EP1532264A2 - Verfahren zur herstellung von ketocarotinoiden in blütenblättern von pflanzen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von ketocarotinoiden in blütenblättern von pflanzen

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EP1532264A2
EP1532264A2 EP03792345A EP03792345A EP1532264A2 EP 1532264 A2 EP1532264 A2 EP 1532264A2 EP 03792345 A EP03792345 A EP 03792345A EP 03792345 A EP03792345 A EP 03792345A EP 1532264 A2 EP1532264 A2 EP 1532264A2
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EP
European Patent Office
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activity
nucleic acids
sequence
cyclase
plant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03792345A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Christel Renate Schopfer
Ralf Flachmann
Karin Herbers
Irene Kunze
Matt Sauer
Martin Klebsattel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SunGene GmbH
Original Assignee
SunGene GmbH
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Publication date
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Priority claimed from DE2002153112 external-priority patent/DE10253112A1/de
Priority claimed from DE2002158971 external-priority patent/DE10258971A1/de
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    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of ketocarotenoids by cultivating plants which have an altered ketolase activity in flower petals compared to the wild type, the genetically modified plants, and their use as food and feed and for the production of ketocarotenoid extracts.
  • Ketocarotenoids are synthesized de novo in bacteria, algae, fungi and plants.
  • Ketocarotenoids i.e. carotenoids, which contain at least one keto group, such as astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin and adonixant in are natural antioxidants and pigments that are produced by some algae and microorganisms as secondary metabolites ,
  • ketocarotenoids and especially astaxanthin are used as pigmenting aids in animal nutrition, especially in trout, salmon and shrimp farming.
  • ketocarotenoids such as natural astaxanthin
  • biotechnological processes by cultivating algae, for example Haematococcus pluvialis, or by fermentation of microorganisms which have been optimized with regard to technology and subsequent isolation.
  • WO 98/18910 describes the synthesis of ketocarotenoids in nectaries of tobacco flowers by introducing a ketolase gene into tobacco.
  • WO 01/20011 describes a DNA construct for the production of ketocarotenoids, in particular astaxanthin, in seeds of oilseed plants such as oilseed rape, sunflower, soybean and mustard using a seed-specific promoter and a ketolase from Haematococcus.
  • WO 98/18910 and WO 01/20011 provide genetically modified plants which contain ketocarotenoids in specific tissues, but have the disadvantage that the level of the ketocarotenoids and the purity, in particular astaxanthin, are still present is not satisfactory.
  • the object of the invention was therefore to provide an alternative process for the production of ketocarotenoids by cultivating plants, or to provide further transgenic plants which produce ketocarotenoids which have optimized properties, such as a higher ketocarotenoid content have and do not have the described disadvantage of the prior art.
  • ketocarotenoids has been found by cultivating genetically modified plants which have an altered ketolase activity in petals compared to the wild type.
  • plants are therefore used as starting plants which, as wild type, have ketolase activity in petals, such as Adonis florets.
  • the genetic modification causes an increase in ketolase activity in petals.
  • Ketolase activity means the enzyme activity of a ketolase.
  • a ketolase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of introducing a keto group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a ketolase is understood to be a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into canthaxanthin.
  • ketolase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene or amount of canthaxanthin formed by the protein ketolase in a certain time.
  • the amount of ⁇ -carotene converted or the amount of canthaxanthin formed is increased by the protein ketolase in a certain time compared to the wild type.
  • This increase in ketolase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the ketolase Wild type activity.
  • wild type is understood to mean the corresponding non-genetically modified starting plant.
  • plant can be understood to mean the starting plant (wild type) or a genetically modified plant according to the invention or both.
  • wild type is used for increasing or causing ketolase activity, for the increase in hydroxylase activity described below, for the increase described below ⁇ -cyclase activity, for the increase in the HMG-CoA reductase activity described below, for the increase in the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity described below, for the Increase in 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity described below, for the increase in 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity described below, for increase in Isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity, for the increase in geranyl diphosphate synthase activity described below, for the increase in farnesyl diphosphine described below at-synthase activity, for the increase in geranyl-geranyl-diphosphate synthase activity described below, for
  • This reference plant is for plants which already have a ketolase activity in petals as a wild type, preferably Adonis aestivalis, Adonis flammeus or Adonis annuus, particularly preferably Adonis aestivalis.
  • This reference plant is for plants which, as a wild type, have no ketolase activity in petals, preferably Tagetes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta or Tagetes campanulata, particularly preferably Tagetes erecta.
  • ketolase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • ketolase activity in plant material is determined using the method of Frazer et al. , (J. Biol. Chem.
  • ketolase activity in plant extracts is determined with the substrates beta-carotene and canthaxanthin in the presence of lipid (soy lecithin) and detergent (sodium cholate). Substrate / product ratios from the ketolase assays are determined by means of HPLC.
  • the ketolase activity can be increased in various ways, for example by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the translation and protein levels or by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase compared to the wild type, for example by inducing the ketolase gene by activators or by introducing Nucleic acids encoding a ketolase in the plant.
  • Increasing the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase is also understood according to the invention in this embodiment to mean the manipulation of the expression of the endogenous ketolases of the plants. This can be achieved, for example, by changing the promoter DNA sequence for genes encoding ketolase. Such a change, which is a changed or preferably increased expression rate of at least one endogenous Ketolase gene results, can be done by deletion or insertion of DNA sequences.
  • an increased expression of at least one endogenous ketolase gene can be achieved in that a regulator protein which is not found or modified in the wild type plant interacts with the promoter of these genes.
  • Such a regulator can represent a chimeric protein which consists of a DNA binding domain and a transcription activator domain, as described for example in WO 96/06166.
  • the ketolase activity is increased compared to the wild type by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase is increased by introducing nucleic acids encoding ketolases into the plant.
  • the transgenic plants according to the invention therefore have at least one further ketolase gene compared to the wild type.
  • plants are used as starting plants which, as a wild type in petals, have no ketolase activity, such as, for example, tomato, Marigold, Tagetes erecta, Tagetes lucida, Tagetes minuta, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri and Tagetes campanulata.
  • ketolase activity such as, for example, tomato, Marigold, Tagetes erecta, Tagetes lucida, Tagetes minuta, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri and Tagetes campanulata.
  • the genetic modification causes ketolase activity in petals.
  • the genetically modified plant according to the invention therefore has a ketolase activity in flower compared to the genetically unmodified wild type. leaf open and is therefore preferably able to transgenically express a ketolase in flower petals.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase is caused analogously to the above-described increase in gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase, preferably by introducing nucleic acids which encode ketolases into the starting plant.
  • any ketolase gene that is to say any nucleic acids encoding a ketolase, can be used in both embodiments.
  • nucleic acids mentioned in the description can be, for example, an RNA, DNA or cDNA sequence.
  • nucleic acid sequences which have already been processed such as the corresponding cDNAs, are preferred to use.
  • nucleic acids encoding a ketolase and the corresponding ketolases that can be used in the method according to the invention are, for example, sequences from
  • Haematoccus pluvialis especially from Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782; nucleic acid: SEQ ID NO: 1, protein SEQ ID NO: 2),
  • Agrobacterium aurantiacum (Accession NO: D58420; nucleic acid: SEQ ID NO: 5, protein SEQ ID NO: 6),
  • Paracoccus marcusii (Accession NO: Y15112; nucleic acid: SEQ ID NO: 9, protein SEQ ID NO: 10).
  • Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO: NP442491; nucleic acid: SEQ ID NO: 11, protein SEQ ID NO: 12). Bradyrhizobium sp. (Accession NO: AF218415; nucleic acid: SEQ ID NO: 13, protein SEQ ID NO: 14).
  • ketolases and ketolase genes which can be used in the method according to the invention can be obtained, for example, from different organisms, the genomic sequence of which is known, by comparing the identity of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the sequences described above and in particular with easily find the sequences SEQ ID NO: 2 and / or 16 and / or 90 and / or 92.
  • ketolases and ketolase genes can also be derived from the nucleic acid sequences described above, in particular from the sequences SEQ ID NO: 2 and / or 16 and / or 90 and / or 92 from different organisms, the genomic sequence of which is not known, can easily be found by hybridization techniques in a manner known per se.
  • the hybridization can take place under moderate (low stringency) or preferably under stringent (high stringency) conditions.
  • Such hybridization conditions are, for example
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with 2X SSC at 50 ° C) and those with high stringency (with 0.2X SSC at 50 ° C, preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M sodium chloride, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from moderate conditions at room temperature, 22 ° C, to stringent conditions at 65 ° C.
  • Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied.
  • Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • 6X SSC at 68 ° C, 100 mg / ml denatured fish sperm DNA, or (iv) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 68 ° C, or
  • nucleic acids are encoded which encode a protein containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and which have an identity of at least 20 %, preferably at least 30%, more preferably at least 40 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 2 and exhibits enzymatic property of a ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, by identity comparison of the Sequences from other organisms can be found or an artificial ketolase sequence that was modified from the sequence SEQ ID NO: 2 by artificial variation, for example by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • nucleic acids which encode a protein are introduced, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 16 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 16 and the enzymatic property of a Has ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, can be found by comparing the identity of the sequences from other organisms, or an artificial ketolase sequence which can be derived from the sequence SEQ ID NO: 16 by artificial variation, for example was modified by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • nucleic acids which encode a protein are introduced, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 90 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 90 and the enzymatic property of a Has ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, can be found by comparing the identity of the sequences from other organisms, or an artificial ketolase sequence which can be derived from the sequence SEQ ID NO: 90 by artificial variation, for example was modified by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • nucleic acids which encode a protein are introduced, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 92 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20 %, preferably at least 30%, more preferably at least 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 92 and the enzymatic Has property of a ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, can be found by comparing the identity of the sequences from other organisms or an artificial ketolase sequence which can be derived from the sequence SEQ ID NO: 92 by artificial variation, for example was modified by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • substitution is to be understood as meaning the replacement of one or more amino acids by one or more amino acids. So-called conservative exchanges are preferably carried out, in which the replaced amino acid has a similar property to the original amino acid, for example replacement of Glu by Asp, Gin by Asn, Val by Ile, Leu by Ile, Ser by Thr.
  • Deletion is the replacement of an amino acid with a direct link.
  • Preferred positions for deletions are the termini of the polypeptide and the links between the individual protein domains.
  • Inserts are insertions of amino acids into the polypeptide chain, whereby a direct bond is formally replaced by one or more amino acids.
  • Identity between two proteins is understood to mean the identity of the amino acids over the respective total protein length, in particular the identity obtained by comparison with the aid of the laser genes software from DNASTAR, ine. Madison, Wisconsin (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5 (2): 151-1) using the following parameters becomes: Multiple alignment parameters:
  • a protein which has an identity of at least 20% at the amino acid level with a specific sequence is accordingly understood to be a protein which has an identity of at least 20% when comparing its sequence with the specific sequence, in particular according to the above-mentioned program logarithm with the above parameter set.
  • a protein which has an identity of at least 20% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 2 or 16 or 90 or 92 is accordingly understood to be a protein which, when its sequence is compared with the sequence SEQ ID NO:
  • NO: 2 or 16 or 90 or 92 in particular according to the above program logarithm with the above parameter set, has an identity of at least 20%.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 1 is introduced into the plant.
  • nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 15 is introduced into the plant.
  • nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 89 is introduced into the plant.
  • nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 91 is introduced into the plant.
  • ketolase genes can also be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897).
  • the addition of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps using the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • genetically modified plants are used which have the highest expression rate of a ketolase in flowers.
  • the gene expression of the ketolase takes place under the control of a flower-specific promoter.
  • the nucleic acids described above, as described in detail below are introduced into the plant in a nucleic acid construct, functionally linked to a flower-specific promoter.
  • plants are preferably understood to mean plants which have chromoplasts as the wild type in petals. Further preferred plants have carotenoids as wild type in the petals, in particular ⁇ -carotene, zeaxanthin, neoxanthin, violaxanthin or lutein. Plants that are more preferred have a hydroxylase activity in the petals as a wild type.
  • Hydroxylase activity means the enzyme activity of a hydroxylase.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of introducing a hydroxyl group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into zeaxanthin or cantaxanthin into astaxanthin.
  • hydroxylase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene or cantaxanthin or the amount of zeaxanthin or astaxanthin formed in a certain time by the protein hydroxylase.
  • Particularly preferred plants are plants selected from the families Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassicaceae, Cucurbita- ceae, Primulaceae, CaryophylIaceae, Amaranthacee, Geraniaceaeaeae, Gentianaceaeae, Gentianaceaeae, Gentianaceaeae , Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, liliaceae or Lamiaceae.
  • Very particularly preferred plants are selected from the group of the plant genera Marigold, Tagetes erhcta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica-, Aquilegia, Aster, Astragalus, Bignonia, Calenduia, Caltha, Campanula, Canna, Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthemum, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita, Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus, Dimorphotheca, Doronicum, Eschscholtzia, Forsythia, Fremontia, Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana, Geranium, Gerbera, Geum, Grevillea, Helenium, Helianthus, Hepatica, Heracle Hisbiscus, Heliopsis, Hypericum, Hypo-choeris, Impatiens, Iris, Jacaranda, Kerria, Laburnum, Lathyrus, Leontodon
  • plants are cultivated which, in addition to the wild type, have an increased hydroxylase activity and / or ⁇ -cyclase activity.
  • Hydroxylase activity means the enzyme activity of a hydroxylase.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of introducing a hydroxyl group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into zeaxanthin or cantaxanthin into astaxanthin.
  • hydroxyase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene or cantaxanthin or the amount of zeaxanthin or astaxanthin formed in a certain time by the protein hydroxylase.
  • the amount of ⁇ -carotene or cantaxantin or the amount of zeaxanthin or astaxanthin formed is increased in a certain time by the protein hydroxylase compared to the wild type.
  • This increase in the hydroxylase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the hydroxylase activity of the Wild type.
  • endogenous ⁇ -hydroxylase means the plant's own endogenous hydroxylase.
  • the activity is determined analogously.
  • ⁇ -cyclase activity means the enzyme activity of a ⁇ -cyclase.
  • a ß-cyclase is understood to be a protein which has the enzymatic activity to convert a terminal, linear residue of lycopene into a ß-ionone ring.
  • a ⁇ -cyclase is understood to be a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into ⁇ -carotene.
  • ß-cyclase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene converted or the amount of ß-carotene formed in a certain time by the protein ß-cyclase. If the ⁇ -cyclase activity is higher than that of the wild type, the amount of ⁇ -carotene converted or the amount of ⁇ -carotene formed is increased by the protein ß-cyclase in a certain time compared to the wild type.
  • This increase in the ⁇ -cyclase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the ⁇ - Wild-type cyclase activity.
  • hydroxylase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • the activity of the hydroxylase is according to Bouvier et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) in vi tro. Ferredoxin, ferredoxin-NADP oxidoreductase, catalase, NADPH and beta-carotene with mono- and digalactosylglycerides are added to a certain amount of plant extract.
  • the hydroxylase activity is particularly preferably determined under the following conditions according to Bouvier, Keller, d'Harlingue and Camara (xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998 ), 320-328):
  • the in vitro assay is carried out in a volume of 0.250 ml volume.
  • the mixture contains 50 mM potassium phosphate (pH 7.6), 0.025 mg ferredoxin from spinach, 0.5 units ferredoxin-NADP + oxidoreductase from spinach, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-carotene (emulsified in 0.1 mg Tween 80), 0.05 mM a mixture of mono - And digalactosylglycerides (1: 1), 1 unit of catalysis, 200 mono- and digalactosylglycerides, (1: 1), 0.2 mg bovine serum albumin and plant extract in different volumes.
  • the reaction mixture is incubated for 2 hours at 30C.
  • the reaction products are extracted with organic solvent such as acetone or chloroform / methanol (2: 1) and determined by means of HPLC.
  • ⁇ -cyclase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably carried out under the following conditions:
  • the activity of the ⁇ -cyclase is according to Fräser and Sandmann
  • the hydroxylase activity is particularly preferably determined under the following conditions according to Bouvier, d'Harlingue and Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346 (1) (1997) 53-64):
  • the in vitro assay is carried out in a volume of 250 1 volume.
  • the mixture contains 50 mM potassium phosphate
  • the hydroxylase activity and / or ⁇ -cyclase activity can be increased in various ways, for example by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the expression and protein level or by increasing the gene expression of nucleic acids encoding a hydroxylase and / or of nucleic acids encoding a ⁇ - Cyclase versus wild type.
  • the increase in the gene expression of the nucleic acids encoding a hydroxylase and / or the increase in the gene expression of the nucleic acid encoding a ⁇ -cyclase compared to the wild type can also be carried out in various ways, for example by inducing the hydroxylase gene and / or ⁇ -cyclase gene by activators or by introducing one or more hydroxylase gene copies and / or ⁇ -cyclase gene copies, ie by introducing at least one nucleic acid encoding a hydroxylase and / or at least one nucleic acid encoding an ⁇ -cyclase into the plant.
  • Increasing the gene expression of a nucleic acid encoding a hydroxylase and / or ⁇ -cyclase is also understood according to the invention to mean the manipulation of the expression of the plants' own endogenous hydroxylase and / or ⁇ -cyclase.
  • the focus of biosynthesis is on the ⁇ -carotenoid pathway, such as plants of the genus Tagetes, it is advantageous to reduce the endogenous ⁇ -hydroxylase activity and to increase the activity of exogenous hydroxylases.
  • an altered or increased expression of an endogenous hydroxylase and / or ⁇ -cyclase gene can be achieved in that a regulator protein which does not occur in the non-transformed plant interacts with the promoter of this gene.
  • Such a regulator can represent a chimeric protein which consists of a DNA binding domain and a transcription activator domain, as described for example in WO 96/06166.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a hydroxylase is increased and / or the gene expression of a nucleic acid encoding a ⁇ -cyclase is increased by introducing at least one nucleic acid encoding a hydroxylase and / or by introducing at least one nucleic acid encoding one ß-cyclase into the plant.
  • any hydroxylase gene or each ⁇ -cyclase gene that is to say any nucleic acid which codes for a hydroxylase and any nucleic acid which codes for a ⁇ -cyclase, can be used for this purpose.
  • genomic hydroxylase or. ⁇ -cyclase nucleic acid sequences from eukaryotic sources which contain introns are, in the event that the host plant is unable or cannot be able to express the corresponding hydroxylase or ⁇ -cyclase, preferably already processed Nucleic acid sequences, how to use the corresponding cDNAs.
  • Examples of a hydroxylase gene are: a nucleic acid encoding a hydroxylase from Haematococcus pluvialis, accession AX038729, WO 0061764); (Nucleic acid: SEQ ID NO: 17, protein: SEQ ID NO: 18),
  • a particularly preferred hydroxylase is also the hydroxylase from tomato (Accession Y14809) (nucleic acid: SEQ ID NO: 97; protein: SEQ ID NO. 98).
  • Examples of a ⁇ -cyclase gene are: a nucleic acid encoding a ⁇ -cyclase from tomato (Accession X86452). (Nucleic acid: SEQ ID NO: 19, protein: SEQ ID O: 20),
  • AAF18989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota] ZP 001140 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str.
  • ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378]
  • BAA29250 393a a long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] AAL01999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2] ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphmgobium aromaticivorans] AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. 0RS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv.
  • ZP_000941 hypothetical protein [Novosphmgobium aromaticivorans] CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusii] BAA20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus] ZP_000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca] ZP_000190 hypothetical protein [chloroflexus aurantiacus] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAB53337 Lycopene beta cyclase BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]
  • a particularly preferred b-cyclase is also the chromoplast-specific b-cyclase from tomato (AAG21133) (nucleic acid: SEQ ID No. 95; protein: SEQ ID No. 96)
  • the preferred transgenic plants according to the invention therefore have at least one further hydroxylase gene and / or ⁇ -cyclase gene compared to the wild type.
  • the genetically modified plant has, for example, at least one exogenous nucleic acid encoding a hydroxylase or at least two endogenous nucleic acids encoding a hydroxylase and / or at least one exogenous nucleic acid encoding a ⁇ -cyclase or at least two endogenous nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase.
  • nucleic acids encoding proteins are preferably used which contain the amino acid sequence SEQ ID NO: 18 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 18, and which have the enzymatic property of a hydroxylase.
  • hydroxylases and hydroxylase genes can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 18.
  • hydroxylases and hydroxylase genes can also be easily found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 17 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the hydroxylase of the sequence SEQ ID NO: 18.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 17 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins are preferably used as the ⁇ -cyclase genes, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 20 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30 %, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 20, and which have the enzymatic property of a ⁇ -cyclase.
  • ⁇ -cyclases and ⁇ -cyclase genes can easily be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SEQ ID NO: 20 find.
  • ⁇ -cyclases and ⁇ -cyclase genes can also be easily found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 19 from various organisms whose genomic sequence is not known, using hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence of the ⁇ -cyclase of the sequence SEQ ID NO: 20 are introduced into organisms to increase the ⁇ -cyclase activity.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 19 is introduced into the organism.
  • hydroxylase genes or ⁇ -cyclase genes can also be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical syn The oligonucleotides can be synthesized, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897). The attachment of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps using the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the plants additionally have a reduced ⁇ -cyclase activity compared to the wild type.
  • ⁇ -Cyclase activity means the enzyme activity of an ⁇ -cyclase.
  • An ⁇ -cyclase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert a terminal, linear residue of lycopene into an ⁇ -ionone ring.
  • ⁇ -cyclase is therefore understood to mean in particular a protein which has the enzymatic activity to convert lycopene to ⁇ -carotene.
  • ⁇ -cyclase activity is understood to mean the amount of lycopene converted or amount of ⁇ -carotene formed by the protein ⁇ -cyclase in a certain time.
  • the amount of lycopene converted or the amount of ⁇ -carotene formed is reduced in a certain time by the protein ⁇ -cyclase compared to the wild type.
  • Reduced ⁇ -cyclase activity is preferably the partial or essentially complete inhibition or blocking of the functionality of an ⁇ -cyclase in a plant cell, plant or a part, tissue, organ, cells or seeds derived therefrom based on different cell biological mechanisms Roger that.
  • the ⁇ -cyclase activity in plants can be reduced compared to the wild type, for example by reducing the amount of ⁇ -cyclase protein or the amount of ⁇ -cyclase mRNA in the plant. Accordingly, ⁇ -cyclase activity which is reduced compared to the wild type can be determined directly or via the determination the amount of ⁇ -cyclase protein or the amount of ⁇ -cyclase mRNA of the plant according to the invention in comparison to the wild type.
  • a reduction in ⁇ -cyclase activity includes a quantitative reduction in ⁇ -cyclase up to an essentially complete absence of ⁇ -cyclase (i.e. lack of detectability of ⁇ -cyclase activity or lack of immunological detectability of ⁇ -cyclase).
  • the ⁇ -cyclase activity or the ⁇ -cyclase protein amount or the ⁇ -cyclase mRNA amount in the plant, particularly preferably in flowers compared to the wild type by at least 5%, more preferably by at least 20% , more preferably reduced by at least 50%, more preferably by 100%.
  • “reduction” also means the complete absence of the ⁇ -cyclase activity (or the ⁇ -cyclase protein or the ⁇ -cyclase mRNA).
  • ⁇ -cyclase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably carried out under the following conditions:
  • the ⁇ -cyclase activity can be determined in vitro if potassium phosphate is used as a buffer for a certain amount of plant extract (pH 7.6 ), Lycopene as substrate, Stromaprotein from Paprika, NADP +, NADPH and ATP are added.
  • ⁇ -cyclase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is carried out particularly preferably according to Bouvier, d'Harlingue and Camara (Molecular Analysis of Carotenoid Cyclase Inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346 (1) ( 1997) 53-64):
  • the in vitro assay is carried out in a volume of 0.25 ml.
  • the mixture contains 50 mM potassium phosphate (pH 7.6), different amounts of plant extract, 20 nM lycopene, 0.25 mg of chromoplastic paprika stromal protein, 0.2 mM NADP +, 0.2 mM NADPH and 1 mM ATP.
  • NADP / NADPH and ATP are dissolved in 0.01 ml ethanol with 1 mg Tween 80 immediately before adding to the incubation medium.
  • the reaction products extracted in chloroform are analyzed by HPLC.
  • the ⁇ -cyclase activity in plants is preferably reduced by at least one of the following methods:
  • ⁇ -cyclase dsRNA a double-stranded ⁇ -cyclase ribonucleic acid sequence, hereinafter also called ⁇ -cyclase dsRNA, or an expression cassette or cassettes ensuring expression thereof.
  • ⁇ -cyclase dsRNA a double-stranded ⁇ -cyclase ribonucleic acid sequence
  • ⁇ -cyclase dsRNA an expression cassette or cassettes ensuring expression thereof.
  • ⁇ -cyclase antisense-ribonucleic acid sequence hereinafter also called ⁇ -cyclase-antisenseRNA, or an expression cassette ensuring its expression.
  • ⁇ -cyclase-antisenseRNA introduction of at least one ⁇ -cyclase antisense-ribonucleic acid sequence, hereinafter also called ⁇ -cyclase-antisenseRNA, or an expression cassette ensuring its expression.
  • ⁇ -cyclase senseRNA introduction of at least one ⁇ -cyclase sense ribonucleic acid sequence, hereinafter also referred to as ⁇ -cyclase senseRNA, for inducing a co-suppression or an expression cassette ensuring its expression
  • Knockout mutants can preferably be introduced by homologous insertion into said ⁇ -cyclase gene Recombination or introduction of sequence-specific nucleases against ⁇ -cyclase gene sequences can be generated.
  • ⁇ -cyclase-dsRNA a double-stranded ⁇ -cyclase-ribonucleic acid sequence
  • double-stranded RNA interference double-stranded RNA interference
  • dsRNAi double-stranded RNA interference
  • Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035 or WO 00/63364.
  • dsRNAi double-stranded RNA interference
  • double-stranded ribonucleic acid sequence means one or more ribonucleic acid sequences which are theoretically double-stranded RNA because of complementary sequences, for example in accordance with the base pair rules of Waston and Crick and / or factually, for example because of hybridization experiments, in vitro and / or in vivo - train structures.
  • RNA structures represents a state of equilibrium.
  • the ratio of double-stranded molecules to is preferred corresponding dissociated forms at least 1 to 10, preferably 1: 1, particularly preferably 5: 1, most preferably 10: 1.
  • a double-stranded ⁇ -cyclase-ribonucleic acid sequence or ⁇ -cyclase-dsRNA is preferably understood to mean an RNA molecule which has a region with a double-strand structure and which contains a nucleic acid sequence in this region which
  • a) is identical to at least part of the plant's own ⁇ -cyclase transcript and / or
  • b) is identical to at least part of the plant's own ⁇ -cyclase promoter sequence.
  • an RNA which has an area with a double-strand structure and which contains a nucleic acid sequence in this area is therefore preferably introduced into the plant in order to reduce the ⁇ -cyclase activity
  • a) is identical to at least part of the plant's own ⁇ -cyclase transcript and / or
  • b) is identical to at least part of the plant's own ⁇ ⁇ cyclase ⁇ promoter sequence.
  • ⁇ -cyclase transcript is understood to mean the transcribed part of an ⁇ -cyclase gene which, in addition to the ⁇ -cyclase coding sequence, also contains, for example, non-coding sequences, such as UTRs.
  • RNA which is "identical to at least part of the plant's own ⁇ -cyclase promoter sequence” means preferably that the RNA sequence with at least part of the theoretical transcript of the ⁇ -cyclase promoter sequence, ie the corresponding RNA sequence is identical.
  • a part of the plant's own ⁇ -cyclase transcript or the plant's own ⁇ -cyclase promoter sequence is understood to mean partial sequences which can range from a few base pairs to complete sequences of the transcript or the promoter sequence.
  • the person skilled in the art can easily determine the optimal length of the partial sequences by routine experiments.
  • the length of the partial sequences is at least 10 bases and at most 2 kb, preferably at least 25 bases and at most 1.5 kb, particularly preferably at least 50 bases and at most 600 bases, very particularly preferably at least 100 bases and at most 500, most preferably at least 200 bases or at least 300 bases and at most 400 bases.
  • the partial sequences are preferably selected in such a way that the highest possible specificity is achieved and the activities of other enzymes, the reduction of which is not desired, are not reduced. It is therefore advantageous to select parts of the ⁇ -cyclase transcript and / or partial sequences of the ⁇ -cyclase promoter sequences for the partial sequences of the ⁇ -cyclase dsRNA that do not occur in other activities.
  • the ⁇ -cyclase dsRNA therefore contains a sequence which is identical to a part of the plant's own ⁇ -cyclase transcripts and the 5 ⁇ end or the 3 ⁇ end of the plant's own nucleic acid, coding for an ⁇ -Cyclase contains.
  • non-translated regions in the 5 or 3 "of the transcript are suitable for producing selective double-strand structures.
  • Another object of the invention relates to double-stranded RNA molecules (dsRNA molecules) which, when introduced into a plant organism (or a cell, tissue, organ or propagation material derived therefrom), reduce a ⁇ -cyclase.
  • dsRNA molecules double-stranded RNA molecules
  • a double-stranded RNA molecule for reducing the expression of an ⁇ -cyclase preferably comprises
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of a “sense” RNA ⁇ -cyclase transcript, and
  • an “antisense” R.NA strand which is essentially, preferably completely, complementary to the RNA “sense” strand under a).
  • a nucleic acid construct which is introduced into the plant and which is transcribed into the ⁇ -cyclase dsRNA in the plant is preferably used to transform the plant with an ⁇ -cyclase dsRNA.
  • the present invention therefore also relates to a nucleic acid construct that can be transcribed into
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of the “sense” RNA ⁇ -cyclase transcript
  • RNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the RNA sense strand under a).
  • nucleic acid constructs are also called expression cassettes or expression vectors below.
  • ⁇ -cyclase nucleic acid sequence is preferably understood to be the sequence according to SEQ ID NO: 38 or a tel thereof.
  • dsRNA sequence can also have insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the ⁇ -cyclase target sequence and nevertheless brings about an efficient reduction in expression.
  • the homology is preferably at least 75%, preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, most preferably 100% between the "sense" strand of an inhibitory dsRNA and at least part of the "sense" RNA transcript of an ⁇ -cyclase Gene, or between the "antisense” strand the complementary strand of an ⁇ -cyclase gene.
  • dsRNA preferably comprises sequence regions of ⁇ -cyclase gene transcripts which correspond to conserved regions. Said conserved areas can easily be derived from sequence comparisons.
  • an "essentially identical" dsRNA can also be defined as a nucleic acid sequence which is capable of hybridizing with part of an ⁇ -cyclase gene transcript (eg in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA at 50 ° C or 70 ° C for 12 to 16 h).
  • an ⁇ -cyclase gene transcript eg in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA at 50 ° C or 70 ° C for 12 to 16 h.
  • “Essentially complementary” means that the “antisense” RNA strand can also have insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the complement of the “sense” RNA strand.
  • the homology is preferably at least 80%, preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 100% between the "antisense” RNA strand and the complement of the "sense” RNA strand.
  • the ⁇ -cyclase dsRNA comprises
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of the "sense" RNA transcript of the promoter region of an ⁇ -cyclase gene
  • RNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the RNA “sense” strand under a).
  • the corresponding nucleic acid construct to be used preferably for transforming the plants comprises
  • a “sense” DNA strand which is essentially identical to at least part of the promoter region of an ⁇ -cyclase gene
  • an “antisense” DNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the DNA “sense” strand under a).
  • the promoter region of an ⁇ -cyclase is preferably understood to mean a sequence according to SEQ ID NO: 47 or a part thereof.
  • the following partial sequences are particularly preferably used, in particular for Tagetes erecta:
  • SEQ ID NO: 40 Sense fragment of the 5'-terminal region of the ⁇ -cyclase
  • SEQ ID NO: 41 Antisense fragment of the 5 ⁇ terminal region of the ⁇ -cyclase
  • SEQ ID NO: 42 Sense fragment of the 3'-terminal region of the ⁇ -cyclase
  • SEQ ID NO: 43 Antisense fragment of the 3'-terminal region, the ⁇ -cyclase
  • SEQ ID NO: 47 Sense fragment of the ⁇ -cyclase promoter
  • SEQ ID NO: 48 Antisense fragment of the ⁇ -cyclase promoter
  • the dsRNA can consist of one or more strands of polyribonucleotides.
  • several individual dsRNA molecules, each comprising one of the ribonucleotide sequence sections defined above, can be introduced into the cell or the organism.
  • the double-stranded dsRNA structure can be formed from two complementary, separate RNA strands or - preferably - from a single, self-complementary RNA strand.
  • the “sense” RNA strand and the “antisense” RNA strand are preferably covalently linked to one another in the form of an inverted “repeat”.
  • the dsRNA can also comprise a hairpin structure by connecting the “sense” and “antisense” strand by means of a connecting sequence (“linker”; for example an intron).
  • linker for example an intron
  • the self-complementary dsRNA structures are preferred since they only require the expression of an RNA sequence and the complementary RNA strands always comprise an equimolar ratio.
  • the connecting sequence is an intron (e.g. an intron of the ST-LS1 gene from potato; Vancanneyt GF et al. (1990) Mol Gen Genet 220 (2): 245-250).
  • the nucleic acid sequence coding for a dsRNA can contain further elements, such as, for example, transcription termination signals or polyadenylation signals.
  • the dsRNA is directed against the promoter sequence of an ⁇ -cyclase, it preferably does not include any transcription termination signals or polyadenylation signals. This enables a retention of the dsRNA in the nucleus of the cell and prevents a distribution of the dsRNA in the whole plant "Spreadinng"). If the two strands of the dsRNA are to be brought together in a cell or plant, this can be done, for example, in the following way:
  • RNA duplex The formation of the RNA duplex can be initiated either outside the cell or inside it.
  • the dsRNA can be synthesized either in vivo or in vitro.
  • a DNA sequence coding for a dsRNA can be placed in an expression cassette under the control of at least one genetic control element (such as, for example, a promoter). Polyadenylation is not required, and there is no need for elements to initiate translation.
  • the expression cassette for the MP-dsRNA is preferably contained on the transformation construct or the transformation vector.
  • the dsRNA is expressed starting from an expression construct under the functional control of a flower-specific promoter, particularly preferably under the control of the promoter described by SEQ ID NO: 28 or a functionally equivalent part of the same.
  • Transformation vector inserted and introduced into the plant cell using the methods described below.
  • a stable insertion into the genome is advantageous for the method according to the invention.
  • the dsRNA can be introduced in an amount that enables at least one copy per cell. Larger quantities (e.g. at least 5, 10, 100, 500 or 1000 copies per cell) can possibly result in an efficient reduction.
  • the antisense nucleic acid molecule hybridizes or binds with the cellular rnRNA and / or genomic DNA coding for the ⁇ -cyclase to be reduced. This suppresses the transcription and / or translation of the ⁇ -cyclase.
  • Hybridization can occur in a conventional manner via the formation of a stable duplex or - in the case of genomic DNA - by binding of the antisense nucleic acid molecule with the duplex of the genomic DNA through specific interaction in the major groove of the DNA helix.
  • An ⁇ -cyclase antisenseRNA can be derived using the nucleic acid sequence coding for this ⁇ -cyclase, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 38 according to the base pair rules of Watson and Crick.
  • the ⁇ -cyclase antisenseRNA can be complementary to the entire transcribed mRNA of the ⁇ -cyclase, limited to the coding region or consist only of an oligonucleotide which is complementary to part of the coding or non-coding sequence of the mRNA.
  • the oligonucleotide can be complementary to the region that comprises the translation start for the ⁇ -cyclase.
  • the ⁇ -cyclase antisenseRNA can have a length of, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides, but can also be longer and at least 100, 200, 500, 1000, 2000 or comprise 5000 nucleotides.
  • ⁇ -Cyclase antisenseRNAs are preferably recombinantly expressed in the target cell in the context of the method according to the invention.
  • Another object of the invention relates to transgenic expression cassettes containing a nucleic acid sequence coding for at least part of an ⁇ -cyclase, said nucleic acid sequence being functionally linked to a promoter which is functional in plant organisms in an antisense orientation.
  • the expression of the antisenseRNA takes place starting from an expression construct under the functional control of a flower-specific promoter, in particular preferably under the control of the promoter described by SEQ ID NO: 28 or a functionally equivalent part thereof.
  • Said expression cassettes can be part of a transformation construct or transformation vector, or can also be introduced as part of a co-transformation.
  • an ⁇ -cyclase can be inhibited by nucleotide sequences that are complementary to the regulatory region of an ⁇ -cyclase gene
  • the ⁇ -cyclase antisenseRNA can be an anomeric nucleic acid.
  • Such ⁇ -anomeric nucleic acid molecules form specific double-stranded hybrids with complementary RNA in which, in contrast to the conventional ⁇ -nucleic acids, the two strands run parallel to one another (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641 ).
  • the antisense strategy described above can advantageously be coupled with a ribozyme method.
  • Catalytic RNA molecules or ribozymes can be adapted to any target RNA and cleave the phosphodiester framework at specific positions, whereby the target RNA is functionally deactivated (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3): 257 -275). This does not modify the ribozyme itself, but is able to cleave further target RNA molecules analogously, which gives it the properties of an enzyme.
  • the incorporation of ribozyme sequences in "antisense" RNAs gives these "antisense” RNAs this enzyme-like, RNA-cleaving property and thus increases their efficiency in inactivating the target RNA.
  • RNA molecules The production and use of corresponding ribozyme “antisense” RNA molecules is described (inter alia in Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591; Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11 (4): 1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250 (3): 329-338).
  • ribozymes for example "Hammerhead”ribozymes; Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591
  • Ribozyme technology can increase the efficiency of an antisense strategy.
  • Methods for the expression of ribozymes for the reduction of certain proteins are described in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). Ribozyme expression is also described in plant cells (Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11 (4): 1525-1530; de Feyter R et al.
  • Suitable target sequences and ribozymes can, for example, as described in "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. Eds, Academic Press, Inc. (1995), pp. 449-460", by secondary structure calculations of ribozyme and Target RNA and their interaction can be determined (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242 (6) : 653-657).
  • Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed which have regions complementary to the mRNA of the ⁇ -cyclase to be suppressed (see also US 4,987,071 and US 5,116,742).
  • ribozymes can also be identified via a selection process from a library of diverse ribozymes (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).
  • ⁇ -cyclase ribonucleic acid sequence (or a part thereof) in sense orientation can lead to a co-repression of the corresponding ⁇ -cyclase gene.
  • sense RNA with homology to an endogenous ⁇ -cyclase gene can reduce or switch off the expression of the same, similarly as has been described for antisense approaches (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31 (5): 957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al.
  • the cosuppression is preferably implemented using a sequence which is essentially identical to at least part of the nucleic acid sequence coding for an ⁇ -cyclase, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 38.
  • the ⁇ -cyclase senseRNA is preferably selected such that translation of the ⁇ -cyclase or a part thereof cannot occur.
  • the 5 'untranslated or 3' untranslated region can be selected or the ATG start codon can be deleted or mutated.
  • a decrease in ⁇ -cyclase expression is also due to specific DNA binding factors e.g. possible with factors of the type of zinc finger transcription factors. These factors attach themselves to the genomic sequence of the endogenous target gene, preferably in the regulatory areas, and
  • This section is preferably in the region of the promoter region. For gene suppression, however, it can also lie in the area of the coding exons or introns.
  • proteins can be introduced into a cell that inhibit the ⁇ -cyclase itself.
  • protein binding factors can e.g. Aptamers (Famulok M and Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243: 123-36) or antibodies or antibody fragments
  • the ⁇ -cyclase expression can also be effectively achieved by induction of the specific ⁇ -cyclase RNA degradation by the plant using a viral expression system (Amplikon; Angell SM et al. (1999) Plant J 20 (3): 357-362) , These systems - also referred to as "VIGS” (viral induced gene silencing) - bring nucleic acid sequences with homology to the transcript of an ⁇ -cyclase to be reduced by means of viral vectors into the
  • the VIGS-mediated reduction is preferably implemented using a sequence which is essentially identical to at least part of the nucleic acid sequence coding for an ⁇ -cyclase, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 38.
  • genomic sequences can be modified in a targeted manner. These include in particular methods such as the generation of knockout mutants by means of targeted homologous recombination e.g. by generating stop codons, shifts in the reading frame etc. (Hohn B and Puchta H (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96: 8321-8323) or the targeted deletion or inversion of sequences using e.g. sequence-specific recombinases or nucleases (see below)
  • the reduction in the ⁇ -cyclase amount, function and / or activity can also be achieved by a targeted insertion of nucleic acid sequences (for example the nucleic acid sequence to be inserted in the process according to the invention) into the sequence coding for an ⁇ -cyclase (for example by means of intermolecular homologous recombination).
  • nucleic acid sequences for example the nucleic acid sequence to be inserted in the process according to the invention
  • sequence coding for an ⁇ -cyclase for example by means of intermolecular homologous recombination
  • a DNA construct is preferably used which comprises at least part of the sequence of an ⁇ -cyclase gene or neighboring sequences, and can thus be recombined in a targeted manner in the target cell, so that deletion, addition or Substitution of at least one nucleotide so the ⁇ -cyclase gene is changed that the functionality of the ⁇ -cyclase gene is reduced or completely eliminated.
  • the change can also affect the regulatory elements (for example the promoter) of the ⁇ -cyclase gene, so that the coding sequence remains unchanged, but expression (transcription and / or translation) is omitted and reduced.
  • the sequence to be inserted is flanked at its 5 'and / or 3' end by further nucleic acid sequences (A 'or B') which are of sufficient length and homology to the corresponding sequences of the ⁇ -cyclase Gene (A or B) to enable homologous recombination.
  • the length is usually in the range from several hundred bases to several kilobases (Thomas KR and Capecchi MR (1987) Cell 51: 503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (8): 4368- 4373).
  • the plant cell with the recombination construct is transformed using the methods described below and successfully recombined clones are selected based on the ⁇ -cyclase which is inactivated as a result.
  • the efficiency of the recombination is increased by combination with methods which promote homologous recombination.
  • methods which promote homologous recombination.
  • Such methods include, for example, the expression of proteins such as RecA or the treatment with PARP inhibitors.
  • PARP inhibitors Puchta H et al. (1995) Plant J 7: 203-210).
  • the rate of homologous recombination in the recombination constructs after induction of the sequence-specific DNA double-strand break and thus the efficiency of the deletion of the transgene sequences can be increased further.
  • Various PARP inhibitors can be used.
  • Inhibitors such as 3-aminobenzamide, 8-hydroxy-2-methylquinazolin-4-one (NU1025), 1, 11b-dihydro- [2H] benzopyrano- [4, 3, 2-de] isoquinolin-3- are preferably included. on (GPI 6150), 5-aminoisoquinolinone, 3,4-dihydro-5- [4- (1-piperidinyl) butoxy] -1 (2H) -isoquinolinone or those described in WO 00/26192, WO 00/29384, WO 00 / 32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 and WO 01/23390.
  • RNA / DNA oligonucleotides into the plant
  • knockout mutants with the help of, for example, T-DNA mutagenesis
  • Point mutations can also be generated using DNA-RNA hybrids, which are also known as "chimeraplasty” are known (Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3): 240-247).
  • PTGS post-transcriptional gene silencing
  • TGS transcriptional gene silencing
  • PTGS / TGS -Procedures are particularly advantageous because the requirements on the homology between the marker protein gene to be reduced and the transgenically expressed sense or dsRNA nucleic acid sequence are lower than, for example, in the case of a classic antisense approach Marker protein nucleic acid sequences from one species also effectively reduce the expression of homologous marker protein proteins in other species, without the isolation and structural elucidation of the marker protein homologs occurring there being absolutely necessary, which considerably simplifies the workload.
  • the ⁇ -cyclase activity is reduced compared to the wild type by:
  • the ⁇ -cyclase activity is reduced compared to the wild type by introducing at least one double-stranded ⁇ -cyclase ribonucleic acid sequence or an expression cassette or expression cassettes ensuring its expression in plants.
  • genetically modified plants are used which have the lowest expression rate of an ⁇ -cyclase in flowers.
  • plants are cultivated which, in addition to the wild type, have an increased activity of at least one of the activities selected from the group HMG-CoA reductase activity, (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2- enyl-diphosphate reductase activity, 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity, l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductantisomerase activity, isopentenyl-diphosphate- ⁇ -isomerase- Activity, geranyl diphosphate synthase activity, farnesyl diphosphate synthase activity, geranyl geranyl diphosphate synthase activity, phytoene synthase activity, phytoene desaturase activity, zeta-carotene desaturase activity Activity, crtlSO activity, FtsZ activity and MinD activity.
  • HMG-CoA reductase activity E
  • E -4-hydroxy-3-methylbut-2- enyl-
  • HMG-CoA reductase activity is understood to mean the enzyme activity of an HMG-CoA reductase (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase).
  • HMG-CoA reductase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme-A into mevalonate.
  • HMG-CoA reductase activity is understood to mean the amount of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme-A or the amount of mevalonate formed in a certain time by the protein HMG-CoA reductase.
  • the amount of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme-A or the is converted by the protein HMG-CoA reductase in a certain time compared to the wild type formed amount of mevalonate increased.
  • HMG-CoA reductase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600 % of the HMG-CoA reductase activity of the wild type.
  • HMG-CoA reductase activity means the enzyme activity of an HMG-CoA reductase.
  • the HMG-CoA reductase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerin, 5mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM
  • HMG-CoA reductase The activity of the HMG-CoA reductase can be measured according to published descriptions (e.g. Schaller, Grausem, Benveniste, Chye, Tan, Song and Chua, Plant Physiol. 109 (1995), 761-770;
  • Plant tissue can be homogenized and extracted in cold buffer (100 mM potassium phosphate (pH 7.0), 4 mM MgCl, 5 mM DTT). The homogenate is centrifuged at 10,000 g at 4C for 15 minutes. The supernatant is then at
  • the ( 1 C) -evalonate formed in the reaction is quantified by adding 125 ⁇ l of a saturated potassium phosphate solution (pH 6.0) and 300 ⁇ l of ethyl acetate. The mixture is mixed well and centrifuged. Radioactivity can be measured by scintillation
  • the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity also called lytB or IspH, describes the enzyme activity of an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl -Diphosphate reductase 45 understood.
  • An (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase means a protein which has the enzymatic activity, (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate in Convert isopentenyl diphosphate and dimethyl allyl diphosphate.
  • the protein (E) -4-hydroxy- 3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase increases the amount of (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate converted or the amount of isopentenyl diphosphate and / or dimethylallyldiphosphate formed.
  • This increase in the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate reductase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate ⁇ reductase activity of the wild type.
  • the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 M MgC12, 10 M KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerin, 5mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM PMSF are added.
  • the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity can be determined by immunological detection.
  • the production of specific antibodies is by Rohdich and colleagues (Rohdich, Hecht, Gärtner, Adam, Krieger, Amslinger, Arigoni, Bacher and Eisenreich: Studies on the non-mevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein, Natl. Acad Nat. Sci. USA 99 (2002), 1158-1163).
  • LytB protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol- 4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis; FEBS Letters 532 (2002,) 437-440) an in vitro system which reduces the reduction of (E) -4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate into the isopentenyl diphosphate and dimethyl allyl diphosphate.
  • l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity is meant the enzyme activity of an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase.
  • An l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert hydroxyethyl-ThPP and glyceraldehyde-3-phosphate into 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate.
  • l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity is the amount of hydroxyethyl-ThPP and / or glyceraldehyde-3 converted by the protein l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase in a certain time Phosphate or the amount of deoxy-D-xylose-5-phosphate formed.
  • the amount converted by the protein 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase in a certain time compared to the wild type Hydroxyethyl-ThPP and / or glyceraldehyde-3-phosphate or the amount formed -deoxy-D-xylose-5-phosphate increased.
  • This increase in l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300% more preferably at least 500%, especially at least 600% of the wild-type 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity.
  • the determination of the l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably carried out under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ - Aminocaproic acid, 10% glycerin, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM PMSF are added.
  • the reaction solution (50-200 ul) for the determination of D-1-deoxy-xylulose-5-phosphate synthase activity consists of 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 3 mM MgCl, 3 mM MnCl 2 , 3 mM ATP, 1 mM thiamine diphosphate, 0.1% Tween-60, 1 mM potassium fluoride, 30 uM (2- 14 C) -Pyru- vat (0.5 uCi), 0.6 mM DL-Glyerinaldehyd-3-phosphate.
  • the plant extract is incubated for 1 to 2 hours in the reaction solution at 37C. Then the reaction is stopped by heating at 80C for 3 minutes.
  • l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity is the enzyme activity of an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase, also l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase called, understood.
  • An l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase means a protein which has the enzymatic activity to convert l-deoxy-D-xylose-5-phosphate into ⁇ -carotene. Accordingly, l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity is the amount of l-deoxy-D-xylose converted by the protein l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase in a certain time -5-phosphate or the amount of isopentenyl diphosphate formed.
  • the protein 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase thus converts the amount converted in a certain time compared to the wild type 1-Deoxy-D-xylose-5-phosphate or the amount of isopentenyl diphosphate formed is increased.
  • This increase in l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300% more preferably at least 500%, especially at least 600% 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity of the wild type.
  • the determination of the l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably carried out under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerol, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM PMSF are added.
  • DI-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase The activity of the DI-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) is measured in a buffer of 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MnCl 2 , 0, 3 mM NADPH and 0.3 mM L- Deoxy-D-xylulose-4-phosphate, which can, for example, be synthesized enzymatically (Kuzuyama, Takahashi, Watanabe and Seto: Tetrahedon letters 39 (1998) 4509-4512).
  • the reaction is started by adding the plant extract.
  • the reaction volume can typically be 0.2 to 0.5 mL; incubation takes place at 37C for 30-60 minutes. During this time, the oxidation of NADPH is monitored photometrically at 340 nm.
  • Isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity is understood to mean the enzyme activity of an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase.
  • An isopentenyl diphosphate D-isomerase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert isopentenyl diphosphate to dimethylallyl phosphate.
  • isopentenyl diphosphate D isomerase activity is understood to mean the amount of isopentenyl diphosphate or dimethylallyl phosphate formed in a certain time by the protein isopentenyl diphosphate D isomerase.
  • the amount of isopentenyl-diphosphate converted or the amount of dimethylallylphosphate formed is increased in a certain time by the protein isopentenyl-diphosphate-D-isomerase compared to the wild type.
  • This increase in the isopentenyl diphosphate ⁇ -isomerase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity of the wild type.
  • the determination of the isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably carried out under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer may consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerin, 5 mM KHC03.
  • IPP isomerase isopentenyl diphosphate isomerase
  • Geranyl diphosphate synthase activity means the enzyme activity of a geranyl diphosphate synthase.
  • a geranyl diphosphate synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert isopentenyl diphosphate and dimethylallyl phosphate into geranyl diphosphate.
  • geranyl diphosphate synthase activity is understood to mean the amount of isopentenyl diphosphate and / or dimethylallyl phosphate or amount of geranyl diphosphate formed in a certain time by the protein geranyl diphosphate synthase.
  • the amount of isopentenyl diphosphate and / or dimethylallyl phosphate or the amount of geranyl diphosphate formed is increased by the protein geranyl diphosphate synthase in a certain time compared to the wild type .
  • This increase in geranyl diphosphate synthase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably 5 at least 500%, in particular at least 600% the wild-type geranyl diphosphate synthase activity.
  • the geranyl diphosphate synthase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Moser in liquid nitrogen and with an extraction buffer
  • the extraction buffer can consist of
  • GPP synthase The activity of geranyl diphosphate synthase (GPP synthase) can be expressed in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 5 mM MnCl 2 , 2 mM DTT, 1 mM ATP, 0.2% Tween-20, 5 ⁇ M ( 1 C ) IPP and 50 ⁇ M DMAPP (dimethyl allyl pyrophosphate) can be determined after adding plant extract (according to Bouvier, Suire, d'Harlingue, Backhaus and Camara:
  • Farnesyl diphosphate synthase activity means the enzyme activity of a farnesyl diphosphate synthase.
  • a farnesyl diphosphate synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert dimethylallyl diphosphate and isopentenyl diphosphate into farnesyl diphosphate. 5
  • farnesyl diphosphate synthase activity is understood to mean the amount of dimethylallyl diphosphate and / or isopentenyl diphosphate or amount of farnesyl diphosphate 10 converted in a certain time by the protein farnesyl diphosphate synthase.
  • the amount of dimethylallyl diphosphate and / or isopentenyl diphosphate or the amount of farnesyl formed is thus converted in a certain time by the protein farnesyl diphosphate synthase compared to the wild type -Diphosphate increased.
  • This increase in the farnesyl diphosphate synthase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% the wild-type farnesyl diphosphate synthase activity.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 M ⁇ - Aminocaproic acid, 10% glycerin, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and
  • the activity of franesyl pyrophosphate snthase can be determined according to a protocol by Joly and Edwards (Journal of Biological Chemistry 268 (1993), 26983-26989). Then the enzyme activity is measured in a buffer of 10 mM HEPES (pH 7.2), 1 mM MgCl, 1 mM dithiothreitol, 20 ⁇ M geranyl pyrophosphate and 40 ⁇ M (1- 1 C) isopentenyl pyrophosphate (4 Ci / mmol).
  • the reaction mixture is incubated at 37 ° C; the reaction is stopped by adding 2.5 N HCl (in 70% ethanol with 19 ⁇ g / ml farnesol).
  • the reaction products are thus hydrolyzed within 30 minutes by acid hydrolysis at 37C.
  • the mixture is neutralized by adding 10% NaOH and extracted with hexane. An aliquot of the hexane phase can be measured using a scintillation counter to determine the built-in radioactivity.
  • reaction products can be separated into benzene / methanol (9: 1) using thin layer chromatography (silica gel SE60, Merck).
  • Radioactively labeled products are eluted and radioactivity determined (according to Gaffe, Bru, Causse, Vidal, Stamitti-Bert, Carde and Gallusci: LEFPS1, a tomato farnesyl pyrophosphate gene highly expressed during early fruit development; Plant Physiology 123 (2000) 1351-1362 ).
  • Geranyl-geranyl diphosphate synthase activity is understood to mean the enzyme activity of a geranyl-geranyl diphosphate synthase.
  • a geranyl-geranyl-diphosphate synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert farnesyl-diphosphate and isopentenyl-diphosphate into geranyl-geranyl-diphosphate.
  • geranyl-geranyl diphosphate synthase activity is understood to mean the amount of farnesyl diphosphate and / or isopentenyl diphosphate or the amount of geranyl geranyl diphosphate formed in a certain time by the protein geranyl-geranyl diphosphate synthase.
  • the amount of farnesyl diphosphate and / or isopentenyl diphosphate and / or isopentenyl diphosphate or the amount of geranyl-geranyl diphosphate formed is increased.
  • This increase in geranyl-geranyl diphosphate synthase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the wild-type geranyl-geranyl-piphosphate synthase activity.
  • the geranyl-geranyl diphosphate synthase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 M HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 10 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerol, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM PMSF are added.
  • GGPP synthase Activity measurements of geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPP synthase) can be carried out by the method described by Dogbo and Camara (in Biochim. Biophys. Acta 920 (1987), 140-148: Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinity chromatography).
  • a buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 2 mM MgCl 2 , 1 mM MnCl 2 , 2 mM dithiothreitol, (1- 1 C) IPP (0.1 ⁇ Ci, 10 ⁇ M), 15 ⁇ M DMAPP, GPP or FPP) with a total volume of about 200 ul plant extract added. Incubation can be for 1-2 hours (or longer) at 30C. The reaction is carried out by adding 0.5 ml of ethanol and 0.1 ml of 6N HCl. After incubation at 37 ° C.
  • the reaction mixture is neutralized with 6N NaOH, mixed with 1 ml of water and extracted with 4 ml of diethyl ether.
  • the amount of radioactivity is determined in an aliquot (for example 0.2 ml) of the ether phase by means of scintillation counting.
  • the radioactively labeled prenyl alcohols can be shaken out in ether and treated with HPLC (25 cm column Spherisorb ODS-1,
  • Phytoene synthase activity means the enzyme activity of a phytoene synthase.
  • a phytoene synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert geranyl-geranyl diphosphate into phytoene.
  • phytoene synthase activity is understood to mean the amount of geranyl-geranyl diphosphate or amount of phytoene formed in a certain time by the protein phytoene synthase.
  • the amount of geranyl-geranyl diphosphate or the amount of phytoene formed is increased in a certain time by the protein phytoene synthase compared to the wild type.
  • This increase in phytoene synthase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the phytoene Wild-type synthase activity.
  • the phytoene synthase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerin, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 M PMSF are added.
  • phytoene (by heating fewer iodine crystals) on the silica plates.
  • a phytoene standard serves as a reference. The amount of radioactively labeled product is determined by measurement in the scintillation counter. Alternatively, phytoene can also be quantified using HPLC, which is equipped with a radioactivity detector (Fräser, Albrecht and Sandmann: Development of high Performance liquid Chromatographie Systems for the Separation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specific enzymatic reactions; J. Chromatogr. 645 (1993) 265-272).
  • Phytoene desaturase activity means the enzyme activity of a phytoene desaturase.
  • a phytoene desaturase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert phytoene into phytofluene and / or phytofluene into ⁇ -carotene (zeta-carotene).
  • phytoene desaturase activity is understood to mean the amount of phytoene or phytofluene or amount of phytofluene or ⁇ -carotene converted in a certain time by the protein phytoene desaturase.
  • the amount of phytoene or phytofluene or the amount of phytofluene or notch.-carotene formed is increased in a certain time by the protein phytoen desaturase compared to the wild type.
  • This increase in phytoene desaturase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the phytoene Wild-type desaturase activity.
  • the phytoene desaturase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Mosern in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the respective ratio depends on the enzyme activities in the available plant material, so that a determination and quantification of the enzyme activities within the linear measuring range is possible.
  • the extraction buffer can consist of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v / v) Triton X-100, 2 mM ⁇ -aminocaproic acid, 10% glycerin, 5 mM KHC03. Shortly before the extraction, 2 mM DTT and 0.5 mM PMSF are added.
  • the activity of phytoene desaturase can be measured by incorporating radioactively labeled ( 1 C) phytoene in unsaturated carotenes (according to Römer, Fraser, Kiano, Shipton, Misawa, Schuch and Bramley: Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants; Nature Biotechnology 18 (2000) 666-669).
  • Radioactively labeled phytoenes can be synthesized according to Fr ser (Fräser, De la Rivas, Mackenzie, Bramley: Phycomyces blakesleanus CarB mutants: their use in assays of phytoene desaturase; Phytochemistry 30 (1991), 3971-3976).
  • Membranes from plastids of the target tissue can be incubated with 100 mM MES buffer (pH 6.0) with 10 mM MgCl 2 and 1 mM dithiothreitol in a total volume of 1 mL.
  • 1 C -Pytoene dissolved in acetone (about 100,000 decays / minute for one incubation each) is added, the acetone concentration not exceeding 5% (v / v).
  • This mixture is incubated at 28C for about 6 to 7 hours in the dark with shaking.
  • pigments are extracted three times with about 5 mL petroleum ether (mixed with 10% diethyl ether) and separated and quantified by HPLC.
  • Zeta-carotene desaturase activity means the enzyme activity of a zeta-carotene desaturase.
  • a zeta-carotene desaturase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert ot-carotene into neurosporin and / or neurosporin into lycopene.
  • zeta-carotene desaturase activity means the amount of ⁇ -carotene or neurosporin or the amount of neurosporin or lycopene formed in a certain time by the protein zeta-carotene desaturase.
  • the amount of Z-carotene or neurosporin or the amount of neurosporin or lycopene formed is increased in a certain time by the protein zeta-carotene desaturase compared to the wild type.
  • This increase in the zeta-carotene desaturase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%,
  • zeta-carotene desaturase activity in genetically modified plants according to the invention and in wild-type or reference plants is preferably determined under the following conditions:
  • Frozen plant material is homogenized by intensive Moser in liquid nitrogen and with an extraction buffer
  • the extraction buffer can consist of
  • ZDS desaturase ⁇ -carotene desaturase
  • Each analytical approach contains 3 mg phosphytidylcholine, which in 0.4 M potassium umphosphate buffer (pH 7.8), 5 ⁇ g g-carotene or neurosporene, 0.02% butylated hydroxytoluene, 10 ⁇ l decyl plastoquinone (1 mM methanolic stock solution) and plant extract.
  • the volume of the plant extract must be adapted to the amount of ZDS desaturase activity present in order to enable quantifications in a linear measuring range.
  • CrtlSO activity means the enzyme activity of a crtlSO protein.
  • a crtlSO protein is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert 7, 9, 7 ', 9' -tetra-cis-lycopene into all-trans-lycopene.
  • crtlSO activity is understood to mean the amount 7, 9, 7 ', 9' -tetra-cis-lycopene or amount of all-trans-lycopene formed in a certain time by the protein crtlSO.
  • the converted amount 7, 9, 7 ', 9' -tetra-cis-lycopene or the amount formed all-trans is thus in a certain time compared to the wild type by the crtlSO protein - Lycopene increased.
  • This increase in crtlSO activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the crtlSO activity of the Wild type.
  • FtsZ activity is understood to mean the physiological activity of an FtsZ protein.
  • An FtsZ protein is understood to be a protein which has a cell division and plastid division-promoting effect and has homologies to tubulin proteins.
  • MinD activity is understood to mean the physiological activity of a MinD protein.
  • a MinD protein is understood to be a protein that has a multifunctional role in cell division. It is a membrane-associated ATPase and can show an oscillating movement from pole to pole within the cell.
  • the increase in the activity of enzymes of the non-mevalonate pathway can lead to a further increase in the desired keto-carotenoid end product.
  • examples include the 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase, the 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase and the 2-C-methyl-D- Erythritol-2,4-cyclodiphoshate synthase.
  • the activity of the enzymes mentioned can be increased by changing the gene expression of the corresponding genes.
  • the changed concentrations of the relevant proteins can be detected using antibodies and corresponding blotting techniques as standard.
  • HMG-CoA reductase activity and / or (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity and / or l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase Activity and / or l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity and / or isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity and / or geranyl diphosphate synthase activity and / or farnesyl diphosphate syn - thase activity and / or geranyl-geranyl diphosphate synthase activity and / or phytoene synthase activity and / or phytoene desaturase activity and / or zeta-carotene desaturase activity and / or crtISO activity and / or FtsZ activity and / or MinD activity can take place in various ways, for example by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the expression and
  • Such a change, which results in an increased expression rate of the gene can take place, for example, by deleting or inserting DNA sequences.
  • Farnesyl diphosphate synthase gene or geranyl geranyl diphosphate synthase gene or phytoene synthase gene or phytoene desaturase gene Gene or zeta-carotene desaturase gene or crtlSO gene or FtsZ gene or MinD gene can be used.
  • Synthase sequences or phytoene desaturase sequences or zeta-carotene desaturase sequences or crtlSO sequences or FtsZ sequences or MinD sequences from eukaryotic sources which contain introns are not in the event that the host plant is able or cannot be enabled to express the corresponding proteins, preferably to use already processed nucleic acid sequences, such as the corresponding cDNAs.
  • the preferred transgenic plants according to the invention therefore have at least one further HMG-CoA reductase gene and / or (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase gene and compared to the wild type / or l-deoxy-D-xylose ⁇ 5-phosphate synthase gene and / or 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase gene and / or isopentenyl-diphosphate- ⁇ -isomerase gene and / or Geranyl diphosphate synthase gene and / or farnesyl diphosphate synthase gene and / or geranyl geranyl diphosphate synthase gene and / or phytoene synthase gene and / or phytoene desaturase gene and / or zeta Carotene desaturase gene and / or crtlSO gene and / or FtsZ gene and / or MinD gene.
  • the genetically modified plant has, for example, at least one exogenous nucleic acid, coding for an HMG-CoA reductase or at least two endogenous nucleic acids, coding for an HMG-CoA reductase and / or at least one exogenous nucleic acid, coding for an (E) -4 -Hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase or at least two endogenous nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase and / or at least one exogenous nucleic acid a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase or at least two endogenous nucleic acids encoding an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase and / or at least one exogenous nucleic acid encoding an l-deoxy-D -Xylose-5
  • HMG-CoA reductase genes are:
  • HMG-CoA reductase genes as well as other HMG-CoA reductase genes from other organisms with the following accession numbers:
  • Examples of l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes are:
  • nucleic acid encoding an I-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase from Lycopersicon esculentum, ACCESSION # AF143812 (nucleic acid: SEQ ID NO: 103, protein: SEQ ID NO: 104),
  • accession numbers AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286_1, NP_193291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AAM65798.1, NP_566686.1, CAD22531.1, AAC33513.1, CAC08458.1, AAG10432.1, T044040, AAP14.
  • nucleic acid encoding an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase from Arabidopsis thaliana, ACCESSION # AF148852, (nucleic acid: SEQ ID NO: 105, protein: SEQ ID NO: 106),
  • isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase genes are:
  • geranyl diphosphate synthase genes are:
  • a nucleic acid encoding a Farnesyl diphosphate synthase from Arabidopsis thaliana (FPS1), ACCESSION # U80605, published by Cunillera, N. , Arro, M., Delourme, D., Karst, F., Boronat, A. and Ferrer, A. : Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed farnesyl-diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996), (nucleic acid: SEQ ID O: 111, protein: SEQ ID O: 112) .
  • Q93RB4 Q93RB5, Q93RB3, Q93RB1, Q93RB2, Q920E5.
  • geranyl-geranyl diphosphate synthase genes are:
  • phytoene synthase genes examples include:
  • phytoene desaturase genes are:
  • a nucleic acid encoding a Narcissus pseudonarcissus zeta-carotene desaturase ACCESSION # AJ224683, published by Al-Babili, S. , Oelschlegel, J. and Beyer, P .: A cDNA encoding for beta carotene desaturase (Accession NO.AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L .. (PGR98-103), Plant Physiol. 117, 719-719 (1998), (nucleic acid: SEQ ID NO: 119, protein: SEQ ID NO: 120),
  • crtISO genes are:
  • nucleic acid encoding a crtlSO from Lycopersicon esculentum; ACCESSION # AF416727, published by Isaacson, T., Ronen, G., Zamir, D. and Hirschberg, J.: Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002), (nucleic acid: SEQ ID NO: 121, protein: SEQ ID NO: 122),
  • FtsZ genes are:
  • MinD genes are:
  • nucleic acids encoding proteins are preferably used as HMG-CoA reductase genes, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 100 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which have an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 100, and which have the enzymatic property of an HMG-CoA reductase.
  • HMG-CoA reductases and HMG-CoA reductase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 100 easy to find.
  • HMG-CoA reductases and HMG-CoA reductase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 99 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques easy to find in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the HMG-CoA reductase of the sequence SEQ ID NO: 100.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code. Those codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this. The codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the organisms concerned.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 99 is introduced into the organism.
  • (N) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase genes as nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 102 or one of these sequences Substitution, insertion or deletion of a sequence derived from amino acids, which has an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the 7 amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 102, and which have the enzymatic property of an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-di-phosphate reductase.
  • (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductases and (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase genes can also be found, for example starting from the sequence SEQ ID NO: 101 from various organisms, the genomic sequence of which is not known, as described above, can be easily found in a manner known per se by hybridization and PCR techniques.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the (E) -4- Hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase of sequence SEQ ID NO: 102.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 101 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 104 or one of these sequences by substitution, insertion or deletion are preferably used as (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes sequence derived from amino acids, which has an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 104, and which has the enzymatic property a (l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase.
  • (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase and (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above , easy to find by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 104.
  • (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase and (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes can also be obtained from different organisms, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 103 whose genomic sequence is not known, as described above, can easily be found by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the (1-deoxy-D-xylose-5 Phosphate synthase of sequence SEQ ID NO: 104.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 103 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 106 or one of these sequences by substitution, insertion or deletion of are used as l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase genes
  • Amino acid-derived sequence which has an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 106 and which has the enzymatic property of a Have l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase.
  • l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase and l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above , easily found by homology comparisons of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 106.
  • l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase and l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase genes can also be found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 105 from different organisms whose genomic sequence is not known, as described above, can easily be found by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the 1-deoxy-D-
  • Xylose-5-phosphate reductoisomerase of sequence SEQ ID NO: 106 Xylose-5-phosphate reductoisomerase of sequence SEQ ID NO: 106.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 105 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins are preferably used as isopentenyl-D-isomerase genes, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 108 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 108 and which have the enzymatic property of an isopentenyl-D-isomerase.
  • isopentenyl-D-isomerases and isopentenyl-D-isomerase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 108 easy to find.
  • isopentenyl-D-isomerases and isopentenyl-D-isomerase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 107 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques easy to find in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the isopentenyl-D-isomerase of the sequence SEQ ID NO: 108.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 107 is introduced into the organism.
  • the geranyl diphosphate synthase genes used are preferably nucleic acids which encode proteins, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 110 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and which have an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 110, and which have the enzymatic property of a geranyl diphosphate synthase.
  • geranyl diphosphate synthases and geranyl diphosphate synthase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 110 easy to find.
  • geranyl diphosphate synthases and geranyl diphosphate synthase genes can also be found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 109 from various sources.
  • Organisms whose genomic sequence is not known, as described above, can easily be found by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the geranyl diphosphate synthase of the sequence SEQ ID NO: 110.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 109 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 112 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and which have an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 112, and which have the enzymatic property of a farnesyl diphosphate synthase.
  • farnesyl diphosphate synthases and farnesyl diphosphate synthase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 112 easy to find.
  • farnesyl diphosphate synthases and farnesyl diphosphate synthase genes can also be found, for example, from the sequence SEQ ID NO: 111
  • Organisms whose genomic sequence is not known, as described above, can easily be found by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the farnesyl diphosphate synthase of the sequence SEQ ID NO: 112. Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 111 is introduced into the organism.
  • geranyl-geranyl-diphosphate synthase genes are preferably used
  • geranyl-geranyl-diphosphate synthases and geranyl-geranyl-diphosphate synthase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the Easily find SeQ ID NO: 114.
  • geranyl-geranyl-diphosphate synthases and geranyl-geranyl-diphosphate synthase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 113 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques can be easily found in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the geranyl-geranyl-diphosphate synthase of the sequence SEQ ID NO: 114.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 113 is introduced into the organism.
  • nucleic acids encoding proteins are preferably used as phytoene synthase genes, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 116 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 116, and which have the enzymatic property of a phytoene synthase.
  • phytoene synthases and phytoene synthase genes can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 116.
  • phytoene synthases and phytoene synthase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 115 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by means of hybridization and PCR techniques in a manner known per se Easy to find.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the phytoene synthase of the sequence SEQ ID NO: 116.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 115 is introduced into the organism.
  • the phytoene desaturase genes used are preferably nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 118 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30 %, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 118, and which have the enzymatic property of a phytoene desaturase.
  • phytoene desaturases and phytoene desaturase genes can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 118.
  • phytoene desaturases and phytoene desaturase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 117 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se Easy to find.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the phytoene desaturase of the sequence SEQ ID NO: 118.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 117 is introduced into the organism.
  • the zeta-carotene desaturase genes used are preferably nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 120 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and which have an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 120, and which have the enzymatic property of a zeta-carotene desaturase.
  • zeta-carotene desaturases and zeta-carotene desaturase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SEQ ID NO: 120 easy to find.
  • zeta-carotene desaturases and zeta-carotene desaturase genes can also be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 119 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques easy to find in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the zeta-carotene desaturase of the sequence SEQ ID NO: 120.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 119 is introduced into the organism.
  • nucleic acids which encode proteins are preferably used as CrtlSO genes, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 122 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 122, and which have the enzymatic property of a Crtlso.
  • CrtlSO and CrtlSO genes can be found, for example, from different organisms, their genomic
  • CrtlSO and CrtlSO genes can also be easily found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 121 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins containing the amino acid sequence of the CrtlSO of the sequence SEQ ID NO: 122.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code. Those codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this. The codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the organisms concerned.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 121 is introduced into the organism.
  • the FtsZ genes used are preferably nucleic acids which encode proteins, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 124 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 124 and which have the enzymatic property of an FtsZ.
  • FtsZn and FtsZ genes can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 124.
  • FtsZn and FtsZ genes can also easily be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 123 from different organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se find.
  • nucleic acids which encode proteins containing the amino acid sequence of the FtsZ of the sequence SEQ ID NO: 124 are introduced into organisms to increase the FtsZ activity
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • Those codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the organisms concerned.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 123 is introduced into the organism.
  • the preferred MinD genes are nucleic acids encoding proteins containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 126 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 126, and which have the enzymatic property of a MinD.
  • MinDn and MinD genes can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by comparing the homology of the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SeQ ID NO: 126.
  • MinDn and MinD genes can also easily be obtained, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 125 from different organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se find.
  • nucleic acids are introduced into organisms which code for proteins containing the amino acid sequence of the MinD of the sequence SEQ ID NO: 126.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons that are frequently used in accordance with the plant-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 125 is introduced into the organism.
  • All of the above-mentioned HMG-CoA reductase genes, (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase genes, 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes, l Deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase genes, isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase genes, geranyl diphosphate synthase genes, farnesyl diphosphate synthase genes, geranyl geranyl diphosphate synthase Genes, phytoene synthase genes, phytoene desaturase genes, zeta-carotene desaturase genes, crtlSO genes, FtsZ genes or MinD genes are also known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by Fragment condensation of individual
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the addition of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps using the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions, as well as general cloning methods, are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the plants additionally have a reduced endogenous ⁇ -hydroxylase activity compared to the wild type.
  • a reduced activity is preferably understood to mean the partial or essentially complete inhibition or blocking of the functionality of an enzyme in a plant cell, plant or a part, tissue, organ, cells or seeds derived therefrom based on different cell biological mechanisms ,
  • Activity in plants can be reduced compared to the wild type, for example by reducing the amount of protein or the amount of mRNA in the plant. Accordingly, an activity reduced compared to the wild type can be determined directly or by determining the amount of protein or the mRNA amount of the plant according to the invention in comparison to the wild type.
  • a reduction in an activity comprises a quantitative reduction of a protein up to an essentially complete absence of the protein (ie a lack of detectability of the corresponding activity or a lack of immunological detectability of the corresponding protein).
  • Endogenous ⁇ -hydroxylase activity is understood to mean the enzyme activity of the endogenous, plant-specific ⁇ -hydroxylase.
  • An endogenous ⁇ -hydroxylase is understood to mean an endogenous, plant-specific hydroxylase as described above.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase is understood to mean the ß-hydroxylase of Tagetes errecta.
  • An endogenous ⁇ -hydroxylase is accordingly understood to mean, in particular, a plant's own protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into zeaxanthin.
  • endogenous ⁇ -hydroxylase activity is understood to mean the amount of ß-carotene or the amount of zeaxanthin formed by the protein endogenous ß-hydroxylase.
  • the amount of ⁇ -carotene converted or the amount of zeaxanthin formed by the protein endogenous ⁇ -hydroxylase is thus reduced in a certain time.
  • This reduction in endogenous ⁇ -hydroxylase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, further preferably 100%.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase activity is particularly preferably completely switched off.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase activity is determined as described above analogously to the determination of the hydroxylase activity.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase activity in plants is preferably reduced by at least one of the following methods:
  • endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA is directed against an endogenous ⁇ -hydroxylase gene (ie genomic DNA sequences such as the promoter sequence) or an endogenous ⁇ -hydroxylase transcript (ie mRNA sequences),
  • endogenous ⁇ -hydroxylase antisense ribonucleic acid sequence hereinafter also called endogenous ⁇ -hydroxylase antisenseRNA, or an expression cassette ensuring its expression.
  • endogenous ⁇ -hydroxylase antisenseRNA is directed against an endogenous ⁇ -hydroxylase gene (ie genomic DNA sequences) or an endogenous ⁇ -hydroxylase gene transcript (ie RNA sequences). Also included are ⁇ -anomeric nucleic acid sequences
  • endogenous ⁇ -hydroxylase sense ribonucleic acid sequence hereinafter also referred to as endogenous ⁇ -hydroxylase sense RNA, for inducing a suppression or an expression cassette ensuring its expression
  • Knockout mutants can preferably be introduced by means of targeted insertion into said endogenous ⁇ -hydroxylase gene by homologous recombination or
  • a double-stranded endogenous ⁇ -hydroxylase ribonucleic acid sequence or also endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA is preferably understood to mean an RNA molecule which has one
  • Has region with double-strand structure and in this region contains a nucleic acid sequence which
  • a) is identical to at least a part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase transcript and / or b) is identical to at least part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase promoter sequence.
  • an RNA which has an area with a double-strand structure and which contains a nucleic acid sequence in this area is therefore preferably introduced into the plant to reduce the endogenous ⁇ -hydroxylase activity
  • a) is identical to at least a part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase transcript and / or
  • b) is identical to at least part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase promoter sequence.
  • endogenous ⁇ -hydroxylase transcript is understood to mean the transcribed part of an endogenous ⁇ -hydroxylase gene which, in addition to the endogenous ⁇ -hydroxylase coding sequence, also contains, for example, non-coding sequences, such as UTRs.
  • a part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase transcript or of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase promoter sequence means partial sequences which can range from a few base pairs to complete sequences of the transcript or the promoter sequence , The person skilled in the art can easily determine the optimal length of the partial sequences by routine experiments.
  • the length of the partial sequences is at least 10 bases and at most 2 kb, preferably at least 25 bases and at most 1.5 kb, particularly preferably at least 50 bases and at most 600 bases, very particularly preferably at least 100 bases and at most 500, most preferably at least 200 bases or at least 300 bases and at most 400 bases.
  • the partial sequences are preferably selected in such a way that the highest possible specificity is achieved and activities of other enzymes, the reduction of which is not desired, are not reduced. It is therefore advantageous for the partial sequences of the parts of the endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA parts of the endogenous ⁇ -hydroxy select transcripts and / or partial sequences of the endogenous ⁇ -hydroxylase promoter sequences which do not occur in other activities.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA therefore contains a sequence which is identical to a part of the plant's own endogenous ⁇ -hydroxylase transcript and which codes for the 5 V end or the 3 'end of the plant's own nucleic acid contains an endogenous ß-hydroxylase.
  • non-translated regions in the 5 ⁇ or 3x of the transcript are suitable for producing selective double-strand structures.
  • Another object of the invention relates to double-stranded RNA molecules (dsRNA molecules) which, when introduced into a plant organism (or a cell, tissue, organ or propagation material derived therefrom) bring about the reduction of an endogenous ⁇ -hydroxylase.
  • dsRNA molecules double-stranded RNA molecules
  • the invention relates to a double-stranded RNA molecule for reducing the expression of an endogenous ⁇ -hydroxylase (endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA) preferably comprising
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of a “sense” RNA endogenous ⁇ -hydroxylase transcript, and
  • RNA strand which is essentially, preferably completely, complementary to the RNA “sense” strand under a).
  • a nucleic acid construct is preferably used to transform the plant with an endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA, which is introduced into the plant and which is transcribed in the plant into the endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA.
  • the present invention also relates to a nucleic acid construct that can be transcribed into
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of the “sense” RNA endogenous ⁇ -hydroxylase transcript, and
  • RNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the RNA sense strand under a).
  • nucleic acid constructs are also called expression cassettes or expression vectors below.
  • the endogenous 5 ⁇ -hydroxylase nucleic acid sequence is preferably understood to mean the sequence according to SEQ ID NO: 127 or a part thereof.
  • the homology is preferably at least 75%, preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90% most
  • a 100% sequence identity between dsRNA and an endogenous ß-hydroxylase gene transcript is not absolutely necessary in order to bring about an efficient reduction in endogenous ß-hydroxylase expression. As a result, there is an advantage that
  • the process is tolerant of sequence deviations, such as those that may arise as a result of genetic mutations, polymorphisms or evolutionary divergences.
  • sequence deviations such as those that may arise as a result of genetic mutations, polymorphisms or evolutionary divergences.
  • the endogenous dsRNA which was generated on the basis of the endogenous ⁇ -hydroxylase sequence of the one organism, the endogenous
  • the dsRNA preferably comprises sequence regions of endogenous ⁇ -hydroxylase gene transcripts which correspond to conserved regions. Said conserved areas can easily be derived from sequence comparisons.
  • an "essentially identical" dsRNA can also be defined as a nucleic acid sequence capable of hybridizing with part of an endogenous ⁇ -hydroxylase gene transcript (e.g. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA)
  • “Essentially complementary” means that the “antisense” RNA strand can also have insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the complement of the “sense” RNA strand 45.
  • the homology is preferably at least 80%, preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 100% between the "antisense” RNA strand and the complement of the "sense” RNA strand.
  • the endogenous ⁇ -hydroxylase dsRNA comprises
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of the “sense” RNA transcript of the promoter region of an endogenous ⁇ -hydroxylase gene
  • RNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the RNA “sense” strand under a).
  • the corresponding nucleic acid construct to be used preferably for transforming the plants comprises
  • a “sense” DNA strand which is essentially identical to at least part of the promoter region of an endogenous ⁇ -hydroxylase gene
  • an “antisense” DNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the DNA “sense” strand under a).
  • the following partial sequences are particularly preferably used to produce the endogenous ⁇ -hydroxylase sequences for reducing the endogenous ⁇ -hydroxylase activity, in particular for Tagetes erecta:
  • SEQ ID NO: 163 Sense fragment of the 5 terminal region of the endogenous ⁇ -hydroxylase
  • SEQ ID NO: 164 Antisense fragment of the 5'-terminal region of the endogenous ⁇ -hydroxylase
  • the dsRNA can consist of one or more strands of polyribonucleotides.
  • several individual dsRNA molecules, each comprising one of the ribonucleotide sequence sections defined above, can be introduced into the cell or the organism.
  • the double-stranded dsRNA structure can be formed from two complementary, separate RNA strands or - preferably - from a single, self-complementary RNA strand.
  • sense RNA strand and anti sense "RNA strand preferably covalently linked together in the form of an inverted" repeat ".
  • the dsRNA can also comprise a hairpin structure, in that the “sense” and “antisense” strand are connected by a connecting sequence (“linker”; for example an intron).
  • linker for example an intron
  • the self-complementary dsRNA structures are preferred since they only require the expression of an RNA sequence and the complementary RNA strands always comprise an equimolar ratio.
  • the connecting sequence is an intron (e.g. an intron of the ST-LS1 gene from potato; Vancanneyt GF et al. (1990) Mol Gen Genet 220 (2): 245-250).
  • the nucleic acid sequence coding for a dsRNA can contain further elements, such as, for example, transcription termination signals or polyadenylation signals.
  • genetically modified plants which have an increased or caused ketolase activity in petals and an increased hydroxylase activity and an increased ß-cyclase activity compared to the wild type, genetically modified plants which have an increased or caused ketolase activity in petals and an increased hydroxylase activity and a reduced ⁇ -cyclase activity compared to the wild type,
  • Activity selected from the group HMG-CoA reductase activity, (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase activity, l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase- Activity, 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity, isopentenyl diphosphate D isomerase activity, geranyl diphosphate synthase activity, farnesyl diphosphate synthase activity, geranyl geranyl diphosphate activity Synthase activity, phytoene synthase activity, phytoene desaturase activity, zeta-carotene desaturase activity, crtlSO activity, FtsZ activity and MinD activity, genetically modified plants that have an increased or caused ketolase activity in petals, a reduced ⁇ -cyclase activity, an increased ß-cyclase activity and an increased hydroxylase activity and a reduced ß-hydroxylase activity compared to the
  • Geranyl-geranyl-diphosphate synthase activity Geranyl-geranyl-diphosphate synthase activity, phytoene synthase activity, phytoene desaturase activity, zeta-carotene desaturase activity, crtlSO activity, FtsZ activity and MinD activity.
  • genetically modified plants have, compared to the wild type, an increased or caused ketolase activity in petals, an increased ⁇ -cyclase activity and an increased hydroxylase activity, wherein
  • the increased ketolase activity is caused by introducing nucleic acids encoding a protein containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which have an identity of at least 20% Amino acid- plane with the sequence SEQ ID NO: 2 and has the enzymatic property of a ketolase,
  • the increased ß-cyclase activity is caused by introducing nucleic acid encoding a ß-cyclase, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 96 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which has an identity of has at least 20% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 20
  • the increased hydroxylase activity is caused by introducing nucleic acids encoding a hydroxylase containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 98 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which have an identity of at least 20% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 18.
  • genetically modified plants have, compared to the wild type, an increased or caused ketolase activity in petals, a reduced ⁇ -cyclase activity, an increased ß-cyclase activity, an increased hydroxylase activity and a reduced endogenous ß-hydroxylase -Activity on where
  • the increased ketolase activity is caused by introducing nucleic acids encoding a protein containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which have an identity of at least 20% Amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 2 and has the enzymatic property of a ketolase,
  • the increased ß-cyclase activity is caused by introducing nucleic acid encoding a ß-cyclase, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 96 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids, which has an identity of has at least 20% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 20,
  • the increased hydroxylase activity is caused by introducing nucleic acids encoding a hydroxylase containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 98 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20 % at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 18, and the reduced ⁇ -cyclase activity and a reduced endo- gene ⁇ -hydroxylase activity according to the preferred embodiments described above.
  • These genetically modified plants can be produced, as described below, for example by introducing individual nucleic acid constructs (expression cassettes) or by introducing multiple constructs which contain up to two, three or four of the activities described.
  • the cultivation step of the genetically modified plants is preferably followed by harvesting the plants and isolating ketocarotenoids from the petals of the plants.
  • the transgenic plants are grown on nutrient media in a manner known per se and harvested accordingly.
  • ketocarotenoids from the harvested blossom 2 0 scroll is carried out in manner known per se, for example by drying and subsequent extraction and proceedingsenf lls further chemical or physical purification processes such as, for example, precipitation methods, crystallography, thermal separation methods such as rectification methods or physical 25 separation method, such as chromatography.
  • Ketocarotenoids are isolated from the petals, for example, preferably using organic solvents such as acetone, hexane, ether or tert. Methyl butyl ether.
  • ketocarotenoids in particular from petals, are described, for example, in Egger and Kleinig (Phytochemistry (1967) 6, 437-440) and Egger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618).
  • ketocarotenoids are preferably selected from the group consisting of astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin and adonixanthin.
  • ketocarotenoid is astaxanthin. 40
  • the ketocarotenoids are obtained in petals in the form of their mono- or diesters with fatty acids.
  • Some detected fatty acids are, for example, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid and lauric acid (Kamata and Simpson (1987) Co p. Biochem. Physiol. Vol. 86B (3), 587-591).
  • the production of genetically modified plants with increased or caused ketolase activity in flower petals is described as an example.
  • the increase in further activities such as, for example, the hydroxylase activity and / or the ⁇ -cyclase activity and / or the HMG-CoA reductase activity and / or the (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2 -enyl-diphosphate reductase activity and / or the l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity and / or the l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity and / or the isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase activity and / or the granyl diphosphate synthase activity and / or the farnesyl diphosphate synthase activity and / or the geranyl geranyl diphosphate synthase activity and / or the phytoene synthase activity and / or the phytoene desaturase activity and / or the zeta-carotene desaturase activity and / or the cr
  • the reduction of further activities can be carried out analogously using anti- ⁇ -cyclase nucleic acid sequences or ⁇ -cyclase-inverted repeat nucleic acid sequence or using anti-endogenous ß-hydroxylase nucleic acid sequences or endogenous ß-hydroxylase inverted repeat nucleic acid sequences instead of nucleic acid sequences encoding a ketolase.
  • the transformation can take place individually or through multiple constructs.
  • the transgenic plants are preferably produced by transforming the starting plants, using a nucleic acid construct which contains the above-described nucleic acids encoding a ketolase, which comprises one or more Regulation signals are functionally linked, which ensure transcription and translation in plants.
  • nucleic acid constructs in which the coding nucleic acid sequence is functionally linked to one or more regulatory signals which ensure transcription and translation in plants, are also called expression cassettes below.
  • the invention further relates to nucleic acid constructs containing at least one nucleic acid encoding a ketolase and additionally at least one further nucleic acid selected from the group a) nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase, b) nucleic acids encoding a ⁇ -hydroxylase, c) nucleic acids encoding an HMG-CoA Reductase, d) nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase e) nucleic acids encoding an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase, f) nucleic acids encoding a 1-deoxy-D-xylose
  • nucleic acids encoding an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase g) nucleic acids encoding an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase, h) nucleic acids encoding a geranyl diphosphate synthase, i) nucleic acids encoding a farnesyl diphosphate synthase, j) nucleic acids encoding a geranyl geranyl diphosphate
  • nucleic acid constructs are therefore preferably used in order to activate in particular to increase or decrease more than 4 activities in the organism.
  • the preferred genetically modified organisms are produced by introducing combinations of nucleic acid constructs.
  • Preferred nucleic acid constructs according to the invention contain the following combinations of nucleic acids functionally linked to one or more regulation signals which ensure transcription and translation in plants:
  • Ketolase nucleic acids encoding a ketolase beta: nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase hxdro (OEX): expression of nucleic acids encoding a ⁇ -hydroxylase hydro (RNAi): double-stranded endogenous ⁇ -hydroxylase ribonucleic acid sequence and / or endogenous ⁇ -hydroxylase antisense sequence epsilon: double-stranded ⁇ -cyclase ribonucleic acid sequence and / or ⁇ -cyclase antisense ribonucleic acid sequence (xxx): at least one nucleic acid selected from the group
  • Nucleic acids encoding an HMG-CoA reductase nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase, nucleic acids encoding an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase, nucleic acids encoding a 1-deoxy
  • D-xylose-5-phosphate reductoisomerase nucleic acids encoding an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase, nucleic acids encoding a geranyl diphosphate synthase, nucleic acids encoding a farnesyl diphosphate synthase, nucleic acids encoding a geranyl geranyl synthase diphosphate Nucleic acids encoding a phytoene synthase, nucleic acids encoding a phytoene desaturase, nucleic acids encoding a zeta-carotene desaturase, nucleic acids encoding a crtlSO
  • Protein encoding an FtsZ protein and nucleic acids encoding a MinD protein Protein encoding an FtsZ protein and nucleic acids encoding a MinD protein.
  • the regulation signals preferably contain one or more promoters which ensure transcription and translation in plants.
  • the expression cassettes contain regulatory signals, that is to say regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette comprises upstream, ie at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, ie at the 3' end, a polyadenylation signal and optionally further regulatory elements which match the coding sequence for at least one of the above genes described are operatively linked.
  • An operational link is understood to mean the sequential arrangement tion of promoter, coding sequence, terminator and possibly other regulatory elements such that each of the regulatory elements can perform its function as intended in the expression of the coding sequence. 5
  • nucleic acid constructs, expression cassettes and vectors for plants and methods for producing transgenic plants and the transgenic plants themselves are described below by way of example.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER),
  • any promoter that can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette.
  • Constant promoter means those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a relatively long period of plant development, preferably at all times during plant development.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used in particular. Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of the CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 35 6: 221-228) or the 19S CaMV promoter (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202 ).
  • pds promoter Another suitable constitutive promoter is the pds promoter (Pecker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Be USA 89:
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter (review article: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), by which the expression of the ketolase gene in the plant at a certain point in time can be controlled.
  • a chemically inducible promoter e.g. the PRP1 promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a benzenesulfonamide-inducible promoter (EP 0 388 186), a tetracycline-inducible promoter Promoter (Gatz et al.
  • promoters that are induced by biotic or abiotic stress such as the pathogen-inducible promoter of the PRPL gene (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato (US 5,187,267), the cold-inducible alpha-amylase promoter from the potato (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter (EP375091).
  • pathogen-inducible promoter of the PRPL gene Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366
  • the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato US 5,187,267
  • the cold-inducible alpha-amylase promoter from the potato
  • the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter EP375091.
  • Pathogen-inducible promoters include those of genes induced by pathogen attack such as genes from PR proteins, SAR proteins, b-1, 3-glucanase, chitinase etc. (e.g. Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al.
  • wound-inducible promoters such as that of the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), the wunl and wun2 gene (US 5,428,148), the winl and win2 genes (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), the systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), the WIPl gene (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; Ekelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), the MPI gene (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 ( 2): 141-150) and the like.
  • suitable promoters are, for example, fruit-ripening-specific promoters, such as the fruit-ripening-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • Development-dependent promoters partly include the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is naturally development-dependent.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which, for example, the biosynthesis of ketocarotenoids or their precursors takes place.
  • promoters with specificities for the anthers, ovaries, petals, sepals, flowers, leaves, stems and roots and combinations thereof are preferred.
  • Tuber-, storage root- or root-specific promoters are, for example, the patatin class I promoter (B33) or the potato cathepsin D inhibitor promoter.
  • Leaf-specific promoters are, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of Rubisco (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
  • Flower-specific promoters are, for example, the phytoene synthase promoter (WO 92/16635), the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593), the EPSPS promoter (database entry M37029), the DFR-A promoter (database entry X79723), the B Gene promoter (WO 0008920) and the CHRC promoter (WO 98/24300; Vishnevetsky et al. (1996) Plant J. 10, 1111-1118) and the promoters of the Arabidopsis gene loci At5g33370 (as a result of MI promoter), At5g22430 (as a result of M2 promoter) and Atlg26630 (as a result of M3 promoter).
  • Anther-specific promoters are, for example, the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the glob-1 promoter or the g-zein promoter.
  • the present invention therefore relates in particular to a nucleic acid construct comprising functionally linked a flower-specific or in particular a petal-specific promoter and a nucleic acid encoding a ketolase.
  • An expression cassette is preferably produced by fusing a suitable promoter with a nucleic acid described above encoding a ketolase and preferably a nucleic acid inserted between promoter and nucleic acid sequence, which codes for a plastid-specific transit peptide, and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W.
  • nucleic acids encoding a plastic transit peptide ensure localization in plastids and in particular in chromoplasts.
  • Expression cassettes the nucleic acid sequence of which codes for a ketolase fusion protein, can also be used, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • Transit peptides specific for the chromoplasts are preferred which, according to transit location of the ketolase in the chromoplasts from the ketolase part can be cleaved enzymatically.
  • rbcS the transit peptide of the small subunit of rubisco
  • ferredoxin NADP oxidoreductase and also the isopentenyl pyrophosphate isomerase-2 is particularly preferred is derived.
  • Nucleic acid sequences of three cassettes of the plastid transit peptide of plastid transketolase from tobacco in three reading frames are particularly preferred as Kpnl / BamHI fragments with an ATG codon in the Ncol interface:
  • a plastid transit peptide examples include the transit peptide of the plastid isopentenyl pyrophosphate isomerase-2 (IPP-2) from Arabisopsis thaliana and the transit peptide of the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase (rbcS) from pea (Guerineau, F, Woolston, S Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the nucleic acids according to the invention can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural nucleic acid constituents, and can consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette preferably contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter, a coding nucleic acid sequence or a nucleic acid construct and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Examples of a terminator are the 35S terminator (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16: 11380), the nos terminator (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. Nopeline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet.
  • Manipulations which provide suitable restriction sites or which remove superfluous DNA or restriction sites can also be used. Where insertions, Deletions or substitutions such as, for example, transitions and transversions, can be used in vi-mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 ( 1984), 835 ff) or functional equivalents.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • Suitable methods for the transformation of plants are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the Agrobacterium -mediated gene transfer described above.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225).
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) or particularly preferably pSUN2, pSUN3, pSUN4 or pSUN5 (WO 02/00900).
  • Agrobacteria transformed with an expression plasmid can be used in a known manner for the transformation of plants, for example by placing wounded leaves or leaf pieces in one Agrobacteria solution are bathed and then cultivated in suitable media.
  • the fused expression cassette which expresses a ketolase, is cloned into a vector, for example pBinl9 or in particular pSUN2, which is suitable for being transformed into ⁇ grro-acterium tumefaciens with such a vector transformed Agrobak
  • Plants in particular cultivated plants, are used, for example, by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • transgenic plants can be regenerated from the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces, which plants contain a gene encoding the expression cassette for the expression of a nucleic acid encoding a ketolase.
  • an expression cassette is inserted as an insert into a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example Se-
  • Cloning techniques can be used to clone the expression cassettes into suitable vectors which enable them to multiply, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include PJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 11380),
  • the expression can be constitutive 45 or preferably specific in the petals. Accordingly, the invention further relates to a method for producing genetically modified plants, characterized in that a nucleic acid construct containing functionally linked, a flower-specific promoter and nucleic acids encoding a ketolase is introduced into the genome of the starting plant.
  • the invention further relates to the genetically modified plants, the genetic modification being the activity of a ketolase in petals,
  • the ketolase activity is increased or caused compared to the wild type, preferably by increasing or causing the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase is increased or caused by introducing nucleic acids encoding a ketolase into the plants and thus preferably by overexpression or transgenic expression of nucleic acids encoding a ketolase.
  • Preferred transgenic plants which, as a wild type, have no ketola activity in the petals contain, as mentioned above, at least one transgenic nucleic acid encoding a ketolase.
  • genetically modified plants additionally have an increased hydroxlase activity and / or ⁇ -cyclase activity compared to a wild type plant. Further preferred embodiments are described above in the method according to the invention.
  • genetically modified plants additionally have a reduced ⁇ -cyclase activity compared to a wild type plant. Further preferred embodiments are described above in the method according to the invention. As mentioned above, further particularly preferred genetically modified plants additionally have at least one further increased activity compared to the wild type, selected from the group HMG-CoA reductase activity, (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl -Diphosphate reductase activity, l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase activity, l-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase activity, isopentenyl-diphosphate- ⁇ -isomerase Activity, geranyl diphosphate synthase activity, farnesyl diphosphate synthase activity, geranyl geranyl diphosphate synthase activity, phytoene synthase activity, phytoene desaturase activity,
  • genetically modified plants as mentioned above, additionally have a reduced endogenous ⁇ -hydroxylase activity compared to the wild type. Further preferred embodiments are described above in the method according to the invention.
  • plants are preferably understood to mean plants which have chromoplasts as the wild type in petals.
  • Further preferred plants have, as wild type, carotenoids, in particular ⁇ -carotene, zeaxanthin, violaxanthin or lutein, in the petals.
  • carotenoids in particular ⁇ -carotene, zeaxanthin, violaxanthin or lutein
  • further preferred plants additionally have a ⁇ -cyclase activity in the petals.
  • Further preferred plants have a hydroxylase activity in the petals as a wild type.
  • the invention therefore relates in particular to genetically modified plants selected from the families Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Gerifoleaaceaea, Gerianceaeaea, Gerianceaeae, Gentianeaeaeae, Gentianaceae Scrophulariaceae, Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, Illiaceaae, or Lamiaceae, containing at least one transgenic nucleic acid encoding a ketolase.
  • Very particularly preferred genetically modified plants are selected from the plant genera Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Adonis, Lycopersicon, Rosa, Calenduia, Physalis, Medicago, Helianthus, Chrysanthemum, Aster, Tulipa, Narcissus, Petunia, Geranium or Tropaeolum, whereby the genetically modified plant contains at least one transgenic nucleic acid encoding a ketolase.
  • the ketolase is expressed in petals, particularly preferably the expression of the ketolase is highest in petals.
  • the present invention further relates to the transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts, in particular their petals.
  • the genetically modified plants can be used to produce ketocarotenoids, in particular astaxanthin.
  • Genetically modified plants according to the invention with an increased content of ketocarotenoids which can be consumed by humans and animals can also be used, for example, directly or after processing known per se as food or feed or as feed and food supplements. Furthermore, the genetically modified plants can be used for the production of extracts of the plants containing ketocarotenoid and / or for the production of feed and food supplements.
  • the genetically modified plants can also be used as ornamental plants in the horticulture area.
  • the genetically modified plants have an increased ketocarotenoid content compared to the wild type.
  • An increased ketocarotenoid content is generally understood to mean an increased total ketocarotenoid content.
  • ketocarotenoids is also understood to mean, in particular, an altered content of the preferred ketocarotenoids, without the total carotenoid content necessarily having to be increased.
  • the genetically modified plants according to the invention have an increased astaxanthin content compared to the wild type.
  • an increased content is also understood to mean a caused content of ketocarotenoids or astaxanthin.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sold by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) , 5463-5467).
  • Example 1 20 Amplification of a cDNA which contains the entire primary sequence of the ketolase from Haematococcus pluvialis Flotow em. Will encodes
  • the cDNA which codes for the ketolase from Haematococcus pluvialis was amplified by means of PCR from Haematococcus pluvialis (strain 25 192.80 from the "Collection of algal cultures of the University of Göttingen") suspension culture.
  • RNA was precipitated with a volume of isopropanol, washed with 75% ethanol and the pellet dissolved in DEPC water (overnight incubation of water with 1/1000 volume of diethyl pyrocarbonate at room temperature, then autoclaved).
  • RNA concentration was determined photometrically.
  • cDNA synthesis 2.5 ⁇ g of total RNA were denatured for 10 min at 60 ° C., cooled on ice for 2 min and using a cDNA kit (ready-to-go-you-prime beads, Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions rewritten into cDNA using an antisense specific primer (PRI SEQ ID NO: 29).
  • the nucleic acid encoding a kematolase from Haematococcus pluvialis was determined by means of a polymerase chain reaction (PCR) from Haematococcus pluvialis using a sense-specific primer (PR2 SEQ ID NO: 30) and an antisense-specific primer (PRI SEQ ID NO: 29) amplified.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR conditions were as follows:
  • the PCR for the amplification of the cDNA which codes for a ketolase protein consisting of the entire primary sequence, was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture which contained:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the PCR amplification with SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 resulted in an 1155 bp fragment which codes for a protein consisting of the entire primary sequence (SEQ ID NO: 22).
  • the amplificate was cloned into the PCR cloning vector pGEM-Teasy (Promega) using standard methods and the clone PGKET02 was obtained.
  • This clone was therefore used for the cloning into the expression vector pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the cloning was carried out by isolating the 1027 bp SpHI fragment from pGEM-Teasy and ligation into the SpHI-cut vector pJITH7.
  • the clone that contains the Haematococcus pluvialis ketolase in the correct orientation as an N-terminal translational fusion with the rbcs transit peptide is called PJKET02.
  • the cDNA which codes for the ketolase from Haematococcus pluvialis (strain 192.80) with an N-terminus shortened by 14 amino acids, was amplified by means of PCR from Haematococcus pluvialis suspension culture (strain 192.80 from the "Collection of algal cultures of the University of Göttingen”).
  • Total RNA was prepared from a suspension culture of Haematococcus pluvialis (strain 192.80) as described in Example 1.
  • the nucleic acid encoding a ketolase from Haematococcus pluvialis was determined by polymerase chain reaction (PCR) from Haematococcus pluvialis using a sense-specific primer (PR3 SEQ ID NO: 31) and an antisense-specific Primers (PRI SEQ ID NO: 29) amplified.
  • the PCR conditions were as follows:
  • the PCR for the amplification of the cDNA which codes for a ketolase protein with an N-terminus shortened by 14 amino acids, was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture which contained:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • PCR amplification with SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 31 resulted in an 1111 bp fragment coding for a ketolase protein in which the N-terminal amino acids (position 2-16) were replaced by a single amino acid (leucine) are.
  • the amplificate was cloned into the PCR cloning vector pGEM-Teasy (Promega) using standard methods. Sequencing with primers T7 and SP6 confirmed a sequence identical to the sequence SEQ ID NO: 22, the 5 'region (position 1-53) of SEQ ID NO: 22 in the amplificate SEQ ID NO: 24 by an in the sequence differing nonamer sequence was replaced. This clone was therefore used for the cloning into the expression vector pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the cloning was carried out by isolating the 985 bp SpHI fragment from pGEM-Teasy and ligation with the SpHI-cut vector pJIT117.
  • the clone that contains the Haematococcus pluvialis ketolase with an N-terminus shortened by 14 amino acids in the correct orientation as an N-terminal translational fusion with the rbcs transit peptide is called pJKET03.
  • Amplification of a cDNA which contains the ketolase from Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille (strain 192.80 of the "Collection of algal cultures of the University of Göttingen") consisting of the entire primary sequence and fused C-terminal myc tag.
  • the cDNA coding for the ketolase from Haematococcus pluvialis (strain 192.80) consisting of the entire primary sequence and fused C-terminal myc tag was PCR-analyzed using the plasmid pGKET02 (described in Example 1) and the primer PR15 (SEQ ID NO: 32).
  • the PR15 primer is composed of an antisense-specific 3 ⁇ region (nucleotides 40 to 59) and a 5 'region coding for myc-tag (nucleotides 1 to 39).
  • the nucleic acid encoding a ketolase from Haematococcus pluvialis (strain 192.80) consisting of the entire primary sequence and fused C-terminal myc tag was determined using a polymerase chain reaction (PCR) from Haematococcus pluvialis using a sense-specific primer (PR2 SEQ ID NO: 30) and an antisense specific primer (PR15 SEQ ID NO: 32).
  • the PCR conditions were as follows:
  • the PCR for the amplification of the cDNA which codes for a ketolase protein with a fused C-terminal myc tag, was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture which contained:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the amplificate was cloned into the PCR cloning vector pGEM-Teasy (Promega) using standard methods. Sequencing with primers T7 and SP6 confirmed a sequence identical to the sequence SEQ ID NO: 22, the 3 ′ region (positions 993 to 1155) of SEQ ID NO: 22 in the amplificate SEQ ID NO: 26 by an in the different sequence from 39 bp was replaced. This clone was therefore used for the cloning into the expression vector pJITH7 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the cloning was carried out by isolating the 1038 bp EcoRI-SpHI fragment from pGEM-Teasy and ligation with the EcoRI-SpHI cut vector pJITH7.
  • the ligation creates a translational fusion between the C-terminus of the rbcS transit peptide sequence and the N-terminus of the ketolase sequence.
  • the clone that contains the Haematococcus pluvialis ketolase with the fused C-terminal myc tag in the correct orientation as a translational N-terminal fusion with the rbcs transit peptide is called pJKET04.
  • ketolase from Haematococcus pluvialis in L. esculentum and in Tagetes erecta was carried out under the control of the constitutive promoter d35S from CaMV (Franck et al. 1980, Cell 21: 285-294). Expression was carried out using the pea transit peptide rbcS (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240: 709-715).
  • fragment d35S contains the duplicated 35S promoter (747 bp), fragment rbcS the rbcS transit peptide from pea (204 bp), fragment KET02 (1027 bp) the whole Primary sequence coding for the Haematococcus pluvialis ketolase, fragment term (761 bp) the polyadenylation signal of CaMV.
  • fragment d35S contains the duplicated 35S promoter (747 bp), fragment rbcS the rbcS transit peptide from pea (204 bp), fragment KET03 (985 bp) the primary sequence shortened by 14 N-terminal amino acids coding for the Haematococcus pluvialis Ketolase, fragment term (761 bp) the polyadenylation signal of CaMV.
  • fragment d35S contains the duplicated 35S promoter ((747 bp), fragment rbcS the rbcS transpeptide from pea (204 bp), fragment KET04 (1038 bp) the entire primary sequence coding for the Haematococcus pluvialis ketolase with C-terminal myc tag, fragment term (761 bp) the polyadenylation signal of CaMV.
  • An expression cassette for the Agrobacterium -mediated transformation of the ketolase from Haematococcus pluvialis into Tagetes erecta was produced using the binary vector pSUN5 (WO02 / 00900).
  • fragment d35S contains the duplicated 35S promoter (747 bp), fragment rbcS the rbcS transit peptide from pea (204 bp), fragment KET02 (1027 bp) the entire primary sequence coding for the Haematococcus pluvialis ketolase, fragment term (761 bp) the polyadenylation signal of CaMV.
  • the DNA fragment which contains the AP3 promoter region -902 to +15 from Arabidopsis thaliana, was PCR-analyzed using genomic DNA (isolated from Arabidopsis thaliana according to standard methods) and the primers PR7 (SEQ ID NO: 33) and PR10 (SEQ ID NO : 36).
  • the PCR conditions were as follows:
  • the PCR for the amplification of the DNA which contains the AP3 promoter fragment (-902 to +15), was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture, which contained:
  • the 922 bp amplificate was cloned into the PCR cloning vector pCR 2.1 (Invitrogen) using standard methods and the plasmid pTAP3 was obtained.
  • Sequencing of clone pTAP3 confirmed a sequence consisting only of an insertion (a G in position 9765 of sequence AL132971) and a base exchange (a G instead of an A in position 9726 of sequence AL132971) from the published AP3 sequence (AL132971, nucleotide region 9298 to 10200). These nucleotide differences were reproduced in an independent amplification experiment and thus represent the actual nucleotide sequence in the Arabidopsis thaliana plants used.
  • the modified version AP3P was produced by recombinant PCR using the plasmid pTAP3.
  • the region 10200 to 9771 was amplified with the primers PR7 (SEQ ID NO: 33) and primers PR9 (SEQ ID NO: 35) (amplificate A7 / 9), the region 9526 to 9285 with the PR8 (SEQ ID NO: 34) ) and PR10 (SEQ ID NO: 36) amplified (amplificate A8 / 10).
  • the PCR conditions were as follows:
  • PCR reactions for the amplification of the DNA fragments which contain the regions region 10200-9771 and region 9526 to 9285 of the AP3 promoter, were carried out in 50 ⁇ l reaction batches, which contained:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the recombinant PCR includes annealing of the amplificates A7 / 9 and A8 / 10, which overlap over a sequence of 25 nucleotides, completion into a double strand and subsequent amplification.
  • the denaturation (5 min at 95 ° C.) and annealing (slow cooling at room temperature to 40 ° C.) of both amplificates A7 / 9 and A8 / 10 was carried out in a 17.6 ⁇ l reaction mixture, which contained:
  • the nucleic acid coding for the modified promoter version AP3P was amplified by means of PCR using a sense-specific primer (PR7 SEQ ID NO: 33) and an antisense-specific primer (PR10 SEQ ID NO: 36).
  • the PCR conditions were as follows:
  • the PCR for the amplification of the AP3P fragment was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture, which contained:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the PCR amplification with SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 36 resulted in a 778 bp fragment which codes for the modified promoter version AP3P.
  • the amplificate was cloned into the cloning vector pCR2.1 (Invitrogen). Sequencing with the primers T7 and Ml3 confirmed a sequence identical to the sequence AL132971, region 10200 to 9298, the internal region 9285 to 9526 being deleted. This clone was therefore used for the cloning into the expression vector pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the cloning was carried out by isolating the 771 bp SacI-HindIII fragment from pTAP3P and ligating into the SacI-HindIII cut vector pJITH7.
  • the clone that contains the promoter AP3P instead of the original promoter d35S is called pJAP3P.
  • the 1027 bp SpHI fragment KET02 (described in Example 1) was cloned into the SpHI-cut vector pJAP3P.
  • the clone which contains the fragment KET02 in the correct orientation as an N-terminal fusion with the rbcS transit peptide is called pJAP3PKET02.
  • the 1032 bp SpHI-EcoRI fragment KET04 (described in Example 3) was cloned into the SpHI-EcoRI cut vector pJAP3P.
  • the clone that contains the fragment KET04 in the correct orientation as an N-terminal fusion with the rbcS transit peptide is called PJAP3PKET04.
  • An expression vector for the Agrobacterium -mediated transformation of the AP3P-controlled ketolase from Haematococcus pluvialis into L. esculentum was produced using the binary vector pSUN3 (WO02 / 00900).
  • fragment AP3P contains the modified AP3P promoter (771 bp), fragment rbcS the rbcS transit peptide from pea (204 bp), fragment KET02 (1027 bp) the entire primary sequence coding for the Haematococcus pluvialis ketolase, fragment term (761 Bp) the polyadenylation signal from CaMV.
  • fragment AP3P contains the modified AP3P promoter (771 bp), fragment rbcS the rbcS transit peptide from pea (204 bp), fragment KET04 (1038 bp) the entire primary sequence coding for the Haematococcus pluvialis ketolase with C-terminal myc tag , Fragment term (761 bp) the polyadenylation signal of CaMV.
  • An expression vector for the Agrobacterium -mediated transformation of the AP3P-controlled ketolase from Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta was produced using the binary vector pSUN5 (WO02 / 00900). 5

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Description

I
Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden in Blütenblättern von Pflanzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren z r Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine veränderte Ketolase-Aktivität in Blüten- blättern aufweisen, die genetisch veränderten Pflanzen, sowie deren Verwendung als Nahrungs- und Futtermittel und zur Herstellung von Ketocarotinoidextrakten.
Carotinoide werden de novo in Bakterien, Algen, Pilzen und Pflanzen synthetisiert. Ketocarotinoide, also Carotinoide, die mindestens eine Keto-Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3 ' -Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixant in sind natürliche Antioxidantien und Pigmente, die von einigen Algen und Mikroorganismen als Sekundärmetabolite produziert werden.
Aufgrund ihrer farbgebenden Eigenschaften werden die Ketocarotinoide und insbesondere Astaxanthin als Pigmentierhilfsstoffe in der Tierernährung, insbesondere in der Forellen-, Lachs- und Shrimpszucht verwendet.
Die Herstellung von Astaxanthin erfolgt heutzutage größtenteils durch chemische Synthese erfahren. Natürliche Ketocarotinoide, wie beispielsweise natürliches Astaxanthin, werden heutzutage in biotechnologischen Verfahren in kleinen Mengen durch Kultivierung von Algen, beispielsweise Haematococcus pluvialis oder durch Fermentation von geήtechnologisch optimierten Mikroorganismen und anschließender Isolierung gewonnen.
Ein wirtschaftliches biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von natürlichen Ketocarotinoiden ist daher von großer Bedeutung.
Aus WO 00/32788 ist es bekannt, durch kombinierte Überexpression von Carotinoid-Biosynthesegenen und Antisense-Verfahren bestimmte Carotinoidverhältnisse in Tagetespetalen zu beeinflussen.
WO 98/18910 beschreibt die Synthese von Ketocarotinoiden in Nektarien von Tabakblüten durch Einbringen eines Ketolase-Gens in Tabak. WO 01/20011 beschreibt ein DNA Konstrukt zur Produktion von Ketocarotinoiden, insbesondere Astaxanthin, in Samen von Ölsaat- pflanzen wie Raps, Sonnenblume, Sojabohne und Senf unter Verwendung eines Samen-spezifischen Promotors und einer Ketolase aus Haematococcus .
Die in WO 98/18910 und WO 01/20011 offenbarten Verfahren liefern zwar genetisch veränderte Pflanzen, die in spezifischen Geweben einen Gehalt an Ketocarotinoiden aufweisen, weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Höhe des Gehalts an Ketocarotinoiden und die Reinheit, insbesondere an Astaxanthin noch nicht zufriedenstellend ist.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von Pflanzen zur Verfügung zu stellen, bzw. weitere transgene Pflanzen, die Ketocarotinoide herstellen, zur Verfügung zu stellen, die optimierte Eigenschaften, wie beispielsweise einen höheren Gehalt an Ketocarotinoiden aufweisen und den geschilderten Nachteil des Standes der Technik nicht aufweisen.
Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden gefunden, indem man genetisch veränderte Pflanzen kultiviert, die im Vergleich zum Wildtyp eine veränderte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern aufweisen.
Bis auf wenige Ausnahmen abgesehen, wie beispielsweise das Adonisröschen, enthalten Pflanzen und insbesondere die Blütenblätter, die auch Petalen genannt werden, zwar Carotinoide, aber keine Ketocarotinoide.' In der Regel weisen daher die Blütenblätter von Wildtyppflanzen keine Ketolase-Aktivität auf.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher als Ausgangspflanzen Pflanzen verwendet, die bereits als Wildtyp in Blütenblättern eine Ketolaseaktivität aufweisen, wie beispielsweise das Adonisröschen. In dieser Ausführungsform bewirkt die genetische Veränderung eine Erhöhung der Ketolase- Aktivität in Blütenblättern.
Unter Ketolase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Ketolase verstanden.
Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Keto-Gruppe einzuführen. Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Ketolase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Ketolase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. gebildete Menge Canthaxanthin verstanden.
Bei einer erhöhten Ketolase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Ketolase die umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. die gebildete Menge Canthaxanthin erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Ketolase-Aktivität minde- stens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Ketolase-Aktivität des Wildtyps.
Unter dem Begriff "Wildtyp" wird erfindungsgemäß die entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangspflanze verstanden.
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff "Pflanze" die Ausgangspflanze (Wildtyp) oder eine erfindungsgemäße, genetisch ver- änderte Pflanze oder beides verstanden werden.
Vorzugsweise und insbesondere in Fällen, in denen die Pflanze oder der Wildtyp nicht eindeutig zugeordnet werden kann, wird unter "Wildtyp" für die Erhöhung oder Verursachung der Ketolase- Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase- Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Farnesyl-Diphos- phat-Synthase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Phytoen-Synthase-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Phytoen-Desaturase- Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der Zeta- Carotin-Desaturase-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der crtlSO-Aktivität , für die nachstehend beschriebene Erhöhung der FtsZ-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Erhöhung der MinD-Aktivität, für die nachstehend beschriebene Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität und für die nachstehend beschriebene Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase Aktivität und die Erhöhung des Gehalts an Ketocarotinoiden jeweils eine Referenzpflanze verstanden.
Diese Referenzpflanze ist für Pflanzen, die bereits als Wildtyp eine Ketolase-Aktivität in Blütenblätter aufweisen vorzugsweise Adonis aestivalis, Adonis flammeus oder Adonis annuus, besonders bevorzugt Adonis aestivalis.
Diese Referenzpflanze ist für Pflanzen, die als Wildtyp keine Ke- tolase-Aktivität in Blütenblätter aufweisen, vorzugsweise Tagetes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta oder Tagetes campanulata, besonders bevorzugt Tagetes erecta.
Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in Pflanzenmaterial erfolgt in Anlehnung an die Methode von Frazer et al . , (J. Biol. Chem.
272(10): 6128-6135, 1997). Die Ketolase-Aktivität in pflanzlichen Extrakten wird mit den Substraten beta-Carotin und Canthaxanthin in Gegenwart von Lipid (Sojalecithin) und Detergens (Natriumcho- lat) bestimmt. Substrat/Produkt-Verhältnisse aus den Ketolase- Assays werden mittels HPLC ermittelt.
Die Erhöhung der Ketolase-Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase gegenüber dem Wildtyp, beispielsweise durch Induzierung des Ketolase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase in die Pflanze.
Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase wird erfindungsgemäß in dieser Ausführungsform auch die Manipulation der Expression der Pflanzen eigenen endogenen Ketolasen verstanden. Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Sequenz für Ketolase kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte oder vorzugsweise erhöhte Expressionsrate mindestens eines endogenen Ketolase Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
Es ist wie vorstehend beschrieben möglich, die Expression min- destens einer endogenen Ketolase durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
Des weiteren kann eine erhöhte Expression mindestens eines endogenen Ketolase-Gens dadurch erzielt werden, dass ein in der Wildtyppflanze nicht vorkommendes oder modifiziertes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt .
Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator- Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Ketolase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren, in die Pflanze.
In den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen liegt also in dieser Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Ketolase-Gen vor. In dieser Ausführungsform weist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Pflanze dementsprechend mindestens eine exogene (=heterologe) Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, auf oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, auf
In einer anderen, bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens werden als Ausgangspflanzen Pflanzen verwendet, die als Wildtyp in Blütenblättern keine Ketolaseakti- vität aufweisen, wie beispielsweise Tomate, Marigold, Tagetes erecta, Tagetes lucida, Tagetes minuta, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri und Tagetes campanulata .
In dieser, bevorzugten Ausführungsform verursacht die genetische Veränderung die Ketolase-Aktivität in Blütenblättern. Die erfindungsgemäße genetisch veränderte Pflanze weist somit in dieser, bevorzugten Ausführungsform im Vergleich zum genetisch nicht veränderten Wildtyp eine Ketolase-Aktivität in Blüten- blättern auf und ist somit vorzugsweise in der Lage, in Blütenblättern transgen eine Ketolase zu exprimieren.
In dieser bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase analog zu der vorstehend beschriebenen Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase vorzugsweise durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren in die Ausgangspflanze .
Dazu kann in beiden Ausführungsformen prinzipiell jedes Ketolase- Gen, also jede Nukleinsäuren die eine Ketolase kodiert verwendet werden .
Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
Bei genomischen Ketolase-Sequenzen aus eukaryontisehen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass die Wirtspflanze nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Ketolase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase und die entsprechenden Ketolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können sind beispielsweise Sequenzen aus
Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 1, Protein SEQ ID NO: 2),
Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO: D45881; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 3, Protein SEQ ID NO: 4),
Agrobacterium aurantiacum (Accession NO: D58420; Nukleinsäure: SEQ ID NO : 5 , Protein SEQ ID NO : 6 ) ,
Alicaligenes spec . (Accession NO: D58422; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 7, Protein SEQ ID NO: 8),
Paracoccus marcusii (Accession NO: Y15112; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 9, Protein SEQ ID NO: 10).
Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO: NP442491; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 11, Protein SEQ ID NO: 12). Bradyrhizobium sp. (Accession NO: AF218415; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 13, Protein SEQ ID NO: 14).
Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO: AP003592, BAB74888; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 15, Protein SEQ ID NO: 16).
Haematococcus pluvialis
(Accession NO: AF534876, AAN03484; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 81, Protein : SEQ ID NO: 82)
Paracoccus sp. MBIC1143
(Accession NO: D58420, P54972; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 83, Protein : SEQ ID NO: 84)
Brevundimonas aurantiaca
(Accession NO: AY166610, AAN86030; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 85, Protein : SEQ ID NO: 86)
Nodularia spumigena NSOR10
(Accession NO: AY210783, AA064399; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 87, Protein : SEQ ID NO: 88)
Nostoc punctiforme ATCC 29133
(Accession NO: NZ_AABC01000195 , ZP_00111258 ; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 89, Protein : SEQ ID NO: 90)
Nostoc punctiforme ATCC 29133
(Accession NO: NZ_AABC01000196 ; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 91, Protein : SEQ ID NO: 92)
Deinococcus radiodurans Rl
(Accession NO: E75561, AE001872; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 93, Protein : SEQ ID NO: 94)
Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen und insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 und/oder 16 und/oder 90 und/oder 92 leicht auffinden.
Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO: 2 und/oder 16 und/oder 90 und/oder 92 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei
Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 be- schrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0.2X SSC bei 50°C, bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0) .
Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden.
Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.
Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Wasch- schritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridiserungsbedingungen mit zum Beispiel
(i) 4X SSC bei 65°C, oder
(ii) 6X SSC bei 45°C, oder
(iii) 6X SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma- DNA, oder (iv) 6X SSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
(v) 6XSSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte 5 Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder
(vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder
(vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0.1 % Rinderserumalbumin, 10 0.1 % Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumeitrat bei 42°C, oder
(viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (moderate Bedingungen) , oder
15
(ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42° (moderate Bedingungen) .
(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel 20
(i) 0.015 M NaCl/0.0015 M Natriumeitrat/0.1 % SDS bei 50°C, oder
(ii) 0.1X SSC bei 65°C, oder
25
(iii) 0.1X SSC, 0.5 % SDS bei 68°C, oder
(iv) 0.1X SSC, 0.5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder
30 (v) 0.2X SSC, 0.1 % SDS bei 42°C, oder
(vi) 2X SSC bei 65°C (moderate Bedingungen) .
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Ver- 35 fahren bringt man Nukleinsäuren ein, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist .
45
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 2 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde .
In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 16 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 16 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 16 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.
In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 90 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 90 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 90 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde. In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 92 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Dele- tion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 92 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 92 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde .
Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gin durch Asn, Val durch lle, Leu durch lle, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen .
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid- kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, ine. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5 (2) : 151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Multiple alignment parameter:
Gap penalty 10
Gap length penalty 10
Pairwise alignment parameter:
K-tuple 1
Gap penalty 3
Window 5
Diagonals saved 5
Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit einer bestimmten Sequenz aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der bestimmten Sequenz insbesondere nach obigem Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20 % aufweist.
Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder 16 oder 90 oder 92 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID
NO: 2 oder 16 oder 90 oder 92, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20 % aufweist.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 1 in die Pflanze ein.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 15 in die Pflanze ein.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 89 in die Pflanze ein. In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 91 in die Pflanze ein.
Alle vorstehend erwähnten Ketolase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oiigonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al . (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
In einer besonderes bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man genetisch veränderte Pflanzen, die in Blüten die höchste Expressionsrate einer Ketolase aufweisen.
Vorzugsweise wird dies dadurch erreicht, das die Genexpression der Ketolase unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors erfolgt . Beispielsweise werden dazu die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, wie nachstehend ausführlich beschrieben, in einem Nukleinsäurekonstrukt, funktionell verknüpft mit einem blütenspezifischen Promotor in die Pflanze eingebracht.
Unter Pflanzen werden erfindungsgemäß vorzugsweise Pflanzen verstanden, die als Wildtyp in Blütenblättern Chromoplasten aufweisen. Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Blütenblättern zusätzlich Carotinoide, insbesondere ß-Carotin, Zeaxanthin, Neoxanthin, Violaxanthin oder Lutein auf. Weiter bevor- zugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Blütenblättern zusätzlich eine Hydroxylase-Aktivität auf.
Unter Hydroxylase -Aktivität wird die Enzymaktivität einer Hydroxylase verstanden.
Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen. Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Cantaxanthin in Astaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Hydroxylase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.
Besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen ausgewählt aus den Familien Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassicaceae, Cucurbita- ceae, Primulaceae, CaryophylIaceae, Amaranthaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, liliaceae oder Lamiaceae.
Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzengattungen Marigold, Tagetes errecta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica-, Aquilegia, Aster, Astragalus, Bignonia, Calenduia, Caltha, Campanula, Canna, Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthemum, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita, Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus, Dimorphotheca, Doronicum, Eschscholtzia, Forsythia, Fremontia, Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana, Geranium, Gerbera, Geum, Grevillea, Helenium, Helianthus, Hepatica, Heracleum, Hisbiscus, Heliopsis, Hypericum, Hypo- choeris, Impatiens, Iris, Jacaranda, Kerria, Laburnum, Lathyrus , Leontodon, Lilium, Linum, Lotus, Lycopersicon, Lysimachia, Maratia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera, Osmanthus, Petunia, Photinia, Physalis, Phyteuma, Potentilla, Pyracantha, Ranunculus, Rhododendron, Rosa, Rudbeckia, Senecio, Silene, Silphium, Sinap- sis, Sorbus, Spartium, Tecoma, Torenia, Tragopogon, Trollius, Tropaeolum, Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola oder Zinnia, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzengattungen Mari- gold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Lycopersicon, Rosa, Calenduia, Physalis, Medicago, Helianthus, Chrysanthemum, Aster, Tulipa, Narcissus, Petunia, Geranium, Tropaeolum oder Adonis.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und/oder ß-Cyclase-Aktivität aufweisen.
Unter Hydroxylase-Aktivität die Enzymaktivität einer Hydroxylase verstanden. Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.
Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Cantaxanthin in Astaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Hydroxyase-Aktivität die in einer be- stimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.
Bei einer erhöhten Hydroxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase die umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxantin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Hydroxylase-Aktivität des Wild- typs .
Unter der nachstehend beschriebenen "endogenen ß-Hydroxylase" wird die pflanzeneigene, endogene Hydroxylase verstanden. Die Bestimmung der Aktivität erfolgt analog.
Unter ß-Cyclase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer ß-Cyclase verstanden.
Unter einer ß-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzyma- tische Aktivität aufweist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen ß-Ionon-Ring zu überführen.
Insbesondere wird unter einer ß-Cyclase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, γ-Carotin in ß-Carotin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter ß-Cyclase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein ß-Cyclase umgesetzte Menge γ-Carotin bzw. gebildete Menge ß-Carotin verstanden. Bei einer erhöhten ß-Cyclase -Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein ß-Cyclase die umgesetzte Menge γ-Carotin bzw. die gebildete Menge ß-Carotin erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der ß-Cyclase-Aktivität des Wildtyps.
Die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Aktivität der Hydroxylase wird nach Bouvier et al . (Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) in vi tro bestimmt. Es wird zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Ferredoxin, Ferredoxin- NADP Oxidoreductase, Katalase, NADPH sowie beta-Carotin mit Mono- und Digalaktosylglyzeriden zugegeben.
Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase- Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, Keller, d'Harlingue und Camara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328):
Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0.250 ml Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), 0.025 mg Ferredoxin von Spinat, 0.5 Einheiten Ferredoxin-NADP+ Oxidoreduktase von Spinat, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-Carotin (in 0.1 mg Tween 80 emulgiert) , 0.05 mM einer Mischung von Mono- und Digalaktosylglyzeriden (1:1), 1 Einheit Katalyse, 200 Mono- und Digalaktosylglyzeriden, (1:1), 0.2 mg Rinderserumalbumin und Pflanzenextrakt in unterschiedlichem Volumen. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 30C inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden mit organischem Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform/ Methanol (2:1) extrahiert und mittels HPLC bestimmt.
Die Bestimmung der ß-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Aktivität der ß-Cyclase wird nach Fräser und Sandmann
(Biochem. Biophys. Res . Comm. 185(1) (1992) 9-15)in vitro bestimmt. Es werden zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Kaliumphosphat als Puffer (ph 7.6), Lycopin als Substrat, Stroma- protein von Paprika, NADP+, NADPH und ATP zugegeben.
Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase- Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346(1) (1997) 53-64):
Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 250 «=1 Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat
(pH 7.6 ) , nterschiedliche Mengen an Pflanzenextrakt, 20 nM Lycopin, 250 °=g an chromoplastidärem Stromaprotein aus Paprika, 0.2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 10 μl Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/ Methanol (2:1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.
Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fräser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res . Comm. 185(1) (1992) 9-15) .
Die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität und/oder ß-Cyclase- Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und/oder von Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase gegenüber dem Wildtyp.
Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und/oder die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Hydroxylase-Gens und/oder ß-Cyclase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Hydro- xylase-Genkopien und/oder ß-Cyclase-Genkopien, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/ oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine ε-Cyclase in die Pflanze.
Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/oder ß-Cyclase wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Pflanzen eigenen, endogenen Hydroxylase und/oder ß-Cyclase verstanden. Bei bestimmten Pflanzen, bei denen der Schwerpunkt der Biosynthese auf dem α—Carotinoid-Weg liegt, wie beispielsweise Pflanzen der Gattung Tagetes, ist es vorteilhaft, die endogene ß-Hydroxylase-Aktivität zu reduzieren und die Aktivittät von exogenen Hydroxylasen zu erhöhen.
Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Sequenz für Hydroxylasen und/oder ß-Cyclasen kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expres- sionsrate des Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen Hydroxylase und/oder ß-Cyclase durch die Applikation ex- ogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
Des weiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression eines endogenen Hydroxylase- und/oder ß-Cyclase-Gens dadurch erzielt werden, dass ein in der nicht transformierten Pflanze nicht vorkommendes Regulator-Protein mit dem Promotor dieses Gens in Wechselwirkung tritt.
Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Ge- nexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/ oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase in die Pflanze.
Dazu kann prinzipiell jedes Hydroxylase-Gen bzw. jedes ß-Cyclase- Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Hydroxylase und jede Nukleinsäure, die eine ß-Cyclase kodiert, verwendet werden.
Bei genomischen Hydroxylase-bzw. ß-Cyclase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontisehen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das die Wirtspflanze nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechende Hydroxylase bzw. ß-Cyclase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nuklein- Säuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden. Beispiele für ein Hydroxylase-Gene sind: eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis, Accession AX038729 , WO 0061764); (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 17, Protein: SEQ ID NO: 18),
sowie Hydroxylasen der folgenden Accession Nummern:
|emb|CAB55626.1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443.1, NP_194300.1, NP_200070.1, AAG10430.1, CAC06712.1, AAM88619.1, CAC95130.1, AAL80006.1, AF162276_1, AA053295.1, AAN85601.1, CRTZ_ERWHE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1, CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1, ZP_00094836.1, AAC44852.1, BAC77670.1, NP_745389.1, NP_344225.1, NP_849490.1, ZP_00087019.1, NP_503072.1, NP_852012.1, NP_115929.1, ZP_00013255.1
Eine besonders bevorzugte Hydroxylase ist weiterhin die Hydroxylase aus Tomate (Accession Y14809) (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 97; Protein: SEQ ID NO. 98) . Beispiele für ein ß-Cyclase-Gene sind: eine Nukleinsäure, kodierend eine ß-Cyclase aus Tomate (Accession X86452) . (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 19, Protein: SEQ ID O: 20),
Sowie ß-Cyclasen der folgenden Accesion Nummern:
S66350 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1.-) - tomato CAA60119 lycopene synthase [Capsicum annuum] S66349 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1.-) - common tobacco CAA57386 lycopene cyclase [Nicotiana tabacum] AAM21152 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAD38049 lycopene cyclase [Citrus x paradisi] AAN86060 lycopene cyclase [Citrus unshiu] AAF44700 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] AAG10429 beta cyclase [Tagetes erecta] AAA81880 lycopene cyclase AAB53337 Lycopene beta cyclase AAL92175 beta-lycopene cyclase [Sandersonia aurantiaca] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta]
AA018661 lycopene beta-cyclase [Zea mays]
AAG21133 chromoplast-specific lycopene beta-cyclase
[Lycopersicon esculentum]
AAF18989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota] ZP 001140 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str.
MIT9313] ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378]
ZP_001046 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378] ZP_001134 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str.
MIT9313]
ZP_001150 hypothetical protein [Synechococcus sp. WH 8102]
AAF10377 lycopene cyclase [Deinococcus radiodurans]
BAA29250 393aa long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] AAL01999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2] ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphmgobium aromaticivorans] AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. 0RS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] CAA64855 lycopene cyclase [Streptomyces griseus] AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea agglomerans] C37802 crtY protein - Erwinia uredovora BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] AAA64980 lycopene cyclase [Pantoea agglomerans] AAC44851 lycopene cyclase BAA09593 Lycopene cyclase [Paracoccus sp. MBIC1143] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphmgobium aromaticivorans] CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusii] BAA20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus] ZP_000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca] ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAB53337 Lycopene beta cyclase BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]
Eine besonders bevorzugte b-Cyclase ist weiterhin die chromo- plastenspezifische b-Cyclase aus Tomate (AAG21133) (Nukleinsäure: SEQ ID No. 95; Protein: SEQ ID No . 96)
In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Pflanzen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Hydroxylase-Gen und/oder ß-Cyclase-Gen vor.
In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die genetisch veränderte Pflanze beispielsweise mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase oder mindestens zwei endo- gene Nukleinsäuren, kodierend eine Hydroxylase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine ß-Cyclase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine ß-Cyclase auf .
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Hydroxylase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 18 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz , die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 18, und die die enzymatische Eigenschaft einer Hydroxylase aufweisen.
Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 18 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 17 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Hydroxylase der Sequenz SEQ ID NO: 18.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- Übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 17 in den Orga- nismus ein. Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als ß-Cyclase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 20 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz , die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 20, und die die enzymatische Eigenschaft einer ß-Cyclase auf- weisen.
Weitere Beispiele für ß-Cyclasen und ß-Cyclase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben durch Ho ologiever- gleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID NO: 20 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für ß-Cyclasen und ß-Cyclase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 19 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der ß-Cyclase der Sequenz SEQ ID NO: 20.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 19 in den Organismus ein.
Alle vorstehend erwähnten Hydroxylase-Gene oder ß-Cyclase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Syn- these aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nuklein- säurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Syn- these von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oiigonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al . (1989) , Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weisen die Pflanzen gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität auf.
Unter ε-Cyclase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer ε-Cyclase verstanden.
Unter einer ε-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen ε-Ionon-Ring zu überführen.
Unter einer ε-Cyclase wird daher insbesondere ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Lycopin in δ-Carotin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter ε-Cyclase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein ε-Cyclase umgesetzte Menge Lycopin bzw. gebildete Menge δ-Carotin verstanden.
Bei einer reduzierten ε-Cyclase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein ε-Cyclase die umgesetzte Menge Lycopin bzw. die gebildete Menge δ-Carotin reduziert.
Unter einer reduzierten ε-Cyclase-Aktivität wird vorzugsweise die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität einer ε-Cyclase in einer pflanzlichen Zelle, Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen verstanden.
Die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität in Pflanzen gegenüber dem Wildtyp kann beispielsweise durch Reduzierung der ε-Cyclase-Pro- teinmenge, oder der ε-Cyclase-mRNA-Menge in der Pflanze erfolgen. Dementsprechend kann eine gegenüber dem Wildtyp reduzierte ε-Cy- clase-Aktivität direkt bestimmt werden oder über die Bestimmung der ε-Cyclase-Proteinmenge oder der ε-Cyclase-mRNA-Menge der erfindungsgemäßen Pflanze im Vergleich zum Wildtyp erfolgen.
Eine Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität umfasst eine mengenmäßige Verringerung einer ε-Cyclase bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen der ε-Cyclase (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von ε-Cyclase-Aktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit der ε-Cyclase) . Vorzugsweise wird die ε-Cyclase-Aktivität (bzw. die ε-Cyclase-Proteinmenge oder die ε-Cyclase-mRNA-Menge) in der Pflanze, besonders bevorzugt in Blüten im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. Insbesondere meint "Reduzierung" auch das vollständigen Fehlen der ε-Cyclase-Aktivität (bzw. des ε-Cyclase-Proteins oder der ε-Cyclase-mRNA) .
Die Bestimmung der ε-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die ε-Cyclase-Aktivität kann nach Fräser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res . Comm. 185(1) (1992) 9-15) in vi tro bestimmt werden, wenn zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Kaliumphosphat als Puffer (ph 7.6), Lycopin als Substrat, Stromaprotein von Pa- prika, NADP+, NADPH und ATP zugegeben werden.
Die Bestimmung der ε-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt besonders bevorzugt nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclase Inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346(1) (1997) 53-64):
Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0.25 ml durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6),unter- schiedliche Mengen an Pflanzenextrakt, 20 nM Lycopin, 0.25 mg an chromoplastidärem Stromaprotein aus Paprika, 0.2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 0.01 ml Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2:1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.
Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fräser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1)
(1992) 9-15) . Eine weitere analytische Methode ist beschrieben in Beyer, Kröncke und Nievelstein (On the mechanism of the lycopene isomerase/cyclase reaction in Narcissus pseudonarcissus L. chro- mopast, ; J. Biol. Chem. 266(26) (1991) 17072-17078).
Vorzugsweise erfolgt die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität in Pflanzen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren:
a) Einbringen mindestens einer doppelsträngigen ε-Cyclase Ribonukleinsäuresequenz, nachstehend auch ε-Cyclase-dsRNA genannt, oder einer deren Expression gewährleistenden Expressions- kassette oder Expressionskassetten. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die ε-Cyclase-dsRNA gegen ein ε-Cyclase-Gen (also genomische DNA-Sequenzen wie die Promotorsequenz) oder ein ε-Cyclase-Transkript (also mRNA-Sequenzen) gerichtet ist,
b) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase antisense-Ribonuklein- säuresequenz, nachstehend auch ε-Cyclase-antisenseRNA genannt, oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die ε-Cyclase-antisenseRNA gegen ein ε-Cyclase-Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein ε-Cyclase-Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch α-anomere Nukleinsäuresequenzen,
c) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase-antisenseRNA kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
d) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase sense-Ribonukleinsäure- sequenz , nachstehend auch ε-Cyclase-senseRNA genannt, zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
e) Einbringen mindestens eines DNA- oder Protein-bindenden Faktors gegen ein ε-Cyclase-Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette
f) Einbringen mindestens einer den ε-Cyclase RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsauresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
g) Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsverlustes, wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Verschiebungen im Leseraster, an einem ε—Cyclase-Gen beispielsweise durch Erzeugung einer Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem ε—Cyclase-Gen. Bevorzugt können Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in besagtes ε-Cyclase-Gen durch homologe Rekombination oder Einbringen von sequenzspezifischen Nu- kleasen gegen ε-Cyclase-Gensequenzen generiert werden.
Dem Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Verminderung einer ε-Cyclase bzw. seiner Aktivität oder Funktion eingesetzt werden können. Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen Variante einer ε-Cyclase oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette vorteilhaft sein. Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität einer ε-Cyclase bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung der ε-Cyclase, des Transports der ε-Cyclase oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA- Spleißens, Induktion eines ε-Cyclase-RNA abbauenden Enzyms und/ oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen.
Die einzelnen bevorzugten Verfahren seien infolge durch beispielhafte Ausführungsformen beschrieben:
a) Einbringen einer doppeisträngigen ε-Cyclase-Ribonukleinsäure- sequenz (ε-Cyclase-dsRNA)
Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ( "double-stranded RNA interference" ; dsRNAi) ist bekannt und beispielsweise in Matzke MA et al . (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035 oder WO 00/63364 beschrieben. Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Unter "Doppelsträngiger Ribonukleinsäuresequenz" wird erfindungsgemäß eine oder mehr Ribonukleinsäuresequenzen, die aufgrund komplementärer Sequenzen theoretisch, beispielsweise gemäß den Basenpaarregeln von Waston und Crick und/oder faktisch, beispielsweise aufgrund von Hybridisierungsexperimenten, in vitro und/oder in vivo in der Lage sind, doppelsträngige RNA-Strukturen auszubilden.
Dem Fachmann ist bewusst, dass die Ausbildung von doppel- strängigen RNA-Strukturen, einen Gleichgewichtszustand darstellt. Bevorzugt ist das Verhältnis von doppelsträngigen Molekülen zu entsprechenden dissozierten Formen mindestens 1 zu 10, bevorzugt 1:1, besonders bevorzugt 5:1, am meisten bevorzugt 10:1.
Unter einer doppelsträngigen ε-Cyclase-Ribonukleinsäuresequenz oder auch ε-Cyclase-dsRNA wird vorzugsweise ein RNA-Molekül verstanden, das einen Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen ε-Cyclase- Transkripts identisch ist und/oder
b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen ε-Cyclase- Promotor-Sequenz identisch ist .
Im erfindungsgemäßen Verfahren bringt man daher zur Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität bevorzugt in die Pflanze eine RNA ein, die einen Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen ε-Cyclase- Transkripts identisch ist und/oder
b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen ε~Cyclase~ Promotor-Sequenz identisch ist.
Unter dem Begriff "ε-Cyclase-Transkript" wird der transkripierte Teil eines ε-Cyclase-Gens verstanden, der neben der ε-Cyclase kodierenden Sequenz beispielsweise auch nichtkodierende Sequenzen, wie beispielsweise auch UTRs enthält.
Unter einer RNA, die "mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen ε-Cyclase-Promotor-Sequenz identisch ist" , ist vorzugsweise gemeint, dass die RNA-Sequenz mit mindestens einem Teil des theoretischen Transkriptes der ε-Cyclase-Promotor-Sequenz , also der entsprechenden RNA-Sequenz, identisch ist.
Unter "einem Teil" des Pflanze eigenen ε-Cyclase-Transkripts bzw. der Pflanze eigenen ε-Cyclase-Promotor-Sequenz werden Teilsequenzen verstanden, die von wenigen Basenpaaren bis hin zu vollständigen Sequenzen des Transkripts bzw. der Promotorssequenz reichen können. Die optimale Länger der Teilsequenzen kann der Fachmann durch Routineversuche leicht ermitteln. In der Regel beträgt die Länge der Teilsequenzen mindestens 10 Basen und höchstens 2 kb, bevorzugt mindestens 25 Basen und höchstens 1,5 kb, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen und höchstens 600 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen und höchstens 500, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen und höchstens 400 Basen.
Vorzugsweise werden die Teilsequenzen so ausgesucht, dass eine möglichst hohe Spezifität erreicht wird und nicht Aktivitäten an- derer Enzyme reduziert werden, deren Verminderung nicht erwünscht ist . Es ist daher vorteilhaft für die Teilsequenzen der ε-Cyclase- dsRNA Teile des ε-Cyclase Transkripts und/oder Teilsequenzen der ε-Cyclase-Promotor-Sequenzen zu wählen, die nicht in anderen Aktivitäten auftreten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält daher die ε-Cyclase-dsRNA eine Sequenz, die mit einem Teil der Pflanze eigenen ε-Cyclase-Transkripts identisch ist und das 5 λ-Ende oder das 3 λ -Ende der Pflanze eigenen Nukleinsäure, kodierend eine ε-Cyclase enthält. Insbesondere sind nichttranslatierte Bereiche im 5 oder 3" des Transkriptes geeignet, selektive Doppel-Strang-Strukturen herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf doppel- strängige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle) , die bei Einbringen in einen pflanzlichen Organismus (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial) die Verminderung einer ε—Cyclase bewirken.
Ein doppelsträngige RNA-Molekül zur Reduzierung der Expression einer ε—Cyclase (ε-Cyclase-dsRNA) umfasst dabei bevorzugt
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonu- kleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu minde- stens einem Teil eines "sense"-RNA-ε-Cyclase Transkriptes, und
b) einen "antisense"-R.NA-Strang, der zu dem RNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen, bevorzugt vollständig, komplemen- tären ist.
Zur Transformation der Pflanze mit einer ε—Cyclase-dsRNA wird bevorzugt ein Nukleinsäurekonstrukt verwendet, das in die Pflanze eingebracht wird und das in der Pflanze in die ε-Cyclase-dsRNA transkripiert wird. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Nukleinsäurekonstrukt, transkripierbar in
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-ε-Cyclase Transkriptes, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementär ist.
Diese Nukleinsäurekonstrukte werden im folgenden auch Expressionskassetten oder Expressionsvektoren genannt.
In Bezug auf die dsRNA-Moleküle wird unter ε-Cyclase-Nuklein- säuresequenz , bzw. das entsprechende Transkript bevorzugt die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38 oder ein Tel derselben verstanden.
"Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der ε-Cyclase Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirkt. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines ε-Cyclase-Gens, bzw. zwischen dem "antisense"-Strang dem komplementären Strang eines ε-Cyclase-Gens .
Eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem ε-Cyclase Gentranskript ist nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der ε-Cyclase Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Se- quenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Poly- morphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit der dsRNA, die ausgehend von der ε-Cyclase Sequenz des einen Organismus generiert wurde, die ε-Cyclase Expression in einem anderen Organismus zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA bevorzugt Sequenzbereiche von ε-Cyclase-Gentranskripten, die konservierten Bereichen entsprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen leicht abgeleitet werden.
Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsauresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines ε-Cyclase Gentranskriptes zu hybridisieren (z.B. in 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h) .
"Im wesentlichen komplementär" meint, dass der "antisense"-RNA- Strang auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "antisense"-RNA- Strang und dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges .
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die ε-Cyclase-dsRNA
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes des Promotorbereichs eines ε-Cyclase-Gens, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementären ist .
Das entsprechende, bevorzugt zur Transformation der Pflanzen zu verwendende, Nukleinsäurekonstrukt, umfasst
a) einen "sense"-DNA-Strang der im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des Promotorbereichs eines ε-Cyclase-Gens, und
b) einen "antisense"-DNA-Strang, der zu dem DNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementär ist.
Vorzugsweise wird unter dem Promotorbereich einer ε-Cyclase eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 47 oder ein Teil der selben verstanden.
Zur Herstellung der ε-Cyclase-dsRNA-Sequenzen zur Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität werden, insbesondere für Tagetes erecta, besonders bevorzugt die folgenden Teil-Sequenzen verwendet:
SEQ ID NO: 40: Sense-Fragment der 5'terminalen Region der ε-Cyclase
SEQ ID NO: 41: Antisense-Fragment der 5λterminalen Region der ε-Cyclase SEQ ID NO: 42: Sense-Fragment der 3'terminalen Region der ε-Cyclase
SEQ ID NO: 43: Antisense-Fragment der 3'terminalen Region, der ε-Cyclase
SEQ ID NO: 47: Sense-Fragment des ε-Cyclase-Promotors
SEQ ID NO: 48: Antisense-Fragment des ε-Cyclase-Promotors
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen von Polyribo- nukleotiden bestehen. Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.
Die doppelsträngige dsRNA-Struktur kann ausgehend von zwei komplementären, separaten RNA-Strängen oder - bevorzugt - ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären RNA-Strang gebildet werden. In diesem Fall sind "sense"-RNA-Strang und "anti- sense"-RNA-Strang bevorzugt kovalent in Form eines invertierten "Repeats" miteinander verbunden.
Wie z.B. in WO 99/53050 beschrieben, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch eine verbindende Sequenz ("Linker"; beispielsweise ein In- tron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression einer RNA-Sequenz erfordern und die komplementären RNA-Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen. Bevorzugt ist die verbindende Sequenz ein Intron (z.B. ein Intron des ST-LS1 Gens aus Kartoffel; Vancanneyt GF et al . (1990) Mol Gen Genet 220 (2) : 245-250) .
Die Nukleinsauresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptionstermina- tionssignale oder Polyadenylierungssignale .
Ist die dsRNA jedoch gegen die Promotorsequenz einer ε-Cyclase gerichtet, so umfasst sie bevorzugt keine Transkriptionstermi- nationssignale oder Polyadenylierungssignale. Dies ermöglicht eine Retention der dsRNA im Nukleus der Zelle und verhindert eine Verteilung der dsRNA in der gesamten Pflanze "Spreadinng" ) . Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies beispielhaft auf folgende Art geschehen:
a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
c) Kreuzung von zwei individuellen Pflanzenlinien, wobei die eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, die andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz kodierend für eine dsRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise einem Promotor) gebracht werden. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein. Bevorzugt ist die Expressionskassette für die MP-dsRNA auf dem Transformationskonstrukt oder dem Transformationsvektor enthalten.
In einer besonders bevorzugten Auführungsform erfolgt die Expression der dsRNA ausgehend von einem Expressionskonstrukt unter funktioneller Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors, besonders bevorzugt unter der Kontrolle des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO: 28 oder eines funktionell äquivalenten Teils desselben.
Die Expressionskassetten kodierend für den "antisense"- und/oder den "sense"-Strang einer ε-Cyclase -dsRNA oder für den selbstkom- plementären-Strang der dsRNA, werden dazu bevorzugt in einen
Transformationsvektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren in die pflanzliche Zelle eingebracht. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist eine stabile Insertion in das Genom vorteilhaft . Die dsRNA kann in einer Menge eingeführt werden, die zumindest eine Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.
b) Einbringen einer antisense-Ribonukleinsäuresequenz einer ε-Cyclase (ε-Cyclase-antisenseRNA)
Verfahren zur Verminderung eines bestimmten Proteins durch die "antisense"-Technologie sind vielfach - auch in Pflanzen - beschrieben (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al . (1990) FEBS Lett 268 (2 ): 427-430) . Das antisense Nukleinsäuremolekül hybridisiert bzw. bindet mit der zellulären rnRNA und/oder genomischen DNA kodierend für das zu vermindernde ε-Cyclase. Dadurch wird die Transkription und/oder Translation der ε-Cyclase unterdrückt. Die Hybridisierung kann auf konventionelle Art über die Bildung einer stabilen Duplex oder - im Fall von genomischer DNA - durch Bindung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit der Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix entstehen.
Eine ε-Cyclase-antisenseRNA kann unter Verwendung der für diese ε-Cyclase kodierenden Nukleinsauresequenz, beispielsweise der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO: 38 nach den Basenpaar- regeln von Watson und Crick abgeleitet werden. Die ε-Cyclase-antisenseRNA kann zu der gesamten transkribierten mRNA der ε-Cyclase komplementär sein, sich auf die kodierende Region beschränken oder nur aus einem Oligonukleotid bestehen, das zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz der mRNA komplementär ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart für die ε-Cyclase umfasst. Die ε-Cyclase-antisenseRNA kann eine Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide haben, kann aber auch länger sein und mindestens 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. ε-Cyclase-antisenseRNAs werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt reko binant in der Zielzelle exprimiert..
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten enthaltend eine Nukleinsauresequenz kodierend für zumindest einen Teil einer ε-Cyclase, wobei besagte Nukleinsauresequenz mit einem in pflanzlichen Organismen funktionellen Promotor in antisense-Orientierung funktionell verknüpft ist. In einer besonders bevorzugten Auführungsform erfolgt die Expression der antisenseRNA ausgehend von einem Expressionskonstrukt unter funk- tioneller Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors, besonders bevorzugt unter der Kontrolle des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO: 28 oder eines funktionell äquivalenten Teils desselben.
Besagte Expressionskassetten können Teil eines Transformations- konstruktes oder Transformationsvektors sein, oder aber auch im Rahmen einer Kotransformation eingeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression einer ε—Cyclase durch Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zu der regulatorischen Region eines ε-Cyclase-Gens
(z.B. einem ε-Cyclase Promoter und/oder Enhancer) sind und triple- helikale Strukturen mit der dortigen DNA-Doppelhelix ausbilden, so dass die Transkription des ε-Cyclase-Gens reduziert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6 (6) : 569-84; Helene C et al . (1992) Ann NY Acad Sei 660:27-36; Mäher LJ (1992) Bioassays 14(12) :807- 815).
In einer weiteren Ausführungsform kann die ε-Cyclase-antisenseRNA eine -anomere Nukleinsäure sein. Derartige α-anomere Nuklein- säuremoleküle bilden spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen, - im Unterschied zu den konventionellen ß-Nukleinsäuren - die beiden Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al . (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641) .
c) Einbringen einer ε-Cyclase-antisenseRNA kombiniert mit einem Ribozym
Vorteilhaft kann die oben beschriebene antisense-Strategie mit einem Ribozym-Ve fahren gekoppelt werden. Katalytische RNA-Mole- küle oder Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3 ): 257-275) . Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält. Der Einbau von Ribozymsequenzen in "antisense"-RNAs verleiht eben diesen "antisense"-RNAs diese enzymähnliche, RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Moleküle ist beschrieben (u.a. bei Haseloff et al . (1988) Nature 334: 585-591); Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591; Steinecke P et al . (1992) EMBO J 11 (4) : 1525-1530 ; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250 (3 ) :329-338) . Auf diese Art können Ribozyme (z.B. "Hammerhead"-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591) verwendet werden, um die mRNA eines zu vermindernden ε-Cyclases katalytisch zu spalten und so die Translation zu verhindern. Die Ribozym-Technologie kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen. Verfahren zur Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine sind beschrieben in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). In pflanzlichen Zellen ist eine Ribozym-Expression ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al . (1992) EMBO J 11 (4) : 1525-1530; de Feyter R et al . (1996) Mol Gen Genet . 250 (3 ): 329-338) . Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al . eds , Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18 (2) :353-361; Lloyd AM and Davis RW et al . (1994) Mol Gen Genet. 242 (6) : 653-657) . Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu supprimierenden ε-Cyclases aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742). Alternativ können solche Ribozyme auch über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribozyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418).
d) Einbringen einer sense-Ribonukleinsäuresequenz einer ε-Cyclase (ε-Cyclase-senseRNA) zur Induktion einer Kosuppression
Die Expression einer ε-Cyclase Ribonukleinsäuresequenz (oder eines Teils derselben) in sense-Orientierung kann zu einer Kosup- pression des entsprechenden ε-Cyclase-Gens führen. Die Expression von sense-RNA mit Homologie zu einem endogenen ε-Cyclasegen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Jorgensen et al . (1996) Plant Mol Biol 31 (5) : 957-973 ; Goring et al . (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:1770-1774; Smith et al . (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al . (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde, homologe Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Die Anwendung dieser Technologie auf Pflanzen ist beschrieben (z.B. Napoli et al . (1990) Plant Cell 2:279-289; in US 5,034,323.
Bevorzugt wird die Kosuppression unter Verwendung einer Sequenz realisiert, die im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil der Nukleinsauresequenz kodierend für eine ε-Cyclase, beispielsweise der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO: 38. Bevorzugt ist die ε-Cyclase-senseRNA so gewählt, dass es nicht zu einer Translation der ε-Cyclase oder eines Teils desselben kommen kann. Dazu kann beispielsweise der 5 ' -untranslatierte oder 3 ' -un- translatierte Bereich gewählt oder aber das ATG-Startkodon dele- 5 tiert oder mutiert werden.
e) Einbringen von DNA-oder Protein-bindende Faktoren gegen ε-Cyclase Gene, -RNAs oder Proteine
10 Eine Verminderung einer ε-Cyclase Expression ist auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. mit Faktoren vom Typ der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken eine Verminde-
15 rung der Expression. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben (Dreier B et al . (2001) J Biol Chem 276 (31) : 29466-78 ; Dreier B et al . (2000) J Mol Biol 303 (4) :489-502; Beerli RR et al . (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4) :1495-1500; Beerli RR et al . (2000) J Biol Chem
20 275(42) :32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(l):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275 (12) :8742-8748; Beerli RR et al . (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (25) :14628- 14633; Kim JS et al . (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(8):3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293 (2) : 215-218 ; Tsai
25 SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30 (1-3 ): 23-31; Mapp AK et al . (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (8) : 3930-3935 ; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29 (12 ): 1371-1387 ; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275 (43 ): 33850-33860) .
30 Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines beliebigen Stückes eines ε-Cyclase-Gens erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen.
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Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die die ε-Cyclase selber inhibieren. Diese proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere (Famulok M und Mayer G (1999) Curr Top Micro- biol Immunol 243:123-36) oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente
40 oder einzelkettige Antikörper sein. Die Gewinnung dieser Faktoren ist beschrieben (Owen M et al . (1992) Biotechnology (N Y) 10 (7) -.790-794; Franken E et al . (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4) : 411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sei 1:286-272).
45 f) Einbringen von den ε-Cyclase RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten
Die ε-Cyclase Expression kann effektiv auch durch Induktion des spezifischen ε-Cyclase RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon; Angell SM et al . (1999) Plant J 20 (3 ): 357-362) realisiert werden. Diese Systeme - auch als "VIGS" (viral induced gene silencing) bezeichnet - bringen Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu dem Transkript einer zu vermindernden ε-Cyclase mittels viraler Vektoren in die
Pflanze ein. Die Transkription wird sodann - vermutlich mediiert durch pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Viren - abgeschaltet. Entsprechende Techniken und Verfahren sind beschrieben (Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25 (2) : 237-45 ; Fagard M und Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43 (2-3 ): 285-93 ; Anandalakshmi R et al . (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (22 ): 13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10 (6) : 937-46) .
Bevorzugt wird die VIGS-vermittelte Verminderung unter Ver- Wendung einer Sequenz realisiert, die im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil der Nukleinsauresequenz kodierend für ein ε—Cyclase, beispielsweise der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO: 38.
g) Einbringen von Konstrukten zur Erzeugung eines Funktionsverlustes oder einer Funktionsminderung an ε-Cyclase-Genen
Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren bekannt, wie genomische Sequenzen gezielt modifiziert werden können. Dazu zählen ins- besondere Verfahren wie die Erzeugung von Knockout-Mutanten mittels gezielter homologen Rekombination z.B. durch Generierung von Stopp-Kodons , Verschiebungen im Leseraster etc. (Hohn B und Puchta H (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96:8321-8323) oder die gezielte Deletion oder Inversion von Sequenzen mittels z.B. sequenzspezifischer Rekombinasen oder Nukleasen (s.u.)
Die Verminderung der ε-Cyclase-Menge, -Funktion und/oder -Aktivität kann auch durch eine gezielte Insertion von Nukleinsäuresequenzen (z.B. der im Rahmen der erfindungsgemäßen Ver- fahrens zu insertierenden Nukleinsauresequenz) in die Sequenz kodierend für eine ε-Cyclase (z.B. mittels intermolekularer homologer Rekombination) realisiert werden. Im Rahmen dieser Aus- führungsform verwendet man bevorzugt ein DNA-Konstrukt, das zumindest einen Teil der Sequenz eines ε-Cyclasegens oder benachbar- ter Sequenzen umfasst, und so mit diesen in der Zielzelle gezielt rekombinieren kann, so dass durch eine Deletion, Addition oder Substitution mindestens eines Nukleotids das ε-Cyclase-Gen so ver- ändert wird, dass die Funktionalität des ε-Cyclase-Gens reduziert oder gänzlich aufgehoben wird. Die Veränderung kann auch die regulativen Elemente (z.B. den Promotor) des ε-Cyclase-Gens betreffen, so dass die kodierende Sequenz unverändert bleibt, eine Ex- pression (Transkription und/oder Translation) jedoch unterbleibt und reduziert wird. Bei der konventionellen homologen Rekombination ist die zu insertierende Sequenz an ihrem 5'- und/oder 3 ' -Ende von weiteren Nukleinsäuresequenzen (A' bzw. B' ) flankiert, die eine ausreichende Länge und Homologie zu entsprechen- den Sequenzen des ε-Cyclase-Gens (A bzw. B) für die Ermöglichung der homologen Rekombination aufweisen. Die Länge liegt in der Regel in einem Bereich von mehreren hundert Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas KR und Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (8) : 4368-4373) . Für die homologe Rekombination wird die pflanzliche Zelle mit dem Rekom- binationskonstrukt unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren transformiert und erfolgreich rekombinierte Klone basierend auf der infolge inaktivierten ε-Cyclase selektioniert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Effizienz der Rekombination gesteigert durch Kombination mit Verfahren, die die homologe Rekombination fördern. Solche Verfahren sind beschrieben und umfassen beispielhaft die Expression von Proteinen wie RecA oder die Behandlung mit PARP-Inhibitoren. Es konnte ge- zeigt werden, dass die intrachromosomale homologe Rekombination in Tabakpflanzen durch die Verwendung von PARP-Inhibitoren erhöht werden kann (Puchta H et al . (1995) Plant J 7:203-210). Durch den Einsatz dieser Inhibitoren kann die Rate der homologen Rekombination in den Rekombinationskonstrukten nach Induktion des sequenz- spezifischen DNA-Doppelstrangbruches und damit die Effizienz der Deletion der Transgensequenzen weiter erhöht werden. Verschiedene PARP Inhibitoren können dabei zum Einsatz kommen. Bevorzugt umfasst sind Inhibitoren wie 3-Aminobenzamid, 8-Hydroxy-2-methyl- quinazolin-4-on (NU1025), 1, llb-Dihydro- [2H]benzopyrano- [4, 3 , 2-de] isoquinolin-3-on (GPI 6150), 5-Aminoisoquinolinon, 3 , 4-Dihydro-5- [4- ( 1-piperidinyl ) butoxy] -1 ( 2H) -isoquinolinon oder die in WO 00/26192, WO 00/29384, WO 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 und WO 01/23390 beschriebenen Substanzen.
Weitere geeignete Methoden sind die Einführung von Nonsense-Muta- tionen in endogene Markerprotein Gene zum Beispiel mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al . (2000) Nat Biotechnol 18 (5) : 555-558) oder die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al., Plant Mol. Biol. 1992, 20 (5) : 963-976) . Punktmutationen können auch mittels DNA-RNA Hybriden erzeugt werden, die auch als "chimeraplasty" bekannt sind (Cole-Strauss et al . (1999) Nucl Acids Res 27 (5) : 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3 ) :240-247) .
Die Methoden der dsRNAi, der Kosuppression mittels sense-RNA und der "VIGS" ("virus induced gene silencing") werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) oder transcriptional gene silencing" (TGS) bezeichnet. PTGS/TGS-Verfahren sind besonders vorteilhaft, weil die Anforderungen an die Homologie zwi- sehen dem zu vermindernden Markerprotein-Gen und der transgen ex- primierten sense- oder dsRNA-Nukleinsäuresequenz geringer sind als beispielsweise bei einem klassischen antisense-Ansatz . So kann man unter Verwendung der Markerprotein-Nukleinsäuresequenzen aus einer Art auch die Expression von homologen Markerprotein- Proteinen in anderen Arten effektiv vermindern, ohne, dass die Isolierung und Strukturaufklärung der dort vorkommenden Markerprotein-Homologen zwingend erforderlich wäre. Dies erleichtert erheblich den Arbeitsaufwand.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch:
a) Einbringen mindestens einer doppelsträngigen ε-Cyclase Ribo- nukleinsauresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in Pflanzen und/oder b) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase antisense-Ribonuklein- säuresequenzen oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch Einbringen mindestens einer doppelsträngigen ε-Cyclase Ribonu- kleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in Pflanzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blüten die geringste Expressionsrate einer ε-Cyclase aufweisen.
Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität blütenspezifisch, besonders bevorzugt blütenblattspezifisch erfolgt. In der vorstehend beschriebenen, besonders bevorzugten Ausführungsform wird dies dadurch erreicht, dass die Transkription der ε-Cyclase-dsRNA-Sequenzen unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors oder noch bevorzugter unter Kontrolle eines blü- tenblattspezifischen Promotors erfolgt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen kultiviert, die zusätzlich gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Synthase-Aktivität, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduk- toisomerase-Aktivität , Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivi- tät, Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität , Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivi- tät, Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desaturase-Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität, crtlSO-Aktivität , FtsZ- Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen.
Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG-CoA-Reduktase ( 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduk- tase) verstanden.
Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl- Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umge- setzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.
Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht .
Vorzusgweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivi- tat mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wildtyps .Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzym- aktivität einer HMG-CoA-Reduktase verstanden. Die Bestimmung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
5 Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung
10 der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12 , 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10% Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0.5 mM
15 PMSF zugegeben.
Die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase kann nach veröffentlichen Beschreibungen gemessen werden (z.B. Schaller, Grausem, Benveniste, Chye, Tan, Song und Chua, Plant Physiol. 109 (1995), 761-770;
20 Chappell, Wolf, Proulx, Cuellar und Saunders, Plant Physiol. 109 (1995) 1337-1343) . Pflanzengewebe kann in kaltem Puffer (100 mM Kaliumphosphat (pH 7.0), 4 mM MgCl , 5 mM DTT) homogenisiert und extrahiert werden. Das Homogenisat wird 15 Minuten lang bei 10.000g bei 4C zentrifugiert. Der Überstand wird danach bei
25 100.000g für 45-60 Minuten nochmals zentrifugiert. Die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase wird im Überstand und im Pellet der mikro- somalen Fraktion (nach dem Resuspendieren in 100 mM Kaliumphosphat (pH 7.0) und 50 mM DTT) bestimmt. Aliquots der Lösung und der Suspension (der Proteingehalt der Suspension entspricht
30 etwa 1-10 μg) werden in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0 mit 3 mM NADPH und 20 μM (l4C)HMG-CoA (58 μCi/μM) idealerweise in einem Volumen von 26 μl für 15-60 Minuten bei 30C inkubiert. Die Reaktion wird terminiert durch die Zugabe von 5 μl Mevalonatlac- ton (1 mg/ml) und 6 N HCI. Nach Zugabe wird die Mischung bei
35 Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert. Das in der Reaktion gebildete (1 C) -Mevalonat wird quantifiziert, indem 125 μl einer gesättigten Kaliumphosphat-Lösung (pH 6.0) und 300 μl Ethylacetat zugegeben werden. Die Mischung wird gut vermischt und zentrifugiert. Mittels Szintillationsmessung kann die Radioaktivität be-
40 stimmt werden.
Unter (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Akti- vität, auch lytB oder IspH bezeichnet, wird die Enzymaktivität einer (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase 45 verstanden. Unter einer (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat in Isopenten- yldiphosphat und Dimethylallyldiphosphate umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Di- phosphat-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase umgesetzte Menge (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat bzw. gebildete Menge Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldi- phosphat verstanden.
Bei einer erhöhten (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase -Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Ver- gleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase die umgesetzte Menge (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat bzw. die gebildete Menge Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldi- phosphat erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat~Reduktase - Aktivität des Wildtyps .
Die Bestimmung der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches mög- licht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4) , 10 M MgC12 , 10 M KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben. Die Bestimmung der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Aktivität kann über einen immunologischen Nachweis erbracht werden. Die Herstellung spezifischer Antikörper ist durch Rohdich und Kollegen (Rohdich, Hecht, Gärtner, Adam, Krieger, Amslinger, Arigoni, Bacher und Eisenreich: Studies on the non- mevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein, Natl. Acad. Natl. Sei. USA 99 (2002), 1158-1163) beschrieben worden. Zur Bestimmung der katalytischen Aktivität bschreiben Altincicek und Kollegen (Altincicek, Duin, Reichen- berg, Hedderich, Kollas, Hintz, Wagner, Wiesner, Beck und Jomaa: LytB protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl- D-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis; FEBS Letters 532 (2002,) 437-440) ein in vitro-System, welches die Reduktion von (E) -4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphat in die Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphat verfolgt .
Unter l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase verstanden.
Unter einer l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Hydroxyethyl-ThPP und Glycerinaldehyd-3-Phosphat in 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase -Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase umgesetzte Menge Hydroxyethyl-ThPP und/oder Glycerinaldehyd-3-Phosphat bzw. gebildete Menge -Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat verstanden.
Bei einer erhöhten l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase - Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Synthase die umgesetzte Menge Hydroxyethyl-ThPP und/ oder Glycerinaldehyd-3-Phosphat bzw. die gebildete Menge -Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Synthase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität des Wildtyps. Die Bestimmung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfüg- baren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist . Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Gly- zerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben.
Die Reaktionslösung (50-200 ul) für die Bestimmung der D-1-Deoxy- xylulose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität (DXS) besteht aus 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 3 mM MgCl , 3 mM MnCl2, 3 mM ATP, 1 mM Thiamin- diphosphat, 0.1% Tween-60, 1 mM Kaliumfluorid, 30 μM (2-14C) -Pyru- vat (0.5 μCi) , 0.6 mM DL-Glyerinaldehyd-3-phosphat . Der Pflanzenextrakt wird 1 bis 2 Stunden in der Reaktionslösung bei 37C inkubiert. Danach wird die Reaktion durch Erhitzen auf 80C für 3 Minuten gestoppt. Nach Zentrifugation bei 13.000 Umdrehungen/ Minute für 5 Minuten wird der Überstand evaporiert, der Rest in 50 μl Methanol resuspendiert, auf eine TLC-Platte für Dünnschichtchromatographie (Silica-Gel 60, Merck, Darmstadt) aufgetragen und in N-Propylalkohol/Ethylacetat/Wasser (6:1:3; v/v/v) aufgetrennt. Dabei trennt sich radioaktiv markiertes D-1-deoxyxy- lulose-5-phosphat (oder D-1-deoxyxylulose) von (2-14C) -Pyruvat . Die Quantifizierung erfolgt mittels Scintillationszähler . Die Methode wurde beschrieben in Harker und Bramley (FEBS Letters 448 (1999) 115-119). Alternativ wurde ein fluorometrischer Assay zur Bestimmung der DXS-Synthaseaktivität von Querol und Kollegen beschrieben (Analytical Biochemistry 296 (2001) 101-105).
Unter l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merase, auch l-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase genannt, verstanden.
Unter einer l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat in ß-Carotin umzuwandeln. Dementsprechend wird unter l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Redukto- isomerase -Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase umgesetzte Menge l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat bzw. gebildete Menge Isopen- tenyl-Diphosphat verstanden.
Bei einer erhöhten l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase- Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase die umgesetzte Menge 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat bzw. die gebildete Menge Isopentenyl-Diphos- phat erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Reduktoisomerase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität des Wildtyps.
Die Bestimmung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase -Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfüg- baren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgC12 , 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Gly- zerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben.
Die Aktivität der D-l-Deoxyxylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase (DXR) wird gemessen in einem Puffer aus 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM MnCl2, 0 , 3 mM NADPH und 0,3 mM l-Deoxy-D-Xylulose-4-Phosphat , welches z.B. enzymatisch synthetisiert werden kann (Kuzuyama, Takahashi, Watanabe und Seto: Tetrahedon letters 39 (1998) 4509-4512) . Die Reaktion wird durch Zugabe des Pflanzenextraktes gestartet. Das Reaktionsvolumen kann typischerweis 0,2 bis 0,5 mL betragen; die Inkubation erfolgt bei 37C über 30-60 Minuten. Während dieser Zeit wird die Oxidation von NADPH photometrisch bei 340 nm verfolgt.
Unter Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase -Aktivität wird die Enzymaktivität einer Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase verstanden.
Unter einer Isopentenyl-Diphosphat-D-Isomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Isopentenyl- Diphosphat in Dimethylallylphosphat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Isopentenyl-Diphosphat-D-Isomerase- Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Iso- pentenyl-Diphosphat-D-Isomerase umgesetzte Menge Isopentenyl-Di- phosphat bzw. gebildete Menge Dimethylallylphosphat verstanden.
Bei einer erhöhten Isopentenyl-Diphosphat-D-Isomerase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Isopentenyl-Diphosphat-D- Isomerase die umgesetzte Menge Isopentenyl-Diphosphat bzw. die gebildete Menge Dimethylallylphosphat erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt minde- stens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Isopentenyl- Diphosphat-Δ-Isomerase Aktivität des Wildtyps.
Die Bestimmung der Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgCl2 , 10 mM KC1 , 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0,5 mM PMSF zugegeben. Aktivitätsbestimmungen der Isopentenyl-Diphosphat-Iso erase (IPP- lsomerase) können nach der von Fräser und Kollegen vorgestellten Methode (Fräser, Römer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, Schuch und Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants ex- pressing an additional phytoene synthase in a fruit-speeific manner; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99 (2002), 1092-1097, basierend auf Fräser, Pinto, Holloway und Bramley, Plant Journal 24 (2000) , 551-558) durchgeführt werden. Für Enzymmessungen werden Inkubationen mit 0,5 μci (1-14C)IPP (Isopentenylpyrophosphat) (56 Ci/ mmol, Amersham ple) als Substrat in 0,4 M Tris-HCl (pH 8,0) mit 1 mM DTT, 4 mM MgCl , 6 M Mn Cl2, 3 mM ATP, 0,1 % Tween 60, 1 mM Kaliunfluorid in einem Volumen von etwa 150-500 μl durchgeführt. Extrakte werden mit Puffer gemischt (z.B. im Verhältnis 1:1) und für wenigstens 5 Stunden bei 28°C inkubiert. Danach wird etwa 200 μl Methanol zugegeben und durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure (Endkonzentration 25 %) eine Säurehydrolyse für etwa 1 Stunde bei 37C durchgeführt. Anschließend erfolgt eine zweimalige Extraktion (jeweils 500 μl) mit Petrolether (versetzt mit 10% Diethylether) . Die Radioaktivität in einem Aliquot der Hyper- phase wird mittels Szmtillationszähler bestimmt. Die spezifische Enzymaktivität kann bei kurzer Inkubation von 5 Minuten bestimmt werden, da kurze Reaktionszeiten die Bildung von Reaktionsneben- Produkten unterdrückt (siehe Lützow und Beyer: The isopentenyl- diphosphate Δ-isomerase and its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts; Biochim. Biophys. Acta 959 (1988), 118-126)
Unter Geranyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität wird die Enzymaktivität einer Geranyl-Diphosphat-Synthase verstanden.
Unter einer Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Isopentenyl-Diphosphat und Dimethylallylphosphat in Geranyl-Diphosphat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Geranyl-Diphosphat-Synthase umgesetzte Menge Isopentenyl-Diphosphat und/oder Dimethylallylphosphat bzw. gebildete Menge Geranyl-Diphosphat verstanden.
Bei einer erhöhten Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Geranyl-Diphosphat-Synthase die umgesetzte Menge Isopentenyl-Diphosphat und/oder Dimethylallylphosphat bzw. die gebildete Menge Geranyl-Diphosphat erhöht. Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Geranyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter 5 mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Geranyl- Diphosphat-Synthase-Aktivität des Wildtyps.
Die Bestimmung der Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- 10 bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen :
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer
15 in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist . Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus
20 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 M MgC12 , 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben.
25 Die Aktivität der Geranyl-Diphosphat-Synthase (GPP-Synthase) kann in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM MnCl2, 2 mM DTT, 1 mM ATP, 0.2 % Tween-20, 5 μM (1 C)IPP und 50 μM DMAPP (Dimethyl- allylpyrophosphat) nach Zugabe von Pflanzenextrakt bestimmt werden (nach Bouvier, Suire, d'Harlingue, Backhaus und Camara:
30 Meolcular cloning of geranyl diphosphate synthase and compart- mentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant Journal 24 (2000,) 241-252). Nach der Inkubation von z.B. 2 Stunden bei 37C werden die Reaktionsprodukte dephosphyryliert (nach Koyama, Fuji und Ogura: Enzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphats,
35 Methods Enzymol . 110 (1985), 153-155) und mittels Dünnschichtchromatographie und Messung der inkorporierten Radioaktivität analysiert (Dogbo, Bardat, Quennemet und Camara: Metabolism of plastid terpenoids : In vitrp inhibition of phytoene synthesis by phenethyl pyrophosphate derivates, FEBS Letters 219 (1987)
40 211-215) .
Unter Farnesyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität wird die Enzymaktivität einer Farnesyl-Diphosphat-Synthase verstanden.
45 Unter einer Farnesyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Dimethylallyl-Diphosphate und Isopentenyl-Diphosphat in Farnesyl-Diphosp- hat umzuwandeln. 5
Dementsprechend wird unter Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Farnesyl-Diphosphat-Synthase umgesetzte Menge Dimethylallyl-Diphosphate und/oder Isopentenyl-Diphosphat bzw. gebildete Menge Farnesyl-Diphosphat 10 verstanden.
Bei einer erhöhten Farnesyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Farnesyl-Diphosphat-Synthase die 15 umgesetzte Menge Dimethylallyl-Diphosphate und/oder Isopentenyl- Diphosphat bzw. die gebildete Menge Farnesyl-Diphosphat erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Farnesyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Farnesyl-Di- phosphat-Synthase-Aktivität des Wildtyps .
25 Die Bestimmung der Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtypbzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen :
30 Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizie-
35 rung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM MgC12 , 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 M ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und
40 0,5 mM PMSF zugegeben.
Die Aktivität der Franesylpyrophosphat-Snthase (FPP-Synthase) kann nach einer Vorschrift von Joly und Edwards (Journal of Bio- logical Chemistry 268 (1993), 26983-26989) bestimmt werden. Da- 45 nach wird die Enzymaktivität in einem Puffer aus 10 mM HEPES (pH 7,2), 1 mM MgCl , 1 mM Dithiothreitol, 20 μM Geranylpyrophosphat und 40 μM (1-1 C) Isopentenylpyrophosphat (4 Ci/mmol) gemessen. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C inkubiert; die Reaktion wird durch Zugabe von 2,5 N HCI (in 70 % Ethanol mit 19 μg/ml Farne- sol) gestoppt. Die Reaktionsproduckte werden somit durch Säurehydrolyse bei 37C innerhalb von 30 Minuten hydrolysiert . Durch Zugabe von 10% NaOH wird die Mischung neutralisiert und mit Hexan ausgeschüttelt. Ein Aliquot der Hexanphase kann zur Bestimmung der eingebauten Radioaktivität mittels Szintillationszähler gemessen werden.
Alternativ können nach Inkubation von Pflanzenextrakt und radioaktiv markierten IPP die Reaktionsprodukte mittels Dünnschichtchromatographie (Silica-Gel SE60, Merck) in Benzol/Methanol (9:1) getrennt werden. Radioaktiv markierte Produkte werden eluiert und die Radioaktivität bestimmt (nach Gaffe, Bru, Causse, Vidal, Stamitti-Bert , Carde und Gallusci: LEFPS1, a tomato farnesyl pyrophosphate gene highly expressed during early fruit development; Plant Physiology 123 (2000) 1351-1362) .
Unter Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität wird die Enzymaktivität einer Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase verstanden.
Unter einer Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Farnesyl-Di- phosphat und Isopentenyl-Diphosphat in Geranyl-Geranyl-Diphosphat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase- Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Geranyl- Geranyl-Diphosphat-Synthase umgesetzte Menge Farnesyl-Diphosphat und/oder Isopentenyl-Diphosphat bzw. gebildete Menge Geranyl- Geranyl-Diphosphat verstanden.
Bei einer erhöhten Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Geranyl-Geranyl-Diphos- phat-Synthase die umgesetzte Menge Farnesyl-Diphosphat und/oder Isopentenyl-Diphosphat bzw. die gebildete Menge Geranyl-Geranyl- Diphosphat erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Geranyl-Geranyl-Diphos- phat-Synthase -Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Geranyl- Geranyl-Piphosphat-Synthase-Aktivität des Wildtyps . Die Bestimmung der Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase -Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen :
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfüg- baren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 M HEPES-KOH (pH 7,4) , 10 mM MgCl2 , 10 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Gly- zerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben.
Aktivitätsmessungen der Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase (GGPP-Synthase) können nach der von Dogbo und Camara beschriebe- nen Methode (in Biochim. Biophys. Acta 920 (1987), 140-148: Puri- fication of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeran- yl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinity chromatography) bestimmt werden. Dazu wird einem Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2 mM MgCl2 , 1 mM MnCl2, 2 mM Dithiothreitol, (1-1 C)IPP (0,1 μCi, 10 μM) , 15 μM DMAPP, GPP oder FPP) mit einem Gesamtvolumen von etwa 200 μl Pflanzenextrakt zugesetzt. Die Inkubation kann für 1-2 Stunden (oder länger) bei 30C erfolgen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml Ethanol und 0 , 1 ml 6N HCI. Nach lOminütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktions- mischung mit 6N NaOH neutralisiert, mit 1 ml Wasser vermischt und mit 4 ml Diethylether ausgeschüttelt. In einem Aliquot (z.B. 0,2 mL) der Etherphase wird mittels Szintillationszählung die Menge an Radioaktivität bestimmt. Alternativ können nach Säurehydrolyse die radioaktiv markierten Prenylalkohole in Ether aus- geschüttelt werden und mit HPLC (25 cm-Säule Spherisorb ODS-1,
5μm; Elution mit Methanol/Wasser (90:10; v/v) bei einer Flussrate von 1 ml/min) getrennt und mittels Radioaktivitätsmonitor quantifiziert werden (nach Wiedemann, Misawa und Sandmann: Purification and enzymatic characterization of the geranylgeranyl pyrophos- phate synthase from Erwinia uredovora after expression in Escherichia coli;
Unter Phytoen-Synthase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Phytoen-Synthase verstanden. Insbesondere wird unter einer Phytoen-Synthase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Geranyl- Geranyl-Diphosphat in Phytoen umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Phytoen-Synthase -Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phytoen-Synthase umgesetzte Menge Geranyl-Geranyl-Diphosphat bzw. gebildete Menge Phytoen verstanden.
Bei einer erhöhten Phytoen-Synthase -Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phytoen-Synthase die umgesetzte Menge Geranyl-Geranyl-Diphosphat bzw. die gebildete Menge Phytoen erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Phytoen-Synthase- Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Phytoen-Synthase- Aktivität des Wildtyps .
Die Bestimmung der Phytoen-Synthase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Refe- renzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist . Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) , 10 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 M PMSF zugegeben.
Aktivitätsbestimmungen der Phytoen-Synthase (PSY) können nach der von Fräser und Kollegen vorgestellten Methode (Fräser, Romer,
Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, Schuch und Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-speeific manner; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99 (2002), 1092-1097, basierend auf Fräser, Pinto, Holloway und Bramley, Plant Journal 24 (2000) 551-558) durchgeführt werden. Für Enzymmessungen werden Inkubationen mit (3H) Geranyl- geranyl-pyrophosphat (15 mCi/mM, American Radiolabeled Chemicals, St. Louis) als Substrat in 0.4 M Tris-HCl (pH 8,0) mit 1 mM DTT, 4 mM MgCl , 6 mM Mn Cl2, 3 mM ATP, 0,1 % Tween 60, 1 mM Kaliun- fluorid durchgeführt. Pflanzenextrakte werden mit Puffer gemischt, z B. 295 μl Puffer mit Extrakt in einem Gesamtvolumen von 500 μl . Inkubiert wird für wenigstens 5 Stunden bei 28C. Anschließend wird Phytoene durch zweimaliges Ausschütteln (jeweils 500 μl) mit Chloroform extrahiert. Das während der Reaktion gebildete radioaktiv markierte Phytoene wird mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicaplatten in Methanol/Wasser (95:5; v/v) getrennt . Phytoene kann in einer Jod-angereicherten Atmosphäre
(durch Erhitzen weniger Iodkristalle) auf den Silicaplatten identifiziert werden. Ein Phytoene-Standard dient als Referenz. Die Menge an radioaktiv markiertem Produckt wird mittels Messung im Szintillationszähler bestimmt. Alternativ kann Phytoene auch mittels HPLC, die mit einem Radioaktivitätsdetektor versehen ist, quantifiziert werden (Fräser, Albrecht und Sandmann: Development of high Performance liquid Chromatographie Systems for the Separation of radiolabeled carotenes and precursors formed in speci- fic enzymatic reactions; J. Chromatogr. 645 (1993) 265-272).
Unter Phytoen-Desaturase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Phytoen-Desaturase verstanden.
Unter einer Phytoen-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Phytoen in Phytofluen und/oder Phytofluen in ζ-Carotin (Zetacarotin) umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Phytoen-Desaturase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phytoen-Desaturase umge- setzte Menge Phytoen bzw. Phytofluen bzw. gebildete Menge Phytofluen bzw. ζ-Carotin verstanden.
Bei einer erhöhten Phytoen-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phytoen-Desaturase die umgesetzte Menge Phytoen bzw. Phytofluen bzw. die gebildete Menge Phytofluen bzw. ζ-Carotin erhöht .
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Phytoen-Desaturase- Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Phytoen-Desaturase- Aktivität des Wildtyps . Die Bestimmung der Phytoen-Desaturase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 mM ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0,5 mM PMSF zugegeben .
Die Aktivität der Phytoen-Desaturase (PDS) kann durch die Inkorporation von radioaktiv markiertem (1C) -Phytoen in ungesättigte Carotine gemessen werden (nach Römer, Fräser, Kiano, Shipton, Misawa, Schuch und Bramley: Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants; Nature Biotechnology 18 (2000) 666-669) . Radioaktiv markiertes Phytoene kann synthetisiert werden nach Fr ser (Fräser, De la Rivas, Mackenzie, Bramley: Phyco- myces blakesleanus CarB mutants: their use in assays of phytoene desaturase; Phytochemistry 30 (1991) , 3971-3976) . Membranen von Piastiden des Zielgewebes können mit 100 mM MES-Puffer (pH 6,0) mit 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 1 mL inkubiert werden. In Aceton gelöstes (1C) -Phytoen (etwa 100.000 Zerfälle/Minute für jeweils eine Inkubation) wird zuge- geben, wobei die Acetonkonzentration 5 % (v/v) nicht übersteigen sollte. Diese Mischung wird bei 28C für etwa 6 bis 7 Stunden im Dunklen unter Schütteln inkubiert . Danach werden Pigmente dreimal mit etwa 5 mL Petrolether (mit 10 % Diethylether versetzt) extrahiert und mittels HPLC getrennt und quantifiziert.
Alternativ kann die Aktivität der Phytoen-Desaturase nach Fräser et al. (Fräser, Misawa, Linden, Yamano, Kobayashi und Sandmann: Expression in Escherichia coli, purification, and reactivation of the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase, Journal of Biological Chemistry 267 (1992), 19891-9895) gemessen werden.
Unter Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Zeta-Carotin-Desaturase verstanden. Unter einer Zeta-Carotin-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ζ-Carotin in Neurosporin und/oder Neurosporin in Lycopin umzuwandeln.
5 Dementsprechend wird unter Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Zeta-Carotin-Desaturase umgesetzte Menge ζ-Carotin oder Neurosporin bzw. gebildete Menge Neurosporin oder Lycopin verstanden.
10 Bei einer erhöhten Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Zeta-Carotin-Desaturase die umgesetzte Menge ζ-Carotin oder Neurosporin bzw. die gebildete Menge Neurosporin oder Lycopin erhöht .
15
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Zeta-Carotin-Desaturase- Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %,
20 insbesondere mindestens 600 % der Zeta-Carotin-Desaturase - Aktivität des Wildtyps .
Die Bestimmung der Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp- 25 bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen :
Eingefrorenes Pflanzenmaterial wird durch intensives Mosern in flüssigem Stickstoff homogenisiert und mit Extraktionspuffer
30 in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 extrahiert. Das jeweilige Verhältnis richtet sich nach den Enzymaktivitäten in dem verfügbaren Pflanzenmaterial, sodaß eine Bestimmung und Quantifizierung der Enzymaktivitäten innerhalb des linearen Messbereiches möglicht ist. Typischerweise kann der Extraktionspuffer bestehen aus
35 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 2 M ε-Aminocapronsäure, 10 % Glyzerin, 5 mM KHC03. Kurz vor der Extraktion wird 2 mM DTT und 0 , 5 mM PMSF zugegeben.
40 Analysen zur Bestimmung der ξ-Carotin-Desaturase (ZDS-Desaturase) können in 0.2 M Kaliumphosphat (pH 7.8, Puffervolumen von etwa 1 ml) durchgeführt werden. Die 7Anlysemethode dazu wurde von Breitenbach und Kollegen (Breitenbach, Kuntz, Takaichi und Sandmann: Catalytic properties of an expressed and purified higher plant
45 type ξ-carotene desaturase from Capsicum annuum; European Journal of Bioche istry. 265 (1) :376-383 , 1999 Oct ) publiziert. Jeder Analyseansatz enthält 3 mg Phosphytidylcholin, das in 0,4 M Kali- umphosphatpuffer (pH 7,8) suspendiert ist, 5 μg ξ-Carotin oder Neurosporene , 0,02 % Butylhydroxytoluol , 10 μl Decyl-Plastochinon (1 mM methanolische Stammlösung) und Pflanzenextrakt. Das Volumen des Pflanzenextraktes muß der Menge an vorhandener ZDS-Desatu- rase-Aktivität angepasst werden, um Quantifizierungen in einem linearen Messbereich zu ermöglichen. Inkubationen erfolgen typischerweise für etwa 17 Stunden bei kräftigem Schütteln (200 Umdrehungen/Minute) bei etwa 28°C im Dunklen. Carotinoide werden durch Zugabe von 4 ml Aceton bei 50°C für 10 Minuten unter Schütteln extrahiert. Aus dieser Mischung werden die Carotinoide in eine Petroletherpahse (mit 10 % Diethylether) überführt. Die Dethylether/Petroletherphase wird unter Stickstoff evaporiert, die Carotinoide wieder in 20 μl gelöst und mittels HPLC getrennt und quantifiziert.
Unter crtlSO -Aktivität wird die Enzymaktivität eines crtlSO- Proteins verstanden.
Unter einem crtlSO-Proteins wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 7 , 9 , 7 ' , 9 ' -tetra-cis-Lycopin in all-trans-Lycopin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter crtlSO-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein crtlSO umgesetzte Menge 7 , 9 , 7 ', 9 ' -tetra-cis-Lycopin bzw. gebildete Menge all-trans- Lycopin verstanden.
Bei einer erhöhten crtlSO-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das crtlSO-Proteins die umgesetzte Menge 7, 9, 7 ', 9 '-tetra-cis- Lycopin bzw. die gebildete Menge all-trans-Lycopin erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der crtlSO-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der crtlSO-Aktivität des Wildtyps .
Unter FtsZ-Aktivität wird die physiologische Aktivität eines FtsZ-Proteins verstanden.
Unter einem FtsZ-Protein wird ein Protein verstanden, das eine Zellteilungs und Plastidenteilungs-fordernde Wirkung hat und Homologien zu Tubulinproteinen aufweist. Unter MinD -Aktivität wird die physiologische Aktivität eines MinD -Proteins verstanden.
Unter einem MinD -Protein wird ein Protein verstanden, das eine multifunktionele Rolle bei der Zellteilung aufweist. Es ist eine Membran-assoziierte ATPase und kann innerhalb der Zelle eine oszillierende Bewegung von Pol zu Pol zeigen.
Weiterhin kann die Erhöhung der Aktivität von Enzymen des Nicht- Mevalonatweges zu einer weiteren Erhöhung des gewünschten Keto- carotenoid-Endproduktes führen. Beipiele hierfür sind die 4-Di- phosphocytidyl-2-C-Methyl-D-Erythritol-Synthase, die 4-Diphospho- cytidyl-2-C-Methyl-D-Erythritol-Kinase und die 2-C-Methyl-D- Erythritol-2 , 4-cyclodiphoshat-Synthase . Durch Änderungen der Genexpression der entsprechenden Gene kann die Aktivität der genannten Enzyme erhöht werden. Die veränderten Konzentrationen der relavanten Proteine können standardgemäß mittels Antikörpern und entsprechenden Blotting-techniken nachgewiesen werden. Die Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivität und/oder Geranyl- Diphosphat-Synthase-Aktivität und/oder Farnesyl-Diphosphat-Syn- thase-Aktivität und/oder Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase- Aktivität und/oder Phytoen-Synthase-Aktivität und/oder Phytoen- Desaturase-Aktivität und/oder Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität und/oder crtISO-Aktivität und/oder FtsZ-Aktivität und/oder MinD- Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispiels- weise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Farne- syl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein MinD-Protein gegenüber dem Wildtyp .
Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Syn- thase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/ oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodierend ein ertISO-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein MinD-Protein gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des HMG-CoA-Reduktase-Gens und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gens und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Synthase-Gens und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Reduktoisomerase-Gens und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Iso- merase-Gens und/oder Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gens und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gens und/oder Geranyl-geranyl- Diphosphat-Synthase-Gens und/oder Phytoen-Synthase-Gens und/oder Phytoen-Desaturase-Gens und/oder Zeta-Carotin-Desaturase-Gens und/oder crtlSO-Gens und/oder FtsZ-Gens und/oder MinD-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Kopien des HMG-CoA-Reduktase-Gens und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2- enyl-Diphosphat-Reduktase-Gens und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Synthase-Gens und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Redukto- isomerase-Gens und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Gens und/oder Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gens und/oder Farnesyl- Diphosphat-Synthase-Gens und/oder Geranyl-geranyl-Diphosphat- Synthase-Gens und/oder Phytoen-Synthase-Gens und/oder Phytoen- Desaturase-Gens und/oder Zeta-Carotin-Desaturase-Gens und/oder crtlSO-Gens und/oder FtsZ-Gens und/oder MinD-Gens, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine HMG- CoA-Reduktase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder mindestens einer Nuklein- säure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Isopente- nyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl- geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder mindestens einer Nuklein- säure kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein crtISO- Protein und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein FtsZ-Protein und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein MinD-Protein in die Pflanze.
Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl- Diphosphat-Reduktase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-
Synthase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder Geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Phytoen- Synthase und/oder Phytoen-Desaturase und/oder Zeta-Carotin- Desaturase und/oder ein crtlSO-Protein und/oder FtsZ-Protein und/oder MinD-Protein wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Pflanzen eigenen, endogenen HMG-CoA-Reduktase und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Isopentenyl-Di- phosphat-Δ-Isomerase und/oder Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Geranyl-geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder Phytoen-Synthase und/oder Phytoen- Desaturase und/oder Zeta-Carotin-Desaturase und/oder des
Pflanzen eigenen crtlSO-Proteins und/oder FtsZ-Proteins und/oder MinD-Proteins verstanden.
Dies kann beispielsweise durch Veränderung der entsprechenden Promotor DNA-Sequenz erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expressionsrate des Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der
Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nuk- leinsäure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/ oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Zeta-Carotin- Desaturase und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend ein crtlSO-Protein und/oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend ein FtsZ-Protein und/ oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend ein MinD-Protein durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Isopentenyl-Diphos- phat-Δ-Isomerase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein crtlSO-Protein und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein FtsZ-Protein und/oder durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein MinD-Protein in die Pflanze.
Dazu kann prinzipiell jedes HMG-CoA-Reduktase-Gen bzw. (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gen bzw. l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gen bzw. 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gen bzw. Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase-Gen bzw. Geranyl-Dip osphat-Synthase-Gen bzw.
Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gen bzw. Geranyl-geranyl-Diphosphat- Synthase-Gen bzw. Phytoen-Synthase-Gen bzw. Phytoen-Desaturase- Gen bzw. Zeta-Carotin-Desaturase-Gen bzw. crtlSO-Gen bzw. FtsZ- Gen bzw. MinD-Gen verwendet werden.
Bei genomischen HMG-CoA-Reduktase-Sequenzen bzw. (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Sequenzen bzw. 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Sequenzen bzw. 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Reduktoisomerase-Sequenzen bzw. Isopentenyl-Diphos- phat-Δ-Isomerase-Sequenzen bzw. Geranyl-Diphosphat-Synthase- Sequenzen bzw. Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Sequenzen bzw. Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Sequenzen bzw. Phytoen-
Synthase-Sequenzen bzw. Phytoen-Desaturase-Sequenzen bzw. Zeta- Carotin-Desaturase-Sequenzen bzw. crtlSO-Sequenzen bzw. FtsZ- Sequenzen bzw. MinD-Sequenzen aus eukaryontisehen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das die Wirtspflanze nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Proteine zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Pflanzen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres HMG-CoA-Reduktase-Gen und/oder (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gen und/ oder l-Deoxy-D-Xylose~5-Phosphat-Synthase-Gen und/oder 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gen und/oder Isopentenyl- Diphosphat-Δ-Isomerase-Gen und/oder Geranyl-Diphosphat-Synthase- Gen und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gen und/oder Geranyl- geranyl-Diphosphat-Synthase-Gen und/oder Phytoen-Synthase-Gen und/oder Phytoen-Desaturase-Gen und/oder Zeta-Carotin-Desaturase- Gen und/oder crtlSO-Gen und/oder FtsZ-Gen und/oder MinD-Gen vor.
In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die genetisch veränderte Pflanze beispielsweise mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine HMG-CoA-Reduktase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Synthase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Iso- pentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase oder minde- stens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Synthase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-De- saturase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend ein crtlSO-Protein oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend ein crtISO-Protein und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend ein FtsZ-Protein oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine FtsZ-Protein und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend ein MinD-Protein oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend ein MinD- Protein auf.
Beispiele für HMG-CoA-Reduktase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine HMG-CoA-Reduktase aus Arabidopsis thallana, Accession NM_106299; (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 99, Protein: SEQ ID NO: 100),
sowie weitere HMG-CoA-Reduktase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
P54961, P54870, P54868, P54869, 002734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135, 064966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136, 064967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4 , 076819, 028538, Q9Y7D2, P54960, 051628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, 024594, P09610, Q58116, 026662, Q01237, Q01559, Q12649, 074164, 059469, P51639, Q10283, 008424, P20715, P13703, P13702, Q96UG4, Q8SQZ9, 015888, Q9TUM4, P93514, Q39628, P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84MM0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9KLM0 Beispiele für (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase aus Arabidopsis thaliana (lytB/ISPH) , ACCESSION AY168881, (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 101, Protein: SEQ ID NO: 102) ,
sowie weitere (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduk- tase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern :
T04781, AF270978_1, NP_485028.1, NP_442089.1, NP_681832.1, ZP_00110421.1, ZP_00071594.1, ZP_00114706.1, ISPH_SYNY3 , ZP_00114087.1, ZP_00104269.1, AF398145_1, AF398146_1, AAD55762.1, AF514843_1, NP_622970.1, NP_348471.1, NP_562001.1, NP_223698.1, NP_781941.1, ZP_00080042.1, NP_859669.1, NP_214191.1, ZP_00086191.1, ISPH_VIBCH, NP_230334.1, NP_742768.1, NP_302306.1, ISPH_MYCLE, NP_602581.1, ZP_00026966.1, NP_520563.1, NP_253247.1, NP_282047.1, ZP_00038210.1, ZP_00064913.1, CAA61555.1, ZP_00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067.1, ZP_00029164.1, NP_790656.1, NP_217899.1, NP_641592.1, NP_636532.1, NP_719076.1, NP_660497.1, NP_422155.1, NP_715446.1, ZP_00090692.1, NP_759496.1, ISPH_BURPS, ZP_00129657.1, NP_215626.1, NP__335584.1, ZP_00135016.1, NP 789585.1, NP_787770.1, NP__769647.1, ZP_00043336.1, NP_242248.1, ZP_00008555.1, NP_246603.1, ZP_00030951.1, NP_670994.1, NP_404120.1, NP_540376.1, NP_733653.1, NP_697503.1, NP_840730.1, NP_274828.1, NP_796916.1, ZP_00123390.1, NP_824386.1, NP_737689.1, ZP_00021222.1, NP_757521.1, NP_390395.1,
ZP_00133322.1, CAD76178.1, NP_600249.1, NP_454660.1, NP_712601.1, NP_385018.1, NP_751989.1
Beispiele für l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase aus Lycopersicon esculentum, ACCESSION #AF143812 (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 103 , Protein: SEQ ID NO: 104),
sowie weitere l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern: AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286_1, NP_193291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AAM65798.1, NP_566686.1, CAD22531.1, AAC33513.1, CAC08458.1, AAG10432.1, T08140, AAP14354.1, AF428463_1, ZP_00010537.1, NP_769291.1, AAK59424.1, NP_107784.1, NP_697464.1, NP_540415.1, NP_196699.1, NP_384986.1, ZP_00096461.1, ZP_00013656.1, NP_353769.1, BAA83576.1, ZP_00005919.1, ZP_00006273.1, NP_420871.1, AAM48660.1, DXS_RHOCA, ZP_00045608.1, ZP_00031686.1, NP_841218.1, ZP_00022174.1, ZP_00086851.1, NP_742690.1, NP_520342.1, ZP_00082120.1, NP_790545.1, ZP_00125266.1, CAC17468.1, NP_252733.1, ZP_00092466.1, NP_439591.1, NP_414954.1, NP_752465.1, NP_622918.1, NP_286162.1, NP_836085.1, NP_706308.1, ZP_00081148.1, NP_797065.1, NP_213598.1, NP_245469.1, ZP_00075029.1, NP_455016.1, NP_230536.1, NP_459417.1, NP_274863.1, NP_283402.1, NP_759318.1, NP_406652.1, DXS_SYNLE, DXS_SYNP7, NP_440409.1, ZP_00067331.1, ZP_00122853.1, NP_717142.1, ZP_00104889.1, NP_243645.1, NP_681412.1, DXS_SYNEL, NP_637787.1, DXS_CHLTE, ZP_00129863.1, NP_661241.1, DXS_XANCP, NP_470738.1, NP_484643.1, ZP_00108360.1, NP_833890.1, NP_846629.1, NP_658213.1, NP_642879.1, ZP_00039479.1,
ZP_00060584.1, ZP_00041364.1, ZP_00117779.1, NP_299528.1 Beispiele für l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Reduktoisomerase aus Arabidopsis thaliana, ACCESSION #AF148852, (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 105 , Protein: SEQ ID NO: 106),
sowie weitere l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952, AJ242588, AB009053, AY202991, NP_201085.1, T52570, AF331705_1, BAB16915.1, AF367205_1, AF250235_1, CAC03581.1, CAD22156.1, AF182287_1, DXR_MENPI, ZP_00071219.1, NP_488391.1, ZP_00111307.1, DXR_SYNLE, AAP56260.1, NP_681831.1, NP_442113.1, ZP_00115071.1, ZP_00105106.1, ZP_0011348 .1, NP_833540.1, NP_657789.1, NP_661031.1, DXR_BACHD, NP_833080.1, NP_845693.1, NP_562610.1, NP_623020.1, NP_810915.1, NP_243287.1, ZP_00118743.1, NP_464842.1, NP_470690.1, ZP_00082201.1, NP_781898.1, ZP_00123667.1, NP_348420.1, NP_604221.1, ZP_00053349.1, ZP_00064941.1, NP_246927.1, NP_389537.1, ZP_00102576.1, NP_519531.1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NP_713472.1, NP_459225.1, NP_454827.1, ZP_00045738.1, NP_743754.1, DXR_PSEPK, ZP_00130352.1, NP_702530.1, NP_841744.1, NP_438967.1, AF514841_1, NP_706118.1, ZP_00125845.1, NP_404661.1, NP_285867.1, NP_240064.1, NP_414715.1, ZP_00094058.1, NP_791365.1, ZP_00012448.1, ZP_00015132.1, ZP_00091545.1, NP_629822.1, NP_771495.1, NP_798691.1, NP_231885.1, NP_252340.1, ZP_00022353.1, NP_355549.1, NP_420724.1, ZP_00085169.1,
EAA17616.1, NP_273242.1, NP_219574.1, NP_387094.1, NP_296721.1, ZP_00004209.1, NP_823739.1, NP_282934.1, BAA77848.1, NP_660577.1, NP_760741.1, NP_641750.1, NP_636741.1, NP_829309.1, NP_298338.1, NP_444964.1, NP_717246.1, NP_224545.1, ZP_00038451.1, DXR_KITGR, NP_778563.1.
Beispiele für Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Iso- merase aus Adonis palaestina clone ApIPI28, (ipiAal) , ACCESSION #AF188060, veröffentlicht durch Cunningham, F.X. Jr. and Gantt,E.: Identification of multi-gene families encoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol. 41 (1), 119-123 (2000) (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 107, Protein: SEQ ID NO: 108),
sowie weitere Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
Q38929, 048964, Q39472, Q13907, 035586, P58044, 042641, 035760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4, Q42553, 027997, P50740, 051627, 048965, Q8KFR5, Q39471, Q39664, Q9RVE2 , Q01335, Q9HHE4 , Q9BXS1, Q9KWF6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35 Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6, 013504, Q9HFW8 , Q8NJL9 , Q9UUQ1, Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6, 081691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3 , Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, Q9AVJ1, Q9AVG8 , Q9M6K6, Q9AVJ5 , Q9M6K2 , Q9AYS5 , Q9M6K8, Q9AVG7, Q8S3L7, Q8W250, Q94IE1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9M6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382 , CAD94476.
Beispiele für Geranyl-Diphosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis thaliana, ACCESSION #Y17376, Bouvier, F., Suire,C, d'Harlingue, A. , Backhaus ,R.A. and Camara, B. ; Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoter- pene synthesis in plant cells, Plant J. 24 (2), 241-252 (2000) (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 109, Protein: SEQ ID NO: 110),
sowie weitere Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3 , Q9SBR3 , Q9SBR4, Q9FET8, Q8LKJ1, Q84LG1, Q9JK86 Beispiele für Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis thaliana (FPS1) , ACCESSION #U80605, veröffentlicht durch Cunillera,N. , Arro,M., Delourme,D., Karst, F., Boro- nat,A. und Ferrer,A. : Arabidopsis thaliana contains two differen- tially expressed farnesyl-diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996), (Nukleinsäure: SEQ ID O: 111, Protein: SEQ ID O: 112),
sowie weitere Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351, 024241, Q43315, P49352, 024242, P49350, P08836, P14324, P49349, P08524, 066952, Q08291,
P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0, P22939, P45204, 066126, P55539,
Q9SWH9, Q9AVI7, Q9FRX2 , Q9AYS7 , Q94IE8, Q9FXR9 , Q9ZWF6, Q9FXR8,
Q9AR37, 050009, Q94IE9, Q8RVK7 , Q8RVQ7 , 004882, Q93RA8, Q93RB0,
Q93RB4, Q93RB5,Q93RB3, Q93RB1, Q93RB2, Q920E5.
Beispiele für Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat- Synthase aus Sinaps alba, ACCESSION #X98795, veröffentlicht durch Bonk,M. , Hoffmann, B., Von Lintig,J., Schledz,M., Al-Babili, S . , Hobeika,E., Kleinig, H. and Beyer, P.: Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differential fates prior to membrane binding and oligomeric assembly, Eur . J. Biochem. 247 (3), 942-950 (1997), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 113, Protein: SEQ ID N0:114),
sowie weitere Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
P22873, P34802 ,P56966, P80042, Q42698 Q92236, 095749, Q9WTN0 ,
Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2 Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4,
Q9SXZ5, Q9AVJ7, Q9AYN1, Q9AVJ4, Q9FXR7 Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC4,
Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0 Q9AVI9, Q9FRW3, Q9FXR5 ,
Q94IF0, Q9FRX1, Q9K567, Q93RA9, Q93QX8 CAD95619, EAA31459
Beispiele für Phytoen-Synthase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Synthase aus Erwinia uredovora, ACCESSION # D90087; veröffentlicht durch Misawa, N. , Nakagawa,M. , Kobayashi , K. , Yamano,S., Izawa, Y. ,Nakamura, K. und Harashima,K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 115, Protein: SEQ ID NO: 116),
sowie weitere Phytoen-Synthase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
CAB39693, BAC69364, AAF10440, CAA45350, BAA20384, AAM72615, BAC09112, CAA48922, P_001091, CAB84588, AAF41518, CAA48155, AAD38051, AAF33237, AAG10427, AAA34187, BAB73532, CAC19567, AAM62787, CAA55391, AAB65697, AAM45379, CAC27383, AAA32836, AAK07735, BAA84763, P_000205, AAB60314, P_001163, P_000718, AAB71428, AAA34153, AAK07734, CAA42969, CAD76176, CAA68575, P_000130, P_001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957, BAC76563, P_000242, P_000551, AAL02001, AAK15621, CAB94795, AAA91951, P 000448
Beispiele für Phytoen-Desaturase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Desaturase aus Erwinia uredovora, ACCESSION # D90087; veröffentlicht durch Misawa,N. , Nakagawa, M. , Kobayashi , K. , Yamano, S . , Izawa, Y. , akamura , K. und Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 117, Protein: SEQ ID NO: 118),
sowie weitere Phytoen-Desaturase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AAL15300, A39597, CAA42573, AAK51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461, AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AA024235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP_001041, ZP_001163, CAA39004, CAA44452, ZP_001142, ZP_000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091, BAC09113, AAP79175, AAL80005, AAM72642, AAM72043, ZP_000745, ZP_001141, BAC07889, CAD55814, ZP_001041, CAD27442, CAE00192, ZP_001163, ZP_000197, B7AA18400, AAG10425, ZP_001119, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081, AAA91161, CAB56041, AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP_001117, ZP_000448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP_000171, AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP_001133 CAA64853, BAB74484, ZP_001156, AAF23289, AAG28703, AAP09348, AAM71569, BAB69140, ZP_000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, AAG10645, ZP_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371, ZP_000612, BAC75676, AAF65582 Beispiele für Zeta-Carotin-Desaturase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase aus Narcissus pseudonarcissus, ACCESSION #AJ224683, veröffentlicht durch Al-Babili , S . , Oelschlegel, J. and Beyer, P.: A cDNA encoding for beta carotene desaturase (Accession NO.AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L.. (PGR98-103), Plant Physiol. 117, 719-719 (1998), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 119, Protein: SEQ ID NO: 120),
sowie weitere Zeta-Carotin-Desaturase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4, 049901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2, ZDS_NARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617_1, ZDS_TARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278A, ZDS_CAPAN, ZDS_LYCES, NP_187138.1, AAM63349.1, ZDS_ARATH, AAA91161.1, ZDS_MAIZE, AAG14399.1, NP_441720.1, NP_486422.1, ZP_00111920.1, CAB56041.1, ZP_00074512.1, ZP_00116357.1, NP_681127.1, ZP_00114185.1, ZP_00104126.1, CAB65434.1, NP_662300.1
Beispiele für crtISO-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine crtlSO aus Lycopersicon esculentum; ACCESSION #AF416727, veröffentlicht durch Isaacson,T., Ronen, G. , Zamir,D. and Hirschberg, J. : Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 121, Protein: SEQ ID NO: 122) ,
sowie weitere crtlSO -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AAM53952
Beispiele für FtsZ-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine FtsZ aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251346, veröffentlicht durch Moehs,C.P., Tian,L., Osteryoung,K.W. and Dellapenna, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 123, Protein: SEQ ID NO: 124), sowie weitere FtsZ -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
CAB89286.1, AF205858_1, NP_200339.1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774,AF383876_1, BAC57986.1, CAD22047.1,
BAB91150.1, ZP_00072546.1, NP_440816.1, T51092, NP_683172.1, BAA85116.1, NP_487898.1, JC4289, BAA82871.1, NP_781763.1, BAC57987.1, ZP_00111461.1, T51088, NP_190843.1, ZP_00060035.1, NP_846285.1, AAL07180.1, NP_243424.1, NP_833626.1, AAN04561.1, AAN04557.1, CAD22048.1, T51089, NP_692394.1, NP_623237.1,
NP_565839.1, T51090, CAA07676.1, NP_113397.1, T51087, CAC44257.1, E84778, ZP_00105267.1, BAA82091.1, ZP_00112790.1, BAA96782.1, NP_348319.1, NP_471472.1, ZP_00115870.1, NP_465556.1, NP_389412.1, BAA82090.1, NP_562681.1, AAM22891.1, NP_371710.1, NP_764416.1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117_1, NP_827300.1, JE0282, NP_626341.1, AAC45639.1, NP_785689.1, NP_336679.1, NP_738660.1, ZP_00057764.1, AAC32265.1, NP__814733.1, FTSZ_MYCKA, NP_216666.1, CAA75616.1, NP_301700.1, NP_601357.1, ZP_00046269.1, CAA70158.1, ZP_00037834.1, NP_268026.1, FTSZ_ENTHR, NP_787643.1, NP_346105.1, AAC32264.1, JC5548, AAC95440.1, NP_710793.1,
NP_687509.1, NP_269594.1, AAC32266.1, NP_720988.1, NP_657875.1, ZP_00094865.1, ZP_00080499.1, ZP_00043589.1, JC7087, NP_660559.1, AAC46069.1, AF179611_14, AAC44223.1, NP_404201.1.
Beispiele für MinD -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine MinD aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251019, veröffentlicht durch Moehs , C . P. , Tian,L., Osteryoung, K.W. und Dellapenna,D. : Analysis of carotenoid bio- synthetic gene expression during marigold petal development; Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (Nukleinsäure: SEQ ID NO: 125, Protein: SEQ ID O: 126),
sowie weitere MinD -Gene mit den folgenden Accession Nummern:
NP_197790.1, BAA90628.1, NP_038435.1, NP_045875.1, AAN33031.1, NP_050910.1, CAB53105.1, NP_050687.1, NP_682807.1, NP_487496.1, ZP_00111708.1, ZP_00071109.1, NP_442592.1, NP_603083.1, NP_782631.1, ZP_00097367.1, ZP_00104319.1, NP_294476.1, NP_622555.1, NP_563054.1, NP_347881.1, ZP_00113908.1, NP_834154.1, NP_658480.1, ZP_00059858.1, NP_470915.1, NP_243893.1, NP_465069.1, ZP_00116155.1, NP_390677.1, NP_692970.1, NP_298610.1, NP_207129.1, ZP_00038874.1, NP_778791.1, NP_223033.1, NP_641561.1, NP_636499.1, ZP_00088714.1, NP_213595.1, NP_743889.1, NP_231594.1, ZP_00085067.1, NP_797252.1, ZP_00136593.1, NP_251934.1, NP_405629.1, NP_759144.1, ZP_00102939.1, NP_793645.1, NP_699517.1, NP_460771.1, NP_860754.1, NP_456322.1, NP_718163.1, NP_229666.1, NP_357356.1, NP_541904.1, NP_287414.1, NP_660660.1, ZP_00128273.1, NP_103411.1, NP_785789.1, NP_715361.1, AF149810_1, NP_841854.1, NP_437893.1, ZP_00022726.1, E7AA24844.1, ZP_00029547.1, NP_521484.1, NP_240148.1, NP_770852.1, AF345908_2, NP_777923.1, ZP_00048879.1, NP_579340.1, NP_143455.1, NP_126254.1, NP_142573.1, NP_613505.1, NP_127112.1, NP_712786.1, NP_578214.1, NP_069530.1, NP_247526.1, AAA85593.1, NP_212403.1, NP_782258.1, ZP_00058694.1, NP_247137.1, NP_219149.1, NP_276946.1, NP_614522.1, ZP_00019288.1, CAD78330.1
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als HMG-CoA-Reduktase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 100 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 100, und die die enzymatische Eigenschaft einer HMG-CoA-Reduktase aufweisen.
Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und HMG-CoA-Reduktase- Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 100 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und HMG-CoA-Reduktase- Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 99 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der HMG-CoA-Reduktase der Sequenz SEQ ID NO: 100.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich. Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 99 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 102 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge- leitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf 7Λminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 102, und die die enzymatische Eigenschaft einer (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Di- phosphat-Reduktase aufweisen.
Weitere Beispiele für (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphos- phat-Reduktasen und (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 102 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphos- phat-Reduktasen und (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 101 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase der Sequenz SEQ ID NO: 102. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 101 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 104 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 104, und die die enzymatische Eigenschaft einer (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase aufweisen.
Weitere Beispiele für (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthasen und (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 104 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthasen und (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 103 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der (l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Synthase der Sequenz SEQ ID NO: 104. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 103 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase- Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 106 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 106, und die die enzymatische Eigenschaft einer l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merase aufweisen.
Weitere Beispiele für l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merasen und l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 106 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merasen und l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 105 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase- Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht , die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der 1-Deoxy-D-
Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase der Sequenz SEQ ID NO: 106. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 105 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Isopentenyl-D-Isomerase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 108 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 108, und die die enzymatische Eigenschaft einer Isopentenyl-D-Isomerase aufweisen.
Weitere Beispiele für Isopentenyl-D-Isomerasen und Isopentenyl-D- Isomerase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der AminosäureSequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 108 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Isopentenyl-D-Isomerasen und Isopentenyl-D- Isomerase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 107 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Isopentenyl-D-Isomerase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Isopentenyl-D-Isomerase der Sequenz SEQ ID NO: 108. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 107 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 110 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz , die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 110, und die die enzymatische Eigenschaft einer Geranyl-Diphosphat-Synthase aufweisen.
Weitere Beispiele für Geranyl-Diphosphat-Synthasen und Geranyl- Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäure- Sequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 110 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Geranyl-Diphosphat-Synthasen und Geranyl- Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 109 aus verschiedenen
Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Geranyl-Diphosphat-Synthase der Sequenz SEQ ID NO: 110. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 109 in den Organismus ein .
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 112 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 112, und die die enzymatische Eigenschaft einer Farnesyl-Diphosphat-Synthase aufweisen.
Weitere Beispiele für Farnesyl-Diphosphat-Synthasen und Farnesyl- Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäure- Sequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 112 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Farnesyl-Diphosphat-Synthasen und Farnesyl- Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 111 aus verschiedenen
Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Farnesyl-Diphosphat-Synthase der Sequenz SEQ ID NO: 112. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 111 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene
Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 114 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 114, und die die enzymatische Eigenschaft einer Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase aufweisen.
Weitere Beispiele für Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthasen und Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 114 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthasen und Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 113 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Geranyl-geranyl-Diphosphat- Synthase der Sequenz SEQ ID NO: 114. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 113 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevor- zugter Ausführungsform als Phytoen-Synthase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 116 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 116, und die die enzymatische Eigenschaft einer Phytoen-Synthase aufweisen.
Weitere Beispiele für Phytoen-Synthasen und Phytoen-Synthase- Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 116 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Phytoen-Synthasen und Phytoen-Synthase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 115 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Phytoen-Synthase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Phytoen-Synthase der Sequenz SEQ ID NO: 116. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 115 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Phytoen-Desaturase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 118 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 118, und die die enzymatische Eigenschaft einer Phytoen-Desaturase aufweisen.
Weitere Beispiele für Phytoen-Desaturasen und Phytoen-Desaturase- Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 118 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Phytoen-Desaturasen und Phytoen-Desaturase- Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 117 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Phytoen-Desaturase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Phytoen-Desaturase der Sequenz SEQ ID NO: 118. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 117 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Zeta-Carotin-Desaturase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 120 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 120, und die die enzymatische Eigenschaft einer Zeta-Carotin-Desaturase aufweisen.
Weitere Beispiele für Zeta-Carotin-Desaturasen und Zeta-Carotin- Desaturase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID NO: 120 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Zeta-Carotin-Desaturasen und Zeta-Carotin- Desaturase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 119 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Zeta-Carotin-Desaturase der Sequenz SEQ ID NO: 120. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 119 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als CrtlSO-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 122 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter minde- stens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 122, und die die enzymatische Eigenschaft einer Crtlso aufweisen.
Weitere Beispiele für CrtlSO und CrtlSO-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische
Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 122 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für CrtlSO und CrtlSO-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 121 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der CrtlSO-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der CrtlSO der Sequenz SEQ ID NO: 122.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich. Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 121 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als FtsZ-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 124 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 124, und die die enzymatische Eigenschaft einer FtsZ aufweisen.
Weitere Beispiele für FtsZn und FtsZ-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rück- übersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 124 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für FtsZn und FtsZ-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 123 aus ver- schiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der FtsZ-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der FtsZ der Sequenz SEQ ID NO: 124
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- Übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 123 in den Organismus ein.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als MinD-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 126 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 126, und die die enzymatische Eigenschaft einer MinD aufweisen.
Weitere Beispiele für MinDn und MinD-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID NO: 126 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für MinDn und MinD-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 125 aus ver- schiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der MinD-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der MinD der Sequenz SEQ ID NO: 126.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- Übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 125 in den Organismus ein. Alle vorstehend erwähnten HMG-CoA-Reduktase-Gene, (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gene , 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Synthase-Gene, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merase-Gene, Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Gene, Geranyl- Diphosphat-Synthase-Gene, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene, Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene , Phytoen-Synthase-Gene , Phytoen-Desaturase-Gene, Zeta-Carotin-Desaturase-Gene, crtlSO- Gene, FtsZ-Gene oder MinD-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oiigonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsver- fahren werden in Sambrook et al . (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrie- ben.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weisen die Pflanzen gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase Aktivität auf.
Unter einer reduzierten Aktivität wird, wie vorstehend erwähnt, vorzugsweise die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität eines Enzyms in einer pflanzlichen Zelle, Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen verstanden.
Die Reduzierung einer Aktivität in Pflanzen gegenüber dem Wildtyp kann beispielsweise durch Reduzierung der Proteinmenge, oder der mRNA-Menge in der Pflanze erfolgen. Dementsprechend kann eine gegenüber dem Wildtyp reduzierte Aktivität direkt bestimmt werden oder über die Bestimmung der Proteinmenge oder der mRNA-Menge der erfindungsgemäßen Pflanze im Vergleich zum Wildtyp erfolgen.
Eine Reduzierung einer Aktivität umfasst eine mengenmäßige Verringerung eines Proteins bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des Proteins (d.h. fehlende Nachweisbarkeit der entsprechenden Aktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des entsprechenden Proteins) . Unter endogener ß-Hydroxylase -Aktivität wird die Enzymaktivität der endogenen, pflanzeneigenen ß-Hydroxylase verstanden.
Unter einer endogenen ß-Hydroxylase wird eine endogene, pflanzen- eigene Hxdroxylase wie vorstehend beschrieben, verstanden. Ist beispielsweise Tagetes errecta die genetisch zu verändernde Zielpflanze, so wird unter der endogenen ß-Hydroxylase die ß-Hydoxy- lase von Tagetes errecta verstanden.
Unter einer endogenen ß-Hydroxylase wird demnach insbesondere ein pflanzeneigenes Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter endogener ß-Hydroxylase -Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein endogene ß-Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin verstanden.
Bei einer reduzierten endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität gegen- über dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die durch das Protein endogene ß-Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin reduziert.
Vorzugsweise beträgt diese Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt 100 %. Besonders bevorzugt ist die endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität komplett ausgeschaltet .
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass es bei Pflanzen die mehrheitlich Carotinoide des α-Carotin-Weges , wie beispielsweise Lutein, herstellen, wie beispielsweise Pflanzen der Gattung Tagetes, vorteilhaft ist, die Aktivität der endogenen ß-Hydroxy- läse zu reduzieren und gegebenenfalls die Aktivität einer hetero- logen Hydroxylase zu erhöhen. Besonders bevorzugt werden dabei Hydroxylasen oder funktionelle Äquivalente davon verwendet, die aus Pflanzen stammen, die mehrheitlich Carotinoide des ß-Carotin- Weges herstellen, wie beispielsweiese die vorstehend beschriebene ß-Hydroxylase aus Tomate (Nukleinsäure: SEQ ID No. 97, Protein: SEQ ID No. 98) .
Die Bestimmung der endogenen ß-Hydroxylase Aktivtät erfolgt wie vorstehend beschrieben analog zur Bestimmung der Hydroxylase- Aktivität. Vorzugsweise erfolgt die Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase- Aktivität in Pflanzen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren:
a) Einbringen mindestens einer doppelsträngigen endogenen ß-Hydroxylase Ribonukleinsäuresequenz, nachstehend auch endogene ß-Hydroxylase-dsRNA genannt, oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten.
Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die endogene ß-Hydroxylase-dsRNA gegen ein endogenes ß-Hydroxylase-Gen (also genomische DNA-Sequenzen wie die Promotorsequenz) oder ein endogenes ß-Hydroxylase-Transkript (also mRNA-Sequenzen) gerichtet ist,
b) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase anti- sense-Ribonukleinsäuresequenz, nachstehend auch endogene ß-Hydroxylase-antisenseRNA genannt, oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die endogene ß-Hydroxylase- antisenseRNA gegen ein endogenes ß-Hydroxylase-Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein endogenes ß-Hydroxylase- Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch α-anomere Nukleinsäuresequenzen,
c) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase-antisenseRNA kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
d) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase sense- Ribonukleinsäuresequenz , nachstehend auch endogene ß—Hydroxy- lase-senseRNA genannt, zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
e) Einbringen mindestens eines DNA- oder Protein-bindenden Faktors gegen ein endogenes ß—Hydroxylase-Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette
f) Einbringen mindestens einer, den endogenen ß-Hydroxylase RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsauresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
g) Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsverlustes, wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Verschiebungen im Leseraster, an einem endogenen ß-Hydroxylase-Gen beispielsweise durch Erzeugung einer Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem endogenen ß—Hydroxylase-Gen. Bevorzugt können Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in besagtes endo- genes ß-Hydroxylase-Gen durch homologe Rekombination oder
Einbringen von sequenzspezifischen Nukleasen gegen endogene ß-Hydroxylase-Gensequenzen generiert werden.
Dem Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Verminderung einer endogenen ß-Hydroxylase bzw. seiner Aktivität oder Funktion eingesetzt werden können. Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen Variante einer endogenen ß-Hydroxylase oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette vor- teilhaft sein. Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität einer endogenen ß-Hydroxylase bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung der endogenen ß-Hydroxylase, des Transports der endogenen ß-Hydroxylase oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens , Induktion eines endogenen ß-Hydroxylase-RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen.
Die einzelnen bevorzugten Verfahren seien infolge durch beispielhafte Ausführungsformen beschrieben:
a) Einbringen einer doppelsträngigen, endogenen ß-Hydroxylase- Ribonukleinsäuresequenz (endogene ß-Hydroxylase-dsRNA)
Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA wurde vorstehend für die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität ausführlich beschrieben. Analog lässt sich dieses Verfahren für die Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität durchführen .
Unter einer doppelsträngigen endogenen ß-Hydroxylase-Ribo- nukleinsäuresequenz oder auch endogenen ß-Hydroxylase-dsRNA wird vorzugsweise ein RNA-Molekül verstanden, das einen
Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Transkripts identisch ist und/oder b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Promotor-Sequenz identisch ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren bringt man daher zur Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität bevorzugt in die Pflanze eine RNA ein, die einen Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Transkripts identisch ist und/oder
b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Promotor-Sequenz identisch ist.
Unter dem Begriff „endogenes ß-Hydroxylase-Transkript" wird der transkripierte Teil eines eines endogenen ß-Hydroxylase-Gens verstanden, der neben der endogenen ß-Hydroxylase kodierenden Sequenz beispielsweise auch nichtkodierende Sequenzen, wie beispielsweise auch UTRs enthält.
Unter einer RNA, die "mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Promotor-Sequenz identisch ist", ist vorzugsweise gemeint, dass die RNA-Sequenz mit mindestens einem Teil des theoretischen Transkriptes der endogenen ß-Hydroxy- lase-Promotor-Sequenz, also der entsprechenden RNA-Sequenz, identisch ist.
Unter "einem Teil" des Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase- Transkripts bzw. der Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Pro- motor-Sequenz werden Teilsequenzen verstanden, die von wenigen Basenpaaren bis hin zu vollständigen Sequenzen des Transkripts bzw. der Promotorssequenz reichen können. Die optimale Länge der Teilsequenzen kann der Fachmann durch Routineversuche leicht ermitteln.
In der Regel beträgt die Länge der Teilsequenzen mindestens 10 Basen und höchstens 2 kb, bevorzugt mindestens 25 Basen und höchstens 1,5 kb, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen und höchstens 600 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen und höchstens 500, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen und höchstens 400 Basen.
Vorzugsweise werden die Teilsequenzen so ausgesucht, dass eine möglichst hohe Spezifität erreicht wird und nicht Aktivitäten anderer Enzyme reduziert werden, deren Verminderung nicht erwünscht ist. Es ist daher vorteilhaft für die Teilsequenzen der der endogenen ß-Hydroxylase-dsRNA Teile des endogenen ß-Hydroxy- läse Transkripts und/oder Teilsequenzen der endogenen ß-Hydroxy- lase-Promotor-Sequenzen zu wählen, die nicht in anderen Aktivitäten auftreten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält daher die endogene ß-Hydroxylase-dsRNA eine Sequenz, die mit einem Teil des Pflanze eigenen endogenen ß-Hydroxylase-Transkripts identisch ist und das 5V-Ende oder das 3 '-Ende der Pflanze eigenen Nukleinsäure, kodierend eine endogene ß-Hydroxylase enthält. Insbesondere sind nichttranslatierte Bereiche im 5 λ oder 3 x des Transkriptes geeignet, selektive Doppel-Strang-Strukturen herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle) , die bei Einbringen in einen pflanzlichen Organismus (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial) die Verminderung einer endogenen ß—Hydroxylase bewirken.
Ferner betrifft die Erfindung ein doppelsträngiges RNA-Molekül zur Reduzierung der Expression einer endogenen ß—Hydroxylase (endogene ß—Hydroxylase-dsRNA) umfassend dabei bevorzugt
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz , die im wesentlichen identisch ist zu min- destens einem Teil eines "sense"-RNA-endogene ß—Hydroxylase- Transkriptes, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen, bevorzugt vollständig, komplemen- tären ist.
Zur Transformation der Pflanze mit einer endogenen ß—Hydroxylase- dsRNA wird bevorzugt ein Nukleinsäurekonstrukt verwendet , das in die Pflanze eingebracht wird und das in der Pflanze in die endo- gene ß-Hydroxylase-dsRNA transkripiert wird.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Nukleinsäurekonstrukt, transkripierbar in
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz , die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-endogene ß-Hydroxylase Transkriptes , und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementär ist . Diese Nukleinsäurekonstrukte werden im folgenden auch Expressionskassetten oder Expressionsvektoren genannt.
In Bezug auf die dsRNA-Moleküle wird unter der endogenen 5 ß-Hydroxylase Nukleinsauresequenz, bzw. das entsprechende Transkript bevorzugt die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 127 oder ein Teil derselben verstanden.
"Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch
10 Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der endogenen ß-Hydroxylase Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirkt. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten
15 bevorzugt 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen ß-Hydroxylase-Gens, bzw. zwischen dem "antisense"-Strang dem komplementären Strang eines endogenen ß-Hydroxylase-Gens .
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Eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem endogenen ß-Hydroxylase Gentranskript ist nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der endogenen ß-Hydroxylase Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das
25 Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit der dsRNA, die ausgehend von der endogenen ß-Hydroxylase Sequenz des einen Organismus generiert wurde, die endogene
30 ß-Hydroxylase Expression in einem anderen Organismus zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA bevorzugt Sequenzbereiche von endogenen ß-Hydroxylase-Gentranskripten, die konservierten Bereichen entsprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen leicht abgeleitet werden.
35
Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsauresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines endogenen ß-Hydroxylase Gentranskriptes zu hybridisieren (z.B. in 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei
40 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h) .
"Im wesentlichen komplementär" meint, dass der "antisense" -RNA- Strang auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges 45 aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "antisense"-RNA- Strang und dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges .
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die endogene ß-Hydroxy- lase-dsRNA
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes des Promotor- bereichs eines endogenen ß-Hydroxylase-Gens , und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementären ist.
Das entsprechende, bevorzugt zur Transformation der Pflanzen zu verwendende, Nukleinsäurekonstrukt, umfasst
a) einen "sense"-DNA-Strang der im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des Promotorbereichs eines endogenen ß-Hydroxylase-Gens, und
b) einen "antisense"-DNA-Strang, der zu dem DNA-"sense"-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplemen- tär ist.
Zur Herstellung der endogenen ß-Hydroxylase-Sequenzen zur Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase-Aktivität werden, insbesondere für Tagetes erecta, besonders bevorzugt die folgenden Teil- Sequenzen verwendet:
SEQ ID NO: 163: Sense-Fragment der 5 terminalen Region der endogenen ß-Hydroxylase
SEQ ID NO: 164: Antisense-Fragment der 5'terminalen Region der endogenen ß-Hydroxylase
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen von Polyribonukleo- tiden bestehen. Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.
Die doppelsträngige dsRNA-Struktur kann ausgehend von zwei kom- plementären, separaten RNA-Strängen oder - bevorzugt - ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären RNA-Strang gebildet werden. In diesem Fall sind "sense"-RNA-Strang und "anti- sense"-RNA-Strang bevorzugt kovalent in Form eines invertierten "Repeats" miteinander verbunden.
Wie z.B. in WO 99/53050 beschrieben, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch eine verbindende Sequenz ("Linker"; beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression einer RNA-Sequenz erfordern und die komplementären RNA-Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen. Bevorzugt ist die verbindende Sequenz ein Intron (z.B. ein Intron des ST-LS1 Gens aus Kartoffel; Vancanneyt GF et al . (1990) Mol Gen Genet 220 (2) : 245-250) .
Die Nukleinsauresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptionstermina- tionssignale oder Polyadenylierungssignale.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen für die Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase Aktivität ergeben sich analog der vor- stehend beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen der Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität unter Austausch der ε-Cyclase durch endogene ß-Hydroxylase.
Besonders bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren gene- tisch veränderte Pflanzen mit folgende Kombinationen genetischer Veränderungen verwendet :
Genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität aufweisen, genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und eine reduzierte ε-Cyclase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität und eine reduzierte ε-Cyclase- Aktivität aufweisen, sowie
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität aufweisen.
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern und eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte e-Cyclase-Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase- Aktivität , (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase- Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität , Iso- pentenyl-Diphosphat-D-Isomerase-Aktivität, Geranyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivitat , Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase- Aktivität , Phytoen-Desaturase-Aktivität , Zeta-Carotin-Desaturase- Aktivität, crtlSO-Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen.
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen.
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte e-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte b-Cyclase- Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Reduktoisomerase-Aktivität , Isopentenyl-Diphosphat-D-Iso- merase-Aktivität , Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Farne- syl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desa- turase-Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität , crtlSO- Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen.
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Reduktoisomerase-Aktivität , Isopentenyl-Diphosphat-D-Iso- merase-Aktivität, Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität, Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desatu- rase-Aktivität , Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität, crtlSO- Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine reduzierte endogene b-Hydroxylase-Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , 1-Deoxy-D-Xylose -5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität, Isopentenyl-Diphosphat-D- Isomerase-Aktivität, Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desa- turase-Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität , crtlSO- Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy- 3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität, Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase-Aktivität , Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen- Desaturase-Aktivität , Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität , crtlSO- Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität, eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte
Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität , 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität, Isopentenyl- Diphosphat-D-Isomerase-Aktivität , Geranyl-Diphosphat-Synthase- Aktivität, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Geranyl- Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desaturase-Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase- Aktivität, crtlSO-Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen, genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und eine redu- zierte ß-Hydroxylase-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität , eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA- Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat- Reduktase-Aktivität, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivi- tät, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität, Iso- pentenyl-Diphosphat-D-Isomerase-Aktivität, Geranyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Phytoen-Synthase- Aktivität , Phytoen-Desaturase-Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase- Aktivität, crtlSO-Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen,
genetisch veränderte Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase- Aktivität, eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität und mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Synthase-Aktivität, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduk- toisomerase-Aktivität, Isopentenyl-Diphosphat-D-Isomerase-Aktivi- tat, Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat- Synthase-Aktiv!tat , Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase- Aktivität, Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desaturase- Aktivität, Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität, crtlSO-Aktivität , FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen.
Besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen, weisen im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase- Aktivität in Blütenblättern, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität und eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität auf, wobei
die erhöhte Ketolase Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäuren einbringt, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäure- ebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist,
die erhöhte ß-Cyclase-Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäure einbringt, kodierend eine ß-Cyclase, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 96 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 20 aufweist
und die erhöhte Hydroxylase-Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäuren einbringt, kodierend eine Hydroxylase, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 98 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 18 aufweist.
Besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen, weisen im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte oder verursachte Ketolase- Aktivität in Blütenblättern, eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte ß-Cyclase-Aktivität, eine erhöhte Hydroxylase- Aktivität und eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase-Aktivität auf , wobei
die erhöhte Ketolase Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäuren einbringt, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist,
die erhöhte ß-Cyclase-Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäure einbringt, kodierend eine ß-Cyclase, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 96 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 20 aufweist,
die erhöhte Hydroxylase-Aktivität dadurch verursacht wird, dass man Nukleinsäuren einbringt, kodierend eine Hydroxylase, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 98 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Amino- säuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 18 aufweist, und die reduzierte ε-Cyclase-Aktivität und eine reduzierte endo- gene ß-Hydroxylase-Aktivität gemäß den vorstehend beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen verursacht wird.
Die Herstellung dieser genetisch veränderten Pflanzen kann, wie ^ nachstehend beschrieben, beispielsweise durch Einbringen einzelner Nukleinsäurekonstrukte (Expressionskassetten) oder durch Einbringen von Mehrfachkonstrukten erfolgen, die bis zu zwei, drei oder vier der beschriebenen Aktivitäten enthalten.
^° Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, ein Ernten der Pflanzen und ein Isolieren von Ketocarotinoiden aus den Blütenblättern der Pflanzen angeschlossen.
15
Die transgenen Pflanzen werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.
Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den geernteten Blüten- 20 blättern erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Trocknung und anschließender Extraktion und gegebenenf lls weiterer chemischer oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische 25 Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie. Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den Blütenblättern erfolgt beispielsweise bevorzugt durch organische Lösungsmittel wie Aceton, Hexan, Ether oder tert . -Methylbutylether .
30 Weitere Isolierverfahren von Ketocarotinoiden, insbesondere aus Blütenblättern, sind beispielsweise in Egger und Kleinig (Phytochemistry (1967) 6, 437-440) und Egger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618) beschrieben.
35 Vorzugsweise sind die Ketocarotinoide ausgewählt aus der Gruppe Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3 ' -Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin .
Ein besonders bevorzugtes Ketocarotinoid ist Astaxanthin. 40
Die Ketocarotinoide fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Blütenblättern in Form ihrer Mono- oder Diester mit Fettsäuren an. Einige nachgewiesene Fettsäuren sind z.B. Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, und Laurin- 45 säure (Kamata und Simpson (1987) Co p. Biochem. Physiol. Vol. 86B(3), 587-591). Im folgenden wird exemplarisch die Herstellung genetisch veränderter Pflanzen mit erhöhter oder verursachter Ketolase-Aktivität in Blütenblättern beschrieben. Die Erhöhung weiterer Aktivitäten, wie beispielsweise der Hydroxylase-Aktivität und/oder der ß-Cy- clase-Aktivität und/oder der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und/oder der (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivi- tät und/oder der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität und/oder der l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase- Aktivität und/oder der Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivi- tat und/oder der Granyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität und/oder der Farnesyl-Diphospaht-Synthase-Aktivität und/oder der Geranyl- geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität und/oder der Phytoen-Synthase-Aktivität und/oder der Phytoen-Desaturase-Aktivität und/ oder der Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität und/oder der crtlSO- Aktivität und/oder der FtsZ-Aktivität und/oder der MinD-Aktivität kann analog unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen kodierend eine Hydroxylase bzw. ß-Cyclase bzw. Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Reduktoisomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase und/oder Nukleinsäuren kodie- rend ein crtlso-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ-Protein und/oder Nukleinsäuren kodierend ein MinD-Protein anstelle von Nukleinsäuresequenzen kodierend eine Ketolase erfolgen. Die Reduzierung weiterer Aktivitäten, wie beispielsweise die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität bzw. der endogenen ß—Hydroxylase-Aktivität kann analog unter Verwendung von anti- ε-Cyclase-Nukleinsäuresequenzen oder ε-Cyclase-Inverted-Repaet- Nukleinsäuresequenz bzw. unter Verwendung von anti-endogenen ß-Hydroxylase-Nukleinsäuresequenzen oder endogenen ß-Hydroxylase- Inverted-Repeat-Nukleinsäuresequenzen anstelle von Nukleinsäure- Sequenzen kodierend eine Ketolase erfolgen. Die Transformation kann bei den Kombinationen von genetischen Veränderungen einzeln oder durch Mehrfachkonstrukte erfolgen.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangspflanzen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase enthält, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.
Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nuklein- säuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressionskassetten genannt .
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurekonstrukte enthaltend mindestens eine Nukleinsäure kodierend eine Ketolase und zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe a) Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, b) Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, c) Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, d) Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase e) Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, f) Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-
5-Phosphat-Reduktoisomerase, g) Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Iso- merase, h) Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, i) Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, j ) Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-
Synthase, k) Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, 1) Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, m) Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, n) Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, o) Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein, p) Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein, q) doppelsträngige endogenen ß-Hydroxylase Ribonukleinsäure- sequenz und/oder endogene ß-Hydroxylase antisense-Ribo- nukleinsäuresequenzen und r) doppelsträngige ε-Cyclase- Ribonukleinsäuresequenz und/oder ε-Cyclase antisense-Ribonukleinsäuresequenz , wobei die Nukleinsäuren mit einem oder mehreren Regulationssigna- len funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.
Es ist, insbesondere in Pflanzen, technisch nur schwer zu realisieren, mehr als vier Aktivitäten mit einem Nukleinsäurekonstrukt zu erhöhen oder zu erniederigen. Daher werden bevorzugt Kombinationen von Nukleinsäurekonstrukten verwendet um die Aktivi- täten, insbesondere um mehr als 4 Aktivitäten im Organismus zu erhöhen oder zu erniedrigen.
Es ist jedoch auch möglich, genetisch veränderte Organismen zu kreuzen, die bereits veränderte Aktivitäten enthalten. Beispielsweise ist es durch Kreuzen von genetisch veränderten Organismen, die jeweils zwei veränderte Aktivitäten enthalten, möglich, Organismen mit vier veränderten Aktivitäten herzustellen. Gleiches kann auch erreicht werden, indem man eine Kombination von zwei Nuklemsäurekonstrukten die jeweils 2 Aktivitäten verändern in den Organismus einführt .
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bevorzugten genetisch veränderten Organismen durch Einbringen von Kombi- nationen von Nukleinsäurekonstrukten hergestellt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte enthalten folgende Kombinationen von Nukleinsäuren mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten:
Ketolase + epsilon
Ketolase + beta
Ketolase + hydro (OEX) Ketolase + epsilon + beta
Ketolase + epsilon + hydro (RNAi)
Ketolase + epsilon + hydro (OEX)
Ketolase + beta + hydro (RNAi)
Ketolase + beta + hydro (OEX) Ketolase + epsilon + (xxx)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (OEX)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (RNAi)
Ketolase+ epsilon + beta
Ketolase + epsilon + hydro (OEX) Ketolase + epsilon + hydro (RNAi)
Ketolase + epsilon + hydro (OEX) + hydro (RNAi)
Ketolase + beta + hydro (OEX) + hydro (RNAi)
Ketolasen- epsilon + beta + (xxx)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (OEX) + hydro (RNAi) Ketolase + epsilon + beta + hydro (OEX)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (RNAi)
Ketolase + epsilon + hydro (RNAi) + (xxx)
Ketolase + epsilon + hydro (OEX) + (xxx)
Ketolase + beta + hydro (RNAi) + (xxx) Ketolase + beta + hydro (OEX) + (xxx)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (OEX) + hydro (RNAi)
Ketolase + epsilon + beta + hydro (OEX) + (xxx) Ketolase + epsilon + beta + hydro (RNAi) + (xxx) ,
wobei die Abkürzungen folgende Bedeutung haben:
Ketolase: Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase beta: Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase hxdro (OEX) : Expression von Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase hydro (RNAi) : doppelsträngige endogene ß-Hydroxylase Ribo- nukleinsauresequenz und/oder endogene ß-Hydroxylase antisense-Ribonukleinsäuresequenzen epsilon: doppelsträngige ε-Cyclase- Ribonukleinsäuresequenz und/oder ε-Cyclase antisense-Ribonukleinsäure- sequenz (xxx) : mindestens eine Nukleinsäure ausgewählt aus Gruppe
Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3- Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase , Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-
D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase , Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl- Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin- Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO
Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.
Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere promotoren, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.
Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anord- nung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, das jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. 5
Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen selbst beschrieben.
10
Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER) ,
15 im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und
Translationsverstärker wie die 5 ' -Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al . , Nucl . Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711) .
20 Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann .
"Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine 25 Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten.
Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promo- 30 tor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al . (1980) Cell 21:285-294; Odell et al . (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al . (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al . (1986) Plant Mol Biol 35 6:221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al . (1989) EMBO J 8:2195-2202).
Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der pds Promoter (Pecker et al . (1992) Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:
40 4962-4966) oder der "Rubisco small subunit (SSU) "-Promotor
(US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc. -Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR- Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al . (1995) Plant
45 Mol Biol 29:637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamyl- alkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolin- reichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) , der Pnit-Promoter (Y07648.L, Hillebrand et al . (1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrand et al . (1996), Gene, 170, 197-200, der Ferredoxin- NADPH-Oxidoreductase Promotor (Datenbankeintrag AB011474, Position 70127 bis 69493), der TPT-Promoter (WO 03006660), der „Superpromotor" (US-Patent 5955646) , der 34S-Promotor (US-Patent 6051753) sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al . (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Ex- pression des Ketolase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al . (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclo- hexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRPl-Gens (Ward et al . (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kältemduzierbare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814) , der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promoter (EP375091) .
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, b-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes , et al . (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al . (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al . (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:2427-2430; Somssich et al . (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al . (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:2507-2511; Warner, et al . (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinll Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wunl und wun2-Gens (US 5,428,148), des winl- und win2-Gens (Stanford et al . (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin (McGurl et al . (1992) Science 225:1570-1573), des WIPl-Gens (Rohmeier et al . (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Ekelkamp et al . (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al . (1994) The Plant J 6(2) :141-150) und dergleichen.
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung- spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung- spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625) . Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt .
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Ketocarotinoiden bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Bevorzugt sind beispielsweise Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Petalen, Sepalen, Blüten, Blätter, Stengel und Wurzeln und Kombinationen hieraus.
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33) oder der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphat- carboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren sind beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) , der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593), der EPSPS-Promotor (Datenbankeintrag M37029 ) , der DFR-A Promotor (Datenbankeintrag X79723), der B-Gen Promotor (WO 0008920) und der CHRC-Promotor (WO 98/24300; Vishnevetsky et al. (1996) Plant J. 10, 1111-1118) sowie die Promotoren der Arabidopsis Gen-Loci At5g33370 (infolge Ml Promoter), At5g22430 (infolge M2 Promoter) und Atlg26630 (infolge M3 Promoter) . Antheren-spezifische Promotoren sind beispielsweise der 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-1 Promotor oder der g-Zein Promotor .
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind beschrieben in Rogers et al. (1987) Methods in Enzymol 153:253-277; Schardl et al . (1987) Gene 61:1-11 und Berger et al . (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:8402-8406).
Alle in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Promotoren ermöglichen in der Regel die Expression der Ketolase in Blütenblättern der erfindungsgemäßen Pflanzen.
Besonders bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren sind konstitu- tive, blütenspezifische und insbesondere blütenblattspezifische Promotoren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen blütenspezifischen oder insbesondere einen blütenblattspezifischen Promotor und eine Nukleinsäure kodierend eine Ketolase.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer vorstehend be- schriebenen Nukleinsäure kodierend eine Ketolase und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein plastidenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. En- quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Die vorzugsweise insertierte Nukleinsäuren kodierend ein plasti- däres Transitpeptid, gewährleisten die Lokalisation in Piastiden und insbesondere in Chromoplasten.
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein Ketolase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chromoplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Trans- lokation der Ketolase in die Chromoplasten vom Ketolase-Teil enzymatisch abgespalten werden.
Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plasti- dären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubi- sco (rbcS) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastern als Kpnl/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der Ncol Schnittstelle:
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA TCC_BamHI
pTPlO
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG GATCC_BamHI
pTPll
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGG ATCC_BamHI
Weitere Beispiele für ein plastidäres Transitpeptid sind das Transitpeptid der plastidären Isopentenyl-pyrophosphat Isome- rase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana und das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase (rbcS) aus Erbse (Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts . Nucl. Acids Res. 16: 11380). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleo- tid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions- stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsauresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Beispiele für einen Terminator sind der 35S-Terminator (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16: 11380), der nos Terminator (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. Nopa- line synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1982; 1 (6) : 561-73 ) oder der ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL- DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3: 835-846) .
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vi ro-Mutagenese, "primer- repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing- back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.
Dazu können an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.
Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Pro- toplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro- injektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) oder besonders bevorzugt pSUN2, pSUN3 , pSUN4 oder pSUN5 (WO 02/00900) .
Mit einem Expressionsplasmid transformierte Agrobakterien können in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen verwendet wer- den, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, 5 im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette, die eine Ketolase exprimiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9 oder insbesondere pSUN2 kloniert, der geeignet ist, in Λgrro-acterium tumefaciens transformiert zu werden Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobak-
10 terien können dann in bekannter Weise zur Transformation von
Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
15
Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press,
20 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase enthalten.
25
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Ketolase kodierenden Nukleinsäure wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Se-
30 quenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.
35 Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und
Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli , ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. PJIT117 (Guerineau et al . (1988) Nucl. Acids Res.16 :11380),
40 pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYCl84. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression konstitutiv 45 oder vorzugsweise spezifisch in den Blütenblättern erfolgen. Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, das man ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen blütenspezifischen Promotor und Nukleinsäu- ren kodierend eine Ketolase in das Genom der Ausgangspflanze einführt .
Die Erfindung betrifft ferner die genetisch veränderten Pflanzen, wobei die genetische Veränderung die Aktivität einer Ketolase in Blütenblättern,
A für den Fall, das die Wildtyppflanze bereits eine Ketolase- Aktivität in Blütenblättern aufweist, gegenüber dem Wildtyp erhöht und
B für den Fall, das die Wildtyppflanze keine Ketolase-Aktivität in Blütenblättern aufweist, gegenüber dem Wildtyp verursacht.
Wie vorstehend ausgeführt erfolgt die Erhöhung oder Verursachung der Ketolase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp vorzugsweise durch eine Erhöhung oder Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt, wie vorste- hend ausgeführt, die Erhöhung oder Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase in die Pflanzen und damit vorzugsweise durch Überexpression oder transgene Expression von Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase .
Bevorzugte transgene Pflanzen, die als Wildtyp keine Ketolaseak- tivität in den Blütenblättern aufweisen, enthalten, wie vorstehend erwähnt, mindestens ein transgene Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase.
Besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen weisen, wie vorstehend erwähnt, zusätzlich eine erhöhte Hydroxlase-Aktivität und/oder ß-Cyclase-Aktivität gegenüber einer Wildtyppflanze auf. Weiter bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben.
Weiter bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen weisen, wie vorstehend erwähnt, zusätzlich eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität gegenüber einer Wildtyppflanze auf. Weiter bevorzugte Ausfüh- rungsformen sind vorstehend im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. Weiter besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen weisen, wie vorstehend erwähnt, zusätzlich gegenüber dem Wildtyp mindestens eine weitere erhöhte Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität , (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , l-Deoxy-D-Xylose-5-Phos- phat-Synthase-Aktivität, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoiso- merase-Aktivität , Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivität , Geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat- Synthase-Aktivität , Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivi- tat, Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desaturase-Aktivität,
Zeta-Carotin-Desaturase-Aktivität , crtlSO-Aktivität , FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität auf. Weiter bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben.
Weiter besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen weisen, wie vorstehend erwähnt, zusätzlich gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase Aktivität auf. Weiter bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben.
Unter Pflanzen werden erfindungsgemäß vorzugsweise Pflanzen verstanden, die als Wildtyp in Blütenblättern Chromoplasten aufweisen. Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Blütenblättern zusätzlich Carotinoide, insbesondere ß-Carotin, Zea- xanthin, Violaxanthin oder Lutein auf. Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Blütenblättern zusätzlich eine ß-Cyclase-Aktivität auf. Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Blütenblättern zusätzlich eine Hydroxylase-Aktivität auf .
Besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen ausgewählt aus den Familien Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassicaceae, Cucurbita- ceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, liliaceae oder Lamiaceae.
Die Erfindung betrifft daher insbesondere genetisch veränderte Pflanzen ausgewählt aus den Familien Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Astera- ceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, Illiaceaae, oder Lamiaceae enthaltend mindestens eine transgene Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase.
Ganz besonders bevorzugte genetisch veränderte Pflanzen sind aus- gewählt aus den Pflanzengattungen Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Adonis, Lycopersicon, Rosa, Calenduia, Physalis, Medicago, Helianthus, Chrysanthemum, Aster, Tulipa, Narcissus, Petunia, Geranium oder Tropaeolum, wobei die genetisch veränderte Pflanze mindestens eine transgene Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, enthält.
Wie vorstehend erwähnt wird in bevorzugten transgenen Pflanzen die Ketolase in Blütenblättern exprimiert, besonderes bevorzugt ist die Expression der Ketolase in Blütenblättern am höchsten.
Die transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile, insbesondere deren Blütenblätter sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die genetisch veränderten Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung von Ketocarotinoiden, insbesondere Astaxanthin verwendet werden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Ketocarotinoiden können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Ferner können die genetisch veränderten Pflanzen zur Herstellung von Ketocaroti- noid-haltigen Extrakten der Pflanzen und/oder zur Herstellung von Futter- und Nahrungsergänzungsmitteln verwendet werden.
Die genetisch veränderten Pflanzen können auch als Zierpflanzen im Horticulture-Bereich verwendet werden.
Die genetisch veränderten Pflanzen weisen im Vergleich zum Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden auf .
Unter einem erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Ketocarotinoid verstanden.
Unter einem erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden wird aber auch insbesondere ein veränderter Gehalt der bevorzugten Ketocarotinoide verstanden, ohne dass zwangsläufig der Gesamt- Carotinoidgehalt erhöht sein muss . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Astaxanthin auf.
5 Unter einem erhöhten Gehalt wird in diesem Fall auch ein verursachter Gehalt an Ketocarotinoiden, bzw. Astaxanthin verstanden.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt: 10
Allgemeine Experimentelle Bedingungen: Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem 15 Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467).
Beispiel 1: 20 Amplifikation einer cDNA, die die gesamte Primärsequenz der Ketolase aus Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille kodiert
Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis kodiert, wurde mittels PCR aus Haematococcus pluvialis (Stamm 25 192.80 der "Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen" ) Suspensionskultur amplifiziert .
Für die Präparation von Total-RNA aus einer Suspensionskultur von Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80), die 2 Wochen mit indirek-
30 tem Tageslicht bei Raumtemperatur in iϊaematococcus-_Medium
(1.2 g/l Natriumacetat, 2 g/l Hefeextrakt, 0.2 g/l MgC12x6H20, 0.02 CaC12x2H20; pH 6.8; nach Autoklavieren Zugabe von 400 mg/l L-Asparagin, 10 mg/l FeS04xH20) gewachsen war, wurden die Zellen geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pul-
35 verisiert. Anschließend wurden 100 mg der gefrorenen, pulverisierten Algenzellen in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0.8 ml Trizol-Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Suspension wurde mit 0.2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12 000 g wurde der wässrige Überstand abgenommen
40 und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert. Die RNA wurde mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75% Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyro- carbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst.
45 Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese wurden 2.5 ug Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PRl SEQ ID NO: 29) in cDNA umgeschrieben.
Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR2 SEQ ID NO: 30) und eines antisense spezifischen Primers (PRl SEQ ID NO : 29) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 4 μl einer Haematococcus pluvialis cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 mM PRl (SEQ ID NO: 29)
- 0.2 mM PR2 (SEQ ID NO: 30)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 25.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
53°C 2 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30 resultierte in einem 1155 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (SEQ ID NO: 22). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR- Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert und der Klon PGKET02 erhalten.
Sequenzierung des Klons pGKET02 mit dem T7- und dem SP6-Primer bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in den drei Codons 73, 114 und 119 in je einer Base von der publizierten Sequenz X86782 unterscheidet. Diese Nukleotidaustausche wurden in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsen- tieren somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Haematococcus pluvialis Stamm 192.80 (Abbildung 3 und 4, Sequenzvergleiche).
Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvek- tor pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1027 Bp SpHI-Fragmentes aus pGEM-Teasy und Ligierung in den SpHI geschnittenen Vektor pJITH7. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heißt PJKET02.
Beispiel 2:
Amplifikation einer cDNA, die die Ketolase aus Haematococcus plu- vialis Flotow em. Wille mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-terminus kodiert
Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus ko- diert, wurde mittels PCR aus Haematococcus pluvialis Suspensionskultur (Stamm 192.80 der "Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen") amplifiziert.
Die Präparation von Total-RNA aus einer Suspensionskultur von Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die cDNA-Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N- Terminus wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR3 SEQ ID NO: 31) und eines antisense spezifischen Primers (PRl SEQ ID NO: 29) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein mit um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus kodiert, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 4 μl einer Haematococcus pluvialis cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0.25 mM dNTPs
0.2 mM PRl (SEQ ID NO: 29) 0.2 mM PR3 (SEQ ID NO: 31) 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA) 25.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
53°C 2 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 31 resultierte in einem 1111 Bp Fragment, das für ein Ketolase Protein kodiert, bei dem N-terminalen Aminosäuren (Position 2-16) durch eine einzige Aminosäure (Leucin) ersetzt sind.
Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Sequenzie- rungen mit mit den Primern T7- und SP6 bestätigten eine zur Sequenz SEQ ID NO: 22 identische Sequenz, wobei die 5 'Region (Position 1-53) der SEQ ID NO: 22 im Amplifikat SEQ ID NO: 24 durch eine in der Sequenz abweichende Nonamersequenz ersetzt wurde. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvek- tor pJIT117 (Guerineau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet .
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 985 Bp SpHI Fragmentes aus pGEM-Teasy und Ligierung mit dem SpHI geschnittenen Vek- tor pJIT117. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heisst pJKET03.
Beispiel 3:
Amplifikation einer cDNA, die die Ketolase aus Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille (Stamm 192.80 der "Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen") bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert .
Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pGKET02 (in Beispiel 1 beschrieben) und des Primers PR15 (SEQ ID NO: 32) hergestellt. Der Primer PR15 setzt sich zusammen aus einer antisense spezifischen 3λ Region (Nucleotide 40 bis 59) und einer myc-Tag kodierenden 5 'Region (Nucleotide 1 bis 39) .
Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abküh- lung bei Raumtemperatur auf 40°C) von pGKET02 und PR15 erfolgte in einem 11.5 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μg pGKET02 PlasmidDNA
- 0.1 μg PR15 (SEQ ID NO: 32)
Das Auffüllen der 3 'Enden (30 min bei 30°C) erfolgte in einem 20 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 11.5 μl pGKET02/PRl5-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben)
- 50 μM dNTPs
- 2 μl IX Klenow Puffer
- 2U Klenow Enzym
Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR2 SEQ ID NO: 30) und eines antisense spezifischen Primers (PR15 SEQ ID NO: 32) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein mit fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl einer Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs - 0.2 mM PR15 (SEQ ID NO: 32)
- 0.2 mM PR2 (SEQ ID NO: 30)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
53°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 30 resultierte in einem 1032 Bp-Fragment, das für ein Protein kodiert, bestehend aus der gesamten Primärsequenz der Ketolase aus Haematococcus pluvialis als zweifache translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptide am N-Terminus und dem myc-Tag am C-Terminus .
Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Sequenzierungen mit mit den Primern T7- und SP6 bestätigten eine zur Se- quenz SEQ ID NO: 22 identische Sequenz, wobei die 3'Region (Position 993 bis 1155) der SEQ ID NO: 22 im Amplifikat SEQ ID NO: 26 durch eine in der abweichende Sequenz aus 39 Bp ersetzt wurde. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJITH7 (Guerineau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet .
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1038 Bp EcoRI-SpHI Fragmentes aus pGEM-Teasy und Ligierung mit dem EcoRI-SpHI geschnittenen Vektor pJITH7. Durch die Ligation entsteht eine translationale Fusion zwischen dem C-Terminus der rbcS Transit- peptidsequenz und dem N-Terminus der Ketolase Sequenz. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase mit fusioniertem C-terminalem myc-Tag in der korrekten Orientierung als translationale N-terminale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heisst pJKET04.
Beispiel 4:
Herstellung von Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum und in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle des konstitutiven Promoters d35S aus CaMV (Franck et al . 1980, Cell 21: 285-294). Die Expression erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715).
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET02 wurde das 2.8 Kb Sacl-Xhol Fragment aus pJKET02 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 5A, Konstrukt- karte) . In der Abbildung 5A beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter (747 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET03 wurde das
2.7 Kb bp Sacl-Xhol Fragment aus pJKET03 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 6, Konstruktkarte) . In der Abbildung 6 beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter (747 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transit- peptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET03 (985 bp) die um 14 N- terminale Aminosäuren verkürzte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET04 wurde das
2.8 Kb Sacl-Xhol Fragment aus pJKET04 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 7, Konstruktkarte) . In der Abbildung 7 beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter ( (747 bp) , Fragment rbcS das rbcS Tranεit- peptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET04 (1038 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase mit C-terminalem myc-Tag, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
- Zur Herstellung des Tagetes-Expressionsvektors pS5KET02 wurde das 2.8 Kb Sacl-Xhol Fragment aus pJKET02 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 5B, Konstruktkarte) . In der Abbildung 5B beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter (747 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transit- peptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 5A:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in . esculentum und Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle einer modifizierten Version AP3P des blütenspezifischen Promoters AP3 aus Arabidopsis thaliana (AL132971: Nukleotidregion 9298 bis 10200; Hill et al . (1998) Development 125: 1711-1721).
Das DNA Fragment, das die AP3 Promoterregion -902 bis +15 aus Arabidopsis thaliana beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Arabidopsis thaliana isoliert) sowie der Primer PR7 (SEQ ID NO: 33) und PR10 (SEQ ID NO: 36) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das AP3-Promoterfragment (-902 bis +15) beinhaltet, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 100 ng genomischer DNA aus A . thaliana
- 0.25 mM dNTPs - 0.2 mM PR7 (SEQ ID NO: 33)
- 0.2 mM PR10 (SEQ ID NO: 36)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.25 μl Pfu Polymerase (Stratagene)
- 28.8 μlAq. Dest. Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten
Das 922 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pTAP3 erhalten.
Sequenzierung des Klons pTAP3 bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in durch eine Insertion (ein G in Position 9765 der Sequenz AL132971) und einen Basenaustausch (ein G statt ein A in Position 9726 der Sequenz AL132971) von der publizierten AP3 Sequenz (AL132971, Nukleotidregion 9298 bis 10200) unterscheidet. Diese Nukleotidunterschiede wurden in einem unabhängigen Ampli- fikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die tatsächliche Nukleotidsequenz in den verwendeten Arabidopsis thaliana Pflanzen. Die modifizierte Version AP3P wurde mittels rekombinanter PCR unter Verwendung des Plasmids pTAP3 hergestellt. Die Region 10200 bis 9771 wurde mit den Primern PR7 (SEQ ID NO: 33) und Primern PR9 (SEQ ID NO: 35) amplifiziert (Amplifikat A7/9), die Region 9526 bis 9285 wurde mit den PR8 (SEQ ID NO: 34) und PR10 (SEQ ID NO: 36) amplifiziert (Amplifikat A8/10) .
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation der DNA-Fragmente, die die Regionen Region 10200-9771 und Region 9526 bis 9285 des AP3 Promoters beinhalten, erfolgte in 50 αl Reaktionsansätzen, in denen enthalten war:
- 100 ng AP3 Amplifikat (oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 mM sense Primer (PR7 SEQ ID NO: 33 bzw. PR8 SEQ ID NO: 34)
- 0.2 mM antisense Primer (PR9 SEQ ID NO: 35 bzw. PR10 SEQ ID NO: 36) - 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.25 μl Pfu Taq Polymerase (Stratagene)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minute
72°C 1 Minute IX 72°C 10 Minute]
Die rekombinante PCR beinhaltet Annealing der sich über eine Sequenz von 25 Nukleotiden überlappenden Amplifikate A7/9 und A8/10, Vervollständigung zu einem Doppelstrang und anschließende Amplifizierung. Dadurch entsteht eine modifizierte Version des AP3 Promoters, AP3P, in dem die Positionen 9670 bis 9526 deletiert sind. Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abkühlung bei Raumtemperatur auf 40°C) beider Amplifikate A7/9 und A8/10 erfolgte in einem 17.6 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 0.5 μg A7/9 Amplifikat
- 0.25 μg A8/10 Amplifikat Das Auffüllen der 3 'Enden (30 min bei 30°C) erfolgte in einem 20 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 17.6 μgA7/9 und A8/10-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben)
- 50 μM dNTPs
- 2 μl IX Klenow Puffer
- 2U Klenow Enzym
Die Nukleinsäure kodierend für die modifizierte Promoterversion AP3P wurde mittels PCR unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR7 SEQ ID NO: 33) und eines antisense spezifischen Primers (PR10 SEQ ID NO: 36) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des AP3P Fragmentes erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 mM PR7 (SEQ ID NO: 33)
- 0.2 mM PR10 (SEQ ID NO: 36)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0.25 μl Pfu Taq Polymerase (Stratagene)
- 28.8 μlAq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 33 und SEQ ID NO: 36 resultierte in einem 778 Bp Fragment das für die modifizierte Promoterversion AP3P kodiert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern T7 und Ml3 bestätigten eine zur Sequenz AL132971, Region 10200 bis 9298 identische Sequenz, wobei die interne Region 9285 bis 9526 deletiert wurde. Diese Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJITll7 (Guerineau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 771 Bp Sacl-HindiII Fragmentes aus pTAP3P und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJITH7. Der Klon, der den Promoter AP3P anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJAP3P.
Zur Herstellung einer Expressionskassette pJAP3PKET02 wurde das 1027 Bp SpHI-Fragment KET02 (in Beispiel 1 beschrieben) in den SpHI geschnittenen Vektor pJAP3P kloniert. Der Klon, der das Fragment KET02 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fu- sion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJAP3PKET02.
Zur Herstellung einer Expressionskassetten pJAP3PKET04 wurde das 1032 Bp SpHI-EcoRI Fragment KET04 (in Beispiel 3 beschrieben) in den SpHI-EcoRI geschnittenen Vektor pJAP3P kloniert. Der Klon, der das Fragment KET04 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst PJAP3PKET04.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3AP3PKET02 wurde das 2.8 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJAP3PKET02 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 8A, Konstruktkarte) . In der Abbildung 8A beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3AP3PKET04 wurde das 2.8 KB Sacl-Xhol Fragment aus pJAP3PKET04 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 9, Konstruktkarte) . In der Abbildung 9 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET04 (1038 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase mit C-terminalem myc-Tag, Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten Ketolase aus Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) . 5
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5AP3PKET02 wurde das 2.8 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJAP3PKET02 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 8B, Konstruktkarte) . In der Abbildung 8B beinhaltet Fragment AP3P den
10 modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp) , Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV
15
Beispiel 5B:
Amplifikation einer Chimären cDNA, die die Ketolase aus Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille mit einer heterologen 5' nicht translatierten Region (5'UTR) beinhaltet, und Herstellung eines
20 Expressionsvektors zur blütenspezifischen Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase ohne Verwendung eines heterologen Transitpeptides in Lycopersicon esculentum.
Die cDNA, die die Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 25 192.80) folgend auf eine heterologe "5 'nicht-translatierten Region" (5'UTR) enthält, wurde mittels PCR hergestellt.
Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) mit einer "5 'nicht-translatierten Region" 30 (5'UTR) wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus dem
Plasmid pGKET02 unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR142 SEQ ID NO: 78) und eines antisense spezifischen Primers (PRl SEQ ID NO: 29) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
35
Die PCR zur Amplifikation des Fragmentes, das sowohl für ein Ketolase Protein kodiert als auch eine heterologe 5 'UTR Region enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
40
- 10 ng des Plasmids pGKET02 (in Beispiel 1 beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 mM PRl (SEQ ID NO: 29)
- 0.2 mM PR142 (SEQ ID NO: 78) 45 - 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 25.8 μl Aq. Dest. Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
53°C 2 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit PRl und PR142 resultierte in einem 1.1 KB Fragment, das eine heterologe 5'UTR Region, gefolgt von der kodierenden Region für ein Ketolase, enthält (SEQ ID NO: 79)
Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierun- gen des resultierenden Klones pTA-KET05 mit den Primern T7 und Ml3 bestätigten eine Sequenz (SEQ ID NO: 79), die [abgesehen vom 5 'Terminus, der identisch zu pJITH7 ist (Guerineau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380)], identisch zur Sequenz SEQ ID NO: 22 ist. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJAP3PKET02 (Beispiel 5A) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 0.3 KB Hindlll Fragmentes aus pTA-KET05 und Ligierung in den Hindlll-geschnittenen Vektor pJAP3PKET02. Der Klon, der den AP3P Promoter, gefolgt vom 5'UTR aus pJIT117 und der kompletten kodierenden Sequenz für die Haematococcus pluvialis Ketolase enthält, heisst pJAP3PKET05.
Die Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum erfolgte unter Kontrolle des Promoters AP3P (siehe Beispiel 5A ) und des 5'UTRs aus pJITH7. Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium-vermittelte Transformation der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO 02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3AP3PKET05 wurde das 2.8 Kb Sacl-Xhol Fragment aus pJAP3PKET05 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 21, Konstruktkarte) . In der Abbildung 21 beinhaltet Fragment AP3P den AP3P-Promoter (747 bp) , Fragment 5 ' UTR die 5'UTR Sequenz aus pJITH7 (30 bp) , Fragment KET05 (1.0 kb) die gesamte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. Beispiel 6 :
Herstellung und Analyse transgener Lycopersicon esculentum
Pflanzen
Transformation und Regeneration von Tomatenpflanzen erfolgte nach der publizierten Methode von Ling und Mitarbeitern (Plant Cell Reports (1998), 17:843-847). Für die Varietät Microtom wurde mit höherer Kanamycin-Konzentration (lOOmg/L) selektioniert.
Als Ausgangsexplantat für die Transformation dienten Kotyledonen und Hypokotyle sieben bis zehn Tage alter Keimlinge der Linie Microtom. Für die Keimung wurde das Kulturmedium nach Murashige und Skoog (1962: Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473-) mit 2 % Saccharose, pH 6.1 verwendet. Die Keimung fand bei 21°C bei wenig Licht (20 bis 100 μE) statt. Nach sieben bis zehn Tagen wurden die Kotyledonen quer geteilt und die Hypokotyle in ca. 5 bis 10 mm lange Abschnitte geschnitten und auf das Medium MSBN (MS, pH 6,1, 3% Saccharose + 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA) gelegt,' das am Vortag mit suspensionskultivierten Tomatenzellen beschickt wurde. Die Tomatenzellen wurden luftblasenfrei mit sterilem Filterpapier abgedeckt. Die Vorkultur der Explantate auf dem beschriebenen Medium erfolgte für drei bis fünf Tage. Zellen des Stammes Agrobakterium tumefaciens LBA4404 wurden einzeln mit den Plasmiden pS3KET02, pS3KET03, pS3AP3PKET05 bzw. pS3AP3KET02 transformiert. Von den einzelnen mit den Binärvektoren pS3KET02, pS3KET03 bzw. pS3KET02 transformierten Agrobakterium-Stämmen wurde jeweils eine Übernachtkultur in YEB Medium mit Kanamycin (20 mg/l) bei 28 Gard Celsius kultiviert und die Zellen zentrifugiert.Das Bakterienpellet wurde mit flüssigem MS Medium (3 % Saccharose, pH 6,1) resuspendiert und auf eine optische Dichte von 0,3 (bei 600 nm) eingestellt. Die vorkultivierten Explantate wurden in die Suspension überführt und für 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Explantate mit sterilem Filterpapier getrocknet und für die dreitägige Co-Kultur (21°C) auf ihr Vorkulturmedium zurück gelegt .
Nach der Co-kultur wurden die Explantate auf MSZ2 Medium (MS pH 6,1 + 3 % Saccharose, 2 mg/l Zeatin, 100 mg/l Kanamycin, 160 mg/l Timentin) transferiert und für die selektive Regeneration bei 21°C unter Schwachlicht Bedingungen (20 bis 100 μE, Lichtrhythmus 16 h/8 h) aufbewahrt. Aller zwei bis drei Wochen erfolgte der Transfer der Explantate bis sich Sprosse bilden. Kleine Sprosse konnten vom Explantat abgetrennt werden und auf MS (pH 6,1 + 3 % Saccharose) 160 mg/l Timentin, 30 mg/l Kanamycin, 0,1 mg/l IAA bewurzelt werden. Bewurzelte Pflanzen wurden ins Gewächshaus überführt .
Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten:
Mit pS3KET02 wurde erhalten: csl3-8, csl3-24, csl3-30, csl3-40.
Mit pS3KET03 wurde erhalten: csl4-2, csl4-3, csl4-9, csl4-19
Mit pS3AP3PKET02 wurde erhalten: csl6-15, cslδ-34, csl6-35, csl6-40.
Tabelle la zeigt das Erscheinungsbild der Blütenblätter der erfindungsgemäß genetisch veränderten Tomatenpflanzen. Die
Analyse der Ketocarotinoide erfolgte wie nachstehend beschrieben.
Tabelle la
Die Quantifizierung der Carotinoide erfolgte durch Extraktion der Pigmente in Aceton, enzymatische Hydrolyse der Carotinoidester und Auftrennung der freigesetzten Carotinoide mittels HPLC. Experimentelle Details sowie Laufbedingungen der HPLC-Trennungen sind in Beispiel 9 detailliert beschrieben. Tabelle 1b zeigt das Carotinoidprofil in Petalen der gemäß der vorstehend beschriebenen Beispiele hergestellten transgenen Tomatenpflanzen einschließlich Kontrollen. Carotinoidkonzen- trationen sind Mittelwerte verschiedener Linien und prozentual bezogen auf den Gehalt an Gesamtcarotinoiden. Tabelle lb
Tomato Viola- Anthera- Lutein Zea- Crypto- Beta Asta- Adoni- Adon 3'-Hydroxy- xan- xanthin xan- xanthin zeta- xan- xanthin irubin echinenone thin thin carotene thin
10 control 70,6 14 13,2 1 0,2 0,95
CS16 0,5 1 3,2 0,3 15,3 61 4,1 15,2 plant
Cs l3 9,7 0,4 0,05 9 68 1,3 12,3 0,2 plant
15
Beispiel 7 :
Herstellung transgener Tagetes Pflanzen
20 Tagetessamen werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS- Medium; Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473-497) pH 5,8, 2 % Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Temperatur/Licht/Zeitintervall von 18 bis 28°C/20-200 μE/3 bis 16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21°C, 20 bis 70 μE, für 4 bis
25 8 Wochen .
Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10 bis 60 mm2 3 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt .
Ein beliebiger Agrobakterium tumefaciens Stamm, bevorzugt aber ein supervirulenter Stamm, wie z.B. EHA105 mit einem entsprechen-
35 den Binärplasmid, das ein Selektionsmarkergen (bevorzugt bar oder pat) sowie ein oder mehrere Trait- oder Reportergene tragen kann wird (beispielsweise pS5KET02 und pS5AP3PKET02 ) , über Nacht angezogen und für die Co-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet. Die Anzucht des Bakterienstammes kann wie folgt erfol-
40 gen: Eine Einzelkolonie des entsprechenden Stammes wird in YEB
(0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rindfleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H0) mit 25 mg/l Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 h angezogen. Anschließend wird die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 6000 g für
45 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, dass eine OD6oo von ca. 0,1 bis 0,8 entstand. Diese Suspension wird für die C-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet.
Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbewahrt worden sind, durch die Bakteriensuspension ersetzt. Die Inkubation der Blättchen in der Agrobakteriensuspen- sion erfolgte für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z.B. 0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise 3 mg/l Benzylamino- purin (BAP) sowie 1 mg/l Indolylessigsäure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, dabei können folgende Bedingungen angewen- det werden: Lichtintensität: 30 bis 80 μMol/m2 x sec, Temperatur: 22 bis 24°C, hell/dunkel Wechsel von 16/8 Stunden. Anschließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstumsregulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zusätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrük- kung des Bakterienwachstums enthält. Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/l ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt. Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/l selektiert sehr effizient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfahrens sind denkbar.
Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium bis sich Sprossknospen und kleine Sprosse entwickeln, die dann auf das gleiche Basalmedium einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsregulatoren, nämlich z.B. 0,5 mg/l Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/l Gibberillinsäure GA3 , zur Bewurzelung übertragen werden. Bewurzelte Sprosse können ins Gewächshaus über- führt werden.
Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteilhafte Modifikationen möglich:
• Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12 Tage, bevorzugt 3 bis 4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vorinkubiert werden. Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben. • Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5,8) kann auf pH 5,2 gesenkt werden. Dadurch wird die Kontrolle des Agro- bakterienwachstums verbessert.
• Die Zugabe von AgN03 (3 bia 10 mg/l) zum Regenerationsmedium verbessert den Zustand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.
• Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem Fachmann bekannt sind, wie z.B. Zitronensäure, Ascorbinsäure, PVP u.v.a.m., wirken sich positiv auf die Kultur aus.
• Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium Verwendung finden. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen Trägern, die auf dem flüssigen Medium positioniert werden inkubiert werden.
Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten:
Mit pS5KET02 wurde beispielsweise erhalten: csl8-l und csl8-2, mit pS5AP3PKET02 wurde beispielsweise erhalten: csl9-l, csl9-2 und csl9-3.
Beispiel 8
Charakterisierung der transgenen Pflanzenblüten
Beispiel 8.1
Trennung von Carotinoidestern in Blütenblättern transgener Pflan- zen
Allgemeine Arbeitsvorschrift:
Die Blütenblätter der transgenen Pflanzen werden in flüssigem Stickstoff gemörsert und das Petalenpulver (etwa 40 mg) mit 100 % Aceton extrahiert (dreimal je 500 μl) . Das Lösungsmittel wird evaporiert und die Carotinoide in 100 bis 200 μl Petrolether/Aceton (5:1, v/v) resuspendiert.
Die Carotinoide werden in konzentrierter Form mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Silica60 F254- Platten (Merck) in einem organischen Laufmittel (Petrolether/Aceton; 5:1) entsprechend ihrer Phobizität aufgetrennt. Gelbe (Xanthophyllester) , rote (Ketocarotinoidester) und orange Banden (Mischung aus Xan- thophyll- und Ketocarotinoidestern) auf der TLC werden ausgekratzt . Die an Silica gebundenen Carotinoide werden dreimal mit 500 μl Aceton eluiert, das Lösungsmittel evaporiert und die Carotinoide mittels HPLC aufgetrennt und identifiziert.
Mittels einer C30-reverse phase-Säule kann zwischen Mono- und Diestern der Carotinoide unterschieden werden. HPLC-Laufbedingun- gen waren nahezu identisch mit einer publizierten Methode (Frazer et al.(2000), Plant Journal 24(4): 551-558). Eine Identifizierung der Carotinoide ist aufgrund der UV-VIS-Spektren möglich.
Petalenmaterial der transgenen Tomatenpflanzen CS13-8, csl3-24, csl3-30, csl3-40, csl4-2, csl4-3, csl4-9, csl4-19 wurden gemörsert und mit Aceton extrahiert. Extrahierte Carotinoide wurden mittels TLC aufgetrennt. In beiden Linien konnten Mono- und Diester von Ketocarotinoiden detektiert werden; die Monoester waren in deutlich geringerer Konzentration als die Diester vorhanden.
HPLC-Analysen ergaben, das Diester der Xanthophylle (gelbe Bande) und der Ketocarotinoide (rote Bande) vorlagen; die Diester der Ketocarotinoide lagen in etwa lOmal höherer Konzentration vor als die Monoester (Abbildung 10) .
Petalenmaterial der transgenen Tomatenpflanzen csl6-15, csl6-34, csl6-35, csl6-40, die den AP3-Promotor tragen, wurden gemörsert und mit Aceton extrahiert. Extrahierte Carotinoide wurden mittels TLC aufgetrennt . Monoester von Ketocarotinoiden konnten nicht oder nur in äußert geringer Konzentration nachgewiesen werden. Diester der Ketocarotinoide waren in gleicher Menge wie in Linien CS13 und CS14 vorhanden. Diester der Xanthophylle waren mengenmäßig wenig verändert im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Abbildung 9A zeigt ein Dünnschicht-Chromatogramm. Die Carotinoide aus Tomatenpetalen wurden mit Aceton extrahiert und mittels Dünn- schicht-Chromatographie aufgetrennt. Im Vergleich zu Kontroll-Extrakten konnten zusätzliche Carotinoidbanden f(l) , (2) und (3)] in Petalen transgener Tomatenpflanzen detektiert werden.
Abbildung 10 zeigt ein HPLC-Diagramm. Die zusätzlichen Carotino- idbanden in Petalen transgener Tomatenfrüchte (siehe (1-3) in Abbildung 9A) wurden extrahiert, mit Aceton eluiert und mittels HPLC analysiert. (1) wurde als Monoester, (2) und (3) wurden als Diester identifiziert. Beispiel 9
Enzymatische Hydrolyse von Carotinoidestern und Identifizierung der Carotinoide
Allgemeine Arbeitsvorschrift
Gemörsertes Petalenmaterial (50 bis 100 mg Frischgewicht) wird mit 100 % Aceton (dreimal 500 μl; jeweils etwa 15 Minuten schütteln) extrahiert. Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in 400 μl Aceton aufgenommen (Absorption bei 475 nm zwischen 0,75 und 1,25) und 5 min im Ultraschall-Bad behandelt. Der Carotinoid-Extrakt wird mit 300 μl 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,0) gemischt und 5 bis 10 Minuten bei 37C inkubiert. Danach erfolgt die Zugabe von 100 bis 200 μl Cholesterol-Esterase (Stammlösung: 6,8 units/ml einer Cholesterol-Esterase von Pseudo- monas spec . ) . Nach 8 bis 12 Stunden wird nochmals 100 bis 200 μl Enzym zugegeben; Hydrolyse der Ester erfolgt innerhalb von 24 Stunden bei Inkubation bei 37C. Nach Zugabe 0.35 g Na2S04xl0H20 und 500 μl Petrolether wird gut gemischt und zentrifugiert (3 Minuten; 4500 g) . Petrolether-Phase wird abgezogen und nochmals mit 0,35 g Na2S04xlOH20 (anhydrous) gemischt. Zentrifugation für 1 Minute bei 10000 g. Petrolether wird evaporiert und freie Carotinoide werden in 100 bis 120 μl Aceton aufgenommen. Mittels HPLC und C30-reverse phase-Säule können freie Carotinoide auf- grund von Retentionszeit und UV-VIS-Spektren identifiziert werden.
Isolierte Ketocarotinoidester (Mono- und Diester) der Linien CS13 , CS14 und CS16 wurden mit Cholesterol-Esterase hydrolysiert und die freigesetzten Carotinoide mittels HPLC aufgetrennt. Identifizierung der Carotinoide erfolgte aufgrund von Retentionszeit und Spektrum im Vergleich zu Carotinoid-Standards . Mono- und Diester enthalten Astaxanthin in hoher Konzentration (90%) und Adonixanthin in geringer Konzentration (10%). (siehe Tabelle und Abbildungen)
Abbildung 11 zeigt ein HPLC-Diagramm. Die eluierten Ester aus Beispiel 9 (Abbildung 10) wurden enzymatisch hydrolysiert und die Hydrolyseprodukte mittels HPLC analysiert. Sowohl Mono- als auch Diester enthalten Astaxanthin als Hauptcarotinoid sowie Adonixanthin in geringer Konzentration. Beispiel 10 :
Herstellung eines Klonierungsvektors zur Herstellung von Inver- ted-Repeat-Expressionskassetten für die blütenspezifischen Expression von Epsilon-cyclase dsRNAs in Tagetes erecta 5
Die Expression von Inverted-Repeat Transkripten bestehend aus Fragmenten der Epsilon-Cyclase in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle einer modifizierten Version AP3P des blütenspezifischen Promoters AP3 aus Arabidopsis thaliana (AL132971: Nukleotidregion 10 9298 bis 10200; Hill et al . (1998) Development 125: 1711 bis 1721) .
Das Inverted-Repeat Transkript enthält jeweils ein Fragment in korrekter Orientierung (Sense-Fragment) und ein sequenzidenti- 15 sches Fragment in entgegengesetzter Orientierung (Antisense-Fragment) , die durch ein funktionelles Intron, das PIV2 Intron des ST-LH1 Genes aus Kartoffel (Vancanneyt G. et al. (1990) Mol Gen Genet 220: 245-50) mit einander verbunden sind.
20 Die cDNA, die für den AP3 Promoter (-902 bis +15) aus Arabidopsis thaliana kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethode aus Arabidopsis thaliana isoliert) und der Primer PR7 (SEQ ID NO: 49) und PR10 (SEQ ID NO: 52) hergestellt.
25
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das AP3-Promoterfragment (-902 bis +15) kodiert, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, 30 in dem enthalten war:
1 μl genomischer DNA aus A. thaliana (1:100 verd hergestellt wie oben beschrieben) 0.25 mM dNTPs 35 - 0.2 mM PR7 (SEQ ID NO: 49) 0.2 mM PR10 (SEQ ID NO: 52) 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene) 0.25 μl Pfu Polymerase (Stratagene) 28.8 μl Aq. Dest.
40
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
45 50°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten Das 922 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pTAP3 erhalten. Sequenzierung des Klons pTAP3 bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in durch eine Insertion (ein G in Position 9765 der Sequenz AL132971) und einen Basenaustausch (ein G statt ein A in Position 9726 der Sequenz AL132971) von der publizierten AP3 Sequenz (AL132971, Nukleotidregion 9298 bis 10200) unterscheidet (Position 33: T statt G, Position 55: T statt G) . Diese Nukleotidunterschiede wurden in einem unabhän- gigen Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die Nukleotidsequenz in der verwendeten Arabidopsis thaliana Pflanze.
Die modifizierte Version AP3P wurde mittels rekombinanter PCR unter Verwendung des Plasmids pTAP3 hergestellt. Die Region 10200 bis 9771 wurde mit den Primern PR7 (SEQ ID NO: 49) und Primern PR9 (SEQ ID NO: 51) amplifiziert (Amplifikat Kl /9 ) , die Region 9526 bis 9285 wurde mit den PR8 (SEQ ID NO: 50) und PR10 (SEQ ID NO: 52) amplifiziert (Amplifikat A8/10) .
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation der DNA-Fragmente , die für die Regionen Region 10200 bis 9771 und 9526 bis 9285 des AP3 Promoters kodieren, erfolgte in 50 μl Reaktionsansätzen, in denen enthalten war:
- 100 ng AP3 Amplifikat (oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs - 0.2 mM PR7 (SEQ ID NO: 49) bzw. PR8 (SEQ ID NO: 50)
- 0.2 mM PR9 (SEQ ID NO: 51) bzw. PR10 (SEQ ID NO: 52)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.25 μl Pfu Taq Polymerase (Stratagene)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 2 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die rekombinante PCR beinhaltet Annealing der sich über eine Sequenz von 25 Nukleotiden überlappenden Amplifikate A7/9 und A8/10, Vervollständigung zu einem Doppelstrang und anschließende Amplifizierung. Dadurch entsteht eine modifizierte Version des AP3 Promoters, AP3P, in dem die Positionen 9670 bis 9526 deletiert sind. Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abkühlung bei Raumtemperatur auf 40°C) beider Amplifi- kate A7/9 und A8/10 erfolgte in einem 17,6 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 0.5 μg A7/9
- 0.25 μg A8/10
Das Auffüllen der 3 'Enden (30 min bei 30°C) erfolgte in einem 20 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 17.6 μl A7/9 und A8/10-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) - 50 μM dNTPs
- 2 μl IX Klenow Puffer
- 2U Klenow Enzym
Die Nukleinsäure kodierend für die modifizierte Promoterversion AP3P wurde mittels PCR unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR7 SEQ ID NO: 49) und eines antisense spezifischen Primers (PR10 SEQ ID NO: 52) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des AP3P Fragmentes erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) - 0.25 mM dNTPs
- 0.2 mM PR7 (SEQ ID NO: 49)
- 0.2 mM PR10 (SEQ ID NO: 52)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.25 μl Pfu Taq Polymerase (Stratagene) - 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit PR7 , SEQ ID NO: 49 und PR10 SEQ ID NO: 52 resultierte in einem 778 Bp Fragment das für die modifizierte Promoterversion AP3P kodiert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequen- zierungen mit den Primern T7 und Ml3 bestätigten eine zur Sequenz AL132971, Region 10200 bis 9298 identische Sequenz, wobei die interne Region 9285 bis 9526 deletiert wurde. Diese Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJITH7 (Gueri- neau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 771 Bp Sacl-Hindlll Fragmentes aus pTAP3P und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon, der den Promoter AP3P anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJAP3P.
Ein DNA-Fragment, das das PIV2 Intron des Gens ST-LSI enthält wurde mittels PCR unter Verwendung von Plasmid-DNA p35SGUS INT (Vancanneyt G. et al.(1990) Mol Gen Genet 220: 245-50)sowie der Primer PR40 (Seq ID NO: 54) und Primer PR41 (Seq ID NO: 55) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der Sequenz des Intron PIV2 des Gens ST-LSI, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war :
- 1 μl p35SGUS INT - 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR40 (SEQ ID NO: 54)
- 0.2 μM PR41 (SEQ ID NO: 55)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA) - 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute
53°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit PR40 und PR41 resultierte in einem
206 Bp-Fragment. Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pBluntll (Invitrogen) kloniert und der Klon pBluntII-40-41 erhalten. Sequenzierungen dieses Klons mit dem Primer SP6 bestätigte eine Sequenz, die identisch ist mit der entsprechenden Sequenz aus dem Vektor p35SGUS INT. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Vektor pJAP3P (oben beschrieben) .
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 206 Bp Sall-BamHI 5 Fragmentes aus pBluntII-40-41 und Ligierung mit dem Sall-BamHI geschnittenen Vektor pJAP3P. Der Klon, der das Intron PIV2 des Gens ST-LSI in der korrekten Orientierung anschließend an das 3 'Ende des rbcs Transitpeptides enthält, heisst pJAIl und ist geeignet, Expressionskassetten für die blütenspezifische Expression 10 von Inverted-Repeat Transkripten herzustellen.
In der Abbildung 12 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment rbcs das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp) , Fragment intron das Intron PIV2 des Kartoffel- 15 Gens ST-LSl, und Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 11
Herstellung von Inverted-Repeat-Expressionskassetten für die 20 blütenspezifische Expression von Epsilon-cyclase dsRNAs in
Tagetes erecta (gerichtet gegen die 5 'Region der Epsilon-Cyclase cDNA)
Die Nukleinsäure, die die 5 ' terminale 435bp Region der Epsilon- 25 Cyclase cDNA (Genbank accession NO: AF251016) enthält, wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Tagetes erecta cDNA unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR42 SEQ ID NO: 56) und eines antisense spezifischen Primers (PR43 SEQ ID NO: 57) amplifiziert. Die 5 'terminale 435 bp Region der 30 Epsilon-Cyclase cDNA aus Tagetes erecta setzt sich zusammen aus 138 bp 5 'Nicht-translatierter Sequenz (5'UTR) und 297 bp der dem N-Terminus entsprechenden kodierenden Region.
Für die Präparation von Total-RNA aus Blüten von Tagetes wurden 35 100mg der gefrorenen, pulverisierten Blüten in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Trizol-Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Suspension wurde mit 0,2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12000 g wurde der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt 40 und mit einem Volumen Ethanol extrahiert. Die RNA wurde mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyrocarbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst. Die RNA-Konzentration wurde photome- 45 trisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese wurden 2.5 ug Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PRl7 SEQ ID NO: 53) in cDNA umgeschrieben.
Die Bedingungen der anschließenden PCR-Reaktionen waren die fol- genden :
Die PCR zur Amplifikation des PR42-PR43 DNA-Fragmentes, das die 5 'terminale 435bp Region der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR42 (SEQ ID NO: 56)
- 0.2 μM PR43 (SEQ ID NO: 57) - 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR zur Amplifikation des PR44-PR45 DNA-Fragmentes, das die 5 'terminale 435 bp Region der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs - 0.2 μM PR44 (SEQ ID NO: 58)
- 0.2 μM PR45 (SEQ ID NO: 59)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR-Reaktionen wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute
58°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit Primer PR42 und PR43 resultierte in einem 443 Bp-Fragment, die PCR-Amplifikation mit Primer PR44 und PR45 resultierte in einem 444 Bp-Fragment.
Die beiden A plifikate, das PR42-PR43 (Hindlll-Sall sense) Frag- ment und das PR44-PR45 (EcoRI-BamHI antisense) Fragment, wurden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit dem Primer SP6 bestätigten jeweils eine zur publizierten Sequenz AF251016 (SEQ ID NO: 38) identische Sequenz abgesehen von den eingeführten Restriktionsstellen. Diese Klone wurde daher für die Herstellung eines Inverted-Repeat Konstrukts in dem Klonierungs- vektor pJAIl (siehe Beispiel 10) verwendet.
Der erste Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 444 Bp PR44-PR45 BamHI-EcoRI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR- Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit dem BamHI-EcoRI geschnit- tenen Vektor pJAIl. Der Klon, der 5 'terminale Region der Epsilon- Cyclase in der antisense Orientierung enthält, heisst pJAI2. Durch die Ligation entsteht eine transkriptionelle Fusion zwischen dem antisense Fragment der 5'terminalen Region der Epsilon- Cyclase und dem Polyadenylierungssignal aus CaMV.
Der zweite Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 443 Bp PR42-PR43 Hindlll-Sall Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit dem Hindlll-Sall geschnittenen Vektor pJAl2. Der Klon, der 435 bp 5 'terminale Re- gion der Epsilon-Cyclase cDNA in der sense Orientierung enthält, heisst pJAl3. Durch die Ligation entsteht eine transkriptioneile Fusion zwischen dem AP3P und dem sense Fragment der 5'terminalen Region der Epsilon-Cyclase.
Für die Herstellung einer Inverted-Repeat Expressionskassette unter Kontrolle des CHRC-Promoters wurde ein CHRC-Promoterfrag- ment unter Verwendung genomischer DNA aus Petunie (nach Standardmethoden hergestellt) sowie der Primer PRCHRC5 (SEQ ID NO: 76) und PRCHRC3 (SEQ ID NO: 77) amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen des resultierenden Klons pCR2.1-CHRC mit den Primern M13 und T7 bestätigten eine zur Sequenz AF099501 identische Sequenz. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor PJAI3 verwendet .
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1537 bp Sacl-Hindlll Fragments aus pCR2.1-CHRC und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJAI3. Der Klon, der den Promoter CHRC anstelle des ursprünglichen Promoters AP3P enthält heisst pJCI3.
Die Herstellung der Expressionsvektoren für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P- bzw. CHRC-kontrollierten Inverted-Repeat Transkripts in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) . Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5Al3 wurde das 2622 bp Sacl-Xhol Fragment aus pJAl3 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 13, Konstruktkarte).
In der Abbildung 13 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment 5sense die 5 'Region der Epsilon- Cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in Sense-Orientierung, Fragment intron das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5anti die 5 'Region der Epsilon- cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in antisense Orientierung, und Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5Cl3 wurde das 3394 bp Sacl-Xhol Fragment aus pJCl3 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vek- tor pSUN5 ligiert (Abbildung 14, Konstruktkarte) .
In der Abbildung 14 beinhaltet Fragment CHRC den Promoter (1537 bp) , Fragment 5sense die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in Sense-Orientierung, Fragment intron das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5anti die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in Antisense-Orien- tierung, und Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 12
Herstellung einer Inverted-Repeat-Expressionskassette für die blütenspezifische Expression von Epsilon-cyclase dsRNAs in Tagetes erecta (gerichtet gegen die 3 'Region der Epsilon-Cyclase cDNA)
Die Nukleinsäure, die die 3 'terminale Region (384 bp) der Epsilon-Cyclase cDNA (Genbank accession NO: AF251016) enthält wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Tagetes erecta cDNA unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR46 SEQ ID NO: 60) und eines antisense spezifischen Primers (PR47
SEQ ID NO: 61) amplifiziert. Die 3 'terminale Region (384 bp) der Epsilon-Cyclase cDNA aus Tagetes erecta setzt sich zusammen aus 140 bp 3 '-Nicht-translatierter Sequenz (3'UTR) und 244 bp der dem C-Terminus entsprechenden kodierenden Region.
Die Präparation von Total-RNA aus Blüten von Tagetes erfolgte wie unter Beispiel 11 beschrieben.
Die cDNA Synthese erfolgte wie unter Beispiel 11 unter Verwendung des antisense spezifischen Primers PR17 (SEQ ID NO: 53) beschrieben. Die Bedingungen der anschließenden PCR-Reaktionen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des PR46-PR457 DNA-Fragmentes, das die 3 'terminale 384 bp Region der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs - 0.2 μM PR46 (SEQ ID NO: 60)
- 0.2 μM PR47 (SEQ ID NO: 61)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR zur Amplifikation des PR48-PR49 DNA-Fragmentes, das die 5 'terminale 384 bp Region der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR48 (SEQ ID NO: 62)
- 0.2 μM PR49 (SEQ ID NO: 63)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR-Reaktionen wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
58°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 60 und SEQ ID NO: 61 resultierte in einem 392 Bp-Fragment, die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO: 62 und SEQ ID NO: 63 resultierte in einem 396 Bp- Fragment.
Die beiden Amplifikate, das PR46-PR47 Fragment und das PR48-PR49 Fragment, wurden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequen- zierungen mit dem Primer SP6 bestätigten jeweils eine zur publizierten Sequenz AF251016 (SEQ ID NO: 38) identische Sequenz abgesehen von den eingeführten Restriktionsstellen. Diese Klone wurde daher für die Herstellung eines Inverted-Repeat Konstrukts in dem Klonierungsvektor pJAIl (siehe Beispiel 10) verwendet.
Der erste Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 396 Bp PR48-PR49 BamHI-EcoRI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR- Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit dem BamHI-EcoRI geschnittenen Vektor pJAIl. Der Klon, der 3 'terminale Region der Epsilon- Cyclase in der antisense Orientierung enthält, heisst pJAl4. Durch die Ligation entsteht eine transkriptionelle Fusion zwi- sehen dem Antisense-Fragment der 3 'terminale Region der Epsilon- Cyclase und dem Polyadenylierungssignal aus CaMV.
Der zweite Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 392 Bp PR46-PR47 Hindlll-Sall Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit dem Hindlll-Sall geschnittenen Vektor pJAl4. Der Klon, der 392 bp 3 'terminale Region der Epsilon-Cyclase cDNA in der sense Orientierung enthält, heisst pJAI5. Durch die Ligation entsteht eine transkriptioneile Fusion zwischen dem AP3P und dem Sense-Fragment 3 'terminale Re- gion der Epsilon-Cyclase.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation des AP3P-kontrollierten Inverted-Repeat Transkripts in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) . Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5AI5 wurde das 2523 bp Sacl-Xhol Fragment aus pJAI5 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 15, Konstruktkarte).
In der Abbildung 15 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment 3sense die 3'region der Epsilon cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in sense Orientierung, Fragment intron das Intron IV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 3anti die 3'region der Epsilon cyclase aus Tagetes erecta (435 bp) in antisense Orientierung, und Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 13
Klonierung des Epsilon-Cyclase Promoters
Ein 199 bp Fragment bzw. das 312 bp Fragment des Epsilon-Cyclase Promoters wurde durch zwei unabhängige Klonierungsstrategien, In- verse PCR (adaptiert Long et al . Proc. Natl. Acad. Sei USA 90: 10370) und TAIL-PCR (Liu Y-G. et al . (1995) Plant J. 8: 457-463) unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethode aus Tagetes erecta , Linie Orangenprinz, isoliert) isoliert. Für den Inverse PCR-Ansatz wurden 2 ug genomische DNA in einem 25 ul Reaktionsansatz mit EcoRV und Rsal verdaut, anschließend auf 300 μl verdünnt und über Nacht bei 16°C mit 3U Ligase reli- giert. Unter Verwendung der Primer PR50 (SEQ ID NO: 64) und PR51 (SEQ ID NO: 65) wurde durch PCR Amplifikation ein Fragment hergestellt, das, jeweils in Sense-Orientierung, 354 bp der Epsilon- Cyclase cDNA (Genbank Accession AF251016) , ligiert an 300 bp des Epsilon-Cyclase Promoters sowie 70 bp des 5'terminalen Bereichs der cDNA Epsilon-Cyclase enthält (siehe Abbildung 16) .
Die Bedingungen der PCR-Reaktionen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des PR50-PR51 DNA-Fragmentes, das unter anderem das 312 bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl Ligationsansatz (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR50 (SEQ ID NO: 64) - 0.2 μM PR51 (SEQ ID NO: 65)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 μl Aq. Dest.
Die PCR-Reaktionen wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute 53°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit Primer PR50 und PR51 resultierte in einem 734 Bp-Fragment, das unter anderem das 312 bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase enthält (Abbildung 16) .
Das Amplifikat, wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern Ml3 und T7 ergaben die Sequenz SEQ ID NO: 45. Diese Sequenz wurde in einem unabhängigen Ampli- fikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz in der verwendeten Tagetes erecta Linie Orangenprinz . Für den TAIL-PCR Ansatz wurden drei sukzessive PCR-Reaktionen mit jeweils unterschiedlichen gen-spezifischen Primern (nested primers) durchgeführt.
Die TAILl-PCR erfolgte in einem 20 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war :
1 ng genomische DNA (hergestellt wie oben beschrieben) 0.2 mM jedes dNTPs
0.2 μM PR60 (SEQ ID NO: 66) 0.2 μM AD1 (SEQ ID NO: 69)
2 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.5 U R Taq Polymerase (TAKARA) mit Aq. Dest. auf 20 μl aufgefüllt
- ADl stellte dabei zunächst eine Mischung aus Primern der Sequenzen (a/c/g/t) tcga(g/c) t (a/t) t (g/c) g(a/t) gtt dar.
Die PCR-Reaktion TAILl wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 93°C 1 Minute, 95°C: 1 Minute
5X 94°C 30 Sekunden, 62°C: 1 Minute, 72°C: 2.5 Minuten
IX 94°C 30 Sekunden, 25°C: 3 Minuten, ramp to 72°C in 3 Minuten,
72°C 2.5 Minuten
15X 94°C 10 Sekunden, 68°C 1 Minute, 72°C: 2.5 Minuten;
94°C 10 Sekunden, 68°C 1 Minute, 72°C: 2.5 Minuten;
94°C 10 Sekunden, 29°C 1 Minute, 72°C: 2.5 Minuten
IX 72°C 5 Minuten
Die TAIL2-PCR erfolgte in einem 21 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl einer 1:50 Verdünnung des TAILl-Reaktionsansatzes (herges- teilt wie oben beschrieben)
- 0.8 mM dNTP
- 0.2 μM PR61 (SEQ ID NO: 67)
- 0.2 μM ADl (SEQ ID NO: 69)
- 2 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0.5 U R Taq Polymerase (TAKARA)
- mit Aq. Dest. auf 21 μl aufgefüllt Die PCR-Reaktion TAIL2 wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
12X 94°C: 10 Sekunden, 64°C 1 Minute, 72°C 2.5 Minuten; 94°C: 10 Sekunden, 64°C 1 Minute, 72°C 2.5 Minuten;
94°C: 10 Sekunden, 29°C 1 Minute, 72°C 2.5 Minuten
IX 72°C: 5 Minuten
Die TAIL3-PCR erfolgte in einem 100 μl Reaktionsansatz, in dem en- thalten war:
- 1 μl einer 1:10 Verdünnung des TAIL2-Reaktionsansatzes (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.8 mM dNTP
- 0.2 μM PR63 (SEQ ID NO: 68)
- 0.2 μM ADl (SEQ ID NO: 69)
- 10 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.5 U R Taq Polymerase (TAKARA) - mit Aq. Dest. auf 100 μl aufgefüllt
Die PCR-Reaktion TAIL3 wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
20X 94°C: 15 Sekunden, 29°C: 30 Sekunden, 72°C: 2 Minuten IX 72°C: 5 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit Primer PR63 und ADl resultierte in einem 280 Bp-Fragment, das unter anderem das 199 bp Promoter- fragment der Epsilon-Cyclase enthält (Abbildung 17).
Das Amplifikat, wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern M13 und T7 ergaben die Sequenz SEQ ID NO: 46. Diese Sequenz ist identisch mit der Sequenz SEQ ID NO: 45, die mit der IPCR Strategie isoliert wurde und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz in der verwendeten Tagetes erecta Linie Orangenprinz .
Der pCR2.1-Klon, der das 312 bp Fragment (SEQ ID NO: 45) des
Epsilon-Cyclase Promoters, das durch die IPCR-Strategie isoliert wurde, enthält, heisst pTA-ecycP und wurde für die Herstellung der IR Konstrukte verwendet . Beispiel 14
Herstellung einer Inverted-Repeat-Expressionskassette für die blütenspezifische Expression von Epsilon-cyclase dsRNAs in Tagetes erecta (gerichtet gegen die Promoterregion der Epsilon-Cy- clase cDNA) .
Die Expression von Inverted-Repeat Transkripten bestehend aus Promoterfragmenten der Epsilon-cyclase in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle einer modifizierten Version AP3P des blütenspezi- fischen Promoters AP3 aus Arabidopsis (siehe Beispiel 10) oder des blütenspezifischen Promoters CHRC (Genbank accession NO: AF099501) . Das Inverted-Repeat Transkript enthält jeweils ein Epsilon-Cyclase-Promoterfragment in korrekter Orientierung (Sense-Fragment) und ein sequenzidentisches Epsilon-Cyclase- Promoterfragment in entgegengesetzter Orientierung (Antisense- Fragment) , die durch ein funktionelles Intron (siehe Beispiel 10) mit einander verbunden sind.
Die Promoterfragmente wurde mittels PCR unter Verwendung von Plasmid-DNA (Klon pTA-ecycP, siehe Beispiel 13 ) und der Primer PR124 (SEQ ID NO: 70) und PR126 (SEQ ID NO: 72) bzw. der Primer PR125 (SEQ ID NO: 71) und PR127 (SEQ ID NO: 73) hergestellt.
Die Bedingungen der PCR-Reaktionen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des PR124-PR126 DNA-Fragmentes, das das Promoterfragment der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR124 (SEQ ID NO: 70)
- 0.2 μM PR126 (SEQ ID NO: 72)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA)
- 28.8 uμl Aq. Dest.
Die PCR zur Amplifikation des PR125-PR127 DNA-Fragmentes, das das 312bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase enthält, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 μl cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- 0.25 mM dNTPs
- 0.2 μM PR125 (SEQ ID NO: 71) - 0.2 μM PR127 (SEQ ID NO: 73)
- 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.25 μl R Taq Polymerase (TAKARA) - 28 . 8 μl Aq . Dest .
Die PCR-Reaktionen wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
53°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit Primer PR124 und PR126 resultierte in einem 358 Bp-Fragment, die PCR-Amplifikation mit Primer PR125 und PR127 resultierte in einem 361 Bp-Fragment.
Die beiden A plifikate, das PR124-PR126 (Hindlll-Sall sense) Fragment und das PR125-PR127 (EcoRI-BamHI antisense) Fragment, wurden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit dem Primer SP6 bestätigten jeweils eine Sequenz, die abgesehen von den eingeführten Restriktionsstellen identisch ist zu SEQ ID NO: 45. Diese Klone wurden daher für die Herstellung eines Inverted-Repeat Konstrukts in dem Klonierungsvektor pJAIl (siehe Beispiel 10) verwendet.
Der erste Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 358 Bp PR124-PR126 Hindlll-Sall Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit dem BamHI-EcoRI geschnittenen Vektor pJAIl. Der Klon, das Epsilon-Cyclase Pro oter- fragment in der sense Orientierung enthält, heisst cs43. Durch die Ligation wird das Sense-Fragment des Epsilon-Cyclase Promoters zwischen den AP3P Promoter und das Intron eingefügt.
Der zweite Klonierungsschritt erfolgte durch Isolierung des 36lBp PR125-PR127 BamHI-EcoRI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR- Bluntll (Invitrogen) und Ligierung mit BamHI-EcoRI geschnittenen Vektor cs43. Der Klon, der das Epsilon-Cyclase Promoterfragment in der antisense Orientierung enthält, heisst cs44. Durch die Ligation entsteht eine transkriptioneile Fusion zwischen dem Intron und dem Antisense-Fragment des Epsilon-Cyclase Promoters .
Für die Herstellung einer Inverted-Repeat Expressionskassette unter Kontrolle des CHRC-Promoters wurde ein CHRC-Promoterfrag- ment unter Verwendung genomischer DNA aus Petunie (nach Standard- methoden hergestellt) sowie der Primer PRCHRC3 ' (SEQ ID NO: 77) und PRCHRC5' (SEQ ID NO: 76) amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzie- rungen des resultierenden Klons pCR2.1-CHRC mit den Primern Ml3 und T7 bestätigten eine zur Sequenz AF099501 identische Sequenz. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvek- tor cs44 verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1537 bp Sacl-Hindlll Fragments aus pCR2.1-CHRC und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor cs44. Der Klon, der den Promoter CHRC anstelle des ursprünglichen Promoters AP3P enthält heisst cs45.
Für die Herstellung einer Inverted-Repeat Expressionskassette unter Kontrolle zweier Promotoren, des CHRC-Promoter und des AP3P-Promoters , wurde der AP3P-Promoter in antisense Orientierung an den 3 'Terminus des Epsilon-Cyclase antisense Fragmentes in cs45 kloniert. Das AP3P-Promoterfragments aus pJAIl wurde unter Verwendung der Primer PR128 und PR129 amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Die Sequenzierung mit den Primern Ml3 und T7 bestätigten eine zur Sequenz SEQ ID NO: 28 (AL132971) identische Sequenz. Dieser Klon pCR2.1-AP3PSX wurde für Herstellung einer Inverted-Repeat Expressionskassette unter Kontrolle zweier Promotoren verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 771 bp Sall-Xhol Fragments aus pCR2.1-AP3PSX und Ligierung in den Xhol geschnitte- nen Vektor cs45. Der Klon, der 3'seitig des Inverted Repeats, den Promoter AP3P in antisense Orientierung enthält heisst cs46.
Die Herstellung der Expressionsvektoren für die Agrobacterium- vermittelte Transformation des AP3P-kontrollierten Inverted-Re- peat Transkripts in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5AI7 wurde das 1685bp Sacl-Xhol Fragment aus cs44 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vek- tor pSUN5 ligiert (Abbildung 18, Konstruktkarte) . In der Abbildung 18 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp) , Fragment P-sense das 312 bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase in sense Orientierung, Fragment intron das Intron IV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI) , und Fragment P-anti das 312 bp Promoter- fragment der Epsilon- Cyclase in antisense Orientierung.
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5CI7 wurde das 2445bp Sacl-Xhol Fragment aus cs45 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 19, Konstruktkarte). In der Abbildung 19 beinhaltet Fragment CHRC den CHRC-Promoter (1537 bp) , Fragment P-sense das 312 bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase in sense Orientierung, Fragment intron das Intron IV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI), und Fragment P-anti das 312 bp Promoterfragment der Epsilon- Cyclase in antisense Orientierung.
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5CAI7 wurde das 3219bp Sacl-Xhol Fragment aus cs46 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 20, Konstruktkarte)
In der Abbildung 20 beinhaltet Fragment CHRC den CHRC-Promoter (1537 bp) , Fragment P-sense das 312 bp Promoterfragment der Epsilon-Cyclase in sense Orientierung, Fragment intron das Intron IV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI) , Fragment P~anti das 312 bp Promo- terfragment der Epsilon-Cyclase in antisense Orientierung und das Fragment AP3P das 771 bp AP3P-Promoterfragment in antisense Orientierung.
Beispiel 15 Herstellung transgener Tagetes Pflanzen mit reduzierter ε-Cyclase- Aktivität
Tagetessamen werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS- Medium; Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473-497) pH 5,8, 2 % Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Temperatur/Licht/Zeitintervall von 18 bis 28°C / 20 bis 200 μE /
3 bis 16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21°C, 20 bis 70 μE, für
4 bis 8 Wochen.
Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10 bis 60 mm2 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt .
Der Agrobakterium tumefaciens Stamm EHA105 wurde mit dem Binär- plasmid pS5AI3 transformiert. Die Anzucht des transformierten A. tumefaciens Stammes EHA105 erfolgte über Nacht unter folgenden Bedingungen: Eine Einzelkolonie wurde in YEB (0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rindfleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H 0) mit 25 mg/l Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 h angezogen. Anschließend wurde die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 6000 g für 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, das eine OD500 von ca. 0,1 bis 0,8 entstand. Diese Suspension wurde für die Co- Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet. Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbewahrt worden sind, durch die Bakteriensuspension ersetzt. Die Inkubation der Blättchen in der Agrobakteriensuspen- sion erfolgte für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtempe- ratur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z.B. 0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise 3 mg/l Benzylamino- purin (BAP) sowie 1 mg/l Indolylessigsäure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, dabei können folgende Bedingungen angewendet werden: Lichtintensität: 30 bis 80 μMol/m2 x sec, Temperatur: 22 bis 24°C, hell/dunkel Wechsel von 16/8 Stunden. Anschließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstumsregulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zusätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrük- kung des Bakterienwachstums enthält. Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/l ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt. Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/l selektiert sehr effizient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfahrens sind denkbar.
Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der
Explantate auf frisches Medium bis sich Sprossknospen und kleine Sprosse entwickeln, die dann auf das gleiche Basalmediu einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsregulatoren, nämlich z.B. 0,5 mg/l Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/l Gibberillinsäure GA , zur Bewurzelung übertragen werden. Bewurzelte Sprosse können ins Gewächshaus überführt werden.
Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteil- hafte Modifikationen möglich:
• Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12 Tage, bevorzugt 3 bis 4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vorinkubiert werden. Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben.
• Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5,8) kann auf pH 5,2 gesenkt werden. Dadurch wird die Kontrolle des Agro- bakterienwachstums verbessert. • Die Zugabe von AgN03 (3 - 10 mg/l) zum Regenerationsmedium verbessert den Zustand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.
5 • Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem
Fachmann bekannt sind, wie z.B. Zitronensäure, Ascorbinsäure, PVP u.v.a.m., wirken sich positiv auf die Kultur aus.
• Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium 10 Verwendung finden. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen
Trägern, die auf dem flüssigen Medium positioniert werden inkubiert werden.
Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden 15 mit dem Expressionskonstrukt pS5Al3 folgende Linien erhalten:
CS30-1, CS30-3 und CS30-4
_0 Beispiel 16:
Charakterisierung der transgenen Tagetes Pflanzen mit reduzierter ε-Cyclase-Aktivität
Das Blütenmaterial der transgenen Tagetes erecta Pflanzen aus „_ Beispiel 15 wurde in flüssigem Stickstoff gemörsert und das
Pulver (etwa 250 bis 500 mg) mit 100 % Aceton extrahiert (dreimal je 500 μl) . Das Lösungsmittel wurde evaporiert und die Carotinoide in 100 μl Aceton resuspendiert.
Mittels einer C30-reverse phase-Säule konnten die individuellen
30 Carotinoide quantifiziert werden. Die HPLC-Laufbedingungen waren nahezu identisch mit einer publizierten Methode (Frazer et al. (2000), Plant Journal 24(4): 551-558). Eine Identifizierung der Carotinoide war aufgrund der UV-VIS-Spektren möglich.
35
Tabelle 2 zeigt das Carotinoidprofil in Tagetespetalen der gemäß der vorstehend beschriebenen Beispiele hergestellten transgenen Tagetes- und Kontrolltagetespflanzen. Alle Carotinoidmengen sind in [ug/g] Frischgewicht angegeben, prozentuale Veränderungen
40 gegenüber der Kontrollpflanze sind in Klammern angegeben.
Im Vergleich zur genetisch nicht veränderten Kontrollpflanze, weisen die genetisch veränderten Pflanzen mit reduzierter epsilon-Cyclase-Aktivität einen deutlich erhöhten Gehalt an
45 Carotinoiden des "ß-Carotin-Weges" , wie beispielsweise ß-Carotin und Zeaxanthin und einen deutlich reduzierten Gehalt an Carotinoiden des " -Carotin-Weges" , wie beispielsweise Lutein auf .
Tabelle 2
Beispiel 17 :
Charakterisierung transgener Tagetespflanzen, die Astaxanthin in Blütenblättern akkumulieren
Das Blütenmaterial der transgenen Tagetes erecta Pflanzen (aus Beispiel 7 mit Plasmid pS5AP3PKET02 ) wird in flüssigem Stickstoff gemörsert und das Pulver (etwa 30-100 mg) mit 100% Aceton extrahiert (dreimal je 500 ul) . Das Lösungsmittel wird evaporiert, die Carotinoide in 30 μl Petrolether :Aceton (Verhältnis 5:1) resuspendiert und auf einer Silica-Dünnschichtplatte aufgetrennt. Tagetespflanzen mit zusätzlichen roten Carotinoidbanden, die in Kontrollpflanzen nicht auftreten, wurden für präparativ-analy- tische Analysen ausgewählt . Für analytische Details siehe Beispiel 9.
Mittels einer C30-Reverse phase-Säule konnten die individuellen Carotinoide quantifiziert werden. Für analytische Details siehe Beispiel 9.
Tabelle 3 zeigt das Carotinoidprofil in Tagetespetalen der gemäß der vorstehend beschriebenen Beispiele hergestellten transgenen Tagetes- und Kontrolltagetespflanzen. Carotinoidkonzentrationen sind prozentual auf den Gehalt an Gesamtcarotinoiden bezogen.
Im Vergleich zur genetisch nicht veränderten Kontrollpflanzen weisen die genetisch veränderten Pflanzen, die eine Ketolase exprimieren, einen Gehalt an Astaxanthin auf. Tabelle 3 : Prozentuale Carotinoidkonzentrationen in Astaxanthin synthetisierenden Tagetes und Kontrollpflanzen
Beta/ 3'- 3- τ , Ant- Ta£js hera- ZeaCrypto- zeta- Asta- Adoni- Hydroxy- Hydroxy-
Lutein xanthin xanthin caro- xanthin rubin echine- echine- " xanthin tene none none control 1,5 93,6 1,2 0,3 3,8 es 19-3 1,3 94,2 1,1 0,3 3,5 0,1 0,05 0,01 CHRC::
1,3-1,5 93,5-94,4 0,9-1,7 0,01-0,02 2-3,1 0,3-0,9 0,03-0,2 0,2 0-0,01 Ketolase DFR- A: keto4,5 91,8 1,1 2,4 0,2 0,02 0.07 lase
Beispiel 18 :
Charakterisierung transgener Tagetespflanzen, die eine verringerte Luteinkonzentration aufweisen und Astaxanthin in Blütenblättern akkumulieren
Tagetespflanzen, die durch Verwendung des AP3P-Promoters und der Ketolase aus Haematococcus in Blütenblättern Astaxanthin synthetisieren (siehe experimentelle Einzelheiten zu pS5AP3PKET02 in Beipiel 5A) und Tagetespflanzen, die durch Verwendung des RNAi- Konstruktes pS5AI3 (siehe Beispiel 11, Abbildung 13) mittels AP3P-Promoter geringere Mengen an Lutein akkumulieren, wurden gekreuzt. Samen wurden gekeimt und die Nachkommenschaft molekularbiologisch und biochemisch analysiert.
Die Anwesenheit der entsprechenden Expressionskassetten wird durch genomische PCR untersucht. Dazu wird junges Blattmaterial geerntet und zur Isolierung genomischer DNA verwendet.
Die Integritaet der DNA Praeparation wird durch Amplifikation eines endogenes Genabschnittes aus der Tagetes Ecyclase, welches in keinem der Expressionskassetten enthalten ist, mittels Forward- primer PR29 (PR29: 5 ' -cccattctcataggtcgtgc-3 ' ) und Reverseprimer PR78 (PR78: 5 ' -gcaagcctgcatggaattgtg-3 ' ) kontrolliert. Diese PCR- Reaktion resultiert bei intakter genomischer DNA in einem 0.6 kb- Fragment .
Die Ketolase-Expressionskassette laesst sich durch genomische PCR mittels Forwardprimer PR7 (PR7: 5 ' -gagctcactcactgatttc- cattgcttg-3 ' ) und Reverseprimer PR185 (PR185: 5 ' -cattaagetge- ctgtttctca-3 ') nachweisen. Diese PCR-Reaktion fuehrt bei Anwesen- heit, nicht bei Abwesenheit, der Ketolase-Expressionskassette zur Produktion eines 0,4 kb-Fragmentes . Die Ecyclase-Runterregulierungskassette laesst sich durch genomische PCR mittels Forwardprimer PR7 und Reverseprimer PR41 (PR41: 5' -ggatccggtgatacctgcacatcaac-3 ' ) nachweisen. Diese PCR- Reaktion fuehrt bei /Anwesenheit, nicht bei Abwesenheit, der 5 Ecyclase-Runterregulierungskassette zur Produktion eines 1,4 kb- Fragmentes .
Die Bedingungen der PCR-Reaktionen sind die folgenden:
10 Die PCR zur Amplifikation der beschriebenen Fragmente erfolgt jeweils in einem 50 ul? Reaktionsansatz, in dem enthalten ist:
1 ul? cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) 0.25 mM dNTPs 15 - 0.2 uM jeweiliger Forwardprimer - 0.2 uM jeweiliger Forwardprimer 5 ul? 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 ul? R Taq Polymerase (TAKARA) 28.8 ul? Aq. Dest.
20
Die PCR-Reaktionen werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt und anschliessend Agarosegelelektrophorese analysiert.
25 IX 94aC 2 Minuten
35X 942C 1 Minute
582C 1 Minuten
72aC 1 Minuten
IX 72aC 10 Minuten
30
Für das biochemische Screening wird das Blütenmaterial der Tagetes erecta Pflanzen in flüssigem Stickstoff gemörsert und das Pulver (etwa 30 bis 100 mg) mit 100% Aceton extrahiert (dreimal je 500 ul) . Das Lösungsmittel wird evaporiert, die Carotinoide in
35 30 μl Petrolether .-Aceton (Verhältnis 5:1) resuspendiert und auf einer Silica-Dünnschichtplatte aufgetrennt. Tagetespflanzen mit roten Carotinoidbanden, die auf Astaxanthinsynthese schließen lassen, und gleichzeitig weniger intensiven Banden für Luteine- ster (eine der mobilsten Banden in der Nähe der Laufmittelfront)
40 wurden für präparativ-analytische Analysen ausgewählt. Mittels Esterhydrolyse durch Lipasebehandlung und Auftrennung des Caroti- noidgemisches mittels HPLC konnten die individuellen Carotinoide quantifiziert werden. Für analytische Details siehe Beispiel 9.
45 Tabelle 4 zeigt das Carotinoidprofil in Tagetespetalen der gemäß der vorstehend beschriebenen Beispiele durch Kreuzung hergestellten transgenen Tagetespflanzen. Carotinoidkonzentrationen sind prozentual auf den Gehalt an Gesamtcarotinoiden bezogen.
Im Vergleich zur genetisch nicht veränderten Kontrollpflanzen weisen die genetisch veränderten Pflanzen mit reduzierter epsilon-Cyclase-Aktivität und gleichzeitiger Synthese von Astaxanthin i) einen deutlich erhöhten Gehalt an Carotinoiden des „ß-Carotin-Weges" , wie beispielsweise ß-Carotin und Zeaxanthin, ii) einen deutlich reduzierten Gehalt an Carotinoiden des „ -Carotin-Weges" , wie beispielsweise Lutein auf, und iii) Akkumulation von Astaxanthin.
Tabelle 4: Prozentuale Carotinoidkonzentrationen in transgenen Tagetes- und Kontrollpflanzen
Viola- ZeaBeta/ 3'- 3-
Tagetes Anthera- Crypto- Astaxan- Lutein xanzeta- Hydroxy- Hydroxy- plant xanthin xanthin xanthin thin thin carotene echinenone echinenone control 1,5 93,6 1,2 0,3 3,8
T109-26 0,6 2,1 65,9 10,4 0,1 19,9 0,3 0,7 0,08
T 105-8 3 67,3 8,2 0,1 20,7 0,05 0,4
T112-5 2,1 48,4 43,6 0.08 5,3 0,05 0,5
Beispiel 19 :
Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der
NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert
Die DNA, die für die NPl96-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der "American Type Culture Collection") amplifiziert .
Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nostoc punctiforme ATCC 29133 , die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 22-Medium (1,5 g/l NaN03, 0,04 g/l K2P04x3H20, 0,075 g/l MgS04xH20, 0,036 g/l CaClx2H0, 0,006 g/l citric acid, 0,006 g/l Ferric ammonium citrate, 0,001 g/l EDTA disodium magnesium, 0,04 g/l Na2C03 , 1 ml Trace Metal Mix "A5+Co" (2,86 g/l H3B03, 1,81 g/l MnCl2x4H2o, 0,222 g/l ZnSO4x7H20, 0,39 g/l NaMo04X2H2o, 0,079 g/l CuS04x5H20, 0,0494 g/l Co (N0 ) 2x6H0) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert. Protokoll für die DNA-Isolation aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 :
Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch lOminütige Zentrifugation bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml lOmM Tris_HCl (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2ml Volumen) überführt. Nach Zugabe von 100 μl Pro- teinase K (Konzentration: 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 μl Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2-ml- Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 0,6 Volumen Isopropanol gefällt und anschließend mit 70 % Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet, in 25 μl Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.
Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 , wurde mittels "polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NP196-1, SEQ ID No. 129) und eines antisense- spezifischen Primers (NP196-2 SEQ ID No . 130) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0.25 mM dNTPs
0.2 mM NP196-1 (SEQ ID No . 129)
0.2 mM NP196-2 (SEQ ID No . 130)
5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA)
0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25.8 ul Aq. Dest. Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 129 und SEQ ID No. 130 re- sultierte in einem 792 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NP196, SEQ ID No. 131) . Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNP196 erhalten.
Sequenzierung des Klons pNPl96 mit dem M13F- und dem M13R- Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 140.571-139.810 des Datenbank-eintrages NZ_AABC01000196 identisch ist (inverse orientiert zum veröffentlichen Datenbankeintrag) mit der Ausnahme, daß G in Position 140.571 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc punctiforme ATCC 29133.
Dieser Klon pNPl96 wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al . 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet.
pJITH7 wurde modifiziert, indem der 35S-Terminator durch den OCS-Terminator (Octopine Synthase) des Ti-Plasmides pTil5955 von Agrobacterium tumefaciens (Datenbankeintrag X00493 von Position 12,541-12,350, Gielen et al . (1984) EMBO J. 3 835-846) ersetzt wurde .
Das DNA-Fragment, das die OCS-Terminatorregion beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmides pHELLSGATE (Datenbankeintrag AJ311874, Wesley et al . (2001) Plant J. 27 581-590, nach Standardmethoden aus E. coli isoliert) sowie der Primer OCS-1 (SEQ ID No. 133) und OCS-2 (SEQ ID No. 134) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die die Octopin Synthase (OCS) Terminatorregion (SEQ ID No. 135) beinhaltet, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten waren: 100 ng pHELLSGATE plasmid DNA 0.25 mM dNTPs
0.2 mM OCS-1 (SEQ ID No. 133) 0.2 mM OCS-2 (SEQ ID No. 134) - 5 ul? 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0.25 ul? Pfu Polymerase (Stratagene) 28.8 ul? Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minute
72°C 1 Minute IX 72°C 10 Minuten
Das 210 bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pOCS erhalten.
Sequenzierung des Klons pOCS bestätigte eine Sequenz, die mit einem Sequenzabschnitt auf dem Ti-Plasmid pTil5955 von Agrobacterium tumefaciens (Datenbankeintrag X00493) von Position 12.541 bis 12.350 übereinstimmt.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 210 bp Sall-Xhol Fragmentes aus pOCS und Ligierung in den Sall-Xhol geschnittenen Vektor pJIT117.
Dieser Klon heisst pJO und wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONPl96 verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 782 Bp Sphl-Fragmentes aus pNPl96 und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJO. Der Klon, der die NPl96-Ketσlase von Nostoc punctiforme in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONPl96.
Beispiel 20: Herstellung von Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression der NPl96-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculentum und in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle des konstitutiven Promoters FNR (Ferredoxin-NADPH- Oxidoreductase, Datenbankeintrag AB011474 Position 70127 bis 69493; WO03/006660) , aus Arabidopsis thaliana . Das FNR-Gen beginnt bei Basenpaar 69492 und ist mit "Ferredoxin-NADP+ Reductase" annotiert. Die Expression erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709-715).
Das DNA Fragment, das die FNR Promotorregion aus Arabidopsis thaliana beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Arabidopsis thaliana isoliert) sowie der Primer FNR-1 (SEQ ID No . 136) und FNR-2 (SEQ ID No . 137) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das FNR-Promotorfragment FNR (SEQ ID No . 138) beinhaltet, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 100 ng genomischer DNA aus A . thaliana 0.25 mM dNTPs - 0.2 mM FNR-1 (SEQ ID No. 136) 0.2 mM FNR-2 (SEQ ID No. 137) 5 ul? 10X PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.25 ul? Pfu Polymerase (Stratagene) 28.8 ul? Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute
72°C 1 Minute
IX 72°C 10 Minuten
Das 652 bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pFNR erhalten.
Sequenzierung des Klons pFNR bestätigte eine Sequenz, die mit einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana (Datenbankeintrag AB011474) von Position 70127 bis 69493 übereinstimmt .
Dieser Klon heisst pFNR und wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONPl96 (in Beispiel 19 beschrieben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 644 bp Smal-Hindlll Fragmentes aus pFNR und Ligierung in den Ecll36II-HindIII geschnittenen Vektor pJONPl96. Der Klon, der den Promoter FNR anstelle des ursprünglichen Promoters d35S und das Fragment NP196 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOFNR:NP196.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium vermittelte Transformation der NPl96-Ketolase aus Nostoc in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP105 wurde das 1.839 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJOFNR:NPl96 mit dem EcoRI-Xhol geschnit- tenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 22, Konstruktkarte) . In der Abbildung 22 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FNR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP196 KETO CDS (761 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase , Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von der Octopin- Synthase.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium- vermittelte Transformation des Expressionsvektor mit der NPl96-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Tagetes-Expressionsvektors MSP106 wurde das 1.839 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJOFNR:NPl96 mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 23, Konstrukt- karte) . In der Abbildung 23 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FΝR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP196 KETO CDS (761 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme ΝPl96-Ketolase , Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin- Synthase.
Beispiel 21:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NPl96-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta
Die Expression der NPl96-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculentum und Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters EPSPS aus Petunia hybrida (Datenbankeintrag M37029: Nukleotidregion 7-1787; Benfey et al . (1990) Plant Cell 2: 849-856) .
Das DNA Fragment, das die EPSPS Promoterregion (SEQ ID No. 141) aus Petunia hybrida beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Petunia hybrida isoliert) sowie der Primer EPSPS-1 (SEQ ID No . 139) und EPSPS-2 (SEQ ID No . 140) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das EPSPS-Promoterfragment (Datenbankeintrag M37029: Nukleotidregion 7-1787) beinhaltet, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
100 ng genomischer DNA aus A. thaliana 0.25 mM dNTPs
0.2 mM EPSPS-1 (SEQ ID No. 139) 0.2 mM EPSPS-2 (SEQ ID No. 140) - 5 ul? 10X PCR-Puffer (Stratagene)
0.25 ul? Pfu Polymerase (Stratagene) 28.8 ul? Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
50°C 1 Minute
72°C 2 Minuten IX 72°C 10 Minuten
Das 1773 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pEPSPS erhalten.
Sequenzierung des Klons pEPSPS bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich durch zwei Deletion (Basen ctaagtttcagga in Position 46-58 der Sequenz M37029; Basen aaaaatat in Position 1422-1429 der Sequenz M37029) und die Basenaustausche (T statt G in Posi- tion 1447 der Sequenz M37029; A statt C in Position 1525 der Sequenz M37029; A statt G in Position 1627 der Sequenz M37029) von der publizierten EPSPS-Sequenz (Datenbankeintrag M37029: Nukleotidregion 7-1787) unterscheidet. Die zwei Deletionen and die zwei Basenaustausche an den Positionen 1447 und 1627 der Sequenz M37029 wurden in einem unabhängigen Amplifikations- experiment reproduziert und repräsentieren somit die tatsächliche Nukleotidsequenz in den verwendeten Petunia hybrida Pflanzen.
Der Klon pEPSPS wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJONP196 (in Beispiel 19 beschrieben) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1763 Bp Sacl-Hindlll Fragmentes aus pEPSPS und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJ0NPl96. Der Klon, der den Promoter EPSPS anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJOESP:NP196. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP196 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS- Transitpeptid .
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NPigδ-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP107 wurde das 2.961 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP:NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 24, Konstruktkarte) . In der Abbildung 24 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP196 KETO CDS (761 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.
Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NPl96-Keto- lase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP108 wurde das 2.961 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP:NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 25, Konstruktkarte). In der Abbildung 25 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP196 KETO CDS (761 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NPl96-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase. Beispiel 22:
Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der
NPl95-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert
5 Die DNA, die für die NPl95-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der "American Type Culture Collection") amplifiziert. Die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nostoc punctiforme ATCC 29133 wurde in Beispiel 10 19 beschrieben.
Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 , wurde mittels "polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezi- 15 fischen Primers (NP195-1, SEQ ID No . 142) und eines antisense- spezifischen Primers (NP195-2 SEQ ID No. 143) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
20 Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie 25 oben beschrieben)
0.25 M dNTPs
0.2 mM NP195-1 (SEQ ID No. 142)
0.2 mM NP195-2 (SEQ ID No. 143)
5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) 30 - 0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA)
25.8 ul Aq. Dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
35 IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
55°C 1 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
40
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No . 142 und SEQ ID No. 143 resultierte in einem 819 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NP195, SEQ ID No . 144). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den 45 PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNP195 erhalten. Sequenzierung des Klons pNPl95 mit dem M13F- und dem M13R- Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 55,604-56,392 des Datenbank-eintrages NZ_AABC010001965 identisch ist, mit der Ausnahme, daß T in Position 55.604 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese
Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc punctiforme ATCC 29133 .
Dieser Klon pNPl95 wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJO (in Beispiel 19 beschrieben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 809 Bp Sphl-Fragmentes aus pNPl95 und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJO. Der Klon, der die NPl95-Ketolase von Nostoc punctiforme in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONPl95.
Beispiel 23:
Herstellung von Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression der NPl95-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der NPl95-Ketolase aus Nostoc punctiforme in
L . esculentum und in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle des konstitutiven Promoters FNR (Ferredoxin-NADPH-Oxidoreductase,
Datenbankeintrag AB011474 Position 70127 bis 69493; WO03/006660) , aus Arabidopsis thaliana . Das FNR-Gen beginnt bei Basenpaar 69492 und ist mit "Ferredoxin-NADP-t- Reductase" annotiert. Die Expression erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709-715).
Der Klon pFNR (in Beispiel 20 beschrieben) wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONPl95 (in Beispiel 22 beschrieben) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 644 bp Sma- Hindlll Fragmentes aus pFNR und Ligierung in den Ecll36ll- Hindlll geschnittenen Vektor pJONPl95. Der Klon, der den Promoter FNR anstelle des ursprünglichen Promoters d35S und das Fragment NP195 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOFNR:NPl95.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium vermittelte Transformation der NPl95-Ketolase aus Nostoc puncti- forme in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) . Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP109 wurde das 1.866 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJOFNR:NPl95 mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 26, Konstruktkarte) . In der Abbildung 26 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FNR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP195 KETO CDS (789 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NPl95-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von der Octopin- Synthase.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium- vermittelte Transformation des Expressionsvektor mit der NP195- Ketolase aus Nostoc punctiforme punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO 02/00900) .
Zur Herstellung des Tagetes-Expressionsvektors MSP110 wurde das 1.866 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJOFNR:NPl95 mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 27, Konstruktkarte) . In der Abbildung 27 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FΝR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP195 KETO CDS (789 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NPl95-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin- Synthase .
Beispiel 24:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NPl95-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta.
Die Expression der NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculentum und Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters EPSPS aus Petunia hybrida (Datenbankeintrag M37029: Nukleotidregion 7-1787; Benfey et al . (1990) Plant Cell 2: 849-856) .
Der Klon pEPSPS (in Beispiel 21 beschrieben) wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONPl95 (in Beispiel 22 beschrieben) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1763 Bp Sacl- Hindlll Fragmentes aus pEPSPS und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJ0NPl95. Der Klon, der den Promoter EPSPS anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJOESP:NPl95. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP195 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS-Transitpeptid.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NPl95-Keto- lase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSPlll wurde das 2.988 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP:NPl95 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 28, Konstruktkarte) . In der Abbildung 28 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP195 KETO CDS (789 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NPl95-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.
Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NPl95-Keto- läse aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP112 wurde das 2.988 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP:NPl95 mit dem Sacl-Xhol ge- schnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 29, Konstruktkarte) . In der Abbildung 29 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NP195 KETO CDS (789 bp) , kodierend für die Nostoc punctiforme NPl95-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.
Beispiel 25:
Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NODK- Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 kodiert.
Die DNA, die für die Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 kodiert, wurde mittels PCR aus Nodularia spumignea NSOR10 amplifiziert .
Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nodularia spumignea NSOR10 , die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 21-Medium (1,5 g/l NaN03, 0,04 g/l K2P04x3H20, 0,075 g/l MgS04xH20, 0,036 g/l CaClx2H0, 0,006 g/l citric acid, 0,006 g/l Ferric ammonium ci- träte, 0,001 g/l EDTA disodium magnesium, 0,04 g/l Na2C03 , 1 ml Trace Metal Mix "A5+Co" (2,86 g/l H3B03, 1,81 g/l MnCl2x4Ho, 0,222 g/l ZnSO4x7H20, 0,39 g/l NaMo0X2H2o, 0.079 g/l CuS04x5H20, 0,0494 g/l Co (N03 ) x6H0) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.
Protokoll für die DNA-Isolation aus Nodularia spumignea NSORI O :
Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch lOminütige Zentrifugation bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10 mM Tris_HCl (pH 7,5) resuspendiert und in ein Eppendorf- Reaktionsgefäß (2 ml Volumen) überführt. Nach Zugabe von 100 μl Proteinase K (Konzentration: 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 μl Phenol extrahiert. Nach 5minütiger
Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 0,6 Volumen Iso- propanol gefällt und anschließend mit 70 % Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet, in 25 μl Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.
Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nodularia spumignea NSORIO, wurde mittels "polymerase chain reaction" (PCR) aus Nodularia spumignea NSORIO unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NODK-1, SEQ ID No . 146) und eines antisense-spezifischen Primers (NODK-2 SEQ ID No. 147) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
1 ul einer Nodularia spumignea NSORI O DNA (hergestellt wie oben beschrieben)
0.25 mM dNTPs
0.2 mM NODK-1 (SEQ ID No . 146) - 0.2 mM NODK-2 (SEQ ID No . 147)
5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA)
0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA)
25.8 ul Aq. Dest. Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten
72°C 3 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 146 und SEQ ID No. 147 re- sultierte in einem 720 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NODK, SEQ ID No. 148) . Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNODK erhalten.
Sequenzierung des Klons pNODK mit dem M13F- und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 2130-2819 des Datenbank-eintrages AY210783 identisch ist (inverse orientiert zum veröffentlichen Datenbankeintrag) . Diese Nukleotid- sequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nodularia spumignea NSORIO .
Dieser Klon pNODK wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJO (in Beispiel 19 beschrieben) verwendet. Die
Klonierung erfolgte durch Isolierung des 710 Bp Sphl-Fragmentes aus pNODK und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJO. Der Klon, der die NODK-Ketolase von Nodularia spumignea in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONODK.
Beispiel 26:
Herstellung von Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORIO in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORIO in L . esculentum und in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle des konstitutiven Promoters FNR (Ferredoxin-NADPH- Oxidoreductase, Datenbankeintrag AB011474 Position 70127 bis 69493; WO03/006660) , aus Arabidopsis thaliana . Das FNR-Gen beginnt bei Basenpaar 69492 und ist mit "Ferredoxin-NADP+ Reductase" annotiert. Die Expression erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715). Der Klon pFNR (in Beispiel 20 beschrieben) wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONODK (in Beispiel 25 beschrieben) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 644 bp Sma-Hindlll Fragmentes aus pFNR und Ligierung in den Ecll36II-HindIII geschnittenen Vektor pJONODK. Der Klon, der den Promoter FNR anstelle des ursprünglichen Promoters d35S und das Fragment NODK in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOFNR:NODK.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium vermittelte Transformation der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORI O in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP113 wurde das 1.767 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJ0FNR:N0DK mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 30, Konstruktkarte). In der Abbildung 30 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FΝR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NODK KETO CDS (690 bp) , kodierend für die Nodularia spumignea NSORIO ΝODK-Ketolase, Fragment OCS Termi nator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von der Octopin- Synthase.
Die Herstellung einer Expressionskassette für die Agrobacterium- vermittelte Transformation des Expressionsvektor mit der ΝODK- Ketolase aus Nodularia spumignea NSORI O punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUΝ5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Tagetes-Expressionsvektors MSP114 wurde das 1.767 bp EcoRI-Xhol Fragment aus pJ0FNR:N0DK mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 31, Konstruktkarte) . In der Abbildung 31 beinhaltet Fragment FNR Promotor den FNR Promotor (635 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NODK KETO CDS (690 bp) , kodierend für die Nodularia spumignea NSORIO NODK-Ketolase, Frag- ment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase . Beispiel 27:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORI O in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta .
Die Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORIO in L. esculentum und Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al . 1986, Biochem J. 240:709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blüten- spezifischen Promoters EPSPS aus Petunia hybrida (Datenbankeintrag M37029: Nukleotidregion 7-1787; Benfey et al . (1990) Plant Cell 2: 849-856) .
Der Klon pEPSPS (in Beispiel 21 beschrieben) wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONODK (in Beispiel 25 beschrieben) verwendet.
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1763 Bp Sacl-Hindlll Fragmentes aus pEPSPS und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnit- tenen Vektor pJONODK. Der Klon, der den Promoter EPSPS anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJOESP:NODK. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NODK in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS- Transitpeptid.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORI O in L . esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP115 wurde das 2.889 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP:NODK mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 32, Konstruktkarte). In der Abbildung 32 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NODK KETO CDS (690 bp) , kodierend für die Nodularia spumignea NSORIO NODK-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.
Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der EPSPS-kontrollierten NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSORI O in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900) .
Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP116 wurde das 2.889 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJ0ESP:N0DK mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Abbildung 33, Konstruktkarte). In der Abbildung 33 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp) , Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp) , Fragment NODK KETO CDS (690 bp) , kodierend für die Nodularia spumignea NSORI O NODK-Ketolase, Fragment OCS Termi- nator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.
Beispiel 28:
Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Pflanzen
Transformation und Regeneration von Tomatenpflanzen wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
Gemäß der in Beispiel 6 beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten:
Mit MSP105 wurde erhalten: mspl05-l, mspl05-2, mspl05-3
Mit MSP107 wurde erhalten: mspl07-l, mspl07-2, mspl07-3 Mit MSP109 wurde erhalten: mspl09-l, mspl09-2, mspl09-3
Mit MSPlll wurde erhalten: msplll-1, msplll-2, msplll-3
Mit MSP113 wurde erhalten: mspll3-l, mspll3-2, mspll3-3 Mit MSP115 wurde erhalten: mspll5-l, mspll5-2, mspll5-3
Die Chrakterisierung und Analyse der transgenen Lycopersicon esculentum Pflanzen erfolgt wie in Beispiel 6 beschrieben.
Beispiel 29: Herstellung transgener Tagetes Pflanzen
Die Transformation und Regeneration von Tagetes Pflanzen wurde wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt.
Gemäß der in Beispiel 7 beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten:
Mit MSP106 wurde erhalten: mspl06-l, mspl06-2, mspl06-3
Mit MSP108 wurde erhalten mspl08-l, mspl08-2, mspl08-3 Mit MSP110 wurde erhalten mspllO-1, mspll0-2, mspllO-3 Mit MSP112 wurde erhalten mspll2-l, mspll2-2, mspll2-3
Mit MSP114 wurde erhalten: mspll4-l, mspll4-2 , mspll4-3 Mit MSP116 wurde erhalten: mspll6-l, mspll6-2, mspll6-3 Die Charakterisierung der transgenen Tagetes Pflanzen erfolgt wie unter Beispiel 8 und 9 sowie wie in Beispiel 17 beschrieben.
Beispiel 30: Herstellung eines Doppel-Expressionsvektors zur Runterregulierung der Epsilon-Cyclase Transkriptmengen sowie der Expression der Nostoc punctiforme Ketolase NP196-1 blütenspezifisch in Tagetes erecta .
Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 2963 Bp Ecll36II- Xhol Fragmentes aus MSP107 (siehe Beispiel 21) und Ligierung mit dem Xhol-Smal geschnittenen Vektor pS5AI7 (Beispiel 14) . Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die zwei Expressionskassetten enthaelt: erstens die Inverted-Repeat-Cassette gerichtet gegen die Ecyclase aus Tagetes erecta und zweitens eine Kassette zur Überexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme . Dieser Klon, heisst pCSPOl (Abbildung 34, Konstruktkarte) . In der Abbildung 34 beinhaltet Fragment AP3P (776 bp) den AP3P-Promoter , Fragment ecycS (439 bp) die 5 'Region der Tagetes Ecyclase Sequenz aus pJITH7, Fragment intron ( 207 bp) das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment ecycAS (440 bp) die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta in Antisense-Orientierung, Fragment 35T (763 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. Weiterhin beinhaltet Fragment ocs (191 bp) das Polyadenylierungs- signal des Octopin-Synthasegens , Fragment NP196 (762 bp) die
Ketolase aus Nostoc punctiforme, Fragment TP (183 bp) das Transitpeptid des rbcS Gens aus Erbse, Fragment EPSPS (1761 bp) den EPSPS Promoter.
Beispiel 31:
Herstellung einer Expressionskassette zur blütenspezifischen Überexpression der chromoplastenspezifischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum.
Die Expression der chromoplastenspezifischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum in Tagetes erecta erfolgt unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters EPSPS aus Petunie (Beispiel 21) . Als Terminatorelement wird LB3 aus Vicia faba verwendet . Die Sequenz der chromoplastenspezifischen B-Hydroxylase wurde durch RNA Isolierung, reverse Transkription und PCR hergestellt.
Für die Herstellung der LB3-Terminator-Sequenz aus Vicia faba wird genomische DNA aus Vicia faba-Gewehe nach Standardmethoden isoliert und durch genomische PCR unter Verwendung der Primer PR206 und PR207 eingesetzt. Die PCR zur Amplifikation dieses LB3 DNA-Fragmentes, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist:
- 1 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0.25 mM dNTPs
0.2 uM PR206 (SEQ ID No. 150) 0.2 uM PR207 (SEQ ID No . 151) 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 28.8 ul Aq. Dest.
Die PCR-Amplifikation mit PR206 und PR207 resultiert in einem 0.3 kb Fragment das für den LB-Terminator enthaelt. Das Amplifikat wird in den Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern T7 und M13 bestätigen eine zur Sequenz SEQ ID: 160 identische Sequenz. Dieser Klon heisst pTA- LB3 und wird daher für die Klonierung in den Vektor pJITH7 verwendet (siehe unten) .
Für die Herstellung der b-Hydroxylase-Sequenz wird Total-RNA aus Tomate präpariert. Dazu werden 100 mg der gefrorenen, pulverisierten Blüten in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Tri- zol-Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Suspension wird mit 0,2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentri- fugation bei 12000 g wird der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert . Die RNA wird mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyro- carbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst. Die RNA-Konzentration wird photometrisch bestimmt. Für die cDNA- Synthese werden 2 , 5 ug Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) nach Hersteller- angaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PR215 SEQ ID No. 152) in cDNA umgeschrieben.
Die Bedingungen der anschließenden PCR-Reaktionen sind die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des VPR203-PR215 DNA-Fragmentes, das fuer die B-Hydroxylase kodiert, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
- 1 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) 0.25 mM dNTPs 0.2 uM VPR203 (SEQ ID No . 159) 0 . 2 uM PR215 ( SEQ ID No . 152 )
5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA)
0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA)
28.8 ul Aq. Dest.
Die PCR-Amplifikation mit VPR203 und PR215 resultiert in einem 0.9 kb Fragment das für die b-Hydroxylase kodiert. Das Amplifikat wird in den Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern T7 und M13 bestätigen eine zur Sequenz SEQ ID No . 161 identische Sequenz. Dieser Klon heisst pTA-CrtR-b2 und wird daher für die Klonierung in den Vektor pCSP02 verwendet (siehe unten).
Die EPSPS-Promoter-Sequenz aus Petunie wird durch PCR Ampli- fikation unter Verwendung des Plasmides MSP107 (s. Beispiel 21) und der Primer VPR001 und VPR002 hergestellt. Die PCR zur Amplifikation dieses EPSPS-DNA-Fragmentes , erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist:
- 1 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
0.25 mM dNTPs
0.2 uM VPR001 (SEQ ID No. 157)
0.2 uM VPR002 (SEQ ID No . 158)
5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA)
28.8 ul Aq. Dest.
Die PCR-Amplifikation mit VPR001 und VPR002 resultiert in einem 1.8 kb Fragment das den EPSPS-Promoter kodiert. Das -Amplifikat wird in den Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern T7 und Ml3 bestätigen eine zur Sequenz SEQ ID: 162 identische Sequenz. Dieser Klon heisst pTA- EPSPS und wird daher für die Klonierung in den Vektor pCSP03 verwendet (siehe unten) .
Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 0,3 kb PR206-PR207 EcoRI-Xhol Fragmentes aus pTA-LB3 , abgeleitet vom Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) , und Ligierung mit dem EcoRI-Xhol geschnittenen Vektor pJITl!7. Der Klon, der den 0,3 kb Terminator LB3 enthält, heisst pCSP02.
Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 0,9 kb VPR003-PR215 EcoRI-Hindlll Fragmentes aus pTA-CrtR-b2 , abgeleitet vom Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) , und Ligierung mit dem EcoRI-Hindlll geschnittenen Vektor pcsp02. Der Klon, der das 0,9 kb B-Hydroxylase-Fragment CrtR-b2 enthält, heisst pCSP03. Durch die Ligation entsteht eine transkriptioneile Fusion zwischen dem Terminator LB3 und dem B-Hydroxylase-Fragment CrtR-b2.
Der dritte Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 1,8 kb VPR001-VPR002 Ncol-Sacl Fragmentes aus pTA-EPSPS, abgeleitet vom Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) , und Ligierung mit dem Ncol-Sacl geschnittenen Vektor pCSP03. Der Klon, der das 1,8 kb EPSPS Promoter-Fragment enthält, heisst pCSP04. Durch die Ligation entsteht eine transkriptioneile Fusion zwischen dem EPSPS- Promoter und dem ß-Hydroxylase-Fragment CrtR-b2. (Abbildung 35, Konstruktkarte) . In der Abbildung 35 beinhaltet Fragment Fragment EPSPS (1792 bp) den EPSPS Promoter, das Fragment crtRb2 (929 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2 , Fragment LB3 (301 bp) den LB3 Terminator .
Zur Klonierung dieser ß-Hydroxylase-Überexpressionskassette in Expressionsvektoren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tagetes erecta wird die ß-Hydroxylase-Kassette als 3103 bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes isoliert. Das Auffüllen der 3λEnden (30 min bei 30°C) erfolgt nach Standardmethoden (Klenow-fill-in) .
Beispiel 32:
Herstellung von Inverted-Repeat-Expressionskassetten für die blütenspezifische Expression von b-Hydroxylase dsRNA in Tagetes erecta (gerichtet gegen die 5'Region der b-Hydroxylase cDNA)
Die Nukleinsäure, die die 5 "terminale bp Region der b-Hydroxylase cDNA (Genbank accession no. AF251018) enthält, wird mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Tagetes erecta cDNA unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR217 SEQ ID
No. 153) und eines antisense spezifischen Primers (PR218 SEQ ID No. 154) amplifiziert.
Für die Präparation von Total-RNA aus Blüten von Tagetes werden 100 mg der gefrorenen, pulverisierten Blüten in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Trizol-Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Suspension wird mit 0 , 2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12 000 g wurde der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert. Die RNA wird mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyrocarbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst. Die RNA-Konzentration wird photometrisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese werden 2,5 ug Gesamt-RNA für 10 min bei 60?C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime- beads, Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PR218 SEQ ID No. 154) in cDNA umgeschrieben.
Die Bedingungen der anschließenden PCR-Reaktionen sind die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation des PR217-PR218 DNA-Fragmentes, das die 5 'terminale 0.3 kb Region der b-Hydroxylase enthält, erfolgt in einem 50 ul? Reaktionsansatz, in dem enthalten ist:
- 1 ul? cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) 0.25 mM dNTPs
0.2 uM PR217 (SEQ ID No. 153) - 0.2 uM PR218 (SEQ ID No. 154) 5 ul? 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 ul? R Taq Polymerase (TAKARA) 28.8 ul? Aq. Dest.
Die PCR zur Amplifikation des PR220-PR219 DNA-Fragmentes, das die 5 'terminale 0,3kb Region der b-Hydroxylase enthält, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist:
- 1 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0.25 mM dNTPs
0.2 uM PR220 (SEQ ID No. 156) 0.2 uM PR219 (SEQ ID No. 155) 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 28.8 ul Aq. Dest.
Die PCR-Reaktionen werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt :
IX 94°C 2 Minuten
35X 94°C 1 Minute
58°C 1 Minuten
72°C 1 Minuten
IX 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit Primer PR217 und PR218 resultiert in einem 332 Bp-Fragment (SEQ ID NO: 163), die PCR-Amplifikation mit Primer PR219 und PR220 resultiert in einem 332 Bp-Fragment (SEQ ID NO: 164) . Die beiden Amplifikate, das PR217-PR218 (Hindlll-Sall sense) Fragment und das PR220-PR219 (EcoRI-BamHI antisense) Fragment, werden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR-Bluntll (Invitrogen) kloniert. Die resultierenden Klone heißen pCR-Bluntll-bhydrS (PR217-PR218-Fragment) bzw. pCR- Bluntll-bhydrAS (PR220-PR219-Fragment) . Sequenzierungen mit dem Primer SP6 bestätigen jeweils eine zur publizierten Sequenz AF251018 (SEQ ID No. 165) identische Sequenz abgesehen von den eingeführten Restriktionsstellen. Diese Klone werden daher für die Herstellung eines Inverted-Repeat Konstrukts in dem Klonierungsvektor pJAIl (siehe Beispiel 10) verwendet.
Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 332 Bp PR217-PR218 Hindlll-Sall Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR-Bluntll-bhydrS (Invitrogen) und Ligierung mit dem Hindlll- Sall geschnittenen Vektor pJAIl. Der Klon, der 5' terminale Region der P-Hydroxylase in der sense Orientierung enthält, heisst pCSP05. Durch die Ligation entsteht eine trranskriptionelle Fusion zwischen dem AP3P und dem sense Fragment der 5'terminalen Region der ß-Hydroxylase sowie dem Intron andererseits.
Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 332 Bp PR220-PR219 BamHI-EcoRI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR- Bluntll-bhydrAS (Invitrogen) und Ligierung mit dem BamHI-EcoRI geschnittenen Vektor pCSP05. Der Klon, der die 332 bp 5 'terminale Region der ß-Hydroxylase cDNA in der antisense Orientierung enthält, heisst pCSP06. Durch die Ligation entsteht eine transkrip- tionelle Fusion zwischen dem antisense Fragment der 5'terminalen Region der ß-Hydroxylase und dem Polyadenylierungssignal aus CaMV einerseits und dem Intron andererseits.
Zur Klonierung dieser Runterregulierungskassette in Expressionsvektoren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tagetes erecta wird die Inverted-Repeat-Kassette als 2394 bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes isoliert. Das Auffüllen der 3 "Enden (30 min bei 30°C) erfolgt nach Standardmethoden (Klenow-fill-in) .
In der Abbildung 36 beinhaltet Fragment AP3P (767 bp) den AP3P- Promoter, Fragment 5 'bhydrS (291 bp) die 5 "Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (206 bp)das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5 'bhydrS (326 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Antisense-Orientierung, und Fragment 35T (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. Zur Klonierung dieser Runterregulierungskassette in Expressionsvektoren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tagetes erecta wird die Inverted-Repeat-Kassette als 2392 bp Ecll36II-XhoI Fragmentes isoliert. Das Auffüllen der 3 'Enden (30 min bei 30°C) erfolgt nach Standardmethoden (Klenow-fill-in) .
Beispiel 33:
Herstellung eines Dreifach-Expressionsvektors zur Runterregulierung der Epsilon-Cyclase, der Expression der Nostoc punctiforme Ketolase NP196-1, sowie der Überexpression der chromoplastenspe- zifischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum blütenspezifisch in Tagetes erecta .
Die Klonierung dieses Dreifach-Expressionsvektors erfolgt durch Isolierung des 3103 Bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes aus pCSP04 (siehe Beispiel 31), nachfolgendes Klenow-Auffuellen des 5 'Überhangs der Xhol Schnittstelle (nach Standardmethoden durchgefuehrt) und schliesslich Ligierung in dem Ecll36ll-geschnittenen Vektor pCSPOl (Beispiel 30) . Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die drei Expressionskassetten enthaelt: erstens die Inverted-Repeat- Cassette gerichtet gegen die Ecyclase aus Tagetes erecta, zweitens eine Kassette zur Überexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme, und drittens eine Kassette zur chromoplasten- spezifischen Überexpression der B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum . Die ß-Hydroxylase-Überexpressions-kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor ligieren. Das hier beschriebene Beispiel pCSP07 beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSP07F und pCSP07R des Dreifach-Expressionsvektors.
Stellvertretend ist hier die Konstruktkarte fuer Version pCSP07F des Beispiels pCSP07 angeben (Abbildung 37, Konstruktkarte).
In der Abbildung 37 beinhaltet Fragment AP3P (773 bp) den AP3P- Promoter, Fragment ecycS (439 bp) die 5 'Region der Ecyclase Sequenz aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (207 bp) das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment ecy- cAS (440 bp) die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta in Antisense-Orientierung, Fragment 35T (763 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Weiterhin beinhaltet Fragment ocs (191 bp) das Polyadenylierungssignal des Octopin-Synthasegens, Fragment NP196 (762 bp) die Ketolase aus Nostoc punctiforme, Fragment TP (183 bp) das Trans- itpeptid des rbcS Gens aus Erbse, Fragment EPSPS (1761 bp) den EPSPS Promoter. Weiterhin beinhaltet Fragment EPSPS (1792 bp) den EPSPS Promoter, das Fragment crtRb2 (929 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2 , Fragment LB3 (301 bp) den LB3 Terminator.
Transformation und Regeneration von Tagetespflanzen wurde in Beispiel 7 beschrieben.
Beispiel 34:
Herstellung eines Vierfach-Expressionsvektors zur Runterregulie- rung der Epsilon-Cyclase, der Expression der Nostoc punctiforme Ketolase NP196-1, der Überexpression der chromoplastenspezifi- schen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum sowie der Runterregulierung der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta blütenspezifisch in Tagetes erecta .
Die Klonierung dieses Vierfach-Expressionsvektors erfolgt durch Isolierung des 2392 Bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes aus pCSPOδ (siehe Beispiel 32), nachfolgendes Klenow-Auffuellen des 5 'Überhangs der Xhol-Schnittstelle (nach Standardmethoden durchgefuehrt) und schliesslich Ligierung in dem Ecll36II-geschnittenen Vektor pCSP07 (Beispiel 33) . Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die vier Expressionskassetten enthaelt: erstens die Inverted-Repeat- Cassette gerichtet gegen die Ecyclase aus Tagetes erecta, zweitens eine Kassette zur Überexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme, drittens eine Kassette zur chromoplasten- spezifischen Überexpression der B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum, und viertens eine Inverted-Repeat-Kassette gerichtet gegen die B-Hydroxylase aus Tagetes erecta. Die B-Hydroxylase- Runterregulierungs-Kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor ligieren. Das hier beschriebene Beispiel pCSP08 beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSP08F und pCSP08R des Vierfach- Expressionsvektors .
Stellvertretend ist hier die Konstruktkarte fuer Version pCSP08F des Beispiels pCSP08 angeben (Abbildung 38, Konstruktkarte) .
In der Abbildung 38 beinhaltet Fragment AP3P (773 bp) den AP3P- Promoter, Fragment ecycS (439 bp) die 5 'Region der Ecyclase Sequenz aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (207 bp) das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment ecycAS (440 bp) die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta in Antisense-Orientierung, Fragment 35T (763 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Weiterhin beinhaltet Fragment ocs (191 bp) das Polyadenylierungs- signal des Octopin-Synthasegens , Fragment NP196 (762 bp) die Ketolase aus Nostoc punctiforme, Fragment TP (183 bp) das Transitpeptid des rbcS Gens aus Erbse, Fragment EPSPS (1761 bp) den EPSPS Promoter.
Weiterhin beinhaltet Fragment EPSPS (1792 bp) den EPSPS Promoter, das Fragment crtRb2 (929 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2 , Fragment LB3 (301 bp) den LB3 Terminator.
Weiterhin beinhaltet Fragment AP3P (767 bp) den AP3P-Promoter , Fragment 5 'bhydrS (291 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (206 bp)das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5 'bhydrS (326 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Antisense- Orientierung, und Fragment 35T (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 35:
Herstellung eines Fuenffach-Expressionsvektors zur Runterregulierung der Epsilon-Cyclase, der Expression der Nostoc punctiforme Ketolase NP196-1, der Überexpression der chromoplastenspezi- fischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum der Runterregulierung der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta sowie der Überexpression der Bgenes aus Tomate blütenspezifisch in Tagetes erecta .
Die Klonierung dieses Fuenffach-Expressionsvektors erfolgt durch Isolierung des 2679 Bp Pmel-Sspl Fragmentes aus pMKPl (siehe Beispiel 37) und Ligierung in dem Ecll36ll-geschnittenen Vektor pCSP08 (Beispiel 34) . Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die fuenf Expressionskassetten enthaelt: erstens die Inverted-Repeat- Cassette gerichtet gegen die Ecyclase aus Tagetes erecta, zweitens eine Kassette zur Überexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme, drittens eine Kassette zur Überexpression der chromoplastenspezifischen ß-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum, viertens eine Inverted-Repeat-Kassette gerichtet gegen die B-Hydroxylase aus Tagetes erecta, und fuenftens eine Kassette zur Überexpression des Bgenes aus Lycopersicon esculentum. Die B-Hydroxylase-Runterregulierungs-Kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor pCSP08 ligieren. Das hier beschriebene Beispiel pCSP09 beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSP09F und pCSP09R des Vierfach-Expressionsvektors.
Stellvertretend ist hier die Konstruktkarte fuer Version pCSP09F des Beispiels pCSP09 angeben (Abbildung 39, Konstruktkarte). In der Abbildung 39 beinhaltet Fragment AP3P (773 bp) den AP3P- Promoter, Fragment ecycS (439 bp) die 5 'Region der Ecyclase
Sequenz aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (207 bp) das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment ecycAS (440 bp) die 5 'Region der Epsilon-Cyclase aus Tagetes erecta in Antisense-Orientierung, Fragment 35T (763 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
i Weiterhin beinhaltet Fragment ocs (191 bp) das Polyadenylierungssignal des Octopin-Synthasegens, Fragment NP196 (762 bp) die Ketolase aus Nostoc punctiforme, Fragment TP (183 bp) das Transitpeptid des rbcS Gens aus Erbse, Fragment EPSPS (1761 bp) den EPSPS Promoter.
Weiterhin beinhaltet Fragment EPSPS (1792 bp) den EPSPS Promoter, das Fragment crtRb2 (929 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2 , Fragment LB3 (301 bp) den LB3 Terminator.
Weiterhin beinhaltet Fragment AP3P (767 bp) den AP3P-Promoter, Fragment 5 'bhydrS (291 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (206 bp)das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5 'bhydrS (326 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Antisense- Orientierung, und Fragment 35T (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. ,
Weiterhin beinhaltet das Fragment P76 (1033 bp) den P76 Promoter, das Fragment Bgene (1666 bp) das Bgene aus Lycopersicon esculen- tum, und das Fragment 35ST (970 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Beispiel 36:
Herstellung eines Vierfach-Expressionsvektors zur der Expression der Nostoc punctiforme Ketolase NP196-1, der Überexpression der chromoplastenspezifischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum, der Runterregulierung der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta sowie der Ueberexpression der Bgenes aus Tomate blütenspezifisch in Tagetes erecta.
Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 3103 bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes aus pCSP04, nachfolgendes Klenow-Auf- fuellen des 5'Ueberhangs der Xhol-Schnittstelle (nach Standardmethoden durchgefuehrt) und schliesslich Ligierung in den Ecll36ll-geschnittenen Vektor pMSP107. Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die zwei Expressionskassetten enthaelt: erstens die Kassette zur Ueberexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme, und zweitens die Kassette zur Ueberexpression der chromoplastenspezifischen ß-Hydroxylase aus Lycopersicon esculen- tum. Die ß-Hydroxylase-Ueberexpressions-Kassette kann in zwei
Orientierungen in den Vektor pMSP107 ligieren. Das hier beschrie- bene Beispiel pCSPOlO beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSPlOF und pCSPlOR des Zweifach-Expressionsvektors .
Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 2392 bp Ecll36lI-XhoI Fragmentes aus pCSP06, nachfolgendes Klenow-Auf- fuellen des 5'Ueberhangs der Xhol-Schnittstelle (nach Standardmethoden durchgefuehrt) und schliesslich Ligierung in den Ecll36II-geschnittenen Vektor pCSPlO. Die B-Hydroxylase-Runter- regulierungs-Kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor pCSPlO ligieren. Das hier beschriebene Beispiel pCSPll beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSPllF und pCSPllR des Dreifach- Expressionsvektors .
Der dritte Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 3679 bp Pmel-Sspl-Fragmentes aus pMKPOl (siehe Beispiel 37) und Ligierung in den Ecll36II-geschnittenen Vektor pCSPll. Die Bgene-Über- expressions-Kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor pCSPll ligieren. Das hier beschriebene Beispiel pCSP12 beinhaltet beide resultierenden Versionen pCSPl2F und pCSP12R des Vierfach- Expressionsvektors.
Stellvertretend ist hier die Konstruktkarte fuer Version pCSPl2F des Beispiels pCSPl2 angeben (Abbildung 40, Konstruktkarte).
In der Abbildung 40 beinhaltet Fragment ocs (191 bp) das Polyadenylierungssignal des Octopin-Synthasegens, Fragment NP196 (762 bp) die Ketolase aus Nostoc punctiforme, Fragment TP (183 bp) das Transitpeptid des rbcS Gens aus Erbse, Fragment EPSPS (1761 bp) den EPSPS Promoter.
Weiterhin beinhaltet Fragment EPSPS (1792 bp) den EPSPS Promoter, das Fragment crtR-b2 (929 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2 , Fragment LB3 (301 bp) den LB3 Terminator.
Weiterhin beinhaltet Fragment AP3P (767 bp) den AP3P-Promoter , Fragment 5 'bhydrS (291 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Sense-Orientierung, Fragment intron (206 bp)das Intron PIV2 des Kartoffel-Gens ST-LSI, Fragment 5 'bhydrS (326 bp) die 5 'Region der B-Hydroxylase aus Tagetes erecta in Antisense- Orientierung, und Fragment 35T (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.
Weiterhin beinhaltet das Fragment P76 (1033 bp) den P76 Promoter, das Fragment Bgene (1666 bp) das Bgene aus Lycopersicon esculen- tum, und das Fragment 35ST (970 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV. Beispiel 37:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der chromoplastenspezifischen Lycopin beta cyclase aus Lycopersicon esculentum unter Kontrolle des Promoters P76 und zur blütenspezifischen Expression der Ketolase NP196 aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Kontrolle des EPSPS Promoters
Isolation von Promoter P76 (SEQ ID NO. 168) mittels PCR mit genomischer DNA von Arabidopsis thaliana als Matrize.
Hierzu wurden die Oligonukleotid Primer P76for (SEQ ID NO. 166) und P76rev (SEQ ID NO. 167) verwendet. Die Oiigonukleotide wurden bei der Synthese mit einem 5' Phosphatrest versehen.
Die genomische DNA wurde aus Arabidopsis thaliana wie beschrieben (Galbiati M et al . Funct . Integr. Geno ics 2000, 20 1:25-34) isoliert .
Die PCR Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt:
80 ng genomische DNA lx Expand Long Template PCR Puffer
2 , 5 mM MgC12 je 350 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTp je 300 nM eines jeden Primers
2 , 5 Units Expand Long Template Polymerase in einem Endvolumen von 25 μl
Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet :
1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C
35 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 48°C für 30 sec und 68°C für 3 min
1 Zyklus mit 68°C für 10 min
Das PCR Produkt wird mit Agarosegelektrophorese gereinigt und das 1032 bp Fragment durch Gelelution isoliert.
Der Vektor pSun5 wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRV verdaut und ebenfalls über Agarosegelektrophorese aufgereinigt und durch Gelelution gewonnen.
Das gereinigte PCR Produkt wird in den so behandelten Vektor kloniert . Um die Orientierung des Promotors im Vektor zu überprüfen wird mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut. Entsteht hierbei ein 628 bp Fragment ist die Orientierung entsprechend der Abb. 43.
Dieses Konstrukt wird mit p76 bezeichnet.
Der 35ST wird aus pJIT 117 durch Verdau mit den Restriktionsendo- nukleasen Kpnl und Smal gewonnen. Das hierbei entstehende 969 bp Fragment wird mit Agarosegelektrophorese gereinigt und durch Gelelution isoliert. Der Vektor p76 wird ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Kpnl und Smal verdaut. Das entstehende 7276bp Fragment wird mit Agarosegelektrophorese gereinigt und durch Gelelution isoliert. Das so gewonnene 35ST Fragment wird in den so behandelten p76 kloniert . Der entstehende Vektor wird mit p76_35ST bezeichnet.
Isolation von Bgene (SEQ ID NO. 171) mittels PCR mit genomischer DNA von Lycopersicon esculentum als Matrize.
Hierzu wurden die Oligonukleotid Primer BgeneFor (SEQ ID NO. 169) und BgeneRev (SEQ ID NO. 170) verwendet. Die Oiigonukleotide wurden bei der Synthese mit einem 5' Phosphatrest versehen.
Die genomische DNA wurde aus Lycopersicon esculentum wie beschrieben (Galbiati M et al . Funct. Integr. Genomics 2000, 20 1:25-34) isoliert.
Die PCR Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt:
80ng genomische DNA lx Expand Long Template PCR Puffer 2,5 mM MgC12 je 350 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTp je 300 nM eines jeden Primers 2 , 5 Units Expand Long Template Polymerase in einem Endvolumen von 25 μl
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:
1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C
35 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 48°C für 30 sec und 68°C für 3 min 1 Zyklus mit 68°C für 10 min Das PCR Produkt wurde mit Agarosegelektrophorese gereinigt und das 1665 bp Fragment durch Gelelution isoliert.
Der Vektor p76_35ST wird mit der Restriktionsendonuklease Smal verdaut und ebenfalls über Agarosegelektrophorese aufgereinigt und durch Gelelution gewonnen.
Das gereinigte PCR Produkt wird in den so behandelten Vektor kloniert . Um die Orientierung von Bgene im Vektor zu überprüfen wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut. Entsteht hierbei ein 2216 bp Fragment ist die Orientierung entsprechend der Abb. 43. Dieses Konstrukt wird mit pB bezeichnet. pB wird mit den Restriktionsendonukleasen Pmel und Sspl verdaut und das 3906bp Fragment enthaltend den Promoter P76, Bgene und den 35ST durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und durch Gelelution gewonnen
MSP108 (Beispiel 21, Abb.25) wird mit der Restriktionsendo- nuklease Ecll26II verdaut, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und durch Gelelution gewonnen
Das gereinigte 3906bp Fragment enthaltend den Promoter P76, Bgene und den 35ST aus pB wird in den so behandelten Vector MSP108 kloniert.
Die Orientierung des Inserts wird durch Restriktionsverdau mit Ncol festgestellt. Entsteht hierbei ein Fragment der Größe 5268bp, ist die Orientierung wie in Abb. XX gezeigt. Dieses Konstrukt wird mit pMKPl (Abb.44) bezeichnet.
Beispiel 38:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der chromoplastenspezifischen Lycopin beta cyclase aus Lycopersicon esculentum unter Kontrolle des Promoters P76, zur blütenspezifischen Expression der Ketolase NP196 aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Kontrolle des EPSPS Promoters und zur blütenspezifischen Produktion von dsRNA-Transkripten enthaltend 5 'terminale Fragmente der Epsilon-Cyclase cDNA (AF251016) unter Kontrolle des AP3P-Promoters
Vektor cspl (Abb. 34, Beispiel 30) wird mir Ecll36ll verdaut und mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und durch Gelelution gewonnen.
Das 3906bp Sspl, Pmel Fragment enthaltend den Promoter P76, Bgene und den 35ST aus pB (siehe Beispiel 37) wird in den so behandelten Vector cspl kloniert . Die Orientierung des Inserts wird durch Restriktionsverdau mit Sacl festgestellt. Entsteht hierbei ein Fragment der Größe 3170bp, ist die Orientierung wie in 7Abb. XX gezeigt.
Dieses Konstrukt wird mit pMKP2 (Abb. 44) bezeichnet.
Beispiel 39:
Herstellung und Charakterisierung transgener Tagetes Pflanzen
Die Transformation und Regeneration von Tagetes Pflanzen unter Verwendung der Nukleinsäurekonstrukte gemäß den Beispielen 30 bis 38 wurde wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt.
Die Charakterisierung der transgenen Tagetes Pflanzen erfolgt wie unter Beispiel 8 und 9 sowie wie in Beispiel 17 beschrieben.

Claims

Patenansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kulti- vierung von genetisch veränderten Pflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp eine veränderte Ketolase-Aktivität in Blütenblättern aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man -0 Pflanzen verwendet, deren Blütenblätter als Wildtyp bereits eine Ketolase-Aktivität aufweisen und die genetische Veränderung eine Erhöhung der Ketolase-Aktivität in Blütenblättern im Vergleich zum Wildtyp bewirkt.
-5 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Ketolase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure, kodierend eine- Ketolase, gegenüber dem Wildtyp erhöht .
0 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression Nukleinsäuren in die Pflanze einbringt, die Ketolasen kodieren.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man 5 Pflanzen verwendet, deren Blütenblätter als Wildtyp keine
Ketolase-Aktivität aufweisen und die genetische Veränderung eine Ketolase-Aktivität in Blütenblättern im Vergleich zum Wildtyp verursach .
° 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blütenblättern transgen eine Ketolase exprimieren.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Verursachung der Genexpression Nukleinsäuren in die Pflanze einbringt, die Ketolasen kodieren.
8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren einbringt, die ein Protein kodieren, ° enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase 5 aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 1 einbringt.
10. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
5 dass man Nukleinsäuren einbringt, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 16 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz , die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz 10 SEQ ID NO: 16 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 15
15 einbringt .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blüten die höchste Expressionsrate einer Ketolase auf-
20 weisen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression der Ketolase unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors erfolgt.
25
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen zusätzlich gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Hydroxylase-Aktivität und ß-Cyclase-
30 Aktivität aufweisen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man zur zusätzlichen Erhöhung mindestens einer der Aktivitäten, die Genexpression mindestens einer Nukleinsäure ausgewählt
35 aus der Gruppe, Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase gegenüber dem Wildtyp erhöht .
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man 40 zur Erhöhung der Genexpression mindestens einer der Nukleinsäuren, mindestens eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe, Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase in die Pflanze einbringt.
45 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase, Nukleinsäuren einbringt die eine Hydroxylase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 18 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 18 aufweist. 5
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 17 einbringt .
10 19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren einbringt die eine ß-Cyclase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 20 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge-
15 leitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 20 aufweist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 19 ein-
20 bringt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blüten die höchste Expressionsrate einer Hydroxylase
25 und/oder ß-Cyclase aufweisen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression der Hydroxylase und/oder ß-Cyclase unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors erfolgt.
30
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine reduzierte ε-Cyclase-Aktivität aufweisen.
35 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch, gekennzeichnet , dass man die Reduzierung der ε-Cyclase-Aktivität in Pflanzen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren erreicht:
a) Einbringen mindestens einer doppelsträngigen ε-Cyclase 40 Ribonukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in Pflanzen, b) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase antisense-Ribo- nukleinsäuresequenzen oder einer deren Expression gewähr-
45 leistenden Expressionskassette in Pflanzen, c) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase antisense-Ribo- nukleinsäuresequenze kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in Pflanzen, d) Einbringen mindestens einer ε-Cyclase sense-Ribonuklein- säuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen, e) Einbringen mindestens eines DNA-oder Protein-bindenden Faktors gegen ein ε-Cyclase -Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen, f) Einbringen mindestens einer den ε-Cyclase RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsauresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in
Pflanzen, g) Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung einer Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem ε-Cyclase-Gen in Pflanzen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, Ausführungsform a) , dadurch gekennzeichnet, dass man in die Pflanze eine RNA einbringt, die einen Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen ε-Cyclase- Transkripts identisch ist und/oder
b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen ε-Cyclase- Promotor-Sequenz identisch ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich mit Doppel-Strang-Struktur eine Nukleinsauresequenz enthält, die mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen ε-Cyclase-Transkripts identisch ist und das 5 '-Ende oder das 3 '-Ende der Pflanze eigenen Nukleinsäure, kodierend eine ε-Cyclase enthält.
27. Verfahren nach Anspruch 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in
Blüten die geringste Expressionsrate einer ε-Cyclase aufweisen.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription der doppelsträngigen ε-Cyclase Ribonukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24, Ausführungsform a) und/oder der Antisense-Sequenzen gemäß Anspruch 24, Ausführungsform b) unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors erfolgt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 28, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Pflanzen zusätzlich gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivi- tät, l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität, 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität, Isopentenyl- Diphosphat-Δ-Isomerase-Aktivität, Geranyl-Diphosphat-Syn- thase-Aktivität, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität, Phytoen-Synthase-Aktivität, Phytoen-Desaturase-Aktivität, Zeta-Carotin- Desaturase-Aktivität , crtlSO-Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität aufweisen.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass man zur zusätzlichen Erhöhung mindestens einer der Aktivitäten, die Genexpression mindestens einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein gegenüber dem Wildtyp erhöht.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression mindestens einer der Nukleinsäuren, mindestens eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase, Nuklein- säuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren 5 kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein in die Pflanze einbringt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man 10 als Nukleinsäure kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren einbringt die eine HMG-CoA-Reduktase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 100 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität
15 von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 100 aufweist.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 99 ein-
20 bringt.
34. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren einbringt die
25 eine (E) -4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 102 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der
30 Sequenz SEQ ID NO: 102 aufweist.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 101 einbringt .
35
36. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, Nukleinsäuren einbringt die eine 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Synthase kodieren, enthaltend die Aminosäurese-
40 quenz SEQ ID NO: 104 oder eine von dieser Sequenz durch
Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 104 aufweist.
45 37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 103 einbringt .
38. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Reduktoiso erase, Nukleinsäuren einbringt die eine 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase kodieren, enthaltend die 5 Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 106 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 106 aufweist.
10 39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 105 einbringt .
40. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man 15 als Nukleinsäure kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase, Nukleinsäuren einbringt die eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 108 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete
20 Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 108 aufweist.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 107
25 einbringt.
42. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren einbringt die eine Geranyl-Diphosphat-Synthase
30 kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 110 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 110 aufweist.
35
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 106 einbringt .
40 44. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren einbringt die eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 112 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion
45 oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 112 aufweist.
45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 111 einbringt .
5 46. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren einbringt die eine Geranyl-Geranyl- Diphosphat-Synthase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 114 oder eine von dieser Sequenz durch 10 Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 114 aufweist.
47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass 15 man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 113 einbringt .
48. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Synthase, Nuklein-
20 säuren einbringt die eine Phytoen-Synthase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 116 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz
25 SEQ ID NO: 116 aufweist.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 115 einbringt .
30
50. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren einbringt die eine Phytoen-Desaturase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 118 oder eine von
35 dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 118 aufweist.
40 51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 117 einbringt .
52. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass 45 man als Nukleinsäure kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren einbringt die eine Zeta-Carotin-Desaturase kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 120 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 120 aufweist. 5
53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 119 einbringt .
10 54. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren einbringt die ein crtlSO Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 122 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren
15 abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 122 aufweist.
55. Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 121 ein- 20 bringt.
56. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure kodierend ein FtsZ Protein, Nukleinsäuren einbringt die ein FtsZ Protein kodieren, enthaltend die
25 Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 124 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 124 aufweist.
30 57. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 123 einbringt .
58. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man 35 als Nukleinsäure kodierend ein MinD Protein, Nukleinsäuren einbringt die ein MinD Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 126 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 % 40 auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 126 aufweist.
59. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 125 einbringt .
45
60. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 59, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blüten die höchste Expressionsrate einer HMG-CoA- Reduktase und/oder (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphos- phat-Reduktase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder Geranyl- Diphosphat-Synthase und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Phytoen-Synthase und/oder Phytoen-Desaturase und/oder Zeta- Carotin-Desaturase und/oder eines crtlSO Proteins und/oder eines FtsZ Proteins und/oder eines MinD Proteins aufweisen.
61. Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression der HMG-CoA-Reduktase und/oder (E)-4-
Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase und/oder l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und/oder 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase und/oder Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase und/oder Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Farnesyl-Diphosphat-Synthase und/oder Geranyl- Geranyl-Diphosphat-Synthase und/oder Phytoen-Synthase und/oder Phytoen-Desaturase und/oder Zeta-Carotin-Desaturase und/oder des crtlSO Proteins und/oder des FtsZ Proteins und/oder des MinD Proteins unter Kontrolle eines bluten- spezifischen Promotors erfolgt.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine reduzierte endogene ß-Hydroxylase Aktivität aufweisen.
63. Verfahren nach Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reduzierung der endogenen ß-Hydroxylase Aktivität in Pflanzen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren erreicht :
a) Einbringen mindestens einer doppelsträngigen endogenen ß-Hydroxylase Ribonukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in Pflanzen, b) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase antisense-Ribonukleinsäuresequenzen oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen, c) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase antisense-Ribonukleinsäureseguenze kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten in
5 Pflanzen, d) Einbringen mindestens einer endogenen ß-Hydroxylase sense-Ribonukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen,
10 e) Einbringen mindestens eines DNA-oder Protein-bindenden
Faktors gegen ein endogenes ß-Hydroxylase-Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen, f ) Einbringen mindestens einer den endogenen ß-Hydroxylase- 15 RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsauresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette in Pflanzen, g) Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung einer Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in
20 einem endogenen ß-Hydroxylase-Gen in Pflanzen.
64. Verfahren nach Anspruch 63, Ausführungsform a) , dadurch gekennzeichnet, dass man in die Pflanze eine RNA einbringt, die einen Bereich mit Doppel-Strang-Struktur aufweist und
25 in diesem Bereich eine Nukleinsauresequenz enthält, die
a) mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen, endogenen ß-Hydroxylase-Transkripts identisch ist und/oder
30 b) mit mindestens einem Teil der Pflanze eigenen, endogenen ß-Hydroxylase-Promotor-Sequenz identisch ist.
65. Verfahren nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich mit Doppel-Strang-Struktur eine Nukleinsauresequenz
35 enthält, die mit mindestens einem Teil des Pflanze eigenen, endogenen ß-Hydroxylase-Transkripts identisch ist und das 5 '-Ende oder das 3 ' -Ende der Pflanze eigenen Nukleinsäure, kodierend eine endogene ß-Hydroxylase enthält .
40 66. Verfahren nach Anspruch 62 bis 65, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Blüten die geringste Expressionsrate einer endogenen ß-Hydroxylase aufweisen.
45
67. Verfahren nach Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription der doppelsträngigen endogenen ß-Hydroxylase Ribonukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 63, Ausführungsform a) und/oder der Antisense-Sequenzen gemäß Anspruch 63, Ausführungsform b) unter Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors erfolgt.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 67, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pflanze eine Pflanze verwendet, die in Blütenblättern Chromoplasten aufweist .
69. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 68, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pflanze eine Pflanze, ausgewählt aus den Familien Ranunculaceae, Berberidaceae , Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae,
Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, liliaceae oder Lamiaceae verwendet.
70. Verfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pflanze eine Pflanze, ausgewählt aus den Pflanzengattungen Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica, Aqulegia, Aster, Astragalus,
Bignonia, Calenduia, Caltha, Campanula, Canna, Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthemum, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita, Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus, Dimorphotheca, Doronicum, Eschscholtzia, Forsythia, Fremontia, Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana, Geranium, Gerbera, Geum, Grevillea, Helenium, Helianthus, Hepatica, Heracleum, Hisbiscus, Heliopsis, Hypericum, Hypochoeris, Impatiens, Iris, Jacaranda, Kerria, Laburnum, Lathyrus, Leontodon, Lilium, Linum, Lotus, Lycopersicon, Lysimachia, Maratia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera, Osmanthus , Petunia, Photinia, Physalis, Phyteuma, Potentilla, Pyracantha, Ranunculus, Rhododendron, Rosa, Rudbeckia, Senecio, Silene, Silphium, Sinapsis, Sorbus, Spartium, Tecoma, Torenia, Tragopogon, Trollius, Tropaeolum, Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola oder Zinnia verwendet.
71. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 70, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Kultivieren die genetisch veränderten Pflanzen erntet und anschließend die Ketocarotinoide aus den Blütenblättern der Pflanzen isoliert.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 71, dadurch gekennzeichnet, dass die Ketocarotinoide ausgewählt sind aus der Gruppe Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxy- echinenon, 3 ' -Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin .
5
73. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen blütenspezifischen Promotor und eine Nukleinsäure codierend eine Ketolase.
10 74. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen blütenblattspezifischen Promotor und eine Nukleinsäure codierend eine Ketolase.
75. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend mindestens eine Nuklein- 15 säure kodierend eine Ketolase und zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe a) Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, b) Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, c) Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase,
20 d) Nukleinsäuren kodierend eine (E) -4-Hydroxy-3-Methyl- but-2-enyl-Diphosphat-Reduktase e) Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, f) Nukleinsäuren kodierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- 25 Reduktoisomerase, g) Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase, h) Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, i) Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Syn-
30 thase, j ) Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat- Synthase, k) Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, 1) Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase,
35 m) Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, n) Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, o) Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein, p) Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein, q) doppelsträngige endogenen ß-Hydroxylase Ribonukleinsäure-
40 sequenz und/oder endogene ß-Hydroxylase antisense-Ribo- nukleinsäuresequenzen und r) doppelsträngige ε-Cyclase- Ribonukleinsäuresequenz und/oder ε-Cyclase antisense-Ribonukleinsäuresequenz , wobei die Nukleinsäuren mit einem oder mehreren Regulations-
45 Signalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.
76. Doppelsträngiges RNA-Molekül umfassend
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz , die im wesentlichen identisch ist
5 zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-ε-Cycläse Transkriptes , und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen komplementär ist.
10
77. Doppelsträngiges RNA-Molekül umfassend
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu
15 mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes des
Promotorbereichs eines ε-Cyclase-Gens, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-"sense"- Strang unter a) im wesentlichen komplementär ist.
20
78. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch 76, wobei die aus dem ε-Cyclase-Transkript ableitbare cDNA-Sequenz durch SEQ ID NO: 38 beschrieben ist.
25 79. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch 77, wobei die
Nukleinsauresequenz des Promotorbereichs des ε-Cyclase-Gens durch SEQ ID NO: 47 beschrieben ist.
80. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 76
30 bis 79, wobei "sense"-RNA-Strang und "antisense"-RNA-Strang kovalent in Form eines invertierten Repeats miteinander verbunden sind.
81 . Doppelsträngiges RNA-Molekül umfassend 35 a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA- Transkriptes der endogenen ß-Hydroxylase, und
40 b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen komplementär ist.
45
82. Doppelsträngiges RNA-Molekül umfassend
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu
5 mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes des
Promotorbereichs des endogenen ß-Hydroxylase -Gens, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-"sense"- Strang unter a) im wesentlichen komplementär ist.
10
83. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch 83, wobei die aus dem endogenen ß-Hydroxylase-Transkript ableitbare cDNA- Sequenz durch SEQ ID NO: 103 beschrieben ist.
15 84. Transgene Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in pflanzlichen Organismen funktioneilen Promotor eine Nukleinsauresequenz transkripierend ein doppelsträngiges RNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 76 bis 83.
20
85. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 84, wobei der Promotor ein blütenspezifischer Promotor ist .
86. Genetisch veränderte Pflanze, wobei die genetische Ver- 25 änderung die Aktivität einer Ketolase in Blütenblättern,
A für den Fall, dass die Wildtyppflanze bereits eine Ketolase-Aktivität in Blütenblättern aufweist, gegenüber dem Wildtyp erhöht und 30
B für den Fall, dass die Wildtyppflanze keine Ketolase- Aktivität in Blütenblättern aufweist, gegenüber dem Wildtyp verursacht .
35 87. Genetisch veränderte Pflanze nach Anspruch 86, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhöhung oder Verursachung der Ketolase-Aktivität durch eine Erhöhung oder Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Ketolase gegenüber dem Wildtyp bewirkt wird.
40
Genetisch veränderte Pflanze nach Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung oder Verursachung der Genexpression Nukleinsäuren in die Pflanze einbringt, die Ketolasen kodieren.
45
89. Genetisch veränderte Pflanze, die in den Blütenblättern Chromoplasten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderte Pflanze mindestens eine transgene Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase enthält.
90. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis
89, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Veränderung zusätzlich mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Hydroxlase-Aktivität und ß-Cyclase-Aktivität gegenüber einer Wildtyppflanze erhöht.
91. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis
90, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Veränderung zusätzlich die ε-Cyclase-Aktivität gegenüber einer Wildtyp- pflanze reduziert.
92. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis
91, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Veränderung zusätzlich mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, (E) -4-Hydroxy-3- Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Aktivität , 1-Deoxy- D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Aktivität, 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität , Isopentenyl-Diphosp- hat-Δ-Isomerase-Aktivität , Geranyl-Diphosphat-Synthase- Aktivität, Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Geranyl- geranyl-Diphosphat-Synthase-Aktivität , Phytoen-Synthase- Aktivität, Phytoen-Desaturase-Aktivität, Zeta-Carotin- Desaturase-Aktivität, crtlSO-Aktivität, FtsZ-Aktivität und MinD-Aktivität gegenüber einer Wildtyppflanze erhöht .
93. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis
92, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Veränderung zusätzlich die endogene ß-Hydroxylase Aktivität gegenüber einer Wildtyppflanze reduziert.
94. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis 93, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus den Pflanzenfamilien Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyl- laceae, Amaranthaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Asteraceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Poaceae, Orchidaceae, Malvaceae, liliaceae oder Lamiaceae.
95. Genetisch veränderte Pflanze nach -Anspruch 94, ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzengattungen Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Lycopersicon, Rosa, Calenduia, Physalis, Medicago, Helianthus, Chrysanthemum, Aster, Tulipa,
5 Narcissus, Petunia, Geranium, oder Tropaeolum oder Adonis.
96. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis 95, dadurch gekennzeichnet, dass die Ketolase in Blütenblättern exprimiert wird.
10
97. Genetisch veränderte Pflanze nach einem der Ansprüche 86 bis 96, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsrate einer Ketolase in Blütenblättern am höchsten ist.
15 98. Verwendung der genetisch veränderten Pflanzen nach einem der Ansprüche 86 bis 97 als Zierpflanzen oder als Futter- und Nahrungsmittel .
99. Verwendung der Blütenblätter der genetisch veränderten
20 Pflanzen nach einem der Ansprüche 86 bis 97 zur Herstellung von Ketocarotinoid-haltigen Extrakten oder zur Herstellung von Futter- und Nahrungsergänzungsmittel .
100. Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen 25 gemäß Anspruch 97, dadurch gekennzeichnet, dass man ein
Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen blütenspezifischen Promotor und Nukleinsäuren kodierend eine Ketolase in das Genom der Ausgangspflanze einführt .
30
35
40
45
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2495444A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Sungene Gmbh & Co.Kgaa Method for producing ketocarotinoids in plant fruit
AU2003250193A1 (en) * 2002-08-20 2004-04-08 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Transgenic expression cassettes for the expression of nucleic acids in plant blooms
EP1532256A1 (de) * 2002-08-20 2005-05-25 Sungene GmbH & Co. KGaA VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON &bgr;-CAROTINOIDEN
EP1554388A1 (de) * 2002-10-11 2005-07-20 Sungene GmbH & Co. KGaA Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
DE10300649A1 (de) * 2003-01-09 2004-07-22 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von genetisch veränderten Organismen
EP1780281B1 (de) * 2004-06-04 2013-12-11 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Verfahren zur herstellung von astaxanthin oder einem stoffwechselprodukt davon unter verwendung von carotinketolase und carotinketolase-genen
ES2546484T3 (es) 2005-03-18 2015-09-24 Dsm Ip Assets B.V. Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos
EP1915450A4 (de) * 2005-07-11 2009-03-18 Commw Scient Ind Res Org Weizenpigment
WO2008042338A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
EP2522735A3 (de) * 2006-10-20 2013-02-13 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Arizona State University Modifizierte Cyanobakterien
PE20090446A1 (es) * 2007-07-19 2009-05-06 Biosigma Sa Plasmidos para transformar una bacteria del genero acidithiobacillus spp. y metodo de transformacion
US20090093015A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-09 Kemin Foods, L.C. Beta-cryptoxanthin production using a novel lycopene beta-monocyclase gene
EP2199399A1 (de) 2008-12-17 2010-06-23 BASF Plant Science GmbH Ketokarotinoidproduktion in Pflanzen
WO2010079032A1 (en) * 2008-12-17 2010-07-15 Basf Plant Science Gmbh Production of ketocarotenoids in plants
CA2843549A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Shriram RAGHAVAN Methods and materials for recombinant production of saffron compounds
EP2785364B1 (de) 2011-11-29 2019-01-09 Proclara Biosciences, Inc. Verwendung von bakteriophagen-p3 als amyloidbindemittel
ES2558953B1 (es) * 2015-11-23 2016-11-18 Universitat De Lleida Maíz enriquecido en antioxidantes para mejorar la calidad nutricional del huevo
JP2019165635A (ja) * 2016-08-10 2019-10-03 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
US10004253B1 (en) * 2017-09-05 2018-06-26 Jose-Odon Torres-Quiroga Method for increasing the health condition of crustaceans in aquaculture, survival rate and pigmentation
CN112458103B (zh) * 2021-01-28 2022-09-30 青岛农业大学 一种调控辣椒红素积累的基因CaBBX20及其应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9016012D0 (en) 1990-07-20 1990-09-05 Unilever Plc Pigments
JP3375639B2 (ja) * 1993-12-27 2003-02-10 麒麟麦酒株式会社 キサントフィルの合成に有用なｄｎａ鎖およびキサントフィルの製造法
US5916791A (en) * 1995-11-24 1999-06-29 Hirschberg; Joseph Polynucleotide molecule from Haematococcus pluvialis encoding a polypeptide having a β--C--4--oxygenase activity for biotechnological production of (3S,3S)astaxanthin
WO1998006862A1 (en) * 1996-08-09 1998-02-19 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds and speciality oils in plant seeds
US6429356B1 (en) 1996-08-09 2002-08-06 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, and specialty oils in plant seeds
US6221417B1 (en) * 1997-05-14 2001-04-24 Kemin Industries, Inc. Conversion of xanthophylls in plant material for use as a food colorant
US5876782A (en) * 1997-05-14 1999-03-02 Kemin Industries, Inc. Method for the conversion of xanthophylls in plant material
JP2002516117A (ja) * 1998-05-22 2002-06-04 ユニバーシティ オブ メリーランド カロチノイド・ケトラーゼ遺伝子及び遺伝子生成物、ケトカロチノイドの生成及び遺伝子を用いてカロチノイドを変成する方法
EP1088054A4 (de) * 1998-06-02 2003-05-07 Univ Maryland Gene der karotinoid-biosynthese und -metabolismus und verfarhen zu deren verwendung
US6232530B1 (en) * 1998-11-30 2001-05-15 University Of Nevada Marigold DNA encoding beta-cyclase
DE19916140A1 (de) * 1999-04-09 2000-10-12 Basf Ag Carotinhydroxylase und Verfahren zur Herstellung von Xanthophyllderivaten
SE9903336D0 (sv) 1999-09-17 1999-09-17 Astacarotene Ab DNA construct and its use
US20050003474A1 (en) * 2001-01-26 2005-01-06 Desouza Mervyn L. Carotenoid biosynthesis
DE10201458A1 (de) * 2001-04-11 2002-10-17 Adelbert Bacher Intermediate und Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg
US7575766B2 (en) * 2001-06-29 2009-08-18 Ball Horticultural Company Tagetes erecta with altered carotenoid compositions and ratios
US6784351B2 (en) * 2001-06-29 2004-08-31 Ball Horticultural Company Targetes erecta marigolds with altered carotenoid compositions and ratios
US6372946B1 (en) * 2001-09-13 2002-04-16 Prodemex, S.A. De C.V. Preparation of 4,4′-diketo-β-carotene derivatives
ES2394880T3 (es) * 2002-03-11 2013-02-06 Dsm Ip Assets B.V. Tasas de alimentación y crecimiento mejoradas de animales acuáticos alimentados con un producto astaxantina dereivado de extracto de caléndula
US7223909B2 (en) * 2002-03-21 2007-05-29 Ball Horticultural 4-ketocarotenoids in flower petals
CA2495444A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Sungene Gmbh & Co.Kgaa Method for producing ketocarotinoids in plant fruit
DE10300649A1 (de) * 2003-01-09 2004-07-22 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von genetisch veränderten Organismen
DE102004007623A1 (de) * 2004-02-17 2005-08-25 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Promotoren zur Expression von Genen in Tagetes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004018693A2 *

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Publication number Publication date
WO2004018694A3 (de) 2004-09-10
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