JPH11504345A - オリゴマー化合物合成の改良法 - Google Patents
オリゴマー化合物合成の改良法Info
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-
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Abstract
(57)【要約】
ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート共有結合を有するオリゴマー化合物を製造する、合成方法を提供する。また、そのような方法に有用な合成中間体を提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
オリゴマー化合物合成の改良法 発明の属する技術分野
本発明は、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホ
スホロジチオエート結合を有するオリゴマー化合物の調製方法、およびその調製
に有用な中間体に関する。発明の背景
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、分子生物学における、ある種の方法
において、プローブ、プライマー、リンカー、アダプター、および遺伝子フラグ
メントとして開発され使用されてきた。これらの方法に使用されるオリゴヌクレ
オチドの修飾には、例えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカ
リホスファターゼ、または他のリポーター分子のような、非同位体標識による標
識がある。他の修飾は、生成する類似体のヌクレアーゼに対する安定性を向上す
るために、リボースリン酸バックボーンに施されてきた。これらの修飾には、メ
チルホスホネート、ホスホロチオエート、及びホスホロジチオエート結合、そし
て2’−O−メチルリボース糖単位の使用がある。更なる修飾には、取り込みお
よび細胞分布を調節するために行われるものがある。診断および治療の両方にこ
の化合物をうまく利用することと共に、改良されたオリゴヌクレオチドおよびそ
の類似体が要求され続けている。
ほとんどの疾病状態を含む、多細胞生物における身体状態のほとんどが、タン
パク質によって影響されることはよく知られている。そのようなタンパク質は、
直接的に作用するか、あるいは、酵素的もしくは他の機能を通じて作用して、動
物およびヒトにおける多くの疾病および調節機能に大きな割合で寄与している。
疾病状態に対しては、古典的な治療は一般に、そのようなタンパク質との相互作
用に焦点を合わせ、それらタンパク質の、病気の原因となる、もしくは病気を増
強する機能を調節する努力をしてきた。より新しい治療のアプローチでは、その
ようなタンパク質の実際の生成を調節することが望まれている。タンパク質の生
成を妨げることにより、最小の副作用で最大の治療効果が得られうる。好ましく
ないタンパク質の生成につながる遺伝子の発現を妨げるか、あるいは調節するこ
とは、そのような治療のアプローチの一般的な目的である。
特定の遺伝子の発現を阻害する一つの方法は、オリゴヌクレオチド、特に、特
定の標的メッセンジャーRNA(mRNA)配列に相補的なオリゴヌクレオチド
を使用するものである。現在、そのような使用のために、いくつかのオリゴヌク
レオチドについて臨床試験が行われている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは、現在、ヒトの様々な疾病状態の臨床試験において、アンチセンス試薬と
して使用されており、それには抗ウィルス性試薬としての使用も含まれている。
転写因子は、転写の調節の際、二本鎖DNAと相互作用する。オリゴヌクレオ
チドは、転写因子の競合阻害剤として働き、その作用を調節することが可能であ
る。いくつかの最近の報告は、そのような相互作用について記載している
(Bielinska,A.ら,Science,1990,250,997-1000;およびWu,H.ら,Gene,1990
,89,203-209を参照すること)。
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、タンパク質の間接的および直接的調
節剤(regulator)としてのそのような使用に加えて、診断試験における使用も
見出された。そのような診断試験は、生物の体液、組織、無傷の(intact)細胞
、または単離された細胞成分を使用して行うことが可能である。遺伝子発現の阻
害と同様、診断への適用は、オリゴヌクレオチドおよびその類似体が、相補的な
核酸鎖とハイブリダイズする能力を利用する。ハイブリダイゼーションは、オリ
ゴマー化合物の、ワトソン−クリックおよび/もしくはフッグステン塩基対を介
した、RNAもしくはDNAへの配列特異的水素結合である。そのような塩基対
の塩基は、互いに相補的であると表現される。
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は研究のための試薬としても広く利用さ
れる。それらは、多くの他の生体分子の機能を理解するために、ならびに他の生
体分子の調製に有用である。例えば、オリゴヌクレオチドおよびその類似体のP
CR反応におけるプライマーとしての使用は、発展中にある商業界を生み出した
。PCRは商業の、そして研究室の中心的存在となり、PCRの適用は多様とな
った。例えば、PCRの技術は今や法廷、古生物学、進化論の研究、および遺伝
相
談の分野の使用が見出されている。商業化によって、分子生物学の訓練を受けて
いない人がPCRを適用する際の助けとなるキットの開発につながった。オリゴ
ヌクレオチドおよびその類似体は、天然物および合成物のどちらも、そのような
PCR技術においてプライマーとして使用される。
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、他の実験方法にも使用される。これ
らの使用のいくつかは、分子クローニング−実験マニュアル(Molecular Cloni
ng,A Laboratory Manual),第2版,J.Sambrookら編集,Cold Spring Har
bor Laboratory Press,1989;および、分子生物学における最新プロトコール(
Current Protocols In Molecular Biology),F.M.Ausubel ら編集,Curr
ent Publications,1993のような、一般的な実験マニュアルに記載されている。
そのような使用には、抗体とオリゴマー化合物を用いた発現ライブラリーのスク
リーニング、DNAシークエンシング、in vitroでのポリメラーゼ連鎖反応によ
るDNAの増幅、およびクローンDNAの部位特異的変異導入における、合成オ
リゴヌクレオチドプローブとしての使用がある。分子クローニング−実験マニュ
アル(上述)の第2巻を参照すること。また、分子生物学における最新プロトコ
ール(上述)の第2巻中の“DNA−タンパク質相互作用およびポリメラーゼ連
鎖反応(DNA-proteininteractions and The Polymerase Chain Reaction
)”も参照すること。
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、所望の使用に合わせて作ることがで
きる、特別な仕様の性質を有するように合成することが可能である。従って、診
断における、研究試薬としての、そして治療物質としての有用性を向上するため
に、多くの化学修飾がオリゴマー化合物に導入されてきた。そのような修飾には
、標的鎖への結合を増強する(すなわち、その融解温度(Tm)を上昇させる)
ため;オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−標的複合体の同定を補助
するため;細胞侵透性を向上するため;オリゴヌクレオチドおよびその類似体の
構造もしくは活性を低下もしくは妨害するヌクレアーゼおよび他の酵素に対して
安定化させるため;一旦標的に配列特異的に結合したものの分裂(disruption)
(終止イベント)の方法を提供するため;そして、オリゴヌクレオチドの薬物動
態性を向上するために設計されたものがある。
規定された配列のオリゴヌクレオチドを生成するための、リンを含有する共有
結合を介したヌクレオシドのカップリングの多くの方法が、化学論文に開示され
ている。最も一般的な方法の一つは、ホスホルアミダイト法(例えば、ホスホル
アミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成の進歩(Advances in the Synthe
sis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach),Beaucage,S
.L.; Iyer,R.P.,Tetrahedron,1992,48,2223-2311;およびそこに引用され
ている参考文献を参照すること)であり、その方法では、遊離の水酸基を有する
ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを、弱酸の存在下で、保護されたシアノ
エチルホスホルアミダイト単量体と反応させ、ホスファイト結合構造を生成する
。ホスファイト結合の酸化に次いで、シアノエチル基を加水分解し、目的のホス
ホジエステルもしくはホスホロチオエート結合を生成する。
しかしながら、ホスホルアミダイト法には重大な欠点がある。例えば、シアノ
エチルホスホルアミダイト単量体はかなり高価である。典型的なホスホルアミダ
イトのカップリングにおいては、かなりの量の単量体が未反応となるが、未反応
の単量体を回収できるとしても、大変な困難を伴う。
シアノエトキシ基のβ−脱離を使用するもう一つの欠点は、リン保護基を除去
する際のアクリロニトリルの生成である。アクリロニトリルは毒性の高い試薬で
あり、発癌物質の疑いがある(1994-1995 Aldrich Chemical Company Catal
ogの32ページを参照すること)。また、アクリロニトリルは、チミジンと環状
構造を形成し、ハイブリダイゼーション能力の低下したオリゴマー化合物を生成
する疑いがある。これらの修飾されたオリゴマー化合物は、目的のオリゴマー化
合物から分離するのが困難なため、好ましくない。
従って、当該分野において、これらの問題を克服する合成法の必要性が残され
ている。
オリゴヌクレオチド化合物の固相合成のためのいくつかの方法が知られている
。これらは一般に、以下の米国特許に開示されている。第4,458,066号(1984.7.
3発行);第4,500,707号(1985.2.19発行);および第5,132,418号(1992.7.21
発行)。更に、ホスホルアミダイト中間体を使用したオリゴヌクレオチドの調製
法は、米国特許第4,973,679号(1990.11.27発行)に開示されている。
ホスホルアミダイトの調製法は、米国特許第4,415,732号(1983.11.15発行)
に開示されている。
ホスホルアミダイトヌクレオシド化合物は、米国特許第4,668,777号(1987.5.
26発行)に開示されている。
β−脱離リン保護基を使用したオリゴヌクレオチドの調製法は、米国特許第R
e.34,069号(1992.9.15発行)に開示されている。
β−脱離またはアリル化リン保護基を使用したオリゴヌクレオチドの調製法は
、米国特許第5,026,838号(1991.6.25発行)に開示されている。発明の概要
共有結合を含有する、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート
、またはホスホロジチオエートを有するオリゴマー化合物の調製方法を提供する
ことが、本発明の目的である。
更に、そのような方法に有用な合成中間体を提供することが、本発明の目的で
ある。他の目的は、当該分野の技術者に明白であろう。
共有結合を含有する、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート
、またはホスホロジチオエートを有するオリゴマー化合物の調製方法を提供する
本発明は、これらの目的を満足させる。
本発明の1つの観点においては、式IX:
[式中:
ZはCN、−Si(R9)3、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル
、スルホニル、チオ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または
置換されたチオ(置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群
より選択される)であり;
R9はそれぞれ独立して、1から約10個の炭素原子を有するアルキル、また
は6から約10個の炭素原子を有するアリールであり;
X1はOまたはSである。]
を有する部分を含有するオリゴマー化合物の調製方法が提供される。この方法は
、
(a)式II:
[式中:
R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、または−O−X3−Dであり;
X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり;
DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ
ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり;
X2はそれぞれOまたはSであり;
R3およびR3aはそれぞれ水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合され
たリンカーであり;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基(nu
cleobase)、または、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩
基であり;
nは0から約50であり;
Qはそれぞれ、リン保護基、好ましくは−X1Hまたは−X1−CH2−CH=
CH−CH2−Zであり;
R5は−N(R6)2、または4から7個の原子を含有し、窒素、硫黄、および
酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキルも
しくは複素環アルケニルであり;
R6は1から10個の炭素を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。]
を有する化合物を提供し;
(b)式IIの化合物を、式III:
[式中:
R3aは水素であり;そして、
R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであるが、ただ
し、R2およびR3の両方が同時に固相支持体に結合されたリンカーであることは
ない。]
を有する化合物と反応させてオリゴマー化合物を生成する、
の各工程を含む。
本発明の方法のある好ましい具体例は、オリゴマー化合物の酸化の工程を更に
含む。好ましい具体例では、本発明の方法は、酸化されたオリゴマー化合物を転
換して、式III(nは1ずつ増加する)を有する更なる化合物を生成することを
更に含む。
本発明の方法は、酸化工程の前、もしくは後に、キャッピングの工程を含むの
が好ましい。
本発明の他の好ましい具体例は、オリゴマー化合物を切断し、式I:
を有する化合物を生成する工程を含む。
本発明のある好ましい具体例では、ZはCNである。本発明の他の好ましい具
体例では、R6はそれぞれイソプロピルである。
好ましい具体例では、X1およびX2はそれぞれ独立してOまたはSであること
が可能である。
好ましい具体例では、式IIの化合物は、式V:
を有する化合物と、式VI:
を有する化合物を酸の存在下で反応させることによって得られる。好ましくは、
R5はN,N−ジイソプロピルアミノである。
また、本発明は式VII:
[式中:
X1はOまたはSであり;
Aは(R7)(R8)P−であり;
R8はR5であるか、または式X:
[式中:
R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、−O−X3−Dであり;
X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり;
DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ
ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり;
X2はそれぞれOまたはSであり;
R5は−N(R6)2、または、4から7個の原子からなり、窒素、硫黄、およ
び酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原予を有する複素環アルキル
もしくは複素環アルケニルであり;
Qはそれぞれリン保護基、好ましくは−X1Hもしくは−X1−CH2−CH=
CH−CH2−Zであり;
mは0から約50であり;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま
たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基である]
を有し;そして、
R7はR5であるか、または式VIII:
[式中:
R3は水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであり;
そして、
nは、0から約50であり、ただしmとnの合計は50を越えない]
を有し;そして、
ZはCN、−Si(R9)3、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル
、スルホニル、チオ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または
置換されたチオ(置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群
から選択される)であり;
R9はそれぞれ独立して、1から約10個の炭素原子を有するアルキル、また
は6から約10個の炭素原子を有するアリールである。]
を有する新規の化合物を提供する。
本発明の化合物のある好ましい具体例では、ZはCNである。他の好ましい具
体例では、ZはSi(R9)3である。更に好ましい具体例では、AはHまたは−
P(R5)2である。
ある好ましい具体例では、R5は−N(CH(CH3)2)2であり、他の好まし
い具体例では、R7は式VIIを有する。
好ましくは、nは1から30であり、1から約20がより好ましい。ある好ま
しい具体例ではnは0である。
より好ましい具体例では、ZはCNであり、X1はOであり、そしてAはHで
あるか;または、ZはCNであり、X1はSであり、そしてAはHである。他の
好ましい具体例では、ZはCNであり、X1はOであり、そしてR6はそれぞれイ
ソプロピルである。更なる好ましい具体例では、ZはCNであり、X1はSであ
り、そしてR6はそれぞれイソプロピルである。
特に好ましい具体例では、本発明の化合物は式IV:
[式中、R2は好ましくは固相支持体に結合されたリンカー、または水素である
。]
を有する。
好ましい具体例では、mおよびnはそれぞれ0であり;またはZはCNであり
、かつX1はOである。
本発明はまた、本発明の方法により製造される生成物を提供する。好ましい具体例の説明
本発明は、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホ
スホロジチオエート結合を有するオリゴマー化合物の調製方法、および、その調
製に有用な中間体を提供する。
本発明の好ましい具体例では、式IX:
[式中:
ZはCN、−Si(R9)3、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル
、スルホニル、チオ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または
置換されたチオ(置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群
より選択される)であり;
R9はそれぞれ独立して、1から約10個の炭素原子を有するアルキル、また
は6から約10個の炭素原子を有するアリールであり;
X1はOまたはSである。]
を有する部分を含有するオリゴマー化合物の調製方法が提供される。該方法は、
(a)式II:
[式中:
R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、または−O−X3−Dであり;
X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり;
DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ
ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり;
X2はそれぞれOまたはSであり;
R3およびR3aはそれぞれ水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合され
たリンカーであり;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま
たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基であり;
nは0から約50であり;
Qはそれぞれ、リン保護基、好ましくは−X1Hまたは−X1−CH2−CH=
CH−CH2−Zであり;
R5は−N(R6)2、または4から7個の原子を含有し、窒素、硫黄、および
酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキルも
しくは複素環アルケニルであり;
R6は1から10個の炭素を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。]
を有する化合物を提供し;
(b)式II:の化合物を、式III:
[式中:
R3aは水素であり;そして
R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであるが、ただ
し、R2およびR3の両方が同時に固相支持体に結合されたリンカーであることは
ない。]
を有する化合物と反応させてオリゴマー化合物を生成する、
の各工程を含む。
本発明の方法は、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、お
よび/またはホスホロジチオエート結合を含む、多様な結合によって結合された
単量体サブユニットを含有するオリゴマー化合物の調製に有用である。
ここで使用される場合、“オリゴマー化合物”という用語は、ホスファイト、
ホスホジエステル、ホスホロチオエート、および/またはホスホロジチオエート
結合によって結合された複数の単量体サブユニットを含む化合物を指して使用さ
れる。オリゴマー化合物にはオリゴヌクレオチド、その類似体、および合成オリ
ゴヌクレオチドがある。上述の式IIもしくはIIIを有する、単量体もしくは、よ
り高次のシントン(synthons)には、天然の(すなわち自然に存在する)、およ
び合成の(例えば、天然物を修飾した、あるいは、完全に合成した)ヌクレオシ
ドの両方がある。
好ましい具体例では、式IIおよび式IIIの化合物を反応させて、式IVの化合物
を生成する。式IIおよび式IIIの化合物をカップリングさせる本発明の方法には
、液相および固相化学の両方がある。代表的な液相技術は、本発明の出願人に譲
渡されている、米国特許第5,210,264号に述べられている。好ましい具体例では
、本発明の方法は、反復固相オリゴヌクレオチド合成法において用いるのに使用
される。代表的な固相技術は、標準的なホスホルアミダイト化学を利用したDN
AおよびRNA合成に一般的に使用されるものである(例えば、オリゴヌクレオ
チドおよび類似体のためのプロトコール;Protocols For Oligonucleotides
And Analogs,Agrawal,S.編集,Humana Press,Totowa,NJ,1993 を参照す
ること)。好ましい固相合成では、活性化されたリン酸化合物としてホスホルア
ミダイトを利用する。この技術では、ホスホルアミダイトの単量体を、伸長する
オリゴマー鎖の遊離水酸基と反応させ、中間体であるホスファイト化合物を生成
し、続いてそれを標準的な方法を使用して酸化し、PV状態にする。この技術は
、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート結合を
含む、数種の型の結合の合成に、一般に使用される。
典型的には、そのような方法の第一工程では、当該分野で知られる標準的な方
法および手順を使用して、保護された5’−水酸基を含有する第一の単量体もし
くはより高次のサブユニットを、通常はリンカーを介して、固相支持体に結合さ
せる。次いで、支持体に結合した単量体もしくはより高次の第一のシントンを処
理して5’−保護基を除去し、R2が固相支持体に結合されたリンカーである、
式IIIの化合物を生成する。典型的には、これは酸で処理することによって行わ
れる。次いで、固相支持体に結合した単量体を式IIの化合物と反応させて式IVの
化合物を生成し、これは式IXのホスファイトもしくはチオホスファイト結合を有
する。好ましい具体例では、式IIおよびIIIのシントンを、例えば1H−テトラ
ゾール、5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾール、もしくはジイソプ
ロピルアミノテトラゾリドのような活性化試薬の存在下、無水条件下で、反応さ
せる。
好ましい具体例では、式IXの結合を含有するホスファイトもしくはチオホスフ
ァイト化合物を下記のように酸化し、X1およびX2がそれぞれOまたはSである
ことが可能である、式XIの結合を有する化合物を生成する。
酸化試薬の選択により、式IXの結合が、酸化されて、ホスホトリエステル、チ
オホスホトリエステル、またはジチオホスホトリエステル結合のいずれになるか
が決定する。
一般に、ホスファイトトリエステル、チオホスファイトトリエステル、もしく
はジチオホスファイトトリエステルの酸化の前、もしくは後のいずれかに、キャ
ッピングの工程を行うのが好ましい。そのようなキャッピングの工程には、カッ
プリングサイクルで反応しなかった鎖をブロックすることによってオリゴマー鎖
が短くなるのを防止するという利点があることが、一般に知られている。キャッ
ピングに使用される代表的な試薬は、無水酢酸である。他の適当なキャッピング
試薬および方法論は、1989年3月28日発行の米国特許第4,816,571号に見出すこ
とができる。
酸による処理によって5’−水酸基保護基を除去し、固相支持体に結合したオ
リゴマーを更なる式III(R3aは水素である)の化合物に転換し、これは次に反
復合成に関与できる、すなわち、更なる式IIの化合物と反応させることができる
。この過程を、目的の長さのオリゴマーが生成するまで繰り返す。
次いで、完成したオリゴマーを固相支持体から切断する。保護された官能基の
保護基除去の前もしくは後に行うことができる切断工程により、R2が水素であ
る式Iを有する化合物が生成する。切断中に、単量体サブユニット間の結合は、
ホスホトリエステル、チオホスホトリエステル、もしくはジチオホスホトリエス
テル結合から、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチ
オエート結合に転換される。この転換は、酸素もしくは硫黄保護基である式Z−
CH2−CH=CH−CH2−の損失によっておこるものである。Zの種類により
、酸素もしくは硫黄保護基の損失は、δ−脱離機構またはδ−断片化(δ-
fragmentation)機構のどちらかを介しておこると考えられる。
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、Zがシリルではない電子
求引基である場合の酸素もしくは硫黄保護基の損失は、下記の図Iに示すように
、δ−脱離機構を介しておこると考えられる。
この機構では、まず最初に、塩基が電子求引基Zに隣接する炭素原子から、酸
性プロトンを引き離す。上記の図Iに示すような電子の共鳴運動により、δ−脱
離反応を介して酸素もしくは硫黄保護基の損失が生じ、ホスホジエステル、ホス
ホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート結合が形成されると考えられる
。脱保護の他の生成物は、電子求引性置換基Zを1−位に有する、1−置換−1
,3−ブタジエンである。
置換基Zは、共鳴、誘起、もしくは他の電子求引機構により、隣接する炭素原
子からのプロトンの引抜を促進するように選択される電子求引基であることが可
能である。従って、Zは、本発明の方法を妨げない限り、様々な電子求引性置換
基のいずれであることも可能である。好ましい、シリルではない電子求引性Z基
には、CN、ハロゲン、NO2、アルカリール基、スルホキシル基、スルホニル
基、チオ基、置換されたスルホキシル基、置換されたスルホニル基、または置換
されたチオ基(置換基は、アルキル、アリール、またはアルカリールからなる群
から選択される)がある。より好ましい具体例では、Zはシアノである。
Zはまた、置換基がアルキル、アリール、もしくはその両方である、三置換シ
リル部分であることも可能である。特定の理論に拘束されることを望むものでは
ないが、Zがそのような三置換シリル部分である場合の酸素もしくは硫黄保護基
の損失は、下記の図IIに示す、6−断片化機構を介しておこると考えられる。
この図において、求核試薬がシリルのケイ素原予を攻撃し、上記の図IIに示すよ
うな電子の共鳴運動により、6−断片化機構を介して酸素もしくは硫黄保護基の
損失が生じ、その結果、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホス
ホロジチオエート結合が形成されると考えられる。脱保護の他の生成物は、1,
3−ブタジエン、およびNu−Si(R3)3である。
酸素もしくは硫黄保護基のδ−脱離反応を開始させるために、多様な塩基を使
用することが可能である。それらには、水酸化アンモニウム水溶液、メチルアミ
ン水溶液、またはDBU(1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7
−エン)がある。
酸素もしくは硫黄保護基のδ−断片化反応を開始させるために、多様な求核試
薬を使用することが可能である。それらには、水酸化アンモニウム、フッ化物イ
オン、アルキルアミン、水性塩基、およびアルキルアミンを水酸化アンモニウム
と組み合わせたものがある。得られる生成物には、ホスフェート、ホスホロチオ
エート、およびホスホロジチオエートを含有する化合物がある。
フッ化物イオンとの接触は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメトキ
シエタン、もしくは水のような溶媒中で行うのが好ましい。フッ化物イオンは、
フッ化テトラアルキルアンモニウム(例えば、フッ化テトラブチルアンモニウム
(TBAF))、フッ化カリウム、もしくはフッ化セシウムから選択された一個
あるいはそれ以上の塩の形で供給されるのが好ましい。
好ましくは、δ−脱離反応もしくはδ−断片化反応を介する酸素もしくは硫黄
保護基の除去のための条件により、固相支持体からのオリゴマー化合物の切断も
行われる。
本発明の方法は、ホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ま
たはホスホロジチオエート結合を有する、多様なオリゴマー化合物の合成に適用
することが可能である。ここで使用する場合、“オリゴマー化合物”という用語
は、そのようなホスファイト、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または
ホスホロジチオエート結合によって連結された、二個あるいはそれ以上の単量体
サブユニットを含有するポリマー化合物を意味する。
合成サイクルの間、式IIおよび式IIIで表されるシントン中に存在する、先在
する任意のヌクレオシド間結合を保護するのが好適である。従って、置換基Qは
、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合の
ようなリン結合を保護するために使用される、多様なリン保護基のいずれである
ことも可能である。本発明の好ましい具体例では、QはX1Hまたは−X1−CH2
−CH=CH−CH2−Zである。他のリン保護基の例には、シアノエチル基お
よびジフェニルメチルシリルエチル(DPSE)基がある。他の代表的な保護基
は、Beaucageら,Tetrahedron 1992,48,2223-2311、および、Beaucageら,Tet
rahedron 1993,49,6123-6194に開示されており、この開示を全体として本明細書
の一部としてここに引用する。
好ましい具体例では、本発明の方法はオリゴヌクレオチドおよびその類似体の
調製に使用される。ここで使用する場合、“オリゴヌクレオチド類似体”という
用語は、自然に存在する(すなわち“天然の”)、および自然に存在しない(“
合成の”)部分のどちらも含有することが可能である化合物を意味し、例えば、
修飾された糖および/または核塩基部分を有するヌクレオシドサブユニットがあ
る。そのようなオリゴヌクレオチド類似体は、典型的には、自然に存在するもし
くは合成の野生型のオリゴヌクレオチドと、構造的には区別できるが、機能的に
は互換性がある。従って、オリゴヌクレオチド類似体には、例えば標的とのハイ
ブリダイゼーションによって、目的のRNAもしくはDNA鎖の構造および/ま
たは
ダイゼーションによって、目的のRNAもしくはDNA鎖の構造および/または
機能を模倣するのに効果的に機能するような構造の全てが含まれる。合成ヌクレ
オシドという用語は、本発明の目的では、修飾されたヌクレオシドを指す。代表
的な修飾には、自然に存在しない核塩基、ヌクレオシドの糖部分、もしくは両者
が同時に得られる、ヌクレオシドの複素環塩基部分の修飾がある。
代表的な核塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン、およびチミ
ン、ならびに、キサンチン;ヒポキサンチン;2−アミノアデニン;アデニンお
よびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体;アデニンおよびグアニン
の2−プロピルおよび他のアルキル誘導体;5−ハロウラシルおよびシトシン;
6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン;5−ウラシル(偽ウラシル);4−
チオウラシル;8−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキ
シル、および他の8−置換アデニンおよびグアニン;5−トリフルオロメチルお
よび他の5−置換ウラシルおよびシトシン;7−メチルグアニンのような、他の
自然に存在しないもしくは天然の核塩基が含まれる。更なる、自然に存在するも
しくは自然に存在しない核塩基には、米国特許第3,687,808号(Meriganら);
アンチセンスの研究と応用(Antisense Research and Application)のSang
hviによる第15章,S.T.CrookeおよびB.Lebleu(編),CRC Press,1993;
Englischら,Angewandte Chemie,国際版,1991,30,613-722(特に622および623
ページを参照すること);および、ポリマーの科学と技術の簡潔事典(Concise
Encyclopedia of Polymer Science and Engineering),J.I.Kroschwitz(
編),John Wiley & Sons,1990,858-859ページ;Cook,P.D.,抗癌剤のドラッ
グデザイン(Anti-Cancer Drug Design),1991,6,585-607に開示されている
ものがある。更に、‘ヌクレオシド塩基’という用語は、最も古典的な意味では
ヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として働く、ある種の‘万能塩基
’を含むヌクレオシド塩基のような働きをすることが可能な複素環化合物を含む
。特に万能塩基として挙げられるのは3−ニトロピロールである。
本発明に適用しうる代表的な糖の2’修飾(R1の位置)には、フルオロ、O
−アルキル、O−アルキルアミノ、O−アルキルアルコキシ、保護されたO−ア
ルキルアミノ、O−アルキルアミノアルキル、O−アルキルイミダゾール、およ
び、式(O−アルキル)m(mが1から約10である)のポリエーテルがある。
これらのポリエーテルの中で好ましいのは、クラウンエーテル、およびOuchiら
,薬剤の設計と発見(Drug Design and Discovery)1992,9,93;Ravasioら,J
.Org.Chem.1991,56,4329;およびDelgardoら,Critical Reviews in Ther
apeutic Drug Carrier Systems 1992,9,249に開示されているもののような、
直鎖および環状ポリエチレングリコール(PEG)および(PEG)−含有基で
ある。更なる糖の修飾は、Cook,P.D.(上述)に開示されている。フルオロ
、O−アルキル、O−アルキルアミノ、O−アルキルイミダゾール、O−アルキ
ルアミノアルキル、およびアルキルアミノ置換は、2’および5’置換ピリミジ
ンヌクレオチドを有するオリゴマー化合物(Oligomeric Compounds having P
yrimidine Nucleotide(s) with 2'and 5'Substitutions)と題する、1995
年3月6日付けの米国特許出願第08/398,901号に記載されている。
リボース環にO−置換基を有する糖もまた、本発明に適用しうる。代表的な環
のO−置換基には、S、CH2、CHF、およびCF2がある(例えば、Secrist
ら,第10回国際円卓会議“ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびその生物学的
適用”の“プログラムおよび要約”の要約21(Abstract 21,Program & Abs
tracts,Tenth International Roundtable,Nucleosides,Nucleotides and t
heir Biological Applications)Park City,Utah,Sept.16-20,1992を参照
すること)。
ここで使用する場合、“アルキル”という用語は、直鎖、分枝鎖、および脂環
式炭化水素の基を含むが、それらに限定されるものではない。本発明のアルキル
基は置換されていてもよい。代表的なアルキル置換基は、米国特許第5,212,295
号、カラム12の41−50行に開示されている。
ここで使用する場合、“アルアルキル”という用語は、例えばベンジル基のよ
うな、アリール基を有するアルキル基を示す。“アルカリール”という用語は、
例えばメチルフェニル基のような、アルキル基を有するアリール基を示す。“ア
リール”基は芳香環式化合物であり、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェ
ナントリル、ピレニル、およびキシリルを含むが、それらに限定されるものでは
ない。
ここで使用する場合、“複素環アルキル”という用語は、一個あるいはそれ以
上のヘテロ原子(すなわち炭素ではない原子)を有するアルキル環系を示す。好
ましい複素環アルキル基には、例えば、モルホリノ基がある。ここで使用する場
合、“複素環アルケニル”という用語は、一個あるいはそれ以上の二重結合、お
よび一個あるいはそれ以上のヘテロ原子を有する環系を示す。好ましい複素環ア
ルケニル基には、例えば、ピロリジノ基がある。
本発明の好ましい具体例では、R2、R3、またはR3aは、固相支持体に結合さ
れたリンカーであることが可能である。固相支持体は、Caruthersの米国特許第
4,415,732号;4,458,066号;4,500,707号;4,668,777号;4,973,679号;および5
,132,418号、そして、Kosterの米国特許第4,725,677号およびRe.34,069号に記
載されているような、固相合成方法論における固相として機能することができる
物質である。リンカーは、固相合成技術において、最初のシントン分子の官能基
(例えば水酸基)に固相を結合させるために働く短い分子として、当該分野で知
られている。好適なリンカーは、例えば、オリゴヌクレオチドおよび類似体−実
用的アプローチ(Origonucleotides And Analogues A Practical Approac
h)Ekstein,F.(編),IRL Press,N.Y.,1991の第1章、1−23ページ
に開示されている。
本発明に係る固相支持体には、例えば、定孔ガラス(controlled pore glass;
CPG)、オキサリル化−定孔ガラス(例えば、Alulら,Nucleic Acids Resea
rch 1991,19,1527を参照すること)、TentaGel支持体−アミノポリエチレング
リコール誘導体化支持体(例えば、Wrightら,Tetrahedron Letters 1993,34,
3373を参照すること)、およびPoros−ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポ
リマーを含む、固相方法論における使用に好適なものとして、当該分野で一般に
知られるものがある。
本発明のある好ましい具体例では、R2、R3、またはR3aは水酸基保護基であ
ることが可能である。多様な水酸基保護基を、本発明の方法に使用することが可
能である。好ましくは、保護基は、塩基性条件下で安定であるが、酸性条件下で
除去することが可能なものである。一般に、保護基は、特定の反応条件に対して
化学的官能基を不活性にし、そして、分子の残部に実質上の損傷を与えることな
く、分子中のそのような官能基部分に付加および除去することが可能である。代
表的な水酸基保護基は、Beaucageら,Tetrahedron 1992,48,2223-2311;および
、GreeneおよびWuts,有機合成における保護基(Protective Groups in Or
ganic Synthesis)第2版,第2章,John Wiley & Sons,New York,1991に
開示されている。R2、R3、およびR3aに使用される好ましい保護基には、ジメ
トキシトリチル(DMT)、モノメトキシトリチル、9−フェニルキサンテン−
9−イル(Pixyl)、および9−(p−メトキシフェニル)キサンテン−9
−イル(Mox)がある。R2またはR3基を、当該分野でよく知られる技術によ
り、本発明のオリゴマー化合物から除去し、遊離の水酸基を生成することが可能
である。例えば、ジメトキシトリチル保護基は、ギ酸、ジクロロ酢酸、トリクロ
ロ酢酸、p−トルエンスルホン酸のようなプロトン酸、または例えば臭化亜鉛の
ようなルイス酸によって除去することができる。例えば、Greene and Wuts(
上述)を参照すること。
本発明の好ましい具体例では、アミノ基を、例えば2’−アルコキシ基(例え
ばR1がアルコキシである)のような、アルキルもしくは他の基に付加する。そ
のようなアミノ基は、自然に存在するあるいは自然に存在しない核塩基中にも、
通常存在する。一般的に、これらのアミノ基は、本発明のオリゴマー化合物の合
成の間、保護された形態であることが好ましい。これらの目的に適した、代表的
なアミノ保護基は、GreeneおよびWuts,有機合成における保護基(Protective
Groups in Organic Synthesis),第2版,第7章,John Wiley & Sons,N
ew York,1991に述べられている。一般に、ここで使用する場合、“保護された
”という用語は、“核塩基”のような分子の部分に関連して使用される場合、分
子部分が、保護基によって保護された一個あるいはそれ以上の官能基を含有する
ことを指す。
ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合を生成するための酸化の
際に使用される硫化(sulfurizing)試薬には、Beaucage試薬(例えば、Iyer,
R.P.ら,J.Chem.Soc.,1990,112,1253-1254およびIyer,R.P.ら,J.Org.
Chem.,1990,55,4693-4699を参照すること);二硫化テトラエチルチウラム(例
えば、Vu,H.,Hirschbein,B.L.,Tetrahedron Lett.,1991,32,3005-3008を
参照すること);四硫化ジベンゾイル(例えば、Rao,M.V.ら,Tetrahedron L
ett.,1992,33,4839-4842を参照すること);ジ(フェニルアセチル)二硫化物(
例えば、Kamer,
P.C.J.,Tetrahedron Lett.,1989,30,6757-6760を参照すること);硫黄、
および、トリアリール、トリアルキル、トリアルアルキル、もしくはトリアルカ
リールホスフィンのようなリガンドと硫黄の組み合わせがある。
ホスホジエステルもしくはホスホロチオエート結合の生成に使用される有用な
酸化試薬には、ヨウ素/テトラヒドロフラン/水/ピリジン、または過酸化水素
/水、またはtert−ブチル過酸化水素、またはm−クロロ過安息香酸のよう
な過酸がある。酸化の場合、水性条件下で反応を行うことができるのに対し、硫
化の場合、反応は無水条件下で、空気、特に酸素のない状態で行う。
本発明に係る、特定の標的とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド類似体は、約5から約50個の単量体サブユニットから成る
のが好ましい。より好ましくは、このような化合物は約10から約30個の単量
体サブユニット、特に15から25個の単量体サブユニットから成るのが好まし
い。より大きいオリゴマー化合物の構築における“基礎単位(building blocks
)”として(すなわち、式IIのシントンとして)使用する場合、より小さいオリ
ゴマー化合物が好ましい。一般的な式IIの二量体、三量体、もしくはより高次の
化合物のライブラリーを、本発明の方法におけるシントンとして使用するために
製造することが可能である。より大きいオリゴヌクレオチドの自動化された合成
において、液相化学を介して合成された小さい配列を利用すると、カップリング
効率および最終的に得られるオリゴヌクレオチドの純度が向上する。例えば、M
iura,K.ら,Chem.Pharm.Bull.,1987,35,833-836;Kumar,G.およびPoonian,
M.S.,J.Org.Chem.,1984,49,4905-4912;Bannwarth,W.,Helvetica Chim
ica Acta,1985,68,1907-1913;Wolter,A.ら,ヌクレオシドおよびヌクレオチ
ド(nucleosides and nucleotides),1986,5,65-77を参照すること。
また、二量体およびより長いシントン(すなわち、式IIの化合物において、n
が1より大きい)の使用により、一個もしくはそれ以上のヌクレオチドが欠失し
た、より短い(失敗の)配列の生成を低減するという、更なる利点が提供される
ことも認識されるであろう。一個のヌクレオチドが欠失した配列(“n−1量体
”)を目的のオリゴヌクレオチドから分離するのはしばしば困難であるため、そ
の混入量を低減するのは、特に有利なことである。
本発明の1つの観点においては、本発明の化合物は、その生成または活性を調
節することが望まれるタンパク質をコードする、RNAもしくはDNAを調節す
るために使用される。従って、使用すべき組成物の標的部分は、DNAもしくは
RNAのあらかじめ選択された部分と相補的であるように、すなわちその部分と
ハイブリダイズできるように選択される。
本発明の方法の好ましい具体例では、式IIの化合物は、式V:
を有する保護されたヌクレオシドを、式VI:
のホスファイト化合物と、酸の存在下で反応させて製造する。好適な酸には、例
えばジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを含む、ホスホルアミダイトのカ
ップリングに有用であるとして当該分野で知られるものがある。
式VIの化合物は、式HOCH2CH=CHCH2Zを有するアルコールを三塩化
リンと反応させ、その生成物Cl2PX1CH2CH=CHCH2Zを、少なくとも
2当量の式[(R6)2N]2NHを有するアミンと反応させて製造するのが好ま
しい。それぞれのR6基は、同じであるか、もしくは異なるものであることが可
能であり、好ましくは1から約10個の炭素原子、より好ましくは1から6個の
炭素原子、中でも3個の炭素原子を有するアルキルであり、特にイソプロピル基
が好ましい。
X1およびX2は、それぞれ独立して、OまたはSであることが可能である。従
って、キラルなリン結合を有する化合物は、本発明の意図するところである。S
tec,W.J.およびLesnikowski,Z.J.,分子生物学における方法(Methods in
Molecular Biology)Vol.20:オリゴヌクレオチドおよび類似体のためのプロ
トコール(Protocols for Oligonucleotides and Analogs),S.Agrawal(
編),Humana Press,Totowa,N.J.(1993),14章を参照すること。また、S
tec,W.J.ら,核酸の研究(Nucleic Acids Research),Vol.19,No.21,5883
-5888(1991);およびヨーロッパ特許出願公開 EP 0 506 242号を参照すること
。
また、本発明の好ましい具体例では、一般式VII:
[式中、X1、A、およびZは上で定義したとおりである。]
を有する化合物を提供する。
本発明のオリゴマー化合物は、診断、治療、そして研究のための試薬およびキ
ットとして使用することが可能である。それらは、好適な製薬上許容しうる希釈
剤もしくは担体を含有させることにより、医薬組成物において使用することが可
能である。それらは更に、タンパク質の好ましくない生成を特徴とする病気を有
する生物の治療に使用することが可能である。生物を、好ましくないタンパク質
をコードする核酸鎖と特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するオ
リゴヌクレオチドと接触させる。この型の処理は、単細胞の原核および真核生物
から多細胞真核生物におよぶ広範の生物に実施することが可能である。DNA−
RNA転写もしくはRNA−タンパク質翻訳を、遺伝、代謝、もしくは細胞の制
御の主要な部分として利用するいずれの生物も、本発明に係る治療および/もし
くは予防処置が可能である。細菌、酵母、原生動物、藻類、全ての植物、および
温血動物を含む、全てのより高等な動物の種類のような、外観上多様な生物を治
療することが可能である。更に、多細胞真核生物は、その細胞活性の不可欠部分
としてDNA−RNA転写およびRNA−タンパク質翻訳の両方を有するので、
そのそれぞれの細胞を処理することが可能である。更にまた、真核細胞のオルガ
ネラの多く(例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体)も、転写および翻訳機構を
有する。従って、単細胞、細胞集団、またはオルガネラもまた、治療もしくは診
断のためのオリゴヌクレオチドで処理することができる生物の定義に含むことが
可能である。
認識されるように、本発明の方法の工程は、特定の回数、あるいは特定の配列
で行う必要はない。本発明の更なる目的、利点、および新規の特徴は、当該分野
の技術者には、以下の実施例の考察により明らかとなるであろうが、それら実施
例は例証を意図するものであり、制限を意図するものではない。実施例1 1−クロロ−2−ブテン−4−オール
2−ブテン−1,4−ジオール(600g、6.81mol)を、冷却器、圧
均等化用添加用漏斗、およびメカニカルスターラーを装備した、5リットルの三
つ口丸底フラスコに添加した。ここに、無水エーテル(1400mL)およびピ
リジン(604.9mL.7.49mol)を添加した。反応フラスコを0℃に
冷却し、塩化チオニル(545.6mL、7.49mol)を、2.5時間にわ
たり、滴下した。添加終了後、反応混液を室温まで暖まらせ、一晩中撹拌した。
その後、反応混液を氷水500mLに注ぎ、エーテルで抽出した(2x400m
L)。合一したエーテル抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム、次いでブラインで洗
浄し、乾燥した(Na2SO4)。乾燥した抽出液を濃縮して標記の化合物を得、
更なる精製をせずに次の工程に使用した。実施例2 4−シアノ−2−ブテン−1−オール
1−クロロ−2−ブテン−4−オール(230g、2.14mol)を無水ア
セトニトリル(1250mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下で3Lの丸底フラス
コに添加した。シアン化カリウム(825g、12.5mol)の全量を一度に
添加し、反応混液を室温で3時間撹拌した。NaI(16g、0.054mol
)
を添加し、反応混液を室温で一晩中撹拌した。反応混液を濾過し、固形物を酢酸
エチル(800mL)で洗浄した。濾液を真空下(in vacuo)濃縮して油を得、
これをエーテル(750mL)で懸濁した(triturate)。この混合液を濾過し
、澄んだ濾液を濃縮した。粗生成物を短縮経路(short path)を使用して蒸留し
、標記の化合物(bp 89−91℃(0.2mm Hgにおいて)、IR(n
eat)cm-1:3400、2900、2250、1650)を得た。実施例3 4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロ ジアミダイト
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した5
00mLの三つ口フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て
、120℃のオーブンで1時間乾燥する。無水エーテル(150mL)および三
塩化リン(67.5mmol)をフラスコに添加する。エーテル(50mL)に
溶解した4−シアノブテン−1−オール(50mmol)を、0℃(氷浴)で撹
拌しながら、圧均等化用添加用漏斗を使用して、徐々に反応フラスコに添加する
。添加終了後、氷浴を除去し、反応混液を室温で3時間撹拌する。その後、反応
混液を500mLのフラスコに移し、減圧下で濃縮する。
無水エーテル(200mL)に溶解した生成物に、ジイソプロピルアミン(5
7.7mL)を、0℃、アルゴン下で添加する。添加終了後、室温で16時間、
撹拌を続ける。反応混液を濾過および濃縮して、標記の化合物を得る。実施例4 保護されたホスホルアミダイト単量体の製造
A.5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル− N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁(septum)を装
備した250mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器
具は全て、120℃で1時間乾燥する。5’−O−DMT−チミジン(7mmo
l)、および、5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾール(5.6mm
ol)、および、無水アセトニトリル(50mL)をフラスコに添加する。この
混合液を室温で撹拌し、アセトニトリル(50mL)に溶解した4−シアノ−2
−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(
10.5mmol)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を
酢酸エチル(100mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄
し、ブラインで処理し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶液を減圧下で濃縮
し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記の化合
物を得る。
B.N2−イソブチリル−5’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−3 ’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダ イト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N2−イソブチリル−5’−O−DM
T−2’−デオキシグアノシン(5mmol)、および、ジイソプロピルアンモ
ニウムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL
)を添加する。この混合液を室温で撹拌し、アセトニトリル(50mL)に溶解
した4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホス
ホロジアミダイト(7.5mmol)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液
を濾過し、濾液を酢酸エチル(100mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液で1度洗浄し、ブラインで処理し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶
液を減圧下で濃縮し、得られた生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグ
ラフィーにより精製する。
C.N6−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−3’ −O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイ ト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N6−ベンゾイル−5’−O−DMT
−2’−デオキシアデノシン(5mmol)、および、ジイソプロピルアンモニ
ウムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL)
を添加する。この混合液を室温で撹拌し、アセトニトリル(50mL)に溶解し
た4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホ
ロジアミダイト(6mmol)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過
および濃縮し、得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー
により精製して、標記の化合物を得る。
D.N4−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシシチジン−3’− O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト )
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N4−ベンゾイル−5’−O−DMT
−2’−デオキシシチジン(5mmol)、および、ジイソプロピルアンモニウ
ムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL)を
添加する。この混合液を室温で撹拌し、アセトニトリル(50mL)に溶解した
4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロ
ジアミダイト(7.5mmol)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾
過し、濾液を酢酸エチル(100mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶
液で1度洗浄し、ブラインで処理し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶液を
減圧下で濃縮し、得られた生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーにより精製する。実施例5 カップリングの方法
A.T−Tホスホロチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−DMT−チ
ミジン、100ミリグラム(4mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロ
ロ酢酸のジクロロメタン溶液(容量/容量)を添加して、5’−水酸基を脱保護
する。生成物を、ジクロロメタン、次いでアセトニトリルで洗浄する。その後、
0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニ
ル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、およ
び、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分
間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeauc
age試薬のアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。この硫化工
程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢
酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/
THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニト
リルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で24
時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、T−Tのホスホロチオエート
二量体を得る。
B.C−Tホスホロチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−DMT−チ
ミジン(100mg、4mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸
のCH2Cl2溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物を
アセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN4−ベンゾイル−5’−O−
DMT−2’−デオキシシチジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N
,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0
.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応
させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試
薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を
、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/
ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/TH
Fを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリル
で洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で24
時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、dC−Tのホスホロチオエ
ート二量体を得る。
C.T−Tホスホジエステル二量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(100
mg、4mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶
液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をCH2Cl2、次
いでアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−DMT−チミジ
ン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホル
アミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールの
アセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリ
ルで洗浄し、その後、0.1Mのヨウ素の水/ピリジン/THF(2:20:8
0、v/v/v)溶液を添加して、室温で5分間反応させる。支持体をアセトニ
トリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液
で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基
をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で24
時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、T−Tのホスホジエステル
二量体を得る。
D.5’−TTTTTTT−3’ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(50m
g、2mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液
(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで
洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−
シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセト
ニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を
添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、
0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反
応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニト
リル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で
洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基を
キャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
この一連の過程を更に5回繰り返し、完全に保護されたチミジン七量体を得る
。化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温
で処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、TTTTTTTのホスホロチ
オエート七量体を得る。
E.5’−d(GACT)−3’ホスホロチオエート四量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(50m
g、2mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液
(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで
洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−
シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセト
ニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を
添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、
0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反
応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニト
リル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で
洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基を
キャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱
保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN4−ベン
ゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシシチジン−3’−O−(4−シアノ
−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリ
ル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し
、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.0
5MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させ
る。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、
次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で洗浄し
、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャッ
プする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱
保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN6−ベン
ゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−3’−O−(4−シア
ノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)の無水アセト
ニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を
添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、
0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反
応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニト
リル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で
洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基を
キャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN2−
イソブチリル−5’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−3’−O−(4
−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセ
トニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液
を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後
、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間
反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニ
トリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液
で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基
をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で24時間、インキュベートする。。水溶液を濾過
し、減圧下で濃縮して、5’−dG−dA−dC−T−3’のホスホロチオエー
ト四量体を得る。実施例6 1−トリメチルシリルチオキシ−4−シアノ−2−ブテン
1−シアノ−2,3−ブタジエン(0.1mol)、および、トリメチルシリ
ルチオール(0.1mol)をアルゴン雰囲気下で無水エーテル(300ml)
に添加して撹拌した混合液に、触媒量の酢酸ロジウムを室温で添加する。24時
間後、反応混液を濾過および濃縮して、標記の化合物を得る。実施例7 4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルチオホス ホロジアミダイト
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した5
00mLの三つ口フラスコを、120℃のオーブンで1時間乾燥した後、組み立
てる。フラスコは、冷却の間アルゴンで満たし、フラスコ内をアルゴン雰囲気に
保持する。無水エーテル(150mL)および三塩化リン(67.5mmol)
をフラスコに添加する。1−トリメチルシリル−4−シアノ−2−ブテン(50
mmol)のエーテル(50mL)溶液を、0℃(氷浴)で撹拌しながら、圧均
等化用添加用漏斗を使用して、徐々に反応フラスコに添加する。添加終了後、氷
浴を除去し、反応混液を室温で3時間撹拌する。その後、反応混液を500mL
のフラスコに移し、減圧下で濃縮する。
得られた残渣を無水エーテル(200mL)に溶解し、ジイソプロピルアミン
(57.7mL)を、0℃、アルゴン下で添加する。添加終了後、室温で16時
間、撹拌を続ける。反応混液を濾過および濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製して、標記の化合物を得る。実施例8 保護されたホスホロチオアミダイト単量体の製造
A.5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル− N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した2
50mLの二口フラスコを、120℃のオーブンで1時間乾燥した後、組み立て
る。フラスコは、冷却の間アルゴンで満たし、フラスコ内をアルゴン雰囲気に保
持する。フラスコに、5’−O−DMT−チミジン(7mmol)、および、5
−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾール(5.6mmol)、および、
無水アセトニトリル(50mL)を添加する。この混合液を室温で撹拌し、4−
シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルチオホスホロ
ジアミダイト(10.5mmol)のアセトニトリル(50mL)溶液を添加す
る。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル(100mL)で希釈
し、冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度洗浄し、ブラインで処理し、乾燥す
る(MgSO4)。乾燥した溶液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲル
フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、標記の化合物を得る。
B.N2−イソブチリル−5’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−3 ’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルア ミダイト)
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した2
50mLの二口フラスコを、120℃のオーブンで1時間乾燥した後、組み立て
る。フラスコは、冷却の間アルゴンで満たし、フラスコ内をアルゴン雰囲気に保
持する。フラスコに、N2−イソブチリル-5’−O−DMT−2’−デオキシ
グアノシン(5mmol)およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(4
mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL)を添加する。この混合
液を室温で撹拌し、4−シアノ−2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライ
ソプロピルチオホスホロジアミダイト(7.5mmol)のアセトニトリル(5
0mL)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル
(100mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄し、ブライ
ンで処理し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶液を濾過し、得られた濾液を
減圧下で濃縮する。得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーにより精製して、標記の化合物を得る。
C.N6−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−3’ −O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミ ダイト)
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した2
50mLの二口フラスコを、120℃のオーブンで1時間乾燥した後、組み立て
る。フラスコは、冷却の間アルゴンで満たし、フラスコ内をアルゴン雰囲気に保
持する。フラスコに、N6−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシア
デノシン(5mmol)、および、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(
4mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL)を添加する。この混
合液を室温で撹拌し、4−シアノ−2−ブテニル-N,N,N’,N’−テトラ
イ
ソプロピルチオホスホロジアミダイト(6mmol)のアセトニトリル(50m
L)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過および濃縮し、得られた残
渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、標記の化
合物を得る。
D.N4−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシシチジン−3’− O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダ イト)
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した2
50mLの二口フラスコを、120℃のオーブンで1時間乾燥した後、組み立て
る。フラスコは、冷却の間アルゴンで満たし、フラスコ内をアルゴン雰囲気に保
持する。フラスコに、N4−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシシ
チジン(5mmol)、および、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(4
mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL)を添加する。この混合
液を室温で撹拌し、4−シアノ−2−ブテニル-N,N,N’,N’−テトライ
ソプロピルチオホスホロジアミダイト(7.5mmol)のアセトニトリル(5
0mL)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル
(100mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄し、ブライ
ンで処理する。有機層を乾燥(MgSO4)および濾過し、濾液を減圧下で濃縮
する。得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精
製し、標記の化合物を得る。実施例9 カップリングの方法
A.T−Tホスホロジチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−DMT−チ
ミジン、100ミリグラム(4mmole)(市販品を入手可能)をガラス反応
器に移し、2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’
−水酸基を脱保護する。生成物を、ジクロロメタン、次いでアセトニトリルで洗
浄する。0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−2
−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)のアセトニトリ
ル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し
、室温で5分間反応させる。生成物を、アセトニトリルで洗浄し、その後、0.
05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させ
る。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、
次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチル
イミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成
物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有するCPGを、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で2
4時間、処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、T−Tのホスホロジチオ
エート二量体を得る。
B.C−Tホスホロジチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(100
mg、4mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶
液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリル
で洗浄する。その後、0.2MのN4−ベンゾイル−5’−O−DMT−2’−
デオキシシチジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプ
ロピルチオホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1
H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生
成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセト
ニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回
、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/
THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加し
て、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する
。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で24
時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、dC−Tのホスホロジチオ
エート二量体を得る。
C.T−Tホスホロチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(100
mg、4mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶
液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をCH2Cl2、次
いでアセトニトリルで洗浄する。0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’
−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミ
ダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセ
トニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで
洗浄し、その後、0.1Mのヨウ素の水/ピリジン/THF(2:20:80、
v/v/v)溶液を添加して、室温で5分間反応させる。支持体をアセトニトリ
ル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で洗
浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキ
ャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有するCPGを、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で2
4時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、T−Tのホスホロチオエ
ート二量体を得る。
D.5’−TTTTTTT−3’ホスホロジチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(50m
g、2mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液
(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで
洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−
シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)のア
セトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶
液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その
後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分
間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセト
ニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶
液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸
基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
この一連の過程を更に5回繰り返し、完全に保護されたチミジン七量体を得る
。化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、TTTTTTTのホスホロ
チ
オエート七量体を得る。
E.5’−d(GACT)−3’ホスホロジチオエート四量体の合成
エステル結合を介してCPGに結合した5’−O−DMT−チミジン(50m
g、2mmole)をガラス反応器に移し、2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液
(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで
洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−
シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)のア
セトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶
液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その
後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分
間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセト
ニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶
液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸
基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱
保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN4−ベン
ゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシシチジン−3’−O−(4−シアノ
−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)のアセトニ
トリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添
加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0
.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応
させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリ
ル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶液で洗
浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキ
ャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のCH2Cl2溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱
保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN6−ベン
ゾイル−5’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−3’−O−(4−シア
ノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)の無水ア
セトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶
液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その
後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分
間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセト
ニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)溶
液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸
基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN2−
イソブチリル−5’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−3’−O−(4
−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルチオホスホルアミダイト)の
アセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル
溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、そ
の後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5
分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセ
トニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8、v/v/v)
溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水
酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、65℃で24
時間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、5’−dG−dA−dC−
T−3’のホスホロチオエート四量体を得る。実施例10 標準的な脱保護の方法
A.NH4OHを使用する脱保護
ホモチミジンホスホロチオエート十二量体を、実施例5(D)の方法により合
成した。十二量体を、飽和NH4OHで、24時間、65℃で処理し、質量分析
法により測定された、完全に脱保護された生成物を得た。
B.CH3NH2を使用する脱保護
ホモチミジンホスホロチオエート十二量体を、実施例5(D)の方法により合
成した。十二量体を、CH3NH2で、55℃で処理し、質量分析法により測定さ
れた、完全に脱保護された生成物を得た。実施例11 ホスホロチオエートホモT二十量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−DMT−チ
ミジン(市販品を入手可能)をガラス反応器に移す。CPGに結合した5’−O
−DMT−チミジンをアセトニトリルで30秒間、次いでジクロロメタンで30
秒間、洗浄した。CPGに結合した5’−O−DMT−チミジンをジクロロ酢酸
(3%)のジクロロメタン溶液で2分間処理し、次いで、アセトニトリルで3分
間洗浄した。
得られたCPGに結合した脱トリチル化されたチミジンを、等量の5’−O−
DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプ
ロピルホスホルアミダイト)(0.2M)のアセトニトリル溶液、および、1H
−テトラゾール(0.4M)のアセトニトリル溶液と、同時に、室温で5分間反
応させた。試薬を濾過により除去(drain away)し、この工程を更に5分間繰り
返した。得られたCPGに結合したT−T二量体をアセトニトリルで30秒間洗
浄し、Beaucage試薬(0.5M)のアセトニトリル溶液で、3分間、酸化した
。この硫化工程を更に3分間繰り返した。CPGをアセトニトリルで30秒間洗
浄し、次いで、等量の、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)、および、
N−メチルイミダゾール/THFで1分間処理し、未反応の部位をキャップした
。上記の洗浄、脱トリチル化、単量体サブユニットとの反応、酸化、およびキャ
ッピングの過程を18回繰り返して、二十量体ホモチミジンホスホロチオエート
オリゴマー化合物を合成した。
CPGに結合した二十量体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、室温で2
時間処理した。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、ホスホロチオエートホモT
二十量体を得た。
合成は1μmoleのスケールで実施し、脱離したp,p’−ジメトキシトリ
フェニルメチルカチオンの分光光度定量による測定により、全体のカップリング
効率が99%より大きいことが見出された。実施例12 ホスホロチオエート混合配列二十量体(GCC−CAA−GCT−GGC−AT C−CGT−CA)の合成
実施例11の方法に次いで、実施例4(a、b、c、およびd)の保護された
単量体サブユニット:5’−O−DMT−チミジン−3’−O−(4−シアノ−
2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト);N2−イソブチ
リル−5’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−3’−O−(4−シアノ
−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト);N6−ベンゾ
イル−5’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−3’−O−(4−シアノ
−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト);N4−ベンゾ
イル−5’−O−DMT−2’−デオキシシチジン−3’−O−(4−シアノ−
2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)を使用して、混合
配列二十量体(GCC−CAA−GCT−GGC−ATC−CGT−CA)を合
成した。
合成は1μmoleのスケールで実施し、二十量体を、NH4OH水溶液で、
室温で1時間処理し、次いで20時間、60℃に加熱して、脱保護した。粗オリ
ゴマーを逆相HPLCにより精製した。更に、キャピラリーゲル電気泳動により
、生成物を確認した。実施例13 シリル含有ヌクレオシドの合成
本発明の代表的なシリル含有ヌクレオシドの合成を、下記のスキーム3に示す
。
まず、市販品の、1−アセトキシ−1,3−ブタジエン(化合物1)を、Rh2
Cl2(CO)4の存在下で(R9)3Si−Hと反応させ、化合物2を生成する
。K2CO3のメタノール溶液を使用して水酸基を脱保護し、化合物3を得た。そ
の後、化合物3を0℃でPCl3のエーテル溶液と反応させて化合物4を生成し
、更にそれをイソプロピルアミンのエーテル溶液と反応させて、化合物5を生成
する。その後、化合物5を、室温で、テトラゾールのCH2Cl2溶液の存在下で
、5’−DMTヌクレオシド6と反応させ、シントン7を生成する。実施例14 1,1,1−トリフェニル−4−アセトキシ−1−シラ−2−ブテンの製造
1−アセトキシ−1,3−ブタジエン(0.1mol)、トリフェニルシラン
(0.1mol)、および、Rh2Cl2(CO)4(194.5mg、0.62
5mol)のトルエン(100mL)溶液を、室温で、アルゴン雰囲気下で、3
日間撹拌した。反応混液を脱色炭で処理し、混合液を短時間煮沸する。冷却後、
反応混液をセライトを通じて濾過する。溶液を濃縮して標記の化合物を得る。実施例15 1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテン−4−オールの製造
実施例14による粗アセトキシ化合物を250mLのメタノールに溶解し、2
5.0gの炭酸カリウムの全量を一度に添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾
過および濃縮する。濃縮残渣を水/酢酸エチル(200/200ml)に分配す
る。有機層を分取し、ブラインで洗浄し、乾燥および濃縮する。粗生成物をシリ
カゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーで精製し、純粋な生成物を得る
。実施例16 1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピル ビスホスホルアミダイトの製造
マグネティックスターラー、ガラス栓、およびアルゴンの挿入口を装備した5
00mLの三つ口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全
て、120℃のオーブンで1時間乾燥する。反応フラスコに、無水エーテル(1
50mL)および三塩化リン(67.5mmol)を充填する。1,1,1−ト
リフェニル−1−シラ−2−ブテン−4−オール(50mmol)のエーテル(
50mL)溶液を、0℃(氷浴)で撹拌しながら、圧均等化用添加用漏斗を使用
して、徐々に反応フラスコに添加する。添加終了後、氷浴を除去し、反応混液を
3時間撹拌する。その後、反応混液を500mLのフラスコに移し、減圧下で濃
縮する。
この生成物を無水エーテル(200mL)に溶解し、ジイソプロピルアミン(
57.7mL)を、0℃、アルゴン下で添加する。添加終了後、室温で16時間
(一晩)、撹拌を続ける。反応混液を濾過および濃縮して、標記の化合物を得る
。実施例17 保護されたホスホルアミダイト単量体の製造
A.5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン−3’−O−(1 ,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホ スホルアミダイト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、5’−O−(4,4’−ジメトキシト
リチル)チミジン(7mmol)、および、5−(4−ニトロフェニル)−1H
−テトラゾール(5.6mmol)を充填する。無水アセトニトリル(50mL
)を添加する。この混合液をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌し、1,1,1−ト
リフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダ
イト(10.5mmol)のアセトニトリル(50mL)溶液を添加する。2時
間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル(100mL)で希釈し、冷飽
和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄し、ブラインで処理し、乾燥する(MgS
O4)。乾燥した溶液を減圧下で濃縮し、粘性のある、泡立った液体を得る。粗
生成物をシリカゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生
成物を得る。精製の間、トリエチルアミン(1%)を使用する。
B.N2−イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2 ’−デオキシグアノシン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ− 2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N2−イソブチリル−5’−O−(4
,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシグアノシン(5mmol)、お
よび、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無
水アセトニトリル(50mL)を添加する。この混合液をアルゴン雰囲気下、室
温で撹拌し、1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジ
イソプロピルホスホルアミダイト(7.5mmol)のアセトニトリル(50m
L)溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル(1
00mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄し、ブラインで
処理し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶液を減圧下で濃縮し、得られた生
成物をシリカゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。精
製の間、トリエチルアミン(1%)を使用する。
C.N6−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’ −デオキシアデノシン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2 −ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N6−ベンゾイル−5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシアデノシン(5mmol)、およ
び、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無水
アセトニトリル(50mL)を添加する。この混合液をアルゴン雰囲気下、室温
で撹拌し、1,1,1−トリフェニル-1−シラ−2−ブテニル-N,N−ジイソ
プロピルホスホルアミダイト(6mmol)のアセトニトリル(50mL)溶液
を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過および濃縮し、得られた生成物をシ
リカゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。精製の間、
トリエチルアミン(1%)を使用する。
D.N4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’ −デオキシシチジン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2− ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)
マグネティックスターラー、アルゴンガス挿入口、および隔壁を装備した25
0mLの二口フラスコを、アルゴン雰囲気下で組み立てる。ガラス器具は全て、
120℃で1時間乾燥する。フラスコに、N4−ベンゾイル−5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(5mmol)、および
、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(4mmol)を充填する。無水ア
セトニトリル(50mL)を添加する。この混合液をアルゴン雰囲気下、室温で
撹拌し、1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソ
プロピルホスホルアミダイト(7.5mmol)のアセトニトリル(50mL)
溶液を添加する。2時間撹拌後、反応混液を濾過し、濾液を酢酸エチル(100
mL)で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液で1度洗浄し、ブラインで処理
し、乾燥する(MgSO4)。乾燥した溶液を減圧下で濃縮し、得られた生成物
をシリカゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。精製の
間、トリエチルアミン(1%)を使用する。実施例18 カップリングの方法
A.T−Tホスホロチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(100mg、4mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジ
クロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護
する。生成物を、ジクロロメタン、次いでアセトニトリルで洗浄する。その後、
0.2Mの5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン−3’−O−
(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピ
ルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テト
ラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をア
セトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル
溶液を添加し、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、
繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1
:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応
の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で90分間処理し
、その後、55℃で12時間、インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で
濃縮した後、室温において、1.0Mのテトラ−n−ブチルフッ化アンモニウム
のTHF溶液で処理し、T−Tのホスホロチオエート二量体を得る。
B.C−Tホスホロチオエート二量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(100mg、4mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジ
クロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護
する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN4−ベンゾイ
ル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン−
3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジ
イソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの
1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。
生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセ
トニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1
回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン
/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加
して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄す
る。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で90分間処理し
、その後、55℃で12時間、インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で
濃縮した後、室温において、1.0Mのテトラ−n−ブチルフッ化アンモニウム
のTHF溶液で処理し、dC−Tのホスホロチオエート二量体を得る。
D.5’−TTTTTTT−3’ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(50mg、2mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護す
る。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)チミジン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル
−1−シラ−2−ブテニル-N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のア
セトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶
液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その
後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分
間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセト
ニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、
N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップ
する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
この一連の過程を更に5回繰り返し、完全に保護されたチミジン七量体を得る
。化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で90分間、室温
で処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、TTTTTTTのホスホロチ
オエート七量体を得る。
E.5’−d(GACT)−3’ホスホロチオエート四量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチル−チミジン(50mg、2mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジ
クロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護
する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−(4
,4’−ジメトキシトリチル)チミジン−3’−O−(1,1,1−トリフェニ
ル−1−シラ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)の
アセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル
溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、そ
の後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5
分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセ
トニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し
、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャッ
プする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN4−
ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシ
チジン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−N
,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0
.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応
させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試
薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を
、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/
ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/TH
Fを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリル
で洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN6−
ベンゾイル-5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシア
デノシン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル−
N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)の無水アセトニトリル溶液、およ
び、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分
間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeauc
age
試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程
を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸
/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/T
HFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリ
ルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2MのN2−
イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ
グアノシン−3’−O−(1,1,1−トリフェニル−1−シラ−2−ブテニル
−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および
、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間
反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucag
e試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工
程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢
酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/
THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニト
リルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で24時間、インキュベートする。。水溶液を濾過
し、減圧下で濃縮して、5’−dG−dA−dC−T−3’のホスホロチオエー
ト四量体を得る。実施例19 3’−O−レブリニルチミジン
標記の化合物を、G.Kumar,M.S.Poonian,J.Org.Chem.1984,49,4905-49
12に発表された方法に従って合成した。実施例20 3’−O−レブリニル−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン
5’−DMT−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン(71.6g
、0.112mol)を1000mlのフラスコに移し、無水ジオキサン(70
0
ml)を添加して、溶液が均一化するまで撹拌する。その後、ジシクロヘキシル
カルボジイミド(57.8g、0.280mol)、レブリン酸(25.9g、
0.224mol)、および4−ジメチルアミノピリジン(0.56g)を添加
し、マグネティックスターラーを使用して激しく撹拌する。3時間後、反応混液
を濾過し、固形残渣を酢酸エチル(250ml)で洗浄する。濾液を合一し、濃
縮して生成物を得る。
この生成物をジクロロメタン(400ml)に溶解し、2.5%DCAのジク
ロロメタン(160ml)溶液を添加して撹拌する。1時間後、反応混液をジク
ロロメタン(400ml)で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄する。
有機層を分取し、乾燥および濃縮する。粗生成物をシリカゲルを使用したフラッ
シュクロマトグラフィーにより精製し、標記の化合物を得る。実施例21 T−Tホスホロチオエート二量体の合成
3’−O−レブリニルチミジン(5mmole)および1H−テトラゾール(
5mmole)を無水アセトニトリル(25ml)に添加し、アルゴン雰囲気下
、室温で撹拌した溶液に、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジ
ン−3’−O−(4−ジフェニルメチルシリル−2−ブテニル−N,N−ジイソ
プロピルホスホルアミダイト)(6mmole)のアセトニトリル(20ml)
溶液を添加する。3時間撹拌後、硫化試薬(硫黄(200mmole)/トリエ
チルアミン(20mmole)をジクロロメタン(75ml)に入れた混合液)
の全量を一度に添加する。5時間後、反応混液を濾過および濃縮する。粗生成物
を、シリカゲル、および溶出液として酢酸エチル/ヘキサンを使用したフラッシ
ュクロマトグラフィーで精製する。実施例22 3’−O−レブリニル基の脱保護
5’−(O−4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−(O−レブリニル)−
チミジン二量体(35.0g)を、ヒドラジン水和物(10.0g)、ピリジン
(240ml)、および酢酸(240ml)の氷冷溶液に溶解する。10分後、
氷を添加し、ジクロロメタンで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥し
て濾過し、溶媒を除去する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸
エチル/n−ヘキサン(1:1)、その後、酢酸エチル、0.1%−トリエチル
アミン)で精製し、目的の生成物を得る。実施例23 チミジル−チミジン二量体アミダイトの合成
アルゴン雰囲気下で、1H−テトラゾール(5mmol)および4−シアノ−
2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
(30mmol)の無水アセトニトリル(100ml)溶液を、チミジル−チミ
ジン二量体(20mmol)に添加する。2時間後、酢酸エチルを添加し、溶液
を炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出する。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥し
、溶媒を減圧下で除去する。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、目的の
生成物を得る。実施例24 C−T−ホスホロチオエート二量体の合成
3’−O−レブリニルチミジン(5mmole)および1H−テトラゾール(
5mmole)を無水アセトニトリル(25ml)に添加し、アルゴン雰囲気下
、室温で撹拌した溶液に、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’
−デオキシシチジン−3’−O−(4−ジフェニルメチルシリル−2−ブテニル
−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)(6mmole)のアセトニト
リル(20ml)溶液を添加する。3時間撹拌後、硫化試薬(硫黄(200mm
ole)/トリエチルアミン(20mmole)をジクロロメタン(75ml)
に入れた混合液)の全量を一度に添加する。5時間後、反応混液を濾過および濃
縮する。粗生成物を、シリカゲル、および溶出液として酢酸エチル/ヘキサンを
使用したフラッシュクロマトグラフィーで精製する。実施例25 3’−O−レブリニル基の脱保護
5’−(O−4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−(O−レブリニル)−
2’−デオキシシチジニル−チミジン二量体(35.0g)を、ヒドラジン水和
物(10.0g)、ピリジン(240ml)、および酢酸(240ml)の氷冷
溶液に溶解する。10分後、氷を添加し、ジクロロメタンで抽出する。有機層を
硫酸ナトリウムにより乾燥して濾過し、溶媒を除去する。残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー(酢酸エチル/n−ヘキサン(1:1)、その後、酢酸エ
チル、0.1%−トリエチルアミン)で精製し、目的の生成物を得る。実施例26 2’−デオキシシチジニル−チミジン二量体アミダイトの合成
アルゴン雰囲気下で、1H−テトラゾール(5mmol)および4−シアノ−
2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
(30mmol)の無水アセトニトリル(100ml)溶液を、2’−デオキシ
シチジニル−チミジン二量体(20mmol)に添加する。2時間後、酢酸エチ
ルを添加し、溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出する。有機層を硫酸ナトリ
ウムにより乾燥し、溶媒を減圧下で除去する。残渣をカラムクロマトグラフィー
で精製し、目的の化合物を得る。実施例27 d(A−G)−ホスホロチオエート二量体の合成
3’−O−レブリニル−2’−デオキシグアノシン(5mmole)および1
H−テトラゾール(5mmole)を無水アセトニトリル(25ml)に添加し
、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌した溶液に、5’−O−(4,4’−ジメトキ
シトリチル)−2’−デオキシアデノシン−3’−O−(4−ジフェニルメチル
シリル−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)(6mm
ole)のアセトニトリル(20ml)溶液を添加する。3時間撹拌後、硫化試
薬(硫黄(200mmole)/トリエチルアミン(20mmole)をジクロ
ロメタン(75ml)に入れた混合液)の全量を一度に添加する。5時間後、反
応混液を濾過および濃縮する。粗生成物を、シリカゲル、および溶出液として酢
酸エチル/ヘキサンを使用したフラッシュクロマトグラフィーで精製する。実施例28 3’−O−レブリニル基の脱保護
5’−(O−4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−(O−レブリニル)−
2’−デオキシアデノシニル−2’−デオキシグアノシン二量体(35g)を、
ヒドラジン水和物(10.0g)、ピリジン(240ml)、および酢酸(24
0ml)の氷冷溶液に溶解する。10分後、氷を添加し、ジクロロメタンで抽出
する。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥して濾過し、溶媒を除去する。残渣を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/n−ヘキサン(1:1)、
その後、酢酸エチル、0.1%−トリエチルアミン)で精製し、目的の生成物を
得る。実施例29 2’−デオキシアデノシニル−2’−デオキシグアノシン二量体アミダイトの合 成
アルゴン雰囲気下で、1H−テトラゾール(5mmol)および4−シアノ−
2−ブテニル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
(30mmol)の無水アセトニトリル(100ml)溶液を、2’−デオキシ
アデノシニル−2’−デオキシグアノシン二量体(20mmol)に添加する。
2時間後、酢酸エチルを添加し、溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出する。
有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥し、溶媒を減圧下で除去する。残渣をカラム
クロマトグラフィーで精製し、目的の生成物を得る。実施例30 5’−TTTTTTT−3’ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(50mg、2mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護す
る。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−チミジル−チミジン−3’−O−(4−シアノ−
2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)のアセトニトリル
溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、
室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05
MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる
。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次
いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイ
ミ
ダゾール/THFを添加して、末反応の5’−水酸基をキャップする。生成物を
アセトニトリルで洗浄する。
この一連の過程を更に2回繰り返し、完全に保護されたチミジン七量体を得る
。化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で1時間、インキュベートする。水溶液を濾過し、
減圧下で濃縮して、5’−TTTTTTT−3’のホスホロチオエート七量体を
得る。実施例31 5’−d(TTCTAGT)−3’ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(50mg、2mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護す
る。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシアデノシニル−2’−デオキシグ
アノシン−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホ
スホルアミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾ
ールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセト
ニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液
を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰
り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:
1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の
5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−
O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジニル−チミジン
−3’−O−(4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルア
ミダイト)のアセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのア
セトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリル
で洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加し
て、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。
支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)
溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水
酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、0.2Mの5’−
O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−チミジル−チミジン−3’−O−(4
−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)の無水
アセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル
溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、そ
の後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5
分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセ
トニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し
N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップ
する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で24時間、インキュベートする。。水溶液を濾過
し、減圧下で濃縮して、5’−d(TTCTAGT)−3’のホスホロチオエー
ト七量体を得る。実施例32 無水レブリン酸
1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(207g、1mol)
のジエチルエーテル(1.2 l)溶液を、レブリン酸(232g、2mol)
の無水ジエチルエーテル(800ml)溶液に添加した。数分以内に、反応フラ
スコ内で、無色の沈殿の生成、およびわずかな温度上昇が認められた。5時間撹
拌後、濾過により固形物(DCU)を除去し、溶媒を減圧下で除去した。220
gの半固体生成物(室温で)を得、更なる精製をせずに次の反応に使用した。実施例33 N4−ベンゾイル−3’−O−レブリニル−2’−デオキシシチジン
無水レブリン酸(51.4g、240mmol)を、5’−DMT−N4−ベ
ンゾイル−デオキシシチジン(76g、120mmol)の無水ピリジン(24
0ml)溶液に添加した。4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(390m
g)を添加した。2時間後、ほとんどのピリジンを真空下で除去し、残存した濃
色の溶液を氷/水(約2kg)に注ぎ、数時間撹拌した。生成した沈殿を濾過に
より単離し、水(2l)で洗浄し、真空下で乾燥した。更に水分を除去するため
、固形物をCH2Cl2(300ml)に溶解した。有機層を分取し、Na2SO4
により乾燥し、蒸発させた。残渣を、p−トルエンスルホン酸(21g)の酢酸
エチル/メタノール(75ml、85:15、v/v)溶液に溶解した。数分(
15−20分)後、フラスコの内容物が凝固した。微細粉砕した固形物を、ジエ
チルエーテル(総量500mlのエーテル)で抽出した。固形物をCH2Cl2(
1l)に溶解し、NaHCO3水溶液(1M)で抽出した。この工程の間に生成
した固形物(生成物)を濾過により分取した。有機層をNa2SO4により乾燥し
、真空下で濃縮した。約90%の溶媒を除去した後、更に生成物を濾過により単
離した。固形画分を合一する:44g(85%)。CH2Cl2溶液から、更に生
成物を回収することが可能である。実施例34 3’−O−レブリニルチミジン
5’−ジメトキシトリチルチミジン(272.3g、500mmol)の無水
ピリジン(500ml)溶液を無水レブリン酸(214g、1mol)のピリジ
ン(500ml)溶液に添加した。ジメチルアミノピリジン(DMAP、1g)
を添加した。5時間後、ほとんどの溶媒をエバポレーションにより除去し、残存
した濃色の油を氷(2kg)/NaHCO3(1M、1l)に注ぎ、数時間撹拌
した。油性/固形沈殿を濾過により単離し、水で数回洗浄した。固形物を真空下
で乾燥した。生成物から更に水分を除去するため、固形物をCH2Cl2に溶解し
、水層を分離し、有機層をNa2SO4により乾燥し、蒸発させた。微細粉砕した
固形物を、p−トルエンスルホン酸(80g)の酢酸エチル/メタノール(85
:15、500ml)溶液に添加した。20分後、反応混液を飽和NaHCO3
(900ml)溶液に添加した(CO2発生)。この混合液にジエチルエーテル
(5
00ml)を添加した。二層を分離し、有機層から希NaHCO3溶液で再抽出
した。合一した水層をジエチルエーテルで抽出した。生成物を単離するため、水
層をCH2Cl2またはCHCl3で数回抽出した。CH2Cl2画分を合一し、N
a2SO4により乾燥し、濃縮した。残渣を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶させ
た(収率:55−60%)。実施例35 N−ベンゾイル−3’−O−レブリニル−2’−デオキシアデノシン
無水レブリン酸(51.4g、240mmol)を、5’−DMT−N−ベン
ゾイル−デオキシアデノシン(120mmol)の無水ピリジン(240ml)
溶液に添加した。4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(390mg)を添
加した。2時間後、ほとんどのピリジンを真空下で除去し、残存した濃色の溶液
を氷/水(約2kg)に注ぎ、数時間撹拌した。生成した沈殿を濾過により単離
し、水(2l)で洗浄し、真空下で乾燥した。更に水分を除去するため、固形物
をCH2Cl2(300ml)に溶解した。有機層を分取し、Na2SO4により乾
燥し、蒸発させた。残渣を、p−トルエンスルホン酸(21g)の酢酸エチル/
メタノール(75ml、85:15、v/v)溶液に溶解した。数分(15−2
0分)後、フラスコの内容物が凝固した。微細粉砕した固形物を、ジエチルエー
テル(総量500mlのエーテル)で抽出した。固形物をCH2Cl2(1l)に
溶解し、NaHCO3水溶液(1M)で抽出した。この工程の間に生成した固形
物(生成物)を濾過により分取した。有機層をNa2SO4により乾燥し、真空下
で濃縮した。固形画分を合一した:44g(85%)。実施例36 N2−イソブチリル−3’−O−レブリニル−2’−デオキシグアノシン
無水レブリン酸(51.4g、240mmol)を、5’−DMT−N2−イ
ソブチリル−デオキシグアノシン(120mmol)の無水ピリジン(300m
l)溶液に添加した。4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(390mg)
を添加した。2時間後、ほとんどのピリジンを真空下で除去し、残存した濃色の
溶液を氷/水(約2kg)に注ぎ、数時間撹拌した。生成した沈殿を濾過により
単離し、水(2l)で洗浄し、真空下で乾燥した。更に水分を除去するため、固
形物をCH2Cl2(300ml)に溶解した。有機層を分取し、Na2SO4によ
り乾燥し、蒸発させた。残渣を、p−トルエンスルホン酸(21g)の酢酸エチ
ル/メタノール(75ml、85:15、v/v)溶液に溶解した。数分(15
−20分)後、フラスコの内容物が凝固した。微細粉砕した固形物を、ジエチル
エーテル(総量500mlのエーテル)で抽出した。固形物をCH2Cl2(1l
)に溶解し、NaHCO3水溶液(1M)で抽出した。この工程の間に生成した
固形物(生成物)を濾過により分取した。有機層をNa2SO4により乾燥し、真
空下で濃縮した。固形画分を合一し、生成物を得た。実施例37 β−シアノエチルホスホロジクロリダイト
この化合物をOgilvie,K.K.Can.J.Chem.58,2686(1980)に報告された方法
で合成した。実施例38 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニル チミジン−5’−イルホスホロチオエート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン(41g、63mmol)を、無水ピリジン(100ml)と共
蒸発させた後、無水THF(200ml)に溶解し、4Aモレキュラーシーブを
添加し、15分間放置した。2−シアノエチルホスホロジクロリダイト(11.
9g、69mmol)を、1,2,4−トリアゾール(9.6g、138mmo
l)およびピリジン(11.2ml、138mmol)を無水THF(300m
l)に添加して撹拌した懸濁液に、−35℃で添加する。10分後、上記の5’
−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシ
シチジンの無水溶液を、30分間にわたり、滴下により添加した。更に10分後
、3’−O−レブリニルチミジン[21.0g、62mmol、あらかじめピリ
ジン(50ml)と共沸したもの]の無水THF(100ml)溶液を、10分
間にわたって添加し、更に20分後、混合液を室温まで暖まらせた。60分後、
Beaucage試薬(40.0g、200mmol)を添加し、生成物を15分間撹
拌した。ピリジン(20ml)を添加し、反応混液を濾過した。固形物をEtO
Acで洗浄し、合一した濾液を減圧下で濃縮した。残渣のEtOAc(1000
ml)溶液を飽和炭酸水素ナトリウム(2x300ml)で洗浄し、乾燥(Na2
SO4)および真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製
し、EtOAcで溶出した好適な画分を回収および減圧濃縮し、無色のガラス質
である、標記の化合物を得た。実施例39 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−チミジン−5’−イル ホスホロチオエート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニ
ルチミジン−5’−イルホスホロチオエート(46.8g、42mmol)を、
ヒドラジン一水和物(11.5ml)の酢酸−ピリジン(1:2 v/v、pH
5.1、345ml)の氷冷溶液に溶解した。混合液を室温まで暖まらせ、計3
0分後、生成物を氷(2000ml)に注いだ。氷を溶解させ、生成した無色の
沈殿を、濾過により回収した。固形物を水で洗浄した後、CH2Cl2(600m
l)に溶解し、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(200ml)で洗浄し、
乾燥(Na2SO4)および真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルで分画し、Et
OAcで溶出した画分を合わせて蒸発させ、無色のガラス質である、標記の化合
物(61%)を得た。実施例40 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−チミジン−5’−イル ホスホロチオエートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホス ホルアミダイト
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−チミジン−5’−イ
ル−ホスホロチオエート(8.54g、8.5mmol)を、無水ジオキサン(
3
0ml)と共蒸発させた後、CH2Cl2(120ml)に再度溶解し、ビス(ジ
イソプロピルアミノ)−4−シアノ−2−ブテニルオキシホスファイン(29.
7mmol)、次いで1−H−テトラゾール(0.89g、12.8mmol)
を添加した。混合液を室温で1時間撹拌した後、CH2Cl2(200ml)で希
釈し、氷冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(200ml)で抽出した。有機層を
乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。残渣のEtOAc−ヘキサン(7:
3 v/v、30ml)溶液を、同じ溶媒系で充填したシリカゲルのショートカ
ラムに通した。カラムを同じ溶媒で洗浄し、生成物を含有する画分を回収し、真
空下で濃縮して、油を得た。油をCH2Cl2(30ml)に溶解し、ヘキサン(
200ml)を、渦を巻かせながら(with swirling)、徐々に添加した。生成
した無色の油から、上清をデカントにより除去し、その手順を繰り返した。残渣
をCH2Cl2(10ml)に溶解し、溶液を減圧下で濃縮して、標記の化合物を
得た。実施例41 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニル −N−ベンゾイル−2−デオキシアデノシン−5’−イル−ホスホロチオエート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン(41g、63mmol)を、無水ピリジン(100ml)と共
蒸発させた後、無水THF(200ml)に溶解し、4Aモレキュラーシーブを
添加し、15分間放置した。1,2,4−トリアゾール(9.6g、138mm
ol)およびピリジン(11.2ml、138mmol)を無水THF(300
ml)に添加して撹拌した懸濁液に、2−シアノエチルホスホロジクロリダイト
(11.9g、69mmol)を、−35℃で添加した。10分後、上記の5’
−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシ
シチジンの無水溶液を、30分間にわたり、滴下により添加した。更に10分後
、3’−O−レブリニル−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン[62m
mol、あらかじめピリジン(50ml)と共沸したもの]の無水THF(10
0ml)溶液を、10分間にわたって添加し、更に20分後、混合液を室温まで
暖まらせた。60分後、Beaucage試薬(40.0g、200mmol)を添加
し、
生成物を15分間撹拌した。ピリジン(20ml)を添加し、反応混液を濾過し
た。固形物をEtOAcで洗浄し、合一した濾液を減圧下で濃縮した。残渣のE
tOAc(1000ml)溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2x300m
l)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)および真空下で濃縮した。残渣をシリカゲル
クロマトグラフィーで精製し、EtOAcで溶出した好適な画分を回収し、減圧
濃縮して、標記の化合物を得た。実施例42 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N−ベンゾイル−2’ −デオキシアデノシン−5’−イル−ホスホロチオエート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニ
ル−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−5’−イル−ホスホロチオエ
ート(42mmol)を、ヒドラジン一水和物(11.5ml)の酢酸−ピリジ
ン(1:2 v/v、pH5.1、345ml)の氷冷溶液に溶解した。混合液
を室温まで暖まらせ、計30分後、生成物を氷(2000ml)に注いだ。氷を
溶解させ、生成した無色の沈殿を、濾過により回収した。固形物を水で洗浄した
後、CH2Cl2(600ml)に溶解し、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液
(200ml)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)および真空下で濃縮した。残渣を
シリカゲルで分画し、EtOAcで溶出した画分を合わせて蒸発させ、標記の化
合物を得た。実施例43 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N−ベンゾイル−2’ −デオキシアデノシン−5’−イル−ホスホロチオエートの4−シアノ−2−ブ テニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N−ベンゾイル−2
’−デオキシアデノシン−5’−イル−ホスホロチオエート(8.54g、8.
5mmol)を、無水ジオキサン(30ml)と共蒸発させた後、CH2Cl2(
120ml)に再度溶解し、ビス(ジイソプロピルアミノ)−4−シアノ−2−
ブテニルオキシホスファイン(29.7mmol)、次いで1−H−テトラゾー
ル(0.89g、12.8mmol)を添加した。混合液を室温で1時間撹拌し
た後、CH2Cl2(200ml)で希釈し、氷冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液
(200ml)で抽出した。有機層を乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃縮した
。残渣のEtOAc−ヘキサン(7:3 v/v、30ml)溶液を、同じ溶媒
系で充填したシリカゲルのショートカラムに通した。カラムを同じ溶媒で洗浄し
、生成物を含有する画分を回収し、真空下で濃縮して、油を得た。油をCH2C
l2(30ml)に溶解し、ヘキサン(200ml)を、渦を巻かせながら、徐
々に添加した。生成した無色の油から、上清をデカントにより除去し、その手順
を繰り返した。残渣をCH2Cl2(10ml)に溶解し、溶液を減圧下で濃縮し
て、標記の化合物を得た。実施例44 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニル −N2−イソブチリル−2−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチオエ ート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン(41g、63mmol)を、無水ピリジン(100ml)と共
蒸発させた後、無水THF(200ml)に溶解し、4Aモレキュラーシーブを
添加し、15分間放置した。1,2,4−トリアゾール(9.6g、138mm
ol)およびピリジン(11.2ml、138mmol)を無水THF(300
ml)に添加して撹拌した懸濁液に、2−シアノエチルホスホロジクロリダイト
(11.9g、69mmol)を、−35℃で添加した。10分後、上記の5’
−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシ
シチジンの無水溶液を、30分間にわたり、滴下により添加した。更に10分後
、3’−O−レブリニル−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン[6
2mmol,あらかじめピリジン(50ml)と共沸したもの]の無水THF(
1
00ml)溶液を、10分間にわたって添加し、更に20分後、混合液を室温ま
で暖まらせた。60分後、Beaucage試薬(40.0g、200mmol)を添
加し、生成物を15分間撹拌した。ピリジン(20ml)を添加し、反応混液を
濾過した。固形物をEtOAcで洗浄し、合一した濾液を減圧下で濃縮した。残
渣のEtOAc(1000ml)溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2x3
00ml)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)および真空下で濃縮した。残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィーで精製し、EtOAcで溶出した好適な画分を回収し
、減圧濃縮して、標記の化合物を得た。実施例45 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N2−イソブチリル− 2’−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチオエート
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−3’−O−レブリニ
ル−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチ
オエート(42mmol)を、ヒドラジン一水和物(11.5ml)の酢酸−ピ
リジン(1:2 v/v、pH5.1、345ml)の氷冷溶液に溶解した。混
合液を室温まで暖まらせ、計30分後、生成物を氷(2000ml)に注いだ。
氷を溶解させ、生成した無色の沈殿を、濾過により回収した。固形物を水で洗浄
した後、CH2Cl2(600ml)に溶解し、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液(200ml)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)および真空下で濃縮した。残
渣をシリカゲルで分画し、EtOAcで溶出した画分を合一および濃縮し、標記
の化合物を得た。実施例46 5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオ キシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N2−イソブチリル− 2’−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチオエートの4−シアノ−2 −ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デ
オキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N2−イソブチリル
−2’−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチオエート(8.54g、
8.5mmol)を、無水ジオキサン(30ml)と共蒸発させた後、CH2C
l2(120ml)に再度溶解し、ビス(ジイソプロピルアミノ)−4−シアノ
−2−ブテニルオキシホスファイン(29.7mmol)、次いで1−H−テト
ラゾール(0.89g、12.8mmol)を添加した。混合液を室温で1時間
撹拌した後、CH2Cl2(200ml)で希釈し、氷冷飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液(200ml)で抽出した。有機層を乾燥し(Na2SO4)、減圧下で濃
縮した。残渣のEtOAc−ヘキサン(7:3 v/v、30ml)溶液を、同
じ溶媒系で充填したシリカゲルのショートカラムに通した。カラムを同じ溶媒で
洗浄し、生成物を含有する画分を回収し、真空下で濃縮して、油を得た。油をC
H2Cl2(30ml)に溶解し、ヘキサン(200ml)を、渦を巻かせながら
、徐々に添加した。生成した無色の油から、上清をデカントにより除去し、その
手順を繰り返した。残渣をCH2Cl2(10ml)に溶解し、溶液を減圧下で濃
縮して、標記の化合物を得た。実施例47 5’−d(CTCACGT)−3’−ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチルチミジン(50mg、2mmole)をガラス反応器に入れ、2%ジク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基を脱保護す
る。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、5’−O−(4,4’−ジメ
トキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3’−イル−
O−2−シアノエチル−O−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−
5’−イル−ホスホロチオエートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソ
プロピルホスホルアミダイト0.2Mのアセトニトリル溶液、および、0.4M
の1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる
。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のア
セトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に
1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジ
ン
/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加
して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄す
る。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3
’−イル−O−2−シアノエチル−O−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノ
シン−5’−イル−ホスホロチオエートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−
ジイソプロピルホスホルアミダイト0.2Mのアセトニトリル溶液、および、0
.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応
させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試
薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を
、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/
ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/TH
Fを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリル
で洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3
’−イル−O−2−シアノエチル−O−チミジン−5’−イル−ホスホロチオエ
ートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト
0.2Mの無水アセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールの
アセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリ
ルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加
して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す
。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8
)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−
水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で24時間、インキュベートする。。水溶液を濾過
し、減圧下で濃縮して、5’−d(CTCACGT)−3’のホスホロチオエー
ト七量体を得る。実施例48 5’−d(CTCACGC)−3’ホスホロチオエート七量体の合成
エステル結合を介してCPG(定孔ガラス)に結合した5’−O−ジメトキシ
トリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン(50mg、2mmol
e)をガラス反応器に入れ、2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)
を添加して、5’−水酸基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
その後、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2
’−デオキシシチジン−3’−イル−O−2−シアノエチル−O−N2−イソブ
チリル−2’−デオキシグアノシン−5’−イル−ホスホロチオエートの4−シ
アノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト0.2Mのア
セトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールのアセトニトリル溶
液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その
後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分
間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセト
ニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、
N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−水酸基をキャップ
する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−N’−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3
’−イル−O−2−シアノエチル−O−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノ
シン−5’−イル−ホスホロチオエートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−
ジイソプロピルホスホルアミダイト0.2Mのアセトニトリル溶液、および、0
.4Mの1−テトラゾールのアセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応さ
せる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬
のアセトニトリル溶液を添加して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、
更に1回、5分間、繰り返す。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ル
チジン/THF(1:1:8)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THF
を添加して、未反応の5’−水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで
洗浄する。
2%ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(v/v)を添加して、5’−水酸基
を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、5’−O−(4,
4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3
’−イル−O−2−シアノエチル−O−チミジン−5’−イル−ホスホロチオエ
ートの4−シアノ−2−ブテニル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト
0.2Mの無水アセトニトリル溶液、および、0.4Mの1H−テトラゾールの
アセトニトリル溶液を添加し、室温で5分間反応させる。生成物をアセトニトリ
ルで洗浄し、その後、0.05MのBeaucage試薬のアセトニトリル溶液を添加
して、室温で5分間反応させる。この硫化工程を、更に1回、5分間、繰り返す
。支持体をアセトニトリル、次いで、無水酢酸/ルチジン/THF(1:1:8
)溶液で洗浄し、N−メチルイミダゾール/THFを添加して、未反応の5’−
水酸基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。
化合物を含有する担体を、30%水酸化アンモニウム水溶液で、90分間、室
温で処理し、その後、55℃で24時間、インキュベートする。。水溶液を濾過
し、減圧下で濃縮して、5’−d(CTCACGC)−3’のホスホロチオエー
ト七量体を得る。
この明細書において言及または引用する特許、刊行物、および他の公表された
文書のそれぞれは、その全部分を本明細書の一部としてここに引用する。
当業者には、本発明の好ましい具体例に多くの変更および改変が施されてもよ
く、そして、それらの変更および改変が本発明の精神から逸脱することなく行い
うることが認識されるだろう。従って、付帯する請求の範囲は、全てのこうした
均等の変更を本発明の真の精神および範囲に含まれるものとして包含することを
意図する。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1997年10月24日
【補正内容】差し替え用紙84−88頁の翻訳文:翻訳文77頁の次に挿入する
39.次の式:
[式中
R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、または−O−X3−Dであり;
DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ
ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり;
R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであり;
R3は水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであり、
ただし、R2およびR3の両方が同時に固相支持体に結合されたリンカーであるこ
とはなく;
X1はOまたはSであり;
X2はそれぞれOまたはSであり;
X3はそれぞれ1から10個の炭素を有するアルキルであり;
Qはそれぞれ−X1Hまたは−X1−CH2−CH=CH−CH2−Zであり;
mおよびnはそれぞれ独立して、0から約50の整数であり、ただし、mとn
の合計は50を越えない;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま
たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基であり;そし
て
ZはCN、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル、スルホニル、チ
オ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または置換されたチオ(
置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群から選択される)
である]
を有する化合物。
40.R2が固相支持体に結合されたリンカーである、請求項39記載の化合物
。
41.R2が水素である、請求項39記載の化合物。
42.mおよびnがそれぞれ0である、請求項39記載の化合物。
43.ZがCNであり、かつX1がOである、請求項39記載の化合物。
44.R8がR5である、請求項23記載の化合物。
45.nが2から50であり、Qがそれぞれ式−X1−CH2−CH=CH−CH2
−Zを有する、請求項44記載の化合物。
46.式IX:
[式中:
ZはCN、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル、スルホニル、チ
オ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または置換されたチオ(
置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群から選択される)
で
あり;そして、
X1はOまたはSである。]
を有する部分を含有するオリゴマー化合物であって、
(a)式II:
[式中:
R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、または−O−X3−Dであり;
X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり;
DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ
ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり;
X2はそれぞれOまたはSであり;
R3は水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであり;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま
たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基であり;
nは0から約50であり;
Qはそれぞれ−X1Hまたは−X1−CH2−CH=CH−CH2−Zであり;
R5は−N(R6)2、または、4から7個の原子を含有し、窒素、硫黄、およ
び酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキル
もしくは複素環アルケニルであり;
R6は1から10個の炭素を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。]
を有する化合物を提供し;
(b)式IIの化合物を、式III:
[式中:
R3aは水素であり;そして、
R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーである]
を有する化合物と反応させ;
(c)工程(b)の生成物を酸化して、式III(式中、R3aは水素、水酸基保護
基、または固相支持体に結合されたリンカーである)を有する更なる化合物を生
成する、
の各工程により製造される化合物。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1997年11月4日
【補正内容】差し替え用紙第77頁の翻訳文 翻訳文第71頁第3行から第72頁第1行の記載を次の記載に差し替える
X2はそれぞれOまたはSであり;
R3およびR3aはそれぞれ水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合され
たリンカーであり;
Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま
たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基であり;
nは0から約50であり;
Qはリン保護基であり;
R5は−N(R6)2、または、4から7個の原子を含有し、窒素、硫黄、およ
び酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキル
もしくは複素環アルケニルであり;
R6は1から10個の炭素を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。]
を有する化合物を提供し;
(b)式IIの化合物を、式III:
[式中:
R3aは水素であり;
mは1から約50であり;そして、
R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであるが、R2お
よびR3の両方が同時に固相支持体に結合されたリンカーであることはない]
を有する化合物と反応させてオリゴマー化合物を生成する、
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.式IX: [式中: ZはCN、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル、スルホニル、チ オ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または置換されたチオ( 置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群から選択される) であり;そして、 X1はOまたはSである。] を有する部分を含有するオリゴマー化合物の製造方法であって、 (a)式II: [式中: R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、または−O−X3−Dであり; X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり; DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ ール、または(−O−X3)p(pは1から約10である)であり; X2はそれぞれOまたはSであり; R3およびR3aはそれぞれ水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合され たリンカーであり; Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基であり; nは0から約50であり; Qはリン保護基であり; R5は−N(R6)2、または、4から7個の原子を含有し、窒素、硫黄、およ び酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキル もしくは複素環アルケニルであり; R6は1から10個の炭素を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。] を有する化合物を提供し; (b)式IIの化合物を、式III: [式中: R3aは水素であり;そして、 R2は水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであるが、R2お よびR3の両方が同時に固相支持体に結合されたリンカーであることはない] を有する化合物と反応させてオリゴマー化合物を生成する、 の各工程を含む方法。 2.更に、オリゴマー化合物を酸化して、式III(式中、R3は水素、水酸基保護 基、または固相支持体に結合されたリンカーであり;そして、mは1ずつ増加す る。)を有する更なる化合物を生成する工程を含む、請求項1記載の方法。 3.更にキャッピングの工程を含む、請求項2記載の方法。 4.キャッピングの工程が酸化後に行われる、請求項3記載の方法。 5.キャッピングの工程が酸化に先だって行われる、請求項3記載の方法。 6.更に、オリゴマー化合物を切断し、式I: を有する化合物を生成する工程を含む、請求項3記載の方法。 7.ZがCNであり、そしてQがX1Hまたは−X1−CH2−CH=CH−CH2 −Zである、請求項1記載の方法。 8.R6がそれぞれイソプロピルである、請求項7記載の方法。 9.X2がOである、請求項7記載の方法。 10.X1がSである、請求項9記載の方法。 11.X1がOである、請求項9記載の方法。 12.X2がSである、請求項7記載の方法。 13.X1がSである、請求項12記載の方法。 14.X1がOである、請求項12記載の方法。 15.式IIの化合物が、式V: を有する化合物を式VI: を有する化合物と酸の存在下で反応させることによって得られる、請求項1記載 の方法。 16.式VII: [式中: X1はOまたはSであり; Aは(R7)(R8)P−であり; R8はR5であるか、または式X: [式中: R1はそれぞれ独立して、H、−OH、−F、−O−X3−Dであり; X3は1から10個の炭素を有するアルキルであり; DはH、アミノ、保護されたアミノ、アルキルで置換されたアミノ、イミダゾ ール、または(−O−X3)pであり; X2はそれぞれOまたはSであり;(pは1から約10である) R5は−N(R6)2、または、4から7個の原子からなり、窒素、硫黄、およ び酸素からなる群から選択された3個までのヘテロ原子を有する複素環アルキル もしくは複素環アルケニルであり; Qはそれぞれリン保護基であり; mは0から約50であり; Bはそれぞれ独立して、自然に存在するもしくは自然に存在しない核塩基、ま たは、自然に存在するもしくは自然に存在しない保護された核塩基である。]を 有し;そして、 R7はR5であるか、または式VIII: [式中: R3は水素、水酸基保護基、または固相支持体に結合されたリンカーであり; そして、 nは、0から約50であり、ただしmとnの合計は50を越えない] を有し;そして、 ZはCN、ハロゲン、NO2、アルカリール、スルホキシル、スルホニル、チ オ、置換されたスルホキシル、置換されたスルホニル、または置換されたチオ( 置換基はアルキル、アリール、またはアルカリールからなる群から選択される) である。] を有する化合物。 17.ZがCNであり、そしてQがX1Hまたは−X1−CH2−CH=CH−C H2−Zである、請求項16記載の化合物。 18.X1がOである、請求項17記載の化合物。 19.X1がSである、請求項17記載の化合物。 20.AがHである、請求項17記載の化合物。 21.Aが−P(R5)2である、請求項17記載の化合物。 22.R5が−N(CH(CH3)2)2である、請求項20記載の化合物。 23.R7が式VIIを有する、請求項16記載の化合物。 24.nが1から30である、請求項23記載の化合物。 25.nが1から約25である、請求項23記載の化合物。 26.nが0である、請求項23記載の化合物。 27.ZがCNであり;X1がOであり;そしてAがHである、請求項17記載 の化合物。 28.ZがCNであり;XlがSであり;そしてAがHである、請求項17記載 の化合物。 29.ZがCNであり;X1がOであり;そしてR6がそれぞれイソプロピルであ る、請求項17記載の化合物。 30.ZがCNであり;X1がSであり;そしてR6がそれぞれイソプロピルであ る、請求項17記載の化合物。 31.式IV: を有する、請求項16記載の化合物。 32.R2が固相支持体に結合されたリンカーである、請求項31記載の化合物 。 33.R2が水素である、請求項31記載の化合物。 34.mおよびnがそれぞれ0である、請求項31記載の化合物。 35.ZがCNであり;QがX1Hまたは−X1−CH2−CH=CH−CH2−Z であり;そして、X1がOである、請求項31記載の化合物。 36.請求項3記載の方法により製造される生成物。 37.前記切断工程が、δ−脱離機構を介して前記オリゴマー化合物から式Z− CH2−CH=CH−CH2−の部分を除去する、請求項6記載の方法。 38.前記切断工程が、δ−断片化機構を介して前記オリゴマー化合物から式Z −CH2−CH=CH−CH2−の部分を除去する、請求項6記載の方法。
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