KR100231454B1

KR100231454B1 - 크산토필의 합성에 유용한 dna 사슬 및 크산토필의 제조법

Info

Publication number: KR100231454B1
Application number: KR1019960703383A
Authority: KR
Inventors: 노리히코 미사와; 게이지 콘도; 수수무 카지와라; 아키히로 요코야마
Original assignee: 무라세 쇼우이치; 가부시키가이샤 가이요우 바이오테크놀로지 켄꾸쇼; 마나배 게이사꾸; 기린비이루 가부시키가이샤
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-26
Publication date: 1999-12-01
Also published as: NO962689D0; US5972690A; EP0735137B1; CA2180024C; EP1203818A3; FI962633A; DE69433969D1; US5811273A; CA2180024A1; US6150130A; AU1281195A; NO962689L; EP1203818A2; ATE274585T1; AU702584B2; FI962633A0; ES2225836T3; EP0735137A4; EP0735137A1; JP3375639B2

Abstract

본 발명은 아스다크산틴을 시작하는 케토기를 포함하는 크산토필에 관한 하기와 같은 DNA 사슬 및 크산토필의 유전자 공학적 제조에 과한 기술을 나타낸 것이다.

β-이오논 고리의 4번 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.

3-히드록시-β-이오논 고리의 4번 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.

4-케토-β-이오논 고리의 3번 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.

상기 DNA 사슬을 적당한 미생물, 특히 대장균에 도입시킨 것을 발현하므로서 칸다크산틴, 아스다크산틴 등의 다양한 크산토필을 제조할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

크산토필의 합성에 유용한 DNA 사슬 및 크산토필의 제조법

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 도미, 연어, 새우등의 양식어류의 재염색에 이용되고, 또한 착색료와 산화방지제로서 식품에 이용한 아스다크산틴등의 케토기를 함유한 크산토필(케포카로티노이드)의 합성에 유용한 DNA 사슬, 및 그 DNA 사슬을 도입한 미생물을 이용한 아스다크산틴등의 케토기를 함유한 크산토필(케토카로티노이드)의 제조법에 관한 것이다.

[배경기술]

크산토필(xanthophyll)이란, 수산기, 케토기, 에포킨기등의 산소를 함유한 카로티노이드(carotenoid)의 총칭이다. 카로티노이드는 메파론산을 출발물질로서, 스테로이드와 테르페노이드와의 도중에 공통된 이소프레노이드 생합성 경로에 의해 합성된다. 이소프렌 기본 생합성계에 의해 생긴 C15의 파르네실피로린산(FPP)은 C5의 이소펜테닐피로린산(IPP)과 축합하는 것에 의해, C20의 게라닐게라닐피로린산(GGPP)을 만들 수 있다. 이어서, 2분자의 GGPP가 축합되어, 최초의 카로티노이드인 무색의 피토엔(phytoene)이 생성된다. 피토엔은 일련의 불포화 반응에 의해, 피토플루엔(phytofluene), ζ-카로틴(ζ-carotene), 네우로스포넬(neurosporene), 리코펜(lycopene)으로 변화되고, 추가로 리코펜은 고리반응에 의해 β-카로틴(β-carotene)으로 변환된다. 그래서, β-카로틴에 수산기와 케토기등을 도입하여, 여러종류의 크산토필이 합성된다고 생각되어지고 있다.(Britton, G., ′Biosynthesis of carotenoids′. Plant Pigments. London, Academic Press, 1988, p.133-182(Goodwin, T, W. ed.)참조).

최근, 발명자들은, 식물에 있는 비광합성세균 Erwinia uredovora의 카로티노이드 생합성 유전자군을 황색의 색조를 지표로 대장균에 클로닝하고, 이들 유전자를 다양하게 조합시킨 것을 대장균등의 미생물로 발현시키는 것에 의해, 대장균 등의 미생물에 피토엔, 리코펜, β-카로틴 및 β-카로틴에 수산기를 도입시킨 황색의 크산토필인 제아크산틴을 생성시키는 것을 가능하게 했다.(제10도 참조)(Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima K., ′Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli′ J. Bacterial., 172, p.6704-6712, 1990, 및, Misawa, N., Yamano, S., Ikenage, H., ′Production of β-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora′ apple. Environ. Microbiol., 57, p. 1847-1849, 1991, 및 본 발명자들에 의한 특허 출원 특원평3-58786호공보(특원평2-53255호 명세서):[카로티노이드의 합성에 유용한 DNA 사슬]참조).

한편, 적색의 크산토필인 아스다크산틴은 특히 해양생물의 연어, 도미등의 적색 어류와 가재, 새우등의 갑각류에 널리 존재하는 대표적 동물 카로티노이드이다. 일반적으로, 동물은 카로티노이드를 생합성할 수 없으므로, 미생물과 식물에 있어서 합성된 카로티노이드를 외부로 부터 채취할 필요가 있다. 이런 이유때문에, 종래로부터 연어, 도미, 새우등의 양식어류를 재염색하기 위해 아스다크산틴은 널리 이용되어져 왔다. 또한, 아스다크산틴은 식품에 있어서도, 착색료로서 뿐만아니라 암의 원인이 되는 생체내에서 발생한 활성산소를 제거하는 산화방지제로서도 주목받고 있다.(송야융남간섭, [동물에 있어서의 카로티노이드의 생리기능과 생물활성] 화학과 생물, 28, p. 219-227, 1990 참조). 아스다크산틴의 공급원으로서는 남극오기아미등의 갑각류, 효모 Phaffia의 배양물, 녹조 Haematococcus의 배양물, 및 유기합성법이 알려져있다. 그러나 남극오기아미등의 갑각류을 사용하는 경우, 그것을 채취, 추출하는데 있어서, 지질을 필두로 하는 불필요한 잡물과의 분리에 있어서 많은 노력과 비용이 든다. 또한, 효모 Phaffia의 배양물에 있어서는 그 세포벽이 강한 고형물인 데다가 생산량이 낮기 때문에 아스다크산틴의 채취, 추출에 많은 비용을 갖는다. 녹조 Haematococcus의 배양물에 있어서는 배양시에 아스다크산틴합성에 빠트릴수 없는 광선을 제공하지 않으면 안되고, 태양광을 얻기 위한 입지조건과 인공광 공급을 위한 배양장치등의 설비가 필요할뿐 아니라, 혼재하는 부생상물의 지방산 에스테르와 혼재하는 클로로필과의 분리가 어렵다. 이상과 같은 이유로 상기의 생물기원의 아스다크산틴은 비용적으로 유기합성에 이길수 없는 것이 현상태이다. 그러나, 유기합성법에 있어서는 아스다크산틴이 어류의 색료와 식품첨가제로서 이용되는 것을 고려한면, 반응시에 생기는 부산물등이라는 측면에서 문제가 남고, 또한, 소비자의 천연물 선호에도 반하고 있다. 이상에 의해, 안전하고 소비자에게 이미지가 좋은 생물기원의 값싼 아스다크산틴의 공급, 제조법의 개발이 요망되고 있다.

[발명의 개시]

만약, 아스다크산틴의 생합성을 할수 있는 유전자 군이 있다면 매우 유용하다고 여겨진다. 왜냐하면, 아스다크산틴의 생산능이 있고 없고에 상관없이, 식품으로서의 안전성과 아스다크산틴의 산재적 생산능력이라는 측면에서 최적인 미생물에 아스다크산틴합성 유전자를 도입함으로서, 생산능력을 부여할 수 있기 때문이다. 이와 같은 경우, 혼재한 부산물의 문제도 없고, 현재 진행된 유전자 조작의 수법으로 유기 합성법을 만족한 레벨까지 아스다크산틴의 생산량을 올리는 것도 어렵지 않다고 여겨진다. 그러나, 크산토필의 한 종류인 제아크산틴까지를 합성하는 유전자군은 상술한 것처럼 다양하게 이미 본 발명자들에 의해 취득되고 있지만, 아스다크산틴을 합성하는 것에 필요한 케토기 도입 효소를 코드하는 유전자등을 얻는 것은 아직 누구도 성공에 이르지 못했다. 이와 같은 이유로는 케토기 도입 효소가 막단백질이고, 막에서 분리되면 활성을 잃기 때문에, 그의 효소 정제, 활성측정이 불가능하고, 알려진 효소가 전무했다는 것을 들 수 있다. 따라서, 지금까지, 아스다크산틴을 유전자 조작에 의해 미생물등에서 생산시키는 것은 불가능하였다.

본 발명은 아스다크산틴을 시작으로 하는 케토기를 함유한 크산토필(케토카로티노이드)을 생산하는 것에 필요한 케토기 도입 효소를 코드하는 유전자등을 얻는 것에 의해, 미생물에 아스다크산틴을 시작으로 하는 케토기를 함유한 크산토필(케토카로티노이드)을 생산시키는 것에 필요한 유전자군을 함유한 DNA 사슬을 도입한 미생물을 이용한, 아스다크산틴을 시작으로 하는 케토기를 함유한 크산토필(케토카로티노이드)의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

통상적으로 잘 사용되는 유전자 클로닝법인, 단백질의 정제를 목적으로 하는, 아미노산 서열의 일부 결정, 및 합성 프로브에 의한 유전자의 취득법은 아스다크산틴 합성 효소의 정제가 불가능하다는 것에 의해 채용할 수 없는 것은 상술한 대로이다. 이것으로, 본 발명자들은 비광합성세균 엘비니아(Erwinia)의 카로티노이드 합성 유전자군이 대장균에서 기능하는 것에 주목하고, 그 유전자군의 조합에 의해, 아스다크산틴의 생합성 중간체라고 여겨지는 리코펜과 β-카로틴을 대장균에서 만들게 하고, 이 대장균을 아스다크산틴합성 유전자의 클로닝하기 위한 숙주로 한다. 본 발명자들은 또한 몇개의 해양 세균이 아스다크산틴을 생성할 수 있다는 것(Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W., ′Marine bacteria produced astaxanthin;. 10th International symposium on carotenoids, abstract, CL11-3, 1993), 및 세균의 경우는 일련의 개연유전자가 크라스타(군)을 구성하고 있을지도 모른다는 것 및 세균의 경우는 대장균에서 이 유전자군이 기능 발현할 지도 모른다는 것에 주목하고, 이 해양 세균을 유전자원으로서 선택하였다. 이 2개의 수단을 조합하여 연구하여, 해양 세균에서 아스다크산틴과 그의 다른 케토기를 함유한 크산토필의 생합성에 필요한 유전자군을 얻는 것에 성공하였고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 또한, 해양세균으로 아스다크산틴 합성 유전자군이 크러스타를 구성하고 있고, 대장균에서 기능 발현하는 것, 및 이들의 유전자 산물이 β-카로틴 또는 리코펜을 기질로서 이용할 수 있는 것은 본 발명에 있어서 처음으로 명확하게 된다.

본 발명에 의한 DNA사슬은 하기에 나타난 것이다.

(1)β-이오논 고리(β-ionone ring)의 4번째 위치의 메틸렌(methylene)기를 케토(keto)기로 변환하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(2)β-이오논 고리의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 갖는 아미노산 서열이 실질적으로 서열 번호 1로 표시된 아미노산 번호 1에서 212까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(3) 상기 (2)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (2)에 기재된 효소활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(4) β-이오논 고리의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소 활성을 가지는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 5에 표시된 아미노산 번호 1로부터 242까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(5) 상기 (4)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (4)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(6) β-카로틴을 에기네논을 거쳐 칸다크산틴으로 변환하는 효소활성을 갖고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열 번호 1에 나타난 아미노산 번호 1부터 212까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(7) 상기 (6)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (6)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(8) β-카로틴을 에기네논을 거쳐 칸다크산틴으로 변환하는 효소활성을 갖고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열 번호 5에 나타난 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(9) 상기 (8)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (8)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(10) 3-히드록시-β-이오논 고리(3-hydroxy-β-ionone ring)의 4번째 자리의 메틸렌(methylene)기를 케토(keto)기로 변환하는 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(11) 3-히드록시-β-이오논 고리의 4번째 자리의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 1로 기재된 아미노산 번호 1부터 212까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(12) 상기 (11)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (11)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(13) 3-히드록시-β-이오논 고리의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 5로 기재된 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(14) 상기 (13)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (13)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(15) 제아크산틴을 4-케토제아크산틴을 거쳐서 아스다크산틴으로 변환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 1로 기재된 아미노산 번호 1부터 212까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(16) 상기 (15)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (15)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(17) 제아크산틴을 4-케토제어크산틴을 거쳐서 아스다크산틴으로 변환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 5로 기재된 아미노산 번호 1로부터 242까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(18) 상기 (17)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (17)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(19) 4-케토-β-이오논 고리(4-keto-β-ionone ring)의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(20) 4-케토-β-이오논 고리의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 2로 기재된 아미노산 번호 1부터 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(21) 상기 (20)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (20)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(22) 4-케토-β-이오논 고리의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 6로 기재된 아미노산 번호 1부터 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(23) 상기 (22)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (22)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(24) 칸다크산틴을 페니코크산틴을 경유해서 아스다크산틴으로 전환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 2로 기재된 아미노산 번호 1부터 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(25) 상기 (24)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (24)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(26) 칸다크산틴을 페니코크산틴을 경유해서 아스다크산틴으로 전환하는 효소활성을 가지고 있는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 6으로 기재된 아미노산 번호 1부터 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

(27) 상기 (26)에 기재된 DNA 사슬에 혼성화되고, 동시에 상기 (26)에 기재된 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬.

본 발명은 또한 크산토필의 제조법에도 관계된다.

즉, 본 발명에 의한 크산토필의 제조법은 하기에 나타낸 것이다.

(1) 상기 (1) 내지 (9)중 어느 하나에 기재된 DNA 사슬을, β-카로틴을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 도입해서 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물로부터 칸다크산틴 또는 에기네논을 채취하는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조법.

(2) 상기 (10) 내지 (18)의 어느 하나에 기재된 DNA 사슬을, 제아크산틴을 생산하는 능력을 갖는 미생물에 도입해서 해당하는 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물부터 아스다크산틴 또는 4-케토제아크산틴을 채취하는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조법.

(3) 상기 (19) 내지 (27)의 어느 하나에 기재된 DNA 사슬을, 칸다크산틴을 생산하는 능력을 갖는 미생물에 도입해서 해당하는 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물부터 아스다크산틴 또는 페니코크산틴을 채취하는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조법.

(4) 미생물이 세균 또는 효모이고, 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나에 기재된 제조법.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 케토기 도입 효소 유전자(crtW 유전자)의 염기서열로 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 설명도이고,

제2도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 수산기 도입 효소 유전자(crtZ 유전자)의 염기서열로 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 설명도이고,

제3도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 리코펜 고리화 효소 유전자(crtY 유전자)의 염기서열로 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 설명도이고,

제4도는 제3도에 이어지는 서열을 나타낸 설명도이고,

제5도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 크산토필 합성 유전자군의 염기서열을 나타낸 설명도이고,

도면중 A부터 F는 제1도부터 제4도의 A부터 F에 대한 것이고,

제6도는 제5도에 이어지는 서열을 나타난 설명도이고,

제7도는 제6도에 이어지는 서열을 나타난 설명도이고,

제8도는 제7도에 이어지는 서열을 나타난 설명도이고,

제9도는 제8도에 이어지는 서열을 나타난 설명도이고,

제10도는 비광합성 해양세균 Erwinia uredovora의 카로티노이드 생합성 경로와 카로티노이드 합성 유전자의 기능을 나타낸 설명도이고,

제11도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1의 주요한 크산토필 생합성 경로와 크산토필 합성 유전자의 기능을 나타낸 설명도이고,

단 crtY 유전자의 기능은 전자에 있어서만 확인,

제12도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 크산토필 합성 유전자(군)을 포함한 여러가지 델레이션 플라스미드를 나타낸 설명도이고,

흑색바탕의 p는 벡터-pBluescript II SK의 lac의 프로모터를 나타낸다. 제한 효소 절단 부위는 보여지는 바와같이 간략하게 표시하였다. Sa, SacI ; X, XbaI ; B, BamHI ; P, PstI ; E, EcoRI : S, SalI ; A, ApaI : K, KpnI ; St, StuI : N, NruI ; Bg, BglII ; Nc, NcoI ; Hc, HincII

제13도는 해양세균 Alcaligenes sp. PC-1의 케토기 도입 효소 유전자(crtW 유전자)의 염기서열로 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 설명도이고,

제14도는 제13도에 이어지는 서열을 나타낸 설명도이고,

제15도는 해양세균 Alcaligenes sp. PC-1의 수산기 도입 효소 유전자(crtZ 유전자)의 염기서열로 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 설명도이고,

제16도는 해양세균 Alcaligenes sp. PC-1의 크산토필 합성 유전자군의 염기서열을 나타낸 설명도이고, 도면중 A부터 D는 제13도 내지 제15도의 A부터 D에 대한 것이고,

제17도는 제16도에 이어지는 서열을 나타낸 설명도이고,

제18도는 제17도에 이어지는 서열을 나타낸 설명도이고,

제19도는 해양세균 Alcaligenes sp. PC-1의 크산토필 합성 유전자군을 포함하는 여러가지 델레이션 플라스미드를 나타낸 설명도이고,

흑색바탕위의 p는 벡터-pBluescript II SK+lac의 프로모터를 나타내고,

제20도는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1의 주요하지 않은 생합성 경로를 포함한 크산토필 생합성 경로와 크산토필 합성 유전자의 기능을 나타낸 설명도이다.

주요하지 않은 생합성계 경로는 화살표로 나타내고 있다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명은 해양 세균인 아크로박테리움 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1에서 유래한 아스다크산틴등의 케토기를 포함한 크산토필(케토카로티노이드)의 합성에 유용한 DNA 사슬, 및 DNA 사슬을 도입한 미생물을 이용한 아스다크산틴등의 케토기를 함유한 크산토필(케토카로티노이드), 다시말하면 아스다크산틴, 페니코크산틴, 4-케토제아크산틴, 칸다크산틴 및 에기네논의 제조법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 DNA 사슬은 정제 화학 생성반응의 관점으로부터 원리, 원clr적으로는 상기 (1), (10) 및 (19)에 의해 표시되고, 기본적으로는 상기 (2),(4),(11),(13),(20) 및 (22)에 의해 정의되는 것이다. DNA 사슬(2) 및 (4)의 구체적인 예가 상기 (6) 및 (8)이고, DNA 사슬(11) 및 (13)의 구체적인 예가 상기 (15) 및 (17)이고, 또한, DNA 사슬(20) 및 (22)의 구체적인 예가 상기 (24) 및 (26)이다. 또한 DNA 사슬(3),(5),(7),(9),(12),(14),(16),(18),(21),(23),(25) 및 (27)는 각각 DNA 사슬(2),(4),(6),(8),(11),(13),(15),(17),(20),(22),(24) 및 (26)에 대해서 엄격한 조건으로 혼성화하는 것이다.

본 발명에 의한 DNA 사슬이 코드하는 폴리펩티드는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 1 내지 2 및 5 내지 6(제1도 내지 제2도 및 제13도 내지 제15도)에 있는 상기와 같은 특정법위(예를 들면 서열번호 1(제1도)로는 아미노산 번호 1 내지 212의 서열인 아미노산 서열(제1도에서는 A 내지 B))를 갖는다. 본 발명에 있어서, 이들 DNA 사슬에 의해 코드된 4종의 폴리펩티드(즉 크산토필 생합성 반응에 관여하는 4종의 효소)는 상술한 바와 같은 효소활성을 가지는 것으로 제한한 아미노산 몇개에 대해서 결실, 치환, 부가등으로 변화시키는 것이 좋다. 이와 같은 것은 [아미노산 서열이 실질적으로---]이라고 하는 것과 대응된다. 예를 들면 효소의 제1호목의 아미노산(Met)이 결실되는 것 등도 그 아미노산 서열의 변화에 의한 폴리펩티드 내지는 효소에 포함된다. 또한, 각 폴리펩티드를 코드하는 본 발명의 DNA 사슬은 서열번호 1 내지 2 및 5 내지 6(제1도 내지 제2도 및 제13도 내지 제15도)에 나타낸 특정 범위의 염기서열을 가지는 것 이외에, 숙중(축重)코돈에 있어서만 다른 동일의 폴리펩티드를 코드하는 숙중 이성체를 포괄하는 경우는 말할것도 없다.

[케토기 도입 효소 유전자(CrtW)]

DNA 사슬(1) 내지 (18)은 케토기 도입 효소를 코드하는 유전자(crtW라 명함)이다. 그것의 고전적인 예는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1으로부터 클로닝한 crtW 유전자이고, 제1도의 A 부터 B(서열번호 1의 아미노산 번호 1 내지 212) 또는 제13도 내지 제14도의 A 부터 B(서열번호 5의 아미노산 번호 1 내지 242)까지의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코드하는 염기서열로부터 되는 DNA 사슬이다. crtW 유전자산물(이하 CrtW라고도 함)은 β-이오논 고리의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소 활성을 가지고 있고, 이것의 구체적 예의 하나가 β-카로틴을 기질로서 에기네논(echinenone)을 경유해서 칸다크산틴(canthaxanthin)을 합성하는 효소활성이다(제11도 참조). 또한, crtW 유전자 산물은 3-히드록시-β-이오논 고리의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소활성도 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가 제아크산틴(zeaxanthin)을 기질로서 4-케토제아크산틴(4-ketozeaxanthin)을 경유해서 아스다크산틴(astaxanthin)을 합성하는 효소할성이다(제11도 참조). 또한, 그와 같은 효소활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 공지되어 있는 것이 아니고, 이 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 DNA 사슬은 현재까지 알려진 것과 같은 폴리펩티드 또는 DNA 사슬과도 전체적인 상동성을 갖고 있지 않다. 또한, β-이오논 고리와 3-히드록시-β-이오논 고리로 한정시키지 않고, 1개의 효소가 디히드로카르보닐기를 직접 케토기로 변환한다라고 알려진 것은 지금까지 없었다. 또한, Agrobacterium과 Alcaligenes 사이의 CrtW의 상동성은 아미노산 서열 레벨로서, 83%의 아이덴티티라고 하는 높은 상동성을 나타낸다.

한편으로, 비광합성 세균 Erwinia의 카로티노이드 합성 유전자를 이용하는 것에 의해, 대장균등의 미생물에 β-카로틴과 제아크산틴을 제조시킬 수 있고, 즉 Erwinia의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자는 대장균등의 미생물에 β-카로틴 생산능을 부여하고, Erwinia의 crtE, crtB, crtI, crtZ 유전자는 대장균등의 미생물에 제아크산틴 생산능을 부여한다.(제10도 및 상기의 WO91/13078호 공개공보 참조). 따라서, CrtW의 기질은 이들 Erwinia의 crt 유전자군에 의해 공급되기 때문에, 상기 Erwinia의 crt 유전자군을 포함한 대장균등의 미생물에 추가로 crtW 유전자를 도입하면, β-카로틴 산생 미생물로는 에기네논을 경유해서 칸다크산틴을, 제아크산틴 산생 미생물로는 4-케토제아크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 생산하게 된다.

[수산기 도입 효소 유전자(crtZ)

DNA 사슬(19) 내지 (27)은 수산기 도입 효소를 코드하는 유전자(crtZ라 명함)이다. 그것의 고전적인 예는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1으로부터 클로닝한 crtZ 유전자이고, 제2도의 C 부터 D(서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 162) 또는 제15도의 C 부터 D(서열번호 6의 아미노산 번호 1 내지 162)까지의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코드하는 염기 서열로부터 되는 DNA 사슬이다. crtZ 유전자산물(이하 CrtZ라고도 함)은 β-이오논 고리의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소 활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가 β-카로틴을 기질로서 β-크립토크산틴(β-cryptoxanthin)을 경유해서 제아크산틴(zeaxanthin)을 합성하는 효소활성이다(제11도 참조). 또한, crtZ 유전자 산물은 4-케토-β-이오논 고리의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성도 가지고 있고, 이것의 구체적 예의 하나가 칸다크산틴(canthaxanthin)을 기질로서 페니코크산틴(phoenicoxanthin)을 경유해서 아스다크산틴(astaxanthin)을 합성하는 효소활성이다(제11도 참조). 또한, 후자의 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 공지되어 있지 않은 것이다. 또한, Agrobacterium 및 Alcaligenes의 CrtZ는, 아미노산 서열 레벨로서, Erwinia uredovora의 crtZ와 각각 57% 및 58%의 아이덴티티라고 하는 높은 상동성을 나타낸다. Agrobacterium와 Alcaligenes 사이의 CrtZ의 상동성은 아미노산 서열 레벨로서 90%의 아이덴티티라는 높은 상동성을 나타낸다.

비광합성 세균 Erwinia의 카로티노이드 합성 유전자를 이용하는 경우에 의해, 대장균등의 미생물에 β-카로틴을 만들 수 있다는 것은 상술한 것과 같다. 또한, 그곳에 crtW을 첨가하면, 대장균등의 미생물에 칸다크산틴을 만들 수 있다는 것도 상술한 것과 같다. 따라서, Agrobacterium 또는 Alcaligenes의 CrtZ의 기질은 Erwinia의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자(β-카로틴의 생산), 및 그곳에 Agrobacterium 또는 Alcaligenes의 crtW 유전자를 첨가하는 것(칸다크산틴의 생산)에 의해 공급되기 때문에, 이들의 crt 유전자군을 함유하는 대장균등의 미생물에 Agrobacterium 또는 Alcaligenes의 crtZ 유전자를 도입하면, β-카로틴 산생 미생물로는 β-크립토크산틴을 경유해서 제아크산틴을, 칸다크산틴 산생 미생물로서는 페니코크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 생산하게 된다.

[리코펜 고리화 효소 유전자(crtY)]

아미노산 서열이 실질적으로 제3도 및 제4도이 E부터 F(서열번호 3의 아미노산 번호 1 내지 386)까지의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 사슬은, 리코펜 고리화 효소를 코드하는 유전자(crtY라고 명명)이다. 그의 고전적인 예로서는 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1으로부터 클로닝한 crtY 유전자이고, 제3도 및 제4도의 E부터 F까지의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 염기 서열로부터 되는 DNA 사슬이다. crtY 유전자 산물(이하, CrtY라고도 함)은 리코펜(lycopene)을 기질로서 β-카로틴을 합성하는 효소 활성을 가지고 있다(제11도 참조). 비광합성 세균 Erwinia의 카로티노이드 합성 유전자를 이용하는 것에 의해, 대장균등의 미생물에 리코펜을 만들 수 있고, 즉 Erwinia의 crtE, crtB, crtI 유전자는, 대장균등의 미생물에 리코펜 생산능을 부여한다(제10도 및 상기의 WO91/13078호 공개공보 참조). 따라서, Agrobacterium의 CrtY의 기질은 Erwinia의 crt 유전자균에 의해 공급되기 때문에, 상기의 Erwinia의 crt 유전자군을 포함한 대장균등의 미생물에 Agrobacterium의 crtY을 도입하면, β-카로틴을 생산하는 것이 가능하게 된다.

또한, Agrobacterium의 CrtY는, 아미노산 서열 레벨로서, Erwinia uredovora의 CrtY와 44.3%의 아이덴티티라고 하는 중요한의 상동성을 가지고 있고, 효소의 기능도 양쪽 모드에서 동일하다(제10도, 제11도 참조).

[해양 세균의 균학적 성질]

크산토필 합성 유전자의 취득원인 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes sp. PC-1은 하기와 같은 균학적 성질을 나타낸다.

〈Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1〉

(1)형태

균의 형태. 크기 : 막대형태, 0.9㎛×1.2㎛

운동성 : 있음

편모 : 주모 있음

세포의 다형성 : 없음

포자의 형성 : 없음

그람염색 : 음성

(2)각배지에 있는 생육상태

육즙한천평판배양 : 비분산성으로 광택이 있고, 등색(오렌지색)의 원형 콜로니를 형성한다.

육즙한천사면배양 : 비분산성으로 광택을 가지고, 등색의 형태로 생육된다.

육즙액체배양 : 배지전체에 균일하게 생육하고, 등색을 나타낸다.

육즙젤라틴천자배양 : 천자공을 중심으로 표면에 생육한다.

(3)생리학적 성질

초산염의 환원 : 양성

탈질반응 : 음성

인돌의 생성 : 음성

크엔산의 이용 : 음성

색소의 생성 : 지용성의 적등색 색소

우레아제활성 : 음성

옥시다제활성 : 양성

카타라제활성 : 양성

β-글루코시다제활성(에스크린분해성) : 양성

β-갈락토시다제활성 : 양성

생육의 범위 : pH 5 내지 9, 온도 10 내지 40℃

산소에 대한 태도 : 호기성

해수내성 : 양성

O-F 테스트 : 산화

당류의 동화능 :

양성 : D-글루코스, D-말토즈, D-칼락토즈, D-프룩토즈, 유당, 맥아당, 이당, 글리코겐, N-아세틸-D-글루코사민

음성 : L-아라비노스, D-만니톨, 이노시롤, L-라마노스, D-솔비톨

유기산의 동화능 :

양성 : 유산염

음성 : 크엔산염, 링고산염, 글루콘산염, 카푸린산염, 코하크산염, 아디핀산염

다른 유기물의 자화능 :

양성 : 이노신, 와리딘, 글루코스-1-린산, 글루코스-6-린산

음성 : 젤라틴, L-알기닌, DNA, 카제인

〈Alcaligenes sp. PC-1〉

(1)형태

균의 색.크기 : 짧은 막대 모양, 1.4㎛

운동성 : 있음

편모 : 주모있음

세포의 다형성 : 없음

포자의 형성 : 없음

그람염색 : 음성

(2)각배지에 있는 생육상태

육즙한천평판배양 : 비분산성으로 광택이 있고, 등색의 원형 콜로니를 형성한다.

육즙젤라틴천자배양 : 천자공을 중심으로 표면에 생육한다.

(3)생리학적 성질

색소의 생성 : 지용성의 적등색 색소

옥시다제활성 : 양성

카타라제활성 : 양성

생육의 범위 : pH 5 내지 9, 온도 10 내지 40℃

산소에 대한 태도 : 호기성

해수내성 : 양성

O-F 테스트 : 산화

젤라틴분해성 : 음성

[다른 해양세균의 크산토필 합성 유전자군]

현재까지 16종의 해양세균이 아스다크산틴등의 케토카로티노이드를 합성한다는 것이 보고되었다(Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W., ′Marine bacteria produced astaxanthin′. 10th International symposium on carotenoids, abstract, CL11-3, 1993). 상술한 해양세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 또는 Alcaligenes sp. PC-1의 crt 유전자내의 어딘가를 프로브로서 이용하면, 그 상동성을 이용하는 것에 의해 다른 아스다크산틴 산생 해양세균으로부터, 아스다크산틴을 시작으로 하는 케토카로티노이드의 생합성을 내포하는 유전자군을 취득하는 것이 가능함이 밝혀진다. 사실, 발명자들은 Ag.aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW와 crtZ을 함유한 DNA 단편을 프로브로서, Alcaligenes PC-1의 염색체 DNA로부터, 강하게 혼성화된 DNA 단편으로서의 crtW와 crtZ 유전자를 취득한 것이다(상세한 것은 실시예를 참조). 또한, 본 발명자들은 아스다크산틴을 합성할 수 있는 나머지의 14종의 해양 세균 중에서 Alteromonas SD-402을 선택해서, 그것으로부터 염색체 DNA를 제조하고, Ag. aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW와 crtZ을 함유한 DNA 단편을 프로브로서, 서젼법을 행한 경우, 예상대로 프로브는 해양세균의 염색체 DNA 에서 유래한 밴드와도 혼성화했다. 본 발명에 의한 DNA 사슬은 이와 같은 상술한 DNA 사슬(2),(4),(6),(8),(11),(13),(15),(17),(20),(22),(24) 및 (26)과 혼성화하는 DNA 사슬을 포함하는 것이다.

[DNA 사슬의 취득]

상기의 각 효소의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 갖는 DNA 사슬을 취득하는 하나의 수단은 핵산합성의 방법에 따라서, 이 사슬의 길이의 적어도 일부를 화학 합성하는 경우이지만, 결합 아미노산이 다수라고 하는 것을 고려하면, 이 화학 합성법보다도 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 또는 Alcaligenes sp. PC-1의 전체 DNA를 적당한 제한 효소로 소화하는 것을 이용해서 대장균에서 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리로부터 유전자 공학의 분야에서 채용되고 있는 방법, 예를 들면, 적당한 프로브에 의한 혼성화법에 의해 이것을 취득하는 방법이 바람직하다고 한다(다른 해양세균의 크산토필 합성 유전자군 참조).

[대장균등의 미생물의 형질전환 및 유전자 발현]

상술한 바와 같이 본 발명의 DNA 사슬을 적당한 세균(예를 들면, 대장균, Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens)과 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae)등의 미생물에 도입하는 것에 의해, 다양한 크산토필을 제조할 수 있다.

이하는, 바람직한 미생물로의 외래 유전자의 도입법의 개념에 대해서 기재한 것이다.

대장균 등의 미생물로의 외래 유전자의 도입 및 발현을 위한 단계 내지 방법은 본 발명에 있어서 하기의 경우 이외의 것에 있어서도, 유전자 공학의 분야에 의해 채용되는 것을 포함하고, 그의 수단 내지 방법(예를 들면, ′Vectors for cloning genes′, Methods in Enzymology, 216, p.469-631, 1992, Academic Press, 및 ′Other bacterial systems′, Methods in Enzymology, 204, p.305-636, 1991, Academic Press 참조)에 준해서 실시되는 것이 좋다.

[대장균]

대장균으로의 외래 유전자의 도입법은 하나한의 방법, 루비디움법 등 만으로 확인되는 몇개의 효과적인 방법이 있고, 이것을 이용하면 좋다(예를 들면, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., ′Molecular cloning-A laboratory manul. ′Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989 참조). 대장균으로의 외래유전자의 발현은 통상적인 방법에 따라서 행하는 것이 좋지만(예를 들면, 상술한 ′Molecular cloning-A laboratory manul.′ 참조), 예를 들면, pUC계와 pBluescript계 등의 lac의 프로모터등을 가지는 대장균용 벡터를 이용해서 행할 수 있다. 본 발명자들은 lac의 프로모터등을 가지는 대장균용 벡터-pBluescript II SK 또는 KS을 이용해서, lac의 프로모터 전사의 리더슬을 받는 방향으로 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW, crtZ, crtY 유전자 및 Alcaligenes sp. PC-1의 crtW, crtZ 유전자를 투입해서, 이것의 유전자를 대장균에서 발현시킨다.

[효모]

효모 Saccharomyces cerevisiae로의 외래 유전자의 도입법은 리튬법 만으로 확인되는 방법이고, 이것을 이용해서 행하면 좋다(예를 들면, 추산속일염수바이오인더스트-협회편집,[효모의 뉴바이오테크놀로지-]의학출판센타-간행 참조). 효모에서의 외래 유전자 발현은 PGK와 GPD등의 프로모터 및 터미네이터를 이용해서, 외래 유전자를 프로모터와 터미네이터 사이에 전사의 리더슬을 제공하는 것에 의해 투입한 발현 카세트를 구성하고, 이 발현 카세트를 S. cerevisiae의 벡터, 예를 들면 YRp계(효모염색체의 ARS 서열을 복제 기점으로 하는 효모용 멀티카피벡터) YEp계(효모의 2㎛ DNA 복제 기점을 가진 효모용 멀티카피 벡터), YIp계(효모의 복제기점을 가지지 않은 효모 염색체 혼합용 벡터)등의 벡터에 투입하는 것에 의해 행할 수 있다(상술한 [호모의 뉴바이오테크놀로지]의학 출판 센타 간행, 일본 농업화학회 ABS 시리즈[물질생산을 위한 유전자 공학]조창 서점 간행, 및 Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H., Misawa, N., ′Metabolic engineering for production of β-carotene and Lycopene in saccharomyces cerevisiae′ Biosci. Biotech. biochem., 58, P.1112-1114, 1994 참조)

〈Zymomonas Mobilis〉

에탄올 생산 세균 Zymomonas Mobilis으로의 외래 유전자 도입법은 그람 음성균에 공통적인 접합 전달법에 의해 행할 수 있고, Zymomonas Mobilis에서의 외래 유전자의 발현은 예를 들면 Zymomonas Mobilis용 벡터-pZA22를 이용해서 행할 수 있다(중촌극기, [Zymomonas 세균의 분자육종], 일본농업화학회지, 63, p. 1016-1018, 1989, 및 Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga, H., ′Production of β-carotene in Zymomonas Mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora′ Appl. Environ. Microbiol., 57, p. 1847-1849, 1991] 참조).

〈Agrobacterium tumefaciens〉

식물 병원 세균 Agrobacterium tumefaciens로의 외래 유전자의 도입법은 그람 음성균에 공통된 접합 전달법에 의해 행할 수 있고, Agrobacterium tumefaciens에서의 외래 유전자의 발현은, 예를 들면 Agrobacterium tumefaciens용 벡터-pBI121을 이용해서 행할 수 있다(Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga, H., ′Production of β-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesisgenes genes from Erwinia uredovora′ Appl. Environ. Microbiol., 57, p.1847-1849 참조).

[미생물에 의한 크산토필 생산]

상술한 미생물로의 외래 유전자 도입 및 발현을 위한 수법 내지 방법에 의해서, 해양세균 유래의 아스다크산틴을 시작으로 하는 케토카로티노이드 합성 유전자군을 도입하고, 발현시키는 것이 가능하다.

파르네실피로린산(FPP)은 카로티노이드 뿐만 아니라, 세스키테르펜, 트리테르펜, 스테롤, 호파놀등의 테르페노이드와 공통된 기질이다. 일반적으로, 미생물은 카로티노이드를 합성할 수 없어도 테르페노이드는 합성할 수 있어서, 모든 미생물은 기본적으로, 중간 대산물로서 FPP를 가지고 있다. 한편, 비광합성 세균 Erwinia의 카로티노이드 합성 유전자군은 FPP를 기질로서, Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 또는 Alcaligenes sp. PC-1의 crt 유전자 산물의 기질, 즉, 리코펜, β-카로틴, 제아크산틴까지 합성시킬 수 있다(제10도 참조). 본 발명자들은 대장균 뿐만 아니라 상술한 미생물, 즉, 효모 Saccharomyces cerevisiae, 에탄올 생산 세균 Zymomonas mobilis, 식물 병원 세균 Agrobacterium tumefaciens에 Erwinia의 crt 유전자군을 도입하고, 이들 미생물이 예상과 같이 β-카로틴등의 카로티노이드를 생산할 수 있는 것을 이미 확인했다(Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H., Misawa, N., ′Metabolic engineering for production of β-carotens and lycopene in Saccharomyces cerevisiae′. Biosci. biotech. Biochem., 58, p.1112-1114, 1994, Misawa, N., Yamano., S., Ikenaga, H., ′Production of β-carotene in Zymomonas Mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora′ Appl. Environ. Microbiol., 57, p. 1847-1849, 1991, 및 본 발명자들에 의한 특허출원 특원평3-58786호공보(특원평2-53255호 명세서) : [카로티노이드의 합성에 유용한 DNA 사슬]).

따라서, Erwinia 유래의 카로티노이드 합성 유전자군과 본 발명의 DNA 사슬(고전적으로 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 또는 Alcaligenes sp. PC-1 유래의 카로티노이드 합성 유전자군)을 조합시켜서 동일한 미생물에 동시에 도입하는 것에 의해, 원리적으로는 유전자 도입 발현계가 확립된 모든 미생물에 아스다크산틴등의 케토카로티노이드를 발생시키는 것이 가능하게 된다. 이하, 다양한 케토카로티노이드의 미생물에 의한 생산 방법에 대해서 설명한다.

〈칸다크산틴, 에기네논의 생산〉

β-카로틴합성에 필요한 Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자 또는 케토기 도입 효소 유전자인 본 발명의 DNA 사슬(1) 내지 (9)중 어느 하나의 DNA 사슬(고전적으로는 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 또는 Alcaligenes PC-1의 crtW 유전자)을 대장균등의 미생물에 도입해서 발현시키는 것에 의해, 최종 산물로서 칸다크산틴, 중간대사산물로서 에기네논을 발생시키는 것이 가능하다. 상기 DNA 사슬(crtW 유전자)의 발현 레벨의 조절과 이것을 함유하는 미생물의 배양조건의 검사등에 의해, 칸다크산틴과 에기네논의 수량과 양의 비율을 변화시킬 수 있다. 이하, 대장균에 있어서의 2개의 예를 서술하지만, 상세한 것은 실시예를 참조한다.

Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pACYC184에 투입한 플라스미드 pACCAR16 △ crtX, 및 Ag. aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pBluescript II SK-1에 투입한 플라스미드 pAK916의 양 플라스미드를 대장균 JM101에 도입하고, 이것을 적당기간까지 배양하고 균체를 모아서, 카로티노이드 색소를 추출한다. 추출된 색소의 94%은 칸다크산틴이고, 6%은 에기네논이다. 또한, 칸다크산틴의 얻어진 양은 배양액 2리터마다 3mg이다.

Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pACYC184에 투입한 플라스미드 pACCAR16 △ crtX, 및 Alcaligenes PC-1의 crtW 유전자를 함유한 단편을 대장균벡터-pBluescript II SK+에 투입한 플라스미드 pPC17-3의 양 플라스미드를 대장균 JM101에 도입하고, 이것을 적당한 기간까지 배양하고 균체를 모아서, 카로티노이드 색소를 추출한다. 추출된 색소의 40%은 칸다크산틴이고, 50%는 에기네논이다. 나머지 10%는 미반응의 β-카로틴이다.

〈아스다크산틴, 4-케토제아크산틴의 생산〉

제아크산틴 합성에 필요한 Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 유전자 및 케토기 도입 효소 유전자인 본 발명의 DNA 사슬(10) 내지 (18)중 어느 하나의 DNA 사슬(고전적으로는 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes PC-1의 crtW 유전자)을 대장균등의 미생물에 도입해서 발현시키는 것에 의해, 최종 산물로서 아스다크산틴, 중간대사산물로서 4-케토제아크산틴을 생산시키는 것이 가능하다. 상기 DNA 사슬(crtW 유전자)의 발현 레벨의 조절과 이것을 함유하는 미생물의 배양조건의 검사등에 의해, 아스다크산틴과 4-케토제어크산틴의 수량과 양의 비율을 변화시킬 수 있다. 단 이하, 대장균에 있어서의 2개의 예를 서술하지만, 상세한 것은 실시예를 참조한다.

Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pACYC184에 투입한 플라스미드 pACCAR25 △ crtX, 및 Ag. aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pBluescript II SK-에 투입한 플라스미드 pAK916의 양 플라스미드를 대장균 JM101에 도입하고, 이것을 적당기간까지 배양하고 균체를 모아서, 카로티노이드 색소를 추출한다. 추출된 색소중에 아스다크산틴과 4-케토제아크산틴의 얻어진 양은 배양액 2리터마다 1.7mg, 1.5mg이였다.

Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pACYC184에 투입한 플라스미드 pACCAR25 △ crtX, 및 Alcaligenes PC-1의 crtW 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pBluescript II SK+에 투입한 플라스미드 pPC17-3의 양 플라스미드를 대장균 JM101에 도입하고, 이것을 적당한 기간까지 배양하고 균체를 모아서, 카로티노이드 색소를 추출한다. 추출된 색소중에 아스다크산틴과 4-케토제아크산틴의 얻어진 양은 각각 배양액 2리터에 대해 약 1mg이다.

〈아스다크산틴, 페니코크산틴의 생산〉

β-카로틴 합성에 필요한 Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자 및 케토기 도입 효소 유전자인 본 발명의 DNA 사슬(1) 내지 (9)중 어느 하나의 DNA 사슬(고전적으로는 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 및 alcaligenes PC-1의 crtW 유전자)과 수산기 도입 효소 유전자인 본 발명 DNA 사슬(19) 내지 (27)중 어느 하나의 DNA 사슬(고전적으로는 Ag. aurantiacus sp. nov. MK1 및 Alcaligenes PC-1의 crtZ 유전자)을 대장균등의 미생물에 도입해서 발현시키는 것에 의해, 최종 산물로서 아스다크산틴, 중간대사산물로서 페니코크산틴을 발생시키는 것이 가능하다. 상기 DNA 사슬(crtW 유전자 및 crtZ 유전자)의 발현 레벨의 조절과 이것을 함유하는 미생물의 배양조건의 검사등에 의해, 아스다크산틴과 페니코크산틴의 수량과 양의 비율을 변화시킬 수 있다. 이하, 대장균에 있어서의 1개의 예를 서술하지만, 상세한 것은 실시예를 참조한다.

Erwinia uredovora의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pACYC184에 투입한 플라스미드 pACCAR16 △ crtX, 및 Ag. aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW, crtZ 유전자를 함유한 단편을 대장균 벡터-pBluescript II SK-에 투입한 플라스미드 pAK96K의 양 플라스미드를 대장균 JM101에 도입하고, 이것을 적당한 기간까지 배양하고 균체를 모아서, 카로티노이드 색소를 추출한다. 추출된 색소중에 아스다크산틴과 페니코크산틴의 얻어진 양은 배양액 2리터마다 3mg, 2mg이다.

[미생물의 기탁]

본 발명의 DNA 사슬의 유전자원이 되는 미생물 및 단순하게 분리시킨 유전자를 조합한 대장균은 공업 기술원 생명공학공업기술 연구소에 하기와 같이 기탁시켰다.

(i) Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1

기탁 번호 : FERM BP-4506

수탁년월일 : 1993년 12월 20일

(ii) Bscherichia coli JM101(PAccrt-EIB, pAK92)

기탁 번호 : FERM BP-4505

수탁년월일 : 1993년 12월 20일

(iii) Alcaligenes sp. PC-1

기탁 번호 : FERM BP-4760

수탁년월일 : 1994년 7월 27일

(iv) Escherichia coil. β : pPC17

기탁 번호 : FERM BP-4761

수탁년월일 : 1994년 7월 27일

[실시예]

이하의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 또한, 여기서 이용된 통상의 유전자조작 실험은 특히 언급되지 않는 경우, 표준적인 방법(Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., ′Molecular cloning-A laboratory Press, 1898)에 기초한다.

[실시예 1]

[염색체 DNA의 제조]

염색체 DNA는 3종류의 해양세균, 즉 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1, Alcaligenes sp. PC-1, 및 Alteromonas SD-402 주(Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W., ′Marine Bacteria Produced astaxanthin′. 10th International symposium on carotenoids, abstract, CL11-3, 1933)로부터 제조했다. 이들 해양 세균을 200㎖의 배지(DIFCO사 제조 “Marine Broth”을 설명서 기재의 방법에 의해 제조한 배지)에서, 25℃ 정상기까지 4일간 증식시킨 균체를 수집한 후, TES 완충액(20mM 트리스, 10mM EDPA, 0.1M NaCl, pH 8)으로 세척하고, 68℃에서 15분간 가열처리한후, 5㎎/㎖ 리조튬(생화학공업 제조)과 100㎍/㎖ RNase A(시금사 제조)을 포함한 I 액(50mM 글루코스, 25mM 트리스, 10mM EDTA, pH 8)에 현탁하였다. 37℃에서 1시간 항온 처리한 후, 250㎍/㎖로 된 프로테인아제 K(Proteninase K, 베링거 만하임 제조)을 가해서, 37℃에서 10분간 항온 처리하였다. 또한, 최종 농도가 1%로 되게 살코신(N-Lauroylsarcosine Na, 시금사 제조)을 가해, 잘 혼합한 후, 37℃에서 수시간 항온 처리했다. 또한, 페놀/클로로포름 추출을 수회 행한 후, 2배량의 에탄올을 천천히 가하면서, 석출한 염색체 DNA을 유리막대로 저어주고, 70%에 탄올로 린스한 후, 2㎖의 TE완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA, pH 8)에 용해해서, 염색체 DNA 제조액으로 했다.

[실시예 2]

[코스미드 라이브러리를 위한 숙주 제조]

(1)피토엔 산생 대장균의 제조

Erwinia uredovora의 crtZ 이외의 카로티노이드 합성 유전자군을 가진 플라스미드 pCAR16(Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yomano, s., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima K., ′Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional of gene products expressed in Escherichia coli′. J. Bacteriol., 172, p. 6704-6712, 1990, 및 본 발명자들에 의한 특허출원 특원평 3-58786호공보(특원평2-53255호 명세서) : [카로티노이드의 합성에 유용한 DNA 사슬])으로부터 BstEII (1235)-Eco52I(4926)단편을 제거한 후, 피토엔 산생에 필요한 crtE와 crtB 유전자를 함유한 2.3 키로염기대(kb)의 Asp718(KpnI)-EcoRI 단편을 절단했다. 그래서, 이 단편을 대장균 벡터-pACYC184의 EcoRV 부위에 투입해서, 목적으로하는 플라스미드(pACCRT-EB)을 얻었다. 이 pACCRT-EB을 갖는 대장균은 항생물질 클로라움페니콜내성(Cm¹)을 나타내고, 피토엔을 생산한다(Linden, H., Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, I., Hirschberg, J., Sandmnn, G., ′Functional complementation in Escherichia coli of different phytoene desaturase genes ans analysis of accumulated carotenes′. Z. Naturforsch., 46c, 1045-1051, 1991)

(2) 리코펜 산생 대장균의 제조

Er. uredovora의 crZ 이외의 카로티노이드 합성 유전자군을 가진 플라스미드 pCAR16으로부터 BstEII(1235)-SnaBI(3497) 단편을 제거한 후, 리코펜 산생에 필요한 crtE, crtI, crtB 유전자를 포함한 3.75kb Asp718(KpnI)-EcoRi 단편을 절단했다. 이어서 이 단편을 대장균 벡터-pACYC184의 EcoRV 부위에 투입하고, 목적으로 하는 플라스미드(pACCRT-EIB)을 얻었다. pACCRT-EIB를 갖는 대장균은 Cm^r을 나타내고, 리코펜을 생산했다(Cunningham Jr, F. X., Chamovitz, D., Misawa, N., Gatt, E., Hirschberf, J., ′Cloning and functional expression in Escherichia coli of a cyanobacterial gene for lycopene cyclase, the enzyme that catalyzes the biosynthesis of β-carotene′. FEBS Lett., 328, 130-138, 1993).

(2) β-카로틴 산생 대장균의 제조

Er. uredovora의 crtZ 이외의 카로티노이드 합성 유전자군을 갖는 플라스미드 pCAR16의 제한효소 BstEII 소화, Klenow frgment 처리, 라이게션 반응을 행하는 것에 의해 crtX 유전자를 프레임 쉬프트에 의해 활성을 잃게 한후, β-카로틴 산생에 필요한 crtE, crtY, crtI, crtB 유전자를 함유한 6.0kb Asp718(Kpnl)-EcoRI 단편을 절단했다. 이어서, 그 단편을 대장균 벡터 pACYC184의 EcoRV 부위에 투입하고, 목적한 플라스미드(pACCAR16△crtX로 명명)을 얻었다. 이 pACCAR16△crtX를 가진 대장균은 Cm^r을 나타내고, β-카로틴을 생산했다. 또한, 제한 효소 및 유전자 조작에 이용한 효소류는 보주조(주) 또는 베링거·만하임사로부터 구매했다.

[실시예 3]

[코스미드 라이브러리의 제조 및 등색을 갖는 대장균의 취득]

Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 염색제 DNA 25㎍에 대해서, 1 유니트의 제한 효소 Sau3AI을 이용하고, 37℃, 15분간 항온처리한 후, 68℃, 1`0분간의 처리로 제한 효소의 활성을 잃게 하였다. 이 조건에서, 40kb 부근에 많은 Sau3AI 부분 분해 단편이 얻어졌다. 이것의 일부를 이용해서 코스미드 벡터-pJB8(안피실린 내성(Ap^r))을 BamHI 소화후 알카리포스파타제 처리한 것 그리고 pJB8을 SalI/BamHI 소화후 오른쪽 부분(적은쪽의 단편)을 겔로 회수한 것을 혼합시켜, 12℃에서 하루밤동안 라이게션 반응을 행하였다. 또한, pJB8은 이전에 아마샴사로부터 구입한 것이다.

상기의 라이게션 반응을 행한 DNA를 이용해서, 기카파크.골드(스트락딘사제, 하나콘 판매)에 의해 시험관내 패키징을 행하고, 크스미드 라이브러리를 만들어 충분한 양의 파지입자를 얻었다.

파지입자를 대장균(Escherichia coli)DH1(ATCC33849), 및 실시예 2에서 제작한 3종의 플라스미드의 각각을 가진 대장균 DH1에 감염시킨 후, 1프레이트 약 100 내지 300 콜로니로 되는 것에 의해 희석하고, 적당한 약제를 함유한 LB(1%트리프튼, 0.5%이스트엑스, 1%NaCl)에 프레이팅하고, 37℃ 또는 실온에서, 하루밤 내지 수일간 배양했다.

결과, 각각의 대장균(베이지색) 및 pACCRT-EB을 갖는 피토엔 산생 대장균(베이지색)을 숙주로한 코스미드 라이브러리로서는 다양하게 일만 콜로니아상 스크리닝하지만, 색소가 변한 것은 얻어지지 않는다. 한편, pACCRT-EIB를 갖는 리코펜 산생 대장균(엷은 적색) 및 pACCAR16△crtX를 β-카로틴 산생 대장균(황색)을 숙주로한 코스미드라이브러리로서는 다양하게 수백 콜로니에 1주의 비율로 등색을 띄는 콜로니가 출현했다. 이 등색을 띄는 대장균 형질 전환 주의 대부분은 pJB8에 40kb 전후의 Sau3AI 부분 분해 단편이 투입된 플라스미드를 포함한 것이다. 또한, 각각의 대장균 및 pACCRT-EB을 갖는 피토엔 산생 대장균을 숙주로한 코스미드 라이브러리로서는 색조가 변한 것은 얻어지지 않았지만, Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 염색체 DNA로부터 크산토필 합성 유전자군을 발현 클로닝하기 위해서는 적어도 피토엔 보다 후에 카로티노이드 합성 중간체를 만드는 대장균을 숙주로 이용하지 않으면 안된다.

[실시예 4]

[등색 색소 합성 유전자군을 함유한 단편의 축소화]

pACCRT-EIB을 가지는 리코펜 산생 대장균 DH1(엷은 적색) 및 pACCAR16△crtX를 가지는 β-카로틴 산생 대장균 DH1(황색)을 숙주로한 코스미드 라이브러리로서 얻어진 등색의 콜로니 중에서, 다양하게 수십개 콜로니를 선택해서, 그 플라스미드를 분석하는 경우, 1주를 제거해서 모두 pJB8에 33kb 내지 47kb의 Sau3AI 부분 분해 단편을 투입시킨 플라스미드를 포함시켰다. 남겨진 1주(리코펜 산생 대장균을 숙주로한 것)에는 pJB8에 3.9kb의 Sau3AI 부분 분해 단편이 투입된 플라스미드(pAK9 명명)을 포함시켰다. 이것은 대장균에 감염후, 투입단편의 생체내 델레이션에 의해 형성된 것이라고 여겨진다. pAK9를 갖는 리코펜 산생 대장균은 그외 다른 코스미드 라이브러리로부터 얻어진 등색 콜로니와 동일한 색소(실시예 6에서 아스다크산틴과 동정)을 합성할 수 있어서, 이후의 해석에는 이 pAX9를 재료로 이용하였다.

[실시예 5]

[등색 색소 합성 유전자군의 염기 서열 결정]

pAK9로부터 제조한 3.9kb의 EcoRI 투입 단편을 대장균 벡터-pBluescript II SK+의 EcoRI 부위에 투입해서, 단편의 방향성의 벡터에 대하여 서로 반대인 2종의 플라스미드(pAK91 및 pAK92라 명명)을 얻었다. 그중에서 플라스미드 pAK92의 제한 효소 지도를 제12도에 나타내었다. pAK92를 리코펜 산생 대장균에 도입한 경우, 아스다크산틴 합성(실시예 6)에 의해 등색 콜로니로 되지만, pAK91을 리코펜 산생 대장균에 도입하여도, 새로운 색소의 합성능은 관찰되진 않는다. 따라서, 플라스미드 pAK92에 있는 색소 합성 유전자군의 방향성은 벡타의 lac 프로모터의 방향과 동일하다고 여겨진다. 다음에 pAK91의 PstI 분해에 의해 얻어진 2.7kb의 PstI 단편과 pAK92로부터 BamHI 분해에 의해 얻어진 2.9kb의 BamHI 단편 및 SalI 분해에 의해 얻어진 2.3kb와 1.6kb와의 Sa1I 단편과를 각각 벡터-pBluescript II SK-에 클로닝하였다. 이것에 의해 얻어진 플라스미드중에 pAK94, pAK96, pAK910, pAK93, pAK95로 명부된 플라스미드의 제한 효소 지도를 제12도에 나타냈다. 플라스미드 pAK94, pAK96, pAK98, pAK910은 색소 합성 유전자군의 방향성이 벡타의 lac 프로모터의 방향과 동일하고, pAK93, pAK95에서는 반대이다.

2.9kb의 BamHI 단편을 가진 플라스미드 pAK96을 리코펜 산생 대장균에 도입하여도, 3.9kb EcoRI 단편을 가진 pAK92를 도입한 경우와 동일한 양식으로, 이 대장균 형질 전환주는 아스다크산틴을 합성하는 것이 알려졌기 때문에(실시예 6),이 2.9kb BamHI 단편의 DNA 서열 결정을 하였다.

DNA 서열의 결정은 2.9kb BamHI 단편에 대해서 정확하게 반대 양쪽 방향으로부터의 결실 변이체를 작성하고, 얻어진 종류의 긴 결실을 갖는 클론에 대해서 행했다. 결실 변이체 제조는 4종의 플라스미드 pAK96, pAK98, pAK93, pAK95에 대해서 이하의 순서로 행하였다. 각각의 플라스미드 10㎍을 SacI과 XbaI으로 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출을 하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 각각의 DNA를 100㎕의 ExoIII버퍼(50mM 트리스-염산, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂, 10mM 2-멜카프트에탄올, pH 8.0)에 용해하고, 180 유니트의 Exo III 뉴크레아제를 첨가해서 37℃에서 보온하였다. 1분쯤에 10㎕을 샘플링해서, 2개의 샘플로 분리하고, 20㎕의 MB버퍼(40mM Na-Acetate, 100mM NaCl, 2mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, pH4.5)가 들어간 빙상의 튜브로 이동시켰다. 샘플링이 종결된 후, 얻어진 5본의 튜브를 65℃, 10분간 보온해서, 효소의 활성을 잃게한 후, 5 유니트의 만그핀뉴클레아제를 첨가해서 37℃로 30분간 보온하였다. 반응 후, 아칼로스겔 전기 영동에 의해, 1개의 플라스미드에 대해서 5종류의 각각 결실의 정도가 다른 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA는 Klenow fragment에 의해 말단을 평골화하고, 16℃에서, 하룻밤 동안 라이게션 반응한 후, 대장균 JM109을 형질전환하였다. 얻어진 각종의 클론에 대해서 헬파디 M13K07을 이용해서 1본 사슬 DNA를 제조하고, 아프라이트 파이오 시스템(주)의 형광 프라이머 시클릭시퀀스키트를 이용해서 반응을 행하고, 자동 시퀀사를 이용해서 DNA 서열을 결정하였다.

얻어진 결과 2886 염기대(bp)로부터 된 DNA 서열을 제 5 내지 9(서열번호 4)로 표시했다. 개시 코든의 앞에 리보좀 결합 부위가 존재하는 오픈 리딩 프레임의 검사의 결과 3종의 크산토필 합성 유전자 crtW, crtZ, crtY의 존재가 예상된 위치(실시예 8)에 각종의 단백질을 코드하는 3개의 오픈리딩프레임(제 5 내지 6도중 A부터 B(서열 번호 4의 염기 위치 229-864), C부터 D(염기위치 864-1349), E부터 F(염기위치 1349-2506))이 보였다. 이들중 A 부터 B, E 부터 F의 2개의 오픈리딩 프레임에 대해서 각각 개시 코든은 GTG이고, C 부터 D에 대해서는 ATG이다.

[실시예 6]

[등색 색소의 동정]

pAK92 또는 pAK96을 리코펜 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균 pACCRT-EIB, pAK92 또는 pAK96)(등색을 띄고 있음) 또는 pAK94 또는 pAK96(제12도)을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균(pACCAR16△crtX, pAK94 또는 pAK96)(등색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 안피시린(Ap, 명치제과제)과 30㎍/㎖의 클로람페니콜(Cm, 삼공제)을 포함한 2YT 배지(1.6%트리프튼, 1%이스트엑스, 0.5%NaCl) 4ℓ에서 37℃, 18시간 배양했다. 배양액으로부터 모은 균인 균체를 600㎖의 아세톤에 의해 추출했다. 이것을 농축액, 400㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카겔 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(15/1)로 전개하는 것에 의해, 박층 크로마토그래피(TLC)를 행하였다. 원래의 등색 색소는 이 TLC에 의해 Rf값 0.72, 0.82, 0.91의 3지점으로 분리된다. 등색 색소 전체의 50%에 상당하고, 최대로 짙은 RF0.72의 색소와 다음으로 진한 Rf0.82의 색소를 TLC플레이트로부터 기록한 후, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에 용해하고, 세파텍스 LH-20 칼럼크로마토그래피-(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올로 전개용출하는 것에 의해, 각종의 순품을 3mg(:Rf0.72), 2mg(:Rf0.82)얻었다.

Rf0.72의 색소는 자외-가시 스펙트럼, 1H-NMR, FD-MS 스펙트럼(m/e 596)의 결과로부터 아스다크산틴과 동일한 평면 구조를 가지고 있는 것이 판명되었다. 그래서, 디에틸에테르 : 2-프로판올 : 에탄올 5:5:2에 용해하고, CD스펙트럼을 측정한 경우, 3S, 3′S의 입체 구조를 얻는 경우가 알려졌기 때문에, 본 물질을 아스다크산틴(astaxanthin, 구조식은 제11도 참조)과 동정했다. 또한, Rf0.82의 색소는 자외-가시 스펙트럼, 1H NMR, FD-MS 스펙트럼(m/e 580)의 결과로 부터 페니코크산틴(phoenicoxanthin, 구조식은 제11도 참조)과 동정시켰다. 또한, Rf 0.91의 색소는 칸다크산틴이였다(실시예 7(2)).

[실시예 7]

[크산토필 중간 대사물의 동정]

(1) 4-케토제아크산틴의 동정

제아크산틴 산생 대장균은 이어지는 바와 같이 제조하였다. 즉, Er. uredovora의 전 카로티노이드 합성 유전자군을 가진 플라스미드 pCAR25(Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, Y., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima K., ′Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli′. J. Bacteriol., 172, p. 6704-6712, 1990, 및 본 발명자들에 의한 특허 출원 특원평3-58786호 공보(특원평2-53255호 명세서) : [카로티노이드의 합성에 유용한 DNA 사슬])의 제한 효소 (m/e 596) BstEII 소화, Klennow fragment 처리, 라이게션 반응을 행하는 것에 의해, crtX 유전자를 프레임 쉬프트에 의해 활성을 잃게 한후, 제아크산틴 산생에 필요한 crtE, crtY, crtI, crtB, crtZ 유전자를 포함한 6.5kb Asp718(Kpnl)-EcoRI 단편을 절단하였다. 그래서, 이 단편을 대장균 벡터-pACYC184의 EcoRV 부위에 투입하고, 목적한 플라스미드(pACCAR25△crtX로 명명)을 얻었다.

pAK910 또는 pAK916(제12도)을 제아크산틴 산생 대장균 JM101에 도입한것(대장균(pACCAR25△crtX, pAK910 또는 pAK916))(등색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서, 37℃, 18시간 배양하였다. 배양액으로부터 수집한 균인 균체를 300㎖의 아세톤에 의해 추출하였다. 이것을 농축한 후, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)에 2회 추출하고, 농축건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카겔 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(15/1)로 전개하는 것에 의해, 박층 크로마토그래피(TLC)를 행하였다. 원래의 등색 색소는 이 TLC에 의해 Rf값 0.54(46%), 0.72(53%), 0.91(1%)의 3지점으로 분리된다. Rf0.54의 색소를 TLC 플레이트로부터 기록한 후, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에 용해하고, 세파텍스 LH-20 칼럼크로마토그래피-(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에서 전개용출하는 것에 의해, 순품을 1.5mg 얻었다.

본 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, FD-MS 스펙트럼(m/e 582) 및 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(15/1)에서 전개)가 4-케토제아크산틴의 표준품(Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1으로부터 정제, 특원평 5-70335)과 모두 일치하기 때문에, 본 물질을 4-케토제아크산틴(4-ketozeaxanthin, 구조식은 제11도 참조)과 동정(同定)했다. 또한, Rf 0.72 및 Rf 0.91의 색소는 각각 아스다크산틴(실시예 6), 칸다크산틴이였다(실시예 7(2)).

(2)칸다크산틴의 동정

pAK910 또는 pAK916을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균(pACCAR16△crtX,pAK910 또는 pAK916))등색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서 37℃, 18시간 배양했다. 배양액으로부터 모은 균인 균체를 300㎖의 아세톤에 의해 추출했다. 이것을 농축액, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카겔 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(50/1)로 전개하는 것에 의해, 박층 크로마토그래피(TLC)를 행하였다. 등색 색소 전체의 94%에 상당하는 최대로 짙은 색소를 TLC 플레이트로부터 기록했다. 또한, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올을 용해하고, 세파텍스 LH-20 칼럼크로마토그래피-(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에서 전개용출하는 것에 의해, 각종의 순품을 3mg 얻었다.

본 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, 1H-NMR, FD-MS 스펙트럼(m/e 564) 및 실라카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개해서 Rf 0.53)가 칸다크산틴의 표준품(BASF사 제작)가 모두 일치하기 때문에, 본 물질을 칸다크산틴(canthaxanthin, 구조식은 제11도 참조)과 동정했다. 또한, 최초의 추출물에서 보인 등색 색소 전체의 6%에 상응하는 색소는 자외-가시 스펙트럼, 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로의 전개에서 Rf 0.78), 및 노파팩타 HR 6μC18(3.9×300mm)(워터스사 제작)을 이용한 HPLC의 이동도(아세트니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)에서 1.0㎖/min)의 속도로 전개하여 RT16 분)로부터 에기네논(echinenone, 구조식은 제11도 참조)이라고 여겨진다.

(3)제아크산틴의 동정

pAK96NK(제12도)을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균(pACCAR16△crtX,pAK96NK))(황색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서 37℃, 18시간 배양했다. 배양액으로부터 모은 균인 균체를 300㎖의 아세톤에 의해 추출했다. 이것을 농축후, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카겔 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(50/1)로 전개하는 것에 의해, 박층 크로마토그래피(TLC)를 행하였다. 황색 색소 전체의 87%에 상당하는 최대로 짙은 색소를 TLC 플레이트로부터 기록했다. 또한, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올을 용해하고, 세파텍스 LH-20 칼럼크로마토그래피-(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에서 전개용출하는 것에 의해, 각종의 순품을 3mg 얻었다.

본 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, 1H-NMR, FD-MS 스펙트럼(m/e 568) 및 실라카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(9/1)로 전개해서 Rf 0.59)가 제아크산틴의 표준품(BASF사 제작)가 모두 일치하기 때문에, 본 물질은 제아크산틴의 동일한 평면 구조를 가진 것으로 판명되었다. 그래서, 디에틸에테르 : 2프로판올 : 에탄올 5:5:2에 용해해서, CD 스펙트럼을 측정하는 경우, 3R, 3′R의 입체 구조를 갖는 것이 알려졌기 때문에, 본 물질을 제아크산틴(zeaxanthin, 구조식은 제11도 참조)과 동일하게 정했다. 또한, 최초의 추출물에서 보인 황색 색소 전체의 13%에 상응하는 색소는 자외-가시 스펙트럼, 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(9/1)로의 전개에서 Rf 0.80), 및 노파팩타 HR 6μC18(3.9×300mm)(워터스사 제작)을 이용한 HPLC의 이동도(아세트니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)에서 1.0㎖/min)의 속도로 전개하여 RT19 분)로부터 β-크립토크산틴(β-cryptoxanthin, 구조식은 제11도 참조)이라고 여겨진다.

(4)β-카로틴의 동정

pAK98을 리코펜 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균 (pACCRT-EIB, pAK98))(황색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서 37℃, 18시간 배양했다. 배양액으로부터 모은 균인 균체를 300㎖의 아세톤에 의해 추출했다. 이것을 농축후, 200㎖의 헥산으로 2회 추출하였다. 또한, 헥산층을 농축하고, 실리카겔 크로마토그래피(15×300mm)로 분리하고, 헥산/초산에테르(50/1)에서 전개 용출하는 것에 의해, 순품을 3mg 얻었다.

본 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, FD-MS 스펙트럼(m/e 536) 및 노파팩타 HR 6μC18(3.9×300mm)(워터스사 제작)을 이용한 HPLC의 이동도(아세트니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)에서 1.0㎖/min)의 속도로 전개하여 RT62 분)가 β-카로틴의 표준품(오일트랜스형, 시그마사 제작)과 모두 일치하기 때문에, 본 물질을 β-카로틴(β-carotene, 구조식은 제11도 참조)과 동정했다.

[실시예 8]

[크산토필 합성 유전자군의 동정]

(1)케토기 도입 효소 유전자군의 동정

pAK9(실시예 4)또는 pAK92에 포함된 3.9kb의 단편중, 리코펜에서 부터 아스다크산틴의 합성에 필요한 모두의 유전자는 우측의 2.9kb BamHI단편(pAK96, 제12도) 중에 포함된 것이 실시예 6의 결과로부터 명확해졌다. 따라서, 좌측의 1.0kb 단편은 필요하지 않다. 이 pAK96의 2.9kb BamHI 단편 중에 1개의 NcoI 부위와 1개의 KpnI 부위가 존재하였다. NcoI와 KpnI 부위의 사이의 1.4kb 단편(pAK96NK)에는 수산기 도입 효소 활성이 존재하고, 케토기 도입 효소 활성이 존재하지 않는다는 것이 실시예 7(3)의 결과로 부터 알려졌다. 또한 2.9kb BamHI 단편 중에 1개 존재하는 상기의 NcoI와 KpnI 부위의 사이에 있는 SalI 부위 또는 SalI 부위에서 좌측의 HincII 부위로부터 2.9kb BamHI 단편의 좌측의 단편을 제거한 단편(pAK910 및 pAK916)에 있어서도, β-카로틴으로부터 칸다크산틴을 합성할 수 있지만(실시예 7(2)), pAK96의 2.9kb BamHI 단편으로부터 HincII 부위로부터 좌측의 NcoI 부위에서 우측의 단편을 제거한 단편에 있어서는 β-카로틴으로 칸다크산틴을 합성하는 활성은 소실되었다. 한편, pAK916의 0.9kB의 BamHI-HincII 단편에 있어서, 이 중간의 왼쪽 방향에 1개 존재하는 BglII 부위로부터 좌측의 단편을 제거해도, 상기의 BamHI-HincII 단편(pAK916)과 같은 양식의 활성이 존재하였다. 따라서, pAK916내의 0.74kb의 BglII-HincII 단편의 중간에 β-카로틴을 기질로서 칸다크산틴을 합성하는 효소 활성을 가진 케토기 도입 효소를 코드하는 유전자가 존재하고, 이 유전자의 중간에 상기의 NcoI 부위가 존재하고 있다고 여겨진다. 염기 서열 결정의 결과, 이 유전자에 상응하는 개시 코든의 직전에 리보좀 결합 부위를 갖는 1개의 오픈.리딩.프레임을 검출할 수 있어서, 이것을 crtW 유전자로 명명하였다. 이 crtW 유전자의 염기 서열과 코드된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제1도(서열번호 1)에 나타냈다.

이 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW 유전자 산물(CrtW)은 β-이온논 고리(β-ionone ring)의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가, β-카로틴(β-carotene)을 기질로서 에기네논을 경우해서 칸다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 7(2), 제11도 참조). 또한, crtW 유전자 산물은 3-히드록시-β이오논 고리(3-hydroxy-β-ionone ring)의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소 활성도 가지고 있고, 그의 구체적 예중 하나가 제아크산틴을 기질로서 4-케토제아크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 7(1), 제11도 참조). 또한, 이와 같은 효소 활성을 가지는 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 알려지지 않은 것이고, 이 폴리펩티드 또는 이것을 코드하는 DNA 사슬은 현재까지 알려진 폴리펩티드 또는 DNA 사슬과도 전체적인 상동성을 가지지 않는다. 또한, β-이오논 고리와 3-히드록시-β이오논 고리로 한정하지 않고, 1개의 효소가 메틸렌기를 갑자기 케토기로 전환한다라고 알려진 것은 지금까지 전무한 것이다.

(2)수산기 도입 효소 유전자의 동정

pAK96의 2.9kb BamHI 단편 중에 1개의 SalI 부위가 존재하였다. 이 SalI 부위에서 2.9kb BamHI 단편을 2개의 단편으로 절단하면, 2개의 단편(pAK910과 pAK98) 모두에, 수산기 도입 효소 활성은 거의 없었다. 다시 말하면, 좌측의 단편(pAK910)에는 케토기 도입 효소 활성 밖에 존재하지 않고(실시예 7(2)), 우측의 단편(pAK98)에는 리코펜 고리화 효소 활성 밖에 존재하지 않았다(실시예 7(4)). 한편, 상기의 SalI 부위를 포함한 1.4kb의 NcOI-KpnI 단편(pAK96NK)을 β-카로틴 산생 대장균에 도입하면, β-크립토크산틴을 경유해서, 제아크산틴을 합성하게 된다(실시예 7(3)). 따라서, 이 1.4kb의 NcoI-Kpnl 단편 중에 β-카로틴을 기질로서 제아크산틴을 합성하는 효소 활성을 가진 수산기 도입 효소를 코드하는 유전자가 존재하고, 이 유전자 중에 상기의 SalI 부위가 존재하고 있다고 생각되어진다. 염기 서열 결정의 결과, 이 유전자에 상응하는, 개시코든의 직전에 리보좀 결합 부위를 갖는 1개의 오픈.리딩.프레임을 검출할 수 있어서, 이것을 crtZ 유전자로 명명하였다. 이 crtZ 유전자의 염기서열과 코드된 폴리펩티드의 아미노산을 제2도(서열번호 2)에 나타내었다.

이 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 crtZ 유전자 산물(CrtZ)은 β-이온논 고리(β-ionone ring)의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소 활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가, β-카로틴(β-carotene)을 기질로서 β-크립토크산틴을 경유해서 제아크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 7(3), 제11도 참조). 또한, crtZ 유전자 산물은 4-케토-β-이오논 고리(3-keto-β-ionone ring)의 3번째 위치의 탄소에 수산기를 부가하는 효소 활성도 가지고 있고, 그의 구체적 예중 하나가 칸다크산틴을 기질로서 페니코크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 6, 제11도 참조). 또한, 후자의 효소 활성을 가지는 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 알려지지 않은 것이다. 또한 Agrobacterium의 CrtZ은 아미노산 서열레벨로서, Erwinia uredovora의 CrtZ와 57%의 아이덴티티라고 하는 중요한 상동성을 나타냈다.

(3)리코펜 고리화 효소 유전자의 동정

pAK96에 있어서 2.9kb BamHI 단편내의 우측 방향에 있는 KpnI 부위로부터 우측의 단편을 제거한 단편(pAK96K), 또는 이 KpnI부위로부터 우측에 있는 PatI 부위로부터 우측의 단편을 제거한 단편(pAK94)에 있어서 β-카로틴으로부터 아스다크산틴은 합성할 수 있지만(실시예 6), 리코펜으로 부터는 아스다크산틴을 합성할 수는 없었다. 한편 2.9kb BamHI 단편 중에 1개 존재한 상기의 KpnI 부위에서 좌측에 존재하는 SalI 부위로 부터 우측의 단편을 포함한 1.6kb SalI 단편(pAK98)을 리코펜 산생 대장균에 도입하면, β-카로틴을 합성하게 된다(실시예 7(4)). 따라서, 이 16.kb SalI 단편 중에 리코펜을 기질로서 β-카로틴을 합성하는 효소 활성을 갖는 리코펜 고리화 효소를 코드하는 유전자가 존재하고, 이 유전자는 상기의 KpnI와 PstI 부위에 걸쳐 존재하고 있다고 생각되어진다. 염기 서열 결정의 결과, 이 유전자에 상응하는 개시코든의 직전에 리보좀 결합 부위를 갖는 1개의 오픈.리딩.프라임을 검출할 수 있어서, 이것을 crtY 유전자로 명명하였다. 이 crtY 유전자의 염기서열과 코드된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제3 내지 제4도(서열번호 3)에 표시하였다.

또한 이 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 crtY 유전자 산물(CrtY)는 아미노산 서열 레벨로서, Erwinia uredovora의 CrtY와 44.3%의 아이덴티티 라는 중요한 상동성을 가지고 있고, 효소의 기능도 양쪽 모두 동일하다.

[실시예 9]

[다른 해양세균의 염색체 DNA와의 서젼 분석]

다른 해양 미생물의 염색체 위에서 단순하게 분리한 crtW와 crtZ와의 상동성을 나타낸 영역이 얻어지는 것을 검사하였다. 실시예 1에서 제조한 Alcaligenes sp. PC-1과 Alteromonas sp. SD-402의 염색체 DNA를 제한 효소 BamHI 및 PstI로 소화하고, 아칼로스겔 전기 영동법으로 분리했다. 전체적으로 분리한 DNA 단편을 0.5N NaOH, 1.5M NaCl의 알카리 용액으로 변성시킨 후, 하루밤동안 나이론멤브레인에 트랜스퍼시켰다. DNA가 흡착된 나이론멤브레인을 혼성화 용액(6xDenhardt, 5xSSC, pAK96K로 부터 BalI에서 절단한 crtW와 crtZ을 함유한 1.5kb의 DNA 단편을 Megaprime TM DNA 라벨링 시스템(아마샴)과 [a-3-2P]dCTP(~110TBq/mmol)을 이용해서 표식화하고, 상기의 예비혼성화 용액에 가해서 16시간, 60℃에서 혼성화를 행하였다.

혼성화 후, 2xSSC, 0.1% SDS에서 60℃, 1시간동안 세척한 오토라디오그래피에 의해 상동성을 표시하는 시그널을 검출한 결과, Alcaligenes sp. PC-1에서는 BamHI 소화물로 약 13kb, PstI 소화물로 2.35kb의 위치에 강한 시그널이 얻어지고, Alteromonas sp. SD-402에서는 BamHI 소화물로서 약 5.6kb, PstI 소화물로서 20kb 이상의 위치에 강한 시그널이 얻어졌다.

[실시예 10]

[다른 해양 세균에서의 크산토필 합성 유전자군의 취득]

실시예 9의 결과로부터 Alcaligenes sp. PC-1의 염색체 DNA의 PstI 소화물로서, 2.35kb 부근에 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1의 crtW와 crtZ 유전자를 포함한 DNA 단편과 혼성화하는 영역이 존재하는 것이 알려져서, Alcaligenes의 염색체 DNA을 PstI에서 소화한 후, 2.3kb의 크기의 DNA 단편을 아칼로스켈 전기 영동으로 부터 회수하였다. 회수한 DNA 단편을 벡터-pBluescript II SK+의 PstI 부위에 T4 DNA리가제를 이용해서 투입하고, 대장균 DH5α에 도입해서, Alcaligenes의 부분 라이브러리를 제작했다. 이 부분 라이브러리를, Agrobacterium의 crtW와 crtZ 유전자를 포함한 1.5kb의 DNA 단편을 프로브로 한 콜로니-혼성화로 제공한 결과, 약 5000 콜로니로부터 포지티브한 콜로니를 1개 단순하게 분리했다. 또한, 콜로니-혼성화의 조건은 실시예 9에 나타낸 서젼 분석법과 동일한 조건으로 행했다. 이어서, 얻어진 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 1개 단순하게 분리하고, PstI로 소화(消化)하여, 혼합한 DNA 단편의 크기를 조사한 바, 플라스미드 중에는 3개의 다른 단편이 포함되어 있다는 것이 알려졌다. 그래서, 3개의 다른 DNA 단편중에 실시예 9에 나타난 서젼 분석법으로 혼성화하는 2.35kb 단편 1개를 특별히 지정하여, 아칼로스겔 전기 영동법을 이용해서 이 2.35kb PstI 단편을 회수하고, 다시 한번 pBluescript II SK+의 PstI 부위에 투입해서, 플라스미드 pPC11, pPC12을 제조했다. pPC11과 pPC12에 있어서는 상기 2.35kb PstI 단편이 pBluescript II SK+의 PstI 부위에 상호 반대방향으로 투입된다. pPC11의 제한 효소 지도를 제19도에 나타냈다.

[실시예 11]

[Alcaligenes 크산토필 합성 유전자군의 염기 서열 결정]

pPC11 및 pPC12을 β-카로틴 산생 대장균에 도입한 경우, 전자는 아스다크산틴 등의 합성(실시예 12)에 의해 등색 콜로니로 되지만, 후자는 신규한 색소의 합성능을 부여하지 않는다. 따라서, 플라스미드 pPC11에 있는 아스다크산틴 합성 유전자군의 방향은 벡터-lac 프로모터의 방향과 동일하다고 여겨졌다. 또한, pPC11을 리코펜 산생 대장균에 도입하여도, 신규한 색소는 산생되지 않아서, pPC11에는 리코펜 고리화 효소 유전자는 포함되지 않는 것으로 알려졌다.

pPC11의 투입 단편 중 우측의 0.72kb BstEII-EcoRV 단편을 탈락시킨 플라스미드(pPC17로 명명, 제19도)를 β-카로틴 산생 대장균에 도입해도 pPC11을 도입한 경우와 동일한 양식으로 대장균 형질 전환체는 아스다크산틴등을 합성하는 것이 알려졌기 때문에(실시예 12), 이 pPC17에 있는 1.63kb PstI-BstEII 단편의 염기 서열을 결정했다.

결실 변이체 제조는 pPC17과 pPC12를 이용해서, 이하의 순서로 행하였다. pPC17 또는 pPC12, 각각 10㎍을 KpnI과 HinIII 또는 KpnI와 EcoRI에서 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출을 하고, 에탄올 침전에 의한 DNA를 회수했다. 각각의 DNA를 100㎕의 ExoIII 버퍼(500mM 트리스-염산, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂, 10mM 2-멜카프트에놀, pH 8.0)에 용해하고, 180 유니트의 ExoIII 뉴클레아제를 첨가해서 37℃에서 보온했다. 1분 쯤에 10㎕을 샘플링해서, 2개의 샘플로 분리해서, 20㎕의 MB 버퍼(40mM Na-Acetate, 100mM NaCl, 2mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, pH 4.5)가 들어간 빙상의 튜브로 이동시켰다. 샘플링 종결후, 얻어진 5본의 튜브를 65℃, 10분간 보온해서 효소의 활성을 잃게한 후, 5 유니트의 만그핀뉴클레아제를 첨가해서 37℃에서 30분간 보온했다. 반응후, 아칼로겔 전기 영동에 의해 1개의 플라스미드에 대해서 10종류 각각 결실 정도가 다른 DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA는 Klenow fragment에 의해 말단을 평골화하고, 16℃, 하루밤동안 라이게션 반응한 후, 대장균 JM109를 형질전환했다. 얻어진 다양한 클론에 대해서 헬파디 M13K07를 이용해서, 1본 사슬 DNA를 제조하고, 아프라이트 파이오 시스템(주)의 형광 프라이머-시클릭시퀀스키트를 이용해서 시퀀스 반응을 행하고, 자동 시퀀사를 이용해서 DNA 서열을 결정했다.

그 결과 얻어진 1631 염기대(bp)로 되는 DNA 서열을 제16 내지 제18도(서열번호 7)에 나타내었다. 개시 코돈의 앞에 리보좀 결합 부위가 존해하는 오픈.리딩.프레임의 검사 결과, 2종의 크산토필 합성 유전자 crtW, crtZ의 존재가 예상된 위치(실시예 13)에 각종의 단백질을 코드하는 2개의 오픈.리딩. 프레임(제16도 내지 제18도 중에서 A부터 B(서열번호 7의 염기 위치 99 내지 824), C부터 D(염기 위치 824 내지 1309))이 나타났다.

[실시예 12]

[Alcaligenes크산토필 합성 유전자군을 가진 대장균이 생산하는 색소의 동정]

(1) 아스다크산틴, 4-케토제아크산틴의 동정

실시예 11에서 제조한 pPC17의 델레이션 플라스미드에서 좌측의 BstEII 말단부터 제17도의 염기 번호 1162(서열번호 7의 염기 위치 1162)까지 결실 델레이션 폴라스미드(crtW만을 가짐) pPC17-3(제19도)로 명부했다.

이 pPC17-3을 제아크산틴 산생 대장균 JM101(실시예 7(1))에 도입한 것(pACCAR25△crtX, pPC17-3))(등색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함하는 2YT 배지 2ℓ에서 37℃ 18시간 배양했다. 배양액으로 부터 균을 모든 균체를 300㎖의 아세톤으로 추출했다. 이것을 농축후, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카켈 TLC 프레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(15/1)에서 전개하는 것에 의해 막층 크로마토그래피(TLC)을 행하였다. 원래의 등색 색소는 이 TLC에 의해 Rf값 0.54(약 25%), 0.72(약 30%), 0.91(약 25%)의 3개의 지점으로 분리되었다. Rf값 0.54와 0.72의 색소를 TLC 플레이트로부터 기록한 후, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에 용해하고, 세파텍스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에서 전개 용출하는 것으로, 댜양한 순품을 약 1㎎씩 얻었다.

이들 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, FD-MS 스펙트럼, 및 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(15/1)로 전개)가 4-케토제아크신틴, 및 아스다크산틴의 표준품(실시예 6,7(1))과 모두 일치하기 때문에 이들 물질을 4-케토제아크산틴(Rf 0.54) 및 아스다크산틴(Rf 0.72)과 동정했다. 또한, Rf값 0.91의 색소는 칸다크산틴이였다(실시예 12(2)).

또한, pPC11 또는 pPC17을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균(pACCAR16△crtX, pPC11 또는 pPC17))(등색을 띄고 있음)도 아스다크산틴, 4-케토제아크산틴 및 칸다크산틴을 산생하는 것이 동일한 방법의 분석에 의해 확인하였다. 또한, 이것이 미량의 페니코크산틴을 생산하는 것을 실시예 6에서 얻어진 표준품을 이용해서 확인하였다.

(2) 칸다크산틴의 동정

pPC17-3을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균 pACCAR16△crtX, pPC17-3))(등색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서, 37℃ 18시간 배양했다. 배양액으로 부터 균을 모은 균체를 300㎖의 아세톤으로 추출했다. 이것을 농축후, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그사에서 제작한 분취용 실리카켈 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(50/1)로 전개하는 것에 의해 막층 크로마토그패피(TLC)을 행하였다. 등색 색소 전체의 40%에 상응하는 최대 짙은 색소를 TLC 플레이트로 부터 기록하였다. 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 클로로포름/메탄올(1/1)에 용해하고, 세타텍스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 클로로포름/메탄올(1/1)로 전개 용출하는 것으로, 순품을 2mg 얻었다.

이들 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, FD-MS 스펙트럼(m/e564), 및 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개)가 칸다크산틴의 표준품(BASF사에서 제조))과 모두 일치하기 때문에, 본 물질을 칸다크산틴과 동정했다. 최초의 추출물에 보여진 등색 색소 전체의 50%에 상응하는 색소는 자외-가시 스펙트럼, 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개), 및 노파팩타HR6μC18(3.9×300mm)(워터스사 제조)를 이용한 HPLC의 이동도(아세트니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)로 전개(실시예 7(2) 참조)에서 에기네논이라고 여겨진다. 또한, 추출된 색소의 남겨진 10%은 미반응의 β-카로틴이였다.

(3) 제아크산틴의 동정

pPC11에 있는 1.15kb Sa1I 단편을 pPC11과 동일한 방향으로 pBluescript II SK×의 SalI 분위에 투입한 플라스미드(pPC13라고 명명, 제19도 참조)을 제조했다.

pPC13을 β-카로틴 산생 대장균 JM101에 도입한 것(대장균 pACCAR16△crtX, pPC13))(황색을 띄고 있음)을 150㎍/㎖의 Ap와 30㎍/㎖의 Cm을 포함한 2YT 배지 2ℓ에서, 37℃ 18시간 배양했다. 배양액으로 부터 균을 모은 균체를 300㎖의 아세톤으로 추출했다. 이것을 농축후, 200㎖의 클로로포름/메탄올(9/1)로 2회 추출하고, 농축 건조하였다. 또한, 이것을 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에 용해한 후, 멜그산에서 제작한 분취용 실리카겔 TLC 플레이트를 이용해서, 클로로포름/메탄올(9/1)에서 전개하는 것에 의해 막층 크로마토그래피(TLC)을 행하였다. 황색 색소 전체의 90%에 상응하는 최대 짙은 색소를 TLC 플레이트로부터 기록하였다. 또한, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탈올에 용해하고, 세파텍스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(15×300mm)로 분리하고, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올에서 전개 용출하는 것으로, 순품을 3㎎ 얻었다.

이들 물질에 있는 자외-가시 스펙트럼, FD-MS 스펙트럼(m/e568), 및 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(9/1)로 전개)가 제아크산틴의 표준품(실시예 7(3))과 모두 일치하기 때문에, 본 물질을 제아크산틴과 동정했다. 최초의 추출물에 보여진 황색 색소 전체의 10%에 사응하는 색소는 자외-가시 스펙트럼, 실리카겔 TLC의 이동도(클로로포름/메탄올(9/1)로 전개), 및 노파팩타HR6μ C18(3.9×300mm)(워터스사 제조)를 이용한 HPLC의 이동도(아세트니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)로 전개(실시예 7(3) 참조)에서 β-크립토크산틴이라고 여겨진다.

[실시예 13]

[Alcaligenes 크산토필 합성 유전자군의 동정]

(1) 케토기 도입 효소 유전자의 동정

pPC11에 포함된 2.35kb의 PstI 단편중, β-카로틴으로 부터 아스다크산틴의 합성에 필요한 모두의 유전자는 좌측의 1.63kb PstI-BamEII 단편(pPC17, 제19도) 중에 포함된 것이 실시예 11 및 실시예 12(1)의 결과로부터 명확해졌다. 따라서, 우측의 0.7kb BstEII-PstI 단편은 필요하지 않다. 이 pPC17의 1.63kb PstI-BamEII 단편 중에 1개의 SmaI 부위와 1개의 SalI 부위가 존재하였다(제19도). SmaI 및 SalI 부위의 좌측의 0.65kb 및 0.69kb의 단편을 취해 제거하면, 일부 케토기 도입 효소 활성이 없어지는 것이 이들 델레이션 플라스미드를 β-카로틴 산생 대장균에 도입하는 것을 이용한 색소 분석에 의해 확인되었다. 또한, 1.63kb PstI-BstEII 단편의 좌측의 0.69kb PstI-SalI 단편을 pBluescript SK+의 PstI-SalI 부위에 투입한 플라스미드가 케토기 도입 효소 활성을 가지지 않는 것은, 이 플라스미드를 β-카로틴 산생 대장균에 도입하는 것을 이용한 색소 분석에 의해 확인되었다. 한편, 좌측의 BstEII 말단으로부터 제17도의 염기 번호 1162(서열 번호 7의 염기 위치 1162)까지 결실된 델레이션 플라스미드 pPC17-3(제19도)에는 케토기 도입 효소 활성이 존재하는 경우(실시예 12(1)(2))로부터, pPC17-3 내의 1162bp 단편내에 β-카로틴 또는 제아크산틴을 기질로서 칸다크산틴 또는 아스다크산틴을 합성하는 효소 활성을 갖는 케토기 도입 효소를 코드하는 유전자가 존재하고, 이 유전자 중에 상기의 SamI 부위와 SalI 부위가 존재하고 있다고 여겨졌다. 염기 서열 결정의 결과, 이 유전자에 상응하는 개시코든의 직전에 리보좀 결합 부위를 갖는 오픈.리딩.프레임을 검출할 수 있어서, 이것을 crtW 유전자라고 명명했다. 이 crtW 유전자의 염기 서열과 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제13도 내지 제14도(서열 번호 5)에 표시되었다.

이 Alcaligene sp. PC-1의 crtW 유전자 산물(CrtW)은 β-이온논 고리(β-ionone ring)의 4번째 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가, β-카로틴(β-carotene)을 기질로서 에기네논을 경유해서 칸다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 12(2), 제11도 참조). 또한, crtW 유전자 산물은 3-히드록시-β-이오논 고리(3-hydroxy-β-ionone ring)의 4번재 위치의 메틸렌기를 케토기로 전환하는 효소활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예중 하나가 제아크산틴을 기질로서 4-케토제아크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 12(1), 제11도 참조). 또한, 이와 같은 효소 활성을 가지는 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 알려지지 않는 것이고, 이 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 알려지지 않은 것이고, 이 폴리펩티드 또는 이것을 코드하는 DNA 사슬은 현재까지 알려진 폴리펩티드 또는 DNA 사슬과도 전체적인 상동성을 가지지 않는다. 또한, Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1과 Alcaligenes sp. PC-1 사이의 crtW 유전자 산물(CrtW)는 아미노산 서열 레벨로서 83%의 아이덴티티라고 하는 높은 상동성을 가지고 있고, 효소의 기능도 양자에서 동일했다. 이들 아미노산 서열 중에서, 아이덴티티를 가지지 않은 17%의 영역의 아미노산 서열은 효소의 기능에 그렇게 중요하지 않다고 여겨진다. 따라서, 특히, 이 영역에 있어서 일부 다른 아미노산과 치환, 또는 결실, 또는 다른 아미노산의 부가를 행해도 효소 활성에 영향을 주지는 않는다고 여겨진다.

해양 세균의 케토기 도입 효소 유전자 crtW는 3번째 위치의 자리에 수산기가 부가되는지 부가되지 않는지에 관계없이, 4번째 위치의 메틸렌기를 직접 케토기로 전환하는 β-이오논 또는 3-히드록시-β-이오논 고리 케토기 도입 효소를 코드하고 있다고 할 수 있다. 또한, β-이오논 고리로 한정하지 않고, 1개의 효소가 메틸렌기를 갑자기 케토기로 전환한다고 알려진 것은 현재까지 전무했다.

(2) 수산기 도입 효소 유전자의 동정

β-카로틴으로 부터 아스다크산틴의 합성에 필요한 모두의 유전자는 pPC17의 1.63kb PstI-BstEII단편(제19도)중에 포함되어 있다. 이 pPC17의 1.63kb PstI-BstEII 단편 중에 1개의 SalI 부위가 존재하였다. 이 SalI 부위의 우측의 단편에 수산기 도입 효소 활성이 존재하는 것은 실시예 12(3)의 결과로부터 명백해졌다. 따라서, 수산기 도입 효소 유전자는 1.63kb PstI-BstEII 단편 중에서 우측의 단편에 있는 094kb SalI-BstEII 단편에 존재하는 것이 알려졌다. 염기 서열 결정의 결과, 이 유전자에 상응하고, 개시코든의 직전에 리보좀 결합 부위를 갖는 오픈.리딩.프레임을 검출할 수 있어서, 이것을 crtZ 유전자라고 명명했다. 이 crtZ 유전자의 염기 서열과 코드시킨 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제15도(서열 번호 6)에 표시되었다.

이 Alcaligenes sp. PC-1의 crtZ 유전자 산물(CrtZ)은 β-이온논 고리(β-ionone ring)의 3번째 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있고, 그의 구체적 예의 하나가, β-카로틴(β-carotene)을 기질로서 β-크립토크산틴을 경유해서 제아크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 12(3), 제11도 참조). 또한, crtZ 유전자 산물은 4-케토-β-이오논 고리(3-keto-β-inone ring)의 3번째 위치의 탄소에 수산기를 부가하는 효소활성도 가지고 있고, 그의 구체적 예중 하나가 칸다크산틴을 기질로서 페니코크산틴을 경유해서 아스다크산틴을 합성하는 효소 활성이다(실시예 12(1), 제11도 참조). 또한, 후자 효소 활성을 가지는 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 DNA 사슬은 종래 알려지지 않은 것이다. 또한, Acaligenes sp. PC-1의 CrtZ은 아미노산 서열 레벨로서, Erwinia uredovora의 CrtZ와 58%의 아이텐티티라고 하는 중요한 상동성을 나타냈다. 또한, Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1과 Alcaligenes sp. PC-1 사이의 crtZ 유전자 산물(CrtZ)은 아미노산 서열 레벨로서, 90%의 아이덴티티라고 하는 높은 상동성을 가지고 있고, 효소의 기능도 양쪽 모두에서 동일하였다. 이들 아미노산 서열 중에서, 아이덴티티를 가지지 않는 10%의 영역의 아미노산 서열은 효소의 기능에 그렇게 중요하지 않다고 여겨진다. 따라서, 특히 이 영역에 있어서는 얼마정도 다른 아미노산으로 치환, 또는 결실, 또는 다른 아미노산의 부가를 행하여도 효솨 활성에 영향을 주지 않는다.

(3) 마이너한 크산토필 생합성 경로의 고찰

식물에 항시 존재하는 세균 Erwinia와 광합성 세균 Rhodobacter의 카로티노이드 합성 유전자를 이용한 우리의 연구에 의해, 일반적으로, 카로티노이드 생합성 효소는 기질로 되는 카로티노이드 분자의 반정도를 인식해서 작용한다는 것이 판명되었다. 예를 들면, Erwinia의 리코펜 고리화 효소 유전자인 crtY는 리코펜분자의 반쯤을 인식해서 고리화하였다. 따라서, Rhodobacter의 피토엔데사튜라제 유전자 crtI를 이용하는 경우에 의한 리코펜의 변화로 노이로스포렌을 대장균에서 합성시키고, 이것에 Erwinia의 crtY를 작동시키면, 노이로스포렌에 있는 리코편과 공통된 반정도의 분자 구조 만큼을 crtY 유전자 산물은 인식하고, 반정도 만큼 고리화한 β-제아카로틴을 산생하였다(Linden, Hl, Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, I., Hirschberg, J., Sandmann, G., Functional complementation in Escherichia coli of different phytoene desaturase genes and analysis of accumulated carotenes′. Z. Naturforsch., 46c, p.1045-1051, 1991). 또한, 본 발명에 있어서도, β-카로틴과 제아크산틴에 CrtW를 작용시키면, 우선 1개 케토기가 도입된 에기네논과 4-케토제아크산틴이 합성되고, β-카로틴과 칸다크산틴에 CrtZ를 작용시키면, 우선 1개 수산기가 도입된 β-크립토크산틴과 페니코크산틴이 합성되었다. 이것은 이들 효소가 기질의 반정도의 분자를 인식한다라고 여겨질 수 있다. 따라서, 예를 들면, Erwinia의 crtE, crtB, crtI, crtY 유전자와 해양 세균의 crtZ를 갖는 대장균은 상술한 바와 같이, 제아크산틴을 산생하지만, 중간 대사물로서, β-카로틴에 1개 수산기가 도입된 β-크립토크산틴을 검출할 수 있다. 이 경우는 그곳에 CrtW가 존재하면, β-크립토크산틴을 기질로서 3′-히드록시에키네논과 3-히드록시에기네논을 합성할 수 있고, 또한, 이것에 CrtW가 작용해서 페니코크산틴을 합성할 수 있다고 여겨질 수 있다. 현재, 이들은 배양물 중에 이들 케토카로티노이드를 동정하는 것에는 이르지 않았지만, 이 이유는 현재 행한 조건에서는 이들의 미량밖에 존재하지 않기 때문이라고 생각된다. 사실, 한편의 유전자원인 해양 세균 Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1에 잇는 마이너한 아스다크산틴 중간 대사물로서 3-히드록시에기네논과 3′-히드록시에기네논의 검출이 보고되고 있다(횡산소요, 간섭, [해양성 세균에 있는 아스다크산틴 생합성에 대해서] 1994년 일본수산학회 춘계대회구연요지집, p252, 1994). 이상과 같이, 제11도에 나타낸 아스다크산틴의 주요 대사경로와 다르게 제20도에 나타난 마이너한 대사 경로도 존재한다고 여겨질 수 있다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명에 있어서, 해양 세균에서 아스다크산틴과 이들 외에 케토기를 함유한 크산토필(아스다크산틴, 페니코크산틴, 4-케토크산틴, 칸다크산틴, 에기네논)의 생합성에 필요한 유전자군의 취득에 성공하였고, 이들 유전자의 구조 내지 염기 서열 및 이들 기능을 명백하게 했다. 따라서, 본 발명에 의한 DNA 사슬은 이들을 외래 유전자로서 유전자 공학적 방법에 의해 대장균 등의 미생물을 형질전환해서 발현시키는 것에 의해, 대장균 등의 미생물에 아스다크산틴과 이외 다른 케토기를 함유하는 크산토필의 생합성능을 부여할 수 있는 유전자로서 유용하다.

[서열표]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 639

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Agrobacterium aurantiacus

주명 : sp. nov. MK1

[서열]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 489

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Agrobacterium aurantiacus

주명 : sp. nov. MK1

[서열]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 1161

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Agrobacterium aurantiacus

주명 : sp. nov. MK1

[서열]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 2886

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Agrobacterium aurantiacus

주명 : sp. nov. MK1

[서열]

서열번호 : 5

서열의 길이 : 729

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Alcaligenes

주명 : sp. PC-1

[서열]

서열번호 : 6

서열의 길이 : 489

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Alcaligenes

주명 : sp. PC-1

[서열]

서열번호 : 7

서열의 길이 : 1631

서열의 형 : 핵산(및 대응의 아미노산 서열)

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Genomic DNA

기원 : 생물명 : Alcaligenes

주명 : sp. PC-1

[서열]

Claims

β-이오논 고리 및/또는 3-히드록시-β-이오논 고리의 4번 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 가지고 있어서 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 번호 1 내지 212까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.
β-이오논 고리 및/또는 3-히드록시-β-이오논 고리의 4번 위치의 메틸렌기를 케토기로 변환하는 효소활성을 가지고 있어서 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 5의 아미노산 번호 1 내지 242까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.
4-케토-β-이오논 고리의 3번 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있어서 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 2의 아미노산 번호 1에서 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.
4-케토-β이오논 고리의 3번 위치의 탄소에 1개의 수산기를 부가하는 효소활성을 가지고 있어서 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 6의 아미노산 번호 1에서 162까지의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코드하는 염기서열을 가지는 DNA 사슬.
제1항 또는 제2항에 따른 DNA 사슬을 β-카로틴을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물로부터 칸다크산틴 또는 에기네논을 얻는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 미생물이 세균 또는 효모인 것인 크산토필의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따른 DNA 사슬을 제아크산틴을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고 배양물로부터 아스다크산틴 또는 4-케토제아크산틴을 얻는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 미생물이 세균 또는 효모인 것인 크산토필의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따른 DNA 사슬을 칸다크산틴을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고 배양물로부터 아스다크산틴 또는 페니코크산틴을 얻는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 미생물이 세균 또는 효모인 것인 크산토필의 제조방법.
제1항 또는 제2항 및 제3항 또는 제4항에 따른 DNA 사슬을 β-카로틴을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양물로부터 아스다크산틴 또는 페니코크산틴을 얻는 것을 특징으로 하는 크산토필의 제조방법.