JP2002516117A - カロチノイド・ケトラーゼ遺伝子及び遺伝子生成物、ケトカロチノイドの生成及び遺伝子を用いてカロチノイドを変成する方法 - Google Patents
カロチノイド・ケトラーゼ遺伝子及び遺伝子生成物、ケトカロチノイドの生成及び遺伝子を用いてカロチノイドを変成する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ケトラーゼ酵素活性を有するタンパク質のためにエンコードする精製された核酸配列およびシーケンスＩＤ ＮＯ：１または３の核酸配列、またはシーケンスＩＤ ＮＯ：２または４のアミノ酸配列をエンコードするように配列されている。ベクターおよびホスト細胞はそれらを含んでいるだけでない。ホスト細胞に含まれるケトカロチノイドを精製するためにその核酸配列を使用する方法、ならびにホスト細胞に含まれるカロチノイドの生成物を修飾するための核酸配列の使用方法が含まれている。
Description
【０００１】
カロチノイド(carotenoids)は、生体に見られる多くの黄色、オレンジ色及び
赤色の原因を成す広く分布している天然の顔料である。カロチノイドは、食品業
において、飼料及び食品添加物として、化粧品において並びにプロビタミンＡ前
駆物質として重要な用途を有している。
赤色の原因を成す広く分布している天然の顔料である。カロチノイドは、食品業
において、飼料及び食品添加物として、化粧品において並びにプロビタミンＡ前
駆物質として重要な用途を有している。
【０００２】 植物種アドニス・アエスチヴァリス(Adonis aestivalis)は、ケトカロチノイ
ド(ketocarotenoids)及びその他のカロチノイド顔料の蓄積に因って花弁の色が
真紅で花弁の基部が略ぼ黒色の花弁を有する花を生成する（Neamtu et al, Rev.
Roum. Biochim. 6 : 157, 1969）。このカロチノイドの蓄積のパターンがこの
種の一部の変種の通常の名称の所以となっている：夏の雉の眼(summer pheasant
’s eye)。
ド(ketocarotenoids)及びその他のカロチノイド顔料の蓄積に因って花弁の色が
真紅で花弁の基部が略ぼ黒色の花弁を有する花を生成する（Neamtu et al, Rev.
Roum. Biochim. 6 : 157, 1969）。このカロチノイドの蓄積のパターンがこの
種の一部の変種の通常の名称の所以となっている：夏の雉の眼(summer pheasant
’s eye)。
【０００３】 これらの種々の種の赤色花弁変種の花弁に存在するカロチノイドの中には、ケ
トカロチノイド・アスタキサンチン(astaxanthin)(3,3’-ジヒドロキシ-4,4’-
ジケト-b,b-カロチン；図１参照)がある。3-ヒドロキシエチネノン(3-ヒドロキ
シ-4-ケト-ｂ,ｂ-カロチン)、アドニルビン(3-ヒドロキシ-4、4’-ジケト-b,ｂ-
カロチン)、アドニサンチン(3,3’-ジヒドロキシ-4-ケト-b,b-カロチン)及びイ
ソゼアサンチン(4,4’-ジヒドロキシ-b,b-カロチン；T. W. Goodwin, The Bioch
emistry of the Carotenoids, vol. 1, Plants. 2nd edition, 1980, page 147
参照)を含む種々のその他のケトカロチノイドも報告されている。この内最後に
挙げた化合物は、4-ヒドロキシが4-ケト基の形成における中間体たり得るという
推測と合致している。
トカロチノイド・アスタキサンチン(astaxanthin)(3,3’-ジヒドロキシ-4,4’-
ジケト-b,b-カロチン；図１参照)がある。3-ヒドロキシエチネノン(3-ヒドロキ
シ-4-ケト-ｂ,ｂ-カロチン)、アドニルビン(3-ヒドロキシ-4、4’-ジケト-b,ｂ-
カロチン)、アドニサンチン(3,3’-ジヒドロキシ-4-ケト-b,b-カロチン)及びイ
ソゼアサンチン(4,4’-ジヒドロキシ-b,b-カロチン；T. W. Goodwin, The Bioch
emistry of the Carotenoids, vol. 1, Plants. 2nd edition, 1980, page 147
参照)を含む種々のその他のケトカロチノイドも報告されている。この内最後に
挙げた化合物は、4-ヒドロキシが4-ケト基の形成における中間体たり得るという
推測と合致している。
【０００４】
カロチノイドの生物学的生成、特にアスタキサンチン及びカンタキサンチン(c
anthaxanthin)等のオレンジ色ケトカロチノイド（図１）の生成、並びにカロチ
ノイド組成の変性に対する関心が現在顕著に見られる。この理由から、A. aesti
valis花の相補DNAライブラリが構築され、β−カロチンをカンタキサンチン（図
１）のような通常のケトカロチノイドが示す吸水性能と類似の吸水性能をもった
オレンジ色化合物に変換するについてこれに関与する相補DNAコード化酵素（以
下、“ケトラーゼ(ketolase)”という。尤も、未だ、その具体的な生物化学的活
性は確立していない。）を求めてのスクリーニングが行なわれている。２種の別
個のAdonis aestivalis相補DNAがこれを基にして選択された数種の相補DNAの中
から得られた。
anthaxanthin)等のオレンジ色ケトカロチノイド（図１）の生成、並びにカロチ
ノイド組成の変性に対する関心が現在顕著に見られる。この理由から、A. aesti
valis花の相補DNAライブラリが構築され、β−カロチンをカンタキサンチン（図
１）のような通常のケトカロチノイドが示す吸水性能と類似の吸水性能をもった
オレンジ色化合物に変換するについてこれに関与する相補DNAコード化酵素（以
下、“ケトラーゼ(ketolase)”という。尤も、未だ、その具体的な生物化学的活
性は確立していない。）を求めてのスクリーニングが行なわれている。２種の別
個のAdonis aestivalis相補DNAがこれを基にして選択された数種の相補DNAの中
から得られた。
【０００５】 よって、本発明の第一の側面は、ケトラーゼ酵素活性を有する蛋白質のために
コード化し、SEQ ID NO:1又は3の核酸シーケンスを有する精製核酸シーケンスで
ある。 本発明は、また、ケトラーゼ酵素活性を有し、SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シ
ーケンスを有する蛋白質のためにコード化する精製核酸シーケンスを含む。 本発明は、また、上に掲げる核酸シーケンスの一部から成るベクトル及び同ベ
クトルをもって変換された宿主細胞(host cells)を含む。
コード化し、SEQ ID NO:1又は3の核酸シーケンスを有する精製核酸シーケンスで
ある。 本発明は、また、ケトラーゼ酵素活性を有し、SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シ
ーケンスを有する蛋白質のためにコード化する精製核酸シーケンスを含む。 本発明は、また、上に掲げる核酸シーケンスの一部から成るベクトル及び同ベ
クトルをもって変換された宿主細胞(host cells)を含む。
【０００６】 本発明のこの他の側面は、宿主細胞中でケトカロチノイドを生成する方法であ
って、この方法が ケトラーゼ酵素活性を有する蛋白質のためにコード化し、(1) SEQ ID NO:1又
は3、又は(2) SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シーケンスのためにコード化するシ
ーケンスから成る異種核酸シーケンスから成るベクトルを宿主細胞に挿入するス
テップであって、異種核酸シーケンスが操作上プロモータに連結していることを
特徴とするステップ；及び 異種核酸シーケンスを表現し、これによりケトラーゼ酵素を生成するステップ
から成る。
って、この方法が ケトラーゼ酵素活性を有する蛋白質のためにコード化し、(1) SEQ ID NO:1又
は3、又は(2) SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シーケンスのためにコード化するシ
ーケンスから成る異種核酸シーケンスから成るベクトルを宿主細胞に挿入するス
テップであって、異種核酸シーケンスが操作上プロモータに連結していることを
特徴とするステップ；及び 異種核酸シーケンスを表現し、これによりケトラーゼ酵素を生成するステップ
から成る。
【０００７】 本発明の別の主題は、宿主細胞中でのカロチノイドの生成を非転換宿主細胞に
関して変性する方法であって、この方法が ケトラーゼ酵素活性を有する蛋白質のためにコード化し、(1) SEQ ID NO:1又
は3、又は(2) SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シーケンスをコード化するシーケン
スから成る異種核酸シーケンスから成るベクトルをカロチノイドを既に生成する
宿主細胞に挿入するステップであって、異種核酸シーケンスが操作上プロモータ
に連結していることを特徴とするステップ；及び 宿主細胞中の異種核酸シーケンスを表現し、宿主細胞中のカロチノイドの生成
を非転換宿主細胞に関して変性する生成するステップ から成る。
関して変性する方法であって、この方法が ケトラーゼ酵素活性を有する蛋白質のためにコード化し、(1) SEQ ID NO:1又
は3、又は(2) SEQ ID NO:2又は4のアミノ酸シーケンスをコード化するシーケン
スから成る異種核酸シーケンスから成るベクトルをカロチノイドを既に生成する
宿主細胞に挿入するステップであって、異種核酸シーケンスが操作上プロモータ
に連結していることを特徴とするステップ；及び 宿主細胞中の異種核酸シーケンスを表現し、宿主細胞中のカロチノイドの生成
を非転換宿主細胞に関して変性する生成するステップ から成る。
【０００８】
本発明はケトラーゼ酵素活性を持つタンパク質をエンコードしSEQＩＤ ＮＯ
：１または３の核酸シーケンスを持つ精製された核酸シーケンスを導くものであ
る。
：１または３の核酸シーケンスを持つ精製された核酸シーケンスを導くものであ
る。
【０００９】 本発明はまたケトラーゼ酵素活性を持ちSEQＩＤ ＮＯ：２または４のアミノ
酸シーケンスを持つタンパク質をエンコードする精製された核酸シーケンスを含
む。
酸シーケンスを持つタンパク質をエンコードする精製された核酸シーケンスを含
む。
【００１０】 ２つの異なったしかし密接に関連した核酸が単離された。各々のもっとも長い
試料のシーケンスがここに示される。上流遺伝子ＤＮＡについてその後に行われ
たシーケンシングはSEQＩＤ ＮＯ：３は最初の３つのアミノ酸（ＭＡＡ、図１
２参照）をエンコードする塩基を欠いていることを示している。同様にSEQＩＤ
ＮＯ：１の場合もそうである。しかしながらこの核酸については上流遺伝子シ
ーケンスはまだ得られていない。
試料のシーケンスがここに示される。上流遺伝子ＤＮＡについてその後に行われ
たシーケンシングはSEQＩＤ ＮＯ：３は最初の３つのアミノ酸（ＭＡＡ、図１
２参照）をエンコードする塩基を欠いていることを示している。同様にSEQＩＤ
ＮＯ：１の場合もそうである。しかしながらこの核酸については上流遺伝子シ
ーケンスはまだ得られていない。
【００１１】 SEQＩＤ ＮＯ：１と３に示される２つの異なったアドニスケトラーゼは以下
に議論されるギャッププログラムによって決定された約９１％の同一性を共有し
ている類似のシーケンスである（図９参照）。SEQＩＤ ＮＯ２と４で示される
酵素の予測されたアミノ酸シーケンスはまたギャッププログラムによって決定さ
れたところによると約９２％の類似性と約９０％の同一性を有している（図１０
参照）。
に議論されるギャッププログラムによって決定された約９１％の同一性を共有し
ている類似のシーケンスである（図９参照）。SEQＩＤ ＮＯ２と４で示される
酵素の予測されたアミノ酸シーケンスはまたギャッププログラムによって決定さ
れたところによると約９２％の類似性と約９０％の同一性を有している（図１０
参照）。
【００１２】 したがって、SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいはSEQＩＤ ＮＯ：２または４
のある程度の修飾が酵素活性を破壊することなく起こりうることは明らかである
。SEQＩＤ ＮＯ：１または３のｃＤＮＡの平頭バージョンが機能的であること
が見出されたことに注目されたい（すなわち、これらのｃＤＮＡはｂ−カロチン
をオレンジ色の化合物に変換させる性質を維持している）。また図１１のケトラ
ーゼSEQＩＤ ＮＯ：２と合わされたアラビドプシス β−カロチンヒドロキシ
ラーゼ（GenBank U58919）は頭を切られたとき最初の１２９のアミノ酸を欠いた
ポリペプタイドを生じる触媒機能を保持している。したがって、図１１の配列か
ら、このことは本発明の２つのケトラーゼは最初の１３２のアミノ酸をエンコー
ドする塩基を切り取っても触媒活性を保持することを示唆する。
のある程度の修飾が酵素活性を破壊することなく起こりうることは明らかである
。SEQＩＤ ＮＯ：１または３のｃＤＮＡの平頭バージョンが機能的であること
が見出されたことに注目されたい（すなわち、これらのｃＤＮＡはｂ−カロチン
をオレンジ色の化合物に変換させる性質を維持している）。また図１１のケトラ
ーゼSEQＩＤ ＮＯ：２と合わされたアラビドプシス β−カロチンヒドロキシ
ラーゼ（GenBank U58919）は頭を切られたとき最初の１２９のアミノ酸を欠いた
ポリペプタイドを生じる触媒機能を保持している。したがって、図１１の配列か
ら、このことは本発明の２つのケトラーゼは最初の１３２のアミノ酸をエンコー
ドする塩基を切り取っても触媒活性を保持することを示唆する。
【００１３】 このように本発明はケトラーゼ酵素の活性を損なうことなく置換、削除、追加
およびその他の修飾が、SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいはSEQＩＤ ＮＯ：２
または４に比べられるように、起こりうるケトラーゼ核酸とアミノ酸シーケンス
を含むことを意図している。好ましくは、置換、削除、追加およびその他の修飾
は現在のシーケンス間にすでに非類似性が見られる位置で起こる。SEQＩＤＮＯ
：１については図９に示されるようにこれらの位置は以下のようである：位置７
，２０，２３，３５，５３，６５，６７，７６，７８，８５，８６，９１，１０
７，１０９−１１１，１３５，１４０，１４４，１４６，１６０，１６８，２１
７，２１９，２４１，２４９，２５４，２５６，２７１，２９１，２９６，３４
９，３８９，４００，４０６，４３１，４４８，４４９，４６０，４７１，４９
９，５３０，５８９，６１９，６４３，６５３，６５４，６６７，６７９，７０
９，７３１，７４２，７８４，７８７，８３６，８７１，８８３，８９６，９１
１，９１９，９２８，９３０，９３９，９４３，９６７，９６９，９７８，９７
９，９８２，９８８，９９５，１００５，１００６，１０１２−１０１４，１０
１７，１０１９−１０２１，１０２３，１０２５，１０４９，１０５０，１０５
４，１０６０−１０６８，１０７０−１０７３，１０７５，１０９４，１１００
，１１０１，１１０６，１１０７，１１０９および１１１１−１１７６、SEQＩ
Ｄ ＮＯ：１について図９に示されるようにこれらの位置は以下のようである：
位置７，２０，２３，３５，５３，６３，６５，６７，７６，７８，８５，８６
，９１，１０７，１０９−１１１，１３５，１４０，１４４，１４６，１６０，
１６８，２１７，２１９，２４１，２４９，２５４，２５６，２７１，２９１，
２９６，３４９，３８９，４００，４０６，４３１，４４８，４４９，４６０，
４７１，４９９，５３０，５８９，６１９，６４３，６５３，６５４，６６７，
６７９，７０９，７３１，７４２，７８４，７８７，８３６，８７１，８８３，
８９６，９１１，９１９，９２８，９３０，９３９，９４３，９６６，９６７，
９７０，９７９，９８０，９８３，９８９，９９６，１００６，１００７，１０
１３−１０１５，１０１８，１０２０−１０２２，１０２４，１０２６，１０５
０，１０５１，１０５５，１０６２−１０６５，１０６７，１０８６，１０９２
，１０９３，１０９８，１０９９，１１０１および１１０３−１１１２。
およびその他の修飾が、SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいはSEQＩＤ ＮＯ：２
または４に比べられるように、起こりうるケトラーゼ核酸とアミノ酸シーケンス
を含むことを意図している。好ましくは、置換、削除、追加およびその他の修飾
は現在のシーケンス間にすでに非類似性が見られる位置で起こる。SEQＩＤＮＯ
：１については図９に示されるようにこれらの位置は以下のようである：位置７
，２０，２３，３５，５３，６５，６７，７６，７８，８５，８６，９１，１０
７，１０９−１１１，１３５，１４０，１４４，１４６，１６０，１６８，２１
７，２１９，２４１，２４９，２５４，２５６，２７１，２９１，２９６，３４
９，３８９，４００，４０６，４３１，４４８，４４９，４６０，４７１，４９
９，５３０，５８９，６１９，６４３，６５３，６５４，６６７，６７９，７０
９，７３１，７４２，７８４，７８７，８３６，８７１，８８３，８９６，９１
１，９１９，９２８，９３０，９３９，９４３，９６７，９６９，９７８，９７
９，９８２，９８８，９９５，１００５，１００６，１０１２−１０１４，１０
１７，１０１９−１０２１，１０２３，１０２５，１０４９，１０５０，１０５
４，１０６０−１０６８，１０７０−１０７３，１０７５，１０９４，１１００
，１１０１，１１０６，１１０７，１１０９および１１１１−１１７６、SEQＩ
Ｄ ＮＯ：１について図９に示されるようにこれらの位置は以下のようである：
位置７，２０，２３，３５，５３，６３，６５，６７，７６，７８，８５，８６
，９１，１０７，１０９−１１１，１３５，１４０，１４４，１４６，１６０，
１６８，２１７，２１９，２４１，２４９，２５４，２５６，２７１，２９１，
２９６，３４９，３８９，４００，４０６，４３１，４４８，４４９，４６０，
４７１，４９９，５３０，５８９，６１９，６４３，６５３，６５４，６６７，
６７９，７０９，７３１，７４２，７８４，７８７，８３６，８７１，８８３，
８９６，９１１，９１９，９２８，９３０，９３９，９４３，９６６，９６７，
９７０，９７９，９８０，９８３，９８９，９９６，１００６，１００７，１０
１３−１０１５，１０１８，１０２０−１０２２，１０２４，１０２６，１０５
０，１０５１，１０５５，１０６２−１０６５，１０６７，１０８６，１０９２
，１０９３，１０９８，１０９９，１１０１および１１０３−１１１２。
【００１４】 図１０に示されるSEQＩＤ ＮＯ：２と４については以下のアミノ酸がケトラ
ーゼ酵素活性を損なうことなく置換、削除、あるいは追加およびその他の修飾が
可能である：位置７，８，１２，１８，２１，２２，２５，２６，３６，３７，
４５，４７−４９，５６，７３，８３，８６，９７，９９，１３０，１４４，１
５０，１５７，１６６，２１８，２４４，２７９，２９９，および３０４．した
がって本発明はこのような変更がなされたアミノ酸シーケンスをも包含する事を
意図している。
ーゼ酵素活性を損なうことなく置換、削除、あるいは追加およびその他の修飾が
可能である：位置７，８，１２，１８，２１，２２，２５，２６，３６，３７，
４５，４７−４９，５６，７３，８３，８６，９７，９９，１３０，１４４，１
５０，１５７，１６６，２１８，２４４，２７９，２９９，および３０４．した
がって本発明はこのような変更がなされたアミノ酸シーケンスをも包含する事を
意図している。
【００１５】 各々の場合核酸およびアミノ酸シーケンスの類似性と同一性はシーケンス解析
ソフトウエアー、例えば、Sequence Analysis, Gap, あるいはジェネチックコン
ピューターグループ（ウイスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、1710 U
niversity Avenue, Wisconsin 53715）のBestFit ソフトウエアーパッケージ、M
EGAJign(DNAStar, Inc., 1228S.Park St., Madison, Wisconsin 53715)、あるい
はMacVector(Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Ca
mpbell, California 95008)、によって測定される。このようなソフトウエアー
はいろいろな置換、削除、追加およびその他の修飾に対して同一性の程度を割り
当てることによって類似のシーケンスを組み合わせるアルゴリズムを使用する。
そしてこの技術に習熟すると容易にシーケンスの類似性と同一性を比較すること
が出来るように有用なパラメーターに関する詳細な説明書を備えている。これに
関する１つの有用なアルゴリズムの例は上述のGapプログラムに使われているニ
ードルマンとブンシュのアルゴリズムである。このプログラムは適合数を最大に
しギャップの数を最小にする２つの完全なシーケンスの配列を見出す。もう一つ
の有用なアルゴリズムはスミスとウオーターマンのアルゴリズムである。これは
上述のBestFitプログラムに使われている。このプログラムは２つのシーケンス
間のもっとも類似性のよいセグメントの最適配列を作る。最適配列はスミスとウ
オーターマンの局在ホモロジーアルゴリズムを用いて適合数を最大にするように
ギャップを挿入することによって見出される。
ソフトウエアー、例えば、Sequence Analysis, Gap, あるいはジェネチックコン
ピューターグループ（ウイスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、1710 U
niversity Avenue, Wisconsin 53715）のBestFit ソフトウエアーパッケージ、M
EGAJign(DNAStar, Inc., 1228S.Park St., Madison, Wisconsin 53715)、あるい
はMacVector(Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Ca
mpbell, California 95008)、によって測定される。このようなソフトウエアー
はいろいろな置換、削除、追加およびその他の修飾に対して同一性の程度を割り
当てることによって類似のシーケンスを組み合わせるアルゴリズムを使用する。
そしてこの技術に習熟すると容易にシーケンスの類似性と同一性を比較すること
が出来るように有用なパラメーターに関する詳細な説明書を備えている。これに
関する１つの有用なアルゴリズムの例は上述のGapプログラムに使われているニ
ードルマンとブンシュのアルゴリズムである。このプログラムは適合数を最大に
しギャップの数を最小にする２つの完全なシーケンスの配列を見出す。もう一つ
の有用なアルゴリズムはスミスとウオーターマンのアルゴリズムである。これは
上述のBestFitプログラムに使われている。このプログラムは２つのシーケンス
間のもっとも類似性のよいセグメントの最適配列を作る。最適配列はスミスとウ
オーターマンの局在ホモロジーアルゴリズムを用いて適合数を最大にするように
ギャップを挿入することによって見出される。
【００１６】 保存的（すなわち類似的）置換は典型的には以下のグループ内の置換を含む：
グリシンとアラニン；バリン、イソロイシンとロイシン；アスパラギン酸、グル
タミン酸、アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニ
ン；そしてフェニルアラニンとチロシン。置換はまた保存される親水性と疎水性
をベースにして（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)参照
）、あるいは類似のペプタイド２次構造をとる可能性をベースとして行われる（
Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148(1978)参照）。
グリシンとアラニン；バリン、イソロイシンとロイシン；アスパラギン酸、グル
タミン酸、アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニ
ン；そしてフェニルアラニンとチロシン。置換はまた保存される親水性と疎水性
をベースにして（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)参照
）、あるいは類似のペプタイド２次構造をとる可能性をベースとして行われる（
Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148(1978)参照）。
【００１７】 もし比較がニュークレオチドシーケンスの間で行われるならば好ましい比較シ
ーケンス長は少なくとも５０ニュークレオチド、より好ましくは少なくとも６０
ニュークレオチド、少なくとも７５ニュークレオチド、あるいは少なくとも１０
０ニュークレオチドである。比較が酵素活性に必要な酵素コード領域をエンコー
ドする核酸シーケンス間でなされるならばそれはもっとも好ましい。もし比較が
アミノ酸シーケンス間で行われるのなら、比較の長さは好ましくは少なくとも２
０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸
、あるいは少なくとも５０アミノ酸である。比較が酵素活性に必要な酵素コード
領域におけるアミノ酸シーケンス間でなされるならばそれはもっとも好ましい。
ーケンス長は少なくとも５０ニュークレオチド、より好ましくは少なくとも６０
ニュークレオチド、少なくとも７５ニュークレオチド、あるいは少なくとも１０
０ニュークレオチドである。比較が酵素活性に必要な酵素コード領域をエンコー
ドする核酸シーケンス間でなされるならばそれはもっとも好ましい。もし比較が
アミノ酸シーケンス間で行われるのなら、比較の長さは好ましくは少なくとも２
０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸
、あるいは少なくとも５０アミノ酸である。比較が酵素活性に必要な酵素コード
領域におけるアミノ酸シーケンス間でなされるならばそれはもっとも好ましい。
【００１８】 本発明における２つの異なったアドニスケトラーゼ酵素は類似のシーケンスで
あるが、以前に記述されたバクテリア（Misawa et al., 1995）シアノバクテリ
ア（Fermandez-Gonzalez et al., 1997）、および緑藻（ヘマトコッコスプルビ
アリス； Lotan et al., 1995; ｋajiwara et al., 1995）β−カロチンケタラ
ーゼ酵素は、予測される２次構造のあるヒスチジンの形と機能は両グループによ
って予測されたポリペプタイドに共通であるけれどもアドニスケトラーゼと殆ど
似ていない（Cunningham and Gannt,1998）。
あるが、以前に記述されたバクテリア（Misawa et al., 1995）シアノバクテリ
ア（Fermandez-Gonzalez et al., 1997）、および緑藻（ヘマトコッコスプルビ
アリス； Lotan et al., 1995; ｋajiwara et al., 1995）β−カロチンケタラ
ーゼ酵素は、予測される２次構造のあるヒスチジンの形と機能は両グループによ
って予測されたポリペプタイドに共通であるけれどもアドニスケトラーゼと殆ど
似ていない（Cunningham and Gannt,1998）。
【００１９】 本発明はまた発明の核酸を含むベクターも含む。本発明による適切なベクター
は上述のようにケトラーゼ酵素をエンコードする遺伝子を形成する、ここでこの
遺伝子は機能的に適切なプロモーターとつながっている。ベクターにたいする適
切なプロモーターはこの分野でよく知られた技術を用いて形成されうる（例えば
、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989; Ausubel et al., Current P
rotocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,
New York, 1991参照）。植物の有核発現に対する適切なベクターはFray et al.
,(1995; Plant J. 8:693-701)およびMisawa et al., (1994;Plant J. 6:481-489
)に書かれている。原核発現に対する適切なベクターにはpaCYC184, Puc119, とP
br322（New England BioLabs, Bevery, MAから入手できる）およびpTrcHis(invi
trogen)とPet28(Novagen)およびその誘導体がある。本発明のベクターは追加し
てプロモーター、レプレッサーのような制御要素、抗生物質抵抗性遺伝子のよう
な選択性マーカー等を含むことが出来る。これらの構成はこの分野ではよく知ら
れている。
は上述のようにケトラーゼ酵素をエンコードする遺伝子を形成する、ここでこの
遺伝子は機能的に適切なプロモーターとつながっている。ベクターにたいする適
切なプロモーターはこの分野でよく知られた技術を用いて形成されうる（例えば
、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989; Ausubel et al., Current P
rotocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,
New York, 1991参照）。植物の有核発現に対する適切なベクターはFray et al.
,(1995; Plant J. 8:693-701)およびMisawa et al., (1994;Plant J. 6:481-489
)に書かれている。原核発現に対する適切なベクターにはpaCYC184, Puc119, とP
br322（New England BioLabs, Bevery, MAから入手できる）およびpTrcHis(invi
trogen)とPet28(Novagen)およびその誘導体がある。本発明のベクターは追加し
てプロモーター、レプレッサーのような制御要素、抗生物質抵抗性遺伝子のよう
な選択性マーカー等を含むことが出来る。これらの構成はこの分野ではよく知ら
れている。
【００２０】 上述のケタラーゼ酵素エンコード遺伝子は適切な発現ベクターにクローニング
されるとホスト細胞発現システムにおいてこれらの酵素を過発現させたり、ある
いはこれらの酵素の発現を抑制したりするように用いることが出来る。例えば、
本発明の遺伝子を含むベクターは生物中のケトカロチノイドの量を増加させそれ
によって栄養あるいは商品価値または生物の薬理を変えるように使うことが出来
る。本発明の遺伝子を含むベクターはまた生物中のカロチノイド生成を修飾する
ために用いることが出来る。
されるとホスト細胞発現システムにおいてこれらの酵素を過発現させたり、ある
いはこれらの酵素の発現を抑制したりするように用いることが出来る。例えば、
本発明の遺伝子を含むベクターは生物中のケトカロチノイドの量を増加させそれ
によって栄養あるいは商品価値または生物の薬理を変えるように使うことが出来
る。本発明の遺伝子を含むベクターはまた生物中のカロチノイド生成を修飾する
ために用いることが出来る。
【００２１】 したがって、本発明はホスト細胞においてケトカロチノイドを生成する方法を
含む、本方法は カタラーゼ酵素活性を有するタンパク質をエンコードしそして（１）SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいは（２）アミノ酸SEQ SEQＩＤ ＮＯ：２または４を
エンコードするシーケンスから成る異種核酸シーケンス、ここにおいてその異種
核酸シーケンスは機能的にプロモーターに結合している、から成るベクターをホ
スト細胞に挿入し、異種核酸シーケンスを発現してそれによってケトカロチノイ
ドを生成することから成る。
含む、本方法は カタラーゼ酵素活性を有するタンパク質をエンコードしそして（１）SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいは（２）アミノ酸SEQ SEQＩＤ ＮＯ：２または４を
エンコードするシーケンスから成る異種核酸シーケンス、ここにおいてその異種
核酸シーケンスは機能的にプロモーターに結合している、から成るベクターをホ
スト細胞に挿入し、異種核酸シーケンスを発現してそれによってケトカロチノイ
ドを生成することから成る。
【００２２】 本発明はホスト細胞中におけるカロチノイドの生成を変換されていないホスト
細胞に対して相対的に修飾する方法を含む、本方法は すでにカロチノイドを生成しているホスト細胞にケタラーゼ酵素活性を有する
タンパク質をエンコードしそして（１）SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいは（
２）SEQＩＤ ＮＯ：２または４のアミノ酸シーケンスをエンコードするシーケ
ンスから成る異種核酸シーケンスから成るベクターを挿入する、ここにおいて異
種核酸シーケンスは機能的にプロモーターと結合している、そしてホスト細胞内
で異種核酸シーケンスを発現させてホスト細胞中におけるカロチノイドの生成を
変換されていないホスト細胞に対して相対的に修飾する。
細胞に対して相対的に修飾する方法を含む、本方法は すでにカロチノイドを生成しているホスト細胞にケタラーゼ酵素活性を有する
タンパク質をエンコードしそして（１）SEQＩＤ ＮＯ：１または３あるいは（
２）SEQＩＤ ＮＯ：２または４のアミノ酸シーケンスをエンコードするシーケ
ンスから成る異種核酸シーケンスから成るベクターを挿入する、ここにおいて異
種核酸シーケンスは機能的にプロモーターと結合している、そしてホスト細胞内
で異種核酸シーケンスを発現させてホスト細胞中におけるカロチノイドの生成を
変換されていないホスト細胞に対して相対的に修飾する。
【００２３】 用語“生成を修飾”は生成されるカロチノイドの量を非変換細胞と比較して増
減または同じにすることが出来ることを意味する。本発明の一つの具体例による
とカロチノイドのメークアップ（すなわち生成されるカロチノイドのタイプ）が
互いに相対して変わる、そしてこのメークアップの変化は細胞で生成されるカロ
チノイドの量のネット増、ネット減または変化なしの結果となる。本発明の他の
具体例によればカロチノイド（またはその形成を触媒する酵素）の生成または生
化学的活性はケタラーゼ酵素エンコード核酸を挿入することによって促進される
。さらにその他の具体例においてはカロチノイドの生成または生化学的活性（ま
たはその形成を触媒する酵素）はこの技術に習熟して者が利用しうる多くの異な
った方法で減少させたり妨害したりする事が出来うる。その方法はアンチセンス
（例えばGray et al., (1992),Plant Mol. Biol. 19:69-87）、リボゾーム（例
えばWegener et al., (1994), Mol. Gen. Gent. 1994 Nov. 15:245(4);465-470
）、共抑制（（例えばFray et al., (1993) Plant Mol. Biol.,22:589-602）遺
伝子の標的分裂（例えばSchaefer et al., Plant J., 11;1195-1206, 1997））
、細胞内抗生物質（例えばRondon et al. (1997) Annu Rev.Microbiol. 61:257-
283）のような、あるいは本発明の核酸シーケンスまたはそれによってエンコー
ドされた酵素の知識または有用性に基づいたその他のあらゆるアプローチを含む
がそれに限定されるものではない。
減または同じにすることが出来ることを意味する。本発明の一つの具体例による
とカロチノイドのメークアップ（すなわち生成されるカロチノイドのタイプ）が
互いに相対して変わる、そしてこのメークアップの変化は細胞で生成されるカロ
チノイドの量のネット増、ネット減または変化なしの結果となる。本発明の他の
具体例によればカロチノイド（またはその形成を触媒する酵素）の生成または生
化学的活性はケタラーゼ酵素エンコード核酸を挿入することによって促進される
。さらにその他の具体例においてはカロチノイドの生成または生化学的活性（ま
たはその形成を触媒する酵素）はこの技術に習熟して者が利用しうる多くの異な
った方法で減少させたり妨害したりする事が出来うる。その方法はアンチセンス
（例えばGray et al., (1992),Plant Mol. Biol. 19:69-87）、リボゾーム（例
えばWegener et al., (1994), Mol. Gen. Gent. 1994 Nov. 15:245(4);465-470
）、共抑制（（例えばFray et al., (1993) Plant Mol. Biol.,22:589-602）遺
伝子の標的分裂（例えばSchaefer et al., Plant J., 11;1195-1206, 1997））
、細胞内抗生物質（例えばRondon et al. (1997) Annu Rev.Microbiol. 61:257-
283）のような、あるいは本発明の核酸シーケンスまたはそれによってエンコー
ドされた酵素の知識または有用性に基づいたその他のあらゆるアプローチを含む
がそれに限定されるものではない。
【００２４】 本発明によるホストシステムは好ましくはカロチノイドを生成する、あるいは
すでに生成している任意の生物から成る。このような生物には植物、藻、ある種
のバクテリア、シアノバクテリアおよびその他の光合成バクテリアを含む。本発
明によるベクターによるこれらのホストの変換は標準的な技術を用いて行うこと
が出来る。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y, 1989, Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wi
ley Interscience, New York, 1991参照。
すでに生成している任意の生物から成る。このような生物には植物、藻、ある種
のバクテリア、シアノバクテリアおよびその他の光合成バクテリアを含む。本発
明によるベクターによるこれらのホストの変換は標準的な技術を用いて行うこと
が出来る。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y, 1989, Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wi
ley Interscience, New York, 1991参照。
【００２５】 代わりに本発明の核酸シーケンスを含む遺伝子導入生物を作ることが出来る。
これらのシーケンスの導入はホスト細胞内でカロチノイドの生合成、含有量また
は組成を調節することを可能にする。これらの遺伝子導入システムは本発明の種
々の核酸シーケンスの過発現を許容するシーケンスを導入するために形成するこ
とができる。本発明の種々の核酸シーケンスのアンダー発現を許容する遺伝子導
入システムを形成することもできる。このようなシステムは本発明の核酸シーケ
ンスのアンチセンス発現を含む。このようなアンチセンス発現は有意なＤＮＡに
よってエンコードされた酵素の基質の集積する結果になるだろう。
これらのシーケンスの導入はホスト細胞内でカロチノイドの生合成、含有量また
は組成を調節することを可能にする。これらの遺伝子導入システムは本発明の種
々の核酸シーケンスの過発現を許容するシーケンスを導入するために形成するこ
とができる。本発明の種々の核酸シーケンスのアンダー発現を許容する遺伝子導
入システムを形成することもできる。このようなシステムは本発明の核酸シーケ
ンスのアンチセンス発現を含む。このようなアンチセンス発現は有意なＤＮＡに
よってエンコードされた酵素の基質の集積する結果になるだろう。
【００２６】 この発明を一般的に説明した後は、説明のためにのみ準備され特に特定しない
限り限定する意図のないいくつかの特定の例を参照することによってさらなる理
解が得られる。
限り限定する意図のないいくつかの特定の例を参照することによってさらなる理
解が得られる。
【００２７】 （実施例 １） ケトカロチノイド状のスペクトルを有する化合物にβ-タカロチンを転換する
植物相補DNAの分離 黄色カロチノイド顔料β−カロチンを蓄積するために構築したEscherichia co
liの菌株に植物Adonis eastivalisからの花の相補DNAライブラリを導入した(Cun
ningham et al., Plant Cell 8: 1613 - 26, 1996参照)。このE. coliの菌株は
、通常、菌株を固形寒天培地に広げると黄色のコロニーを生成する。β−カロチ
ンから誘導したエチネノン(echinenone)及びカンタキサンチン(図１)等のケトカ
ロチノイドは、これと対照的に、色がオレンジ色からオレンジレッド色である。
色が黄色より寧ろオレンジであるコロニーを目視で選別し、これらのコロニーに
含まれているプラスミド・ベクトル内のAdonis eastivalis相補DNAのDNAシーケ
ンスを確認した。２つの別個の相補DNAが約10の選別されたコロニーから得たプ
ラスミド中の相補DNAインサートの分析から得られた。これら２つのケトラーゼ
相補DNAのDNAシーケンスをここに提示する。
植物相補DNAの分離 黄色カロチノイド顔料β−カロチンを蓄積するために構築したEscherichia co
liの菌株に植物Adonis eastivalisからの花の相補DNAライブラリを導入した(Cun
ningham et al., Plant Cell 8: 1613 - 26, 1996参照)。このE. coliの菌株は
、通常、菌株を固形寒天培地に広げると黄色のコロニーを生成する。β−カロチ
ンから誘導したエチネノン(echinenone)及びカンタキサンチン(図１)等のケトカ
ロチノイドは、これと対照的に、色がオレンジ色からオレンジレッド色である。
色が黄色より寧ろオレンジであるコロニーを目視で選別し、これらのコロニーに
含まれているプラスミド・ベクトル内のAdonis eastivalis相補DNAのDNAシーケ
ンスを確認した。２つの別個の相補DNAが約10の選別されたコロニーから得たプ
ラスミド中の相補DNAインサートの分析から得られた。これら２つのケトラーゼ
相補DNAのDNAシーケンスをここに提示する。
【００２８】 Eschericia coliの菌株を蓄積したβ−カロチンをもって表現される本発明の
ケトラーゼによって生成される生成物については、未だ、同定していない。基質
β−カロチンの他に、５種又は６種もの色付きバンドがC18 TLC分離によって容
易に識別できる（図３参照）。同定に役立てるための適切な基準を提供するため
に、H. pluvialisケトラーゼ及びアラビドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラ
ーゼを別個にE. coli蓄積β−カロチンに導入して、エチネノン(3-ケト-β,β-
カロチン)及びカンタキサンチン(3,3-ジケト-β,β-カロチン)又はβ−クリプト
キサンチン(4-ヒドロキシ-β,β-カロチン)及びゼアキサンチン(zeaxanthin)(4,
4’-ジヒドロキシ-β,β-カロチン)を生成した。本発明のケトラーゼの存在下で
形成した化合物は、いずれも、（本発明の別個の２つの核酸シーケンスの存在下
で形成された生成物には相違点は認められなかったが）TLCシステム中を移動せ
ず、エチネノン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン又はゼアキサンチ
ンについて予測されるような吸水スペクトルを有していない。アドニス・ケトラ
ーゼ相補DNAの存在下で生成した色付きのTLCバンドの内の2つがオレンジ色であ
る。オレンジ色のバンド＃１は、カンタキサンチンの吸水スペクトルに類似の吸
水スペクトルを有している(図４参照)が、エチネノン及びβ−カロチンへの中間
にある極性を示している位置で移動する。オレンジ色バンド＃２もまた、カンタ
キサンチンの吸水スペクトルに類似の吸水スペクトルを有しているが、カンタキ
サンチン及びゼアキサンチンへの中間にある極性を示す位置で移動する(図２参
照)。この吸水スペクトルとTLCの結果は、これら２つのオレンジ色生成物が双方
の環の3-4の位置で(3,4-ジデヒドロ；図２参照)非飽和になる可能性があること
を示唆している。オレンジ色バンド＃１(図３参照)は、次いで、3,4,3’,4’-テ
トラデヒドロ-β,β-カロチンに成る可能性がある。基質β−カロチンの吸水ス
ペクトルに実質的に影響を与えるために、如何なる変性も、発色団を構成する炭
素−炭素二重結合の共役鎖をもった共役状態にある炭素に関わる可能性が高い(G
oodwin, 1980: The Biochemistry of the Carotenoids, volume 1: 2nd edition
, Chapman and Hill)。得たスペクトルを見ると、2つの環の4の位置の炭素だけ
が変性の位置として妥当と思われる位置である。しかし、左右対称のβ−カロチ
ンから生成した黄色及びオレンジ色の生成物の数とTLC移動から見ても、本発明
の酵素が1つを超える反応を実施するものであることが判る。本発明のケトラー
ゼのアラビドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラーゼとの見掛けの相同関係か
らしても、一方の環の又は双方の環の３及び/又は４の位置にヒドロキシル基を
有する化合物が別の生成物である可能性があることを示唆している(図２参照)。
事実、かかる化合物は、アドニス(上記参照)において同定されており、４の位置
のヒドロキシル基が4-ケト(例えば、ロブスターの外骨格においてアスタキサン
チンの前駆物質と成る可能性がある3,3’,4,4’-テトラヒドロキシ・カロチノイ
ドである クルスタキサンチン(crustaxanthin))の形成における中間体であると
いうことが長い間推測されて来ている。ヒドロキシラーゼ酵素とケトラーゼ酵素
とに共通のヒスチジン・モチーフ(histidine motif)と二次構造とは、その構成
要素が非飽和物の例を含む二鉄酵素添加酵素の大きなグループの特徴であり(J.
Shanklin, 1998, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.)、従って、3-4
非飽和(及び/又は恐らく黄色化合物の１種以上の2-3非飽和)も妥当な生成物であ
ると考えられる。
ケトラーゼによって生成される生成物については、未だ、同定していない。基質
β−カロチンの他に、５種又は６種もの色付きバンドがC18 TLC分離によって容
易に識別できる（図３参照）。同定に役立てるための適切な基準を提供するため
に、H. pluvialisケトラーゼ及びアラビドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラ
ーゼを別個にE. coli蓄積β−カロチンに導入して、エチネノン(3-ケト-β,β-
カロチン)及びカンタキサンチン(3,3-ジケト-β,β-カロチン)又はβ−クリプト
キサンチン(4-ヒドロキシ-β,β-カロチン)及びゼアキサンチン(zeaxanthin)(4,
4’-ジヒドロキシ-β,β-カロチン)を生成した。本発明のケトラーゼの存在下で
形成した化合物は、いずれも、（本発明の別個の２つの核酸シーケンスの存在下
で形成された生成物には相違点は認められなかったが）TLCシステム中を移動せ
ず、エチネノン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン又はゼアキサンチ
ンについて予測されるような吸水スペクトルを有していない。アドニス・ケトラ
ーゼ相補DNAの存在下で生成した色付きのTLCバンドの内の2つがオレンジ色であ
る。オレンジ色のバンド＃１は、カンタキサンチンの吸水スペクトルに類似の吸
水スペクトルを有している(図４参照)が、エチネノン及びβ−カロチンへの中間
にある極性を示している位置で移動する。オレンジ色バンド＃２もまた、カンタ
キサンチンの吸水スペクトルに類似の吸水スペクトルを有しているが、カンタキ
サンチン及びゼアキサンチンへの中間にある極性を示す位置で移動する(図２参
照)。この吸水スペクトルとTLCの結果は、これら２つのオレンジ色生成物が双方
の環の3-4の位置で(3,4-ジデヒドロ；図２参照)非飽和になる可能性があること
を示唆している。オレンジ色バンド＃１(図３参照)は、次いで、3,4,3’,4’-テ
トラデヒドロ-β,β-カロチンに成る可能性がある。基質β−カロチンの吸水ス
ペクトルに実質的に影響を与えるために、如何なる変性も、発色団を構成する炭
素−炭素二重結合の共役鎖をもった共役状態にある炭素に関わる可能性が高い(G
oodwin, 1980: The Biochemistry of the Carotenoids, volume 1: 2nd edition
, Chapman and Hill)。得たスペクトルを見ると、2つの環の4の位置の炭素だけ
が変性の位置として妥当と思われる位置である。しかし、左右対称のβ−カロチ
ンから生成した黄色及びオレンジ色の生成物の数とTLC移動から見ても、本発明
の酵素が1つを超える反応を実施するものであることが判る。本発明のケトラー
ゼのアラビドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラーゼとの見掛けの相同関係か
らしても、一方の環の又は双方の環の３及び/又は４の位置にヒドロキシル基を
有する化合物が別の生成物である可能性があることを示唆している(図２参照)。
事実、かかる化合物は、アドニス(上記参照)において同定されており、４の位置
のヒドロキシル基が4-ケト(例えば、ロブスターの外骨格においてアスタキサン
チンの前駆物質と成る可能性がある3,3’,4,4’-テトラヒドロキシ・カロチノイ
ドである クルスタキサンチン(crustaxanthin))の形成における中間体であると
いうことが長い間推測されて来ている。ヒドロキシラーゼ酵素とケトラーゼ酵素
とに共通のヒスチジン・モチーフ(histidine motif)と二次構造とは、その構成
要素が非飽和物の例を含む二鉄酵素添加酵素の大きなグループの特徴であり(J.
Shanklin, 1998, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.)、従って、3-4
非飽和(及び/又は恐らく黄色化合物の１種以上の2-3非飽和)も妥当な生成物であ
ると考えられる。
【００２９】 本発明のアドニス・ケトラーゼのこの実施例の結果を要約すると、ケトカロチ
ノイド状のスペクトルをもった2つのカロチノイドを含む幾つかの異なるカロチ
ノイドが本発明の2つの異なる核酸のいずれかの生成物の作用を介してβ−カロ
チンから生成される。これらのオレンジ色化合物が主たる生成物であると思われ
る。相補DNAのベクトルpTrcHls(インビトロゲン(invitrogen))中のより強力なプ
ロモータへのトランケージョン及びフュージョンは、E. coliの成長には害とな
ったが、最も極性の高いオレンジ色生成物(図３のオレンジ色バンド＃２)の収率
の改良を齎した。藍色細菌性フェレドキシンを導入しても、種々の生成物の収率
又は相対的数量に変化はなかった。理論に縛られることがなければ、アドニスの
花弁に生成されるケトカロチノイドには実際には本発明の核酸を用いてE. coli
において生成される未だ同定されていないオレンジ色の化合物が含まれると言え
るようである。
ノイド状のスペクトルをもった2つのカロチノイドを含む幾つかの異なるカロチ
ノイドが本発明の2つの異なる核酸のいずれかの生成物の作用を介してβ−カロ
チンから生成される。これらのオレンジ色化合物が主たる生成物であると思われ
る。相補DNAのベクトルpTrcHls(インビトロゲン(invitrogen))中のより強力なプ
ロモータへのトランケージョン及びフュージョンは、E. coliの成長には害とな
ったが、最も極性の高いオレンジ色生成物(図３のオレンジ色バンド＃２)の収率
の改良を齎した。藍色細菌性フェレドキシンを導入しても、種々の生成物の収率
又は相対的数量に変化はなかった。理論に縛られることがなければ、アドニスの
花弁に生成されるケトカロチノイドには実際には本発明の核酸を用いてE. coli
において生成される未だ同定されていないオレンジ色の化合物が含まれると言え
るようである。
【００３０】 （実施例 ２） アドニス・ケトラーゼの基質特異性 ε環を有するカロチノイドは、植物に通常存在するものである。このε環は、
環の中の二重結合の位置にしかないβ環とは異なる(図２)。このε環は、アラビ
ドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラーゼの基質としては劣悪であると報告さ
れている(Sun et al., 1996)。１つ又は２つのε環を有するカロチノイド(d-カ
ロチン及びε-カロチン)又はアクリル・カロチノイド・リコピンを蓄積するよう
に構成したE. coliの菌株(Cunningham et al., 1996)にアドニス・ケトラーゼ相
補DNAを導入した。アセトン抽出物をTLC分析したところ、形成された新規の生成
物が存在しないことが示している通り、これらのカロチノイドがアドニス・ケト
ラーゼによっては変性されないことが判明した。ゼアキサンチンを蓄積するよう
に構成したE. coli (Sun et al., 1996)において生成された生成物は、培養液を
蓄積したβ−カロチンの場合と同じであると思われ、このことは、3-OHがアドニ
ス・ケトラーゼによってβ環に導入された官能基の一つである可能性が高いこと
を示していると見られる。従って、アドニス・ケトラーゼの作用によってβ環に
導入された極性が比較的高いオレンジ色バンド(例えば、図３のオレンジ色バン
ド２)は、3,3’-ジヒドロキシ-3,4,3’,4’-テトラデヒドロ-b,b-カロチンであ
ると見てよいと思われる。
環の中の二重結合の位置にしかないβ環とは異なる(図２)。このε環は、アラビ
ドプシス・β−カロチン・ヒドロキシラーゼの基質としては劣悪であると報告さ
れている(Sun et al., 1996)。１つ又は２つのε環を有するカロチノイド(d-カ
ロチン及びε-カロチン)又はアクリル・カロチノイド・リコピンを蓄積するよう
に構成したE. coliの菌株(Cunningham et al., 1996)にアドニス・ケトラーゼ相
補DNAを導入した。アセトン抽出物をTLC分析したところ、形成された新規の生成
物が存在しないことが示している通り、これらのカロチノイドがアドニス・ケト
ラーゼによっては変性されないことが判明した。ゼアキサンチンを蓄積するよう
に構成したE. coli (Sun et al., 1996)において生成された生成物は、培養液を
蓄積したβ−カロチンの場合と同じであると思われ、このことは、3-OHがアドニ
ス・ケトラーゼによってβ環に導入された官能基の一つである可能性が高いこと
を示していると見られる。従って、アドニス・ケトラーゼの作用によってβ環に
導入された極性が比較的高いオレンジ色バンド(例えば、図３のオレンジ色バン
ド２)は、3,3’-ジヒドロキシ-3,4,3’,4’-テトラデヒドロ-b,b-カロチンであ
ると見てよいと思われる。
【００３１】 本出願において引用されている文献は、以下に掲げる文献と併せて、引用をも
って本出願の一部とする。 Bouvier F, et al. (1998) キサントフィル生合成：ペッパーフルーツからのカ
ロチノイド・ヒドロキシラーゼの分子及び機能上の特徴付け(Capsicum annuum L
.)。Biochim. Biophys. Acta. 1391: 320 - 8 Breitenbach J. et al. (1996) Escherichia coliにおける表現及びHaematococc
us pluvialisからのカロチン・ケトラーゼの特性。FEMS Microbiol Lett. 140 :
241 - 6 Cunningham FX Jr. Gantt E (1998) 植物におけるカロチノイド生合成の遺伝子
及び酵素。Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49 : 557 - 583 Fernandez - Gonzalez B, et al. (1997) 左右非対称に作用する新規のタイプの
β-カロチンがcyanobacterium Synechocystis sp. におけるエチネノン(echinen
one)の合成に必要である。PCC 6803. J. Biol Chem. 272 : 9728 - 33 Fraser PD, et al. (1997) アスタキサンチン生合成酵素のインヴィトロ特徴付
け。J Biol Chem. 1997272 : 6128 - 35 Fraser PD, et al. (1998) アスタキサンチン形成への経路に関係する反応の酵
素に関わる確認について、インヴィトロ・アッセイにおける直接基質を用いて解
説したもの。Eur J Biochem. 252 : 229 - 36 Harker M, et al. (1997) β-C-4-酵素添加酵素について藻類遺伝子を表現する
形質転換藍色細菌におけるケトカロチノイドの生合成、crt O. FEBS Lett. 404
: 129 - 34 Kajiwara S, et al. (1995) Haematococcus pluvialisからのアスタキサンチン
の生合成及びEscherichia coliにおけるアスタキサンチンの合成のための新規の
相補DNAの分離及び機能同定。Plant Mol Biol. 29 : 343 - 52 Lotan T, et al. (1995) Haematococcus pluvialisにおいてβ−カロチンをケト
カロチノイド・カンタキサンチンに変換するβ-C-4-酵素添加酵素をコード化す
る遺伝子のEscherichia coliでのクローン化及び表現。FEBS Lett 364 : 125 -
8 Misawa N, et al. (1995)単一の遺伝子によって炭化水素β−カロチンにおける
メチレンのケト基への変換によるカンタキサンチンの生合成。Biochem Biophys
Res Commun. 209 : 867 - 76 Misawa N, et al. (1995) 海洋バクテリア・カロチノイド生合成遺伝子クラスタ
の構造及び機能分析並びに遺伝子レベルにおいて提案されているアスタキサンチ
ン生合成経路。J Bacteriol. 177 : 6575 - 84 Miura Y, et al. (1998) 食品イーストCandida utilisにおけるカロチノイド・
リコピン、β−カロチン及びアスタキサンチンの生成。Appl Environ Microbiol
. 64 : 1226 - 9 Shanklin J, et al. (1997) アルカリΩ−ヒドロキシラーゼのメスバウアー研究
：一体膜(integral membrane)酵素中の二鉄クラスターの存在の証拠。Proc Natl
Acad Sci U S A, 94 : 2981 - 6 Shanklin J, Cahoon EB (1998) 脂肪酸の非飽和及び関連の変性。Ann Rev Plant
Physiol Plant Mol Bio 49 : 611 - 641 Wang CW, et al. 構築したイソプレノイド経路はEscherichia coliにおけるアス
タキサンチンの生成を強化する。Biotechol Bioeng. 1999 Jan 20 : 62 (2) : 2
35 - 41
って本出願の一部とする。 Bouvier F, et al. (1998) キサントフィル生合成：ペッパーフルーツからのカ
ロチノイド・ヒドロキシラーゼの分子及び機能上の特徴付け(Capsicum annuum L
.)。Biochim. Biophys. Acta. 1391: 320 - 8 Breitenbach J. et al. (1996) Escherichia coliにおける表現及びHaematococc
us pluvialisからのカロチン・ケトラーゼの特性。FEMS Microbiol Lett. 140 :
241 - 6 Cunningham FX Jr. Gantt E (1998) 植物におけるカロチノイド生合成の遺伝子
及び酵素。Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49 : 557 - 583 Fernandez - Gonzalez B, et al. (1997) 左右非対称に作用する新規のタイプの
β-カロチンがcyanobacterium Synechocystis sp. におけるエチネノン(echinen
one)の合成に必要である。PCC 6803. J. Biol Chem. 272 : 9728 - 33 Fraser PD, et al. (1997) アスタキサンチン生合成酵素のインヴィトロ特徴付
け。J Biol Chem. 1997272 : 6128 - 35 Fraser PD, et al. (1998) アスタキサンチン形成への経路に関係する反応の酵
素に関わる確認について、インヴィトロ・アッセイにおける直接基質を用いて解
説したもの。Eur J Biochem. 252 : 229 - 36 Harker M, et al. (1997) β-C-4-酵素添加酵素について藻類遺伝子を表現する
形質転換藍色細菌におけるケトカロチノイドの生合成、crt O. FEBS Lett. 404
: 129 - 34 Kajiwara S, et al. (1995) Haematococcus pluvialisからのアスタキサンチン
の生合成及びEscherichia coliにおけるアスタキサンチンの合成のための新規の
相補DNAの分離及び機能同定。Plant Mol Biol. 29 : 343 - 52 Lotan T, et al. (1995) Haematococcus pluvialisにおいてβ−カロチンをケト
カロチノイド・カンタキサンチンに変換するβ-C-4-酵素添加酵素をコード化す
る遺伝子のEscherichia coliでのクローン化及び表現。FEBS Lett 364 : 125 -
8 Misawa N, et al. (1995)単一の遺伝子によって炭化水素β−カロチンにおける
メチレンのケト基への変換によるカンタキサンチンの生合成。Biochem Biophys
Res Commun. 209 : 867 - 76 Misawa N, et al. (1995) 海洋バクテリア・カロチノイド生合成遺伝子クラスタ
の構造及び機能分析並びに遺伝子レベルにおいて提案されているアスタキサンチ
ン生合成経路。J Bacteriol. 177 : 6575 - 84 Miura Y, et al. (1998) 食品イーストCandida utilisにおけるカロチノイド・
リコピン、β−カロチン及びアスタキサンチンの生成。Appl Environ Microbiol
. 64 : 1226 - 9 Shanklin J, et al. (1997) アルカリΩ−ヒドロキシラーゼのメスバウアー研究
：一体膜(integral membrane)酵素中の二鉄クラスターの存在の証拠。Proc Natl
Acad Sci U S A, 94 : 2981 - 6 Shanklin J, Cahoon EB (1998) 脂肪酸の非飽和及び関連の変性。Ann Rev Plant
Physiol Plant Mol Bio 49 : 611 - 641 Wang CW, et al. 構築したイソプレノイド経路はEscherichia coliにおけるアス
タキサンチンの生成を強化する。Biotechol Bioeng. 1999 Jan 20 : 62 (2) : 2
35 - 41
【配列表】
本発明のより完全な評価とそれに伴う利得の多くは、以下の図面に関連して考
察されたとき以下の詳細な記述を参照することによってよりよく理解されるよう
になるので、容易に得られるであろう。 図１は構造とｂ−カロチンから本文に引用されている種々のケトカロチノイド
に導く生化学的道筋を図示している。β−カロチンのヒドロキシラーゼ酵素（Ｈ
ｙ）およびケタラーゼ酵素（ｋｅｔｏ）によるアスタキサンチンへの変換は反応
の順序に応じて複数の可能な道筋の一つまたはすべてを経由して進行しうる。 図２はｂ−カロチンのベータ環構造とＡ．エスチバリスケトラーゼ ｃＤＮＡ
の生成物の作用によって生成されうるこの母環の種々の修飾型を示す。また、Ａ
．エスチバリスケトラーゼに対する基質ではなくてｄ−カロチン、ｅ−カロチン
、ａ−カロチンおよびルテインのようなカロチノイドに存在するエプシロン（ep
silon）環の構造も示されている。 図３は、以前にｂ−カロチンを生成するために設計されたが今はＡ．エスチバリ
スケトラーゼ ｃＤＮＡおよび／またはその他の導入遺伝子とｃＤＮＡを含むＥ
．ｃｏｌｉ培養物から抽出されたカロチノイド色素のＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）分離で得られた結果を示す。図は空のプラスミドベクター ｐブルース
クリプトＳＫ−（ＳＫ−）、このプラスミドベクター中のアドニスＡ．エスチバ
リスケトラーゼ ｃＤＮＡ（Ａｄ ｋｅｔｏ１）、このプラスミドベクター中の
ヘマトコッコスプルビアリスケトラーゼ ｃＤＮＡ（ＨＰｋｅｔｏ）、あるいは
アラビドプシス β−カロチンヒドロキシラーゼ ｃＤＮＡ（Ａｔ Ｏｈａｓｅ
）を示す。オレンジ色のバンドはここでは黄色のバンドよりも暗く示されている
。種々のバンドの同定はバンドの右に示されている。 図４はアドニスケトラーゼの作用によってｂ−カロチンから生成したオレンジ
カロチノイドの一つの吸収スペクトルを示していてカンサキサンチンのスペクト
ルとの同一性を明らかにしている。（アセトン中の）β−カロチン、カンサキサ
ンチンおよびアドニスＡ．エスチバリスケトラーゼ ｃＤＮＡ（SEQＩＤ ＮＯ
：１）を、そうしなければβ−カロチンを生成して集積するＥ．ｃｏｌｉの細胞
に導入した後培養物から抽出した未知のオレンジ色の生成物（オレンジバンド＃
１；図３の第１列の下側のオレンジバンド）の吸収スペクトル。未知物質の吸収
スペクトルはカンサキサンチンに似ているがこの化合物はメタノール：アセトン
（１：１容積比）の移動相で展開したＲＰ１３ ＴＬＣ板でエチネノンの下の位
置に移動している。オレンジバンド＃２の吸収スペクトルもカンサキサンチンに
似ているがカンサキサンチンよりも早く移動し多分より極性の化合物であること
を示している。 図５はSEQＩＤ ＮＯ：５を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：１およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターの多重
クローニングサイト（ＭＣＳ）からのフランクＤＮＡのいくつかを含む、そのシ
ーケンスは太字で示されている）。 図６はSEQＩＤ ＮＯ：６を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：２およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターおよび
プラスミドベクターｐＴｒｃＨｉｓからの開始コドンの多重クローニングサイト
（ＭＣＳ）からのアミノ酸遷移を含む、そのシーケンスは太字で示されている）
。 図７はSEQＩＤ ＮＯ：７を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：３およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターの多重
クローニングサイト（ＭＣＳ）からのフランクＤＮＡのいくつかを含む、そのシ
ーケンスは太字で示されている）。 図８はSEQＩＤ ＮＯ：８（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ ＮＯ：４
およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターおよびプラス
ミドベクターからの開始コドンの多重クローニングサイト（ＭＣＳ）からのアミ
ノ酸遷移を含む、そのシーケンスは太字で示されている）。 図９は本発明の２つのアドニスケトラーゼ シーケンスの“ギャップ”配列を
示す。SEQＩＤ ＮＯ：１の平頭バージョンが比較のためにこの図に示されてい
てSEQＩＤ ＮＯ：９と示されている。同一性率は９１．１０７と算出された。 図１０はSEQＩＤ ＮＯ：２と４の“ギャップ”を示す。以下の結果が得られ
た。 ギャップウエイト： １２ 平均マッチ： ２．９１２ 長さウエイト： ４ 平均ミスマッチ：−２．００３ 質（Quality）： 1440 長さ： ３０７ 比率： ４．６９１ ギャップ： ０ 類似率： ９２．１８２ 同一性率： ９０．２２８ 図１１はSEQＩＤ ＮＯ：２とアラビドプシスタリアナ β−カロチンヒドロ
キシダーゼ酵素（GenBank U58919）(SEQＩＤ ＮＯ：１0)の比較を示す。 図１２ＡはSEQＩＤ ＮＯ：３のｃＤＮＡのすぐ上流のｇＤＮＡ（SEQＩＤ Ｎ
Ｏ：１１）を示す。このシーケンスはClontech Laboratory のGenomeWalker キ
ットを用いて発生されたＰＣＲ生成物とアドニス エスチバリスのケトラーゼに
特有のネストプライマー（cagaatcggtctgttctattagttcttcc（SEQＩＤ ＮＯ：１
７）およびcaatttgaggaatatcaaggttccttgttctc（SEQＩＤ ＮＯ：１８））から
得られた。開始コドン（２０４−２０６位置におけるＴＡＡ）の上流のフレーム
内の終端コドンは太字で示されている。開始コドン（ＡＴＧ）もまた太字で示さ
れている。 図１２Ｂ（SEQＩＤ ＮＯ：１２）はSEQＩＤ ＮＯ：４の全長ポリペプタイド
は図８に示されるケトラーゼシーケンスにすぐに先行するアミノ酸ＭＡＡ（太字
で示す）で始まる。SEQＩＤ ＮＯ：１にすぐ先行する同様のＭＡＡアミノ酸シ
ーケンスもまた期待される。 図１３はSEQＩＤ ＮＯ：２，SEQＩＤ ＮＯ：１２，アラビドプシス β−カ
ロチンヒドロキシラーゼ酵素（GenBank U58919）が予言した生成物）（SEQＩＤ
ＮＯ：１３）、遺伝子ＤＮＡシーケンス（GenBank AB025606；エクソン／イン
トロン接合が）アラビドプシス β−カロチンヒドロキシラーゼ ｃＤＮＡ ｕ
５８９１９）（SEQＩＤ ＮＯ：１４）によって予測される想像上の第２のアラ
ビドプシスヒドロキシラーゼそして２つのカプシカムアンヌームβ−カロチンヒ
ドロキシラーゼ（GenBank Y09722およびY09225）（SEQＩＤ ＮＯ：１５および
１６）が予測する化合物、を示す。
察されたとき以下の詳細な記述を参照することによってよりよく理解されるよう
になるので、容易に得られるであろう。 図１は構造とｂ−カロチンから本文に引用されている種々のケトカロチノイド
に導く生化学的道筋を図示している。β−カロチンのヒドロキシラーゼ酵素（Ｈ
ｙ）およびケタラーゼ酵素（ｋｅｔｏ）によるアスタキサンチンへの変換は反応
の順序に応じて複数の可能な道筋の一つまたはすべてを経由して進行しうる。 図２はｂ−カロチンのベータ環構造とＡ．エスチバリスケトラーゼ ｃＤＮＡ
の生成物の作用によって生成されうるこの母環の種々の修飾型を示す。また、Ａ
．エスチバリスケトラーゼに対する基質ではなくてｄ−カロチン、ｅ−カロチン
、ａ−カロチンおよびルテインのようなカロチノイドに存在するエプシロン（ep
silon）環の構造も示されている。 図３は、以前にｂ−カロチンを生成するために設計されたが今はＡ．エスチバリ
スケトラーゼ ｃＤＮＡおよび／またはその他の導入遺伝子とｃＤＮＡを含むＥ
．ｃｏｌｉ培養物から抽出されたカロチノイド色素のＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）分離で得られた結果を示す。図は空のプラスミドベクター ｐブルース
クリプトＳＫ−（ＳＫ−）、このプラスミドベクター中のアドニスＡ．エスチバ
リスケトラーゼ ｃＤＮＡ（Ａｄ ｋｅｔｏ１）、このプラスミドベクター中の
ヘマトコッコスプルビアリスケトラーゼ ｃＤＮＡ（ＨＰｋｅｔｏ）、あるいは
アラビドプシス β−カロチンヒドロキシラーゼ ｃＤＮＡ（Ａｔ Ｏｈａｓｅ
）を示す。オレンジ色のバンドはここでは黄色のバンドよりも暗く示されている
。種々のバンドの同定はバンドの右に示されている。 図４はアドニスケトラーゼの作用によってｂ−カロチンから生成したオレンジ
カロチノイドの一つの吸収スペクトルを示していてカンサキサンチンのスペクト
ルとの同一性を明らかにしている。（アセトン中の）β−カロチン、カンサキサ
ンチンおよびアドニスＡ．エスチバリスケトラーゼ ｃＤＮＡ（SEQＩＤ ＮＯ
：１）を、そうしなければβ−カロチンを生成して集積するＥ．ｃｏｌｉの細胞
に導入した後培養物から抽出した未知のオレンジ色の生成物（オレンジバンド＃
１；図３の第１列の下側のオレンジバンド）の吸収スペクトル。未知物質の吸収
スペクトルはカンサキサンチンに似ているがこの化合物はメタノール：アセトン
（１：１容積比）の移動相で展開したＲＰ１３ ＴＬＣ板でエチネノンの下の位
置に移動している。オレンジバンド＃２の吸収スペクトルもカンサキサンチンに
似ているがカンサキサンチンよりも早く移動し多分より極性の化合物であること
を示している。 図５はSEQＩＤ ＮＯ：５を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：１およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターの多重
クローニングサイト（ＭＣＳ）からのフランクＤＮＡのいくつかを含む、そのシ
ーケンスは太字で示されている）。 図６はSEQＩＤ ＮＯ：６を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：２およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターおよび
プラスミドベクターｐＴｒｃＨｉｓからの開始コドンの多重クローニングサイト
（ＭＣＳ）からのアミノ酸遷移を含む、そのシーケンスは太字で示されている）
。 図７はSEQＩＤ ＮＯ：７を示す（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ Ｎ
Ｏ：３およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターの多重
クローニングサイト（ＭＣＳ）からのフランクＤＮＡのいくつかを含む、そのシ
ーケンスは太字で示されている）。 図８はSEQＩＤ ＮＯ：８（この図に示されるシーケンスはSEQＩＤ ＮＯ：４
およびアダプターＤＮＡおよびライブラリークローニングベクターおよびプラス
ミドベクターからの開始コドンの多重クローニングサイト（ＭＣＳ）からのアミ
ノ酸遷移を含む、そのシーケンスは太字で示されている）。 図９は本発明の２つのアドニスケトラーゼ シーケンスの“ギャップ”配列を
示す。SEQＩＤ ＮＯ：１の平頭バージョンが比較のためにこの図に示されてい
てSEQＩＤ ＮＯ：９と示されている。同一性率は９１．１０７と算出された。 図１０はSEQＩＤ ＮＯ：２と４の“ギャップ”を示す。以下の結果が得られ
た。 ギャップウエイト： １２ 平均マッチ： ２．９１２ 長さウエイト： ４ 平均ミスマッチ：−２．００３ 質（Quality）： 1440 長さ： ３０７ 比率： ４．６９１ ギャップ： ０ 類似率： ９２．１８２ 同一性率： ９０．２２８ 図１１はSEQＩＤ ＮＯ：２とアラビドプシスタリアナ β−カロチンヒドロ
キシダーゼ酵素（GenBank U58919）(SEQＩＤ ＮＯ：１0)の比較を示す。 図１２ＡはSEQＩＤ ＮＯ：３のｃＤＮＡのすぐ上流のｇＤＮＡ（SEQＩＤ Ｎ
Ｏ：１１）を示す。このシーケンスはClontech Laboratory のGenomeWalker キ
ットを用いて発生されたＰＣＲ生成物とアドニス エスチバリスのケトラーゼに
特有のネストプライマー（cagaatcggtctgttctattagttcttcc（SEQＩＤ ＮＯ：１
７）およびcaatttgaggaatatcaaggttccttgttctc（SEQＩＤ ＮＯ：１８））から
得られた。開始コドン（２０４−２０６位置におけるＴＡＡ）の上流のフレーム
内の終端コドンは太字で示されている。開始コドン（ＡＴＧ）もまた太字で示さ
れている。 図１２Ｂ（SEQＩＤ ＮＯ：１２）はSEQＩＤ ＮＯ：４の全長ポリペプタイド
は図８に示されるケトラーゼシーケンスにすぐに先行するアミノ酸ＭＡＡ（太字
で示す）で始まる。SEQＩＤ ＮＯ：１にすぐ先行する同様のＭＡＡアミノ酸シ
ーケンスもまた期待される。 図１３はSEQＩＤ ＮＯ：２，SEQＩＤ ＮＯ：１２，アラビドプシス β−カ
ロチンヒドロキシラーゼ酵素（GenBank U58919）が予言した生成物）（SEQＩＤ
ＮＯ：１３）、遺伝子ＤＮＡシーケンス（GenBank AB025606；エクソン／イン
トロン接合が）アラビドプシス β−カロチンヒドロキシラーゼ ｃＤＮＡ ｕ
５８９１９）（SEQＩＤ ＮＯ：１４）によって予測される想像上の第２のアラ
ビドプシスヒドロキシラーゼそして２つのカプシカムアンヌームβ−カロチンヒ
ドロキシラーゼ（GenBank Y09722およびY09225）（SEQＩＤ ＮＯ：１５および
１６）が予測する化合物、を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 23/00 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 23/00 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA80 CA04 CA07 DA01 DA05 DA11 EA01 EA03 EA04 FA02 GA11 4B050 CC01 CC03 DD13 LL01 LL02 4B064 AC37 AH01 CA01 CA08 CA11 CA19 CC24 DA01 DA10 DA16 4B065 AA01X AA57X AA83X AA88X AA88Y AB01 BA02 CA02 CA09 CA41 CA47 CA52 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 4H045 AA20 BA41 CA30 DA89 EA01 EA07 EA15 EA20 FA72 FA74
Claims (20)
- 【請求項１】 ホスト細胞においてケトカロチノイドを生成する方法であっ
て、 カタラーゼ酵素活性を有するタンパク質をエンコードしそして核酸SEQＩＤ
ＮＯ：１または３を持つ異種核酸シーケンス、ここにおいてその異種核酸シーケ
ンスは機能的にプロモーターに結合している、から成るベクターをホスト細胞に
挿入し、異種核酸シーケンスを発現してそれによってケトカロチノイドを生成す
ることから成ることを特徴とするケトカロチノイド生成方法。 - 【請求項２】 ホスト細胞はバクテリア細胞、藻細胞および植物細胞から成
るグループから選ばれることを特徴とする請求項１記載のケトカロチノイド生成
方法。 - 【請求項３】 ホスト細胞においてケトカロチノイドを生成する方法であっ
て、 カタラーゼ酵素活性を有するタンパク質をエンコードしそしてSEQＩＤ ＮＯ
：２または４のアミノ酸シーケンスをエンコードするシーケンスを持つ異種核酸
シーケンス、ここにおいてその異種核酸シーケンスは機能的にプロモーターに結
合している、から成るベクターをホスト細胞に挿入し、異種核酸シーケンスを発
現してそれによってケトカロチノイドを生成することを特徴とするケトカロチノ
イド生成方法。 - 【請求項４】 ホスト細胞はバクテリア細胞、藻細胞および植物細胞から成
るグループから選ばれることを特徴とする請求項３記載のケトカロチノイド生成
方法。 - 【請求項５】 ホスト細胞におけるカロチノイドの生成を非変換ホスト細胞
にたいして相対的に修飾する方法であって、 すでにカロチノイドを生成しているホスト細胞にケトラーゼ酵素活性を有する
タンパク質をエンコードし核酸SEQＩＤ ＮＯ：１または３を持つ異種核酸シー
ケンスをから成るベクターを挿入する、ここにおいて異種核酸は機能的にプロモ
ーターと結合している、そしてホスト細胞において異種核酸シーケンスを発現し
て非変換ホスト細胞にたいしてカロチノイドの生成を相対的に修飾することを特
徴とする修飾方法。 - 【請求項６】 ホスト細胞はバクテリア細胞、藻細胞および植物細胞から成
るグループから選ばれることを特徴とする請求項５記載の修飾方法。 - 【請求項７】 ホスト細胞におけるカロチノイドの生成を非変換ホスト細胞
にたいして相対的に修飾する方法であって、 すでにカロチノイドを生成しているホスト細胞にケトラーゼ酵素活性を有する
タンパク質をエンコードしアミノ酸SEQＩＤ ＮＯ：２または４をエンコードす
る異種核酸シーケンスをから成るベクターを挿入する、ここにおいて異種核酸は
機能的にプロモーターと結合している、そしてホスト細胞において異種核酸シー
ケンスを発現して非変換ホスト細胞にたいしてカロチノイドの生成を相対的に修
飾することを特徴とする修飾方法。 - 【請求項８】 ホスト細胞はバクテリア細胞、藻細胞および植物細胞から成
るグループから選ばれることを特徴とする請求項７記載の修飾方法。 - 【請求項９】 ケタラーゼ酵素活性を持つタンパク質をエンコードしSEQＩ
Ｄ ＮＯ：１の核酸シーケンスを持つ精製された核酸シーケンス。 - 【請求項１０】 ケタラーゼ酵素活性を持つタンパク質をエンコードしSEQ
ＩＤ ＮＯ：３の核酸シーケンスを持つ精製された核酸シーケンス。 - 【請求項１１】 ケタラーゼ酵素活性を持つタンパク質をエンコードしSEQ
ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸シーケンスをエンコードするシーケンスを持つ精製さ
れた核酸シーケンス。 - 【請求項１２】 ケタラーゼ酵素活性を持つタンパク質をエンコードしSEQ
ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸シーケンスをエンコードするシーケンスを持つ精製さ
れた核酸シーケンス。 - 【請求項１３】 請求項９から１２のいずれか一項記載の核酸シーケンスか
らなるベクターであって、核酸シーケンスはプロモーターと機能的に結合してい
ることを特徴とするベクター。 - 【請求項１４】 請求項１３記載のベクターにより変換されたことを特徴と
するホスト細胞。 - 【請求項１５】 請求項１４記載のホスト細胞であって、該ホスト細胞はバ
クテリア細胞、藻細胞および植物細胞から成るグループから選ばれることを特徴
とするホスト細胞。 - 【請求項１６】 ホスト細胞は光合成細胞であることを特徴とする請求項１
４記載のホスト細胞。 - 【請求項１７】 ホスト細胞はケトカロチノイドを含むことを特徴とする請
求項１４記載のホスト細胞。 - 【請求項１８】 ホスト細胞は非変換ホスト細胞に対して相対的に修飾され
たレベルのカロチノイドを含むことを特徴とする請求項１４記載のホスト細胞。 - 【請求項１９】 アミノ酸シーケンス SEQＩＤ ＮＯ：２によってエンコ
ードされ精製されたことを特徴とするケタラーゼ酵素。 - 【請求項２０】 アミノ酸シーケンス SEQＩＤ ＮＯ：４によってエンコ
ードされ精製されたことを特徴とするケタラーゼ酵素。
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Cited By (2)
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