JP3375639B2 - キサントフィルの合成に有用なｄｎａ鎖およびキサントフィルの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、タイ、サケ、エビ等の養殖魚介類の色揚げ
に有用であり、また、着色料や抗酸化剤として食品に利
用されるアスタキサンチン等のケト基を含むキサントフ
ィル（ケトカロチノイド）の合成に有用なDNA鎖、及
び、このDNA鎖を導入した微生物を利用したアスタキサ
ンチン等のケト基を含むキサントフィル（ケトカロチノ
イド）の製造法に関するものである。

背景技術 キサントフィル（xan'thophyll）とは、水酸基、ケト
基、エポキシ基などの酸素を含むカロチノイド（carote
noid）色素の総称である。カロチノイドは、メバロン酸
を出発物質として、ステロイドやテルペノイドと途中ま
で共通なイソプレノイド生合成経路によって合成され
る。イソプレン基本生合成系によて生じたC15のファル
ネシロピロリン酸（FPP）は、C5のイソペンテニルピロ
リン酸（IPP）と縮合することにより、C20のゲラニルゲ
ラニルピロリン酸（GGPP）が作られる。次に、２分子の
GGPPが縮合して、最初のカロチノイドである無色のフィ
トエン（phytoene）が合成される。フィトエンは、一連
の不飽和反応により、フィトフルエン（phytofluen
e）、ζ−カロチン（ζ−carotene）、ノイロスポレン
（neurosporene）、リコピン（lycopene）に変換され、
さらに、このリコピンは環化反応によりβ−カロチン
（β−carotene）に変換される、そして、β−カロチン
に水酸基やケト基などが導入され、種々のキサントフィ
ルが合成されると考えられている（Britton,G.,′Biosy
nthesis of carotenooids′.Plant Pigments.London,Ac
ademic Press,1988,p.133−182.（Goodwin,T.W.ed.）参
照）。

最近、発明者らは、植物常在非光合成細菌Erwinia ur
edovoraのカロチノイド生合成遺伝子群を、その黄色の
色調を指標に大腸菌にクローニングし、これらの遺伝子
のいろいろな組み合わせを大腸菌等の微生物で発現させ
ることにより、大腸菌等の微生物に、フィトエン、リコ
ピン、β−カロチン、および、β−カロチンに水酸基が
導入された黄色のキサントフィルであるゼアキサンチン
を生産させることを可能にした（図10参照）（Misawa,
N.,Nakagawa,M.,Kobayashi,K.,Yamano,S.,Izawa,Y.,Nak
amura,K.,Harashima. K,′Elucidation of the Erwinia
uredovora carotenoid biosynthetic pathway by func
tional analysis of gene products expressed in Esch
erichia coli′.J.Bacteriol.,172,p.6704−6712,199
0、及び、Misawa,N.,Yamano,S.,Ikenaga,H.,′Producti
on of β−carotene in Zymomonas mobilis and Agroba
cterium tumefaciens by introduction of the biosynt
hesis genes from Erwinia uredovora′.Appl.Environ.
Microbiol.,57,p.1847−1849,1991、及び、本発明者ら
による特許出願特願平３−58786号公報（特願平２−532
55号明細書）：「カロチノイドの合成に有用なDNA鎖」
参照）。

一方、赤色のキサントフィルであるアスタキサンチン
は、特に海岸生物のタイ、サケ等の赤色魚類や、カニ、
エビ等の甲殻類に広く存在する代表的動物カロチノイド
である。一般に、動物はカロチノイドを生合成すること
ができないので、微生物や植物によって合成されたカロ
チノイドを外界より摂取する必要がある。そのため、従
来より、タイ、サケ、エビ等の養殖魚介類の色揚げの目
的にアスタキサンチンは広く用いられてきた。また、ア
スタキサンチンは、食品においても、着色料としてだけ
ではなく、癌の原因となる生体内で発生する活性酸素を
除去する抗酸化剤としても注目を集めている（松野隆
男、幹渉、「動物におけるカロテノイドの生理機能と生
物活性」化学と生物、28,p.219−227,1990参照）。アス
タキサンチンの供給源としては、南極オキアミ等の甲殻
類、酵母Phaffiaの培養物、緑藻Haematococcusの培養
物、及び、有機合成法が知られている。しかし、南極オ
キアミ等の甲殻類を用いる場合、その採取、抽出におい
て、脂質を始めとする夾雑物との分離等において多大な
労力とコストを有する。また、酵母Phaffiaの培養物に
おいては、その細胞壁が強固でしかも生産量が低いた
め、アスタキサンチンの採取、抽出に多大なコストを有
する。緑藻Haematococcusの培養物においては、その培
養時には、アスタキサンチン合成に欠くことのできない
光を供給しなければならず、太陽光採取のための立地条
件や人工光供給のための培養装置等の設備が必要である
だけでなく、混在する副生成物の脂肪酸エステルや混在
するクロロフィルとの分離が困難である。以上のことか
ら上記の生物起源のアスタキサンチンは、コスト的に、
有機合成法に勝てないのが現状であった。しかしなが
ら、有機合成法においては、アスタキサンチンが魚介類
の飼料や食品添加剤として用いられることを考慮する
と、反応時に生ずる副生成物等の面で問題が残り、ま
た、消費者の天然物嗜好にも反している。以上のことよ
り、安全で消費者イメージのよい生物起源の安価なアス
タキサンチンの供給、製造法の開発が望まれている。

発明の開示 もし、アスタキサンチンの生合成を担う遺伝子群があ
れば非常に有用であると考えられる。なぜなら、アスタ
キサンチンの産生能の有無にかかわりなく、食品として
の安全性やアスタキサンチンの潜在的生産能の面で最適
な微生物に、アスタキサンチン合成遺伝子群を導入する
ことにより、その生産能を与えることができるからであ
る。この場合、混在する副生成物の問題もなく、今日の
進んだ遺伝子操作の手法をもって、有機合成法を凌駕す
るレベルまでアスタキサンチンの生産量を上げることも
難しくないと思われる。しかしながら、キサントフィル
の１種であるゼアキサンチンまでを合成する遺伝子群
は、前述した様にすでに本発明者等によって取得されて
いるが、アスタキサンチンを合成するのに必要なケト基
導入酵素をコードする遺伝子等の取得は未だ誰も成功に
至ってはいない。この原因としては、ケト基導入酵素は
膜タンパク質であり、膜から分離すると活性を失うた
め、その酵素精製、活性測定が不可能であり、酵素の知
見が皆無であったことが挙げられる。したがって、今日
まで、アスタキサンチンを遺伝子操作により微生物等に
生産させることは不可能であった。

本発明は、アスタキサンチンを始めとするケト基を含
むキサントフィル（ケトカロチノイド）を生産するのに
必要なケト基導入酵素をコードする遺伝子等を取得する
ことにより、微生物にアスタキサンチンを始めとするケ
ト基を含むキサントフィル（ケトカロチノイド）を生産
させるのに必要な遺伝子群を含むDNA鎖、および、このD
NA鎖を導入した微生物を利用した、アスタキサンチンを
始めとするケト基を含むキサントフィル（ケトカロチノ
イド）の製造法を提供することを目的とするものであ
る。

通常よく使われる遺伝子クローニング法である、目的
とするタンパク質の精製、アミノ酸配列の一部決定、お
よび、合成プローブによる遺伝子の取得法は、アスタキ
サンチン合成酵素の精製が不可能であることより採用で
きないことは前述したとおりである。そこで、本発明者
等は、非光合成細菌エルビニア（Erwinia）のカロチノ
イド合成遺伝子群が大腸菌で機能することに注目し、そ
の遺伝子群の組み合わせによって、アスタキサンチンの
生合成中間体であると考えられるリコピンやβ−カロチ
ンを大腸菌で作らせ、これらの大腸菌をアスタキサンチ
ン合成遺伝子のクローニングのための宿主とした。本発
明者等は、また、いくつかの海洋細菌がアスタキサンチ
ンを生産できること（Yokoyama,A.,Izumida,H.,Miki,
W.,′Marine bacteria produced astaxanthin′.10th I
nternational symposium on carotenoids,abstract,CL1
1−3,1993）、および、細菌の場合は一連の関連遺伝子
がクラスター（群）を構成しているかもしれないこと、
および、細菌の場合は大腸菌でその遺伝子群が機能発現
するかもしれないことに注目し、この海洋細菌を遺伝子
源として選んだ。これら２つの手段を組み合わせて研究
を行うことにより、海洋細菌よりアスタキサンチンやそ
の他のケト基を含むキサントフィルの生合成に必要な遺
伝子群の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
なお、海洋細菌でアスタキサンチン合成遺伝子群がクラ
スターを構成しており、大腸菌で機能発現すること、お
よび、これらの遺伝子産物がβ−カロチンまたはリコピ
ンを基質として利用できることは、本発明において始め
て明かにされたのである。

本発明によるDNA鎖は下記に示すものである。

（１）β−イオノン環（β−ionone ring）の４位のメ
チレン（methylene）基をケト（keto）基に変換する酵
素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有
するDNA鎖。

（２）β−イオノン環の４位のメチレン基をケト基に変
換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に配
列番号１に示したアミノ酸番号１から212までのアミノ
酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有するDN
A鎖。

（３）上記（２）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（２）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（４）β−イオノン環の４位のメチレン基をケト基に変
換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に配
列番号５に示したアミノ酸番号１から242までのアミノ
酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有するDN
A鎖。

（５）上記（４）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（４）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（６）β−カロチンをエキネノンを経てカンタキサンチ
ンに変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質
的に配列番号１に示したアミノ酸番号１から212までの
アミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するDNA鎖。

（７）上記（６）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（６）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（８）β−カロチンをエキネノンを経てカンタキサンチ
ンに変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質
的に配列番号５に示したアミノ酸番号１から242までの
アミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するDNA鎖。

（９）上記（８）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（８）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（10）３−ヒドロキシ−β−イオノン環（３−hydroxy
−β−ionone ring）の４位のメチレン（methylene）基
をケト（keto）基に変換する酵素活性を有するポリペプ
チドをコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（11）３−ヒドロキシ−β−イオノン環の４位のメチレ
ン基をケト基に変換する酵素活性を有していてアミノ酸
配列が実質的に配列番号１に示したアミノ酸番号１から
212までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩
基配列を有するDNA鎖。

（12）上記（11）記載のDNA鎖にハイブリダイズし、か
つ上記（11）に記載の酵素活性を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を有するDNA鎖。

（13）３−ヒドロキシ−β−イオノン環の４位のメチレ
ン基をケト基に変換する酵素活性を有していてアミノ酸
配列が実質的に配列番号５に示したアミノ酸番号１から
242までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩
基配列を有するDNA鎖。

（14）上記（13）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（13）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（15）ゼアキサンチンを４−ケトゼアキサンチンを経て
アスタキサンチンに変換する酵素活性を有していてアミ
ノ酸配列が実質的に配列番号１に示したアミノ酸番号１
から212までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するDNA鎖。

（16）上記（15）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（15）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（17）ゼアキサンチンを４−ケトゼアキサンチンを経て
アスタキサンチンに変換する酵素活性を有していてアミ
ノ酸配列が実質的に配列番号５に示したアミノ酸番号１
から242までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するDNA鎖。

（18）上記（17）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（17）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（19）４−ケト−β−イオノン環（４−keto−β−iono
ne ring）の３位の炭素に１つの水酸基を付加する酵素
活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有す
るDNA鎖。

（20）４−ケト−β−イオノン環の３位の炭素に１つの
水酸基を付加する酵素活性を有していてアミノ酸配列が
実質的に配列番号２に示したアミノ酸番号１から162ま
でのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列
を有するDNA鎖。

（21）上記（20）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（20）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（22）４−ケト−β−イオノン環の３位の炭素に１つの
水酸基を付加する酵素活性を有していてアミノ酸配列が
実質的に配列番号６に示したアミノ酸番号１から162ま
でのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列
を有するDNA鎖。

（23）上記（22）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（22）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（24）カンタキサンチンをフェニコキサンチンを経てア
スタキサンチンに転換する酵素活性を有していてアミノ
酸配列が実質的に配列番号２に示したアミノ酸番号１か
ら162までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
塩基配列を有するDNA鎖。

（25）上記（24）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（24）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

（26）カンタキサンチンをフェニコキサンチンを経てア
スタキサンチンに変換する酵素活性を有していてアミノ
酸配列が実質的に配列番号６に示したアミノ酸番号１か
ら162までのアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
塩基配列を有するDNA鎖。

（27）上記（26）に記載のDNA鎖にハイブリダイズし、
かつ上記（26）に記載の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有するDNA鎖。

本発明は、また、キサントィルの製造法にも関する。

すなわち、本発明によるキサントフィルの製造法は下
記に示すものである。

（１）上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載のDNA
鎖を、β−カロチンを産生する能力を有する微生物に導
入して該形質転換微生物を培地で培養し、培養物からカ
ンタキサンチンまたはエキネノンを採取することを特徴
とする、キサントフィルの製造法。

（２）上記（10）〜（18）のいずれか１項に記載のDNA
鎖を、ゼアキサンチンを産生する能力を有する微生物に
導入して該形質転換微生物を培地で培養し、培養物から
アスタキサンチンまたは４−ケトゼアキサンチンを採取
することを特徴とする、キサントフィルの製造法。

（３）上記（19）〜（27）のいずれか１項に記載のDNA
鎖を、カンタキサンチンを産生する能力を有する微生物
に導入して該形質転換微生物を培地で培養し、培養物か
らアスタキサンチンまたはフェニコキサンチンを採取す
ることを特徴とする、キサントフィルの製造法。

（４）微生物が細菌または酵母である、上記（１）〜
（３）のいずれか１項に記載の製造法。

図面の簡単な説明 第１図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1のケト基導入酵素遺伝子（crtW遺伝子）の塩基配
列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す説
明図である。

第２図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1の水酸基導入酵素遺伝子（crtZ遺伝子）の塩基配
列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す説
明図である。

第３図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1のリコピン環化酵素遺伝子（crtY遺伝子）の塩基
配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す
説明図である。

第４図は、第３図に続く配列を示す説明図である。

第５図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1のキサントフィル合成遺伝子群の塩基配列を示す
説明図である。

図中のＡからＦは、第１図から第４図のＡからＦに対
応している。

第６図は、第５図に続く配列を示す説明図である。

第７図は、第６図に続く配列を示す説明図である。

第８図は、第７図に続く配列を示す説明図である。

第９図は、第８図に続く配列を示す説明図である。

第10図は、非光合成細菌Erwinia uredovoraのカロチ
ノイド生合成経路とカロチノイド合成遺伝子の機能を示
す説明図である。

第11図は、海洋細菌Agrobacterium auranitiacus sp.
nov.MK1およびAlcaligenes sp.PC−１の主要なキサント
フィル生合成経路とキサントフィル合成遺伝子の機能を
示す説明図である。

ただし、crtY遺伝子の機能は前者においてのみ確認。

第12図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1のキサントフィル合成遺伝子（群）を含むいろい
ろなデレーションプラスミドを示す説明図である。

白抜きのＰは、ベクターpBluescript II SKのlacのプ
ロモーターを示している。制限酵素切断部位は次のよう
に省略して示されている。Sa,Sac I;X,Xba I;B,BamH I;
P,Pst I;E,EcoR I;S,Sal I;A,Apa I;K,Kpn I;St,Stu I;
N,Nru I;Bg,Bal II;Nc,Nco I;Hc.Hinc II. 第13図は、海洋細菌Alcaligenes sp.PC−１のケト基
導入酵素遺伝子（crtW遺伝子）の塩基配列とコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す説明図である。

第14図は、第13図に続く配列を示す説明図である。

第15図は、海洋細菌Alcaligenes sp.PC−１の水酸基
導入酵素遺伝子（crtZ遺伝子）の塩基配列とコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す説明図である。

第16図は、海洋細菌Alcaligenes sp.PC−１のキサン
トフィル合成遺伝子群の塩基配列を示す説明図である。
図中のＡからＤは、図13〜図15のＡからＤに対応してい
る。

第17図は、第16図に続く配列を示す説明図である。

第18図は、第17図に続く配列を示す説明図である。

第19図は、海洋細菌Alcaligenes sp.PC−１のキサン
トフィル合成遺伝子（群）を含むいろいろなデレーショ
ンプラスミドを示す説明図である。

白抜きのＰは、ベクターpBluescript II SK＋のlacの
プロモーターを示している。

第20図は、海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1およびAlcaligenes sp.PC−１のマイナーな生合
成経路を含むキサントフィルを生合成経路とキサントフ
ィル合成遺伝子の機能を示す説明図である。

マイナーな生合計経路は点線の矢印で示されている。

発明を実施するための最良の形態 本発明は、海洋細菌であるアグロバクテリウムAgroba
cterium aurantiacus sp.nov.MK1およびAlcaligenes s
p.PC−１に由来するアスタキサンチン等のケト基を含む
キサントフィル（ケトカロチノイド）の合成に有用なDN
A鎖、及び、このDNA鎖を導入した微生物を利用したアス
タキサンチン等のケト基を含むキサントフィル（ケトカ
ロチノイド）、すなわち、アスタキサンチン、フェニコ
キサンチン、４−ケトゼアキサンチン、カンタキサンチ
ン、及び、エキネノンの製造法を提供するものである。

本発明によるDNA鎖は、ファインケミカル生成反応の
点から原理、原則的には、前記（１），（10）および
（19）により示され、基本的には、前記（２），
（４），（11），（13），（20）および（22）により定
義されるものである。DNA鎖（２）および（４）の具体
例が前記（６）および（８）であり、DNA鎖（11）およ
び（13）の具体例が前記（15）および（17）であり、さ
らに、DNA鎖（20）および（22）の具体例が前記（24）
および（26）である。なお、DNA鎖（３），（５），
（７），（９），（12），（14），（16），（18），
（21），（23），（25）および（27）は、それぞれ、DN
A鎖（２），（４），（６），（８），（11），（1
3），（15），（17），（20），（22），（24）および
（26）に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするものである。

本発明によるDNA鎖がコードするポリペプチドは、ア
ミノ酸配列が実質的に配列番号１〜２及び５〜６（第１
〜２図及び第13〜15図）における前記したような特定範
囲（たとえば配列番号１（第１図）ではアミノ酸番号１
〜212の配列であるアミノ酸配列（第１図ではＡ〜
Ｂ））を有するものである。本発明において、これらの
DNA鎖によってコードされる４種のポリペプチド（すな
わちキサントフィル生成反応に関与する４種の酵素）
は、前述のような酵素活性を有する限りアミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等の変化があってもよい
（実施例13参照）。このことは、「アミノ酸配列が実質
的に−−−」ということと対応している。たとえば、こ
の酵素の第１番目のアミノ酸（Met）が欠失しているも
のなどもこのアミノ酸配列の変化によるポリペプチドな
いしは酵素に包含される。なお、各ポリペプチドをコー
ドする本発明DNA鎖は、配列番号１〜２及び５〜６（第
１〜２図及び第13〜15図）に示した特定範囲の塩基配列
をもつものの他に、縮重コドンにおいてのみ異なる同一
のポリペプチドをコードする縮重異性体をも包含するも
のであることはいうまでもない。

ケト基導入酵素遺伝子（crtW） DNA鎖（１）〜（18）はケト基導入酵素をコードする
遺伝子（crtWと命名）である。この典型的な例は、海洋
細菌Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1またはAlca
ligenes sp.PC−１よりクローニングしたcrtW遺伝子で
あり、第１図のＡからＢ（配列番号１のアミノ酸番号１
〜212）または第13〜14図のＡからＢ（配列番号５のア
ミノ酸番号１〜242）までのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする塩基配列からなるDNA鎖である。c
rtW遺伝子産物（以下CrtWとも呼ぶ）は、β−イオノン
環（β−ionone ring）の４位のメチレン（methylene）
基をケト（keto）基に転換する酵素活性を有しており、
その具体的な例の１つが、β−カロチン（β−caroten
e）を基質としてエキネノン（echinenone）を経てカン
タキサンチン（canthaxanthin）を合成する酵素活性で
ある（第11図参照）。さらに、crtW遺伝子産物は、３−
ヒドロキシ−β−イオノン環（３−hydroxy−β−ionon
e ring）の４位のメチレン（methylene）基をケト（ket
o）基に転換する酵素活性も有しており、その具体的な
例の１つが、ゼアキサンチン（zeaxanthin）を基質とし
て４−ケトゼアキサンチン（４−ketozeaxanthin）を経
てアスタキサンチン（astaxanthin）を合成する酵素活
性である（第11図参照）。なお、このような酵素活性を
有するポリペプチドおよびこれをコードするDNA鎖は、
従来知られていなかったものであり、このポリペプチド
またはこれをコードするDNA鎖は、現在までに知られて
いるどのようなポリペプチドまたはDNA鎖とも全体的な
ホモロジーは有していない。また、β−イオノン環や３
−ヒドロキシ−β−イオノン環に限られず、１つの酵素
がジハイドロカルボニル基を直接ケト基に変換するとい
う知見は今まで無かったものである。なお、Agrobacter
iumとAlcaligenes間のCrtWのホモロジーは、アミノ酸配
列レベルで、83％のアイデンティティーという高いホモ
ロジーを示した。

一方、非光合成細菌Erwiniaのカロチノイド合成遺伝
子を用いることにより、大腸菌等の微生物にβ−カロチ
ンやゼアキサンチンを作らせることができる、すなわ
ち、ErwiniaのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝子は、大腸
菌等の微生物にβ−カロチン生産能を与え、Erwiniaのc
rtE、crtB、crtI、crtY、crtZ遺伝子は、大腸菌等の微
生物にゼアキサンチン生産能を与える（第10図および前
記のWO91/13078号公開公報参照）。したがって、CrtWの
基質は、これらErwiniaのcrt遺伝子群により供給される
ので、上記のErwiniaのcrt遺伝子群を含む大腸菌等の微
生物にさらにcrtW遺伝子を導入すると、β−カロチン産
生微生物では、エキネノンを経てカンタキサンチンを、
ゼアキサンチン産生微生物では、４−ケトビアキサンチ
ンを経てアスタキサンチンを生産するようになる。

水酸基導入酵素遺伝子（crtZ） DNA鎖（19）〜（27）は水酸基導入酵素をコードする
遺伝子（crtZと命名）である。この典型的な例は、海洋
細菌Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1またはAlca
ligenes sp.PC−１よりクローニングしたcrtZ遺伝子で
あり、第２図のＣからＤ（配列番号２のアミノ酸番号１
〜162）または第15図のＣからＤ（配列番号６のアミノ
酸番号１〜162）までのアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードする塩基配列からなるDNA鎖である。crtZ
遺伝子産物（以下CrtZとも呼ぶ）は、β−イオノン環
（β−ionone ring）の３位の炭素に１つの水酸基を付
加する酵素活性を有しており、その具体的な例の１つ
が、β−カロチン（β−carotene）を基質としてβ−ク
リプトキサンチン（β−cryptoxanthin）を経てゼアキ
サンチン（zeaxanthin）を合成する酵素活性である（第
11図参照）。さらに、crtZ遺伝子産物は、４−ケト−β
−イオノン環（４−keto−β−ionone ring）の３位の
炭素に１つの水酸基を付加する酵素活性も有しており、
その具体的な例の１つが、カンタキサンチン（canthaxa
nthin）を基質としてフェニコキサンチン（phoenicoxan
thin）を経てアスタキサンチン（astaxanthin）を合成
する酵素活性である（第11図参照）。なお、後者の酵素
活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするDNA
鎖は、従来知られていなかったものである。また、Agro
bacteriumおよびAlcaligenesのCrtZは、アミノ酸配列レ
ベルで、Erwinia uredovoraのCrtZとそれぞれ、57％お
よび58％のアイデンティティーという高いホモロジーを
有した。なお、AgrobacteriumとAlcaligenes間のCrtZの
ホモロジーは、アミノ酸配列レベルで、90％のアイデン
ティティーという高いホモロジーを示した。

非光合成細菌Erwiniaのカロチノイド合成遺伝子を用
いることにより、大腸菌等の微生物にβ−カロチンを作
らせることができるのは前述のとおりである。さらに、
これにcrtWを加えると、大腸菌等の微生物にカンタキサ
ンチンを作らせることができるのも前述のとおりであ
る。したがって、AgrobacteriumまたはAlcaligenesのCr
tZの基質は、ErwiniaのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝子
（β−カロチンの生産）、および、これらにAgrobacter
iumまたはAlcaligenesのcrtW遺伝子を加えたもの（カン
タキサンチンの生産）により供給されるので、これらの
crt遺伝子群を含む大腸菌等の微生物にAgrobacteriumま
たはAlcalgenesのcrtZ遺伝子を導入すると、β−カロチ
ン産生微生物では、β−クリプトキサンチンを経てゼア
キサンチンを、カンタキサンチン産生微生物では、フェ
ニコキサンチンを経てアスタキサンチンを生産するよう
になる。

リコピン環化酵素遺伝子（crtY） アミノ酸配列が実質的に第３および４図のＥからＦ
（配列番号３のアミノ酸番号１〜386）までのアミノ酸
配列をコードするDNA鎖は、リコピン環化酵素をコード
する遺伝子（crtYと命名）である。この典型的な例は、
海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1よりク
ローニングしたcrtY遺伝子であり、第３および４図のＥ
からＦまでのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列からなるDNA鎖である。crtY遺伝子産物
（以下CrtYとも呼ぶ）は、リコピン（lycopene）を基質
としてβ−カロチン（β−carotene）を合成する酵素活
性を有している（第11図参照）。非光合成細菌Erwinia
のカロチノイド合成遺伝子を用いることにより、大腸菌
等の微生物にリコピンを作らせることができる、すなわ
ち、ErwiniaのcrtE、crtB、crtI遺伝子は、大腸菌等の
微生物にリコピン生産能を与える（第10図および前記の
WO91/13078号公開公報参照）。したがって、Agrobacter
iumのCrtYの基質は、Erwiniaのcrt遺伝子群により供給
されるので、上記のErwiniaのcrt遺伝子群を含む大腸菌
等の微生物にAgrobacteriumのcrtYを導入すると、β−
カロチンを生産させることが可能となる。

なお、AgrobacteriumのCrtYは、アミノ酸配列レベル
で、Erwinia uredovoraのCrtYと44.3％のアイデンティ
ティーという意義深いホモロジーを有しており、酵素の
機能も両者で同一である（第10図、第11図参照）。

海洋細菌の菌学的性質 キサントフィル合成遺伝子の取得源となった海洋細菌
であるAgrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1およびAl
caligenes sp.PC−１は、下記のような菌学的性質を示
す。

＜Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1＞ （１）形態 菌の形・大きさ：桿状、0.9μm x 1.2μｍ 運動性：あり 鞭毛：周毛あり 細胞の多形成：なし 胞子の形成：なし グラム染色：陰性 （２）各培地における生育状況 肉汁寒天平板培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の円
形コロニーを形成する。

肉汁寒天斜面培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の帯
状に生育する。

肉汁液体培養：培地全体に均一に生育し、橙色を示す。

肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔を中心に表面に生育す
る。

（３）生理学的性質 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陰性 インドールの生成：陰性 クエン酸の利用：陰性 色素の生成：脂溶性の赤橙色色素 ウレアーゼ活性：陰性 オキシダーゼ活性：陽性 カタラーゼ活性：陽性 β−グルコシダーゼ活性（エスクリン分解性）：陽性 β−ガラクトシダーゼ活性：陽性 生育の範囲:PH5〜９、温度10〜40℃ 酸素に対する態度：好気性 海水耐性：陽性 Ｏ−Ｆテスト：酸化 糖類の同化能： 陽性:D−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−フルクトース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、グリ
コーゲン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン 陰性:L−アラビノース、Ｄ−マンニトール、イノシロ
ール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ソルビトール 有機酸の同化能： 陽性：乳酸塩 陰性：クエン酸塩、リンゴ酸塩、グルコン酸塩、カプ
リン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩 他の有機物資化能： 陽性：イノシン、ウリジン、グルコース−１−リン
酸、グルコース−６−リン酸 陰性：ゼラチン、Ｌ−アルギニン、DNA、カゼイン ＜Alcaligenes sp.PC−１＞ （１）形態 菌の形・大きさ：短桿状、1.4μｍ 運動性：あり 鞭毛：周毛あり 細胞の多形成：なし 胞子の形成：なし グラム染色：陰性 （２）各培地における生育状況 肉汁寒天平板培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の円
形コロニーを形成する。

肉汁寒天斜面培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の帯
状に生育する。

肉汁液体培養：培地全体に均一に生育し、橙色を示す。

肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔を中心に表面に生育す
る。

（３）生理学的性質 色素の生成：脂溶性の赤橙色色素 オキシダーゼ活性：陽性 カラターゼ活性：陽性 生育の範囲:PH5〜９、温度10〜40℃ 酸素に対する態度：好気性 海水耐性：陽性 Ｏ−Ｆテスト：酸化 ゼラチン分解性：陰性 他の海洋細菌のキサントフィル合成遺伝子群 現在までに16種の海洋細菌がアスタキサンチン等のケ
トカロチノイドを合成することが報告されている（Yoko
yama,A.,Izumida,H.,Miki,W.,′Marine bacteria produ
ced astaxanthin′.10th International symposium on
carotenoids,abstract,CL11−3,1993）。前述した海洋
細菌Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1またはAlca
ligenes sp.PC−１のcrt遺伝子の内のいずれかをプロー
ブとして用いれば、そのホモロジーを利用することによ
って、他のアスタキサンチン産生海洋細菌から、アスタ
キサンチンを始めとするケトカロチノイドの生合成を担
う遺伝子群を取得することができるはずである。事実、
発明者は、Ag.aurantiacus sp.nov.MK1のcrtWとcrtZを
含むDNA断片をプローブとして、Alcaligenes PC−１の
染色体DNAから、強くハイブリダイズするDNA断片とし
て、crtWとcrtZ遺伝子を取得したのであった（詳細は実
施例を参照されたい）。さらに、発明者等は、アスタキ
サンチンを合成できる残りの14種の海洋細菌の中からAl
teromonas SD−402を選んで、これから染色体DNAを調製
し、Ag.aurantiacus sp.nov.MK1のcrtWとcrtZを含むDNA
断片をプローブとして、サザン法を行ったところ、予想
どおり、このプローブはこの海洋細菌の染色体DNAに由
来するバンドともハイブリダイズした。本発明によるDN
A鎖は、このような前記DNA鎖（２），（４），（６），
（８），（11），（13），（15），（17），（20），
（22），（24）および（26）とハイブリダイズするDNA
鎖を包含するものである。

DNA鎖の取得 上記の各酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するDNA鎖を取得する一つの手段は、核酸合成の方法
に従って、その鎖長の少なくとも一部を化学合成するこ
とであるが、結合アミノ酸が多数であるということを考
えれば、この化学合成法よりもAgrobacterium aurantia
cus sp.nov.MK1またはAlcaligenes sp.PC−１のトータ
ルDNAを適当な制限酵素で消化したものを用いて大腸菌
でライブラリーを作製し、このライブラリーから遺伝子
工学の分野で慣用されている方法、たとえば適当なプロ
ーブによるハイブリダイゼーション法、により、これを
取得するほうが好ましいと言える（他の海洋細菌のキサ
ントフィル合成遺伝子群参照）。

大腸菌等の微生物の形質転換および遺伝子発現 上述のような本発明DNA鎖を適当な細菌（例えば、大
腸菌、Zymomonas mobilis、Agrobacterium tumefacien
s）や酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）等の微
生物に導入することにより、種々のキサントフィルを製
造することができる。

以下は、好ましい微生物への外来遺伝子の導入法の概
要について記載したものである。

大腸菌等の微生物への外来遺伝子の導入および発現の
ための手順ないし方法は、本発明において下記したとこ
ろ以外のものにおいても、遺伝子工学の分野により慣用
されているものを含み、その手法ないし方法（たとえ
ば、′Vectors for cloning genes′,Methods in Enzym
ology,216,p.469−631,1992,Academic Press、およ
び、′Other bacterial systems′,Methods in Enzymol
ogy,204,p.305−636,1991,Academic Press参照）に準じ
て実施すればよい。

＜大腸菌＞ 大腸菌への外来遺伝子の導入法は、ハナハンの方法、
ルビジウム法などすでに確立されたいくつかの効率的方
法があり、それを用いて行えばよい（たとえば、Sambro
ok,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,′Molecular cloning
−A laboratory manual.′Cold Spring Harbor Laborat
ory Press,1989参照）。大腸菌での外来遺伝子の発現は
常法に従って行えばよいが（たとえば、前述の′Molecu
lar cloning−A laboratory manual.′参照）、たとえ
ば、pUC系やpBluescript系等のlacのプロモーター等を
有する大腸菌用ベクターを用いて行うことができる。発
明者等は、lacのプロモーター等を有する大腸菌用ベク
ターpBluescript II SKまたはKSを用いて、lacのプロモ
ーターの転写のリードスルーを受ける方向に、Agrobact
erium aurantiacus sp.nov.MK1のcrtW、crtZ、crtY遺伝
子およびAlcaligenes sp.PC−１のcrtW、crtZ遺伝子を
挿入し、これらの遺伝子を大腸菌で発現させた。

＜酵母＞ 酵母Saccharomyces cerevisiaeへの外来遺伝子の導入
法は、リチウム法などすでに確立された方法があり、そ
れを用いて行えばよい（たとえば、秋山裕一監修バイオ
インダストリー協会編集、「酵母のニューバイオテクノ
ロジー」医学出版センター刊参照）。酵母での外来遺伝
子の発現は、PGKやGPD等のプロモーターおよびターミネ
ーターを用いて、外来遺伝子をこのプロモーターとター
ミネーターの間に転写のリードスルーを受けるように挿
入した発現カセットを構築し、この発現カセットを、S.
cerevisiaeのベクター、たとえば、YRp系（酵母染色体
のARS配列の複製起点とする酵母用マルチコピーベクタ
ー）、YEp系（酵母の２μm DNAの複製起点を持つ酵母用
マルチコピーベクター）、YIp系（酵母の複製起点を持
たない酵母染色体組込み用ベクター）等のベクターに挿
入することにより行うことができる（前述の「酵母のニ
ューバイオテクノロジー」医学出版センター刊、日本農
芸化学会ABCシリーズ「物質生産のための遺伝子工学」
朝倉書店刊、および、Yamano,S.,Ishii,T.,Nakagawa,
M.,Ikenaga,H.,Misawa,N.,′Metabolic engineering fo
r production of β−carotene and lycopen in Saccha
romyces cerevisiae′.Biosci.Biotech.Biochem.,58,P.
1112−1114,1994参照）。

＜Zymomonas mobilis＞ エタノール生産細菌Zymomonas mobilisへの外来遺伝
子の導入法は、グラム陰性菌に共通な接合伝達法により
行うことができ、Zymomonas mobilisでの外来遺伝子の
発現は、たとえばZymomonas mobilis用ベクターpZA22を
用いて行うことができる（中村克己、「Zymomonas細菌
の分子育種」、日本農芸化学会誌,63,p.1016−1018,198
9、および、Misawa,N.,Yamano,S.,Ikenaga,H.,′Produc
tion of β−carotene in Zymomonas mobilis and Agro
bacterium tumefaciens by introduction of the biosy
nthesis genes from Erwinia uredovora′.Appl.Enviro
n.Microbiol.,57,p.1847−1849,1991参照）。

＜Agrobacterium tumefaciens＞ 植物病原細菌Agrobacterium tumefaciensへの外来遺
伝子の導入法は、グラム陰性菌に共通な接合伝達法によ
り行うことができ、Agrobacterium tumefaciensでの外
来遺伝子の発現は、たとえばAgrobacterium tumefacien
s用ベクターpBI121を用いて行うことができる（Misawa,
N.,Yamano,S.,Ikenaga,H.,′Production of β−carote
ne in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaci
ens by introduction of the biosynthesis genes from
Erwinia uredovora′.Appl.Environ.Microbiol.,57,p.
1847−1849,1991参照）。

微生物によるキサントフィル生産 前述した、微生物への外来遺伝子の導入および発現の
ための手法ないし方法によって、海洋細菌由来のアスタ
キサンチンを始めとするケトカロチノイド合成遺伝子群
を導入し、発現させることが可能である。

ファルネシルピロリン酸（FPP）はカロチノイドだけ
でなく、セスキテルペン、トリテルペン、ステロール、
ホパノール等のテルペノイドと共通な基質である。一般
に、微生物は、カロチノイドを合成できないものでも、
テルペノイドは合成しているので、すべての微生物は、
基本的に、中間代謝産物としてFPPを有しているはずで
ある。一方、非光合成細菌Erwiniaのカロチノイド合成
遺伝子群は、FPPを基質として、Agrobacterium auranti
acus sp.nov.MK1またはAlcaligenes sp.PC−１のcrt遺
伝子産物の基質、すなわち、リコピン、β−カロチン、
ゼアキサンチンまで合成させることが可能である（第10
図参照）。発明者等は、大腸菌だけでなく前記した微生
物、すなわち、酵母Saccharomyces cerevisiae、エタノ
ール生産細菌Zymomonas mobilis、植物病原細菌Agrobac
terium tumefaciensにErwiniaのcrt遺伝子群を導入し、
これらの微生物が、予想どおり、β−カロチン等のカロ
チノイドを生産できるようになることを、すでに確認し
ている（Yamano,S.,Ishii,T.,Nakagawa,M.,Ikenaga,H.,
Misawa,N.,′Metabolic engineering for production o
f β−carotene and lycopene in Saccharomyces cerev
isiae′.Biosci.Biotech.Biochem.,58,P.1112−1114,19
94、Misawa,N.,Yamano,S.,Ikenaga,H.,′Production of
β−carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacteri
um tumefaciens by introduction of the biosynthesis
genes from Erwinia uredovora′.Appl.Environ.Micro
biol.,57,p.1847−1849,1991、および、本発明者らによ
る特許出願特願平３−58786号公報（特願平２−53255号
明細書）：「カロチノイドの合成に有用なDNA鎖」）。

したがって、Erwinia由来のカロチノイド合成遺伝子
群と本発明DNA鎖（典型的には、Agrobacterium auranti
acus sp.nov.MK1またはAlcaligenes sp.PC−１由来のカ
ロチノイド合成遺伝子群）を組み合わせて同一の微生物
に同時に導入することにより、原理的には、遺伝子導入
発現系が確立しているすべての微生物に、アスタキサン
チン等のケトカロチノイドを生産させることが可能とな
るはずである。以下に、各種ケトカロチノイドの微生物
による生産法について説明する。

＜カンタキサンチン、エキネノンの生産＞ β−カロチン合成に必要なErwinia uredovoraのcrt
E、crtB、crtI、crtY遺伝子およびケト基導入酵素遺伝
子である本発明DNA鎖（１）〜（９）のいずれか１項のD
NA鎖（典型的にはAgrobacterium aurantiacus sp.nov.M
K1またはAlcaligenes PC−１のcrtW遺伝子）を大腸菌等
の微生物に導入し発現させることにより、最終産物とし
てカンタキサンチン、中間代謝産物としてエキネノンを
生産させることができる。上記DNA鎖（crtW 遺伝子）
の発現レベルの調節やこれを有する微生物の培養条件の
検討等により、カンタキサンチンやエキネノンの収量や
量比を変えることができる。以下に大腸菌における２つ
の例を述べるが、詳細は実施例を参照されたい。

Erwinia uredovoraのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝子
を含む断片を大腸菌ベクターpACYC184に挿入したプラス
ミドpACCAR16ΔcrtX、および、Ag.aurantiacus sp.nov.
MK1のcrtW遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpBluescri
pt II SK−に挿入したプラスミドpAK916の両プラスミド
を大腸菌JM101に導入し、それを定常期まで培養し、菌
体を集め、カロチノイド色素を抽出した。抽出された色
素の94％はカンタキサンチンであり、６％はエキネノン
であった。また、カンタキサンチンの収量は、培養液２
リットルから3mgであった。

Erwinia uredovoraのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝子
を含む断片を大腸菌ベクターpACYC184に挿入したプラス
ミドpACCAR16ΔcrtX、および、Alcaligenes PC−１のcr
tW遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpBluescript II S
K＋に挿入したプラスミドpPC17−３の両プラスミドを大
腸菌JM101に導入し、それを定常期まで培養し、菌体を
集め、カロチノイド色素を抽出した。抽出された色素の
40％はカンタキサンチンであり、50％はエキネノンであ
った。残りの10％は未反応のβ−カロチンであった。

＜アスタキサンチン、４−ケトゼアキサンチンの生産＞ ゼアキサンチン合成に必要なErwinia uredovoraのcrt
E、crtB、crtI、crtY、crtZ遺伝子およびケト基導入酵
素遺伝子である本発明DNA鎖（10）〜（18）のいずれか
１項のDNA鎖（典型的にはAgrobacterium aurantiacus s
p.nov.MK1またはAlcaligenes PC−１のcrtW遺伝子）を
大腸菌等の微生物に導入し発現させることにより、最終
産物としてアスタキサンチン、中間代謝産物として４−
ケトゼアキサンチンを生産させることができる。上記DN
A鎖（crtW遺伝子）の発現レベルの調節やこれを有する
微生物の培養条件の検討等により、アスタキサンチンや
４−ケトゼアキサンチンの収量や量比を変えることがで
きる。ただし、 以下に大腸菌における２つの例を述べるが、詳細は実施
例を参照されたい。

Erwinia uredovoraのcrtE、crtB、crtI、crtY、crtZ
遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpACYC184に挿入した
ラスミドpACCAR25ΔcrtX、および、Ag.aurantiacus sp.
nov.MK1のcrtW遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpBlue
script II SK−に挿入したプラスミドpAK916の両プラス
ミドを大腸菌JM101に導入し、それを定常期まで培養
し、菌体を集め、カロチノイド色素を抽出した。抽出さ
れた色素のうち、アスタキサンチンと４−ケトゼアキサ
ンチンの収量は、それぞれ、培養液２リットルから1.7m
g、1.5mgであった。

Erwinia uredovoraのcrtE、crtB、crtI、crtY、crtZ
遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpACYC184に挿入した
プラスミドpACCAR25ΔcrtX、および、Alcaligenes PC−
１のcrtW遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpBluescrip
t II SK＋に挿入したラスミドpPC17−３の両プラスミド
を大腸菌JM101に導入し、それを定常期まで培養し、菌
体を集め、カロチノイド色素を抽出した。抽出された色
素のうち、アスタキサンチンと４−ケトゼアキサンチン
の収量は、それぞれ、培養液２リットルから約1mgであ
った。

＜アスタキサンチン、フェニコキサンチンの生産＞ β−カロチン合成に必要なErwinia uredovoraのcrt
E、crtB、crtI、crtY遺伝子およびケト基導入酵素遺伝
子である本発明DNA鎖（１）〜（９）のいずれか１項のD
NA鎖（典型的にはAgrobacterium aurantiacus sp.nov.M
K1またはAlcaligenes PC−１のcrtW遺伝子）と水酸基導
入酵素遺伝子である本発明DNA鎖（19）〜（27）のいず
れか１項のDNA鎖（典型的にはAg.aurantiacus sp.nov.M
K1またはAlcaligenes PC−１のcrtZ遺伝子）を大腸菌等
の微生物に導入し発現させることにより、最終産物とし
てアスタキサンチン、中間代謝産物としてフェニコキサ
ンチンを生産させることができる。上記DNA鎖（crtW遺
伝子およびcrtZ遺伝子）の発現レベルの調節やこれを有
する微生物の培養条件の検討等により、アスタキサンチ
ン、フェニコキサンチンの収量や量比を変えることがで
きる。以下に大腸菌における１例を述べるが、詳細は実
施例を参照されたい。

Erwinia uredovoraのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝子
を含む断片を大腸菌ベクターpACYC184に挿入したプラス
ミドpACCAR16ΔcrtX、および、Ag.aurantiacus sp.nov.
MK1のcrtW、crtZ遺伝子を含む断片を大腸菌ベクターpBl
uescript II SK−に挿入したラスミドpAK96Kの両プラス
ミドを大腸菌JM101に導入し、それを定常期まで培養
し、菌体を集め、カロチノイド色素を抽出した。抽出さ
れた色素のうち、アスタキサンチンとフェニコキサンチ
ンの収量は、それぞれ、培養液４リットルから3mg、2mg
であった。

微生物の寄託 本発明DNA鎖の遺伝子源となった微生物および単離さ
れた遺伝子を組み込んだ大腸菌は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に下記の通りに寄託されている。

（ｉ）Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1 寄託番号:FERM BP−4506 受託年月日：平成５年12月20日 （ii）Escherichia coli JM101（pAccrt−EIB,pAK92） 寄託番号:FERM BP−4505 受託年月日：平成５年12月20日 （iii）Alcaligenes sp.PC−１ 寄託番号:FERM BP−4760 受託年月日：平成６年７月27日 （iv）Escherichia coli.β:pPC17 寄託番号FERM BP−4761 受託年月日：平成６年７月27日 例 以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するた
めのものであり、本発明を限定するものではない。な
お、ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に
言及されていない場合は、標準的な方法（Sambrook,J.,
Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,′Molecular cloning−A la
boratory manual.′Cold Spirng Harbor Laboratory Pr
ess,1989）に基づいている。

実施例1:染色体DNAの調製 染色体DNAは、３種の海洋細菌、すなわち、Agrobacte
rium aurantiacus sp.nov.MK1、Alcaligenes sp.PC−
１、及びAlteromonas SD−402株（Yokoyama,A.,Izumid
a,H.,Miki,W.,′Marine bacteria produced astaxanthi
n′.10th International symposium on carotenoids,ab
stract,CL11−3,1993）から調製した。これらの海洋細
菌を200ミリリットル（ml）の培地（DIFCO社製“Marine
Broth"を説明書記載の方法により調製した培地）で、2
5℃、定常期まで４日間増殖させた菌体を集菌後、TES緩
衝液（20mMトリス、10mM EDTA、0.1M NaCl、pH8）で洗
浄し、68℃で15分間熱処理した後、5mg/mlリゾチーム
（生化学工業製）と100μg/ml RNase A（シグマ社製）
を含むＩ液（50mMグルコース、25mMトリス、10mM EDTA,
pH8）に懸濁した。37℃で１時間インキュベートした
後、250μg/mlになるようにプロテイナーゼＫ（Protein
ase K,ベーリンガー・マンハイム製）を加え、37℃で10
分間インキュベートした。さらに、最終濃度が１％にな
るようにザルコシール（Ｎ−Lauroylsarcosine Na、シ
グマ社製）を加え、よく混合した後、37℃で数時間イン
キュベートした。さらに、フェノール／クロロホルム抽
出を数回行った後、２倍量のエタノールをゆっくり加え
ながら、析出してきた染色体DNAのガラス棒に巻き付
け、70％エタノールでリンスした後、2mlのTE緩衝液（1
0mMトリス、1mM EDTA、pH8）に溶解して、染色体DNA調
製液とした。

実施例2:コスミドライブラリーのための宿主の作製 （１）フィトエン産生大腸菌の作製 Erwinia uredovoraのcrtZ以外のカロチノイド合成遺
伝子群を有するプラスミドpCAR16（Misawa,N.,Nakagaw
a,M.,Kobayashi,K.,Yamano,S.,Izawa,Y.,Nakamura,K.,H
arashima K.,′Elucidation of the Erwinia uredovora
carotenoid biosynthetic pathway by functional ana
lysis of gene products expressed in Escherichia co
li′.J.Bacteriol.,172,p.6704−6712,1990、および、
本発明者らによる特許出願特願平３−58786号公報（特
願平２−53255号明細書）：「カロチノイドの合成に有
用なDNA鎖」）からBstE II（1235）−Eco521（4926）断
片を除いた後、フィトエン産生に必要なcrtEとcrtB遺伝
子を含む2.3キロ塩基対（kb）のAsp718（Kpn I）−EcoR
I断片を切りだした。そして、この断片を大腸菌ベクタ
ーpACYC184のEcoR V部位に挿入し、目的とするプラスミ
ド（pACCRT−EB）を得た。このpACCRT−EBを有する大腸
菌は、抗生物質クロラムフェニコール耐性（Cm^r）を示
し、フィトエンを生産する（Linden,H.,Misawa,N.,Cham
ovitz,D.,Pecker,I.,Hirschberg,J.,Sandmann,G.,′Fun
ctional complementation in Escherichia coli of dif
ferent phytoene desaturase gens and analysis of ac
cumulated carotenes′.Z.Naturforsch.,46c,1045−105
1,1991）。

（２）リコピン産生大腸菌の作製 Er.uredovoraのcrtZ以外のカロチノイド合成遺伝子群
を有するプラスミドpCAR16からBstE II（1235）−SnaB
I（3497）断片を除いた後、リコピン産生に必要なcrt
E、crtI、crtB遺伝子を含む3.75kb Asp718（Kpn I）−E
coR I断片を切りだした。そして、この断片を大腸菌ベ
クターpACYC184のEcoR V部位に挿入し、目的とするプラ
スミド（pACCRT−EIB）を得た。このpACCRT−EIBを有す
る大腸菌は、Cm^rを示し、リコピンを生産する（Cunning
ham Jr.F.X.,Chamovitz,D.,Misawa,N.,Gatt,E.,Hirschb
erf,J.,′Cloning and functional expression in Esch
erichia coli of a cyanobacterial gene for lycopene
cyclase,the enzyme that catalyzes the biosynthesi
s of β−carotene′.FEBS Lett.,328,130−138,199
3）。

（３）β−カロチン産生大腸菌の作製 Er.uredovoraのcrtZ以外のカロチノイド合成遺伝子群
を有するプラスミドpCAR16の制限酵素BstE II消化、Kle
now fragment処理、ライゲーション反応を行うことによ
り、crtX遺伝子をフレームシフトにより失活させた後、
β−カロチン産生に必要なcrtE、crtY、crtI、crtB遺伝
子を含む6.0kb Asp718（Kpn I）−EcoR I断片を切りだ
した。そして、この断片を大腸菌ベクターpACYC184のEc
oR V部位に挿入し、目的とするプラスミド（pACCAR16Δ
crtXと命名）を得た。このpACCAR16ΔcrtXを有する大腸
菌は、Cm^rを示し、β−カロチンを生産する。なお、制
限酵素および遺伝子操作に用いる酵素類は、宝酒造
（株）またはベーリンガー・マンハイム社から購入し
た。

実施例3:コスミドライブラリーの作製および橙色を呈す
る大腸菌の取得 Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1の染色体DNA
25μｇに対して、１ユニットの制限酵素Sau3A Iを用
い、37℃、15分間インキュベートした後、68℃、10分間
の処理で制限酵素を失活させた。この条件で40kb付近に
多くのSau3A I部分分解断片が得られた。この一部を用
いて、コスミドベクターpJB8（アンピシリン耐性（A
p^r））を、BamH I消化後アルカリフォスファターゼ処理
したもの、および、pJB8をSal I/BamH I消化後右アーム
（小さい方の断片）をゲルから回収したものを混ぜ、12
℃、一晩ライゲーション反応を行った。なお、pJB8は以
前にアマーシャム社から購入したものである。

上記のライゲーション反応を行ったDNAを用い、ギガ
パック・ゴールド（ストラタジーン社製、フナコシ販
売）によりin vitroパッケージングを行い、コスミドラ
イブラリーを作るのに十分量のファージ粒子を得た。

このファージ粒子を大腸菌（Escherichia coli）DH1
（ATCC33849）、および、実施例２で作製した３種のプ
ラスミドの各々を有する大腸菌DH1に感染させた後、１
プレートあたり100−300コロニーになるように希釈し、
適当な薬剤を含むLB（１％トリプトン、0.5％イースト
エキス、１％NaCl）にプレーティングし、37℃または室
温で、一晩から数日間培養した。

その結果、ただの大腸菌（ベージュ色）およびpACCRT
−EBを有するフェトエン産生大腸菌（ベージュ色）を宿
主としたコスミドライブラリーでは、各々、１万コロニ
ー以上スクリーニングしたが、色調が変化したものは得
られなかった。一方、pACCRT−EIBを有するリコピン産
生大腸菌（うすい赤色）およびpACCAR16ΔcrtXを有する
β−カロチン産生大腸菌（黄色）を宿主としたコスミド
ライブラリーでは、各々、数百コロニーに１株の割合
で、橙色を呈するコロニーが出現した。これらの橙色を
呈する大腸菌形質転換株のほとんどは、pJB8に40kb前後
のSau3A I部分分解断片が挿入されたプラスミドを含ん
でいた。なお、ただの大腸菌およびpACCRT−EBを有する
フィトエン産生大腸菌を宿主としたコスミドライブラリ
ーでは色調が変化したものは得られなかったことから、
Agrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1染色体DNAから
キサントフィル合成遺伝子群を発現クローニングするた
めには、少なくともフィトエンより後のカロチノイド合
成中間体を作る大腸菌を宿主として用いなければならな
いことがわかる。

実施例4:橙色色素合成遺伝子群を含む断片の縮小化 pACCRT−EIBを有するリコピン産生大腸菌DH1（うすい
赤色）およびpACCAR16ΔcrtXを有するβ−カロチン産生
大腸菌DH1（黄色）を宿主としたコスミドライブラリー
で得られた橙色のコロニーの中から、各々、数十コロニ
ーを選んで、このプラスミドを分析したところ、１株を
除いてすべて、pJB8に33kbから47kbのSau3A I部分分解
断片が挿入されたプラスミドが含まれていた。残りの１
株（リコピン産生大腸菌を宿主としたもの）には、pJB8
に3.9kbのSau3A I部分分解断片が挿入されたプラスミド
（pAK9と命名）が含まれていた。これは、大腸菌に感染
後、挿入断片のin vivoデレーションにより形成された
ものであると考えられた。pAK9を有するリコピン産生大
腸菌は、その他のコスミドライブラリーから得られた橙
色コロニーと同一の色素（実施例６においてアスタキサ
ンチンと同定）を合成することができたので、以後の解
析には、このpAK9を材料として用いた。

実施例5:橙色色素合成遺伝子群の塩基配列決定 pAK9から調製した3.9kbのEcoR I挿入断片を大腸菌ベ
クターpBluescript II SK＋のEcoR I部位に挿入して、
断片の方向性がベクターに対して互いに逆の２種のプラ
スミド（pAK91およびpAK92と命名）を得た。このうちプ
ラスミドpAK92の制限酵素地図を第12図に示す。pAK92を
リコピン産生大腸菌に導入したところ、アスタキサンチ
ン合成（実施例６）により橙色コロニーになったが、pA
K91をリコピン産生大腸菌に導入しても、新たな色素の
合成能は与えられなかった。したがって、プラスミドpA
K92における色素合成遺伝子群の方向性はベクターのlac
プロモーターの向きと同じであると考えられた。つぎに
pAK91のPst I分解により得られる2.7kbのPst I断片と、
pAK92からBamH I分解により得られる2.9kbのBamH I断片
およびSal I分解により得られる2.3kbと1.6kbとのSal I
断片とを、それぞれベクターpBluescript II SK−にク
ローニングした。これにより得られたプラスミドのう
ち、pAK94、pAK96、pAK98、pAK910、pAK93、pAK95と名
付けたプラスミドの制限酵素地図を第12図に示す。プラ
スミドpAK94、pAK96、pAK98、pAK910は色素合成遺伝子
群の方向性がベクターのlacプロモーターの向きと同じ
であり、pAK93、pAK95では逆である。

2.9kbのBamH I断片を有するプラスミドpAK96をリコピ
ン産生大腸菌に導入しても、3.9kb EcoR I断片を有する
pAK92を導入した場合と同様に、その大腸菌形質転換株
はアスタキサンチンを合成することがわかったため（実
施例６）、この2.9kb BamH I断片のDNA配列の決定を行
った。

DNA配列の決定は2.9kbのBamH I断片について正逆両方
向からの欠失変異体を作成し、得られた種々の長さの欠
失を有するクローンについて行った。欠失変異体作製は
４種のプラスミドpAK96、pAK98、pAK93、pAK95について
以下の手順で行った。それぞれのプラスミド、10μｇを
Sac IとXba Iとで分解した後、フェノール／クロロホル
ム抽出を行い、エタノール沈殿によりDNAを回収した。
それぞれのDNAを100μｌのExo IIIバッファー（50mM Tr
is−HCl,100mM NaCl,5mM MgCl2,10mM 2−メルカプトエ
タノール,pH8.0）に溶解し、180ユニットのExo IIIヌク
レアーゼを加えて37℃で保温した。１分ごとに10μｌを
サンプリングして、２サンプル分ずつ、20μｌのMBバッ
ファー（40mM Na−Acetate,100mM NaCl,2mM ZnCl2,10％
グリセロール,pH4.5）の入った氷上のチューブに移し
た。サンプリング終了後、得られた５本のチューブを65
℃、10分間保温して酵素を失活させた後、５ユニットの
マングビーンヌクレアーゼを加えて37℃で30分間保温し
た。反応後、アガロースゲル電気泳動により、１つのプ
ラスミドについて５種のそれぞれ欠失の程度が異なるDN
A断片を回収した。回収したDNAはKlenow fragmentによ
り末端を平滑化し、16℃、一晩ライゲーション反応した
後、大腸菌JM109を形質転換した。得られた種々のクロ
ーンについてヘルパーファージM13K07を用いて１本鎖DN
Aを調製し、アプライドバイオシステム（株）の蛍光プ
ライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエ
ンス反応を行い、自動シークエンサーを用いてDNA配列
を決定した。

その結果得られた2886塩基対（bp）からなるDNA配列
を第５〜９図（配列番号４）に示す。開始コドンの前に
リボソーム結合部位が存在するオープン・リーディング
・フレームの検索の結果、３種のキサントフィル合成遺
伝子crtW、crtZ、crtYの存在が予想された位置（実施例
８）に各々のタンパク質をコードしうる３つのオープン
リーディングフレーム（第５〜９図中ＡからＢ（配列番
号４の塩基位置229〜864）、ＣからＤ（塩基位置864〜1
349）、ＥからＦ（塩基位置1349〜2506））が見いださ
れた。このうちＡからＢ、ＥからＦの２つのオープンリ
ーディングフレームについてはそれぞれ開始コドンはGT
Gであり、ＣからＤについてはATGである。

実施例6:橙色色素の同定 pAK92またはpAK96をリコピン産生大腸菌JM101に導入
したもの（大腸菌（pACCRT−EIB、pAK92またはpAK9
6））（橙色を呈している）、または、pAK94またはpAK9
6K（第12図）をβ−カロチン産生大腸菌JM101に導入し
たもの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX,pAK94またはpAK96
K））（橙色を呈している）を150μg/mlのアンピシリン
（Ap、明治製菓製）と30μg/mlのクロラムフェニコール
（Cm、三共製）を含む2YT培地（1.6％トリプトン、１％
イーストエキス、0.5％NaCl）４リットルで、37℃、18
時間培養した。培養液から集菌した菌体を、600mlのア
セトンにより抽出した。これを濃縮後、400mlのクロロ
ホルム／メタノール（9/1）で２回抽出し、濃縮乾固し
た。さらに、これを小量のクロロホルム／メタノール
（9/1）に溶解後、メルク社製の分取用シリカゲルTLCプ
レートを用いて、クロロホルム／メタノール（15/1）で
展開することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）
を行った。元の橙色色素は、このTLCにより、Rf値0.7
2、0.82、0.91の３スポットに分かれた。橙色色素全体
の50％に相当する、最も濃いRf0.72の色素と、次に濃い
Rf0.82の色素を、TLCプレートから、かきとり後、小量
のクロロホルム／メタノール（9/1）またはメタノール
に溶解し、セファデクスLH−20カラムクロマトグラフィ
ー（15 X 300mm）にかけ、クロロホルム／メタノール
（9/1）またはメタノールで展開溶出することにより、
各々の純品を、3mg（:Rf0.72）、2mg（:Rf0.82）得た。

Rf0.72の色素は、紫外−可視スペクトル、1H−NMR、F
D−MSスペクトル（m/e596）の結果より、アスタキサン
チンと同一の平面構造を持つものであることが明かにな
った。そこで、ジエチルエーテル:2−プロパノール：エ
タノール5:5:2に溶解し、CDスペクトルを測定したとこ
ろ、3S,3′Ｓの立体構造をとることがわかったため、本
物質をアスタキサンチン（astaxanthin、構造式は第11
図参照）と同定した。また、Rf0.82の色素は、紫外−可
視スペクトル、1H−NMR、FD−MSスペクトル（m/e580）
の結果より、フェニコキサンチン（phoenicoxanthin、
構造式は第11図参照）と同定された。なお、Rf0.91の色
素はカンタキサンチンであった （実施例７（２））。

実施例7:キサントフィル中間代謝産物の同定 （１）４−ケトゼアキサンチンの同定 ゼアキサンチン産生大腸菌は次のようにして作製され
た。すなわち、Er.uredovoraの全カロチノイド合成遺伝
子群を有するプラスミドpCAR25（Misawa,N.,Nakagawa,
M.,Kobayashi,K.,Yamano,S.,izawa,Y.,Nakamura,K.,Har
ashima K.,′Elucidation of the Erwinia uredovora c
arotenoid biosynthetic pathway by functional analy
sis of gene products expressed in Escherichia col
i′.J.Bacteriol.,172,p.6704−6712,1990、および、本
発明者らによる特許出願特願平３−58786号公報（特願
平２−53255号明細書）：「カロチノイドの合成に有用
なDNA鎖」）の制限酵素BstE II消化、Klenow fragment
処理、ライゲーション反応を行うことにより、crtX遺伝
子をフレームシフトにより失活させた後、ゼアキサンチ
ン産生に必要なcrtE、crtY、crtI、crtB、crtZ遺伝子を
含む6.5kb Asp718（Kpn I）−EcoR I断片を切りだし
た。そして、この断片を大腸菌ベクターpACYC184のEcoR
V部位に挿入し、目的とするプラスミド（pACCAR25Δcr
tXと命名）を得た。

pAK910またはpAK916（第12図）をこのゼアキサンチン
産生大腸菌JM101に導入したもの（大腸菌（pACCAR25Δc
rtX、pAK910またはpAK916））（橙色を呈している）を1
50μg/mlのApと30μg/mlのCmを含む2YT培地２リットル
で、37℃、18時間培養した。培養液から集菌した菌体
を、300mlのアセトンにより抽出した。これを濃縮後、2
00mlのクロロホルム／メタノール（9/1）で２回抽出
し、濃縮乾固した。さらに、これを小量のクロロホルム
／メタノール（9/1）に溶解後、メルク社製の分取用シ
リカゲルTLCプレートを用いて、クロロホルム／メタノ
ール（15/1）で展開することにより、薄層クロマトグラ
フィー（TLC）を行った。元の橙色色素は、このTLCによ
り、Rf値0.54（46％）、0.72（53％）、0.91（１％）の
３スポットに分かれた。Rf0.54の色素を、TLCプレート
から、かきとり後、小量のクロロホルム／メタノール
（9/1）またはメタノールに溶解し、セファデクスLH−2
0カラムクロマトグラフィー（15 X 300mm）にかけ、ク
ロロホルム／メタノール（9/1）またはメタノールで展
開溶出することにより、純品を1.5mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、FD−MSスペク
トル（m/e582）、および、シリカゲルTLCの移動度（ク
ロロホルム／メタノール（15/1）で展開）が、４−ケト
ゼアキサンチンの標準品（Agrobacterium aurantiacus
sp.nov.MK1より精製、特願平５−70335）とすべて一致
したため、本物質を４−ケトゼアキサンチン（４−keto
zeaxanthin、構造式は第11図参照）と同定した。なお、
Rf0.72およびRf0.91の色素はそれぞれ、アスタキサンチ
ン（実施例６）、カンタキサンチン（実施例７（２））
である。

（２）カンタキサンチンの同定 pAK910またはpAK916をβ−カロチン産生大腸菌JM101
に導入したもの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX、pAK910また
はpAK916）（橙色を呈している）を150μg/mlのApと30
μg/mlのCmを含む2YT培地２リットルで、37℃、18時間
培養した。培養液から集菌した菌体を、300mlのアセト
ンにより抽出した。これを濃縮後、200mlのクロロホル
ム／メタノール（9/1）で２回抽出し、濃縮乾固した。
さらに、これを小量のクロロホルム／メタノール（9/
1）に溶解後、メルク社製の分取用シリカゲルTLCプレー
トを用いて、クロロホルム／メタノール（50/1）で展開
することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）を行
った。橙色色素全体の94％に相当する最も濃い色素を、
TLCプレートから、ときとった。さらに小量のクロロホ
ルム／メタノール（9/1）またはクロロホルム／メタノ
ール（1/1）に溶解後、セファデクスLH−20カラムクロ
マトグラフィー（15 X 300mm）にかけ、クロロホルム／
メタノール（9/1）またはクロロホルム／メタノール（1
/1）で展開溶出することにより、純品を3mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、1H−NMR、FD
−MSスペクトル（m/e564）、および、シリカゲルTLCの
移動度（クロロホルム／メタノール（50/1）での展開で
Rf0.53）が、カンタキサンチンの標準品（BASF社製）と
すべて一致したため、本物質をカンタキサンチン（cant
haxanthin、構造式は第11図参照）と同定した。また、
最初の抽出物に見られた橙色色素全体の６％に相当する
色素は、紫外−可視スペクトル、シリカゲルTLCの移動
度（クロロホルム／メタノール（50/1）での展開でRf0.
78）、および、ノバパックHR 6μ C18（3.9 X 300mm）
（ウォーターズ社製）を用いたHPLCの移動度（アセトニ
トリル／メタノール/2−プロパノール（90/6/4）で1.0m
l/minの速度での展開でRT16分）よりエキネノン（echin
enone、構造式は第11図参照）であると考えられた。

（３）ゼアキサンチンの同定 pAK96NK（第12図）をβ−カロチン産生大腸菌JM101に
導入したもの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX、pAK96NK））
（黄色を呈している）を150μg/mlのApと30μg/mlのCm
を含む2YT培地２リットルで、37℃、18時間培養した。
培養液から集菌した菌体を、300mlのアセトンにより抽
出した。これを濃縮後、200mlのクロロホルム／メタノ
ール（9/1）で２回抽出し、濃縮乾固した。さらに、こ
れを小量のクロロホルム／メタノール（9/1）に溶解
後、メルク社製の分取用シリカゲルTLCプレートを用い
て、クロロホルム／メタノール（9/1）で展開すること
により、薄層クロマトグラフィー（TLC）を行った。黄
色色素全体の87％に相当する最も濃い色素を、TLCプレ
ートから、かきとった。さらに小量のクロロホルム／メ
タノール（9/1）またはメタノールに溶解後、セファデ
クスLH−20カラムクロマトグラフィー（15 X 300mm）に
かけ、クロロホルム／メタノール（9/1）またはメタノ
ールで展開溶出することにより、純品を3mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、1H−NMR、FD
−MSスペクトル（m/e568）、および、シリカゲルTLCの
移動度（クロロホルム／メタノール（9/1）での展開でR
f0.59）が、ゼアキサンチンの標準品（BASF社製）とす
べて一致したため、本物質はゼアキサンチンと同一の平
面構造を持つものであることが明かになった。そこで、
ジエチルエーテル:2−プロパノール：エタノール5:5:2
に溶解し、CDスペクトルを測定したところ、3R,3′Ｒの
立体構造をとることがわかったため、本物質をゼアキサ
ンチン（zeaxanthin、構造式は第11図参照）と同定し
た。また、最初の抽出物に見られた黄色色素全体の13％
に相当する色素は、紫外−可視スペクトル、シリカゲル
TLCの移動度（クロロホルム／メタノール（9/1）での展
開でRf0.80）、および、ノバパックHR 6μ C18（3.9 X
300mm）（ウォーターズ社製）を用いたHPLCの移動度
（アセトニトリル／メタノール/2−プロパノール（90/6
/4）で1.0ml/minの速度での展開でRT19分）よりβ−ク
リプトキサンチン（β−cryptoxanthin、構造式は第11
図参照）であると考えられた。

（４）β−カロチンの同定 pAK98をリコピン産生大腸菌JM101に導入したもの（大
腸菌（pACCRT−EIB、pAK98））（黄色を呈している）を
150μg/mlのApと30μg/mlのCmを含む2YT培地２リットル
で、37℃、18時間培養した。培養液から集菌した菌体
を、300mlのアセトンにより抽出した。これを濃縮後、2
00mlのヘキサンにより２回抽出した。さらに、ヘキサン
層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（15
X 300mm）にかけ、ヘキサン／酢酸エチル（50/1）で展
開溶出することにより、純品を3mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、FD−MSスペク
トル（m/e536）、および、ノバパックHR 6μ C18（3.9
X 300mm）（ウォーターズ社製）を用いたHPLCの移動度
（アセトニトリル／メタノール/2−プロパノール（90/6
/4）で1.0ml/minの速度でRT62分）が、β−カロチンの
標準品（オールトランス型、シグマ社製）とすべて一致
したため、本物質をβ−カロチン（β−carotene、構造
式は第11図参照）と同定した。

実施例8:キサントフィル合成遺伝子群の同定 （１）ケト基導入酵素遺伝子の同定 pAK9（実施例４）またはpAK92に含まれる3.9kbの断片
のうち、リコピンからアスタキサンチンの合成に必要な
すべての遺伝子は、右側の2.9kb BamH I断片（pAK96、
第12図）の中に含まれていることが実施例６の結果より
明かである。したがって、左側の1.0kb断片は必要な
い。このpAK96の2.9kb BamH I断片の中に１ケ所のNco I
部位と１ケ所のKpn I部位が存在する。このNco IとKpn
I部位の間の1.4kb断片（pAK96NK）には水酸基導入酵素
活性が存在し、ケト基導入酵素活性が存在しないことが
実施例７（３）の結果よりわかる。また、2.9kb BamH I
断片の中に１ケ所存在し上記のNco IとKpn I部位の間に
あるSal I部位さらにはこのSal I部位より左のHinc II
部位から2.9kb BamH I断片の右側の断片を除いた断片
（pAK910およびpAK916）においても、β−カロチンから
カンタキサンチンを合成できるが（実施例７（２））、
pAK96の2.9kb BamH I断片からHinc II部位よりさらに左
のNco I部位から右側の断片を除いた断片においてはβ
−カロチンからカンタキサンチンを合成する活性は消失
していた。一方、pAK916の0.9kbのBamH I−Hinc II断片
において、その中の左方に１ケ所存在するBal II部位か
ら左側の断片を除いても、上記のBamH I−Hinc II断片
（pAK916）と同様の活性が存在した。したがって、pAK9
16内の0.74kbのBgl II−Hinc II断片の中にβ−カロチ
ンを基質としてカンタキサンチンを合成する酵素活性を
有するケト基導入酵素をコードする遺伝子が存在し、こ
の遺伝子の中に上記のNco I部位が存在していると考え
られる。塩基配列決定の結果、この遺伝子に相当する、
開始コドンの直前にリボソーム結合部位を有する１つの
オープン・リーディング・フレームを検出することがで
きたので、これをcrtW遺伝子と命名した。このcrtW遺伝
子の塩基配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は第１図（配列番号１）に示されている。

このAgrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1のcrtW遺
伝子産物（CrtW）は、β−イオノン環（β−ionone rin
g）の４位のメチレン（methylene）基をケト（keto）基
に転換する酵素活性を有しており、その具体的な例の１
つが、β−カロチン（β−carotene）を基質としてエキ
ネノン（echinenone）を経てカンタキサンチン（cantha
xanthin）を合成する酵素活性である（実施例７
（２）、第11図参照）。さらに、crtW遺伝子産物は、３
−ヒドロキシ−β−イオノン環（３−hydroxy−β−ion
one ring）の４位のメチレン（methylene）基をケト（k
eto）基に転換する酵素活性も有しており、その具体的
な例の１つが、ゼアキサンチン（zeaxanthin）を基質と
して４−ケトゼアキサンチン（４−ketozeaxanthin）を
経てアスタキサンチン（astaxanthin）を合成する酵素
活性である（実施例７（１）、第11図参照）。なお、こ
のような酵素活性を有するポリペプチドおよびこれをコ
ードするDNA鎖は、従来知られていなかったものであ
り、このポリペプチドまたはこれをコードするDNA鎖
は、現在までに知られているどのようなポリペプチドま
たはDNA鎖とも全体的なホモロジーは有していない。ま
た、β−イオノン環や３−ヒドロキシ−β−イオノン環
に限らず、１つの酵素がメチレン基をいきなりケト基に
変換するという知見は今まで無かったものである。

（２）水酸基導入酵素遺伝子の同定 pAK96の2.9kb BamH I断片の中に１ケ所のSal I部位が
存在する。このSal I部位で2.9kb BamH I断片を２つの
断片に切断して切り出すと、２つの断片（pAK910とpAK9
8）ともに、水酸基導入酵素活性は無くなってしまう。
すなわち、左側の断片（pAK910）にはケト基導入酵素活
性しか存在しなく（実施例７（２））、右側の断片（pA
K98）にはリコピン環化酵素活性しか存在しない（実施
例７（４））。一方、上記のSal I部位を含む1.4kbのNc
o I−Kpn I断片（pAK96NK）をβ−カロチン産生大腸菌
に導入すると、β−クリプトキサンチンを経て、ゼアキ
サンチンを合成するようになる（実施例７（３））。し
たがって、この1.4kbのNco I−Kpn I断片の中にβ−カ
ロチンを基質としてゼアキサンチンを合成する酵素活性
を有する水酸基導入酵素をコードする遺伝子が存在し、
この遺伝子の中に上記のSal I部位が存在していると考
えられる。塩基配列決定の結果、この遺伝子に相当す
る、開始コドンの直前にリボソーム結合部位を有する１
つのオープン・リーディング・フレームを検出すること
ができたので、これをcrtZ遺伝子と命名した。このcrtZ
遺伝子の塩基配列とコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は第２図（配列番号２）に示されている。

このAgrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1のcrtZ遺
伝子産物（CrtZ）は、β−イオノン環（β−ionone rin
g）の３位の炭素に１つの水酸基を付加する酵素活性を
有しており、この具体的な例の１つが、β−カロチン
（β−carotene）を基質としてβ−クリプトキサンチン
（β−cryptoxanthin）を経てゼアキサンチン（zeaxant
hin）を合成する酵素活性である（実施例７（３）、第1
1図参照）。さらに、crtZ遺伝子産物は、４−ケト−β
−イオノン環（４−keto−β−ionone ring）の３位の
炭素に１つの水酸基を付加する酵素活性も有しており、
その具体的な例の１つが、カンタキサンチン（canthaxa
nthin）を基質としてフェニコキサンチン（phoenicoxan
thin）を経てアスタキサンチン（astaxanthin）を合成
する酵素活性である（実施例６、第11図参照）。なお、
後者の酵素活性を有するポリペプチドおよびこれをコー
ドするDNA鎖は、従来知られていなかったものである。
また、AgrobacteriumのCrtZは、アミノ酸配列レベル
で、Erwinia uredovoraのCrtZと57％のアイデンティテ
ィーという意義深いホモロジーを示した。

（３）リコピン環化酵素遺伝子の同定 pAK96において2.9kb BamH I断片内の右方にあるKpn I
部位から右側の断片を除いた断片（pAK96K）、さらには
このKpn I部位より右にあるPst I部位から右側の断片を
除いた断片（pAK94）においては、β−カロチンからア
スタキサンチンは合成できるが（実施例６）、リコピン
からはアスタキサンチンを合成することはできなくな
る。一方、2.9kb BamH I断片の中に１ケ所存在し上記の
Kpn I部位より左に存在するSal I部位から右側の断片を
含む1.6kb Sal I断片（pAK98）をリコピン産生大腸菌に
導入すると、β−カロチンを合成するようになる（実施
例７（４））。したがって、この1.6kb Sal I断片の中
にリコピンを基質としてβ−カロチンを合成する酵素活
性を有するリコピン環化酵素をコードする遺伝子が存在
し、この遺伝子は、上記のKpn IとPst I部位にまたがっ
て存在していると考えられる。塩基配列決定の結果、こ
の遺伝子に相当する、開始コドンの直前にリボソーム結
合部位を有する１つのオープン・リーディング・フレー
ムを検出することができたので、これをcrtY遺伝子と命
名した。このcrtY遺伝子の塩基配列とコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は第３〜４図（配列番号３）に
示されている。

なお、このAgrobacterium aurantiacus sp.nov.MK1の
crtY遺伝子産物（Crt Y）は、アミノ酸配列レベルで、E
rwinia uredovoraのCrtYと44.3％のアイデンティティー
という意義深いホモロジーを有しており、酵素の機能も
両者で同一である。

実施例9:他の海洋細菌の染色体DNAとのサザン分析 他の海洋微生物の染色体上に単離したcrtWとcrtZと相
同性を示す領域が得られるか否かを検討した。実施例１
で調製したAlcaligenes sp.PC−１とAlteromonas sp.SD
−402の染色体DNAを制限酵素BamH IおよびPst Iで消化
し、アガロースゲル電気泳動法で分離した。全ての分離
したDNA断片を0.5N NaOH、1.5M NaClのアルカリ溶液で
変性した後、一晩かけてナイロンメンブレンにトランス
ファーさせた。DNAが吸着したナイロンメンブレンをハ
イブリダイゼーション溶液（6xDenhardt、5xSSC、100μ
g/ml ssDNA）に浸し、２時間、60℃でプレハイブリダイ
ゼーションを行なった。次に、pAK96KからBal Iで切り
出したcrtWとcrtZを含む1.5kbのDNA断片をMegaprimeTM
DNA labelling systems（アマシャム）と［ａ−32P］dC
TP（〜110TBq/mmol）とを用いて標識化し、上記のプレ
ハイブリダイゼーション溶液に加えて16時間、60℃でハ
イブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、2xSSC、0.1％SDSで60
℃、１時間洗浄しオートラジオグラフィーによって相同
性を示すシグナルを検出した結果、Alcaligenes sp.PC
−１ではBamH I消化物で約13kb、Pst I消化物で2.35kb
の位置に強いシグナルが得られ、Alteromonas sp.SD−4
02ではBamH I消化物で約5.6kb、Pst I消化物で20kb以上
の位置に強いシグナルが得られた。

実施例10:他の海洋細菌よりのキサントフィル合成遺伝
子群の取得 実施例９の結果より、Alcaligenes sp.PC−１の染色
体DNAのPst I消化物で、2.35kb付近にAgrobacterium au
rantiacus sp.nov.MK1のcrtWとcrtZ遺伝子を含むDNA断
片とハイブリダイズする領域が存在することがわかった
ので、Alcaligenesの染色体DNAをPst Iで消化した後、
２〜3.5kbのサイズのDNA断片をアガロースゲル電気泳動
法により回収した。回収したDNA断片をベクターpBluesc
ript II SK＋のPst I部位にT4 DNAリガーゼを用いて挿
入し、大腸菌DH5αに導入して、Alcaligenesの部分ライ
ブラリーを作製した。この部分ライブラリーを、Agroba
cteriumのcrtWとcrtZ遺伝子を含む1.5kbのDNA断片をプ
ローブとしたコロニーハイブリダイゼーションに供した
結果、約5000コロニーからポジティブなコロニーを１つ
単離した。なお、コロニーハイブリダイゼーションの条
件は、実施例９に示したサザン分析法と同条件で行っ
た。続いて、得られたコロニーからプラスミドDNAを単
離し、Pst Iで消化して、組込まれたDNA断片のサイズを
調べたところ、プラスミド中には３つの異なる断片が含
まれていることがわかった。そこで、３つの異なるDNA
断片の中から実施例９に示したサザン分析法でハイブリ
ダイズする2.35kb断片１つを特定し、アガロースゲル電
気泳動法を用いてこの2.35kb Pst I断片を回収し、再度
pBluescript II SK＋のPst I部位に挿入して、プラスミ
ドpPC11、pPC12を作製した。pPC11とpPC12においては、
上記2.35kb Pst I断片がpBluescript II SK＋のPst I部
位に互いに逆向きに挿入されたものである。pPC11の制
限酵素地図を第19図に示す。

実施例11:Alcaligenesキサントフィル合成遺伝子群の塩
基配列決定 pPC11及びpPC12をβ−カロチン産生大腸菌に導入した
ところ、前者はアスタキサンチン等の合成（実施例12）
により橙色コロニーになったが、後者は新たな色素の合
成能を与えなかった。したがって、プラスミドpPC11に
おけるアスタキサンチン合成遺伝子群の方向はベクター
lacプロモーターの向きと同じであると考えられた。ま
た、pPC11をリコピン産生大腸菌に導入しても、新たな
色素は産生されなかったので、pPC11にはリコピン環化
酵素遺伝子は含まれていないことがわかった。

pPC11の挿入断片のうち右側の0.72kb BstE II−EcoR
V断片を脱落させたプラスミド（pPC17と命名、第19図）
をβ−カロチン産生大腸菌に導入しても、pPC11を導入
した場合と同様に、その大腸菌形質転換体はスタキサン
チン等を合成することがわかったため（実施例12）、こ
のpPC17における1.63kb Pst I−BstE II断片の塩基配列
の決定を行った。

欠失変異体作製はpPC17とpPC12を用いて、以下の手順
で行った。pPC17またはpPC12、それぞれ10μｇをKpn I
とHind IIIまたはKpn IとEcoR Iとで分解した後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によ
りDNAを回収した。それぞれのDNAを100μｌのExo IIIバ
ッファー（50mM Tris−HCl,100mM NaCl,5mM MgCl2,10mM
2−メルカプトエタノール,pH8.0）に溶解し、180ユニ
ットのExo IIIヌクレアーゼを加えて37℃で保温した。
１分ごとに10μｌをサンプリングして、２サンプル分ず
つ、20μｌのMBバッファー（40mM Na−Acetate,100mM N
aCl,2mM ZnCl2,10％グリセロール,pH4.5）の入った氷上
のチューブに移した。サンプリング終了後、得られた５
本のチューブを65℃、10分間保温して酵素を失活させた
後、５ユニットのマングビーンヌクレアーゼを加えて37
℃で30分間保温した。反応後、アガロースゲル電気泳動
により、１つのプラスミドについて10種のそれぞれ欠失
の程度が異なるDNA断片を回収した。回収したDNAはKlen
ow fragmentにより末端を平滑化し、16℃、一晩ライゲ
ーション反応した後、大腸菌JM109を形質転換した。得
られた種々のクローンについてヘルパーファージM13K07
を用いて１本鎖DNAを調製し、アプライドバイオシステ
ム（株）の蛍光プライマーサイクルシークエンスキット
を用いてシークエンス反応を行い、自動シークエンサー
を用いてDNA配列を決定した。

その結果得られた1631塩基対（bp）からなるDNA配列
を第16〜18図（配列番号７）に示す。開始コドンの前に
リボソーム結合部位が存在するオープン・リーディング
・フレームの検索の結果、２種のキサントフィル合成遺
伝子crtW、crtZの存在が予想された位置（実施例13）に
各々のタンパク質をコードしうる２つのオープンリーデ
ィングフレーム（第16〜28図中ＡからＢ（配列番号７の
塩基位置99〜824）、ＣからＤ（塩基位置824〜1309）が
見出された。

実施例12:Alcaligenesキサントフィル合成遺伝子群を有
する大腸菌が生産する色素の同定 （１）アスタキサンチン、４−ケトゼアキサンチンの同
定 実施例11で作製したpPC17のデレーションプラスミドの
うち、右側のBstE II末端から第17図の塩基番号1162
（配列番号７の塩基位置1162）まで欠失したデレーショ
ンプラスミド（crtWのみを有する）をpPC17−３（第19
図）と名付けた。

このpPC17−３をゼアキサンチン産生大腸菌JM101（実
施例７（１））に導入したもの（大腸菌（pACCAR25Δcr
tX、pPC17−３））（橙色を呈している）を150μg/mlの
Apと30μg/mlのCmを含む2YT培地２リットルで、37℃、1
8時間培養した。培養液から集菌した菌体を、300mlのア
セトンにより抽出した。これを濃縮後、200mlのクロロ
ホルム／メタノール（9/1）で２回抽出し、濃縮乾固し
た。さらに、これを小量のクロロホルム／メタノール
（9/1）に溶解後、メルク社製の分取用シリカゲルTLCプ
レートを用いて、クロロホルム／メタノール（15/1）で
展開することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）
を行った。元の橙色色素は、このTLCにより、Rf値0.54
（約25％）、0.72（約30％）、0.91（約25％）の３スポ
ットに分かれた。Rf値0.54と0.72の色素を、TLCプレー
トから、かきとり後、小量のクロロホルム／メタノール
（9/1）またはメタノールに溶解し、セファデクスLH−2
0カラムクロマトグラフィー（15 X 300mm）にかけ、ク
ロロホルム／メタノール（9/1）またはメタノールで展
開溶出することにより、各々の純品を約1mgづつ得た。

これらの物質における紫外−可視スペクトル、FD−MS
スペクトル、および、シリカゲルTLCの移動度（クロロ
ホルム／メタノール（15/1）で展開）が、４−ケトゼア
キサンチン、及び、アスタキサンチンの標準品（実施例
６、７（１））とすべて一致したため、これらの物質を
４−ケトゼアキサンチン（Rf0.54）、及び、アスタキサ
ンチン（Rf0.72）と同定した。なお、Rf値0.91の色素は
カンタキサンチンであった（実施例12（２））。

また、pPC11またはpPC17をβ−カロチン産生大腸菌JM
101に導入したもの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX、pPC11ま
たはpPC17））（橙色を呈している）もアスタキサンチ
ン、４−ケトゼアキサンチン及びカンタキサンチンを産
生することが同様の分析により確認された。さらに、こ
れらは、微量のフェニコキサンチンを生産することが実
施例６で得られた標品を用いて確認された。

（２）カンタキサンチンの同定 pPC17−３をβ−カロチン産生大腸菌JM101に導入した
もの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX、pPC17−３））（橙色
を呈している）を150μg/mlのApと30μg/mlのCmを含む2
YT培地２リットルで、37℃、18時間培養した。培養液か
ら集菌した菌体を、300mlのアセトンにより抽出した。
これを濃縮後、200mlのクロロホルム／メタノール（9/
1）で２回抽出し、濃縮乾固した。さらに、これを小量
のクロロホルム／メタノール（9/1）に溶解後、メルク
社製の分取用シリカゲルTLCプレートを用いて、クロロ
ホルム／メタノール（50/1）で展開することにより、薄
層クロマトグラフィー（TLC）を行った。橙色色素全体
の40％に相当する最も濃い色素を、TLCプレートから、
かきとった。さらに小量のクロロホルム／メタノール
（9/1）またはクロロホルム／メタノール（1/1）に溶解
後、セファデクスLH−20カラムクロマトグラフィー（15
X 300mm）にかけ、クロロホルム／メタノール（9/1）
またはクロロホルム／メタノール（1/1）で展開溶出す
ることにより、純品を2mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、FD−MSスペク
トル（m/e564）、およびシリカゲルTLCの移動度（クロ
ロホルム／メタノール（50/1）で展開）が、カンタキサ
ンチンの標準品（BASF社製）とすべて一致したため、本
物質をカンタキサンチンと同定した。また、最初の抽出
物に見られた橙色色素全体の50％に相当する色素は、紫
外−可視スペクトル、シリカゲルTLCの移動度（クロロ
ホルム／メタノール（50/1）で展開）、および、ノバパ
ックHR 6μ C18（3.9 X 300mm）（ウォーターズ社製）
を用いたHPLCの移動度（アセトニトリル／メタノール/2
−プロパノール（90/6/4）で展開）（実施例７（２）参
照）よりエキネノンであると考えられた。なお、抽出さ
れた色素の残りの10％は未反応のβ−カロチンであっ
た。

（３）ゼアキサンチンの同定 pPC11における1.15kb Sal I断片をpPC11と同じ方向に
pBluescript II SK＋のSal I部位に挿入したプラスミド
（pPC13と命名、第19図参照）を作製した。

このpPC13をβ−カロチン産生大腸菌JM101に導入した
もの（大腸菌（pACCAR16ΔcrtX、pPC13））（黄色を呈
している）を150μg/mlのApと30μg/mlのCmを含む2YT培
地２リットルで、37℃、18時間培養した。培養液から集
菌した菌体を、300mlのアセトンにより抽出した。これ
を濃縮後、200mlのクロロホルム／メタノール（9/1）で
２回抽出し、濃縮乾固した。さらに、これを小量のクロ
ロホルム／メタノール（9/1）に溶解後、メルク社製の
分取用シリカゲルTLCプレートを用いて、クロロホルム
／メタノール（9/1）で展開することにより、薄層クロ
マトグラフィー（TLC）を行った。黄色色素全体の90％
に相当する最も濃い色素を、TLCプレートから、かきと
った。さらに小量のクロロホルム／メタノール（9/1）
はまたメタノールに溶解後、セファデクスLH−20カラム
クロマトグラフィー（15 X 300mm）にかけ、クロロホル
ム／メタノール（9/1）またはメタノールで展開溶出す
ることにより、純品を3mg得た。

本物質における紫外−可視スペクトル、FD−MSスペク
トル（m/e568）、および、シリカゲルTLCの移動度（ク
ロロホルム／メタノール（9/1）で展開）が、ゼアキサ
ンチンの標準品（実施例７（３））とすべて一致したた
め、本物質をゼアキサンチンと同定した。また、最初の
抽出物に見られた黄色色素全体の10％に相当する色素
は、紫外−可視スペクトル、シリカゲルTLCの移動度
（クロロホルム／メタノール（9/1）で展開）、およ
び、ノバパックHR 6μ C18（3.9 X 300mm）（ウォータ
ーズ社製）を用いたHPLCの移動度（アセトニトリル／メ
タノール/2−プロパノール（90/6/4）で展開）（実施例
７（３）参照））よりβ−クリプトキサンチンであると
考えられた。

実施例13:Alcaligenesキサントフィル合成遺伝子群の同
定 （１）ケト基導入酵素遺伝子の同定 pPC11に含まれる2.35kbのPst I断片のうち、β−カロ
チンからアスタキサンチンの合成に必要なすべての遺伝
子は、左側の1.63kb Pst I−BstE II断片（pPC17、第19
図）の中に含まれていることが実施例11及び12（１）の
結果より明かである。したがって、右側の0.72kb BstE
II−Pst I断片は必要ない。このpPC17の1.63kb Pst I−
BstE II断片の中に１ケ所のSma I部位と１ケ所のSal I
部位が存在する（第19図）。このSma IおよびSal I部位
の左の0.65kbおよび0.69kbの断片を取り除くと、いずれ
もケト基導入酵素活性が無くなることは、これらのデレ
ーションプラスミドをβ−カロチン産生大腸菌に導入し
たものを用いた色素分析により確認した。また、1.63kb
Pst I−BstE II断片の左側の0.69kb Pst I−Sal I断片
をpBluescript SK＋のPst I−Sal I部位に挿入したプラ
スミドはケト基導入酵素活性を持たないことは、このプ
ラスミドをβ−カロチン産生大腸菌に導入したものを用
いた色素分析により確認した。一方、右側のBstE II末
端から第17図の塩基番号1162（配列番号７の塩基位置11
62）まで欠失したデレーションプラスミドpPC17−３
（第19図）にはケト基導入酵素活性が存在すること（実
施例12（１）（２））から、pPC17−３内の1162bp断片
内にβ−カロチンまたはゼアキサンチンを基質としてカ
ンタキサンチンまたはアスタキサンチンを合成する酵素
活性を有するケト基導入酵素をコードする遺伝子が存在
し、この遺伝子の中に上記のSma I部位とSal I部位が存
在していると考えられる。塩基配列決定の結果、この遺
伝子に相当する、開始コドンの直前にリボソーム結合部
位を有するオープン・リーディング・フレームを検出す
ることができたので、これをcrtW遺伝子と命名した。こ
のcrtW遺伝子の塩基配列とコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は第13〜14図（配列番号５）に示されてい
る。

このAlcaligenes sp.PC−１のcrtW遺伝子産物（Crt
W）は、β−イオノン環（β−ionone ring）の４位のメ
チレン（methylene）基をケト（keto）基に転換する酵
素活性を有しており、その具体的な例の１つが、β−カ
ロチン（β−carotene）を基質としてエキネノン（echi
nenone）を経てカンタキサンチン（canthaxanthin）を
合成する酵素活性である（実施例12（２）、第11図参
照）。さらに、crtW遺伝子産物は、３−ヒドロキシ−β
−イオノン環（３−hydroxy−β−ionone ring）の４位
のメチレン（methylene）基をケト（keto）基に転換す
る酵素活性も有しており、その具体的な例の１つが、ゼ
アキサンチン（zeaxanthin）を基質として４−ケトゼア
キサンチン（４−ketozeaxanthin）を経てアスタキサン
チン（astaxanthin）を合成する酵素活性である（実施
例12（１）、第11図参照）。なお、このような酵素活性
を有するポリペプチドおよびこれをコードするDNA鎖
は、従来知られていなかったものであり、このポリペプ
チドまたはこれをコードするDNA鎖は、現在までに知ら
れているどのようなポリペプチドまたはDNA鎖とも全体
的なホモロジーは有していない。なお、Agrobacterium
aurantiacus sp.nov.MK1とAlcaligenes sp.PC−１間のc
rtW遺伝子産物（CrtW）は、アミノ酸配列レベルで83％
のアイデンティティーという高いホモロジーを有してお
り、酵素の機能も両者で同一である。これらのアミノ酸
配列の中で、アイデンティティーを有さない17％の領域
のアミノ酸配列は、酵素の機能にそれほど重要ではない
と考えられる。したがって、特に、この領域において
は、少しくらい他のアミノ酸と置換、あるいは、欠失、
または他のアミノ酸の付加を行っても酵素活性に影響は
与えないと考えられる。

海洋細菌のケト基導入酵素遺伝子crtWは、３位の位置
に水酸基が付加しているしていないにかかわりなく、４
位のメチレン基を直接ケト基に変換するβ−イオノンま
たは３−ヒドロキシ−β−イオノン環ケト基導入酵素
（β−ionone or 3−hydroxy−β−ionone ring ketola
se）をコードしているということができる。なお、β−
イオノン環や３−ヒドロキシ−β−イオノン環に限ら
ず、１つの酵素がメチレン基をいきなりケト基に変換す
るという知見は今まで存在しなかったものである。

（２）水酸基導入酵素遺伝子の同定 β−カロチンからアスタキサンチンの合成に必要なす
べての遺伝子は、pPC17の1.63kb Pst I−BstE II断片
（第19図）の中に含まれている。このpPC17の1.63kb Ps
t I−BstE II断片の中に１ケ所のSal I部位が存在す
る。このSal I部位の右側の断片に水酸基導入酵素活性
が存在することは実施例12（３）の結果より明かであ
る。したがって、水酸基導入酵素遺伝子は、1.63kb Pst
I−BstE II断片のうち右側の断片である0.94kb Sal I
−BstE II断片に存在することがわかる。塩基配列決定
の結果、この遺伝子に相当する、開始コドンの直前にリ
ボソーム結合部位を有する１つのオープン・リーディン
グ・フレームを検出することができたので、これをcrtZ
遺伝子と命名した。このcrtZ遺伝子の塩基配列とコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列は第15図（配列番号
６）に示されている。

このAlcaligenes sp.PC−１のcrtZ遺伝子産物（Crt
Z）は、β−イオノン環（β−ionone ring）の３位の炭
素に１つの水酸基を付加する酵素活性を有しており、そ
の具体的な例の１つが、β−カロチン（β−carotene）
を基質としてβ−クリプトキサンチン（β−cryptoxant
hin）を経てゼアキサンチン（zeaxanthin）を合成する
酵素活性である（実施例12（３）、第11図参照）。さら
に、crtZ遺伝子産物は、４−ケト−β−イオノン環（４
−keto−β−ionone ring）の３位の炭素に１つの水酸
基を付加する酵素活性も有しており、その具体的な例の
１つが、カンタキサンチン（canthaxanthin）を基質と
してフェニコキサンチン（phoenicoxanthin）を経てア
スタキサンチン（astaxanthin）を合成する酵素活性で
ある（実施例12（１）、第11図参照）。なお、後者の酵
素活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするDN
A鎖は、従来知られていなかったものである。また、Alc
aligenes sp.PC−１のCrtZは、アミノ酸配列レベルで、
Erwinia uredovoraのCrtZと58％のアイデンティティー
という意義深いホモロジーを示した。なお、Agrobacter
ium aurantiacus sp.nov.MK1とAlcaligenes sp.PC−１
間のcrtZ遺伝子産物（CrtZ）は、アミノ酸配列レベル
で、90％のアイデンティティーという高いホモロジーを
有しており、酵素の機能も両者で同一である。これらの
アミノ酸配列の中で、アイデンティティーを有さない10
％の領域のアミノ酸配列は、酵素の機能にそれほど重要
ではないと考えられる。したがって、特に、この領域に
おいては、少しくらい他のアミノ酸と置換、あるいは、
欠失、または他のアミノ酸の付加を行っても酵素活性に
影響は与えないと考えられる。

（３）マイナーなキサントフィル生合成経路の考察 植物常在細菌Erwiniaや光合成細菌Rhodobacterのカロ
チノイド合成遺伝子を用いた我々の研究により、一般
に、カロチノイド生合成酵素は、基質となるカロチノイ
ド分子の半分を認識して作用することが明かになってき
た。たとえば、Erwiniaのリコピン環化酵素遺伝子であ
るcrtYはリコピン分子の半分ずつを認識して環化する。
したがって、Rhodobacterのフィトエンデサチュラーゼ
遺伝子crt Iを用いることによりリコピンの変わりにノ
イロスポレンを大腸菌に合成させ、これにErwiniaのcrt
Yを作用させると、ノイロスポレンにおけるリコピンと
共通な半分の分子構造だけをcrtY遺伝子産物は認識し、
半分だけ環化したβ−ゼアカロチンを産生する（Linde
n,H.,Misawa,N.,chamovitz,D.,Pecker,I.,Hirschberg,
J.,Sandmann,G.,′Functional complementation in Esc
herichia coli of different phytoene desaturase gen
es and analysis of accumulated carotenes′.Z.Natur
forsch.,46c.p.1045−1051,1991）。また、本発明にお
いても、β−カロチンやゼアキサンチンにCrtWを作用さ
せると、まず１つケト基が導入されたエキネノンや４−
ケトゼアキサンチンが合成されるし、β−カロチンやカ
ンタキサンチンにCrtZを作用させると、まず１つ水酸基
が導入されたβ−クリプトキサンチンやフェニコキサン
チンが合成される。これは、これらの酵素が基質の半分
の分子を認識するからと考えることができる。したがっ
て、たとえば、ErwiniaのcrtE、crtB、crtI、crtY遺伝
子と海洋細菌のcrtZを有する大腸菌は、前述したよう
に、ゼアキサンチンを産生するが、その中間代謝産物と
して、β−カロチンに１つ水酸基が導入されたβ−クリ
プトキサンチンを検出することができる。このことは、
そこにCrtWが存在すると、β−クリプトキサンチンを基
質として３′−ヒドロキシエキネノンや３−ヒドロキシ
エキネノンを合成することができ、さらに、これらにCr
tWが作用してフェニコキサンチンを合成することができ
ると考えることができる。今回、我々は、培養物中にこ
れらのケトカロチノイドを同定するには至っていない
が、その理由は、今回行われた条件では、これらが微量
しか存在しないためであると思われる。事実、一方の遺
伝子源である海洋細菌Agrobacterium aurantiacus sp.n
ov.MK1におけるマイナーなアスタキサンチン中間代謝産
物として、３−ヒドロキシエキネノンや３′−ヒドロキ
シエキネノンの検出が報告されている（横山昭裕、幹
渉、「海洋性細菌におけるアスタキサンチン生合成につ
いて」平成６年度日本水産学会春季大会講演要旨集、p.
252,1994）。以上のことより、第11図に示したアスタキ
サンチンの主要代謝経路の他に、図10に示したマイナー
な代謝経路も存在すると考えることができる。

産業上の利用可能性 本発明において、海洋細菌よりアスタキサンチンやそ
の他のケト基を含むキサントフィル（アスタキサンチ
ン、フェニコキサンチン、４−ケトゼアキサンチン、カ
ンタキサンチン、エキネノン）の生合成に必要な遺伝子
群の取得に成功し、それらの遺伝子の構造ないし塩基配
列およびそれらの機能を明かになった。従って、本発明
によるDNA鎖は、それらを外来遺伝子として遺伝子工学
的手法により大腸菌等の微生物を形質転換し発現させる
ことによって、大腸菌等の微生物にアスタキサンチンや
その他のケト基を含むキサントフィルの生合成能を付与
することが可能な遺伝子として有用である。

配列表 配列番号:1 配列の長さ:639 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Agrobacterium aurantiacus 株名:sp.nov.MK1 配列 配列番号:2 配列の長さ:489 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Agrobacterium aurantiacus 株名:sp.nov.MK1 配列 配列番号:3 配列の長さ:1161 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Agrobacterium aurantiacus 株名:sp.nov.MK1 配列 配列番号:4 配列の長さ:2886 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Agrobacterium aurantiacus 株名:sp.nov.MK1 配列 配列番号:5 配列の長さ:729 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Alcaligenes 株名:sp.PC−１ 配列 配列番号:6 配列の長さ:489 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Alcaligenes 株名:sp.PC−１ 配列 配列番号:7 配列の長さ:1631 配列の型：鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源： 生物名:Alcaligenes 株名:sp.PC−１ 配列

フロントページの続き (72)発明者 梶原 將 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (72)発明者 横山 昭裕 静岡県清水市袖師町1900番 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所 清水研究 所内 (56)参考文献 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ（1991）Ｖｏｌ．78, Ｎｏ．２／３，ｐ．157−161 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（1990）Ｖ ｏｌ．172，Ｎｏ．12，ｐ．6704−6712 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 7/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (25)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−イオノン環の４位のメチレン基をケト
   基に変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が配列
   番号１に示したアミノ酸番号１から212までのアミノ酸
   配列のポリペプチド、またはこの配列において１もしく
   は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を有するポリペプチド
   をコードする塩基配列を有するDNA鎖。
2. 【請求項２】配列番号１に示した塩基配列を有するDNA
   鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
   ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
   タイズし、かつ請求の範囲第１項に記載の酵素活性を有
   するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
   鎖。
3. 【請求項３】β−イオノン環の４位のメチレン基をケト
   基に変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が配列
   番号５に示したアミノ酸番号１から242までのアミノ酸
   配列のポリペプチド、またはこの配列において１もしく
   は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を有するポリペプチド
   をコードする塩基配列を有するDNA鎖。
4. 【請求項４】配列番号５に示した塩基配列を有するDNA
   鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
   ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
   ダイズし、かつ請求の範囲第３項に記載の酵素活性を有
   するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
   鎖。
5. 【請求項５】β−カロチンをエキネノンを経てカンタキ
   サンチンに変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列
   が配列番号１に示したアミノ酸番号１から212までのア
   ミノ酸配列のポリペプチド、またはこの配列において１
   もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
   たアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を有するポリペ
   プチドをコードする塩基配列を有するDNA鎖。
6. 【請求項６】配列番号１に示した塩基配列を有するDNA
   鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
   ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
   ダイズし、かつ請求の範囲第５項に記載の酵素活性を有
   するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
   鎖。
7. 【請求項７】β−カロチンをエキネノンを経てカンタキ
   サンチンに変換する酵素活性を有していてアミノ酸配列
   が配列番号５に示したアミノ酸番号１から242までのア
   ミノ酸配列のポリペプチド、またはこの配列において１
   もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
   たアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を有するポリペ
   プチドをコードする塩基配列を有するDNA鎖。
8. 【請求項８】配列番号５に示した塩基配列を有するDNA
   鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
   ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
   ダイズし、かつ請求の範囲第７項に記載の酵素活性を有
   するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
   鎖。
9. 【請求項９】３−ヒドロキシ−β−イオノン環の４位の
   メチレン基をケト基に変換する酵素活性を有していてア
   ミノ酸配列が配列番号１に示したアミノ酸番号１から21
   2までのアミノ酸配列のポリペプチド、またはこの配列
   において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
   は付加されたアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を有
   するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
   鎖。
10. 【請求項１０】配列番号１に示した塩基配列を有するDN
    A鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
    ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
    ダイズし、かつ請求の範囲第９項に記載の酵素活性を有
    するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
    鎖。
11. 【請求項１１】３−ヒドロキシ−β−イオノン環の４位
    のメチレン基をケト基に変換する酵素活性を有していて
    アミノ酸配列が配列番号５に示したアミノ酸番号１から
    242までのアミノ酸配列のポリペプチド、またはこの配
    列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もし
    くは付加されたアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活性を
    有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
    鎖。
12. 【請求項１２】配列番号５に示した塩基配列を有するDN
    A鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
    ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
    ダイズし、かつ請求の範囲第11項に記載の酵素活性を有
    するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
    鎖。
13. 【請求項１３】ゼアキサンチンを４−ケトゼアキサンチ
    ンを経てアスタキサンチンに変換する酵素活性を有して
    いてアミノ酸配列が配列番号１に示したアミノ酸番号１
    から212までのアミノ酸配列のポリペプチド、またはこ
    の配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換
    もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活
    性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する
    DNA鎖。
14. 【請求項１４】配列番号１に示した塩基配列を有するDN
    A鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
    ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
    ダイズし、かつ請求の範囲第13項に記載の酵素活性を有
    するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
    鎖。
15. 【請求項１５】ゼアキサンチンを４−ケトゼアキサンチ
    ンを経てアスタキサンチンに変換する酵素活性を有して
    いてアミノ酸配列が配列番号５に示したアミノ酸番号１
    から242までのアミノ酸配列のポリペプチド、またはこ
    の配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換
    もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ上記酵素活
    性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する
    DNA鎖。
16. 【請求項１６】配列番号５に示した塩基配列を有するDN
    A鎖に、６×Denhardt,5×SSCにて60℃16時間反応後、２
    ×SSC,0.1％SDSにて60℃１時間洗浄する条件でハイブリ
    ダイズし、かつ請求の範囲第15項に記載の酵素活性を有
    するポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNA
    鎖。
17. 【請求項１７】４−ケト−β−イオノン環の３位および
    ／またはβ−イオノン環の３位の炭素に１つの水酸基を
    付加する酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩
    基配列を有するDNA鎖であって、ポリペプチドのアミノ
    酸配列が下記の群から選択される配列であるDNA鎖。 （１）配列番号２に示したアミノ酸番号１から162まで
    の配列を有するアミノ酸配列、 （２）配列番号６に示したアミノ酸番号１から162まで
    の配列を有するアミノ酸配列、 （３）上記配列（１）または（２）に対して少なくも90
    ％の同一性を有するアミノ酸配列。
18. 【請求項１８】ポリペプチドが、カンタキサンチンをフ
    ェニコキサンチンを経てアスタキサンチンに転換する酵
    素活性を有している、請求の範囲第17項に記載のDNA
    鎖。
19. 【請求項１９】ポリペプチドが、β−カロチンをβ−ク
    リプトキサンチンを経てゼアキサンチンに転換する酵素
    活性を有している、請求の範囲第17項に記載のDNA鎖。
20. 【請求項２０】請求の範囲第１〜16項のいずれか１項に
    記載のDNA鎖、および／または請求の範囲第17〜19項の
    いずれか１項に記載のDNA鎖を、β−カロチンを産生す
    る能力を有する微生物に導入して該形質転換微生物を培
    地で培養し、培養物からキサントフィルを採取すること
    を特徴とする、キサントフィルの製造法。
21. 【請求項２１】請求の範囲第１〜16項のいずれか１項に
    記載のDNA鎖と、請求の範囲第17〜19のいずれか１項に
    記載のDNA鎖を、β−カロチンを産生する能力を有する
    微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培養し、培
    養物からアスタキサンチンまたはフェニコキサンチンを
    採取することを特徴とする、請求の範囲第20項に記載の
    キサントフィルの製造法。
22. 【請求項２２】請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に
    記載のDNA鎖を、β−カロチンを産生する能力を有する
    微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培養し、培
    養物からカンタキサンチンまたはエキネノンを採取する
    ことを特徴とする、キサントフィルの製造法。
23. 【請求項２３】請求の範囲第10〜16のいずれか１項に記
    載のDNA鎖を、ゼアキサンチンを産生する能力を有する
    微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培養し、培
    養物からアスタキサンチンまたは４−ケトゼアキサンチ
    ンを採取することを特徴とする、キサントフィルの製造
    法。
24. 【請求項２４】請求の範囲第17〜19項のいずれか１項に
    記載のDNA鎖を、カンタキサンチンを産生する能力を有
    する微生物に導入して該形質転換微生物を培地で培養
    し、培養物からアスタキサンチンまたはフェニコキサン
    チンを採取することを特徴とする、キサントフィルの製
    造法。
25. 【請求項２５】微生物が細菌または酵母である、請求の
    範囲第20〜24項のいずれか１項に記載の製造法。