins von einem der Ansprüche 5 bis 8 verglichen mit Zellen, Zellkulturen, oder Organismen oder Teile davon ohne besagte Transformation oder Transfektion.

Außerdem stellt die Erfindung eine Methode zur Veränderung des Expressionslevels des(r) Genprodukts(e) von ispG und/oder ispH oder einen Funktion-konservativen Homologen aus anderen Organismen oder Varianten davon in Zellen, bestehend aus

a) Transformieren der Wirtzellen mit dem ispG und/oder ispHGen,
b) Kultivieren der transformierten Wirtszellen aus Schritt (a) unter Bedingungen, die geeignet sind für die effiziente Expression der(s) IspG- und/oder IspH-Genprodukts(e), resultierend in Erreichung eines anderen Levels des(r) IspG- und/oder IspH- Genprodukts(e) in den transformierten Zellen relativ zu dem Expressionslevels der untransformierten Zellen.

Außerdem stellt die Erfindung eine Methode bereit, zur Identifizierung eines Inhibitors eines Enzyms, dass funktionell ist für die Umwandlung von 2C-methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner E-Form, des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs durch die folgenden Schritte:

a) inkubieren einer Mischung die besagtes Enzymen enthält mit seinem, optional Isotopen- markiertem, Substrat 2C-methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat unter Bedingungen, die geeignet sind für besagte Umwandlung in der Gegenwart und in der Abwesenheit eines potenziellen Inhibitors,
b) anschließende Bestimmung der Konzentration von 2C-methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat und/oder 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, und
c) vergleichen der Konzentration in der Gegenwart und in der Abwesenheit eines besagten potenziellen Inhibitors.

Außerdem stellt die Erfindung eine Methode bereit für die Identifizierung eines Inhibitors eines Enzyms, dass funktionell ist in der Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat, insbesondere in seiner E-Form, in Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs durch die folgenden Schritte:

a) inkubieren einen Mischung, die besagtes Enzym enthält mit seinem, optional Isotopen- markierten, Substrat 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat unter Bedingungen, die geeignet sind für besagte Umwandlung in der Gegenwart und in der Abwesenheit eines potenziellen lnhibitors, wobei besagte Mischung vorzugsweise FAD enthält,
b) Bestimmung der Konzentrationen von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat, und
c) vergleichender Konzentrationen in der Gegenwart und in der Abwesenheit von besagtem potenziellen Inhibitor.

Weitere Darstellungen von besagten Methoden zur fdentifizierung sind definiert in den Unteransprüchen zu diesem Methoden.

Es ist bekannt, dass Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Biosynthesewegs verantwortlich sind für die λδ T-Zellaktivierung durch zahlreiche pathogene Bakterien. λδ T- Zellaktivierung ist gefolgt von T-Zellproliferation, Ausschüttung von Zytokininen und Chemokininen und ist sehr wahrscheinlich entscheidend für die Regulation der Immunantwort nach einer Infektion durch Pathogene (Altincicek et al., 2001 und darin zitierte Literatur). Kürzlich wurde gezeigt, dass E. coli-Stämme die Fähigkeit zur Stimulierung gamma delta T- Zellen verloren, wenn das dxr oder das gcpE Gen ausgeknockt worden war, was stark darauf hindeutete, dass ein Intermediat stromab von gcpE und stromauf von Isopentenyldiphosphat die stärkste Antigenaktivität aufweist (Altincicek et al., 2001). Dennoch ist das Intermediat, welches durch das GcpE-Genprodukt in diesem Biosyntheseweg produziert wird, unbekannt. Hier ist dieses Intermediat überraschenderweise identifiziert worden als eine bislang beispiellose Verbindung, welche eine große Bandbreite von neuartigen Anwendungen für diese Verbindung eröffnet.

Die Verbindungen der Formel I können als immunmodulierende oder immunstimulierende Agenzien verwendet werden, beispielsweise für die Aktivierung von λδ T-Zellen. Immunmodulation über λδ T-Zellaktivierung durch besagte Verbindungen könnte sich als nützlich erweisen, nicht nur für die Unterstützung der Bekämpfung von Pathogenen, sondern auch für viele Gegebenheiten, für die eine Stimulation des Immunsystems erforderlich ist. Diese neuartigen Verbindungen der Erfindung können deswegen benützt werden für die medizinische Behandlung von Infektionen durch Pathogene. Solch eine Behandlung stimuliert die Aktivität des Immunsystems gegen das Pathogen. Vorzugsweise wird für diese Anwendung die Verbindung, wobei R¹ = H und/oder A =CH₂OH, benützt. Alternativ kann sich das Oxidationsprodukt mit A=CHO als hoch aktiv erweisen. Von den Verbindungen der Formel I kann die mit der höchsten oder geeignetsten λδ T-Zellstimulation ausgewählt werden in einem Testsystem, welches dem Stand der Technik entspricht (beispielsweise beschrieben von Altincicek et al., 2001). Wichtig ist, dass die Entwicklung von Resistenzen nicht problematisch für die Methode der Behandlung, die hier offengelegt ist, ist, da die Verbindungen der Erfindung nicht als Antibiotika fungieren.

In einer bevorzugten Darstellung, können besagte Verbindungen für die Behandlung einer Infektion durch ein Pathogen mit einer antibiotisch aktiven Verbindung kombiniert werden. Solch eine Behandlung kombiniert die Vorteile der Inhibierung der Proliferation des Pathogens durch ein Antibiotikum und Stimulation des Immunsystems gegen das Pathogen, resultierend in einer sehr viel schnelleren und effektiveren Behandlung. Solch eine antibiotisch aktive Verbindung kann ein bakeriostatisch wirksames Antibiotikum sein (beispielsweise Tetrazykline).

Deswegen können die neuartigen Verbindungen für die Herstellung eines Medikamentes benützt werden. Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung, die eine Verbindung der Formel I und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger enthält. Besagte pharmazeutische Zubereitung kann weiterhin eine antibiotisch aktive Verbindung wie oben erwähnt enthalten.

Die Erfindung beinhaltet weiterhin Antikörper gegen die Verbindung der Formel I. Besagte Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und können hergestellt werden gemäß konventioneller Techniken. Herstellung solcher Antikörper wird die Kopplung einer Verbindung der Formel I als Hapten an einen makromolekularen Träger wie ein Protein beinhalten, um immunogen zu sein. Solch eine immunogene Verbindung der Formel I kann weiterhin als Impfstoff benützt werden.

Die Antikörper der Erfindung können für die Detektion einer Verbindung der Formel I benützt werden. Da besagte Verbindungen durch Organismen hergestellt werden, die den Mevalonat- unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg besitzen, können solche Organismen durch besagte Antikörper detektiert werden. Vorzugsweise können solche Organismen in Körperflüssigkeiten detektiert werden mittels einer diagnostischen Methode, dadurch dass sie eine Infektion durch ein pathogenen anzeigen, das den Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg besitzt. Ein positives Ergebnis in einer solchen diagnostischen Methode kann gleichzeitig eine mögliche Behandlung durch die Verbindungen der Erfindung anzeigen.

Falls ein Antikörper der Erfindung für die Detektion einer Verbindung der Formel I benützt wird, ist er vorzugsweise markiert, um eine photometrische Detektion zu erlauben und/oder an einen Träger immobilisiert. Solche Methoden sind in der Technik gut bekannt.

Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für chemische Herstellung einer Verbindung mit der Formel I oder eines Salzes davon bereit (siehe Abb. 7):

wobei A -CH₂OH oder -CHO darstellt, R¹ Wasserstoff ist, und R² -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂, -CH₂-O-PO(OH)₂ oder -CH₂-OH ist durch folgende Schritte:

a) Umwandlung von 2-Methyl-2-vinyl-oxiran in 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al; (b) Umwandlung von 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al in sein Azetal;
b) Substitution des Chloratoms im Produkt von Schritt (b) durch eine Hydroxylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Pyrophosphatgruppe;
c) Hydrolysierung des in Schritt (c) erhaltenen Azetals, um eine Aldehydgruppe zu erhalten;
d) optional Umwandlung der Aldehydgruppe des Produktes von Schritt (d) in eine -CH₂OH- Gruppe.

Bevorzugte Darstellungen dieses Verfahrens sind in Unteransprüchen definiert und in Beispiel 42 exemplifiziert.

Die Erfindung wird nun beschrieben im Hinblick auf spezifische Beispiele.

Beispiel 1 Konstruktion eines Vektors mit dem xylB Gen aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression von D-xylulokinase

Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1-Blue (Bullock et al., 1987; kommerzielle Quelle: Stratagene, LaJolla, CA, USA) wird isoliert entsprechend einer von Meade et al., 1982 beschriebenen Methode.

Der E. coli ORF xylB (Accession Nr. gb AE000433) von Basenpaar- (bp) Position 8596 bis 10144 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CCGTCGGAATTCGAGGAGAAATTAACCATGTATATCGGGATAGATCTTGG-3', 10 pMol des Primers 5'-GCAGTGAAGCTTTTACGCCATTAATGGCAGAAGTTGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 75 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt (Hilden, Deutschland).

1,0 µg des Vektors pBLuescript und 0,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit EcoRI und HindIII verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland (NEB)) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR- Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 20 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4- Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBSxylB. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert gemäß einer Methode, die von Dower et al., 1988 beschrieben wurde. Das Plasmid pBSxylB wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBSxylB wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode (Sanger et al., 1992) unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer (Norwalk, USA) mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions (Foster City, USA) sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000433).

Beispiel 2 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB und dxr aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase und DXP-Reduktoisomerase

Der E. coli ORF dxr (Accession Nr. gb AE000126) von Basenpaar- (bp) Position 9887 bis 11083 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CTAGCCAAGCTTGAGGAGAAATTAACCATGAAGCAACTCACCATTCTGG-3', 10 pMol des Primers 5'-GGAGATGTCGACTCAGCTTGCGAGACGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen (Hilden) gereinigt.

1,2 µg des Vektors pBSxylB (Beispiel 1) und 0,6 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit HindIII und SalI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB), Frankfurt am Main, Deutschland) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 18 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBSxylBdxr. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBSxylBdxr wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBSxylBdxr wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000126). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxr ist in Annex A gezeigt.

Beispiel 3 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr und ispD aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase, DXP-Reduktoisomerase und CDP- ME-Synthase

Der E. coli ORF ispD (Accession Nr. gb AE000358) von Basenpaar- (bp) Position 6754 bis 7464 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CCGGGAGTCGACGAGGAGAAATTAACCATGGCAACCACTCATTTGGATG-3', 10 pMol des Primers 5'-GTCCAACTCGAGTTATGTATTCTCCTTGATGG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

1,5 µg des Vektors pBSxylBdxr (Beispiel 2) und 0,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SalI und XhoI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB), Frankfurt am Main, Deutschland) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 12 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBSxylBdxrispD. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBSxylBdxrispD wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBSxylBdxrispD wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000358). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxrispD ist in Annex B gezeigt.

Beispiel 4 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr, ispD und ispE aus Escherichia coli, kompetent für die Transkri 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002010201458 00004 99880ption und Expression der D-Xylulokinase, DXP-Reduktoisomerase, CDP-ME-Synthase und cMEPP-Synthase

Die E. coli ORFs ispD und ispF (Accession Nr. gb AE000358) von Basenpaar- (bp) Position 6275 bis 7464 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CCGGGAGTCGACGAGGAGAAATTAACCATGGCAACCACTCATTTGGATG-3', 10 pMol des Primers 5'-TATCAACTCGAGTCATTTTGTTGCCTTAATGAG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

1,4 µg des Vektors pBSxylBdxr (Beispiel 2) und 0,7 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SalI und XhoI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB), Frankfurt am Main, Deutschland) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 18 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBSxylBdxrispDF. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBSxylBdxrispDF wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBSxylBdxrispDF wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000358).

Beispiel 5 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr, ispD, ispE und ispE aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase, DXP-Reduktoisomerase, CDP-ME-Synthase, CDP-ME-Kinase und cMEPP-Synthase

Der E. coli ORF ispE (Accession Nr. gb AE000219) von Basenpaar- (bp) Position 5720 bis 6571 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GCGAACCTCGAGGAGAAATTAACCATGCGGACACAGTGGCCC-3', 10 pMol des Primers 5'- CCTGACGGTACCTTAAAGCATGGCTCTGTGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

1,2 µg des Vektors pBSxylBispDF (Beispiel 4) und 0,6 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit XhoI und KpnI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 15 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScyclo. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScyclo wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScyclo wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000219). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclo ist in Annex C gezeigt.

Beispiel 6 Konstruktion eines Vektors mit dem Gen gcpE kompetent für dessen Transkription und Expression

Der E. coli ORF gcpE (Accession Nr. gb AE000338) von Basenpaar- (bp) Position 372 bis 1204 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CGTACCGGATCCGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTC-3', 10 pMol des Primers 5'-CCCATCGTCGACTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

2,0 µg des Vektors pACYC184 (Chang and Cohen, 1978, NEB) und 0,7 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit BamHl und SalI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor- DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 20 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYCgcpE. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYCgcpE wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYCgcpE wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000338). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCgcpE ist in Annex D gezeigt.

Beispiel 7 Konstruktion von Vektoren mit einem Carotinoin-Operon aus Erwinia uredovora kompetent für die in vivo Herstellung von β-Carotin

Die offenen Leserahmen crtY, crtl und crtB des Carotinoid-Operon aus Erwinia uredovora (Accession Nr. gb D90087) von Basenpaar- (bp) Position 2372 bis 6005 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. uredovora DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'-CATTGAGAAGCTTATGTGCACCG-3', 10 pMol des Primers 5'-CTCCGGGGTCGACATGGCGC-3', 40 ng chromosomale DNA, 8 E Taq- DNA Polymerase (Eurogentec), 20 nMol dNTP's, Tag Extender (Stratagene) in einem Gesamt volumen von 100 µl 1× Tag Extender-Puffer (Stratagene).

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 40 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 300 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

1,0 µg des Vektors pBluescript SKII- (Stratagene) und 2,0 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit HindIII und SalI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 40 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScaro34. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScaro34 wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScaro34 wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb D90087).

Der E. uredovora ORF crtE (Accession Nr. gb D90087) von Basenpaar- (bp) Position 175 bis 1148 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. uredovora DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CCGCATCTTTCCAATTGCCG-3', 10 pMol des Primers 5'- ATGCAGCAAGCTTAACTGACGGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

1,5 µg des Vektors pBScaro34 (siehe oben) wird mit EcoRI und HindIII verdaut und 0,6 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit MfeI und HindIII verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 16 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScaro14. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScaro14 wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScaro14 wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb D90087). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScaro14 ist in Annex E gezeigt.

5 µg des Vektors pBScaro14 (siehe oben) wird mit BamHI und SalI verdaut. Die Restriktionsmischung wird gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird auf einem Agarose-gel aufgetrennt und die Fragmente der Größen 2237 und 2341 bp mit dem Gelextraktionskit von Qiagen gereinigt.

3 µg des Vektors pACYC184 (siehe oben) wird mit BamHI und SalI verdaut. Die Restriktionsmischung wird gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird auf einem Agarose-gel aufgetrennt und das Fragment der Größe 3968 bp mit dem Gelextraktionskit von Qiagen gereinigt.

30 ng der gereinigten Vektor-DNA und 25 ng der gereinigten 2237 und 2341 bp Fragmente werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYCcaro14. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1- Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYCcaro14 wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYCcaro14 wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb D90087). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCcaro14 ist in Annex F gezeigt.

Beispiel 8 Enzymatische Darstellung von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat

Es wird eine Reaktionsmischung hergestellt, die 960 mg [U-¹³C₆]Glukose (5,1 mmol), 6,1 g ATP (10.2 mmol), 337 mg Thiaminpyrophosphat, 1,14 g [2,3-¹³C₂]Pyruvat (10,2 mmol), 10 mM MgCl₂ und 5 mM Dithiothreitol in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 enthält. Zu einem Endvolumen von 315 ml werden 410 Einheiten (E) Triosephosphatisomerase (aus Kanninchen Muskel, Typ III-S. E.C. 5.3.1.1, Sigma), 100 E Hexokinase (aus Bäckerhefe, Typ VI, E.C. 2.7.1.1, Sigma), 100 E Phosphoglukoseisomerase (aus Bäckerhefe, Typ III, E.C. 5.3.1.9, Sigma), 100 E Phosphofruktokinase (aus Bacillus stearothermophilus, Typ VII, E.C. 2.7.1.11, Sigma), 50 E Aldolase (aus Kanninchen Muskel, E.C. 4.1.2.13, Sigma) und 12 E rekombinante DXP-Synthase aus B. subtilis zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C über Nacht inkubiert und der pH-Wert wird während der Inkubation auf einem konstanten Wert von 8,0 gehalten. Die Reaktion wird durch ¹³C-NMR Spektroskopie überwacht.

Beispiel 9 Enzymatische Darstellung von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat

Eine Lösung, die 150 mM Tris-Hydrochlorid, 10 mM MgCl₂, 1,0 g [U-¹³C₆]Glukose (5,4 mmol), 0,23 g Dithiothreitol (1.5 mmol), 0,3 g Thiaminpyrophosphat (0,7 mmol), 0,1 g ATP (Dinatriumsalz) (0,2 mmol) und 2,2 g Phosphoenolpyruvat (Kaliumsalz) (11 mmol) enthält, wird durch die Zugabe von 8 M NaOH auf pH 8,0 eingestellt. Zu einem Endvolumen von 300 ml werden 403 E (Units) (2,8 mg) Pyruvatkinase (aus Kanninchenmuskel, E.C. 2.7.1.40), 410 E Triosephosphatisomerase (aus Kanninchen Muskel, Typ III-S. E.C. 5.3.1.1, Sigma), 100 E Hexokinase (aus Bäckerhefe, Typ VI, E.C. 2.7.1.1, Sigma), 100 E Phosphoglukoseisomerase (aus Bäckerhefe, Typ III, E.C. 5.3.1.9, Sigma), 100 E Phosphofruktokinase (aus Bacillus stearothermophilus, Typ VII, E.C. 2.7.1.11, Sigma), 50 E Aldolase (aus Kanninchen Muskel, E.C. 4.1.2.13, Sigma) und 12 U rekombinante DXP-Synthase aus B. subtilis zugegeben. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37°C inkubiert.

Beispiel 10 Enzymatische Darstellung von 1-Deoxy-D-xylulose

Der pH-Wert der Reaktionsmischung aus Beispiel 8 oder 9 wird auf 9,5 eingestellt. Magnesiumchlorid wird bis zu einer Konzentration von 30 mM zugegeben. 50 mg (950 E) alkalische Phosphatase aus Rinder Magenschleimhaut (Sigma, E.C. 3.1.3.1) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 16 h inkubiert. Der Umsatz wird durch ¹³C-NMR Spektroskopie überwacht. Der pH wird auf einen Wert von 7,0 eingestellt und die Lösung wird bei 14.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert. Ausgehend von markierter Glukose (Beispiel 8 oder 9) beträgt die Gesamtausbeute von 1-Deoxy-D-xylulose ungefähr 50%.

Der Überstand oder der lyophylisierte Überstand wird für Einbauexperimente (Beispiele 11 bis 17) verwendet.

Beispiel 11 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBSxylB unter Verwendung von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose

0,2 Liter Luria Bertani (LB) Medium, das 36 mg Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur eines E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBSxylB enthält (vgl. Beispiel 1). Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,6 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG wird 50 ml (0,9 mmol) urgereinigte [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose (pH 7,0) (vgl. Beispiel 9 und 10) zugegeben. 25 ml Aliquots werden im Abstand von 30 min gezogen und 20 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. ¹³C-NMR Spektren des Überstandes werden direkt mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland), ohne weitere Reinigung, aufgenommen. Die NMR Analyse beruht auf publizierten Signalzuordnungen (Wungsintaweekul et al., 2001).

30 min nach der Zugabe von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose kann die Bildung von [3,4,5-¹³C₃]1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat beobachtet werden. Die maximale Ausbeute an [3,4,5-¹³C₃]1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat wird 3-5 h nach Zugabe von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose zum Medium beobachtet. Die ¹³C NMR Signale zeigen eine Mischung aus [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D- xylulose und [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in einem molaren Verhältnis von ungefähr 1 : 9. Die intrazelluläre Konzentration an [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat wird durch quantitative NMR Spektroskopie auf 20 mM geschätzt.

Beispiel 12 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBSxylBdxr unter Verwendung von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose

0,12 Liter Luria Bertani (LB) Medium, das 22 mg Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur eines E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBSxylBdxr enthält (vgl. Beispiel 2). Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,6 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG wird ca. 1 mmol ungereinigte [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose (pH 7.0) (vgl. Beispiel 8 und 10) zugegeben. 25 ml Aliquots werden im Abstand von 1 h gezogen und 20 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des Überstandes werden direkt, ohne weitere Reinigung, mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen.

HMQC und HMQC-TOCSY Experimente zeigen ¹H-¹³C und ¹H-¹H Spinsysteme (Tabelle 1) von [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol und [1,2,2',3,4-¹³C₅]4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in einem molaren Verhältnis von ungefähr 6.6 : 7 : 1. Die intrazelluläre Konzentration von [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat wird durch quantitative NMR-Spektroskopie auf 10 mM geschätzt.

Die NMR Daten, die in Tabelle 1 zusammengefaßt sind, sind identisch mit publizierten NMR- Daten der authentischen Verbindungen (Takahashi et al., 1998; Rohdich et al., 1999).

Tabelle 1

NMR-Daten von ¹³C-markierten Produkten in Zellextrakten von E. coli XL1- pBSxylBdxr nach Fütterung mit [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose

Beispiel 13 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBSxylBdxrispDF unter Verwendung von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose

0,1 Liter Luria Bertani (LB) Medium, das 18 mg Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur eines E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBSxylBdxrispDF enthält (vgl. Beispiel 4). Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG wird ca. 1,0 mmol ungereinigte [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose (vgl. Beispiel 9 und 10) zugegeben. Nach 3 h werden die Zellen geerntet und 20 min bei 5000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 1,5 ml 20 mM NaF in D₂O suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 15 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des Überstandes werden direkt, ohne weitere Reinigung, mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen.

HMOC und HMQC-TOCSY Experimente zeigen ¹H-¹³C und ¹H-¹H Spinsysteme von [1,3,4- ¹³C₃]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, [1,3,4-¹³C₃]2C-Methyl-D-erythritol und [1,3,4-¹³C₃]4- Diphosphocytidyl-2C-Methyl-D-erythritol (Tabelle 1). Die molaren Verhältnisse von [1,3,4- ¹³C₃]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, [1,3,4-¹³C₃]2C-Methyl-D-erythritol und [1,3,4-¹³C₃]4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol sind 1 : 0.6 : 0.9.

Dieses Ergebnis zeigt, dass die intrazelluläre Menge an CTP, die für die Synthese von 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol benötigt wird, limitierend ist. Deshalb wurde ein modifiziertes Fermentationsprotokoll entwickelt (vgl. Beispiel 14).

Beispiel 14 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBSxylBdxrispDF unter Verwendung von [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose

0,1 Liter Luria Bertani (LB) Medium, das 18 mg Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur eines E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBSxylBdxrispDF enthält (vgl. Beispiel 4). Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte von 0,5 (600 nm) wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG, werden 10 mg (0.041 mmol) Cytidirr und 5 ml 1 M NaKHPO₄, pH 7,2, und ca. 1,0 mmol ungereinigte [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose (vgl. Beispiele 9 und 10) zugegeben. Nach 3 h werden die Zellen geerntet und 20 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0.9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des Überstandes werden direkt, ohne weitere Reinigung, mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer aufgenommen.

HMQC und HMQC-TOCSY Experimente zeigen ¹H-¹³C und ¹H-¹H Spinsysteme (Tabelle 1) von [1,3,4-¹³C₃]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, (1,3,4- 13C3J2C-Methyl-D-erythritol und [1,3,4- ¹³C₃J4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in einem molaren Verhältnis von ungefähr 1 : 3.4 : 4.2. Die relative Menge an [1,3,4-¹³C₃]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol ist um einen Faktor 2 im Vergleich zur relativen Menge in Beispiel 13 erhöht. Die intrazelluläre Konzentration an [1,3,4-¹³C₃]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol wird durch quantitative NMR Spektroskopie auf 10 mM geschätzt. Die relativ hohe Menge an 2C-Methyl-D-erythritol zeigt, dass unspezifische Phosphatasen intermediär gebildetes 2C-Methyl-D-erythritol-4- phosphat in 2C-Methyl-D-erythritol umwandeln. Deshalb wurde ein verändertes Fermentationsprotokoll entwickelt, um die Zellen mit einer ausreichenden Menge an organischen Phosphaten zu versorgen und um die Aktivität von Phosphatasen zu unterdrücken (vgl. Beispiele 15 bis 17).

Beispiel 15 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBScyclo unter Verwendung von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose

0,2 Liter Luria Bertani (LB) Medium, das 36 mg Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur eines E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBScyclo enthält (vgl. Beispiel 5). Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte von 1,3 (600 nm) wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG, werden 30 mg (0,12 mmol) Cytidin, 300 mg (0,95 mmol) DL-α-Glyzerin- 3-phosphat und 10 ml 1 M NaKHPO₄, pH 7,2 zugegeben. Nach 30 min wird ca. 1 mmol [U- ¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose (vgl. Beispiel 8 und 10) zugegeben. In Zeitintervallen von 1 h werden 25 ml Aliquots entnommen und 20 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des zellfreien Extraktes werden direkt, ohne weitere Reinigung, mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen.

¹³C-NMR Spektren sowie HMQC und HMQC-TOCSY Spektren belegen [U-¹³C₅]2C-Methyl-D- erythritol-2,4-zyklodiphosphat (Herz et al., 2000) als einziges Produkt. Die Bildung von [U- ¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat kann 30 min nach Zugabe von [U-¹³C₅]1- Deoxy-D-xylulose beobachtet werden, während die maximale Ausbeute 5 h nach Zugabe von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose beobachtet wird. Die intrazelluläre Konzentration an [U-¹³C₅]2C- Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat wird durch quantitative NMR Spektroskopie auf 20 mM geschätzt. Die Bildung von sämtlichen anderen isotop-markierten Produkten, wie [U-¹³C₅]2C- Methyl-D-erythritol wird komplett unterdrückt.

Beispiel 16

Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBScyclo-pACYCgcpE unter Verwendung von [2-¹⁴C]- und [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose

0,2 Liter Terrific-Broth (TB) Medium, das 36 mg Ampicillin und 2,5 mg Chloramphenicol enthält, wird mit dem E. Coli Stamm XL1-Blue angeimpft, der die Plasmide pBScyclo und pACYCgcpE enthält (vgl. Beispiele 5 und 6). Die Zellen werden über Nacht in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte von 4,8-5,0 (600 nm) wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion mit IPTG, werden 30 mg (0,1 mmol) Cytidin, 300 mg (0,94 mmol) DL-α-Glyzerin-3-phosphat und 10 ml 1 M NaKHPO₄, pH 7,2 zugegeben. Nach 30 min wird eine Mischung von 2,6 µmol [2-¹⁴C]1-Deoxy-D-xylulose (15 µCi µmol^-1) (Wungsintaweekul et al., 2001) und 1 ml ungereinigte [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose (0.02 mmol) (vgl. Beispiel 8 und 10) zugegeben. Nach 1,5 h werden die Zellen geerntet und 10 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in einer Mischung von 20 mM NaF (2 ml) und Methanol (2 ml) suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 15 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. Die Radioaktivität im Überstand wird durch einen Szintillationszähler gemessen (Beckmann, LS 7800). 10% der Radioaktivität, die zu Beginn als ¹⁴C markierte 1-Deoxy-D-xylulose zugegeben wurde, wird im Überstand detektiert. Aliquots werden, wie in Beispiel 19 beschrieben, durch DC und HPLC analysiert und die Produkte, wie in Beispiel 20 beschrieben, gereinigt.

Auf Grund dieser Daten werden 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat und 2C-Methyl-D- erythritol-2,4-zyklodiphosphat als Produkte in einem molaren Verhältnis von 7 : 3 identifiziert. (vgl. auch Beispiele 17 und 18).

Beispiel 17 Einbauexperiment mit rekombinanten Escherichia Coli XL1-pBScyclo-pACYCgcpE unter Verwendung von [U-¹³C₅]- oder [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose

0,2 Liter Terrific-Broth (TB) Medium, das 36 mg Ampicillin und 2.5 mg Chloramphenicol enthält, wird mit dem E. Coli Stamm XL1-Blue angeimpft, der die Plasmide pBScyclo und pACYCgcpE enthält. Die Zellen werden über Nacht in einer Schüttelkultur bei 37°C angezogen. Bei einer optischen Dichte von 4,8-5,0 (600 nm) werden 30 mg (0.1 mmol) Cytidin, 300 mg (0,93 mmol) DL-α-Glyzerin-3-phosphat und 10 ml 1 M NaHKPO₄, pH 7,2 zugegeben. Nach 30 Minuten werden 3 ml einer Lösung von ungereinigter [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose oder [U-¹³C₅]1- Deoxy-D-xylulose (0,05 mmol) (vgl. Beispiele 8 bis 10) zugegeben. In Zeitintervallen von 1 h werden 25 ml Aliquots entnommen und 20 min bei 5.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0,9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O oder in einer 700 µl einer Mischung von Methanol und D₂O (6 : 4; v/v), welche 10 mM NaF enthält, suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15.000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des zellfreien Extraktes werden direkt mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Um eine Zersetzung während der Aufarbeitung zu vermeiden, werden die Strukturen der Produkte durch NMR-Spektroskopie ohne weitere Reinigung bestimmt (vgl. Beispiel 18).

Beispiel 18 Strukturbestimmung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

Das ¹H-entkoppelte ¹³C-NMR Spektrum mit [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose als Startmaterial zeigt 5 ¹³C-¹³C gekoppelte Signale, die zu 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat gehören (Herz et al., 2000) und 5 ¹³C-¹³C gekoppelte Signale bei 14.7, 64.5, 68.6, 122.7 und 139.5 ppm (Tabelle 1), die zu einem unbekannten Metabolit gehören. Die chemischen Verschiebungen des unbekannten Metaboliten legen ein Doppelbindungsmotiv nahe (Signale bei 122.7 und 139.5 ppm), sowie eine Methylgruppe (Signal bei 14.7 ppm) und zwei Kohlenstoffatome (Signale bei 64.5 und 68.6 ppm), die mit OR verbunden sind (R = unbekannt). Die drei Signale, die Kohlenstoffatomen mit sp³-Hybridisierung zugerechnet werden (14.7, 64.5 und 68.5 ppm) zeigen ¹³C-¹³C-Kopplung mit jeweils einem benachbarten ¹³C-Atom mit Kopplungskonstanten zwischen 40 und 50 Hz (Tabelle 2). Das Signal bei 122.7 ppm zeigt ¹³C Kopplungen mit zwei benachbarten ¹³C Atomen (Kopplungskonstanten, 74 und 50 Hz), während das Signal bei 141.5 ppm ¹³C Kopplungen mit drei benachbarten ¹³C Atomen zeigt (Kopplungskonstanten, 74, 43 und 43 Hz). In Verbindung mit der chemischen Verschiebungstopologie belegt diese Kopplungssignatur ein 2-Methyl-2-butenyl-Skelett.

HMQC und HMQC-TOCSY Experimente zeigen die ¹H NMR chemischen Verschiebungen auf (Tabelle 2), sowie ¹³C-¹H und ¹H-¹H Spinsysteme (Tabelle 3). Im Einzelnen korreliert das ¹³C NMR Signal bei 122.7 ppm mit einem ¹H NMR Signal bei 5.6 ppm, welches im typischen chemischen Verschiebungsbereich für H-Atome liegt, die an CC-Doppelbindungen gebunden sind, während das Signal bei 139.5 ppm keine ¹³C-¹H Korrelationen ergibt. Die Signale bei 64.5 und 68.6 ppm zeigen jeweils ¹³C-¹H Korrelationen mit ¹H Signalen bei 4.5 und 3.9 ppm. Das Methylsignal bei 14.7 ppm korreliert mit einem Protonensignal bei 1.5 ppm. Im Zusammenhang mit den ¹³C-¹³C Kopplungsmustern (Tabelle 2), sowie mit den ¹H-¹³C Weitbereichskorrelationen (HMBC Experiment, Tabelle 3), legen diese Daten ein 1,4-Dihydroxy-2-methyl-2-butenyl- System fest.

Mit [3,4,5-¹³C₃]1-Deoxy-D-xylulose als gefüttertes Startmaterial werden drei Signale bei 64.5, 68,6 und 122.7 ppm beobachtet, die den Atomen 4, 1 und 3 des neuen Produkts zugeteilt werden. Es kann geschlossen werden, dass die Kohlenstoffatome 1, 3 und 4 des neuen Produkts biogenetisch äquivalent sind mit den Kohlenstoffatomen 3, 4 und 5 von [3,4,5-¹³C₃]1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat.

Die ¹³C NMR Signale für C-4 und C-3 bei 64.5 und 122.7 ppm zeigen ¹³C-Kopplungen von 5.5 bzw. 8.0 Hz. Diese Kopplungen zeigen die Anwesenheit eines Phosphats oder einer Pyrophosphatgruppe an Position 4 des 2-Methyl-2-butenylskeletts an. Im Einklang mit dieser Beobachtung zeigt das ¹H-entkoppelte ³¹P NMR Spektrum des Produkts ein Dublett bei -9.2 (³¹P-³¹P Kopplungskonstante, 20.9 Hz) und ein Doppel-Doppel-Dublett bei -10.6 ppm (³¹P-¹³C Kopplungskonstanten, 5.8 und 7.4 Hz, ³¹P- ³¹P Kopplungskonstanten, 20.9 Hz). Ohne ¹H- Entkopplung wird das ³¹P Signal bei -10.6 ppm verbreitert, während das Signal bei -9.2 ppm nicht beeinflusst wird durch ¹H-Kopplung. Sowohl die chemischen Verschiebungen als auch das beobachtete Kopplungsmuster bestätigen die Anwesenheit einer freien Diphosphat-Einheit an Position 4. Zusammenfassend belegen diese Daten die Struktur als 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat.

Tabelle 2

NMR-Daten von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

^areferenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat.
^breferenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat.
^creferenziert auf externe 85% Orthophosphorsäure.
^dbeobachtet mit [1,3,4-¹³C₃]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat
^ebeobachtet mit [U-¹³C₅]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

Tabelle 3

Korrelationsmuster von [1,3,4-¹³C₃]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat und [U- ¹³C₅]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

^abeobachtet mit [1,3,4-¹³C₃]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat
^bbeobachtet mit [U-¹³C₅]1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

Beispiel 19 Detektion von phosphorylierten Metaboliten aus dem Mevalonat-unabhängigen Stoffwechselweg Methode A) durch eine Dünnschicht-chromatographische Methode (DC)

Aliquote (10 µl) aus zellfreien Extrakten von rekombinanten Zellen, die wie oben beschrieben hergestellt werden (siehe Beispiel 16), werden auf eine Polygram SIL NH-R Dünnschichtplatte aufgetragen (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland). Die DC Platte wird entwickelt mit n- Propanol : Ethylacetat : Wasser, 6 : 1 : 3 (v/v/v) als Laufmittelsystem. Die Laufzeit beträgt ungefähr 4 Stunden. Das Radiochromatogramm wird aufgenommen und analysiert durch einen Phosphorimager (Storm 860, Molecular Dynamics, USA). Die Rf-Werte der untersuchten Verbindungen sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Rf-Werte von Precursor und Intermediaten des Mevalonat-unabhängigen Terpenoidbiosynthesewegs

Methode B) durch eine HPLC-Methode

Aliquote (100 µl) aus zellfreien Extrakten von rekombinanten Zellen, die wie oben beschrieben hergestellt werden (siehe Beispiel 16), werden durch HPLC analysiert unter Verwendung einer Multospher 120 RP 18-AQ-5 Säule (4.6 × 250 mm, Korngröße 5 µm, CS-Chromatographic Service GmbH, Langerwehe, Deutschland), die 15 Minuten lang mit 10 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBAS), pH 6.0 bei einer Flußrate von 0.75 ml min^-1 äquilibriert wurde. Nach Injektion der Probe wird die Säule 20 Minuten lang mit 10 mM TBAS entwickelt, anschließend 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten von 0-42% (v/v) Methanol in 10 mM TBAS. Der Durchfluß wird analysiert durch einen Durchflussradiodetektor (Beta-RAM, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland). Die Retentionsvolumina der untersuchten Verbindungen sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Retentionsvolumina von Precursor und Intermediaten des Mevalonat-unabhängigen Terpenoidbiosynthesewegs

Beispiel 20 Reinigung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

Der zellfreie Rohextrakt, der aus rekombinanten Escherichia coli XL1-pBScyclo-pACYCgcpE Zellen nach Fütterung von [2-¹⁴C]- und [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose erhalten wird (siehe Beispiel 16), wird gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in 600 µl Wasser gelöst und 10 Minuten bei 14.000 Upm zentrifugiert. Jeweils 90 µl werden auf eine Säule mit Nucleosil 10 SB (4.6 × 250 mm, Macherey & Nagel, Düren, Deutschland) aufgetragen. Die Säule wird entwickelt mit einem linearen Gradienten von 0.1-0.25 M Ammoniumformiat in 70 ml bei einer Flussrate von 2 ml/Minute. Die Retentionsvolumina von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und 1- Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat betragen 25 bzw. 44 ml. Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet.

Die NMR-Daten von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat sind identisch mit den Daten, die in Beispiel 18, Tabelle 2 gezeigt werden.

Beispiel 21 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr, ispD, ispE, ispF und ispG aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase, DXP- Reduktoisomerase, CDP-ME-Synthase, CDP-ME-Kinase, cMEPP-Synthase und 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat-Synthase

Der E. coli ORF ispG (Accession Nr. gb AE000338) von Basenpaar- (bp) Position 372 bis 1204 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GCGGGAGACCGCGGGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTCG-3', 10 pMol des Primers 5-CGCTTCCCAGCGGCCGCTTATTTTTCAACCTGCTGAACG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

1,4 µg des Vektors pBScyclo (Beispiel 5) und 0,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SacII und NotI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 18 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScyclogcpE. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScyclogcpE wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScyclogcpE wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000338). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstukts pBScyclogcpE ist in Annex H gezeigt.

Beispiel 22 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG und lytB aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase, DXP- Reduktoisomerase, CDP-ME-Synthase, CDP-ME-Kinase, cMEPP-Synthase, 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat-Synthase und LytB

Der E. coli ORF lytB (Accession Nr. gb AE005179) von Basenpaar- (bp) Position 7504 bis 8454 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- AAATCGGAGCTCGAGGAGAAATTAACCATGCAGATCCTGTTGGCC-3', 10 pMol des Primers 5'-GCTGCTCCGCGGTTAATCGACTTCACGAATATCG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

1,3 µg des Vektors pBScyclogcpE (Beispiel 21) und 0,7 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SacI und SacII verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 16 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScyclogcpElytB. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScyclogcpElytB wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScyclogcpElytB wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE005179).

Beispiel 23 Einbauexperiment mit rekombinantem Escherichia coli XL1-pBScyclogcpE mit [U-¹³C₅]1- Desoxy-D-xylulose

0,1 Liter Terrific Broth (TB) Medium, das 18 mg Ampicillin enthält, wird mit einem E. Coli Stammes XL1-Blue angeimpft, der das Plasmid pBScyclogcpE enthält. Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C über Nacht angezogen. Bei einer optischen Dichte von 4,8-5,0 (600 nm), werden 30 mg (0,1 mmol) Cytidin zugegeben. Eine Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 ml bestehend aus 1,2 g Lithiumlactat (12,5 mmol), 6 ml ungereinigter [U-¹³C₅]1-Desoxy- D-xylulose (0,05 mmol) (vgl. Beispiele 8, 9 und 10) in 0,1 M Trishydrochlorid (pH = 7,5) wird kontinuierlich über 2 h zugegeben. In Zeitintervallen von 1 h werden 25 ml Aliquots entnommen und 20 min bei 5000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0.9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl 20 mM NaF in D₂O oder in einer Mischung von Methanol und D₂O (6 : 4, v/v), die 10 mM NaF enthält, suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 Sekunden mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 90% Ausgangsleistung, Kontrolleinstellung 4 eingestellt ist, beschallt. Die Suspension wird bei 15000 Upm 15 min zentrifugiert. NMR Spektren des zellfreien Extraktes werden direkt mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland), ohne weitere Reinigung, aufgenommen. Um einen Zerfall während der Aufarbeitung zu vermeiden, werden die Strukturen der Produkte durch NMR-Spektroskopie, ohne weitere Aufreinigung, bestimmt.

Die relative Menge von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat zu 2C-Methyl-D-erythritol- 2,4-zyklodiphosphat konnte durch Zugabe von Lithiumlactat zum Medium um ungefähr einen Faktor 2-3 gesteigert werden.

Beispiel 24 Darstellung von (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat Triammoniumsalz (8)

Allgemein. Chemikalien wurden von Acros Organics (Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland), Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland), MERCK (Darmstadt, Deutschland) erhalten und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Lösungsmittel wurden destilliert und/oder getrocknet verwendet. Chromatographie wurde mit Kieselgel 60 (230-400 mesh, Fluka Riedel de Haen, Taufkirchen, Deutschland), DOWEX 50 WX8 (200-400 mesh, SERVA, Heidelberg, Deutschland) und Zellulose (Avicel, Zellulose Mikrokristallin, MERCK, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. DC wurde mit Kieselgel 60 F₂₅₄ Plastikfolien (MERCK) oder Zellulose F Plastikfolien (MERCK) durchgeführt, die Detektion erfolgte durch eine Anisaldehyd Lösung (Anisaldehyd : H₂SO₄ : HAc 0.5 : 1 : 50 v/v/v). NMR Spektren wurden mit einem Bruker AMX 400, DRX 500 und AC 250 Spektrometer bei Raumtemperatur aufgenommen.

Azetonyltetrahydropyranylether (12) (Hagiwara et al., 1984)

Eine Mischung aus 339 mg (1,35 mmol) Pyridinium-toluol-4-sulfonat, 9,35 ml (10,0 g, 0,135 mol) Hydroxyazeton und 24,7 ml (22,7 g, 0,270 mol) 3,4-Dihydro-2H pyran wird 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Zurückbleibendes 3,4-Dihydro-2H pyran wird unter reduziertem Druck entfernt. Die Rohmischung wird durch FC auf Kieselgel (Hexan/Aceton 4 : 1, 6,5 × 20 cm) gereinigt, wodurch 18,7 g (0,118 mol, 88%) einer farblosen Flüssigkeit erhalten werden.
¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 4,62 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 17,3 Hz, 1H), 4,09 (d, J = 17,3 Hz, 1H), 3,83-3,79 (m, 1H), 3,51-3,47 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 1,87-1,49 (m, 6H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 206,7, 98,7, 72,3, 62,3, 30,2, 26,5, 25,2, 19,2; MS (Cl, Isobutan) m/z 159 [M + 1]⁺.

(E,Z)-Ethyl-2-methyl-1-terahydropyranyloxy-but-2-enoat (13) (Watanabe et al., 1996)

33,0 g (94,8 mmol) (Ethoxycarbonylmethylen)-triphenylphosphoran werden in 500 ml trockenem Toluol unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gelöst. Danach werden 10,0 g (63,2 mmol) Azetonyltetrahydropyranylether 12 zugegeben und die Mischung wird unter Rückfluß erhitzt. Nach 39 h bei dieser Temperatur wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck eingeengt, wobei ein orangefarbenes Öl erhalten wird. Der Hauptteil von Triphenylphosphinoxid wird durch Zugabe von 100 ml Hexan/Aceton 9 : 1 gefällt. Nach Filtration wird das Filtrat konzentriert und es werden weitere 100 ml Hexan/Aceton 9 : 1 zugegeben. Der Feststoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel entfernt, wobei 18 g eines orangefarbenes Öls erhalten wird, welches durch FC auf Kieselgel (Hexan/Aceton 9 : 1, 6,5 × 28 cm) gereinigt wird, wobei 12,9 g (56,5 mmol, 89%) einer Mischung aus (E)-13/(Z)-13 = 5 : 1 erhalten wird.
(E)-(13). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,96 (q, J = 1,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 15,5 Hz, 1,3 Hz, 1H), 4,14 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,93 (dd, J = 15,6, 1,3 Hz, 1H), 3,84-3,79 (m, 1H), 3,52-3,48 (m, 1H), 2,08 (d, J = 1,4 Hz, 3H), 1,88-1,50 (m, 6H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 166,8, 154,7, 114,5, 98,0, 70,6, 62,0, 59,7, 30,3, 25,3, 19,1, 15,9, 14,3; MS (Cl, Isobutan) m/z 229 [M + 1]⁺.
(Z)-(13). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,71 (q, J = 1,4 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 15,5 Hz, 1,3 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,93 (dd, J = 15,6, 1,3 Hz, 1H), 3,84- 3,79 (m, 1H), 3,52-3,48 (m, 1H), 1,97 (d, J = 1,4 Hz, 3H), 1,88-1,50 (m, 6H), 1,24 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 165,9, 156,8, 116,9, 98,7, 66,5, 62,3, 59,8, 30,6, 25,3, 21,9, 19,5, 14,3; MS (Cl, Isobutan) m/z 229 [M + 1]⁺.

(E,Z)-2-Methyl-1-tetrahydropyranyloxy-but-2-en-4-ol (14) (Watanabe et al., 1996)

Eine Lösung des Esters 13 (8,73 g, 38,2 mmol) in 100 ml trockenem CH₂Cl2 wird auf -78°C gekühlt. Dann wird langsam 91,8 ml (91,8 mmol) 1,0 M DIBAH in Hexan unter einer Stickstoff Atmosphäre zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 3 h bei -78°C gerührt, bevor die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml 1 M NaOH abgebrochen wird. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter reduzierten Druck entfernt. Der erhaltene gummiartige Rückstand wird größtenteils durch Zugabe von zweimal 100 ml MeOH gelöst. Die erhaltene Mischung wird durch eine SiO₂-Säule passiert, vom Lösungsmittel befreit und auf eine SiO₂/Na₂SO₄-Säule geladen, die mit 1400 ml MeOH gespült wird. Durch Einengen des Lösungsmittels erhält man 9,5 g einer farblosen Flüssigkeit, die durch FC auf Kieselgel (Hexan/Aceton 1 : 3, 6.5 × 16 cm) gereinigt wird, wobei 6,98 g (37,4 mmol, 98%) einer farblosen Flüssigkeit (E)-14/(Z)-14 6 : 1 erhalten wird.
(E)-(14). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,68 (tq, J = 6,6, 1,3 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,12 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,87-3,82 (m, 1H), 3,85 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 3,52-3,48 (m, 1H), 1,86-1,48 (m, 6H), 1,69 (s, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 135,7, 125,4, 97,8, 71,9, 62,1, 59,1, 30,5, 25,4, 19,4, 14,1; MS (Cl, Isobutan) m/z 169 [M - H₂O + 1]⁺.
(Z)-(14). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,64 (tq, J = 6,6, 1,3 Hz, 1H), 4,63 (t, J = 3,3 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,15 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 3,87-3,82 (m, 1H), 3,83 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 3,52-3,48 (m, 1H), 1,86-1,48 (m, 6H), 1,79 (s, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 136,2, 128,6, 96,6, 65,1, 61,8, 58,1, 30,3, 25,3, 21,9, 19,0; MS (Cl, Isobutan) m/z 169 (M - H₂O + 1]⁺.

(E,Z)-4-Chlor-2-methyl-1-tetrahydropyranyloxy-but-2-en (15) (Hwang et al., 1984)

Zu einer Lösung des Alkohols 14 (1,00 g, 5,37 mmol) in 10 ml trockenem CH₂Cl₂ werden 918 mg (7,52 mmol) DMAP in 10 ml trockenem CH₂Cl₂ und 1,23 g (6,44 mmol) p-TsCl in 10 ml trockenem CH₂Cl₂ gegeben. Die erhaltene Lösung wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wird der Rückstand durch FC auf Kieselgel (CH₂Cl₂, 5 × 20 cm) gereinigt, wobei 693 mg (3,39 mmol, 63%) einer farblosen Flüssigkeit (E)-15/(Z)-15 = 6 : 1 erhalten wird.
(E)-(15). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,77 (tq, J = 8,0, 1,5 Hz, 1H), 4,64 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,92 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 3,90-3,86 (m, 1H), 3,59-3,52 (m, 1H), 1,92-1,52 (m, 6H), 1,77 (s, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 138,6, 121,7, 97,8, 71,3, 62,1, 40,2, 30,5, 25,4, 19,3, 13,9; MS (Cl, Isobutan) m/z 205 [M + 1]⁺.
(Z)-(15). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5,65 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,92 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 3,90-3,86 (m, 1H), 3,59-3,52 (m, 1H), 1,92-1,52 (m, 6H), 1,86 (s, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 126 MHz) δ 138,3, 124,6, 97,5, 64,7, 62,2, 40,1, 30,5, 25,4, 21,8, 19,4; MS (Cl, Isobutan) m/z 205 [M + 1]⁺.

(E,Z)-2-Methyl-1-tetrahydropyranyloxy-but-2-enyldiphosphat Triammoniumsalz (16) (Davisson et al., 1986)

Zu einer Lösung des Chlorids 15 (260 mg, 1,27 mmol) in 1,3 ml MeCN wird eine Lösung von 1,38 g (1,52 mmol) Tris(tetra-n-butylammonium)-hydrogenpyrophosphat in 3,0 ml MeCN langsam bei Raumtemperatur zugegeben, wodurch eine orange-rote Lösung erhalten wird. Die Reaktion wird durch ¹H-NMR verfolgt, wobei der Vorteil des Hochfeld-Shiftes des Multipletts von H-3 ausgenützt wird. Nach 2 h ist die Reaktion beendet und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Das orange Öl wird in 2,5 ml H₂O gelöst und durch eine DOWEX 50 WX8 (2,5 × 3 cm) Kationenaustauschersäule (NH₄ ⁺-Form) passiert, die mit zwei Säulenvolumen (40 ml) 25 mM NH₄HCO₃ äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 60 ml 25 mM NH₄HCO₃ eluiert. Die erhaltene Lösung wird lyophylisiert, in 5 ml Isopropanol/100 mM NH₄HCO₃ 1 : 1 gelöst und auf eine Zellulosesäule (2 × 18 cm) geladen, die mit Isopropanol/100 mM NH₄HCO₃ 1 : 1 eluiert wird. Der Durchlauf wird lyophylisiert, wodurch 495 mg (1,25 mmol, 98%) (E)-16/(Z)-16 = 6 : 1 als ein weißer Festkörper erhalten wird.
(E)-(16). ¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δ 5,52 (tq, J = 6,8 Hz, 1H), 4,65 (s, 1H), 4,34 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,98 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 3,84 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 3,74-3,70 (m, 1H), 3,42-3,38 (m, 1H), 1,61-1,57 (m, 2H), 1,54 (s, 3H), 1,40-1,32 (m, 4H); ¹³C NMR (D₂O, 126 MHz) δ 136,4, 123,9 (dd, J = 8,0, 2,3 Hz), 98,5, 72,5, 63,2, 62,2 (d, J = 5,3 Hz), 29,9, 24,5, 19,0, 13,4; ³¹P NMR (D₂O, 101 MHz) δ -5,62 (d, J = 20,9 Hz), -7,57 (d, J = 20,8 Hz).
(Z)-(16). ¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δ 5,52 (t, J = 6,8, 1H), 4,65 (s, 1H), 4,31 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 3,98 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 3,84 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 3,74-3,70 (m, 1H), 3,42-3,38 (m, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,61-1,57 (m, 2H), 1,40-1,32 (m, 4H); ¹³C NMR (D₂O, 126 MHz) δ 136,3, 125,8 (d, J = 8,6 Hz), 98,6, 72,5, 63,2, 61,8 (d, J = 5,1 Hz), 29,9, 24,5, 20,8, 19,0; ³¹P NMR (D₂O, 101 MHz) δ -5,69 (d, J = 20,8 Hz), -7,68 (d, J = 20,8 Hz).

(E,Z)-1-Hydroxy-2-methyl-but-2-enyldiphosphat Triammoniumsalz (8) (Davisson et al., 1986)

268 mg (0,675 mmol) des geschützten Pyrophosphates 16 werden in 2,0 ml D₂O gelöst und der pH wird auf 1 durch Zugabe von 40 µl 37% DCl in D₂O eingestellt. Nach 1 min bei diesem pH wird die Lösung durch Zugabe von 40 µl 40% NaOD in D₂O neutralisiert und ein ¹H NMR wird gemessen, das 50% Entschützung zeigt. Die Prozedur wird solange wiederholt, bis die Entschützung beendet ist und nur geringe Mengen an Zersetzungsprodukt gebildet wurden, was innerhalb 7 min bei pH 1 erreicht wird. Die Reinigung wird durchgeführt, indem die neutrale Lösung, die durch Zugabe von 2 ml Isopropanol/100 mM NH₄HCO₃ 1 : 1 verdünnt wurde, auf eine Zellulose-Säule (Isopropanol/100 mM NH₄HCO₃ 1 : 1, 2 × 10,5 cm) aufgetragen wird, wodurch 193 mg (0,616 mmol, 91%) eines weißen Festkörpers von (E)-8/(Z)-8 = 7 : 1 erhalten wird.
(E)-(8). ¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δ 5,51 (tq, J = 6,8, 1,2 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,90 (s, 2H), 1,59 (s, 3H); ¹³C NMR (D₂O, 126 MHz) δ139,8, 120,6 (d, J = 7,7 Hz), 66,5, 62,4 (d, J = 5,3 Hz), 13,2; ³¹P NMR (D₂O, 101 MHz) δ -4,48 (d, J = 20,8 Hz), -7,06 (d, J = 20,8 Hz).
(Z)-(8). ¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δ 5,49 (tm, J = 6,8 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 4,03 (s, 2H), 1,70 (s, 3H); ¹³C NMR (D₂O, 126 MHz) δ139,8, 123,5 (d, J = 7,7 Hz), 61,7 (d, J = 5,1 Hz), 59,9, 20,6; ³¹P NMR (D₂O, 101 MHz) δ -4,48 (d, J = 20,8 Hz), -7,06 (d, J = 20,8 Hz).
Reagenzien und Bedingungen (Schritt (a) bis (f) in Abb. 1): (a) DHP, PPTS, 25°C (2,5 h); (b) Ph₃PCHCO₂Et, Toluol, Rückfluß (39 h); (c) (1) DIBAH, CH₂Cl₂, -78°C (3 h), (2) 1 M NaOH/H₂O; (d) p-TsCl, DMAP, CH₂Cl₂, 25°C (1 h); (e) ((CH₃CH₂CH₂CH₂)₄N)₃HP₂O₇, MeCN, 25°C (2 h); (f), HCl/H₂O pH 1, 25°C (7 min).

Beispiel 25 Identifizierung von (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat

Die Struktur des GcpE Produktes wird ferner durch Vergleich mit den chemischen Verschiebungen einer synthetischen Probe von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat analysiert.

Dafür wird [2-¹⁴C]1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat (0,36 µCi) zu einem Zellextrakt gegeben, der ausgehend von gentechnisch veränderten Escherichia coli Zellen ausgestattet mit artifiziellen Genkonstrukten für die Überexpression der xylB, ispC, ispD, ispE, ispF und gcpE erhalten wurde, die mit [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose gefüttert worden sind (siehe Beispiel 16). Der Überstand des Zellextraktes wird durch HPLC (Nucleosil 5 SB, 7,5 × 250 mm, die mit einem Gradienten von 100 mM bis 250 mM NH₄HCOO entwickelt wurde, Flußrate 2 ml/min, 35 min) gereinigt. Das Produkt eluiert nach 23 min und wird gesammelt. Nach Lyophylisation wird der Rückstand in D₂O (pH 6) gelöst und zur ¹H NMR Analyse übergeben (Abb. 3-A).

Danach werden 40 µl einer synthetisch hergestellten (E,Z)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat (E/Z = 7 : 1) (D₂O, pH 7) Lösung zu der NMR Probe gegeben und wiederum durch ¹H NMR Spektroskopie (Abb. 3-B) untersucht. Einerseits sind, wie in Abb. 3-B dargestellt, solche Signale erhöht, die zu (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl gehören, wodurch der Beweis erbracht wird, daß die biologisch produzierte Struktur mit der synthetisch produzierten, d. h. dem (E)-Isomer identisch ist. Andererseits erhöht sich das in geringerer Menge vorliegende (Z)-Isomer ohne jegliche Korrelation zu den Signalen des biologisch erzeugten Produkts. Abb. 3-C zeigt die gleichen Effekte nach Zugabe weiterer 40 µl der synthetisch erzeugten Lösung von (E,Z)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat.

Beispiel 26 Einbau von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat in die lipidlösliche Fraktion von Capsicum annuum Chromoplasten

Chromoplasten wurden nach einer leicht modifizierten Methode, die von Camara (Camara, 1985; Camara, 1993) beschrieben wurde, isoliert. Perikarp aus roter Paprika (650 g) werden bei 4°C in 600 ml 50 mM Hepes, pH 8,0, das 1 mM DTE, 1 mM EDTA und 0,4 M Sucrose enthält (Puffer A), homogenisiert. Die Suspension wird durch vier Schichten eines Nylonnetzes (50 µm) filtriert und zentrifugiert (10 min, 4,500 Upm, GSA Rotor), wodurch ein Pellet von ungereinigten Chromoplasten erhalten wird, das in 200 ml Puffer A homogenisiert wird. Die Suspension wird zentrifugiert (10 min, 4,500 Upm, GSA Rotor). Das Pellet wird homogenisiert und in 3 ml 50 mM Hepes, pH 7,6, der 1 mM DTE enthält, resuspendiert. Die Suspension wird durch eine Lage eines Nylonnetzes (50 µm) filtriert.

Die Reaktionsmischung enthält 100 mM Hepes, pH 7,6, 2 mM MnCl₂, 10 mM MgCl₂, 5 mM NaF, 2 mM NADP⁺, 1 mM NADPH, 6 mM ATP, 20 µM FAD und 2 mg Chromoplasten. 8,8 nmol [2-¹⁴C]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat, [2-¹⁴C]1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4- diphosphat oder [2-¹⁴C]Isopentenyldiphosphat (in spezifischen Konzentrationen von je 15.8 µCi/µmol) werden zugegeben und die Mischungen bei 30°C über Nacht inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion mit Methylenchlorid beendet. Die organische Phase wird unter einem Stickstoffstrom konzentriert. Aliquots werden auf Kieselgelplatten (Polygram SIL-G, UV254, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) aufgetragen. Die Platten werden mit Hexan : Ether = 6 : 1 (System I) und/oder Hexan : Toluol = 9 : 1 (System II) entwickelt. Die Chromatogramme werden mit einem Phosphor Imager (Storm 860, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) ausgewertet. Die R_f-Werte von Geranylgeraniol und der Carotinfraktion mit System I sind 0,35 und 0,9. Die R_f-Werte von β-Carotin, Phytoen und Phytofluen mit System II sind 0,65, 0,6 und 0,55.

Die Entwicklung der Chromatogramme zeigt, daß die Radioaktivität von 1-Hydroxy-2-methyl-2- (E)-butenyl-diphosphat effizient in die Geranylgeraniol-, β-Carotin-, Phytoen- und Phytofluenfraktionen von C. annuum Chromoplasten verteilt werden kann, wodurch 1-Hydroxy- 2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat als ein echtes Intermediat des Mevalonat-unabhängigen Weges stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und stromauf Isopentenyldiphosphat bewiesen wird.

Beispiel 27 Konstruktion eines Vektors mit den ispG (gcpE) und ispH (lytB) Genen von Escherichia coli kompetent für deren Transkription und Expression

Der E. coli ORF ispH (lytB) (Accession Nr. gb AE000113) von Basenpaar- (bp) Position 5618 bis 6568 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GCTTGCGTCGACGAGGAGAAATTAACCATGCAGATCCTGTTGGCCACC-3', 10 pMol des Primers 5'-GCTGCTCGGCCGTTAATCGACTTCACGAATATCG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

2,4 µg des Vektors pACYC184 (Chang and Cohen, 1978, NEB) und 0,7 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SalI und Eagl verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden En den zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor- DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 18 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYClytB. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYClytB wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYClytB wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000113).

Der E. coli ORF ispG (gcpE) (Accession Nr. gb AE000338) von Basenpaar- (bp) Position 372 bis 1204 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- CGTACCGGATCCGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTC-3', 10 pMol des Primers 5'-CCCATCGTCGACTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

2,0 µg des Vektors pACYClytB und 0,9 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit BamHI und SalI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 23 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYClytBgcpE. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYClytBgcpE wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYClytBgcpE wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000338). Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYClytBgcpE ist in Annex I gezeigt.

Die DNA- und korrespondierende Aminosäuresequenz von ispH (lytB) aus E. coli ist in Annex J gezeigt.

Beispiel 28 Konstruktion eines Vektors mit den Genen xylB, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG und ispH aus Escherichia coli, kompetent für die Transkription und Expression der D-Xylulokinase, DXP- Reduktoisomerase, CDP-ME-Synthase, CDP-ME-Kinase, cMEPP-Synthase, 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat-Synthase und IPP/DMAPP-Synthase

Der E. coli ORFs ispG (früher gcpE) und ispH (früher (lytB) werden durch PCR amplifiziert unter Benutzung des Plasmids pACYClytBgcpE als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GCGGGAGACCGCGGGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG-3', 10 pMol des Primers 5'-AGGCTGGCGGCCGCTTAATCGACTTCACGAATATCG-3', 2 ng pACYClytBgcpE DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 150 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

1,7 µg des Vektors pBScyclo (Beispiel 5) und 1,3 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit Saclt und NotI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

22 ng der gereinigten Vektor-DNA und 19 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pBScyclogcpElytB2. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pBScyclogcpElytB2 wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pBScyclogcpElytB2 wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Die DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclogcpElytB2 ist in Annex K gezeigt.

Beispiel 29 Einbauexperiment mit rekombinantem Escherichia Coli XL1-pBScyclogcpElytB2 unter Verwendung von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose

0.1 Liter Terrific Broth (TB) Medium, das 18 mg Ampicillin enthielt, wird mit einem E. coli XL1- Blue Stamm, der das Plasmid pBScyclogcpElytB2 besitzt, angeimpft. Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C über Nacht angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 1.3- 1.7 wird eine Lösung aus 2.4 g Lithiumlactat (25 mmol), 10 ml ungereinigter [U-¹³C₅]1-Desoxy- D-xylulose (0.05 mmol) (vgl. Beispiel 8) in einem Gesamtvolumen von 30 ml (pH = 7.4) kontinuierlich über 2 Stunden zugegeben. In Zeitintervallen von 30 Minuten werden 40 ml Aliquots entnommen und 20 Minuten bei 5000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit wässriger 0.9% NaCl-Lösung gewaschen und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl einer Mischung aus Methanol und D₂O (6 : 4), die 10 mM NaF enthält, suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 sec mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company) beschallt, der auf 80% Ausgangsleistung, Kontrollstellung 4 eingestellt ist. Die Suspension wird bei 15.000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Die NMR Spektren des zellfreien Überstandes werden direkt mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Um einen Zerfall während der Aufarbeitung zu vermeiden, werden die Strukturen der Produkte mittels NMR-Spektroskopie ohne weitere Aufreinigung bestimmt.

Beispiel 30 Strukturbestimmung von Isopentenyldiphosphat (IPP) und Dimethylallyldiphosphat (DMAPP)

Das ¹H-entkoppelte ¹³C-NMR Spektrum ausgehend von [U-¹³C₅]1-Desoxy-D-xylulose als Vorstufe (vgl. Beispiel 8 und 30) zeigt fünf intensive ¹³C-¹³C gekoppelte Signale, die zu 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat (Herz et al., 2000) gehören, und fünf ¹³C-¹³C gekoppelte Signale mit geringerer Intensität, die zu 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat gehören (vgl. Beispiel 18) (100 : 3 Verhältnis der ¹³C-NMR Signalintensitäten der 2-Methyl- Gruppen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat).

Zusätzlich wird ein Satz von fünf ¹³C-¹³C gekoppelten Signalen bei 21.6 (Dublett), 37.8 (Triplett), 64.1 (Dublett), 111.6 (Dublett) und 143.3 ppm (duplizierte Tripletts) (unbekannter Metabolit A) detektiert, die von Signalen bei 21.1 (Dublett), 39.6 (Triplett), 59.3 (Dublett), 111.8 (Dublett) und 143.2 (duplizierte Tripletts) begleitet werden. Das Verhältnis der Signalintensitäten der 2-Methyl-Gruppen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und der wahrscheinlichen Methylsignale der unbekannten Verbindungen bei 21.6 ppm (Metabolit A) und 21.1 ppm (Metabolit B) ist 100 : 24 : 4.

Weiterhin, werden ¹³C-gekoppelte Signale mit niedriger Intensität, die zu einer anderen, unbekannten Verbindung (Metabolit C) gehören, bei 17.1 (Dublett), 24.9 (Dublett), 62.7 (Dublett), 119.6 (dupliziertes Dublett) und 139.4 ppm (Multiplett) detektiert. Das Verhältnis der Intensitäten der wahrscheinlichen Methylsignale bei 21.6 (Metabolit A), 17.1 und 24.9 (Metabolit C) ist 100 : 13 : 13.

Das ³¹P NMR Spektrum der Reaktionsmischung ist durch intensive Signale von 2C-Methyl-D- erythritol-2,4-zyklodiphosphat (Herz et al., 2000) charakterisiert. Ferner werden ³¹P-³¹P gekoppelte, verbreiterte Signale in einem chemischen Verschiebungsbereich beobachtet, der typisch für organische Diphosphate (6 bis -13 ppm, ³¹P-³¹P Kopplungskonstanten, 20 Hz) ist.

Metabolit A

Die Signale von Metabolit A bei 111.6 und 143.3 ppm deuten auf ein Doppelbindungsmotiv hin und die Signale bei 64.1, 37.8 und 21.6 ppm spiegeln drei aliphatische Kohlenstoffatome wider, von denen eines (Signal bei 64.1 ppm) mit einer OH oder OR Gruppe (R = unbekannt) verbunden scheint.

Zusätzliche Information über die Struktur des unbekannten Metabolits A kann aus dem ¹³C Kopplungsmuster erhalten werden. Drei der ¹³C-NMR Signale (21.6, 64.1 und 111.6 ppm) sind zu Dubletts aufgespalten, was anzeigt, daß jedes der drei ¹³C Atome mit einem ¹³C-markiertem Nachbarn verbunden ist. Ein Signal (37.8 ppm) zeigt eine pseudo-Triplett Signatur, was ein ¹³C- Atom mit zwei benachbarten ¹³C-Atomen anzeigt und ein Signal (143.3 ppm) ist in ein Dublett von Tripletts aufgespalten, was ein ¹³C-Atom mit drei ¹³C Verknüpfungen anzeigt. In Verbindung mit den chemischen Verschiebungen belegt dieses Kopplungsmuster Metabolit A als ein Isopentenyl Derivat.

Die komplexe Signatur für das Signal bei 143.3 ppm verdient eine detailliertere Analyse. Die große Kopplung (71 Hz) ist typisch für ¹³C-¹³C-Kopplungen zwischen Kohlenstoffatomen, die an einer C-C Doppelbindung beteiligt sind. Eine 71 Hz Kopplung wird auch für das Dublett Signal bei 111.6 ppm gefunden, was den zweiten Kohlenstoff der Doppelbindung repräsentiert. Auf Grund der Kopplungsmuster und der chemischen Verschiebungen ist die Gegenwart einer exo- Methylen Funktion offensichtlich. Die zwei zusätzlichen ¹³C Kopplungen, die in der Triplett Substruktur des Signals bei 143.3 ppm gefunden werden, sind jeweils 41 Hz und belegen den entsprechenden Kohlenstoff als den Verzweigungspunkt der Struktur.

HMQC Experimente legen sowohl die ¹H NMR chemischen Verschiebungen als auch die ¹³C-¹H und ¹H-¹H Spinsysteme offen. Um genauer zu sein, korreliert das ¹³C-NMR Signal bei 111.6 ppm mit einem ¹H NMR Signal bei 4.73 ppm, während das Signal bei 143.3 ppm keine ¹³C-¹H Korrelation zeigt. Die Signale bei 64.1, 37.8 und 21.6 ppm zeigen ¹³C-¹H Korrelationen zu ¹H Signalen bei 4.00, 2.31 und 1.68 ppm. Wie durch HMQC-TOCSY Experimenten gezeigt wurde, koppeln die Protonensignale bei 2.31 und 4.00 ppm, während die Signale bei 4.73 und 1.68 ppm als Singulett in den HMQC-TOCSY Experiment gefunden werden. Die beobachteten ¹H NMR chemischen Verschiebungen in Verbindung mit den Kopplungsmuster zeigen, daß Metabolit A ein Isopentenylderivat ist mit einem einfach gebundenen Heteroatom (am glaubhaftesten O) an Position 1.

Die ¹³C und ¹H chemischen Verschiebungen einer authentischen Probe von Isopentenyldiphosphat (IPP, gemessen in der selben Lösungsmittelmischung) sind mit den chemischen Verschiebungen identisch, die Metabolit A zugeordnet wurden. Somit ist Metabolit A als [U-¹³C₅]IPP identifiziert.

Metabolit B

Wie oben bereits erwähnt, sind die beobachteten Kopplungs- und Korrelationsmuster von Metabolit B sowohl bei den ¹³C-NMR Signalen, als auch in den HMQC und HMQC-TOCSY Spektren praktisch die gleichen wie für Metabolit A, was andeutet, daß die Kohlenstoffverknüpfungen von Metabolit B und IPP identisch sind. Der größte signifikante Unterschied zwischen den NMR Daten von Metabolit B und IPP ist die ¹³C-NMR Verschiebung eines Dublett Signals von Metabolit B (59.3 ppm), welches analog zu dem C-1 Signal von IPP (64.1 ppm) ist und um 4.9 ppm zu höherem Feld verschoben ist. Dies deutet an, das die Phosphatsubstitution an C-1 in Metabolit B fehlt. Deshalb wird Metabolit B als [U- ¹³C₅]Isopentenol bestimmt. Vermutlich wird Isopenten-1-ol aus IPP durch die katalytische Aktivität von Pyrophosphatasen und Phosphatasen, die in dem experimentellen System vorhanden sind, gebildet.

Metabolit C

Wie oben für Metabolit A (IPP) beschrieben, wird die Struktur von Metabolit C durch NMR Analyse bestimmt. Das ¹³C Kopplungsmuster der Signale, die Metabolit C zugeordnet werden (drei Dubletts, ein Doppeldublett, ein Multiplett) deuten darauf hin, daß die Verbindung ein weiteres Isopentanderivat ist. Die chemischen Verschiebungen, die für das Doppeldublett (119.6 ppm) und das Multiplett (139.4 ppm) beobachtet werden, zeigen, daß eine Kohlenstoff- Kohlenstoff Doppelbindung C-2 (gekoppelt mit zwei ¹³C Nachbarn) und C-3 (gekoppelt mit drei ¹³C-Nachbarn) des Moleküls verknüpft.

Die ¹H NMR chemischen Verschiebungen von Metabolit C werden durch HMQC und HMQC- TOCSY Experimente aufgedeckt, die zwei Singuletts bei 1.75 und 1.71 ppm zeigen und ein Spinsystem, das die Signale bei 5.43 und 4.45 ppm beinhaltet. In Verbindung mit den chemischen Verschiebungen zeigt dieses Korrelationsmuster, daß Metabolit C ein Dimethylallylderivat ist.

Die ¹³C und ¹H NMR chemischen Verschiebungen einer authentischen Proben von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) sind identisch mit den chemischen Verschiebungen der Signale, die Metabolit C zugeordnet wurden. Das läßt keinen Zweifel übrig, daß Metabolit C [U- ¹³C₅]Dimethylallydiphosphat (DMAPP) ist.

Die NMR Daten von Metabolit A (IPP) und Metabolit C (DMAPP) sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengefaßt.

Tabelle 6

NMR-Daten von Isopentenyldiphosphat (IPP)

Tabelle 7

NMR-Daten von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP)

Beispiel 31 Klonierung des ispG Gens (Fragment) aus Arabidopsis thaliana

RNA aus 1 g 2 Wochen alten Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stengel und Blätter) werden nach publizierten Verfahren isoliert (Logemann et 1987).

Eine Mischung mit einem Gehalt von 2,75 µg RNA, 50 nmol dNTPs, 1 µg hexamere Ran domprimer, 1 µg T15-Primer und 20% First strand 5x Puffer (Promega) in einem Ge samtvolumen von 50 µl wird bei 95°C 5 Min. inkubiert und auf Eis gekühlt. 500 E M-MLV reverse Transkriptase (Promega) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Nach Inkubation bei 92°C für 5 Min. werden 20 E RNase A und 2 E RNase H zu gefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die resultierende cDNA (1 µl dieser Mischung) wird für die PCR-Amplifizierung von ispG benutzt.

Der A. thaliana ORF ispG (Accession Nr. dbj AB005246) ohne die kodierende Region für die vermutete Signalsequenz wird von Basenpaar (bp) Position 2889 bis 6476 durch PCR ampli fiziert unter Verwendung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 25 µmol des Primers CCTGCATCCGAGGAAGCCC, 25 pmol des Primers CAGTTTTCAAAGAATGGCCC, 1 µl cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nmol dNTPs in 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 60 Sek. bei 94 °C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen. Es werden 1,7 µg gereinigtes PCR-Produkt erhalten.

Das PCR-Amplifikat wird als Matrize für eine zweite PCR Reaktion benützt. Die Reak tionsmischung enthält 25 pmol Primer TGAATCAGGATCCAAGACGGTGAGAAGG, 25 pmol Primer TCCGTTTGGTACCCTACTCATCAGCCACGG, 2 µl des ersten PCR-Amplifikats, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nmol dNTPs in einer Lösung mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris Hydrochlorid, pH 8.8 und 0.1% (w/w) Triton X-100 (Gesamtvolumen, 100 µl).

Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.

Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen. 1,4 µg gereinigtes PCR- Produkt werden erhalten. 2,0 µg des Vektors pQE30 und 1,4 µg des gereinigten PCR Produkts werden mit BamHI und KpnI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Die Restriktionsmischungen werden nach den Bedingungen, wie vom Hersteller (NEB) angegeben hergestellt und 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der Vektor-DNA und 12 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4- Ligase (Gibco) und 2 µl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei wird das Plasmid pQEgcpEara erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4°C inkubiert. 2 µl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue und M15[pREP4] Zellen (Zamenhof et al., 1972) transformiert. Das Plasmid pQEgcpEara wird isoliert wie oben beschrieben. 7 µg der Plasmid-DNA werden erhalten.

Das DNA-Insert des Plasmids pQEgcpEara wird sequenziert wie in oben beschrieben. Die DNA-Sequenz ist nicht identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Akzessions-Nr. dbj AB005246, siehe Annex L).

Beispiel 32 Screening der lspG (GcpE)-Enzymaktivität

0,2 g Zellen von XL1-pACYClytBgcpE werden in 1 ml 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4 und 2 mM DTT suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 7 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company) beschallt, der auf 80% Ausgangsleistung, Kontrollstellung 4 eingestellt ist. Die Suspension wird bei 14.000 UpM für 15 Min. zentrifugiert. Der Überstand wir als ungereinigter Zellextrakt in Assays verwendet, wie wie folgt beschrieben.

Die Assay-Mischung enthält 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, 1,2 mM Dithiothreitol, 10 mM NaF, 1 mM CoCl₂, 2 mM NADH, 20 mM (18 µCi mol^-1) [2-¹⁴C]2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat, 0,5 mM Pamidronat und 100 µl ungereinigter Zellextrakt von XL1- pACYClytBgcpE in einem Gesamtvolumen von 150 µl. Die Mischung wird für 10 bis 45 Min. bei 37°C inkubiert und auf Eis gekühlt. 10 µl von 30%iger Trichloressigsäure werden hinzugefügt und die Mischung neutralisiert mit 20 µl von 1 M NaOH. Die Mischung wird bei 14.000 UpM für 10 Min. zentrifugiert. Aliquote von 130 µl von dem Überstand werden mittels reversed-phase Ionenpaar-Chromatographie analysiert unter Verwendung einer Säule von Multospher 120 RP 18-AQ-5 (4,6 × 2500 mm, CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland). Die Säule wird entwickelt mit einem linearen Gradienten von 7-21% (v/v) Methanol in 20 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 bei einer Flußrate von 1 ml min^-1 und danach mit einem linearen Gradienten von 21-49% (v/v) Methanol in 15 ml von 10 mM Tetra-n- butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0. Nach dem Waschen der Säule mit 49% (v/v) Methanol in 5 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 wird die Säule equilibriert mit 7% (v/v) Methanol in 20 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0. Der Durchlauf wird mit einem continous-flow Radiodetektor überwacht (Bet-RAM, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland). Die Retentionsvolumina von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat, 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat bzw. DMAPP/IPP sind 18, 24 bzw. 39 ml.

Nach 10 min. Inkubation sind ungefähr 13% von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat (5%) bzw. in DMAPP/IPP (8%) umgewandelt worden.

Nach 45 min. wird kein 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat, dafür aber 21% DMAPP/IPP in der Assay-Mischung gefunden.

Beispiel 33 Screening der IspH (LytB)-Enzymaktivität

Assay-Mischungen enthalten 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, 1,2 mM Dithiothreitol, 10 mM NaF, 0,5 mM NADH, 20 mM (18 µCi mol^-1) [2-¹⁴C]1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4- diphosphat, 0,5 mM Pamidronat (Dunford et al., 2001) und 20 µl ungereinigter Zellextrakt von M15-pMALlytB (wie in Beispiel 32 beschrieben hergestellt) in einem Gesamtvolumen von 150 µl. Die Mischung wird für 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird abgestoppt durch Abkühlung auf Eis, Zufügung von 10 µl von 30%iger Trichloressigsäure und sofortiger Neutralisation mit 20 µl von 1 M NaOH. Die Mischungen werden bei 14.000 UpM für 10 Min. zentrifugiert und Aliquote von 130 µl von dem Überstand werden mittels reversed-phase Ionenpaar-Chromatographie analysiert unter Verwendung einer Säule von Multospher 120 RP 18-AQ-5 (4,6 × 2500 mm, CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland). Die Säule wird entwickelt mit einem linearen Gradienten von 7-21% (v/v) Methanol in 20 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 bei einer Flußrate von 1 ml min^-1 und danach mit einem linearen Gradienten von 21-49% (v/v) Methanol in 15 ml von 10 mM Tetra-n- butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0. Nach dem Waschen der Säule mit 49% (v/v) Methanol in 5 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0 wird die Säule equilibriert mit 7% (v/v) Methanol in 20 ml von 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, pH 6,0. Der Durchlauf wird mit einem continous-flow Radiodetektor überwacht (Bet-RAM, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland.

Unter Standardassay-Bedingungen verschwindet der HPLC-Peak, der dem Substrat 1-Hydroxy- 2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat entspricht, vollständig, während 2 neue Peaks, die DMAPP und IPP entsprechen, erscheinen, wenn ungereinigter Zellextrakt von E. coli M15- pMALlytB Zellen verwendet wird als Proteinquelle. Keine Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl- 2-(E)-butenyl-4-diphosphat in DMAPP und IPP kann beobachtet werden, wenn ungereinigter Zellextrakt aus E. coli Wild-Typ als Proteinquelle verwendet wird. Diese Resultate zeigen eindeutig, dass die FAD- und NADH- oder NADPH-abhängige Umwandlung von 1-Hydroxy-2- methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat in DMAPP und IPP katalysiert wird durch rekombinantes LYTB-Protein. Die Hinzugabe von Pamidronat in die Assay-Mischungen verhindert einen weiteren Abbau von IPP und DMAPP durch hochaktive Prenyl-Transferasen, die in ungereinigten E. coli Extrakten vorhanden sind, und bewirkt daher die komplette Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat in DMAPP und IPP.

Beispiel 34 Konstruktion eines Vektors mit den dxs, xylB und ispC Genen kompetent für deren Transkription und Expression

Der B. subtilis ORF dxs (Accession Nr. dbj D84432) von Basenpaar- (bp) Position 193991 bis 195892 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von pNCODXSBACSU Plasmid-DNA als Matrize (siehe Patentanmeldung PCT/EP00/007548). Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'-GGCGACTCGCGAGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTC-3', 10 pMol des Primers 5'-GGCACCCGGCCGTCATGATCCAATTCCTTTGTGTG-3, 20 ng DNA von pNNCODXSBACSU, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris- Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 120 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen.

2,4 µg des Vektors pACYC184 (Chang and Cohen, 1978, NEB) und 1,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit NruI und EagI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden En den zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor- DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der gereinigten Vektor-DNA und 19 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 2 µl T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYCdxs. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYCdxs wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYCdxs wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (dbj D84432).

2,0 µg des Vektors pACYCdxs und 8 µg des Vektors pBScyclo (siehe Beispiel 5) werden mit EagI und SalI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng der verdauten und gereinigten Vektor-DNA und 30 ng von einem durch DNA- Gelelektrophorese abgetrennten und gereinigten 2,7 kb EagI/SalI-Fragments (die ORFs xylB und ispC aus E. coli enthaltend) werden zusammenligiert mittels 2 µl T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYCdxsxylBispC. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYCdxsxylBispC wird mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYCdxsxylBispC wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert.

Beispiel 35 Konstruktion eines Vektors mit den dxs, xylB, ispC und ispG und optional ispH Genen kompetent für deren Transkription und Expression

Der E. coli ORF ispH (lytB) (Accession Nr. gb AE000113) von Basenpaar- (bp) Position 5618 bis 6568 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GCTTGCGTCGACGAGGAGAAATTAACCATGCAGATCCTGTTGGCCACC-3', 10 pMol des Primers 5'-GCTGCTCTCGAGTTAATCGACTTCACGAATATCG-3', 20 ng chromosomale E. coli DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

2,5 µg des Vektors pACYCdxsxylBispC (siehe Beispiel 34) und 0,9 µg des gereinigten PCR- Produkts werden mit SalI und XhoI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

15 ng der gereinigten Vektor-DNA und 18 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 2 µl T4-Ligase von Gibco BRL in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pACYCdxsxylBispClytB. Die Ligationsmischung wird für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1- Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pACYCdxsxylBispClytB wird mit dem Plasmid Isolationskit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmids pACYCdxsxylBispClytB wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000113).

Der E. coli ORF ispG (gcpE) (Accession Nr. gb AE000338) von Basenpaar- (bp) Position 372 bis 1204 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Ma trize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GGTCGAGTCGACGAGGAGAAATTAACCATGCATAACCAGGCTCCAATTC-3', 10 pMol des Primers 5'-CCCATCCTCGAGTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCG-3', 20 ng chromosomale E. coli DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Je 2,0 µg der Vektoren pACYCdxsxylBispC (siehe Beispiel 34) und pACYCdxsxylBispClytB (siehe oben) werden linearisiert mit SalI und 1,1 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit SalI und XhoI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

18 ng der gereinigten Vektor-DNAs und 23 ng des gereinigten PCR-Fragments werden zusammenligiert mittels 1 E T4-Ligase, 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultieren die Plasmide pACYCdxsxylBispCgcpE und pACYCdxsxylBispClytBgcpE. Die Ligationsmischungen werden für 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischungen werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Die Plasmide pACYCdxsxylBispCgcpE und pACYCdxsxylBispClytBgcpE werden mit dem Plasmid-Isolationskit von Qiagen isoliert.

Die DNA-Inserts der Plasmide pACYCdxsxylBispCgcpE und pACYCdxsxylBispClytBgcpE werden nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Sie sind identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000338).

Beispiel 36 Einbauexperiment mit rekombinantem Escherichia coli XL1-pACYCdxsxylBispCgcpE unter Verwendung von [U-¹³C₆]Glukose

0.2 Liter Terrific Broth (TB) Medium, das 5 mg Chloramphenicol enthielt, wird mit einem E. coli XL1-Blue Stamm, der das Plasmid pACYCdxsxylBispCgcpE besitzt, angeimpft. Die Zellen werden in einer Schüttelkultur bei 37°C über Nacht angezogen. Bei einer 25556 00070 552 001000280000000200012000285912544500040 0002010201458 00004 25437optischen Dichte (600 nm) von 1.7-2.4 wird eine Lösung aus 1 g Lithiumlactat (10 mmol), 200 mg [U- ¹³C₆]Glukose (1.1 mmol) in einem Gesamtvolumen von 24 ml (pH = 7.4) kontinuierlich über 2 Stunden zugegeben. Nach 1 weiteren Stunde wird ein 40 ml Aliquot genommen und 20 Minuten bei 5000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Zellen werden mit Wasser, das 0.9% NaCl enthält, gewaschen und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Zellen werden in 700 µl einer Mischung aus Methanol-d₄ und D₂O (6 : 4), die 10 mM NaF enthält, suspendiert, auf Eis gekühlt und 3 × 10 sec mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company), der auf 80 % Ausgangsleistung, Kontrollstellung 4 eingestellt ist. Die Suspension wird bei 15.000 Upm, 15 Minuten zentrifugiert. Die NMR Spektren des zellfreien Extraktes werden direkt mit einem Bruker AVANCE DRX 500 Spektrometer (Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Um einen Zerfall während der Aufarbeitung zu vermeiden, werden die Strukturen der Produkte mittels NMR-Spektroskopie ohne weitere Aufreinigung bestimmt. Die ¹³C-NMR Spektren zeigten Signale, die zu 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat gehörten (vgl. Tabelle 2 und 4, Beispiel 18) als Hauptprodukt. Eine Bildung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat konnte nicht detektiert werden.

Beispiel 37 Einbauexperiment mit rekombinantem Escherichia coli XL1-pACYCdxsxylBispClytBgcpE unter Verwendung von Glukose

Beispiel 36 kann mit rekombinanten Escherichia coli XL1-pACYCdxsxylBispClytBgcpE unter Verwendung von Glucose für die Umwandlung von Glucose zu Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat durchgeführt werden.

Beispiel 38 Klonierung des ispG Gens von Escherichia coli und Expression als Maltosebinde-Protein (MBP- IspG)

Der E. coli ORF ispG (gcpE) (Accession Nr. gb AE000338) wird von bp Position 372 bis 1204 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- GACCGGAATTCATGCATGCATAACCAGGCTCCAATTC-3', 10 pMol des Primers 5'- CGAGGCGGATCCCATCACG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt.

2,2 µg des Vektors pMAL-C2 (NEB) und 0,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit EcoRI und BamHI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng Vektor-DNA und 15 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei resultiert das Plasmid pMALgcpE. Die Ligationsmischung wird 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pMALgcpE wird mit dem Plasmidisolations-Kit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmides pMALgcpE wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000338).

Beispiel 39 Klonierung des ispH Gens von Escherichia coli und Expression als Maltosebinde-Protein (MBP- IspH)

Der E. coli ORF ispH (lytB) (Accession Nr. gb AE000113) wird von bp Position 5618 bis 6568 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 10 pMol des Primers 5'- TGGAGGGGATCCATGCAGATCCTGTTGGCCACC-3', 10 pMol des Primers 5'- GCATTTCTGCAGAACTTAGGC-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.

Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation bei 72°C für 10 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga rosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt.

2,2 µg des Vektors pMAL-C2 (NEB) und 0,7 µg des gereinigten PCR-Produkts werden mit EcoRI und BamHI verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Die Restriktionsmischungen werden gemäß den Bedingungen, die der Hersteller (NEB) angibt, hergestellt und werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.

20 ng Vektor-DNA und 14 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei resultiert das Plasmid pMALlytB. Die Ligationsmischung wird 2 h bei 25°C inkubiert. Mit 1 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert. Das Plasmid pMALlytB wird mit dem Plasmidisolations-Kit von Qiagen isoliert.

Das DNA-Insert des Plasmides pMALlytB wird nach der automatischen Dideoxynukleotid- Methode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions sequenziert. Es ist identisch mit der DNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE000113).

Beispiel 40 Präparation und Reinigung von rekombinantem IspG-Maltosebinde-Fusionsprotein (MBP-IspG)

0,5 Liter von Luria-Bertani (LB) -Medium mit 90 mg Ampicillin werden angeimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur vom E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pMALgcpE enthält. Die Kultur wächst in einer Schüttelkultur bei 37°C. Bei einer optischen Dicht (600 nm) von 0,7 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Die Kultur wächst für weitere 5 h. Die Zellen werden mittels Zentrifugation bei 5.000 UpM und 4°C für 20 Min. geerntet. Die Zellen werden gewaschen mit 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, zentrifugiert wie oben und zur Lagerung bei -20°C eingefroren.

2 g der Zellen werden in 20 ml von 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, 0,2 M Natriumchlorid und 0,02% (g/v) Natriumazid (Puffer A) in Gegenwart von 1 mg ml^-1 Lysozym und 100 µg ml^-1 DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultra schallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4°C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt wird aufgetragen auf eine Säule aus Amyloseharz FF (Säulenvolumen 25 ml, NEB), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 130 ml Puffer A gewaschen. MBP-lspG wird mit einem linearen Gradienten von 0-10 mM Maltose in Puffer A eluiert. MBP-IspG enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4 über Nacht dialysiert. Die Homogenität des MBP-lspG wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 84 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 9 mg reines Enzym werden erhalten.

Beispiel 41 Präparation und Reinigung von rekombinantem lspH-Maltosebinde-Fusionsprotein (MBP-IspH)

0,5 Liter von Luria-Bertani (LB) -Medium mit 90 mg Ampicillin werden angeimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur vom E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pMALlytB enthält. Die Kultur wächst in einer Schüttelkultur bei 37°C. Bei einer optischen Dicht (600 nm) von 0,7 wird die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Die Kultur wächst für weitere 5 h. Die Zellen werden mittels Zentrifugation bei 5.000 UpM und 4°C für 20 Min. geerntet. Die Zellen werden gewaschen mit 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, zentrifugiert wie oben und zur Lagerung bei -20°C eingefroren.

2 g der Zellen werden in 20 ml von 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, 0,2 M Natriumchlorid und 0,02% (g/v) Natriumazid (Puffer A) in Gegenwart von 1 mg ml^-1 Lysozym und 100 µg ml^-1 DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultra schallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4°C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt wird aufgetragen auf eine Säule aus Amyloseharz FF (Säulenvolumen 25 ml, NEB), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 130 ml Puffer A gewaschen. MBP-IspH wird mit einem linearen Gradienten von 0-10 mM Maltose in Puffer A eluiert. MBP-IspH enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4 über Nacht dialysiert. Die Homogenität des MBP-IspH wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 78 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 14 mg reines Enzym werden erhalten.

Beispiel 42 Synthese von 1-Hydroxy-2-methyl-but-2-enyl-4-diphosphat (siehe Abb. 7) 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al (Choi et al. (1999) J. Org. Chem. 64, 8051-8053)

Eine Lösung aus 1,17 ml 2-Methyl-2-vinyl-oxiran (12 mmol), 1,6 g CuCl₂ (12 mmol) und 510 mg LiCl (12 mmol) in 10 ml Ethylazetat wurde für 30 min auf 80°C erhitzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 g Eis gestoppt. Die Mischung wurde durch einen gesinnterten Glastrichter unter reduziertem Druck gefiltert. 100 ml CH₂Cl₂ wurde zugegeben und die organische Phase abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit je 100 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie über Silicagel (CH₂Cl₂, 3 × 37 cm) gereinigt, und ergab eine gelbe Flüssigkeit mit einer Ausbeute von 0.755 g (6.4 mmol, 53%).
¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 9.43 (s, 1H), 6.50 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 1.77 (s, 3H)
¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 194.3, 145.7, 141.1, 38.6, 9.1

4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al-dimethyl-azetal

Eine Lösung aus 184 mg 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al (1.55 mmol), 600 µl HC(OMe)₃ (5.6 mmol) und einer katalytischen Menge p-TsOH wurde für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die ungereinigte Mischung wurde durch Chromatographie über Silicagel (n-Hexan/Ethylazetat 7 : 3) gereinigt und ergab 177 mg einer farblosen Flüssigkeit (1.08 mmol, 72%).
¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 5.78 (t, 1H, J = 7.9), 4.47 (s, 1H), 4.15 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.33 (s, 6 H), 1.73 (s, 3H)
¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 137.6, 124.4, 106.0, 53.5, 39.6, 11.4

(E)-3-Formyl-2-buten-1-diphosphat Triammoniumsalz (Davisson et al. (1986) J. Org. Chem., 51, 4768)

Zu einer Lösung von 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al-dimethyl-azetal (25 mg, 0.15 mmol) in 250 µl MeCN wurde eine Lösung aus 0.162 g (0.18 mmol) Tris(tetra-n-butylammonium) hydrogenpyrophosphat in 400 µl MeCN langsam bei Raumtemperatur zugegeben, wobei eine orange-rote Lösung entstand.

Nach 2 h war die Reaktion beendet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das orange Öl wurde in 3 ml H₂O gelöst und durch eine DOWEX 50 WX8 (1 × 4 cm) Kationenaustauscher Säule (NH₄ ⁺-Form) geschickt, die mit 20 ml einer 20 mM NH₄HCO₃ Lösung equilibriert wurde. Die Säule wurde mit 20 ml einer 25 mM NH₄HCO₃ Lösung eluiert. Die erhaltene Lösung wurde lyophylisiert. Der erhaltene Festkörper wurde in 2 ml Wasser gelöst und mit wässriger HCl auf pH = 3 angesäuert. Nach 2 Minuten wurde die Lösung neutralisiert und lyophylisiert.
¹H NMR (D₂O, 360 MHz) δ 9.37 (s, 1H), 6.86 (t, 1H, 5.6 Hz), 4.85 (dd, J = 7.9, J = 5.8 Hz, 2H), 1.72 (s, 3H)
¹³C NMR (D₂O, 90 MHz) δ 199.2, 153.1 (d, J = 7.5 Hz), 138.5, 63.2 (d, J = 4.9), 8.5

[^1-3H]1-Hydroxy-2-methyl-but-2-enyl-4-diphosphat

Eine Lösung bestehend aus 50 mCi (15 µmol) NaBH₃T, 15 µmol 3-Formyl-2-buten-1- diphosphat Triammoniumsalz und 100 mM Tris/HCl pH = 8 wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 M HCl auf pH = 2 angesäuert. Nach 2 Minuten wurde die Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH neutralisiert.

Das Produkt wurde durch Ionenaustausch Chromatographie charakterisiert (vgl. Beispiele 20 und 25).

Beispiel 43 γδ T-Zell Stimulations-Assay

PBMCs von gesunden Donoren (Donor A und Donor B) werden aus heparinisierten peripheren Blut durch Dichtezentrifugation über Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) isoliert. 5 × 10⁵ PBMCs/well werden in 1 ml RPMI 1640 Medium, das mit 10% menschlichen AB serum (Klinik rechts der Isar, München, Deutschland), 2 mM L-Glutamin und 10 µM Mercaptoethanol versetzt war, cultiviert. Die Menge an rekombinanten menschlichen IL- 2 wird von 1 bis 10 U (freundlicher Weise von Eurocetus, Amsterdam, Niederlande zur Verfügung gestellt) und die Substrate werden von 10 bis 0.1 µM variiert. 20 µM IPP (Echelon, Research Laboratories Inc., Salt Lake City, USA) dient als positiv Kontrolle, während Medium alleine als negativ Kontrolle dient. Die Inkubation erfolgte für sieben Tage bei 37°C in der Gegenwart von 7% CO₂. Die geernteten Zellen werden doppelt angefärbt mit Fluorescinisothiocyanat (FITC)-conjugierten Maus anti-humanen monoclonalen Antikörpern Vδ2 TCR und Phycoerythrin (PE)-conjugierten monoclonalen CD3 Antikörpern. Die Zellen werden mit einem FACS Gerät, das mit Cellquest ausgerüstet ist (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) analysiert.

Die Substrate (E)-1-Hydroxy-3-Methyl-but-2-enyl-4-diphosphat (HMBPP) und 3-Formyl-but-2- enyl-1-diphosphat (Aldehyd) wurden synthetisch, wie oben beschrieben, hergestellt.

Es wurde gefunden, daß beide synthetisch hergestellten Substrate (HMBPP und Aldehyd) wenigstens die doppelte Stimulation verglichen mit IPP zeigen, wenn sie in Konzentrationen die 200-fach niedriger als die Konzentration der IPP Proben verwendet wurden (Tabelle 8).

Tabelle 8

Aktivierung von γδT-Zellen durch phosphororganische Verbindungen

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Annex A

DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxr

Annex B

DNA-Ssequenz des Vektorkonstrukts pBSxylBdxrispD

Annex C

DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pBScyclo

Annex D

DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCgcpE

Annex E

DNA-Sequenz des Plasmids pBScaro14

Annex F

DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYCcaro14

Annex G

DNA und zugehörige Aminosäuresequenz des ispG (früher gcpE) Gens von Escherichia coli

Annex H

DNA-Sequenz des Vektorconstrukts pBScyclogcpE

Annex I

DNA-Sequenz des Vektorkonstrukts pACYClytBgcpE

Annex J

DNA- und korrespondierende Aminosäuresequenz des ispH (früher lytB) Gens aus E. coli

Annex K

DNA-Sequenz des Plasmidkonstrukts pBScyclogcpElytB2

Annex L

DNA- und korrespondierende Aminosäuresequenz des ispG Gens (Fragment) aus Arabidopsis thaliana

Annex M

DNA- und korrespondierende Aminosäuresequenz des ispG Gens (früher gcpE) aus Arabidopsis thaliana

Claims

1. Ein Protein in einer Form, dass funktionell ist für die enzymatische Umwandlung von 2C- methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form.

2. Das Protein in Übereinstimmung mit Anspruch 1, wobei es funktionell ist für besagte Umwandlung in Gegenwart von in NADH und/oder NADPH.

3. Das Protein in Übereinstimmung mit Anspruch 2, wobei es funktionell ist für besagte Umwandlung in Gegenwart von Co²⁺.

4. Das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es eine Sequenz hat, die codiert wird durch das ispG Gen (früher geht gcpE) Gen von E. coli oder einem Funktion-konservativen Homologen von besagter Sequenz.

5. Ein Protein in einer Form, dass funktionell ist für die enzymatisch Umwandlung von 1- Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form, in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat.

6. Das Protein in Übereinstimmung mit Anspruch 5, wobei es in einer Form vorliegt, die funktionell ist für besagte Umwandlung in Gegenwart von FAD und NAD(P)H.

7. Das Proteine in Übereinstimmung mit Anspruch 6, wobei es in einer Form vorliegt, die funktionell ist für besagte Umwandlung in der Gegenwart eines Metallregion, ausgewählt aus der Gruppe von Mangan-, Eisen-, Kobalt-, oder Nickelionen.

8. Das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei es eine Sequenz hat, die durch das ispH (früher lytB) Gen von E. coli oder einem Funktion konservativen Homologen von besagter Sequenz codiert wird.

9. Das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es ein Pflanzenprotein ist, insbesondere aus Arabidopsis thaliana.

10. Das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es ein bakterielles Protein ist, insbesondere aus E. coli.

11. Das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es ein protozoelles Protein ist, insbesondere aus Plasmodium falciparum.

12. Gereinigte, isolierte Nukleinsäure, die das Protein codiert in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder das Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 5 bis 8 mit oder ohne Introns.

13. Ein DNA-Expressionsvektor, der die Sequenz der Nukleinsäure enthält in Übereinstimmung mit Anspruch 12.

14. Verwendung eines Proteins in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 11 zum Screenen einer chemischen Bibliothek nach einem Inhibitor der Biosynthese von Isoprenoiden.

15. Zellen, Zellkulturen, Organismen oder Teile davon, die rekombinant versehen sind mit der Sequenz der Nukleinsäure in Übereinstimmung mit Anspruch 12 oder mit dem Vektor in Übereinstimmung mit Anspruch 13, wobei besagte Zelle ausgewählt wird von der Gruppe bestehend aus bakteriellen, protozoellen, Pilz-, pflanzlichen, Insekten- und Säugerzellen.

16. Zellen, Zellkulturen, Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 15, wobei diese rekombinant versehen sind mit einem Vektor, der einen Nukleinsäuresequenz enthält, die codiert für ein Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Protein in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei besagte Zelle optional weiterhin versehen ist mit mindestens einem Gen ausgewählt aus der folgenden Gruppe: dxs, dxr, ispD (früher ygbP), ispE (früher ychB), ispF (früher ygbB) von E. coli oder einem Funktions-konservativen Homologen davon, oder einer Funktions-konservativen Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante von einem der obigen Gene.

17. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon, die transformiert oder transfiziert sind für eine erhöhte Bildungsrate von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner (E)-Form, verglichen mit Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon ohne besagte Transformation oder Transfektion.

18. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon, die transformiert oder transfiziert sind für eine erhöhte Bildungsrate zu Umwandlung von (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl- 4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat verglichen mit Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon ohne besagte Transformation oder Transfektion.

19. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 15 transformiert oder transfiziert für ein erhöhtes Expressionslevel von dem Protein von einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder dem Protein von einem der Ansprüche 5 bis 8 verglichen mit Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon ohne besagte Transformation oder Transfektion.

20. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 15 oder 16, charakterisiert durch die rekombinante Ausstattung mit Sätzen von Genen wie folgt:
aus dem E. coli Genom oder eine Funktions-konservative orthologe, paraloge oder homologe und/oder Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante eines obiger Gene.

21. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 20, charakterisiert durch weitere rekombinante Ausstattung(en) mit (einem) Gen(en), funktionell für die biosynthetischen Schritte stromab von C5-Isoprenoiden.

22. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei mindestens ein Gen mit besagten rekombinanten Ausstattungen versehen ist mit (einer) künstlichen Ribosomenbindungsstelle(n) für die Expression des(r) entsprechenden Genprodukte(s) mit einer erhöhten Rate verglichen mit der Rate ohne Ribosomenbindungsstelle(n).

23. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei mindestens einer der besagten rekombinanten Ausstattungen verursacht ist durch einen Replikationsvektor mit hoher Kopienzahl.

24. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei sie bakteriellen, protozoellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sind.

25. Verwendung von Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 15 bis 24 oder Abbauprodukten davon für die erhöhte Rate der in vivo Bildung oder für die effiziente in vitro Produktion von einem Isotopen-markiertem, biosynthetischem Intermediat oder Produkt des Mevalonat unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg, optional durch Fütterung von 1-Deoxy-D- xylulose oder Glukose, die Isotopen-markiert sein können.

26. Verwendung in Übereinstimmung mit Anspruch 25, wobei besagtes Intermediat oder Produkt eine C5-isoprenoide intermediäre Verbindung ist; oder eine <C5-isoprenoide Verbindung; oder eine terpenoide Verbindung.

27. Verwendung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 25 oder 26, wobei die Bildungsrate oder Herstellung erhöht wird durch Bereitstellung einer Quelle für CTP.

28. Verwendung in Übereinstimmung mit Anspruch 27, wobei die Quelle für CTP Cytidin und/oder Uridin und/oder Cytosin und/oder Uracil und/oder Ribose und/oder Ribose-5- phosphat und/oder irgendein biosynthetischer Precursor von CTP ist.

29. Verwendung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Bildungsrate oder Herstellung verstärkt wird durch Bereitstellung einer Quelle mit Phosphorylierungsaktivität.

30. Verwendung in Übereinstimmung mit Anspruch 29, wobei die Quelle mit Phosphorylierungsaktivität Glyzerin-3-phosphat und/oder Phosphoenolpyruvat und/oder anorganisches Phosphat und/oder anorganisches Pyrophosphat und/oder irgendein organisches Phosphat oder Pyrophosphat ist.

31. Verwendung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 25 bis 30, wobei die Bildungsrate oder Produktion verstärkt wird durch Bereitstellung einer Quelle für Reduktionsäquivalente.

32. Verwendung in Übereinstimmung mit Anspruch 31, wobei die Quelle für Reduktionsäquivalente Succinat und/oder Lipide und/oder Glukose und/oder Glyzerin und/oder Laktat ist.

33. Optional Isotopen-markierte Verbindung oder eines Salzes davon der folgenden Formel I:
wobei R¹ und R² verschieden voneinander sind und einer von R¹ und R² Wasserstoff ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂-O-PO(OH)₂, und wobei A für -CH₂OH oder -CHO steht.

34. Die optional Isotopen-markierte Verbindung in Übereinstimmung mit Anspruch 33, wobei A für -CH₂OH steht.

35. Die optional Isotopen-markierte Verbindung in Übereinstimmung mit Anspruch 33, wobei A für -CHO steht.

36. Die optional Isotopen-markierte Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei R¹ H ist und R² ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus - CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂-O-PO(OH)₂ ist.

37. Die optional Isotopen-markierte Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei R² H ist und R¹ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus - CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ und -CH₂-O-PO(O)₂ ist.

38. Die optional Isotopen-markierte Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei besagte Gruppe aus -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ besteht.

39. Die optional Isotopen-markierte Verbindung 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat oder ein Salz oder eine protonierte Form davon.

40. Die optional Isotopen-markierte Verbindung (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat oder ein Salz oder eine protonierte Form davon.

41. Die optional Isotopen-markierte Verbindung (Z)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat oder ein Salz oder eine protonierte Form davon.

42. Verwendung einer Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 41 für das Screenen nach Genen, Enzymen oder Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden oder Terpenoiden, entweder in vitro in Gegenwart eines Elektronendonors oder in vivo.

43. Verwendung einer Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 41, insbesondere in Übereinstimmung mit Anspruch 40, als immunmodulatorisches Agenz.

44. Verwendung einer Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 41, insbesondere in Übereinstimmung mit Anspruch 40, für die Aktivierung von λδ T-Zellen.

45. Verwendung einer Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 41, insbesondere in Übereinstimmung mit Anspruch 40, für die Herstellung eines Medikamentes.

46. Pharmazeutische Zubereitung, die eine Verbindung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 33 bis 41 enthält, insbesondere in Übereinstimmung mit Anspruch 40, und ein pharmazeutisch verwendbarer Träger.

47. Die pharmazeutische Zubereitung in Übereinstimmung mit Anspruch 46, die weiterhin eine antibiotisch aktive Verbindung enthält.

48. Die pharmazeutische Zubereitung in Übereinstimmung mit Anspruch 47, worin die antibiotisch aktive Verbindung bakteriostatisch ist.

49. Die pharmazeutische Zubereitung in Übereinstimmung mit Anspruch 47, worin die antibiotisch aktive Verbindung die bakterielle Proteinbiosynthese hemmt.

50. Ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion durch ein Pathogen, welche eine zu verabreichende pharmazeutische Zubereitung beinhaltet in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 46 bis 49.

51. Monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen eine Verbindung einer der Ansprüche 33 bis 41.

52. Ein Verfahren zur Detektion eines Pathogens, insbesondere in einer Körperflüssigkeit, unter Benützung des Antikörpers aus Anspruch 51.

53. Verwendung der Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit den Ansprüchen 15 bis 24 für die Herstellung eines Proteins in enzymatisch kompetenter Form für die Umwandlung von 2C-methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1- Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat.

54. Verwendung der Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit den Ansprüchen 15 bis 24 für die Herstellung eines Proteins in enzymatisch kompetenter Form für die Umwandlung von (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat.

55. Verwendung der Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit den Ansprüchen 15 bis 24 für die Herstellung eines Proteins in enzymatisch kompetenter Form für die Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat.

56. Eine Methode zur Veränderung des Expressionslevels des(r) Genprodukts(e) von ispG und/oder ispH in Zellen beinhaltend

a) Transformieren der Wirtzellen mit dem ispG und/oder ispH Gen
b) Kultivieren der transformierten Zellen von Schritt (a) unter Bedingungen, die geeignet für die effiziente Expression von ispG und/oder ispH sind, resultierend in Erreichung eines geänderten Levels des ispG und/oder des ispH Genprodukts(e) in den transformierten Zellen relativ zum Expressionslevel der untransformierten Zellen.

57. Eine Methode zur Identifizierung eines Inhibitors für ein Enzym, das funktionell ist für die Umwandlung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat in 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner E-Form, des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg durch folgende Schritte:

a) Inkubieren einer Mischung, die besagtes Enzym enthält, mit seinem, optional Isotopen-markierten, Substrat 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat unter Bedingungen, die geeignet sind für besagte Umwandlung in Gegenwart und in Abwesenheit eine potentiellen Inhibitors,
b) anschließende Bestimmung der Konzentration von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat und/oder 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, und
c) Vergleichen der Konzentration in der Gegenwart und in der Abwesenheit von besagtem Inhibitors.

58. Eine Methode zur Identifizierung eines Inhibitors für ein Enzym, das funktionell ist für die Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere in seiner E- Form, in Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat des Mevalonat- unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg durch folgende Schritte:

a) Inkubieren einer Mischung, die besagtes Enzym enthält, mit seinem, optional Isotopen-markierten, Substrat 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat unter Bedingungen, die geeignet sind für besagte Umwandlung in Gegenwart und in Abwesenheit eine potentiellen Inhibitors,
b) anschließende Bestimmung der Konzentration von 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat, und
c) Vergleichen der Konzentration in der Gegenwart und in der Abwesenheit von besagtem lnhibitors.

59. Die Methode in Übereinstimmung mit Anspruch 58, wobei Schritt (a) in Gegenwart von FAD ausgeführt wird.

60. Die Methode von einem der Ansprüche 57 bis 59, welches weiterhin die Herstellung von Zellen beinhaltet, die rekombinant versehen sind mit einem Gen, welches für besagtes Enzym codiert, Kultivierung von besagten Zellen, Herstellung eines Rohextraktes von besagten Zellen und Verwendung von besagtem Rohextraktes in Schritt (a).

61. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 60, wobei besagtes Enzyme in pflanzliches Enzym ist.

62. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 60, wobei besagtes Enzyme ein Enzym ist von Plasmodium falciparum.

63. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 60, wobei besagtes Enzymen ein bakterielles Enzym ist.

64. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 60, wobei die Inkubation von Schritt (a) in Gegenwart eines Sulfhydryl-Reduktionsmittels z. B. Dithiothreitol ausgeführt wird.

65. Die Methode entsprechend einem der Ansprüche 57 bis 64, wobei die Inkubation in Schritt (a) in Gegenwart eines Phosphatase-lnhibitors ausgeführt wird.

66. Die Methode in Übereinstimmung mit Anspruch 65, wobei der Phosphatase-Inhibitor ein Alkalifluorid ist.

67. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 66, wobei die Inkubation von Schritt (a) in Gegenwart von NADH oder NADPH ausgeführt wird.

68. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 67, wobei die Inkubation in Schritt (a) ausgeführt wird in Gegenwart eines Inhibitors eines Enzyms, das stromab von Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat agiert.

69. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 68, wobei die Inkubation von Schritt (a) ausgeführt wird in Gegenwart eines Salzes ausgewählt aus der Gruppe von Co²⁺-, Mn²⁺-, Fe²⁺-, Ni²⁺-Salzen.

70. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 69, wobei Schritt (b) ausgeführt wird durch reversed-phase Ionenpaar-Chromatographie.

71. Die Methode in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 57 bis 69, wobei Schritt (b) ausgeführt wird durch Bestimmung des Verbrauchs von NADH oder NADPH.

72. Ein Verfahren für die effiziente in vivo Synthese von 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat; insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, oder Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat, optional Isotopen-markiert, in Salzform oder protonierter Form, mittels folgender Schritte:

a) Kultivierung bakterieller Zellen, vorzugsweise E. coli Zellen, rekombinant ausgestattet in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 15 bis 24 für besagte Synthese, für eine vorher festgelegte Zeitdauer bei einer vorher festgelegten Temperatur;
b) optional Hinzufügung von Glukose in einer vorher festgelegten Konzentration und weitere Kultivierung für eine vorher festgelegte Zeitdauer;
c) Ernten der Zellen;
d) Herstellung eines Rohextraktes von den geernteten Zellen;
e) Auftrennung und Reinigung von optional Isotopen-markiertem 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl- 4-diphosphat; oder Isopentenyldiphosphat; oder Dimethylallyldiphosphat; in Salzform oder in protonierter Form mittels präparativer Chromatographie.

73. Ein Verfahren für das Screenen einer chemischen Bibliothek auf Anwesenheit oder Abwesenheit einer Inhibierung der Biosynthese von Isoprenoiden, insbesondere durch Hemmung der Biosynthese der Intermediate 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat, besagtes Screenen beinhaltend:

a) Kultivierung der Zellen, vorzugsweise bakterieller Zellen, rekombinant ausgestattet in Übereinstimmung mit dem Anspruch 15 für eine vorher festgelegte Zeitdauer bei einer vorher festgelegten Temperatur;
b) optional Hinzufügung von Glukose in einer vorher festgelegten Konzentration und weitere Kultivierung für eine vorher festgelegte Zeitdauer;
c) Ernten der Zellen;
d) Herstellung eines Rohextraktes von den geernteten Zellen; wobei Schritte (a) bis
e) in Gegenwart und in Abwesenheit eines prospektiven lnhibitors ausgeführt werden;
f) Detektion des(r) Unterschieds(e) in dem(n) Level von 1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat; zwischen der Gegenwart und Abwesenheit eines prospektiven Inhibitors; und
g) Korrelieren besagtem(r), detektierten(r) Unterschieds(e) mit der Gegenwart und Abwesenheit von oben definierter Inhibition.

74. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon für die effiziente Bildung eines biosynthetischen Produktes oder Intermediates des 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat abhängigen Biosyntheswegs, gekennzeichnet durch

a) erste rekombinante Ausstattung mit einem Gen, funktionell für die Biosynthese von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat ausgehend von 1-Deoxy-D-xylulose;
b) Fähigkeit zur Aufnahme von 1-Deoxy-D-xylulose; und
c) rekombinante Ausstattung(en) mit Gen(en), das(die) funktionell ist(sind) für die Umwandlung von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in erforderliche(s) Stromab- C5-Intermediat(en) von besagtem Biosyntheseweg.

75. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 74, wobei besagtes(e) Gen(e) dieser besagten rekombinanten Ausstattung(en) für (ein) Enzym(e) kodieren für die Bildung von mindestens einem der folgenden C5-Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthesewegs:

a) 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat;
b) 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol;
c) 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat;
d) 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat;
e) 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat;
f) Isopentenyldiphosphat;
g) Dimethylallyldiphosphat.

76. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 74 oder 75, charakterisiert durch die rekombinante Ausstattung mit Sätzen von Genen wie folgt:

a) xylB, dxr, oder
b) xylB, dxr, ispD (früher ygbP; oder
c) xylB, dxr, ispD (früher ychB); oder
d) xylB, dxr, ispD, ispF (früher ygbB); oder
e) xylB, dxr, ispD, ispF, ispG (früher gcpE); oder
f) xylB, dxr, ispD, ispF, ispG, ispH (früher lytB)

von E. coli oder einem Funktions-konservativen Homologen davon und/oder einer funktions-konservativen Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante eines obiger Gene.

77. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 74, charakterisiert durch die rekombinante Ausstattung mit xylB und ispG (früher gcpE) und optional mindestens einem Gen ausgewählt aus folgender Gruppe: dxr; ispD (früher ygbP); ispE (früher ychB); ispF (früher ygbB); von E. coli oder einem Funktions- konservativen Homologen davon und/oder einer Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante eines obiger Gene.

78. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 74, charakterisiert durch die rekombinante Ausstattung mit xylB und ispH (früher lytB) und optional mindestens einem Gen ausgewählt aus folgender Gruppe: dxr; ispD (früher ygbP); ispE (früher ychB); ispE (früher ygbB); ispG (früher gcpE) von E. coli oder einem Funktions-konservativen Homologen davon und/oder einer Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante eines obiger Gene.

79. Zellen, Zellkulturen oder Organismen oder Teile davon in Übereinstimmung mit Anspruch 74, charakterisiert durch die rekombinante Ausstattung mit xylB, ispG (früher gcpE) und ispH (früher lytB) und optional mindestens einem Gen ausgewählt aus folgender Gruppe: dxr; ispD (früher ygbP); ispE (früher ychB); ispE (früher ygbB) von E. coli oder einem Funktions-konservativen Homologen davon und/oder einer Fusions-, Deletions- oder Insertionsvariante eines obiger Gene.

80. Ein Verfahren für die effiziente in vivo Synthese von 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphat; oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol-2-phosphat; oder 2C-methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat; oder 1-Hydroxy-2- methyl-2-butenyl-4-diphosphat; insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4- diphosphat, oder Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat, optional Isotopen- markiert, in Salzform oder in protonierter Form, mittels folgender Schritte:

a) Kultivierung bakterieller Zellen, vorzugsweise E. coli Zellen, rekombinant ausgestattet in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 74 bis 79 für besagte Synthese, für eine vorher festgelegte Zeitdauer bei einer vorher festgelegten Temperatur;
b) Hinzufügung von 1-Deoxy-D-xylulose in einer vorher festgelegten Konzentration und weitere Kultivierung für eine vorher festgelegte Zeitdauer;
c) Ernten der Zellen;
d) Herstellung eines Rohextraktes von den geernteten Zellen;
e) Auftrennung und Reinigung von optional Isotopen-markierten 2C-Methyl-D- erythritol-4-phosphat; oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat; oder 2C-Methyl-D-erythritol- 2,4-zyklodiphosphat; oder 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, oder Isopentenyldiphosphat; oder Dimethylallyldiphosphat; in Salzform oder in protonierter Form mittels präparativer Chromatographie.

81. Das Verfahren in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 72, 73 oder 80, wobei Schritt (a) in Terrific-Broth Medium ausgeführt wird.

82. Das Verfahren in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 72, 73, 80 oder 81, wobei in Schritt (a) eine Quelle für CTP, vorzugsweise Cytidin oder Uridin, zugefügt wird.

83. Das Verfahren in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 72, 73, 80 bis 82, wobei in Schritt (a) eine Quelle mit Phosphorylierungsaktivität, vorzugsweise Glyzerin-3-phosphat und/oder anorganischem Phosphat, hinzugefügt wird.

84. Das Verfahren in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 72, 73, 80 bis 83, wobei in Schritt (a) eine Quelle für Reduktionsäquivalente, vorzugsweise Succinat und/oder Lipide und/oder Glukose und/oder Glyzerin und/oder Laktat, hinzugefügt wird.

85. Ein Verfahren für das Screenen einer chemischen Bibliothek auf Anwesenheit oder Abwesenheit einer Inhibierung der Biosynthese von Isoprenoiden, insbesondere durch Hemmung der Biosynthese der Intermediate 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und/oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und/oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol-2-phosphat und/oder 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-zyklodiphosphat und/oder 1- Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)-1-Hydroxy-2-methyl-2- butenyl-4-diphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat, besagtes Screenen beinhaltend: (i) Ausführen der Schritte (a) bis (e) von Anspruch 80, vorzugsweise in Verbindung mit einem der Ansprüche 81 bis 84, in Gegenwart und Abwesenheit eines prospektiven lnhibitors; (ii) Detektion des Unterschieds an Menge(n) von 1-Deoxy-D-xylulose und/oder 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat und/oder 2C-Methyl-D- erythritol-4-phosphat und/oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und/oder 4- Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und/oder 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- zyklodiphosphat und/oder 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat, insbesondere (E)- 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphat und/oder Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat mittels HPLC und/oder NMR Spektroskopie; zwischen der Gegenwart und Abwesenheit eines prospektiven Inhibitors und (iii) korrelieren von besagtem(n) detektierten Unterschied(e) mit der Gegenwart und Abwesenheit der oben definierten Inhibition.

86. Das Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 73 oder 85, wobei Schritt (ii) mittels HPLC und/oder NMR-Spektroskopie ausgeführt wird.

87. Vektor mit einer Sequenz, die für eine der rekombinanten Ausstattungen, wie in einem der Ansprüche 74 bis 79 definierte, kodiert.

88. Ein Verfahren für die chemische Herstellung einer Verbindung mit der Formel I oder einem Salz davon:
wobei A eine -CH₂OH repräsentiert und R¹ und R² unterschiedlich von einander sind und einer von R¹ und R² ein Wasserstoff ist und der andere -CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂, -CH₂-O-PO(O)₂ oder -CH₂-OH ist, in den folgenden Schritten:

a) Umwandlung einer Verbindung der folgenden Formel (II):
wobei B eine Schutzgruppe in einer Verbindung mit den folgenden Formeln (III) oder (IV) ist:
durch ein Wittig- oder Horner-Reagenz, worin die Gruppe D eine Vorstufe ist, die reduktiv in eine -CH₂-OH Gruppe umwandelbar ist;
b) reduktive Umwandlung der Gruppe D zu einer -CH₂-OH Gruppe;
c) optionale Umwandlung der -CH₂-OH Gruppe, die in Schritt (b) erhalten wurde in
- - CH₂-O-PO(OH)-O-PO(OH)₂ oder -CH₂ ^-O-PO(OH)₂ oder Salze davon in einer per se bekannten Weise;
- - optionale Umwandlung in ein gewünschtes Salz;
- - Entfernung der Schutzgruppe B.

89. Der Prozess gemäß Anspruch 88, worin die genannte Schutzgruppe B ein Acetal bildet mit dem verbleibenden Teil der Verbindung oder Formel (II).

90. Der Prozess gemäß Anspruch 88 oder 89, worin die genannte Schutzgruppe B eine 2- Tetrahydropyranyl-Gruppe ist.

91. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 oder 90, worin D eine Alkoxycarbonyl Gruppe ist.

92. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 bis 91, worin die genannte Reduktion des Schrittes (b) mit einem Metallhydrid, in besonderem Maß eine Aluminiumhydrid oder Borhydrid durchgeführt wird.

93. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 bis 92, worin Schritt (c) die Umwandlung der genannten -CH₂-OH Gruppe in eine -CH₂-Halogen Gruppe umfaßt.

94. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 bis 93, worin Schritt (c) die Reaktion der genannten -CH₂-OH Gruppe mit einem Sulfonsäurehalogenid, in besonderem Maß Tosylchlorid umfaßt.

95. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 bis 94, worin Schritt (c) die Reaktion mit einer Phosphorsäure oder einer Diphosphorsäure oder einem Salz davon, umfaßt.

96. Der Prozess gemäß einer der Ansprüche 88 bis 95, worin die Schritte (a) bis (c) in aprotischen Lösungsmitteln durchgeführt werden.

97. Der Prozess von einem der Ansprüche 88 bis 96, worin Schritt (e) wird durch Säurehydrolyse durchgeführt.

98. Ein Verfahren für die chemische Präperation einer Verbindung mit der Formel I oder eines Salzes davon:
wobei A -CH₂OH oder -CHO darstellt, R¹ Wasserstoff ist, und R² -CH₂-O-PO(OH)-O- PO(OH)₂, -CH₂-O-PO(OH)₂ oder -CH₂-OH ist durch folgende Schritte:

a) Umwandlung von 2-Methyl-2-vinyl-oxiran in 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al;
b) Umwandlung von 4-Chlor-2-methyl-2-buten-1-al in sein Azetal;
c) Substitution des Chloratoms im Produkt von Schritt (b) durch eine Hydroxylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Pyrophosphatgruppe;
d) Hydrolysierung des in Schritt (c) erhaltenen Azetals, um eine Aldehydgruppe zu erhalten;
e) optional Umwandlung der Aldehydgruppe des Produktes von Schritt (d) in eine -CH₂OH-Gruppe.

99. Das Verfahren von Anspruch 98, wobei Schritt (a) in Gegenwart von CuCl2 durchgeführt wird.

100. Das Verfahren von Anspruch 98 oder 99, wobei Schritt (b) in Gegenwart eines Orthoalkylesters von Ameisensäure durchgeführt wird.

101. Das Verfahren von einem der Ansprüche 98 bis 100, wobei R² -CH₂-O-PO(OH)-O- PO(OH)₂ oder -CH₂-O-PO(OH)₂ und Schritt (C) durchgeführt wird durch Reaktion des Produktes von Schritt (b) mit einem Tetra-alkylammoniumpyrophosphat bzw. einem Tetra-alkylammoniumphosphat in einem polaren, aprotischem Solvenz.

102. Das Verfahren von einem der Ansprüche 98 bis 101, wobei Schritt (e) ausgeführt wurde mit einem Alkalimetallborhydrid in wässriger Lösung.