ES2225836T3 - Cadena de adn util para la sintesis de xantofilas y proceso para producir xantofilas. - Google Patents
Cadena de adn util para la sintesis de xantofilas y proceso para producir xantofilas.Info
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Abstract
LAS SIGUIENTES CADENAS DE ADN SE REFIEREN A XANTOFILOS QUE TIENEN UN GRUPO CETO, REPRESENTADOS POR ASTAXANTINA, Y LA SIGUIENTE TECNICA SE REFIERE A LA PRODUCCION MEDIANTE INGENIERIA GENETICA DE XANTOFILOS: UNA CADENA DE ADN QUE TIENE UNA SECUENCIA DE BASE QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE CONVERSION DEL GRUPO 4-METILENO DEL ANILLO {BE}IONONA EN UN GRUPO CETO; UNA CADENA DE ADN QUE TIENE UNA SECUENCIA DE BASE QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE CONVERTIR EL GRUPO 4-METILENO DE UN ANILLO DE 3-HIDROXI-{BE}-IONONA EN UN GRUPO CETO; UNA CADENA DE ADN QUE TIENE UNA SECUENCIA DE BASE QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE AÑADIR UN GRUPO DE HIDROXILO AL ATOMO DE CARBONO 3 DE UN ANILLO DE 4-CETO-{BE}IONONA; Y UN PROCESO PARA PRODUCIR DIFERENTES XANTOFILAS, TALES COMO CANTAXANTINA Y ASTAXANTINA, INTRODUCIENDO LAS MENCIONADAS CADENAS DE ADN EN UN MICROORGANISMO ADECUADO, POR EJEMPLO, "ESCHERICHIA COLI", SIGUIENDOCON LA EXPRESION DE LAS MISMAS.
Description
Cadena de ADN útil para la síntesis de xantofilas
y procesos para producir xantofilas.
La presente invención se refiere a cepas de ADN
útiles para la síntesis de xantofilas que contienen grupos ceto
(cetocarotenoides) tales como astaxantina que son útiles para
aumentar el color de peces cultivados y moluscos tales como besugos,
salmones, langostas y similares y se usa para comidas como agente
colorante y antioxidante, y a un proceso para producir xantofilas
que contienen grupos ceto (cetocarotenoides) tales como astaxantina
con uso de un microorganismo en el que las cepas de ADN han sido
introducidas.
El término xantofilas indica pigmentos
carotenoides que poseen un grupo que contiene oxígeno como un grupo
hidroxilo, un grupo ceto o un grupo epoxi. Los carotenoides están
sintetizados mediante el proceso biosintético de isoprenoides que
se utiliza en caminos comunes con esteroides y otros terpenoides
con ácido mevalónico como material de partida. El C15 farnesil
pirofosfato (FPP) resultante de la ruta biosintética básica de
isopreno se condensa con C5 isopentenil pirofosfato (IPP) para
proporcionar C20 geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Dos moléculas
de GGPP se condensan para sintetizar un fitoeno incoloro como un
carotenoide inicial. El fitoeno se convierte en fitoflueno,
\zeta-caroteno, neurosporeno y entonces licopeno
mediante una serie de reacciones de desaturación, y licopeno es a su
vez convertido en \beta-caroteno mediante la
reacción de ciclación. Se cree que una variedad de xantofilas son
sintetizadas introduciendo un grupo hidroxilo o un grupo ceto en el
\beta-caroteno (Véase Britton, G., "Biosynthesis
of Carotenoids"; Plant Pigments, Goodwin, T.W. ed., London,
Academic Press, 1988, pp. 133-182).
Los presentes inventores han hecho posible
recientemente de clonar un cluster génico de biosíntesis de
carotenoides de una bacteria epifita no fotosintética Erwinia
uredovora en Escherichia coli con un índice de tono
amarillo de la bacteria, una variedad de combinaciones de los genes
siendo expresaos en microorganismos tales como Escherichia
coli para producir fitoeno, licopeno,
\beta-caroteno, y zeaxantina que es un derivado de
\beta-caroteno en que los grupos hidroxilo han
sido introducidos (Véase Fig. 10; Misawa, N., Nakagawa, M.,
Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima, K.;
"Elucidation of the Erwinia uredovora Carotenoid
biosynthetic Pathway by Functional Analysis of Gene Products
Expressed in Escherichia coli" J. Bacteriol., 172,
p.6704-6712, 1990; Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga,
H., "Production of \beta-carotene in
Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia
uredovora", Appl. environ. Microbiol., 57, p.
1847-1849, 1991; y Solicitud de Patente Japonesa
No. 53255/1990):"DNA Strands useful for the Synthesis of
Carotenoids").
Por otro lado, la astaxantina, una xantofila
roja, es un carotenoide típico de animales que aparece
particularmente en una amplia variedad de animales marinos
incluyendo peces rojos como besugo y salmón, y crustáceos como
langosta y cangrejo. En general, los animales no pueden
biosintetizar carotenoides, por lo que es necesario para ellos
ingerir carotenoides sintetizados por microorganismos o plantas de
su ambiente. Así, la astaxantina ha sido hasta ahora ampliamente
utilizada para potenciar el color de peces cultivados y mariscos
como besugo, salmón, langosta y similares. Además, la astaxantina
ha atraído la atención no sólo por su función colorante en alimentos
sino por ser un antioxidante que elimina el oxígeno activo generado
en el cuerpo, que causa carcinoma (Véase Takao Matsuno ed.,
"Physiological Functions and Bioactivities of carotenoids in
Animals", Kagaku to Seibutsu, 28, p. 219-227,
1990). Como fuentes de Astaxantina, se conocen crustáceos como krill
en el Océano Antártico, productos cultivados de una levadura
Phaffia, productos cultivados de un alga verde
Haematococcus, y productos obtenidos mediante los métodos de
síntesis orgánica. No obstante, cuando los crustáceos como el krill
en el Océano Antártico o similares se han utilizado, requiere un
trabajo laborioso y muchos gastos el aislamiento de astaxantina de
los contaminantes como lípidos y similares durante la separación y
extracción del krill. Además, en el caso del producto cultivado de
Phaffia, son necesarios muchos gastos para la recolección y
extracción de astaxantina, ya que la levadura posee paredes
celulares rígidas y produce astaxantina sólo en una bajo
proporción. También, en el caso del producto cultivado del alga
verde Haematococcus, no solo una es necesaria una
localización para recoger la luz del sol o una inversión en un
aparato de cultivo para proporcionar una luz artificial para
proporcionar luz que es esencial para la síntesis de astaxantina,
sino también es difícil de separar astaxantina de los ésteres de
ácidos grasos como productos secundarios o clorofilas presentes en
los productos cultivados. Por estas razones, la astaxantina
producida a partir de fuentes biológicas es en la presente
situación inferior a la obtenida mediante los métodos sintéticos
orgánicos en base a su precio. Los métodos sintéticos orgánicos no
obstante tienen un problema de productos secundarios producidos
durante las reacciones en consideración de su uso como comida para
peces y crustáceos y un aditivo para alimentos, y los productos
obtenidos mediante los métodos sintéticos orgánicos son opuestos a
las preferencias del consumidor para los productos naturales. Así,
ha sido necesario proporcionar una astaxantina barata que es
inofensiva y producida a partir de fuentes biológicas y así presenta
una buena imagen a los consumidores y a desarrollar un proceso para
producir la astaxantina.
Se considerará muy útil encontrar un grupo de
genes para jugar un rol de la biosíntesis de astaxantina, debido a
que es posible conseguir la capacidad de producir astaxantina en un
microorganismo óptimo en seguridad como alimento o en potencialidad
de producir astaxantina, independientemente de la presencia de la
capacidad de producir astaxantina, introduciendo un cluster génico
para la biosíntesis de astaxantina en microorganismos. No se causan
problemas de productos secundarios como contaminantes en este caso,
por lo que se considerará no muy difícil de aumentar la cantidad de
producción de astaxantina con una técnica avanzada reciente de
manipulación génica a un nivel mayor del que se alcanza mediante
los métodos de síntesis orgánica. No obstante, los grupos de genes
para sintetizar zaexantina, una de las xantofilas, han sido
adquiridos ya por los presentes inventores como se ha descrito
antes, mientras que no se ha obtenido con éxito genes que codifican
un enzima que introduce grupos ceto necesarios para la síntesis de
astaxantina. La razón del fracaso en la obtención de genes incluye
que el enzima que introduce grupos ceto es una proteína de membrana
y pierde su actividad y no se ha obtenido información del enzima.
Así, ha sido imposible hasta ahora producir astaxantina en
microorganismos mediante manipulación génica.
El objeto de la presente invención es
proporcionar cadenas de ADN que contienen genes necesarios para
producir xantofilas que contienen grupos ceto (cetocarotenoides)
como astaxantina, y proporcionar un proceso para producir xantofilas
que contienen grupos ceto (cetocarotenoides) tales como astaxantina
con los microorganismos en los que las cadenas de ADN han sido
introducidas.
El método de clonaje de genes que se utiliza
normalmente y que comprende normalmente la purificación de la
proteína pretendida, la determinación parcial de la secuencia de
aminoácidos y la obtención de genes mediante una sonda sintética, no
puede emplearse debido a que la purificación del enzima sintético
de astaxantina es imposible tal como se ha descrito antes. De esta
manera, los presentes inventores han mostrado atención al hecho de
que el cluster de los genes de síntesis de carotenoides en
bacterias no fotosintéticas (Erwinia) funciona en
Escherichia coli, en los que el licopeno y el
\beta-caroteno se creen que son intermediarios
para la biosíntesis de astaxantina se permiten producir en
combinación con genes del cluster génico, y han usado Escherichia
coli como huésped para clonar los genes sintéticos de
astaxantina. Los presentes inventores también han prestado atención
a los hechos de que algunas bacterias marinas poseen la habilidad
de producir astaxantina (Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W.,
"Marine bacteria produced astaxanthin", 10th International
Symposium on Carotenoids, Resumen, CL11-3, 1993),
que una serie de genes relacionados constituirán un cluster en el
caso de bacterias, y que el cluster de genes será expresado
funcionalmente en Escherichia coli en el caso de las
bacterias. Los presentes inventores han seleccionado así las
bacterias marinas como fuente de genes. Han llevado a cabo
investigaciones con una combinación de estos dos medios y han
obtenido con éxito el grupo de genes que es necesario para la
biosíntesis de astaxantina y las otras xantofilas que contienen
grupos ceto a partir de bacterias marinas. De esta manera se ha
cumplido la presente invención. Además, se ha esclarecido por
primera vez en la presente invención que el cluster génico de la
síntesis de astaxantina en bacterias marinas constituya un cluster
y exprese su función en Escherichia coli, y estos productos
génicos pueden utilizar \beta-carotenos o
licopenos como sustrato.
Las cadenas de ADN de acuerdo con la presente
invención se han publicado como sigue.
(1) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo \beta-ionona en el grupo ceto.
(2) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo \beta-ionona en el grupo ceto y que posee
una secuencia de aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos
Nos. 1-212 que se muestran en el Id. de Sec.
No:2.
(3) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (2) y que posee una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática descrita
en (2).
(4) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo \beta-ionona en el grupo ceto y que posee
una secuencia de aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos
Nos. 1-242 que se muestran en el Id. de Sec.
No:9.
(5) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (4) y que posee una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática descrita
en (4).
(6) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el \beta-caroteno en
cantaxantina vía equinenona y que posee una secuencia de
aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos Nos.
1-212 que se muestran en el Id. de Sec. No:2.
(7) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (6) y que posee una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática descrita
en (6).
(8) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el \beta-caroteno en
cantaxantina vía equinenona y que posee una secuencia de
aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos Nos.
1-242 que se muestran en el Id. de Sec. No:9.
(9) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (8) y que posee una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática descrita
en (8).
(10) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto.
(11) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto y que posee una secuencia de aminoácidos
sustancialmente de los aminoácidos Nos. 1-212 que
se muestran en el Id. de Sec. No:2.
(12) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (11) y que posee una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática
descrita en (11).
(13) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir el grupo metileno en la posición 4 del
anillo
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto y que posee una secuencia de aminoácidos
sustancialmente de los aminoácidos Nos. 1-242 que
se muestran en el Id. de Sec. No:9.
(14) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (13) y que posee una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática
descrita en (13).
(15) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir zeaxantina en astaxantina por medio de
4-cetozeaxantina y que posee una secuencia de
aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos Nos.
1-212 que se muestran en el Id. de Sec. No:2.
(16) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (15) y que posee una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática
descrita en (15).
(17) Una cadena de ADN con una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que posee una actividad
enzimática para convertir zeaxantina en astaxantina por medio de
4-cetozeaxantina y que posee una secuencia de
aminoácidos sustancialmente de los aminoácidos Nos.
1-242 que se muestran en el Id. de Sec. No:9.
(18) Una cadena de ADN que hibrida con la cadena
de ADN descrita en (17) y que posee una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido que posee una actividad enzimática
descrita en (17).
La presente invención también se refiere a un
proceso para producir xantofilas.
Esto es, el proceso para producir xantofilas de
acuerdo con la presente invención se publica a continuación.
(1) Un proceso para producir una xantofila que
comprende la introducción de una cadena de ADN descrita en
cualquiera de las cadenas de ADN mencionadas antes (1)-(9) en un
microorganismo que posee la habilidad de sintetizar
\beta-carotenos, cultivando el microorganismo
transformado en un medio de cultivo, y obteniendo cantaxantina o
equinenona a partir de las células cultivadas.
(2) Un proceso para producir una xantofila que
comprende la introducción de una cadena de ADN descrita en
cualquiera de las cadenas de ADN mencionadas antes (10)-(18) en un
microorganismo que posee la habilidad de sintetizar zeaxantina,
cultivando el microorganismo transformado en un medio de cultivo, y
obteniendo astaxantina o 4-cetozeaxantina a partir
de las células cultivadas.
(3) Un proceso para producir una xantofila de
acuerdo con cualquiera de los procesos mencionados anteriormente
(1)-(2) en donde el microorganismo es una bacteria o una
levadura.
La Fig.1 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del gen del enzima que introduce el grupo
ceto (gen crt W) de la bacteria marina Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1 y la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido a ser codificado de esta manera.
La Fig.2 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del gen del enzima que introduce el grupo
hidroxilo (gen crt Z) de la bacteria marina Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1 y la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido a ser codificado de esta manera.
La Fig.3 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del gen del enzima que cicla licopeno (gen
crt Y) de la bacteria marina Agrobacterium aurantiacus sp.
nov. MK1 y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido a ser
codificado de esta manera.
La Fig.4 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 3.
La Fig.5 ilustra en forma de diagrama la
continuación del cluster génico de la síntesis de xantofilas de la
bacteria marina Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1.
Las letras A-F en la Fig.5
corresponden a aquellas en las Figs. 1-4.
La Fig. 6 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 5.
La Fig. 7 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 6.
La Fig. 8 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 7.
La Fig. 9 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 8.
La Fig. 10 ilustra en forma de diagrama la ruta
de síntesis de carotenoides de la bacteria no fotosintética
Erwinia uredovora y las funciones de los genes
sintetizadores de carotenoides
La Fig. 11 ilustra en forma de diagrama las
principales rutas biosintéticas de xantofilas de la bacteria marina
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 y Alcaligenes
sp. PC-1 y las funciones de los genes de síntesis
de xantofilas.
La función del gen crtY, no obstante, sólo
ha sido confirmado en la anterior bacteria.
La Fig. 12 ilustra en forma de diagrama una
variedad de plásmidos de deleción que contienen los genes de
síntesis de xantofilas (cluster) de la bacteria marina
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1.
La letra P representa el promotor de lac
del vector pBluescript II SK. Las posiciones de corte con los
enzimas de restricción están representados por abreviaciones como
sigue: Sa, SacI; X, XbaI; B, BamHI; P,
PstI; E, EcoRI; S, SalI; A, ApaI; K,
KpnI; St, StuI; N, NruI; Bg, BglII; Nc,
NcoI; Hc, HincII.
La Fig. 13 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del gen del enzima que introduce el grupo
ceto (gen crt W) de la bacteria marina Alcaligenes sp.
PC-1 y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido
a ser codificado de esta manera.
La Fig. 14 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 13.
La Fig. 15 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del gen del enzima que introduce el grupo
hidroxilo (gen crtZ) de la bacteria marina Alcaligenes sp.
PC-1 y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido
a ser codificado de esta manera.
La Fig. 16 ilustra en forma de diagrama la
secuencia de nucleótidos del cluster de genes que sintetizan
xantofila de la bacteria marina Alcaligenes sp.
PC-1 y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido
a ser codificado de esta manera. Las letras A-D en
la Fig. 16 corresponden a aquellas en las Figs.
13-15
La Fig. 17 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 16.
La Fig. 18 ilustra en forma de diagrama la
continuación de las secuencias siguiendo aquellas ilustradas en la
Fig. 17.
La Fig. 19 ilustra en forma de diagrama una
variedad de plásmidos de deleción que contienen los genes de
síntesis de xantofilas (cluster) de la bacteria marina
Alcaligenes sp. PC-1.
La letra P representa el promotor de
lac del vector pBluescript II SK+.
La Fig. 20 ilustra en forma de diagrama las rutas
biosintéticas de xantofilas que contienen rutas biosintéticas
menores en la bacteria marina Agrobacterium aurantiacus sp.
nov. MK1. y Alcaligenes sp. PC-1 y las
funciones de los genes de síntesis de xantofilas.
Las rutas biosintéticas menores se representan
mediante flechas punteadas.
La presente invención pretende proporcionar
cadenas de ADN que son útiles para sintetizar xantofilas que
contienen un grupo ceto (cetocarotenoides) tales como astaxantina
derivadas de una bacteria marina Agrobacterium aurantiacus
sp. nov. MK1. y Alcaligenes sp. PC-1, y un
proceso para producir xantofilas que contienen un grupo ceto
(cetocarotenoides), es decir, astaxantina, fenicoxantina,
4-cetozeaxantina, cantaxantina, y equinenona con uso
de un microorganismo en los que las cadenas de ADN han sido
introducidos.
Las cadenas de ADN de acuerdo con la presente
invención están en principio ilustradas generalmente por las
cadenas de ADN anteriormente mencionadas (1) y (10) desde el punto
de vista de la fina reacción química generadora, y básicamente
definida por las cadenas de ADN anteriormente mencionadas (2), (4),
(11), y (13). Los ejemplos específicos de las cadenas de ADN (2) y
(4) son las cadenas de ADN anteriormente mencionadas (6) y (8); los
ejemplos específicos de las cadenas de ADN (11) y (13) son las
cadenas de ADN anteriormente mencionadas (15) y (17). Relacionado
con esto, las cadenas de ADN (3), (5), (7), (9), (12), (14), (16) y
(18) hibridan con las cadenas de ADN (2), (4), (6), (8), (11),
(13), (15) y (17) respectivamente, bajo condiciones
astringentes.
Los polipéptidos codificados por las cadenas de
ADN de acuerdo con la presente invención poseen secuencias de
aminoácidos sustancialmente en un rango tal como se ha descrito
antes en los Id. de Sec. nos. 2 y 4 y 9 y 11 (Figs.
1-2, y 13-15), pej. una secuencia de
aminoácidos de los aminoácidos Nos. 1-212 en los
Id. de Sec. nos. 2 (A-B en la Fig.1). En la presente
invención, cuatro polipéptidos codificados por estas cadenas de
ADN, (que son cuatro enzimas que participan en la reacción
productoras de xantofila) puede ser modificada por deleción,
sustitución o adición en algunos de los aminoácidos con la excepción
de los polipéptidos que poseen las actividades enzimáticas tal como
se ha descrito antes (ver ejemplo 13). Esto corresponde con
"secuencias de aminoácidos ...sustancialmente..." por ejemplo,
un enzima cuyo primer aminoácido es (Met) ha sido delecionado
también está involucrado en el polipéptido o enzima obtenido por la
modificación de la secuencia de aminoácidos. En esta conexión, no es
necesario decir que las cadenas de ADN de acuerdo con la presente
invención para codificar los polipéptidos también incluyen, además
de aquellos que poseen secuencias de nucleótidos en un rango
específico mostrado en los Id de Sec nos: 2, 4, 9 y 11 (Figs.
1-2, y 13-15), isómeros degenerados
que codifican los mismos polipéptidos que antes excepto codones
degenerados.
Las cadenas de ADN (1)-(18) son genes que
codifican los enzimas que introduce grupos ceto (referidos de aquí
en adelante como crtW). Ejemplos típicos de los genes son
genes crtW clonados de la bacteria marina Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1. o Alcaligenes sp.
PC-1, que son las cadenas de ADN que comprenden las
secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos que poseen
las secuencias de aminoácidos A-B en la Fig.1
(aminoácidos Nos. 1-242 en los Id de Sec Nos:9). El
producto génico crtW (también referido de aquí en adelante
como CrtW) posee una actividad enzimática para convertir el grupo
4-metileno del anillo \beta-ionona
en un grupo ceto, y uno de los ejemplos específicos es una actividad
enzimática para sintetizar la cantaxantina con
\beta-caroteno como sustrato mediante la vía de la
equinenona (Ver Fig. 11). Además, el producto génico de crtW
también posee una actividad enzimática para convertir el grupo
4-metileno de del anillo
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto, y uno de los ejemplos específicos es una
actividad enzimática para sintetizar astaxantina con zeaxantina como
sustrato por la vía de la 4-cetozeaxantina (Ver
Fig. 11). En esta conexión, los polipéptidos que poseen tales
actividades enzimáticas y las cadenas de ADN que codifican los
polipéptidos no han sido hasta ahora comunicados, y los
polipéptidos o las cadenas de ADN que codifican los polipéptidos no
poseen una homología total con los polipéptidos o las cadenas de
ADN que han sido hasta ahora comunicados. Además, se ha mostrado
una homología de CrtW del 83% de identidad a nivel de secuencia de
aminoácidos entre Agrobacterium y Alcaligenes.
Por otro lado, es posible permitir a un
microorganismo como Escherichia coli o similar de producir
\beta-caroteno o zeaxantina usando los genes de
síntesis de carotenoides de la bacteria no fotosintética
Erwinia, que son los genes de Erwinia crtE, crtB,
crtI y crtY permitir al microorganismo tal como
Escherichia coli o similar la capacidad de producir
\beta-caroteno, y los genes de Erwinia crtE,
crtB, crtI, crtY y crtZ y permitir al microorganismo tal
como Escherichia coli o similar la capacidad de producir
zeaxantina (ver Fig. 10 y la Publicación revelada de WO91/13078).
Así, el sustrato de CrtW se suministra mediante el cluster génico
crt de Erwinia, por lo que cuando se introduce un gen
adicional de CrtW en un microorganismo tal como
Escherichia coli o similar que contiene el cluster génico
mencionado antes crt de Erwinia, el microorganismo
productor de \beta-caroteno producirá cantaxantina
por la vía de la equinenona, y los microorganismos productores de
zeaxantina producirán astaxantina por la vía de la
4-cetozeaxantina.
Las cadenas de ADN ejemplificados por los Id de
Sec Nos: 4 y 11 son genes que codifican los enzimas que introduce
grupos hidroxilo (referidos de aquí en adelante como crtZ).
Ejemplos típicos de los genes son genes crtZ clonados de la
bacteria marina Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1. o
Alcaligenes sp. PC-1, que son las cadenas de
ADN que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los
polipéptidos que poseen las secuencias de aminoácidos
C-D en la Fig.2 (aminoácidos Nos.
1-162 en los Id de Sec Nos:4) o C-D
en la Fig. 15 (aminoácidos Nos. 1-162 en los Id de
Sec Nos:11) El producto génico crtZ (también referido de aquí
en adelante como CrtZ) posee una actividad enzimática para añadir
un grupo hidroxilo al átomo de carbono 3 del anillo
\beta-ionona, y uno de los ejemplos específicos es
una actividad enzimática para sintetizar la zeaxantina con
\beta-caroteno como sustrato mediante la vía de
la \beta-criptoxantina (Ver Fig. 11). Además, el
producto génico de crtZ también posee una actividad
enzimática para añadir un grupo hidroxilo al átomo de carbono 3 del
4-ceto-\beta-ionona,
y uno de los ejemplos específicos es una actividad enzimática para
sintetizar astaxantina con cantaxantina como sustrato por la vía de
la fenicoxantina (Ver Fig. 11). En esta conexión, los polipéptidos
que poseen esta última actividad enzimática y las cadenas de ADN
que codifican el polipéptido no han sido hasta ahora comunicados.
Además, se ha mostrado una homología muy alta entre el CrtZ de
Agrobacterium y Alcaligenes con el CrtZ de Erwinia
uredovora (57% y 58% de identidad), respectivamente, a nivel de
secuencia de aminoácidos. Además, se ha encontrado un nivel de
homología de más del 90% de identidad a nivel de secuencia de
aminoácidos en el gen CrtZ de Agrobacterium y
Alcaligenes.
Ha sido descrito antes que es posible permitir a
un microorganismo como Escherichia coli o similar de
producir \beta-caroteno usando los genes de
síntesis de carotenoides de la bacteria no fotosintética
Erwinia. Además, ha sido descrito antes que es posible
permitir a un microorganismo como Escherichia coli o similar
de producir cantaxantina añadiéndole crtW a ellos. Así, el
sustrato de CrtZ de Agrobacterium o Alcaligenes es
proporcionado por los genes crtE, crtB, crtI y crtY de
Erwinia (producción de \beta-caroteno), y
el gen CrtW de Agrobacterium o Alcaligenes añadido a ellos,
para que cuando el gen CrtZ de Agrobacterium o
Alcaligenes sea introducido a un microorganismo como
Escherichia coli o similar que contiene el grupo génico
crt, el microorganismo productor de
\beta-caroteno producirá zeaxantina por la vía de
la \beta-criptoxantina, y los microorganismos
productores de cantaxantina producirán astaxantina por la vía de la
fenicoxantina.
Las cadenas de ADN que codifican la secuencia de
aminoácidos sustancialmente de E a F de las Figs. 3 y 4
(aminoácidos Nos. 1-386 en el Id de Sec. No: 6) es
un gen que codifica un enzima que cicla licopenos (referido de aquí
en adelante como crtY).Un ejemplo típico del gen es el gen
crtY clonado de la bacteria marina Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1, que es la cadena de ADN que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que posee
la secuencia de aminoácidos E-F en las Figs.3 y 4.
El producto génico crtY (también referido de aquí en
adelante como CrtY) posee una actividad enzimática para la síntesis
de \beta-caroteno con licopeno como sustrato (ver
Fig. 11). Es posible permitir a un microorganismo como
Escherichia coli o similar de producir licopeno usando los
genes de síntesis de carotenoides de la bacteria no fotosintética
Erwinia, que son los genes crtE, crtB y crtI de
Erwinia que proporcionan a un microorganismo como
Escherichia coli o similar la capacidad de biosíntesis de
licopeno (ver Fig. 10, y Publicación revelada de WO91/13078). Así,
el sustrato de CrtY de Agrobacterium se suministra mediante
el grupo génico crt de Erwinia, por lo que cuando se
introduce el crtY de Agrobacterium en un
microorganismo tal como Escherichia coli o similar que
contiene el grupo génico crt, es posible permitir al
microorganismo producir \beta-caroteno.
En esta conexión, el CrtY de Agrobacterium
en presenta una homología significativa de un 44,35 de identidad
con el CrtY de Erwinia uredovora a nivel de secuencia de
aminoácidos, y estos enzimas CrtY poseen también la misma función
enzimática (ver Figs. 10 y 11).
La bacteria marina Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1 y Alcaligenes sp.
PC-1 como fuentes de los genes sintéticos de
xantofila muestran las siguientes propiedades bacteriológicas.
<Agrobacterium aurantiacus sp. nov.
MK1>
Forma y tamaño de la bacteria: bastón, 0,9 \mum
x 1,2 \mum;
Motilidad; Sí;
Flagelo: flagelo periférico;
Polimorfismo de la célula: ninguno;
Esporogénesis: ninguna;
Tinción Gram: negativa;
Placa de cultivos de agar: se forman colonias
naranjas circulares no-difusivas con brillo.
Cultivo inclinado de agar: se forman una banda
naranja no-difusiva con brillo.
Cultivo de picadura en medio de gelatina:
crecimiento sobre la superficie alrededor del poro de la
picadura.
Reducción de nitrato: positiva;
Reacción de desnitrificación: negativa;
Formación de indol: negativa;
Utilización de ácido cítrico: negativo;
Formación de pigmentos: pigmento naranja rojizo
soluble en grasas;
Actividad ureasa: negativa;
Actividad oxidasa: positiva;
Actividad catalasa: positiva;
Actividad \beta-glucosidasa
(degradabilidad de esculina): positiva;
Actividad \beta-galactosidasa:
positiva;
Rango de crecimiento: pH, 5-9;
temperatura, 10-40ºC:
Comportamiento con oxígeno: aeróbico;
Durabilidad en agua de mar: positiva;
Test O-F: oxidación;
Capacidad anabólica de sacáridos:
Positivo: D-glucosa,
D-manosa, D-galactosa,
D-fructosa,lactosa, maltosa, sacarosa, glucógeno,
N-acetil-D-glucosamina;
Negativo: L-arabinosa,
D-manitol, inositol, L-ramnosa,
D-sorbitol;
Capacidad anabólica de los ácidos orgánicos:
Positivo: lactato;
Negativo: citrato, malato, gluconato, caprinato,
succinato, adipato;
Capacidad anabólica de otros materiales
orgánicos:
Positivo: inosina, uridina,
glucosa-1-fosfato,
glucosa-6-fosfato;
Negativo: gelatina, L-arginina,
ADN, caseína.
<Alcaligenes sp.
PC-1>
Forma y tamaño de la bacteria: bastón corto, 1,4
\mum;
Motilidad; Sí;
Flagelo: flagelo periférico;
Polimorfismo de la célula: ninguno;
Esporogénesis: ninguna;
Tinción Gram: negativa;
Placa de cultivos de agar: se forman colonias
naranjas circulares no-difusivas con brillo.
Cultivo inclinado de agar: se forman una banda
naranja no-difusiva con brillo.
Cultivo de picadura en medio de gelatina:
crecimiento sobre la superficie alrededor del poro de la
picadura.
Formación de pigmentos: pigmento naranja rojizo
soluble en grasas;
Actividad oxidasa: positiva;
Actividad catalasa: positiva;
Rango de crecimiento: pH, 5-9;
temperatura, 10-40ºC:
Comportamiento con oxígeno: aeróbico;
Durabilidad en agua de mar: positiva;
Test O-F: oxidación;
Degradabilidad de gelatina: negativa.
Ha sido descrito hasta ahora que 16 bacterias
marinas poseen la capacidad de síntesis de cetocarotenoides tales
como astaxantina y similares (Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W.,
"Marine bacteria produced astaxanthin", 10th International
Symposium on Carotenoids, Resumen, CL11-3, 1993). Si
cualquiera de los genes crt de las anteriormente mencionadas
bacterias marinas Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o
Alcaligenes sp. PC-1 se utiliza como una
sonda, el cluster génico juega un papel en la biosíntesis de
cetocarotenoides tales como astaxantina y similares se podrán
obtener a partir de otras bacterias marinas productoras de
astaxantina utilizando la homología de los genes. De hecho, los
presentes inventores han obtenido con éxito los genes crtW y
crtZ como los fragmentos de ADN fuertemente hibridantes del
ADN cromosómico de Alcaligenes PC-1 usando un
fragmento de ADN que contiene crtW y crtZ de Ag.
aurantiacus sp. nov. MK1 como una sonda (ver Ejemplos para los
detalles). Además, cuando se seleccionó Ateromonas
SD-402 de las restantes 14 bacterias marinas que
poseen la capacidad de sintetizar astaxantina y un ADN cromosómico
se preparó con eso y se sometió a un experimento con un fragmento
de ADN que contiene crtW y crtZ de Ag.
aurantiacus sp. nov. MK1, la sonda hibridada con las bandas
derivadas del ADN cromosómico de las bacterias marinas. Las cadenas
de ADN de acuerdo con la presente invención también incluyen una
cadena de ADN que hibrida con las cadenas de ADN (2), (4), (6),
(8), (11), (13), (15) y (17).
Aunque uno de los métodos para obtener la cadena
de ADN con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia
de aminoácidos de cada enzima descrita antes es para sintetizar
químicamente al menos una parte de la longitud de cadenas de
acuerdo con el método para sintetizar un ácido nucleico, se cree que
es más preferible que el método de síntesis química para obtener la
cadena de ADN usando el ADN total que ha sido digerido con un
enzima de restricción apropiado para preparar una biblioteca de
Escherichia coli, a partir de la cual se obtiene la cadena
de ADN mediante los métodos utilizados de forma convencional en el
campo de la ingeniería genética tales como los métodos de
hibridación con una sonda apropiada (ver el cluster génico de
síntesis de xantofila de las otras bacterias marinas).
Puede prepararse una variedad de xantofilas
mediante la introducción las cadenas de ADN presentes descritas
antes en los microorganismos apropiados tales como bacterias, por
ejemplo Escherichia coli, Zymomonas mobilis y
Agrobacterium tumefaciens, y levaduras, por ejemplo
Saccharomyces cerevisiae.
El plan para introducir un gen extraño en un
microorganismo preferido se describe a continuación.
El procedimiento o método para introducir y
expresar el gen extraño en un microorganismo tal como
Escherichia coli o similares que comprende los que se
utilizan normalmente en el campo de la ingeniería genética además de
aquellos descritos a continuación en la presente invención y pueden
llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento o método (ver,
pej., "Vectores para clonar genes", Methods in Enzimology,
216, p. 469-631, 1992, Academic Press, y "Other
bacterial Systems", Methods in Enzimology, 204, p.
305-636, 1991, Academic Press).
El método para introducir genes extraños en
Escherichia coli incluye muchos métodos eficientes tales
como el método de Hanahan y el método del rubidio, y los genes
extraños pueden ser introducidos de acuerdo con aquellos métodos
(ver, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.,
"Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Mientras que los genes extraños en
Escherichia coli pueden ser expresados de acuerdo con los
métodos convencionales (ver por ejemplo "Molecular Cloning - A
Laboratory Manual"), la expresión puede llevarse a cabo por
ejemplo con un vector para Escherichia coli que posee un
promotor lac y similar para insertar los genes crtW,
crtZ y crtY de Agrobacterium aurantiacus sp. nov.
MK1 y los genes crtW y crtZ de Alcaligenes sp.
PC-1 y se permite expresar estos genes en
Escherichia coli.
El método para introducir genes extraños en la
levadura Saccharomyces cerevisiae incluye los métodos que ya
han sido establecidos como el método del litio y similares, y la
introducción puede llevarse a cabo de acuerdo con estos métodos
(ver, por ejemplo, Ed. Yuichi Akiyama, compilado por
Bio-Industry Association, "New Biotechnology of
Yeast", publicado por IGAKU SHUPPAN CENTER). Los genes extraños
pueden ser expresados en levaduras usando un promotor y un
terminador tal que PGK y GPD para construir un casete de expresión
en que el gen extraño es insertado entre el promotor y el
terminador para que la transcripción se lleve a cabo, e insertando
el casete de expresión en un vector tal que el sistema YRp que es
un vector multicopia para levaduras que posee la secuencia ARS del
cromosoma de levaduras como origen de replicación, el sistema YEp
que es un vector multicopia para levaduras que posee el origen de
replicación del ADN de 2 \mum de levadura, y el sistema YIp que
es un vector para integrar un cromosoma de levadura que no posee
origen de replicación de levadura (ver "New Biotechnology for
Yeast", publicado por IGAKU SHUPPAN CENTER, ibid.; NIPPON
NOGEI-KAGAKU KAI ABC series "Genetic Engineering
for Producing Materials", publicado por AKASHURA SHOTEN; y
Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H., Misawa, N.,
"Metabolic Engineering for Production of
\beta-carotene and lycopene in Saccharomyces
cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., 58, p.
1112-1114, 1994).
Se pueden introducir genes extraños en
Zymomonas mobilis mediante el método de transferencia
conjugada que es común para las bacterias Gram negativas, y los
genes extraños pueden expresarse usando un vector pZA22 para
Zymomonas mobilis (ver Katsumi Nakamura, "Molecular
Breeding of Zymomonas mobilis", Nippon Nogei Kagaku
Kaishi, 63, p. 1016-1018, 1989; y Misawa, N.,
Yamano, S., Ikanaga, H., "Production of
\beta-carotene in Zymomonas mobilis and
Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis
genes from Erwinia uredovora", Appl. Environ. Microbiol.,
57, p.1847-1849, 1991).
Se pueden introducir genes extraños en una
bacteria patógena de plantas Agrobacterium tumefaciens
mediante el método de transferencia conjugada que es común para las
bacterias Gram negativas, y los genes extraños pueden expresarse
usando un vector pPI121 para una bacteria tal que Agrobacterium
tumefaciens (ver Misawa, N., Yamano, S., Ikanaga, H.,
"Production of \beta-carotene in Zymomonas
mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of
the biosynthesis genes from Erwinia uredovora", Appl.
Environ. Microbiol., 57, p.1847-1849, 1991).
El cluster génico para la síntesis de
cetocarotenoides como astaxantina derivada de una bacteria marina
puede ser introducido y expresado por el procedimiento o método
descrito antes para introducir y expresar un gen extraño en un
microorganismo.
Farnesil pirofosfato (FPP) es un sustrato que es
común no sólo a carotenoides sino también a otros terpenoides como
sesquiterpenos, triterpenos, esteroles, hopanoles y similares. En
general, los microorganismos sintetizan terpenoides aún si no
pueden sintetizar carotenoides, por lo que todos los microorganismos
pueden poseer básicamente FPP como un metabolito intermediario.
Además, el cluster génico de síntesis de carotenoides de una
bacteria no fotosintética Erwinia posee la capacidad de
sintetizar los substratos de los productos del gen crt de
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o Alcaligenes
sp. PC-1 usando FPP como sustrato (ver Fig. 10). Los
presentes inventores han confirmado ya que cuando el grupo de genes
crt de Erwinia es introducido en no sólo Escherichia
coli sino también los microorganismos anteriormente mencionados,
esto es la levadura Saccharomyces cerevisiae, la bacteria
productora Zymomonas mobilis, o la bacteria patogénica de
plantas Agrobacterium tumefaciens, carotenoides tales como
(\beta-caroteno y similares pueden producirse,
como se esperó, por estos microorganismos (Yamano, S., Ishii, T.,
Nakagawa, M., Ikenaga, H., Misawa, N.,"Metabolic Engineering for
Production of \beta-Carotene and Lycopene in
Saccharomyces cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., 58,
p. 1112-1114, 1994; Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga,
H., "Production of \beta-Carotene in
Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
Introduction of the Biosynthetic Genes from Erwinia
uredovora", Appl. Environ. Microbiol., 57, p.
1847-1849, 1991; y Solicitud de Patente Japonesa
No. 58786/1991 (Solicitud de Patente Japonesa No. 53255/1990) por
los presentes inventores; "DNA strands useful for the Synthesis
of Carotenoids"). Así, será posible en principio permitir a todos
los microorganismos, en los que se establezca la introducción del
gen y el sistema de expresión, producir cetocarotenoides tales como
astaxantina y similares por introducción de la combinación del
cluster génico de síntesis de carotenoides derivados de
Erwinia y las Cadenas de ADN de acuerdo con la presente
invención (normalmente el cluster génico de síntesis de carotenoides
deriva de Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o
Alcaligenes sp. PC-1) al mismo tiempo en el
mismo microorganismo. El proceso para producir una variedad de
cetocarotenoides en microorganismos se describe a continuación.
Es posible producir cantaxantina como producto
final y equinenona como un metabolito intermediario mediante la
introducción en un microorganismo como Escherichia coli y
expresando los genes crtE, crtB, crtI y crtY de Erwinia
uredovora necesarios para la síntesis de
\beta-caroteno y cualquiera de las cadenas de ADN
de la presente invención (1) - (9) que es gen de enzima que
introduce un grupo ceto (normalmente, el gen de crtW de
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o Alcaligenes
PC-1). Los rendimientos o las proporciones de
cantaxantina y equinenona pueden ser cambiados controlando los
niveles de expresión de la cadena de ADN (gen crtW) o examinando las
condiciones de cultivo de un microorganismo que posee la cadena de
ADN. Se describen a continuación dos realizaciones en Escherichia
coli, y más detalles serán ilustrados en los Ejemplos.
Se introdujeron en Escherichia coli JM101
un plásmido pACCAR16\DeltacrtX con un fragmento que contiene los
genes crtE, crtB, crtI y crtY de
Erwinia uredovora que fue insertado en el vector pACYC184 de
Escherichia coli y un plásmido pAK916 con un fragmento que
contiene el gen crtW de Agrobacterium aurantiacus sp.
nov. MK1 que fue insertado en el vector vector pBluescript II SK-
de Escherichia coli y se cultivaron hasta la fase
estacionaria para recoger células bacterianas y para extraer
pigmentos carotenoides. Los pigmentos extraídos comprendieron el
94% de cantaxantina y el 6% de equinenona. También, se obtuvo
cantaxantina en un rendimiento de 3 mg partiendo de 2 litros de la
solución de cultivo.
Se introdujeron en Escherichia coli JM101
un plásmido pACCAR16\DeltacrtX con un fragmento que contiene los
genes crtE, crtB, crtI y crtY de Erwinia
uredovora que fue insertado en el vector pACYC184 de
Escherichia coli y un plásmido pPC17-3 con un
fragmento que contiene el gen crtW de Alcaligenes
PC-1 que fue insertado en el vector pBluescript II
SK+ de Escherichia coli y se cultivaron hasta la fase
estacionaria para recoger células bacterianas y para extraer
pigmentos carotenoides. Los pigmentos extraídos comprendieron el
40% de cantaxantina y 50% de equinenona. El resto comprendió un 10%
de \beta-caroteno sin reaccionar.
Es posible producir astaxantina como producto
final y 4-cetozeaxantina como un metabolito
intermediario por introducción en un microorganismo como
Escherichia coli o similares y expresando los genes crtE,
crtB, crtI, crtY y crtZ de Erwinia uredovora
necesarios para la síntesis de zeaxantina y cualquiera de las
cadenas de ADN de la presente invención (10) - (18) que es un gen de
un enzima que introduce grupos ceto (normalmente, el gen
crtW de Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o
Alcaligenes PC-1). Las proporciones o
relaciones de astaxantina y 4-cetozeoxantina pueden
cambiarse por control de los niveles de expresión de la cadena de
ADN (gen crtW) o examinando las condiciones de cultivo de un
microorganismo que tiene la cadena de ADN.
Se describen a continuación dos realizaciones de
Escherichia coli, y más detalles serán ilustrados en los
Ejemplos.
Se introdujeron en Escherichia coli JM101
un plásmido pACCAR25\DeltacrtX con un fragmento que contiene los
genes crtE, crtB, crtI, crtY y crtZ de Erwinia
uredovora que fue insertado en el vector pACYC184 de
Escherichia coli y un plásmido pAK916 con un fragmento que
contiene el gen crtW de Ag. aurantiacus sp. nov. MK1
que fue insertado en el vector vector pBluescript II SK- de
Escherichia coli y se cultivaron hasta la fase estacionaria
para recoger células bacterianas y para extraer pigmentos
carotenoides. La proporción de los pigmentos extraídos fue de 1,7 mg
de astaxantina y 1,5 mg de 4-cetozeaxantina basado
en 2 litros de solución de cultivo.
Se introdujeron en Escherichia coli JM101
un plásmido pACCAR25\DeltacrtX con un fragmento que contiene los
genes crtE, crtB, crtI, crtY y crtZ de Erwinia
uredovora que fue insertado en el vector pACYC184 de
Escherichia coli y un plásmido pPC17-3 con un
fragmento que contiene el gen crtW de Alcaligenes
PC-1 que fue insertado en el vector pBluescript II
SK+ de Escherichia coli y se cultivaron hasta la fase
estacionaria para recoger células bacterianas y para extraer
pigmentos carotenoides. La proporción de pigmentos extraídos fue
de 1 mg de astaxantina y 4-cetozeaxantina,
respectivamente basado en 2 litros de solución de cultivo.
Es posible producir astaxantina como producto
final y fenicoxantina como un metabolito intermediario por
introducción en un microorganismo como Escherichia coli o
similares y expresando los genes crtE, crtB, crtI y
crtY de Erwinia uredovora necesarios para la síntesis
de \beta-caroteno, cualquiera de las cadenas de
ADN de la presente invención (1) - (9) que es un gen de un enzima
que introduce grupos ceto (normalmente, el gen crtW de
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 o Alcaligenes
PC-1), y cualquiera de las cadenas de ADN de la
presente invención ejemplificadas por los Id. de Sec Nos. 4 y 11
que es un gen de un enzima que introduce grupos hidroxilo
(normalmente, el gen crtZ de Ag. aurantiacus sp. nov.
MK1 o Alcaligenes PC-1). Las proporciones o
relaciones de astaxantina y fenicoxantina pueden cambiarse por
control de los niveles de expresión de la cadena de ADN (genes
crtZ y crtW) o examinando las condiciones de cultivo
de un microorganismo que tiene la cadena de ADN. Una realización en
Escherichia coli se describe a continuación, y será ilustrado
con más detalles en los Ejemplos.
Se introdujeron en Escherichia coli JM101
un plásmido pACCAR16\DeltacrtX con un fragmento que contiene los
genes crtE, crtB, crtI y crtY de Erwinia
uredovora que fue insertado en el vector pACYC184 de
Escherichia coli y un plásmido pAK96K con un fragmento que
contiene el gen crtW y crtZ de Ag. aurantiacus
sp. nov. MK1 que fue insertado en el vector pBluescript II SK- de
Escherichia coli y se cultivaron hasta la fase estacionaria
para recoger células bacterianas y para extraer pigmentos
carotenoides. La proporción de los pigmentos extraídos comprendidos
fue de 3 mg de astaxantina y 2 mg de fenicoxantina partiendo de 4
litros de la solución de cultivo.
Los microorganismos como las fuentes de genes de
las cadenas de ADN de la presente invención y Escherichia
coli portando los genes aislados (las cadenas de ADN de la
presente invención) han sido depositados en el National Institute
of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and
Technology.
- (i)
- Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1
- Depósito No: FERM BP-4506
- Fecha de Depósito: 20 de diciembre de 1993
- (ii)
- Escherichia coli JM101 (pAccrt-EIB, pAK92)
- Depósito No: FERM BP-4505
- Fecha de Depósito: 20 de diciembre de 1993
- (iii)
- Alcaligenes sp. PC-1
- Depósito No: FERM BP-4760
- Fecha de Depósito: 27 de Julio de 1994
- (iv)
- Escherichia coli P: pPC17
- Depósito No: FERM BP-4761
- Fecha de Depósito: 27 de Julio de 1994
La presente invención se describe más
específicamente con referencia a los siguientes ejemplos sin
restricción de la invención. Además, los experimentos ordinarios de
la manipulación génica empleados aquí está basado en los métodos
estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., "Molecular.
Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989), a menos que se especifique lo contrario.
Los ADNs cromosómico se prepararon a partir de
tres cadenas de bacterias marinas, es decir, Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1, Alcaligenes sp.
PC-1, y Alteromonas SD-402
(Yokoyama, A., Izumida, H., Miki, W., "Marine bacteria produced
astaxantin", 10th International Simposium on Carotenoids,
Resumen, CL11-3, 1993). Tras hacer crecer cada una
de estas bacterias marinas en 200 ml de un medio de cultivo (un
medio de cultivo preparado de acuerdo con las instrucciones de
"Marine broth" elaborado por DIFCO) a 25ºC durante 4 días a la
fase estacionaria, se recogieron las células bacterianas, se lavaron
con un tampón TES (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1 M NaCl, pH 8), se
sometieron a un tratamiento de calor a 68ºC durante 15 minutos, y
se suspendieron en la solución I (50 mM glucosa, 25 mM Tris, 10 mM
EDTA, pH 8) que contiene 5 mg/ml de lisozima (elaborado por
SEIKAGAKU KOGYO) y 100 \mug/ml de RNasa A (elaborado por Sigma).
Tras la incubación de la suspensión a 37ºC durante 1 hora, se añadió
Proteinasa K (elaborado por Boehringer-Mannheim) y
la mezcla se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Tras añadir SARCOSIL
(N-lauroilsarcosina Na, elaborado por Sigma) a la
concentración final de 1% y la mezcla fue suficientemente mezclada,
se incubó a 37ºC durante varias horas. La mezcla se extrajo varias
veces con fenol/cloroformo, y etanol en una cantidad a dos tiempos
se añadió lentamente. El ADN cromosomal así depositado se enrolló
alrededor de una varilla de vidrio, se aclaró con 70% etanol y se
disolvió en 2 ml de un tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) para
preparar una solución de ADN cromosomal.
Tras la eliminación del fragmento BstEII
(1235) - Eco521 (4926) de un plásmido pCAR16 que posee un
cluster génico de síntesis de carotenoides menos el gen crtZ
de Erwinia uredovora (Misawa, N.,Nakagawa, M., Kobayashi, K.,
Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima, K., "Elucidation
of the Erwinia uredovora Carotenoid Biosynthetic Pathway by
Functional Analysis of Gen Porducts expressed en Escherichia
coli", J. Bacteriol., 172, p. 6704-6712,
1990; y Solicitud de Patente Japonesa No. 58786/1991 (Solicitud de
Patente Japonesa No. 53255/1990): "DNA Strands useful for the
Synthesis of Carotenoids"), un fragmento de 2,3 kb de Asp718
(Kpni) – EcoRI que contiene los genes crtE y crtB
necesarios para la producción de fitoenos se extrajo. Este
fragmento se insertó entonces en el sitio EcoRV del vector pACYC184
de E. coli para proporcionar el plásmido esperado
(pACCRT-EB). La bacteria E. coli que
contiene pACCRT-EB presenta resistencia hacia el
antibiótico cloramfenicol (Cmr) y produce fitoenos (Linden, H.,
Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, I., Hirschberg, J., Sandmann,
G., "Functional Complementation in Escherichia coli of
Different Phytoene Desaturase Genes and Analysis of Accumulated
Carotenes", Z. Naturforsch., 46c, 1045-1051,
1991).
Tras la eliminación del fragmento BstEII
(1235) – SnaBI (3497) de un plásmido pCAR16 que posee un
cluster génico de síntesis de carotenoides menos el gen crtZ
de Erwinia uredovora un fragmento de 3,75 kb de Asp718
(Kpni) - EcoRI que contiene los genes crtE, crtI, y
crtB necesarios para la producción de licopenos se extrajo.
Este fragmento se insertó entonces en el sitio EcoRV del
vector pACYC184 de E. coli para proporcionar el plásmido
esperado (pACCRT-EIB). La bacteria E. coli
que contiene pACCRT-EIB presenta Cm^{r} y produce
licopeno (Cunningham Jr, F. X., Chamovitz, D., Misawa, N., Gatt, E.,
Hirschberg, J., "Cloning and Functional Expression in
Escherichia coli of Cyanobacterial Gene for Lycopene Cyclase,
the Enzyme that catalyzes the Biosynthesis of
\beta-Carotenes", FEBS Lett., 328,
130-138, 1993).
Tras inactivar el gen crtX al someter un
plásmido pCAR16 con un cluster génico de síntesis de carotenoides
excepto el gen crtZ de Erwinia uredovora a digestión
con el enzima de restricción BstEII, el tratamiento con el
fragmento Klenow y la reacción de ligación, se extrajo un fragmento
de 6,0 kb Asp718 (KpnI) - EcoRI que contiene los genes
crtE, crtY, crtI y crtB necesarios para la producción
de \beta-caroteno. Este fragmento se insertó en
el sitio EcoRV del vector pACYC184 de E.coli para
proporcionar el plásmido esperado (referido de aquí en adelante
como pACCAR16\DeltacrtX). La bacteria E. coli que contiene
pACCAR16\DeltacrtX presenta Cm^{r} y produce
\beta-caroteno. En esta conexión, los restricción
enzimas de restricción y enzimas usados para manipulación genética
han sido comprados de TAKARA SHUZO (K.K.) o
Boehringer-Mannheim.
Tras añadir el enzima de restricción
Sau3AI en una cantidad de una unidad a 25 \mug del ADN
cromosómico de Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1, la
mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos y se trató con calor a
68ºC durante 10 minutos para inactivar el enzima de restricción.
Bajo esta condición, muchos fragmentos parcialmente digeridos con
Sau3AI se obtuvieron de alrededor de 40 kb. El cósmido pJBB
(resistente a ampicilina (Ap^{r})) que se había sometido a una
digestión con BamHI y tratamiento con fosfatasa alcalina y
el brazo derecho (fragmento corto) de pJBB que había sido digerido
con SalI/BamHI y luego recuperado del gel se mezclaron
con una parte de los anteriores fragmentos parciales Sau3AI,
y ligados a 12ºC durante la noche. En esta conexión, pJBB se compró
de Amersham.
Se obtuvieron partículas fágicas en una cantidad
suficiente para preparar una biblioteca cosmídica mediante el
empaquetamiento in vitro con un Gigapack Gold (elaborado por
Stratagene; disponible de Funakoshi) usando el ADN anterior
ligado.
Después de que Escherichia coli DH1
(ATCC33849) y Escherichia coli DH1, cada uno de los cuales
posee uno de los tres plásmidos preparados en el Ejemplo 2, se
infectaran con las partículas fágicas, estas bacterias se diluyeron
hasta encontrar de 100 - 300 colonias por placa, se plaquearon en LB
que contiene antibióticos apropiados (1% triptona, 0.5% extracto de
levadura, 1% NaCl), y se incubaron a 37ºC o temperatura ambiente
toda la noche hasta varios días.
Como resultado, en las bibliotecas cosmídicas que
poseen la Escherichia coli (beige) o la Escherichia
coli productora de fitoeno (beige) con
pACCRT-EB como huésped, no se obtuvieron colonias
con color cambiado a pesar del cribaje de diez mil o más colonias
de las respectivas bibliotecas. Por otro lado, en las bibliotecas
cosmídicas que tienen la Escherichia coli productora de
licopeno (rojo claro) con pACCRT-EIB o la
Escherichia coli productora de
\beta-caroteno (amarillo) con pACCAR16AcrtX como
huésped, aparecieron colonias naranjas en una proporción de una
cadena en varios cientos de colonias, respectivamente. La mayoría de
estas cadenas de Escherichia coli transformadas que
presentan un color naranja contenían el plásmido pJB8 en los que se
clonaron fragmentos de 40 kb parcialmente digeridos con
Sau3AI. También se entiende del hecho de que no aparecen
colonias con el color cambiado en las bibliotecas cosmídicas que
tienen la Escherichia coli sencilla o la Escherichia
coli productora de fitoeno con pACCRT-EB como
huésped, que Escherichia coli que posee una capacidad de
producir un intermediario sintético de carotenoides de los últimos
pasos de al menos fitoeno será usado como huésped para el propósito
de expresión clonaje del cluster génico de síntesis de xantofila a
partir del ADN cromosómico de Agrobacterium aurantiacus sp.
nov. MK1.
Cuando se seleccionaron varias veces diez
colonias individuales de entre las colonias naranjas obtenidas en
bibliotecas cosmídicas que tienen la Escherichia coli
productora de licopenos (rojo claro) con pACCRT-EIB
o la Escherichia coli productora de
\beta-caroteno (amarilla) con
pACCAR16\DeltacrtX como huésped para analizar los plásmidos,
fueron insertados fragmentos de 33 kb - 47 kb parcialmente
digeridos con Sau3AI en el vector pJB8 en todas las colonias
excepto una cadena. La cadena restante (Escherichia coli
productora de licopenos como huésped) contiene un plásmido, en que
un fragmento de 3,9 kb parcialmente digerido con Sau3AI se
insertó en pJB8 (referido de aquí en adelante como plásmido pAK9).
Este fue considerado como el que se formó por la deleción in
vivo del fragmento insertado tras la infección a Escherichia
coli. El mismo pigmento (identificado como astaxantina en el
Ejemplo 6) como el obtenido en las colonias naranjas de otras
bibliotecas cosmídicas se sintetizó exitosamente con la
Escherichia coli productora de licopenos con pAK9, pAK9 se
usó como un material en los siguientes análisis.
Un fragmento de 3,9 kb insertado con EcoRI
preparado de pAK9 se insertó en el sitio EcoRI del vector
pBluescrip II SK+ de Escherichia coli para proporcionar dos
plásmidos (pAK91 y pAK92) con las direcciones opuestas del
fragmento al vector. El mapa de restricción de uno de los plásmidos
(pAK92) se ilustra en la Fig. 12. Cuando pAK92 se introdujo en la
Escherichia coli productora de licopenos, se obtuvieron
colonias naranja como resultado de la síntesis de astaxantina
(Ejemplo 6). No obstante, no se alcanzó la capacidad para
sintetizar nuevos pigmentos aún si pAK91 se introdujo en la
Escherichia coli productora de licopenos. Se consideró de
esta manera que el cluster génico de síntesis de pigmentos en el
plásmido pAK92 posee la misma dirección que el promotor lac
del vector. A continuación, cada uno de los fragmentos de 2,7 kb de
Pstl obtenidos por la digestión con Pstl de pAK91, un
fragmento de 2,9 kb de BamHI obtenido por la BamHI
digestión de pAK92, y fragmentos de 2,3 kb y 1,6 kb Sal1 obtenidos
por la digestión de Sal1 de pAK92 se clonó en el vector pBluescrip
II SK-. Los mapas de restricción de los plásmidos referidos como
pAK94, pAK96, pAK98, pAK910, pAK93, y pAK95 se ilustran en la Fig.
12. Los plásmidos pAK94, pAK96, pAK98 y pAK910 poseen el cluster
génico de síntesis de pigmentos en la misma dirección que el
promotor lac del vector, mientras que los plásmidos pAK93 y
pAK95 poseen el cluster génico de síntesis de pigmentos en la
dirección opuesta del promotor.
Se ha encontrado que cuando el plásmido pAK96 que
posee un fragmento de 2,9 kb de BamHI se introduce en la
Escherichia coli productora de licopenos, el transformante
también sintetizó astaxantina como en el caso cuando el plásmido
pAK92 con un fragmento de 3,9 kb de EcoRI se introdujo
(Ejemplo 6), por lo que se determinó la secuencia de ADN del
fragmento de 2,9 kb de BamHI.
La secuencia de ADN se determinó por la
preparación de mutantes de deleción; del fragmento de 2,9 kb de
BamHI de las direcciones normales y opuestas y determinando
la secuencia usando clones con varias longitudes de deleción. Los
mutantes de deleción se prepararon de los cuatro plásmidos pAK96,
pAK98, pAK93 y pAK95 de acuerdo con el siguiente procedimiento: 10
\mug de cada uno de los plásmidos, se decompuso con SacI y
XbaI y se extrajo con fenol/cloroformo para recuperar el ADN
por precipitación con etanol. Cada ADN se disolvió en 100 \mul de
tampón ExoIII (50 mM Tris-HC1, 100,mM NaCl, 5 mM
MgCl_{2}, 10 mM 2-mercaptoetanol, pH 8,0), se
añadieron 180 unidades de ExollI nucleasa, y la mezcla se mantuvo a
37ºC. Una porción de 10 \mul se muestreó cada minuto, y dos
muestras se transfirieron en un tubo que contenía 20 \mul de
tampón MB (40 mM de acetato de sodio, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl_{2},
10% glicerol, pH 4,5) y que se situó en hielo. Tras completar el
muestreo, cinco tubos así obtenidos se mantuvieron a 65ºC durante
10 minutos para inactivar el enzima, se añadieron cinco unidades de
nucleasa de fríjol de oro, y las mezclas se mantuvieron a 37ºC
durante 30 minutos. Tras la reacción, cinco fragmentos de ADN
diferentes unos de otros en los grados de deleción se recuperaron de
cada plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa. Los
fragmentos de ADN así recuperados se finalizaron en romo con el
fragmento Klenow, y sometido a reacción de ligación a 16ºC durante
la noche, y se transformó Escherichia coli JM109. Un ADN de
cadena sencilla se preparó de cada uno de los diferentes clones así
obtenido con un fago ayudante M13K07, y se sometió a la secuencia
reacción con un equipo de ciclos de secuencias con cebador
fluorescente disponible de Applied Biosystem (K.K.), y la secuencia
de ADN se determinó con un secuenciador automático.
La secuencia de ADN que comprende 2886 pares de
base (pb) así obtenida se ilustra en las Figs. 5 - 9 (ID. DE SEC.
NO.: 7). Como resultado de examinar un marco de lectura abierto con
un sitio de unión a ribosoma delante del codón de iniciación, tres
marcos de lectura abiertos que pueden codificar las
correspondientes proteínas (A - B (posiciones de nucleótidos 229 -
864 del ID. DE SEC. NO.: 7), C - D (posiciones de nucleótidos 864 -
1349), E - F (posiciones de nucleótidos 1349 - 2506) en las Figs. 5
- 9) se encontraron en las posiciones donde los tres genes de
síntesis de xantofilas crtW; crtZ y crtY se esperan
que estén presentes. Para los dos marcos de lectura abiertos de A -
B y E - F, el codón de iniciación es GTG, y para los restantes
marcos de lectura abiertos C - D, es ATG.
La Escherichia coli JM101 productora de
licopenos portadora de pAK92 o pAK96 introducida en ella
(Escherichia coli (pACCRT-EIB, pAK92 o
pAK96); mostrando color naranja) o la Escherichia coli JM101
productora de \beta-carotenos portadora de pAK94
o pAK96K (Fig. 12) introducida en ella (Escherichia coli
(pACCAR16\DeltacrtX, pAK94 o pAK96K); mostrando color naranja) se
cultivó en 4 litros de un medio de cultivo 2YT (1,6% triptona, 1%
extracto de levadura, 0,5% NaCl) que contiene 150 \mug/ml de
ampicilina (Ap, manufacturado por Meiji Seika) y 30 \mug/ml de
cloramfenicol (Cm, fabricado por Sankyo) a 37ºC durante 18 horas.
Las células bacterianas recogidas de la solución de cultivo se
extrajeron con 600 ml de acetona, se concentraron, se extrajeron
dos veces con 400 ml de cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron
hasta sequedad. Entonces, se realizó una cromatografía en capa fina
(TLC) para disolver el residuo en una pequeña cantidad de
cloroformo/metanol (9/1) y progresando en una placa de gel de
sílice para TLC preparativa elaborada por Merck con
cloroformo/metanol (15/1). El pigmento original naranja se separó en
tres puntos en los valores de Rf de 0,72, 0,82 y 0,91 por TLC. El
pigmento del punto más oscuro Rf 0,72 correspondiente al 50% de la
cantidad total de pigmento naranja y el pigmento del segundo punto
más oscuro en Rf 0,82 se rascaron de la placa de TLC, se
disolvieron en una pequeña cantidad de cloroformo/metanol (9/1) o
metanol, y se cromatografiaron en una columna Sephadex
LH-20 (15 x 300 mm) con un eluyente de
cloroformo/metanol (9/1) o metanol para proporcionar los materiales
purificados en una proporción de 3 mg (Rf 0,72) y 2 mg (Rf 0,82),
respectivamente.
Se ha esclarecido de los resultados del espectro
UVvisible, 1H-RMN y FD-MS (m/e 596)
que el pigmento a Rf 0,72 posee la misma estructura planar
que la astaxantina. Cuando el pigmento se disolvió en dietil éter:
2-propanol: etanol (5: 5: 2) para medir el espectro
CD, se comprobó que poseía la configuración estereoquímica de 3S,
3'S, y así identificado como astaxantina; ver Fig.
11-para la fórmula estructural). También, el
pigmento a Rf 0,82 se identificó como fenicoxantina (ver Fig. 11
para la fórmula estructural) de los resultados de su espectro
UV-visible, 1H-RMN y
FD-MS (m/e 580). Además, el pigmento a 0,91 fue
cantaxantina (Ejemplo 7(2)).
La Escherichia coli productora de
zeaxantina se preparó de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se
debe decir, que el plásmido pCAR25 que posee el clúster génico
total de síntesis de carotenoides de Er. uredovora (Misawa,
N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura,
K., Harashima, K., "Elucidation of the Erwinia uredovora
Carotenoid Biosintetic Pathway by Functional Analysis of Gen
Products expressed in Escherichia coli", J. Bacteriol.,
172, p. 6704-6712, 1990; y Solicitud de Patente
Japonesa No. 58786/1991 (Solicitud de Patente Japonesa No.
53255/1990): "DNA Strands useful for the Synthesis of
Carotenoids") se digirió con el enzima de restricción
BstEII, y se sometió al tratamiento con el te fragmento
Klenow y reacción de ligación para inactivar el gen crtX por
cambio del marco de lectura, y entonces se corta un fragmento de 6,5
kb Asp718 (KpnI) - EcoRI que contiene los
genes crtE, crtY, crtI, crtB y crtZ necesarios para
producir zeaxantina. Este fragmento se insertó entonces en el sitio
EcoRV del vector de Escherichia coli pACYC184 para
proporcionar el plásmido pretendido (referido de aquí en adelante
como pACCAR25\DeltacrtX).
La Escherichia coli JM101 productora de
zeaxantina portadora de pAK910 o pAK916 (Fig. 12) - introducida en
ella (Escherichia coli (pACCAR25\DeltacrtX, pAK910 o
pAK916); de color naranja) se cultivó en 2 litros de un medio de
cultivo 2YT que contiene 150 \mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Cm a
37ºC durante 18 horas. Las células bacterianas recogidas de la
solución de cultivo se extrajeron con 300 ml de acetona, se
concentraron, se extrajeron dos veces con 200 ml de
cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron hasta sequedad.
Entonces, se realizó una cromatografía en capa fina (TLC) para
disolver el residuo en una pequeña cantidad de cloroformo/metanol
(9/1) y progresando en una placa de gel de sílice para TLC
preparativa elaborada por Merck con cloroformo/metanol (15/1). El
pigmento original naranja se separó en tres puntos en los valores de
Rf de 0,54 (46%), 0,72 (53%) y 0,91 (1%) por TLC. El pigmento de Rf
0,54 se rascó de la placa de TLC, se disolvió en una pequeña
cantidad de cloroformo/metanol (9/1) o metanol, y se cromatografió
en una columna Sephadex LH-20 (15 x 300 mm) con un
eluyente de cloroformo/metanol (9/1) o metanol para proporcionar
los materiales purificados en una proporción de 1,5 mg
Este material se identificó como
4-cetozeaxantina (ver Fig. 11 para la fórmula
estructural) ya que su espectro UV-visible, espectro
FD-MS (m/e 582) y movilidad en gel de sílice en TLC
(desarrollado con cloroformo/metanol (15/1)) de acuerdo
perfectamente con aquellas de las muestras estándar de
4-cetozeaxantina (purificado de Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1; Solicitud de Patente Japonesa No.
70335/1993). Además, los pigmentos a Rf 0,72 y 0,91 son astaxantina
(Ejemplo 6) y cantaxantina (Ejemplo 7 (2)), respectivamente.
La Escherichia coli JM101 productora de
\beta-caroteno portadora de pAK910 o pAK916
introducida en ella (Escherichia coli (pACCAR16\DeltacrtX,
pAK910 o pAK916); de color naranja) se cultivó en 2 litros de un
medio de cultivo 2YT que contiene 150 \mug/ml de Ap y 30
\mug/ml de Cm a 37ºC durante 18 horas. Las células bacterianas
recogidas de la solución de cultivo se extrajeron con 300 ml de
acetona, se concentraron, se extrajeron dos veces con 200 ml de
cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron hasta sequedad.
Entonces, se realizó una cromatografía en capa fina (TLC) para
disolver el residuo en una pequeña cantidad de cloroformo/metanol
(9/1) y progresando en una placa de gel de sílice para TLC
preparativa elaborada por Merck con cloroformo/metanol (50/1). El
pigmento del punto más oscuro original naranja se separó en tres
puntos en los valores de Rf de 0,54 (46%), 0,72 (53%) y 0,91 (1%)
por TLC. El pigmento del punto más oscuro correspondiente al 94% de
la cantidad total de los pigmentos naranjas se rascó de la placa de
TLC, se disolvió en una pequeña cantidad de cloroformo/metanol
(9/1) o cloroformo/metanol (1/1), y se cromatografió en una columna
Sephadex LH-20 (15 x 300 mm) con un eluyente de
cloroformo/metanol (9/1) o cloroformo/metanol (1/1) para
proporcionar los materiales purificados en una proporción de 3
mg.
Este material se identificó como cantaxantina
(ver Fig. 11 para la fórmula estructural) ya que su espectro
UV-visible, 1H-RMN,
FD-MS (m/e 564) y movilidad en gel de sílice en TLC
(Rf 0,53 en desarrollo con cloroformo/metanol (50/1)) de acuerdo
perfectamente con aquellos de la muestra estándar de cantaxantina
(fabricado por BASF). Además, el pigmento correspondiente al 6% de
los pigmentos naranjas totales encontrados en el extracto inicial
se consideró equinenona (ver Fig. 11 para la fórmula estructural) en
base a su espectro UV-visible, movilidad en gel de
sílice en TLC (Rf 0,78 en desarrollo con cloroformo/metanol
(50/1)), y movilidad en HPLC con NOVA PACK HR 6 \mu C18 (3,9 x 300
mm; fabricado por Waters) (TA 16 minutos en desarrollo en una rasa
de flujo de 1,0 ml/min con
acetonitrilo/metanol/2-propanol (90/6/4)).
La Escherichia coli JM101 productora de
\beta-caroteno portadora de pAK96NK introducida
en ella (Escherichia coli (pACCAR16\DeltacrtX, pAK96NK);
de color amarillo) se cultivó en 2 litros de un medio de cultivo 2YT
que contiene 150 \mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Cm a 37ºC
durante 18 horas. Las células bacterianas recogidas de la solución
de cultivo se extrajeron con 300 ml de acetona, se concentraron, se
extrajeron dos veces con 200 ml de cloroformo/metanol (9/1), y se
concentraron hasta sequedad. Entonces, se realizó una cromatografía
en capa fina (TLC) para disolver el residuo en una pequeña cantidad
de cloroformo/metanol (9/1) y progresando en una placa de gel de
sílice para TLC preparativa elaborada por Merck con
cloroformo/metanol (9/1). El pigmento del punto más oscuro original
naranja se separó en tres puntos en los valores de Rf de 0,54 (46%),
0,72 (53%) y 0,91 (1%) por TLC. El pigmento del punto más oscuro
correspondiente al 87% de la cantidad total de los pigmentos
amarillos se rascó de la placa de TLC, se disolvió en una pequeña
cantidad de cloroformo/metanol (9/1) o metanol, y se cromatografió
en una columna Sephadex LH-20 (15 x 300 mm) con un
eluyente de cloroformo/metanol (9/1) o metanol para proporcionar
los materiales purificados en una proporción de 3 mg.
Se ha esclarecido que este material posee la
misma estructura planar que la zeaxantina ya que su espectro
UV-visible, 1H-RMN,
FD-MS (m/e 568) y movilidad en gel de sílice en TLC
(Rf 0,59 en desarrollo con cloroformo/metanol (9/1)) de acuerdo
perfectamente con aquellos de las muestras estándar de zeaxantina
(fabricado por BASF). Cuando el pigmento se disolvió en dietil éter:
2-propanol: etanol (5: 5 : 2) para medir el
espectro CD, se probó tener una configuración estereoquímica de 3R,
31R, y así se identificó como zeaxantina (ver Fig. 11 para la
fórmula estructural). También, el pigmento correspondiente al 13% de
los pigmentos amarillos totales encontrados en el extracto inicial
se consideró \beta-criptoxantina (ver Fig. 11
para la fórmula estructural) en base a su espectro
UV-visible, movilidad en gel de sílice TLC (Rf 0,80
en desarrollo con cloroformo/metanol (9/1)), y movilidad en HPLC
con NOVA PACK HR 6 \mu C18 (3,9 x 300 mm; fabricado por Waters)
(TA 19 minutos en desarrollo a una tasa de flujo de 1,0 ml/min con
acetonitrilo/metanol/2-propanol (90/6/4)).
La Escherichia coli JM101 productora de
licopenos portadora de pAK98 introducida en ella (Escherichia
coli (pACCRT-EIB, pAK98);, de color amarillo)
se cultivó en 2 litros de un medio de cultivo 2YT que contiene 150
\mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Cm a 37ºC durante 18 horas. Las
células bacterianas recogidas de la solución de cultivo se
extrajeron con 300 ml de acetona, se concentraron, y se extrajeron
dos veces con 200 ml de hexano. La capa de hexano se concentró y
cromatografió en una columna de gel de sílice (15 x 300 mm) con un
eluyente de hexano/acetato de etilo (50/1) para proporcionar 3 mg
de un material purificado.
El material se identificó como
\beta-caroteno (ver Fig. 11 para la fórmula
estructural), ya que todos los datos de sus espectros
UV-visible, FD-MS (m/e 536) y
movilidad en HPLC con NOVA PACK HR 6 \mu C18 (3,9 x 300 mm;
fabricado por Waters) (TA 62 minutos en desarrollo a una tasa de
flujo de 1,0 ml/min con
acetonitrilo/metanol/2-propanol (90/6/4)) de acuerdo
con aquellos de la muestra estándar de
\beta-caroteno (todos de tipo trans; fabricado por
Sigma).
Se aprecia de los resultados del Ejemplo 6 que
entre el fragmento de 3,9 kb contenido en pAK9 (Ejemplo 4) o pAK92,
todos los genes necesarios para la síntesis de astaxantina a partir
de licopeno está contenido en el fragmento BamHI de 2,9 kb
en el lado derecho (pAK96, Fig. 12). Así, el fragmento de 1,0 kb en
el lado izquierdo no es necesario. Los sitios únicos NcoI y
KpnI están presentes dentro del fragmento BamHI de 2,9
kb de pAK96. Se extrae de los resultados del Ejemplo 7 (3) que el
fragmento de 1,4 kb (pAK96NK) entre los sitios NcoI y
KpnI posee una actividad de enzima que introduce grupos
hidroxilo pero no posee actividad de enzima que introduce grupos
ceto. La cantaxantina también puede ser sintetizada a partir de
\beta-caroteno con el fragmento BamHI de
2,9 kb del que se ha extraído un fragmento del lado derecho del
sitio único SalI entre los sitios NcoI y KpnI (pAK910)
o con el fragmento de 2,9 kb BamHI del que se ha extraído un
fragmento del lado derecho del sitio HincII situado en el
lado izquierdo del sitio SalI (pAK916), pero la actividad
para sintetizar cantaxantina a partir de
\beta-caroteno desaparece en el fragmento
BamHI de 2,9 kb de pAK96 del que se ha extraído un fragmento
del lado derecho del sitio único NcoI a la izquierda del
sitio HincII. Por otra parte, aunque fue eliminado el
fragmento de la parte izquierda de la única diana BglII
presente hacia la izquierda del fragmento BamHI -
HincII de 0,9 kb de pAK916, fue observada una actividad
similar a la del mencionado fragmento (pAK916) BamHI -
HincII. Se considera que un gen que codifica un enzima
introductor de grupo ceto para la síntesis de cantaxantina a partir
del \beta-caroteno como sustrato se encuentra
presente en el fragmento BglII - HincII de 0,74 kb de
pAK916, y la mencionada diana NcoI se encuentra presente en
este gen. Como resultado de la determinación de la secuencia
nucleotídica, una pauta abierta de lectura que correspondía al gen
y que contenía un sitio de unión a ribosoma enfrente del codón de
iniciación fue detectada con éxito, fue entonces designado como gen
crtW. La secuencia nucleotídica del gen crtW y la
secuencia de aminoácidos por la que codifica son ilustradas en la
Fig. 1 (ID. DE SEC. NO.: 1 y 2).
El producto (CrtW) del gen crtW de
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 presenta una
actividad enzimática para convertir los grupos metileno de la
posición 4 de un anillo \beta-ionona en el grupo
ceto, y uno de los ejemplos específicos es una actividad enzimática
para la síntesis de la cantaxantina a partir de
\beta-caroteno como sustrato mediante la vía de la
equinenona (Ejemplo 7 (2); ver Fig. 11). Además, el producto del
gen crtW también presenta una actividad enzimática para la
conversión de un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto, y uno de los ejemplos específicos es una
actividad enzimática para la síntesis de astaxantina a partir de
zeaxantina como sustrato por la vía de la 4 cetozeaxantina (Ejemplo
7 (1); ver Fig. 11). Además, los polipéptidos que poseen estas
actividades enzimáticas así como las cadenas de ADN codificantes
para estos polipéptidos no son hasta ahora conocidos, y los
polipéptidos y las cadenas de ADN que codifican estos polipéptidos
no presentan una homología total con ningún polipéptido o cadena de
ADN hasta ahora conocida. Además, hasta ahora no han sido descritas
informaciones a cerca de la conversión directa de un grupo metileno
a un grupo ceto mediante un enzima, no solamente en un anillo de
\beta-ionona o un anillo de
3-hidroxi-\beta-ionona
si no que también de otros compuestos.
Una diana única SalI se encuentra presente
en el fragmento de 2,9 kb BamHI de pAK96. Cuando el
fragmento BamHI de 2,9 kb es cortado en dos fragmentos en la
Diana SalI, estos dos fragmentos (pAK910 y pAK98) no
presentan la actividad introductora de grupos hidroxilo. Es decir,
el fragmento izquierdo (pAK910) tiene solamente la actividad
enzimática introductora de grupos ceto (Ejemplo 7 (2)), y el
fragmento derecho (pAK98) tiene solamente la actividad enzimática
licopeno ciclasa (Ejemplo 7 (4)). Por otra parte, cuando un
fragmento Ncol - KpnI de 1,4 kb (pAK96NK) que contiene
la mencionada diana Sall se introduce en una Escherichia
coli productora de \beta-caroteno, la
zeaxantina se sintetiza se sintetiza por la vía de la
\beta-criptoxantina (Ejemplo 7 (3)). Por lo tanto
se debe considerar que un gen que codifica para un enzima
introductor de grupos hidroxilo el cual presenta actividad
enzimática para la síntesis de zeaxantina a partir de
\beta-caroteno como sustrato se encuentra
presente en el fragmento NcoI - KpnI de 1,4 kb de
pAK96NK, y la mencionada diana SalI se encuentra presente en
este gen. Como resultado de la determinación de la secuencia
nucleotídica, una pauta abierta de lectura la cual corresponde al
gen y que presenta un lugar de unión a ribosoma enfrente del codón
de iniciación fue detectada con éxito, fue entonces referida como
el gen crtZ. La secuencia nucleotídica del gen crtZ
así como la secuencia de aminoácidos para la que codifica se
ilustran en la Fig.2 (ID. DE SEC. NO.: 3 y 4).
El producto (CrtZ) del gen crtZ de
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 presenta actividad
enzimática para añadir grupos hidroxilo al carbono 3 del anillo de
\beta-ionona, y uno de los ejemplos específicos es
una actividad enzimática para la síntesis de zeaxantina a partir de
\beta-caroteno como sustrato por la vía de la
\beta-criptoxantina (Ejemplo 7 (3); ver Fig. 11).
Además, el producto del gen crtZ también presenta actividad
enzimática para la adición de grupos hidroxilo al carbono 3 del
anillo de
4-ceto-\beta-ionona,
y uno de los ejemplos específicos es una actividad enzimática para
la síntesis de astaxantina a partir de cantaxantina como sustrato
por la vía de la fenicoxantina (Ejemplo 6; ver Fig. 11). Además,
los polipéptidos que poseen la última actividad enzimática y las
cadenas de ADN que codifican para estos polipéptidos no son
conocidos hasta ahora. Además, el CrtZ de
Agrobacterium mostró una homología significativa con el CrtZ
de Erwinia uredovora (identidad del 57%) a nivel de la
secuencia de aminoácidos.
La astaxantina puede ser sintetizada a partir de
\beta-caroteno con el fragmento de 2,9 kb de
BamHI del cual un fragmento del lado derecho de una diana
KpnI haya sido eliminada (pAK96K) o con el fragmento de 2,9
kb de BamHI de la que un fragmento a la derecha de la diana
PstI, la cual se encuentra localizada más hacia la derecha
respecto a la diana KpnI, haya sido eliminada (pAK94)
(Ejemplo 6), pero la astaxantina no puede ser sintetizada a partir
del licopeno. Por otro lado, cuando un fragmento SalI de 1,6 kb
(pAK98), el cual contiene un fragmento derecho de una única diana
SalI presente más hacia la izquierda de la citada diana KpnI
en el fragmento BamHI de 2,9 kb, fue introducido en una
Escherichi coli productora de licopenos, se produjo la
síntesis de \beta-caroteno (Ejemplo 7(4)).
Por lo tanto debe considerarse que un gen que codifica para una
licopeno ciclasa que presenta una actividad enzimática para la
síntesis de \beta-caroteno a partir de licopeno
como sustrato se encuentra presente en el fragmento SalI de
1,6 kb de pAK98, y que este gen se encuentra presente en el
intervalo entre las dianas KpnI y PstI. Como
resultado de la determinación de la secuencia nucleotídica, una
pauta abierta de lectura que correspondía al gen y que contenía un
sitio de unión a ribosoma en frente del codón de iniciación fue
detectado con éxito, fue entonces designado como gen crtY. La
secuencia nucleotídica del gen crtY y la secuencia de
aminoácidos por la que codifica son ilustradas en las Figs. 3 - 4
(ID. DE SEC. NO.: 3).
El producto (CrtY) del gen CrtY de
Agrobacterium auranticus sp. Nov. MK1 mostró una homología
significativa con el CrtY de Erwinia uredovora (identidad
del 44,3%) a nivel de la secuencia de aminoácidos, y la función de
ambos enzimas es la misma.
Se llevó a cabo un examen para determinar si se
podía obtener una región de ADN cromosómico de otros
microorganismos marinos que exhibiera homología con los crtW
y crtZ aislados. Los ADN cromosómicos de Alcaligenes
sp. PC-1 y Alteromonas sp.
SD-402 preparados en el Ejemplo 1 fueron digeridos
mediante los enzimas de restricción BamHI y PstI, y
separados por eletroforesis en gel de agarosa. Todos los fragmentos
de ADN separados de este modo fueron desnaturalizados mediante una
solución alcalina de NaOH 0,5 N y NaCl 1,5 M, y se transfirieron a
un filtro de membrana de nailon durante toda la noche. El filtro de
membrana de nailon en el cual el ADN había sido absorbido fue
sumergido en la solución de hibridación (6 x Denhardt, 5 x SSC, 100
\mug/ml ADNss), y la pre-hibridización fue
realizada a 60ºC durante 2 horas. Seguidamente, el fragmento de ADN
de 1,5 kb cortado a partir de pAK96K con BalI, el cual
contiene crtW y crtY, fue marcado con sistemas de
marcaje de ADN Mega prime™ (Amersham) y
[\alpha-
\hbox{ ^{32} }P]dCTP (\sim11OTBq/mmol)
y añadido a la mencionada solución de prehibridización para llevar
a cabo la hibridación a 60ºC durante 16 horas.
Después de la hibridación, el filtro fue lavado
con 2 x SSC que contiene 0,1% SDS a 60ºC durante 1 hora, y sometido
a la detección de señales que muestren homología mediante
autoradiografía. Como resultado, se obtuvieron fuertes señales de
un fragmento de alrededor de 13 kb en el producto digerido con
BamHI y de un fragmento de 2,35 kb en el producto digerido
con PstI en el caso de Alcaligenes sp.
PC-1, y se obtuvieron fuertes señales de un
fragmento de cerca de 5,6 kb en el producto digerido con
BamHI y en un fragmento de 20 kb o más en el producto
digerido con PstI en el caso de Alteromonas sp.
SD-4.
Tal y como ha sido descubierto a partir de los
resultados del ejemplo 9 el producto de digerir el ADN cromosómico
de Alcaligenes sp. PC-1 con PstI
posee una región de alrededor de 2,35 kb que se hibrida con el
fragmento de ADN que contiene los genes crtW y crtZ
de Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1, el ADN
cromosómico de Alcaligenes fue digerido con PstI, y entonces
los fragmentos de ADN de un tamaño de 2 - 3,5 kb fueron recuperados
mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN
recogidos de esta manera fueron insertados en la diana PstI
de un vector pBluescript II SK+, y introducido en Escherichia
coli DH5\alpha para preparar una biblioteca parcial de
Alcaligenes. Cuando la biblioteca parcial fue sometida a
hibridación de colonias utilizando como sonda un fragmento de ADN de
1,5 kb que contenía los genes crtW y crtZ de
Agrobacterium, una colonia positiva fue aislada a partir de
cerca de 5.000 colonias. En este caso, la hibridación de colonias
fue llevada a cabo bajo las mismas condiciones que el análisis por
Southern blot mostrado en el Ejemplo 9. Cuando se aisló un plásmido
de ADN de la colonia obtenida de esta manera, y se digirió con
PstI para examinar el tamaño de los fragmentos de ADN
integrados, se observó que el plásmido contenía tres fragmentos
diferentes. De esta manera, por el análisis de Southern blot
descrito en el ejemplo 9, fue seleccionado un fragmento de 2,3 kb
para ser hibridado a partir de tres fragmentos de ADN diferentes, el
fragmento PstI de 2,35 kb fue recuperado por electroforesis
en gel de agarosa y insertado en una diana PstI del
pBluescript II SK+ para preparar los plásmidos pPCll y pPC12. En
pPC11 y pPC12, el anteriormente mencionado fragmento PstI de
2,35 kb fue insertado en la diana PstI del pBluescript II
SK+ en dirección opuesta respecto al otro. El mapa de restricción de
pPCll se ilustra en la Fig. 19.
Cuando pPC11 y pPC12 fueron introducidos por
separado en Escherichia coli productora de
\beta-caroteno, se obtuvieron colonias de color
naranja debido a la síntesis de astaxantina (Ejemplo 12) en el
primero pero no hubo nueva síntesis de otros pigmentos en el
último. De esta manera se consideró que la dirección del clúster de
genes para la síntesis de astaxantina en el plásmido pPC11 era la
misma que en el vector promotor lac. También se descubrió que pPC11
no contenía genes codificantes para enzimas cicladoras de licopeno,
ya que ningún otro pigmento fue producido de nuevo aún introduciendo
el pPC11 en Escherichia coli productora de licopenos.
Se descubrió que aún si un plásmido que poseía un
fragmento BstEII - EcoRV de 0,72 kb posicionado en
el lado derecho del fragmento PstI había sido eliminado (en
referencia a pPC17, Fig. 19) fue introducido en Escherichia
coli productora de \beta-caroteno, la
Escherichia coli transformada sintetizó astaxantina y
similares (Ejemplo 12), como en el caso de E. coli en la que
había sido introducido pPC11, entonces la secuencia de nucleótidos
del fragmento PstI - BstEII de 1,63 kb en pPC17 fue
determinada.
Fueron preparados mutantes por deleción con pPC17
y pPC12 de acuerdo con el siguiente procedimiento. Una cantidad de
10 \mug tanto de pPC17 como de pPC12 fue digerida con KpnI
y HindIII o KpnI y EcoRI, se extrajeron con
fenol/cloroformo, y el ADN fue recuperado por precipitación con
etanol. Cada uno de los ADNs se disolvió en 100 \mul de tampón
ExoIII (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl_{2}, 10 mM
2-mercaptoetanol, pH 8,0), se añadieron 180
unidades de nucleasa ExoIII, y la mezcla se mantuvo a 37ºC.
Una cantidad de 10 \mul se muestreaba cada minuto, y dos muestras
se transfirieron en un tubo que contenía 20 \mul de un tampón MB
(acetato de sodio 40 mM, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl_{2}, 10%
glicerol, pH 4,5) y que fue depositado en hielo. Después de
completar el muestreo, cinco tubos obtenidos de esta manera se
mantuvieron a 65ºC durante 30 minutos. Después de la reacción, diez
fragmentos de ADN que se diferenciaban los unos de los otros por el
grado de deleción se recuperaron para cada plásmido mediante
electroforesis en gel de agarosa. A los fragmentos de ADN
recuperados de este modo les fueron inducidos extremos romos
mediante el fragmento Klenow, fueron sometidos a reacción de
ligación a 16ºC durante toda la noche, y se transformaron
Escherichia coli JM109. Un ADN de cadena sencilla se preparó
a partir de cada uno de los varios clones obtenidos de esta manera
mediante un fago ayudante M13K07, y sometido a reacción de
secuenciación mediante un kit de secuenciación utilizando un primer
fluorescente de Applied Biosistems (K.K.), y la secuencia de ADN se
determinó con un secuenciador automático.
La secuecia de ADN que comprende 1631 pares de
bases (bp) obtenida de este modo se ilustra en las Figs. 16 - 18
(ID. DE SEC. NO.: 12). Como resultado de examinar una pauta abierta
de lectura con un sitio de unión a ribosoma en frente del codón de
iniciación, fueron detectadas, en las posiciones donde se esperaba
encontrar los dos genes de sintesis de xantofila crtW y
crtZ, dos pautas abiertas de lectura codificaban las
correspondientes proteínas (A - B (posiciones nucleotídicas 99 -
824 de la ID. DE SEC. NO.: 12), C – D (posiciones nucleotídicas 824
- 1309) en Figs. 16 - 18.
Se denominó pPC17-3 a un plásmido
de deleción (que poseía solamente crtW) con una deleción
desde la derecha de BstEII hasta la posición nucleotídica
1162 (Fig. 17) (posición nucleotídica 1162 de la ID. DE SEC. NO.:
12) de entre los plásmidos de deleción procedentes de pPC17
preparados en el Ejemplo 11 (Fig. 19).
La Escherichia coli JM101 productora de
zeaxantina (Ejemplo 7 (1)) a la que se le había introducido
pPC17-3 (Escherichia coli
(pACCAR25\DeltacrtX, pPC17-3); exhibiendo color
naranja) se cultivó en 2 litros de medio de cultivo 2YT que
contiene 150 \mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Cm a 37ºC durante 18
horas. Las células bacterianas recogidas de la solución de cultivo
se extrajeron con 300 ml de acetona, se concentraron, se extrajeron
dos veces con 200 ml de cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron
hasta dejarlas totalmete secas. Entonces, se realizó una
cromatografía de capa delgada (TLC) disolviendo el residuo en una
pequeña cantidad de cloroformo/metanol (9/1) y desarrollando en una
placa de gel de sílice para TLC preparativa fabricado por Merck con
cloroformo/metanol (15/1). El pigmento naranja original se separó
en tras manchas con los valores de Rf de 0,54 (ca. 25%), 0,72 (ca.
30%) y 0,91 (ca. 25%). Los pigmentos con valores de Rf de 0,54 y
0,72 fueron rascados de la placa de TLC, disueltos en una pequeña
cantidad de cloroformo/metanol (9/1) o metanol, y cromatografiados
en una columna de Sephadex LH-20 (15 x 300 mm) con
un eluyente de cloroformo/metanol (9/1) o metanol para proporcionar
materiales purificados con una producción de cerca de 1 mg,
respectivamente.
Los materiales se identificaron como
4-cetozeaxantina (Rf 0,54) y astaxantina (Rf 0,72),
dado que todos los datos relativos a UV-visible,
espectro FD-MS y movilidad en TLC (desarrollada con
cloroformo/metanol (15/1)) se correspondían con los de las muestras
estandar de 4-cetozeaxantina y astaxantina. Además,
el pigmento con un valor de Rf 0,91 fue cantaxantina (Ejemplo 12
(-2)).
También se confirmó, por procedimientos
analíticos similares, que la Escherichia coli JM101
productora de \beta-caroteno, y que posee pPCll o
pPC17 introducida en ella (Escherichia coli
(pACCAR16\DeltacrtX, pPC11 o pPC17) (exhibiendo color naranja)
produce astaxantina, 4-cetozeaxantina y
cantaxantin. Además, también se confirmó mediante la muestra
auténtica de fenicoxantina obtenida en el Ejemplo 6 que estas E.
coli transformadas producen cantidades traza de
fenicoxantina.
La Escherichia coli JM101 productora de
\beta-caroteno a la que se le ha introducido en
su interior un pPC17-3 (Escherichia coli
(pACCAR16\DeltacrtX, pPC17-3); que exhibe color
naranja) se cultivó en 2 litros de medio de cultivo 2YT que
contiene 150 \mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Cm a 37ºC durante 18
horas. Las células bacterianas recogidas de la solución de cultivo
se extrajeron con 300 ml of acetona, se concentraron, se extrajeron
dos veces con 200 ml de cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron
hasta dejarlas totalmente secas. Entonces, se realizó una
cromatografía de capa delgada (TLC) disolviendo el residuo en una
pequeña cantidad de cloroformo/metanol (9/1) y desarrollando en una
placa de gel de sílice para TLC preparativa fabricado por Merck con
cloroformo/metanol (50/1). El pigmento más oscuro, correspondiente
a un 40% de la cantidad total de pigmentos naranja, fue rascado de
la placa de TLC, disuelto en una cantidad pequeña de
cloroformo/metanol (9/1) o cloroformo/metanol (1/1), y
cromatografiado en una columna de Sephadex LH-20
(15 x 300 mm) con un eluyente de cloroformo/metanol (9/1) o
cloroformo/metanol (1/1) para proporcionar un material purificado
con una producción de 2 mg.
El material se identificó como cantaxantina, dado
que todos los datos relativos a UV-visible,
espectro FD-MS (m/e 564) y movilidad en TLC
(desarrollada con cloroformo/metanol (50/1)) concordaron con los de
la muestra estandar de cantaxantina (fabricado por BASF). Además,
el pigmento, el cual se presentó en una cantidad correspondiente al
50% del total de los pigmentos de color naranja observados en el
extracto inicial, se consideró que era equinenona por su espectro
UV-visible, movilidad en gel de sílice TLC
(desarrollada con cloroformo/metanol (50/1)), y movilidad en HPLC
con NOVA PACK HR 6 \mu C18 (3,9 x 300 mm;fabricado por Waters)
(desarrollada con acetonitrilo/ metanol/2-propanol
(90/6/4)) (Ejemplo 7 (2)).
Además, el balance de los pigmentos que fueron
extraidos, 10%, fue \beta-caroteno no
reaccionado.
Un plásmido que contenía un fragmento Sall
de 1,15 kb en pPC11 insertado en la misma dirección que el plásmido
pPCll en la diana SalI del pBluescript II SK+ se preparó (en
referencia a pPC13, ver Fig. 19).
La Escherichia coli JM101 productora de
\beta-caroteno a la que se le ha introducido en
su interior un pPC13 (Escherichia coli
(pACCAR16\DeltacrtX, pPC13); que exhibe color amarillo) se cultivó
en 2 litros de medio de cultivo 2YT que contiene 150 \mug/ml de
Ap y 30 \mug/ml de Cm a 37ºC durante 18 horas. Las células
bacterianas recogidas de la solución de cultivo se extrajeron con
300 ml of acetona, se concentraron, se extrajeron dos veces con 200
ml de cloroformo/metanol (9/1), y se concentraron hasta dejarlas
totalmente secas. Entonces, se realizó una cromatografía de capa
delgada (TLC) disolviendo el residuo en una pequeña cantidad de
cloroformo/metanol (9/1) y desarrollando en una placa de gel de
sílice para TLC preparativa fabricado por Merck con
cloroformo/metanol (9/1). El pigmento más oscuro, correspondiente a
un 90% de la cantidad total de pigmentos naranja, fue rascado de la
placa de TLC, disuelto en una cantidad pequeña de
cloroformo/metanol (9/1) o metanol, y cromatografiado en una columna
de Sephadex LH-20 (15 x 300 mm) con un eluyente de
cloroformo/metanol (9/1) o metanol para proporcionar un material
purificado con una producción de 3 mg.
El material se identificó como zeaxantina, dado
que todos los datos relativos a UV-visible,
espectro FD-MS (m/e 564) y movilidad en TLC
(desarrollada con cloroformo/metanol (9/1)) concordaron con los de
la muestra estandar de zeaxantina (Ejemplo 7 (3)). Además, el
pigmento, el cual se presentó en una cantidad correspondiente al
10% del total de los pigmentos de color naranja observados en el
extracto inicial, se consideró que era
\beta-criptoxantina por su espectro
UV-visible, movilidad en gel de sílice TLC
(desarrollada con cloroformo/metanol (9/1)), y movilidad en HPLC con
NOVA PACK HR 6 \mu C18 (3,9 x 300 mm; fabricado por Waters)
(desarrollada con acetonitrilo/metanol/2-propanol
(90/6/4)) (Ejemplo 7 (2)).
Los resultados de los Ejemplos 11 y 12 (1)
parecen indicar la que la totalidad de los genes requeridos para la
síntesis de la astaxantina a partir de
\beta-caroteno dentro del fragmento PstI de
2,35 kb contenido en pPC11 se encuentra contenida en el lado
izquierdo del fragmento PstI - BstEII de 1,63 kb
(pPC17, Fig. 19). De esta manera, el fragmento BstEII -
PstI de 0,72 kb en el lado derecho no es necesario. Dianas
únicas SmaI y SalI se encuentran presentes en el
fragmento PstI - BstEII dentro del fragmento de 1,63
kb de pPC17 (Fig. 19). A partir de los análisis de pigmentos
llevados a cabo en Escherichia coli productora de
\beta-caroteno con los plásmidos de deleción
introducidos en ella se confirmó que la actividad enzimática
introductora de grupos ceto se perdió cuando fueron eliminados los
fragmentos de 0,65 kb y 0,69 kb en el lado izquierdo desde las
dianas SmaI y SalI. A partir de los análisis de
pigmentos llevados a cabo en Escherichia coli productora de
\beta-caroteno con los plásmidos de deleción
introducidos en ella también se confirmó que el plásmido que
contiene el fragmento PstI - SalI de 0,69 kb situado
en el lado izquierdo del fragmento PstI - BstEII de
1,63 kb insertado en sitio PstI - Sall del
pBluescript SK+ no presenta actividad enzimática introductora de
grupos ceto. Por otro lado, el plásmido de deleción
pPC17-3 (Fig. 19) en el que había ocurrido la
deleción desde el extremo BstEIl del extremo derecho hasta el
nucleótido No. 1162 (posición nucleotídica 1162 en ID. DE SEC. NO.:
12) presenta una actividad encimática introductora de grupos ceto
(Ejemplo 12 (1), (2)), por lo que se consideró que un gen
codificante por un enzima introductor de grupos ceto con una
actividad enzimática para la síntesis de cantaxantina o astaxantina
con a sustrato de \beta-caroteno o zeaxantina se
encuentra presente en el fragmento de 1162 bp en
pPC17-3, y que las anteriormente mencionadas dianas
SmaI y SalI se encuentran presentes en este gen. Como
resultado de la determinación de la secuencia nucleotídica, una
pauta abierta de lectura que correspondía al gen y que contenía un
sitio de unión a ribosoma en frente del codón de iniciación fue
detectado con éxito, fue entonces designado como gen crtW.
La secuencia nucleotídica del gen crtW y la secuencia de
aminoácidos por la que codifica son ilustradas en las Figs. 13 - 14
(ID. DE SEC. NO.: 8 y 9).
El producto (CrtW) del gen crtW de
Alcaligenes sp. PC-1 presenta una actividad
enzimática para convertir los grupos metileno de la posición 4 de
un anillo \beta-ionona en el grupo ceto, y uno de
los ejemplos específicos es una actividad enzimática para la
síntesis de la cantaxantina a partir de
\beta-caroteno como sustrato mediante la vía de la
equinenona (Ejemplo 12 (2); ver Fig. 11). Además, el producto del
gen crtW también presenta una actividad enzimática para la
conversión de un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto, y uno de los ejemplos específicos es una
actividad enzimática para la síntesis de astaxantina a partir de
zeaxantina como sustrato por la vía de la 4 cetozeaxantina (Ejemplo
12 (1); ver Fig. 11). Además, los polipéptidos que poseen estas
actividades enzimáticas así como las cadenas de ADN codificantes
para estos polipéptidos no son hasta ahora conocidos, y los
polipéptidos y las cadenas de ADN que codifican estos polipéptidos
no presentan una homología total con ningún polipéptido o cadena de
ADN hasta ahora conocida. Además, los productos génicos (CrtW) del
gen crtW de Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 y
Alcaligenes sp. PC-1 comparte una elevada
homología (identidad del 83%) a nivel de la secuencia de
aminoácidos, y las funciones de ambas enzimas es la misma. La
secuencia de aminoácidos en la regíon del 17% que no presenta
identidad con estas secuencias de aminoácidos no se considera
significativa para las funciones de la enzima. De esta manera se
considera que, particularmente en esta región, una pequeña cantidad
de sustituciones por otros aminoácidos, deleción, o adición de otros
aminoácidos no afectará la actividad enzimática.
Se puede decir que el gen crtW codificante
para un enzima introductor de grupo ceto de las bacterias marinas
codifica por una cetolasa del anillo de
\beta-ionona o
3-hidroxi-\beta-ionona
la cual convierte directamente el grupo metileno en la posición 4
en un grupo ceto independientemente de si se ha añadido o no un
grupo hidroxilo en la posición 3. Además, no ha sido descrito hasta
el momento que los grupos metileno, no solamente presentes en el
anillo de \beta-ionona y en el anillo de
3-hidroxi-\beta-ionona
si no que también de otros compuestos, sean directamente
convertidos en un grupos ceto por medio de un enzima.
La totalidad de los genes requeridos para la
síntesis de astaxantina a partir de
\beta-caroteno está contenida en el fragmento
PstI - BstEII de 1,63 kb (Fig. 19) de pPC17. Una
diana SalI se encuentra presente en el fragmento
\hbox{ Pst I –} BstEII de 1,63 kb de pPC17. A
partir de los resultados del ejemplo 12 (3) se revela que una
actividad enzimática introductora de grupo hidroxilo se encuentra
presente en el lado derecho a partir de la diana SalI. De
este modo, se entiende que la actividad enzimática introductora de
grupos hidroxilo se encuentra presente en el fragmento SalI -
BstEII de 0,94 kb el cual constituye el fragmento derecho
del fragmento PstI - BstEII de 1,63 kb. Como
resultado de la determinación de la secuencia nucleotídica, una
pauta abierta de lectura que correspondía al gen y que contenía un
sitio de unión a ribosoma en frente del codón de iniciación fue
detectado con éxito, fue entonces designado como gen crtZ. La
secuencia nucleotídica del gen crtZ y la secuencia de
aminoácidos por la que codifica son ilustradas en la Fig. 15 (ID.
DE SEC. NO: 10 y 11).
El producto (CrtZ) del gen crtZ de
Alcaligenes sp. PC-1 presenta una actividad
enzimática para añadir un grupo hidroxilo al carbono 3 de un anillo
\beta-ionona, y uno de los ejemplos específicos es
una actividad enzimática para la síntesis de la zeaxantina a partir
de \beta-caroteno como sustrato mediante la vía
de la \beta-criptoxantina (Ejemplo 12 (3); ver
Fig. 11). Además, el producto del gen crtZ también presenta
una actividad enzimática para añadir un grupo hidroxilo al carbono
3 de un anillo
4-ceto-\beta-ionona,
y uno de los ejemplos específicos es una actividad enzimática para
la síntesis de astaxantina a partir de cantaxantina como sustrato
por la vía de la fenicoxantina (Ejemplo 12 (1); ver Fig. 11).
Además, los polipéptidos que poseen la última de las actividades
enzimáticas así como las cadenas de ADN codificantes para estos
polipéptidos no son hasta ahora conocidos. Además, el CrtZ
Alcaligenes sp. PC-1 comparte una elevada
homología con el CtrZ de Erwinia uredovora (identidad del
58%) a nivel de la secuencia de aminoácidos. Además, los productos
génicos (CrtZ) del gen crtZ de Agrobacterium
aurantiacus sp. nov. MK1 y Alcaligenes sp.
PC-1 comparte una elevada homología (identidad del
90%) a nivel de la secuencia de aminoácidos, y las funciones de
ambas enzimas es la misma. La secuencia de aminoácidos en la regíon
del 10% que no presenta identidad con estas secuencias de
aminoácidos no se considera significativa para las funciones de la
enzima. De esta manera se considera que, particularmente en esta
región, una pequeña cantidad de sustituciones por otros
aminoácidos, deleción, o adición de otros aminoácidos no afectará
la actividad enzimática.
Ha sido dilucidado de nuestros estudios sobre
genes de síntesis de carotenoides en la bacteria epífita
Erwinia o en la bacteria fotosintética Rhodobacter
que los enzimas para la biosíntesis de carotenoides generalmente
actuan reconociendo la mitad de una molécula de carotenoide como
sustrato. Por ejemplo, la licopeno ciclasa de Erwinia,
crtY, reconoce las mitades de la molécula de licopeno para
ciclarla. Cuando el gen crtI de la fitoeno desaturasa de
Rhodobacter fue utilizada para la síntesis de neurosporeno en
lugar de licopeno en Escherichia coli y se permitió al
crtY de Erwinia trabajar en ella, el producto génico
de crtY reconoció la mitad de la estructura molecular comun
al licopeno para producir una mitad ciclada
\beta-zeacaroteno (Linden, H., Misawa, N.,
Chamovits, D., Pecher, I., Hirschberg, J., Sandmann, G.,
"Functional Complementation in Escherichia coli of
Different Phytoene Desaturase Genes and Analysis of Accumulated
Carotenes", Z. Naturforsch., 46c, p. 1045-1051,
1991). También, en la presente invención, cuando se permitió
trabajar a CrtW sobre \beta-caroteno o
zeaxantina, equinenona o 4-cetozeaxantina en las
cuales un grupo ceto había sido introducido fueron primeramente
sintetizadas, y cuando se permitió a CrtZ trabajar sobre
\beta-caroteno o cantaxantina,
\beta-criptoxantina o fenicoxantina en las que un
grupo hidroxilo había sido introducido fueron primeramente
sintetizadas. Esto puede ser considerado porque estos enzimas
reconocen la mitad de la molécula del sustrato. De esta manera,
mientras las Escherichia coli que presentan los genes crtE,
crtB, crtI y crtY de Erwinia y el gen crtZ de una
bacteria marina son capaces de producir zeaxantina como ha sido
descrito más arriba, \beta-criptoxantina la cual
es un \beta-caroteno que presenta un grupo
hidroxilo introducido en ella puede ser detectada como una
metabolito intermediario. De esta manera se puede considerar que si
CrtW se encuentra presente, 3'-hidroxiequinenona o
3-hidroxiequinenona pueden ser sintetizadas a
partir de \beta-criptoxantina como sustrato, y que
la fenicoxantina puede ser después sintetizada por la acción de
CrtW en estos intermediarios. Los presentes inventores no han
identificado estos cetocarotenoides en las soluciones de cultivo, y
la razón de esto se considera que es que solamente una cantidad
traza de estos compuestos se encuentra presente en las condiciones
bajo las cuales han sido realizados los presentes experimentos. De
hecho, se ha descrito que 3'-hidroxiequinenona o
3'-hidroxiequinenona fue detectada como matabolito
intermediario menor de la astaxantina en las bacterias marinas
Agrobacterium aurantiacus sp. nov. MK1 como fuente de genes
(Akihiro Yokoyama ed., "For te biosynthesis of astaxantin in
marine bacteria", Nippon Suisan Gakkai, Spring Simposium, 1994,
Resumen, p. 252, 1994). A partir de las descripciones hechas más
arriba se puede considerar que las vías metabólicas menores
mostradas en la Fig. 20 son también presentes además de las vías
metabólicas principales de la astaxantina mostradas en Fig. 11.
De acuerdo con la presente invención, los
clústers genicos requeridos para la biosíntesis de xantofilas que
contengan un grupo ceto tales como astaxantin, fenicoxantina,
4cetozeaxantina, cantaxantina y equinenona han sido obtenidos de
forma exitosa a partir bacterias marinas, y sus estructuras,
secuencias nucleotídicas, y funciones han sido dilucidados. Las
cadenas de ADN de acuerdo con la presente invención son utiles como
genes capaces de proporcionar la capacidad de biosíntesis de
xantofilas que contienen un grupo ceto tales como la astaxantina a
microorganismos como Escherichia coli y similares.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10-1 Shinkawan 2-chome
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chu-ku, Tokyo-to
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ninguno
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): Ninguno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO.,LTD
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28-10 Hongo 1-chome
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bunkyo-ku, Tokyo-to
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ninguno
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): Ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cadena de ADN útil para la síntesis de xantofilas y procesos para producir xantofilas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: PE 95 903 959.5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 639 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Agrobacterium auranticus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.nov.MK1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..636
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 489 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Agrobacterium auranticus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.nov.MK1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..486
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 162 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1161 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Agrobacterium auranticus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.nov.MK1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1168
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 386 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2886 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Agrobacterium auranticus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.nov.MK1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 729 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Alcaligenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.PC-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..726
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 242 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 489 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Alcaligenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.PC-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..486
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 162 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1631 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Alcaligenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: sp.PC-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10
Claims (16)
1. Una cadena de ADN que contiene una secuencia
que codifique un polipéptido que presente una actividad enzimática
para la conversión del grupo metileno en la posición 4 de un anillo
de \beta-ionona en un grupo ceto y/o que presente
una actividad enzimática que permita convertir el grupo metileno en
la posición 4 de un anillo
3-hidroxi-\beta-ionona
en un grupo ceto, y que presente secuencias de aminoácidos como la
comprendida entre las posiciones 1 a la 212 de la secuencia
mostrada en la ID. DE SEC. NO. 2 y/o una secuencia de aminoácidos
como la comprendida entre las posiciones 1 y 242 de la secuencia
mostrada en ID. DE SEC. NO. 9, donde el polipéptido puede ser
modificado por deleción, sustitución o adición en alguno de sus
aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos a menos que se
mantenga la actividad enzimática mostrada por el polipéptido que
presenta la secuencia de aminoácidos 1 a la 212 de la secuencia
mostrada en la ID. DE SEC. NO. 2 o la secuencia de aminoácidos 1 a
242 mostrada en ID. DE SEC. NO. 9.
2. Una cadena de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el polipéptido presenta una actividad
enzimática para la conversión del grupo metileno en la posición 4
de un anillo de \beta-ionona en un grupo ceto y
presenta una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 212
mostrados en la ID. DE SEC. NO. 2 o los aminoácidos 1 a 242
mostrados en la ID. DE SEC. NO. 9.
3. Una cadena de ADN de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, donde el polipéptido se encuentra en
Agrobacterium o Alcaligenes.
4. Una cadena de ADN que hibride con una cadena
de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 bajo las siguientes
condiciones: que la hibridación se produzca en una solución 6 x
Denhardt, 5 x SSC a 60ºC durante 16 horas seguida de lavado con 2 x
SSC, 0,1% SDS a 60ºC durante 1 hora, y presentando una secuencia de
nucleotidos la cual codifique por un polipéptido que presente una
actividad enzimática de acuerdo con la reivindicación 1.
5. Una cadena de ADN de acuerdo con cualquiera de
la reivindicaciones de la 1 a la 3 que presente una secuencia de
nucleótidos que codifique por un polipéptido que presente una
actividad enzimática para convertir
\beta-caroteno en cantaxantina por la vía de la
equinenona.
6. Una cadena de ADN de acuerdo con cualquiera de
la reivindicaciones de las 1 a la 3 que presente una secuencia de
nucleótidos que codifique por un polipéptido que presente una
actividad enzimática para convertir zeaxantina en astaxantina por
la vía de la 4-cetozeaxantina.
7. Un proceso para producir una xantofila
comprendiendo la introducción de una cadena de ADN de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 en un
microorganismo que tenga capacidad para la síntesis de
\beta-caroteno, cultivando los microorganismos
transformados en un medio de cultivo, y obteniendo una xantofila de
este cultivo.
8. Un proceso para la producción de una xantofila
de acuerdo con la reivindicación 7 y, además introduciendo una
cadena de ADN que presente una secuencia de nucleótidos la cual
codifique por un polipéptido que presente una actividad enzimática
para añadir grupos hidroxi en el carbono de la posición 3 del
anillo de
4-ceto-\beta-ionona
y/o en el carbono 3 del anillo de la \beta-ionona
donde una secuencia de aminácidos del polipéptido es un miembro
seleccionado a partir de un grupo consistente en:
- a)
- una secuencia de aminoácidos como la comprendida entre las posiciones 1 a la 162 que se muestra en la ID. DE SEC. NO. 4
- b)
- una secuencia de aminoácidos como la comprendida entre las posiciones 1 a la 162 que se muestra en la ID. DE SEC. NO. 11, y
- c)
- una secuencia de aminoácidos que presente una identidad de al menos el 90% con (1) o (2) indicadas arriba,
en un microorganismo que presente
capacidad para la síntesis de \beta-caroteno,
cultivando los microorganismos transformados en un medio de cultivo
y obteniendo una xantofila de este
cultivo.
9. Un proceso para producir una xantofila de
acuerdo a la reivindicación 7 comprendiendo la introducción de una
cadena de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de
la 1 a la 5 en microorganismos que presenten la capacidad de
sintetizar \beta-caroteno, cultivando los
microorganismos transformados en un medio de cultivo, y obteniendo
cantaxantina o equinenona a partir de las células cultivadas.
10. Un proceso para producir una xantofila de
acuerdo a la reivindicación 7 comprendiendo la introducción de una
cadena de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de
la 1 a la 4 o l 6 en microorganismos que presenten la capacidad de
sintetizar zeaxantina, cultivando los microorganismos transformados
en un medio de cultivo, y obteniendo astaxantina o
4-cetozea-xantina a partir de las
células cultivadas.
11. Un proceso para producir una xantofila de
acuerdo a la reivindicación 8 comprendiendo el cultivo de los
microorganismos transformados en un medio de cultivo, y obteniendo
astaxantina o fenicoxantina a partir de las células cultivadas.
12. Un proceso para producir una xantofila de
acuerdo con las reivindicaciones de la 7 a la 10 donde el
microorganismo es una bacteria o una levadura.
13. Un microorganismo recombinante el cual es
capaz de producir una xantofila donde dicho microorganismo
comprende una cadena de ADN de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 6.
14. Un microorganismo recombinante de acuerdo con
la reivindicación 13 donde dicho microorganismo es FERM
BP-4505 depositado en el National Institute of
Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Japón.
15. Un microorganismo recombinante de acuerdo con
la reivindicación 13 donde dicho microorganismo es FERM
BP-4761 depositado en el National Institute of
Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Japón.
16. Uso de un microorganismo recombinante de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15 en
la producción de xantofila.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34873793 | 1993-12-27 | ||
| JP34873793 | 1993-12-27 | ||
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| JP23591794 | 1994-09-05 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95903959T Expired - Lifetime ES2225836T3 (es) | 1993-12-27 | 1994-12-26 | Cadena de adn util para la sintesis de xantofilas y proceso para producir xantofilas. |
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