KR20210033101A - 효소반응을 이용한 크로신-2의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 NtUGT 효소 또는 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 GjUGT1 효소를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 크로신-2의 생산방법을 이용하면, 간단한 효소반응 또는 생물전환 공정을 이용하여, 크로신-2를 효율적으로 생산할 수 있으므로, 사프란 화합물의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

효소반응을 이용한 크로신-2의 생산방법{Process for preparing crocin-2 using enzyme reaction}

본 발명은 효소반응을 이용한 크로신-2의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 NtUGT 효소 또는 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 GjUGT1 효소를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법에 관한 것이다.

사프란은 크로쿠스 사티부스 L. 꽃의 암술머리로부터의 추출에 의해 제조된 건조 향신료이며, 이는 3500년 이상 사용된 것으로 생각된다. 이러한 향신료는 다수의 의학적 목적을 위해 역사적으로 사용되어 왔으나, 최근에는 이의 착색제 특성에 대해 주로 이용된다. 사프란의 주요 성분 중 하나인 크로세틴은 관련된 카로티노이드-타입 분자와 유사한 항산화제 특성을 가지며, 또한 착색제이다. 사프란의 주요 색소는 황적색의 색을 부여하는 글리코시드의 혼합물인 크로신이다. 크로신의 주요 성분은 색에 있어서 황색인 α-크로신이다. 사프라날은 건조 과정의 생성물인 것으로 생각되며, 식품 제조에 사용될 수 있는 후각자극제 특성을 또한 갖는다. 사프라날은 무색인 사프란 추출물인 피크로크로신의 쓴 부분의 아글리콘 형태이다. 따라서, 사프란 추출물은 착색제 또는 플라보란트로서 또는 이의 후각자극제 특성에 대해 많은 목적에 사용된다.

사프란 식물은 이탈리아, 프랑스, 인도, 스페인, 그리스, 모로코, 터키, 스위스, 이스라엘, 파키스탄, 아제르바이잔, 중국, 이집트, 아랍에미리트 연합, 일본, 호주, 및 이란을 포함하는 많은 국가에서 상업적으로 재배된다. 이란은 전세계의 매년 사프란 생산량(200톤 바로 위로 추정됨)의 약 80%를 생산한다. 1 kg의 생성에 150,000개 초과의 꽃이 필요한 것으로 보고되었다. 생산량을 증가시키기 위한 식물 품종개량 노력은 열매를 맺지 않는 식물을 발생시키는 식물의 유전체의 세배수체에 의해 복잡해진다. 또한, 상기 식물은 10월 중순 또는 하순에 시작하여 약 15일 동안만 개화 상태로 존재한다. 통상적으로, 생산은 또한 비효율적인 과정인 꽃으로부터 암술머리의 수작업 제거를 포함한다. 사프란 kg 당 $1000을 초과하는 판매 가격이 통상적이다.

이처럼 비싼 생산비용을 대체하기 위한 수단으로, 생물전환공정을 통해 사프란 성분을 생산하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 미국공개특허 제2017-0306376호에는 제아잔틴 분해 디옥시게나제를 단독으로 또는 UDP-글리코실트랜스페라제(UGT)를 엔코딩하는 재조합 유전자와 조합하여 발현하도록 조작된 재조합 미생물을 이용하여 크로세틴, 크로세틴 디알데하이드, 크로신, 또는 피크로크로신과 같은 사프란으로부터의 화합물을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 사용된 UDP-글리코실트랜스페라제에 의한 사프란 화합물의 생성수율이 낮아서 이들의 수율을 향상시킬 필요가 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 사프란 화합물의 생성수율을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 니코티아나 타바쿰 균주 또는 가르데니아 자스미노이데스 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 사용할 경우, 크로신-2를 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 니코티아나 타바쿰 균주 또는 가르데니아 자스미노이데스 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 니코티아나 타바쿰 균주 또는 가르데니아 자스미노이데스 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 이용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 니코티아나 타바쿰 균주 또는 가르데니아 자스미노이데스 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 사용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 GjUGT1 효소 또는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 NtUGT 효소를 포함하는, 크로신-2 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "UDP-글리코실트랜스페라제(UDP-glucosyltransferase, UGT)"란, UDP-글루코스와 같은 다양한 UDP-글루쿠론산의 글루쿠론산 성분을 작은 소수성 분자로 전달하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 UGT는 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 반응에 직접적으로 관여하는 효소인 것으로 해석할 수 있다.

본 발명에서 규명한 바와 같이, 모든 종류의 UGT가 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 반응에 직접적으로 관여하는 것은 아니며, 특정 균주로부터 유래된 UGT가 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 반응에 관여할 수 있다.

일 예로서, 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 UGT인 GjUGT1 효소(서열번호 1) 또는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 UGT인 NtUGT 효소(서열번호 9)는 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 반응에 직접적으로 관여할 수 있다.

상술한 바와 같이, GjUGT1 효소 또는 NtUGT 효소는 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 반응에 직접적으로 관여할 수 있으므로, 상기 GjUGT1 효소 또는 NtUGT 효소를 포함하는 조성물은 크로신-2 생산용 조성물로서 사용될 수 있다.

상기 크로신-2 생산용 조성물은 크로신-2 생산에 필요한 크로세틴 및 UDP-글루코스를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 가르데니아 자스미노이데스 균주 또는 니코티아나 타바쿰 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 이용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 효소반응은 기질인 크로세틴과 UDP-글루코스를 포함하는 반응물에서 수행될 수 있다.

상기 효소반응을 수행하기 위한 온도 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 40℃가 될 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35℃가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 30℃가 될 수 있다.

상기 효소반응을 수행하기 위한 시간 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 10 내지 240분이 될 수 있고, 다른 예로서, 60 내지 180분이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 120분이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 가르데니아 자스미노이데스 균주 또는 니코티아나 타바쿰 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양산물을 포함하는 크로신-2 생산용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 특정한 균주로부터 유래된 UGT를 사용하면 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산할 수 있으므로, 상기 UGT를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 사용한 생물전환 공정에 의하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산할 수 있다.

상기 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 가르데니아 자스미노이데스 균주로부터 유래된 GjUGT1 효소를 코딩하는 유전자(서열번호 2) 또는 니코티아나 타바쿰 균주로부터 유래된 NtUGT 효소를 코딩하는 유전자(서열번호 10)가 될 수 있다.

상기 형질전환체의 배양산물은 크로세틴으로부터 크로신-2를 높은 수율로 생산하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 형질전환체의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 형질전환체의 배양물을 원심분리하여 수득한 배양상등액, 형질전환체를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득한 파쇄물, 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득한 분획물 등이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 가르데니아 자스미노이데스 균주 또는 니코티아나 타바쿰 균주로부터 유래된 UDP-글리코실트랜스페라제를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 사용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법은 상기 GjUGT1 유전자(서열번호 2) 또는 NtUGT 유전자(서열번호 10)가 도입된 형질전환체를 크로세틴이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.

상술한 바와 같이, GjUGT1 효소(서열번호 1) 또는 NtUGT 효소(서열번호 9)를 사용하면 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산할 수 있으므로, 상기 GjUGT1 유전자(서열번호 2) 또는 NtUGT 유전자(서열번호 10)가 도입된 형질전환체를 사용하면, 생물전환 공정에 의하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산할 수 있다.

또한, 상기 방법은 배양을 통해 수득한 배양물로부터 크로신-2를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 상기 형질전환체로부터 크로신-2를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 자일로즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등을 부가적으로 사용할 수 있는데, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 반응액으로부터 크로신-2를 회수하는 단계는 투석, 원심분리, 여과, 용매추출, 크로마토그래피, 결정화 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 반응액을 원심분리하여 형질전환체를 제거하고 얻어진 상등액을, 용매추출법에 적용하여 목적하는 크로신-2를 회수하는 방법을 사용할 수 있고, 이외에도 상기 목적하는 크로신-2의 특성에 맞추어 공지된 실험방법을 조합하여 상기 크로신-2를 회수할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 크로신-2의 생산방법을 이용하면, 간단한 효소반응 또는 생물전환 공정을 이용하여, 크로신-2를 효율적으로 생산할 수 있으므로, 사프란 화합물의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 크로세틴을 크로신-2로 전환시킬 수 있는 당 전이 효소의 후보 유전자를 발현시킨 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 2는 실험실조건(in vitro)에서 GjUGT1 효소, GT1-316 효소 또는 NtUGT 효소를 사용하여 크로세틴을 크로신-2로 전환시킨 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 형질전환 미생물의 구성을 나타내는 개략도 및 성장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4는 형질전환 미생물을 사용하여, 크로신-2를 생산한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 당 전이 효소의 발굴

크로세틴(Crocetin)을 크로신-2(Crocetin diglucosyl-ester)로 전환시킬 수 있는 당 전이 효소(UDP-glucosyltransferase-1, UGT-1)를 발굴하기 위하여, Gardenia jasminoides 균주유래의 당 전이 효소인 UGT75L6의 유전자를 기준으로 BLAST 검색을 수행하여, Gardenia jasminoides 균주로부터 유래된 GjUGT1 유전자(서열번호 2), Populus 속 균주(Populus fremontii X Populus angustifolia)로부터 유래된 GT1-316 유전자(서열번호 6), Nicotiana tabacum 균주로부터 유래된 NtUGT 유전자(서열번호 10), Fragaria ananassa 균주로부터 유래된 FaGT2 유전자(서열번호 14) 및 Solanum tuberosum 균주로부터 유래된 StUGT 유전자(서열번호 18)를 발굴하고, 이들의 염기서열을 코돈 최적화시킨 후, 합성하였다.

이때, 사용된 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

GjUGT1_F: 5'-CGGAATTCATGGTTCAGCAGCGTCAC-3'(서열번호 3)

GjUGT1_R: 5'-CCGCTCGAGGTTGCTCTCCGCTTGATAG-3'(서열번호 4)

GT1-316_F: 5'-CGGGATCCATGGTCTCCGAGAGTCTAG-3'(서열번호 7)

GT1-316_R: 5'-ACGCGTCGACTGCGGATGATCCGACTAAC-3'(서열번호 8)

NtUGT_F: 5'-CGGGATCCATGGTTCAACCTCATGTCCT-3'(서열번호 11)

NtUGT_R: 5'-CCCAAGCTTACAACCTTTTCCTACTTCTTGC-3'(서열번호 12)

FaGT2_F: 5'-CGGGATCCATGGGTAGTGAGTCTT-3'(서열번호 15)

FaGT2_R: 5'-CCCAAGCTTTGACTCTACTAACTCGACTT-3'(서열번호 16)

StUGT_F: 5'-CCGGAATTCATGGTTCAACCTCATGTGCTT-3'(서열번호 19)

StUGT_R: 5'-CCGCTCGAGACAAGATTTTCCCACTTCCTG-3'(서열번호 20)

상기 합성된 각 유전자가 클로닝된 pET21α(+) 벡터들을 공벡터 pET21α(+)와 함께 각각 BL21 균주에 도입시킨 뒤 50 mL의 LB(Luria bertani) 배지로 호기성 조건에서 250 rpm에서 배양을 진행하였다. 배양 온도의 경우 37℃에서 배양을 진행하다가 OD 0.6이 되었을 때 1 mM IPTG로 induction하였고 이후 30℃에서 4시간 배양을 진행하였다. 이후 4℃, 3800 rpm으로 20분 원심분리하여 균체를 회수하였으며 50 mL의 50 mM Tris 버퍼(pH 7.0)로 세척하였다. 이후 10 mL의 Tris 버퍼에 현탁시키고, 0.2 mg/mL 리소자임(lysozyme)과 0.1 mM PMSF를 처리하고, 25% amp.로 10초간 펄스를 주고 10초간 쉬는 초음파 분쇄법으로 세포를 파쇄시켰다. 이후, 4℃ 13200 rpm 10분간 원심분리하여 상등액(soluble protein)과 침전물(insoluble pellet)로 분리하였으며, 상기 침전물은 소량의 Tris 버퍼에 현탁시켰다. 브래드포드 단백질 정량법을 사용하여 동일량 만큼의 단백질을 확보하여 SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 발현을 확인하였다(도 1).

도 1은 크로세틴을 크로신-2로 전환시킬 수 있는 당 전이 효소의 후보 유전자를 발현시킨 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

도 1에서 보듯이, 52030 내지 61389Da의 크기를 갖는 다양한 당 전이 효소가 발현되었는데, GjUGT1 유전자(서열번호 2), GT1-316 유전자(서열번호 6) 및 NtUGT 유전자(서열번호 10)는 정상적으로 발현되었으나, FaGT2 유전자(서열번호 14) 및 StUGT 유전자(서열번호 18)는 정상적으로 발현되지 않음을 확인하였다.

이어, 상기 정상적으로 발현된 3종의 당 전이 효소(GjUGT1, GT1-316 및 NtUGT)가 크로세틴을 크로신-2로 전환시킬 수 있는지의 여부를, 실험실조건(in vitro)에서 평가하였다.

대략적으로, 당 전이 효소 활성을 확인하기 위한 반응 부피를 100㎕로 정하고 그 조성이 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0), 5 mM UDP-glucose, 0.1 mM 캡슐화된 크로세틴(encapsulated crocetin) 및 25㎍ 세포파쇄물(crude protein extract)을 준비하였다

최종 농도 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)와 기질에 해당하는 5 mM UDP-glucose, 0.1 mM 캡슐화된 크로세틴을 모두 첨가한 뒤 마지막으로 25㎍ 세포파쇄물(GjUGT1 효소, GT1-316 효소 또는 NtUGT 효소)들을 첨가하고, 30℃에서 2시간동안 반응시켰다. 이어, 200㎕의 차가운 메탄올(-20℃ chilled MeOH)을 첨가하여 반응을 종결하였다. 각 반응 샘플들을 4℃, 13200 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액의 HPLC 분석을 통해 얼마나 크로세틴이 크로신-2로 전환되었는지 확인하였다(도 2). 이때, 크로세틴 및 크로신-2는 HPLC 머무름 시간(retention time), 자외선-가시광선(UV-Vis) 스펙트럼을 통해 확인하였다. 대략적으로, A: 100% MeOH(2% formic acid) 및 B: 100% DDW(2% formic acid)를 이동상으로 하여 분석하였다. 구배(Gradient) 조건으로는 A용매를 50%로 시작하여 A용매를 80%로 60분까지, A용매를 100%로 80분까지, 다시 A용매를 50%로 90분까지, A용매를 50%로 100분까지 지속하여 총 100분 분석하였다. Zorbax eclipse XDB-C18 컬럼(4.6150 mm, 5 ㎛; Agilent Technology)을 고정상으로 0.8 mL/분의 유속으로 분석하였다.

도 2는 실험실조건(in vitro)에서 GjUGT1 효소, GT1-316 효소 또는 NtUGT 효소를 사용하여 크로세틴을 크로신-2로 전환시킨 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2에서 보듯이, GT1-316 효소는 크로세틴을 크로신-2로 전환시키지 못하였고, GjUGT1 효소는 대부분의 크로세틴을 크로신-1으로 전환시키고, 소량의 크로세틴만을 크로신-2로 전환시켰으나, NtUGT 효소는 크로세틴을 동등한 수준의 크로신-1과 크로신-2로 전환시킴을 확인하였다.

따라서, 크로세틴을 크로신-2로 전환시킬 수 있는 효소는 NtUGT 효소와 GjUGT1 효소임을 확인하였다.

실시예 2: 형질전환 미생물을 이용한 크로신-2의 생산

상기 실시예 1에서 확인된 효소의 유전자가 도입된 형질전환 미생물을 사용하여 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하고자 하였다.

실시예 2-1: 대사회로유전자의 고도화 및 모듈화

먼저, 대장균 MG1655 균주의 염색체에, 대장균 유래의 ispA (geranyl diphosphate/farnesyl diphosphate synthase), idi (isopentenyl-diphosphate Δ-isomerase), dxs (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) 및 dxr (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase) 유전자를 도입하고, 이들 도입된 유전자가 lac 프로모터로 발현되도록 형질전환시켜서, MEP 대사회로가 강화된 대장균주(1차 변이주)를 제작하였다.

다음으로, 상기 제작된 1차 변이주에 Pantoea agglomerans 유래의 지아잔틴 합성 유전자인 CrtE, CrtB, CrtI, CrtY 및 CrtZ 유전자를 도입하고, 이들 도입된 유전자가 trc 프로모터로 발현되도록 형질전환시켜서, MEP 대사회로가 강화되고 지아잔틴이 생산가능한 ZEA-1 균주(2차 변이주)를 제작하였다.

실시예 2-2: 크로세틴 생합성 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

먼저, 크로세틴 다이알데하이드의 생합성에 사용되는 카로티노이드 절단 효소인 CsCCD2의 유전자를 합성 및 증폭시킨 후, 증폭산물을 pKK223-3 벡터의 EcoRI 및 HindIII 자리에 클로닝하였다. 그런 다음, pSTVM 벡터의 BglII 및 NotI 자리에 서브클로닝하여 발현벡터 pSTVM_CsCCD2를 제작하였다.

상기 CsCCD2 유전자의 클로닝 및 서브클로닝시에 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

CsCCD2_F ; 5'-CGGAATTCATGGCGAACAAAGAAGAGG-3'(서열번호 33)

CsCCD2_R ; 5'-CCCAAGCTTTTAGGTCTCCGCTTGATGC-3'(서열번호 34)

sub_CCD2_F ; 5'-GGAAGATCTGCTGTGCAGGTCGTAAA-3'(서열번호 37)

sub_CCD2_R ; 5'-ATAAGAATGCGGCCGCGAAACGCAAAAAGGCCA-3'(서열번호 38)

다음으로, 크로세틴의 생합성에 사용되는 aldH의 유전자를 Synechococcus elongatus PCC 7942 균주로부터 수득 및 증폭시킨 후, 증폭산물을 pUCM 벡터의 XbaI 및 EcoRI 자리에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 제작된 pSTVM_CsCCD2 벡터에 서브클로닝하여, pSTVM_CsCCD2_aldH7942를 제작하였다.

상기 aldH 유전자의 클로닝 및 서브클로닝시에 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

aldH_F ; 5'-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACTGCTGTCGTTCTCC-3'(서열번호 35)

aldH_R ; 5'-CGGAATTCCTAGAGCTTGCGGAAGAG-3'(서열번호 36)

sub_aldH_F ; 5'-AAGAGCGUCTAGAAGGAGGATTACAAAA-3'(서열번호 39)

sub_aldH_R ; 5'-AGCTGATUGTACTGAGAGTGCACCAT-3'(서열번호 40)

실시예 2-3: 당전이 효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

먼저, 상기 실시예 1을 통해 크로세틴으로부터 크로신-2의 생산에 적합한 것으로 확인된 NtUGT 유전자를 pUCrop 벡터에 클로닝하여, pUCrop_NtUGT 벡터를 제작하였다. 이때, 상기 클로닝시에 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

pUCrop_NtUGT_F: 5'-GCTCTAGAAGAGGATTACAAAATGGTTCAACCTCATGTCC-3'(서열번호 41)

pUCrop_NtUGT_R: 5'-TCCCCCCGGGTTAACAACCTTTTCCTACTTCTTG-3'(서열번호 42)

실시예 2-4: 형질전환 미생물의 제작

상기 실시예 2-1에서 제작된 ZEA-1 균주에 실시예 2-2에서 제작한 크로세틴 생합성 유전자를 포함하는 발현벡터 및 실시예 2-3에서 제작한 당전이 효소 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하고, 앰피실린 및 클로람페니콜이 첨가된 평판배지에 도말하여 37℃에서 12시간동안 정치배양 진행하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 500ml 플라스크에 150ml TB (Terrific broth)배지에 접종하여 37℃ , 250rpm에서 12시간동안 진탕 배양을 진행하였다.

상기 12시간 동안 진탕배양을 통해 수득한 배양액을 사용하여 비연속 발효를 진행한다. 이때, 비연속 발효의 배지 조성은 탄소원으로 글리세롤 20g/L가 포함된 1.5L TB (Terrific broth) 배지이며, 50 μg/ml 클로람페니콜, 100 μg/ml 앰피실린을 모두 첨가하였다. 배양 온도의 경우 30℃에서 배양을 진행하다가 OD600 5~6 사이가 되면 20℃로 온도를 전환한 후, 계속 배양 하였다. 배양시, 산소의 농도는 30%로 진행하였으며, 공기 공급은 1vvm으로 진행하였다(도 3).

도 3은 형질전환 미생물의 구성을 나타내는 개략도 및 성장곡선을 나타내는 그래프이다.

상기 발효가 종료된 후, 배양액에 포함된 크로신 화합물을 HPLC분석을 통해 확인하였다(도 4).

배양액에 크로신이 존재하는지 분석하기 위해 세포 추출과 배지 직접 분석 방법으로 추출 및 분리를 진행하였다. 세포 추출의 경우 배양액을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였고, 상등액은 모두 버렸다. 확보한 세포는 0.9% NaCl 용액을 이용하여 세척을 진행하고 다시 한 번 위와 같은 조건으로 원심분리 후 상등액을 버렸다. 확보한 세포에 Acetone : MeOH (50:50, v/v) 5 ml 혹은 10 ml로 색이 완전히 빠질 때까지 반복적으로 추출하였다. 추출된 용액을 진공 원심 분리기 (EZ-2 plus, Genevac)를 이용해 농축하였으며, 농축된 용액에 5 ml의 Ethyl acetate를 가하여 섞어준 후, 5 N NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리하였다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 3차수로 세척하고 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 분리기를 이용해 완전히 말렸다. 완전히 마른 샘플을 MeOH : Dimethylformamide (7:1, v/v)로 녹여서 추후의 분석에 이용하였다. 배지 직접 분석의 경우 배양액을 원심분리한 뒤 얻은 상층액 배지를 0.2 μm PTFE 또는 PVDF 필터로 걸러낸 뒤 직접 HPLC 분석에 사용하였다.

이때, HPLC는 A : 100% MeOH(25mM formic acid) 와 B : 100% DDW(25mM formic acid)를 이동상으로 하여 분석하였다. 농도구배 조건으로는 A용매를 50%로 50분까지 , A용매를 80%로 60분까지, A용매를 100%로 80분까지로 하였다. Zorbax eclipse XDB-C18 컬럼 (4.6× 150 mm 혹은 250 mm, 5 μm; Agilent Technology)을 고정상으로 0.8ml/min의 유속으로 분석하였다. 구조분석을 위해 HPLC retention time 과 흡수 spectrum, mass spectrum을 비교하여 분석하였다. Mass spectrum은 Varian 1200L LC/MS system을 이용하여 positive 모드와 negative 모드를 모두 모니터 하였고, 이온화에는 APCI (atmosphere pressure chemical ionization) 모듈을 사용하였다.

도 4는 형질전환 미생물을 사용하여, 크로신-2를 생산한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4에서 보듯이, 크로세틴으로부터 크로신-2가 생산됨을 확인하였다.

상술한 결과에서 보듯이, 형질전환 미생물로부터 생산된 크로신-2는, 상기 미생물에 도입된 크로세틴 생합성 유전자에 의해 생성된 크로세틴으로부터 전환된 것으로 분석되었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Process for preparing crocin-2 using enzyme reaction <130> KPA190917-KR <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant GjUGT1 <400> 1 Met Val Gln Gln Arg His Val Leu Leu Ile Thr Tyr Pro Ala Gln Gly 1 5 10 15 His Ile Asn Pro Ala Leu Gln Phe Ala Gln Arg Leu Leu Arg Met Gly 20 25 30 Ile Gln Val Thr Leu Ala Thr Ser Val Tyr Ala Leu Ser Arg Met Lys 35 40 45 Lys Ser Ser Gly Ser Thr Pro Lys Gly Leu Thr Phe Ala Thr Phe Ser 50 55 60 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Phe Arg Pro Lys Gly Val Asp His Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Met Ser Ser Leu Ala Lys Gln Gly Ser Asn Thr Leu Arg Asn Val 85 90 95 Ile Asn Thr Ser Ala Asp Gln Gly Cys Pro Val Thr Cys Leu Val Tyr 100 105 110 Thr Leu Leu Leu Pro Trp Ala Ala Thr Val Ala Arg Glu Cys His Ile 115 120 125 Pro Ser Ala Leu Leu Trp Ile Gln Pro Val Ala Val Met Asp Ile Tyr 130 135 140 Tyr Tyr Tyr Phe Arg Gly Tyr Glu Asp Asp Val Lys Asn Asn Ser Asn 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gtgtatacct tgttgctgcc atgggctgct 360 accgttgcac gtgaatgcca cattccgagc gcgctgctgt ggatccaacc ggttgctgtg 420 atggatatct actattacta tttccgtggt tatgaagatg acgttaagaa taacagcaat 480 gacccgacct ggagcatcca gtttccgggt ctgccgagca tgaaagctaa ggatctgccg 540 agcttcattc tgccgagcag cgacaacatc tacagctttg cactgccgac cttcaaaaag 600 caactggaaa ccctggatga agaagaacgt ccgaaagttc tggtgaatac ctttgacgcg 660 ctggaaccgc aggcactgaa ggcgattgaa agctataacc tgattgcaat tggtccactg 720 accccgagcg cgttcctgga tggtaaagac ccgagcgaaa ccagctttag cggtgacctg 780 tttcagaaaa gcaaggacta caaggaatgg ctgaatagcc gtccggctgg tagcgttgtg 840 tatgttagct ttggtagcct gctgaccctg ccgaaacaac agatggaaga aattgcacgt 900 ggtctgctga agagcggtcg tccgttcctg tgggttattc gtgcgaaaga aaacggtgaa 960 gaagaaaagg aagaagatcg tctgatttgc atggaagaac tggaagaaca gggtatgatt 1020 gttccgtggt gtagccagat cgaagtgctg acccatccga gcctgggttg ctttgttacc 1080 cactgtggtt ggaatagcac cctggaaacc ctggtttgcg gtgtgccggt tgtggctttc 1140 ccgcattgga ccgatcaagg taccaatgca aaactgatcg aagacgtttg ggaaaccggt 1200 gtgcgtgttg tgccgaacga agatggtacc gttgaaagcg acgaaattaa acgttgtatc 1260 gaaaccgtta tggatgacgg tgaaaaaggt gtggaactga agcgtaacgc gaaaaagtgg 1320 aaggaactgg ctcgtgaagc aatgcaggaa gatggtagca gcgacaaaaa cctgaaagcg 1380 ttcgtggagg atgcgggcaa gggctatcaa gcggagagca actaa 1425 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggaattcat ggttcagcag cgtcac 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccgctcgagg ttgctctccg cttgatag 28 <210> 5 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant GT1-316 <400> 5 Met Val Ser Glu Ser Leu Gly His Leu Phe Leu Val Ser Phe Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly His Val Asn Pro Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ile Leu Ala Ser 20 25 30 Lys Gly Phe Leu Val Thr Phe Ser Thr Thr Glu Thr Thr Gly Glu Gln 35 40 45 Met Arg Lys Ala Ser Asp Ile Ile Asp Lys Leu Thr Pro Phe Gly Asp 50 55 60 Gly Phe Ile Arg Phe Glu Phe Ile Ala Asp Gly Trp Glu Glu Asp Glu 65 70 75 80 Pro Arg Arg Gln Asp Leu Asp Gln Tyr Leu Leu Gln Leu Glu Leu Val 85 90 95 Gly Lys Gln Val Ile Pro Gln Met Ile Lys Lys Asn Ala Glu Gln Gly 100 105 110 Arg Pro Val Ser Cys Leu Ile Asn Asn Pro Phe Ile Pro Trp Val Thr 115 120 125 Asp Val Ala Thr Thr Leu Gly Leu Pro Ser Ala Met Leu Trp Val Gln 130 135 140 Ser Cys Ala Cys Phe Ala Ser Tyr Tyr His Tyr Tyr His Gly Thr Val 145 150 155 160 Pro Phe Pro Asp Glu Glu His Pro Glu Ile Asp Val Gln Leu Pro Trp 165 170 175 Met Pro Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Val Pro Ser Tyr Leu Tyr Pro Thr 180 185 190 Thr Pro Tyr Pro Phe Leu Arg Arg Ala Ile Leu Gly Gln Tyr Lys Asn 195 200 205 Leu Asp Lys Pro Phe Cys Ile Leu Met Glu Thr Phe Glu Glu Leu Glu 210 215 220 Pro Glu Leu Ile Lys His Met Ser Glu Ile Phe Pro Ile Lys Ala Val 225 230 235 240 Gly Pro Leu Phe Arg Asn Thr Lys Ala Pro Lys Thr Thr Val His Gly 245 250 255 Asp Phe Leu Lys Ala Asp Asp Cys Ile Glu Trp Leu Asp Thr Lys Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Val Val Gln Leu Lys 275 280 285 Gln Asp Gln Trp Asn Glu Ile Ala Tyr Gly Leu Leu Asn Ser Gly Val 290 295 300 Ser Phe Leu Leu Val Met Lys Pro Ala His Lys Asp Ala Gly His Asp 305 310 315 320 Leu Leu Val Leu Pro Asp Gly Phe Leu Glu Lys Ala Gly Asp Arg Gly 325 330 335 Lys Val Val Gln Trp Ser Pro Gln Glu Lys Val Leu Gly His Pro Ser 340 345 350 Val Ala Cys Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Met Glu Ala 355 360 365 Leu Thr Ser Gly Met Pro Val Val Ala Phe Pro Gln Trp Gly Asp Gln 370 375 380 Val Thr Asn Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ile Leu Lys Val Gly Val Arg 385 390 395 400 Met Cys Arg Gly Glu Ala Glu Asn Lys Leu Ile Thr Arg Asp Glu Ile 405 410 415 Glu Lys Cys Leu Leu Glu Ala Thr Val Gly Pro Lys Ala Val Glu Met 420 425 430 Lys Gln Asn Ala Met Lys Trp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala 435 440 445 Glu Gly Gly Ser Ser Asp Gln Asn Ile Arg Tyr Phe Thr Asp Asp Ile 450 455 460 Val Lys Ala Asn Glu Ser Glu Ile Ala Arg Lys Cys Ile Gly Ser Asn 465 470 475 480 Glu Phe Pro Val Ser Val Val Val Lys Ser Asn Glu Lys Val Asp Glu 485 490 495 Leu Val Gly Ser Ser Ala 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cttcttaaaa 780 gcagatgatt gtatagaatg gttggatacc aaacctccat cttctgtcgt ttacgtatca 840 ttcggctctg ttgtgcagct aaaacaggac caatggaacg agatagctta cggtttactt 900 aactctgggg tttccttttt attggtgatg aagcccgctc ataaagacgc tgggcatgac 960 cttctagtac ttcctgacgg cttcttagag aaagctggcg acagagggaa ggtggtccag 1020 tggtcacctc aagaaaaggt actaggtcac ccgagcgtag cctgctttgt aactcactgt 1080 ggatggaaca gcacgatgga agctctgacc tctggaatgc ccgtggtcgc ttttccccag 1140 tggggtgatc aggttacaaa tgcgaaatac ttggtagaca tactaaaggt aggagtcagg 1200 atgtgtaggg gagaggccga aaataagctt attacaagag atgaaattga aaaatgccta 1260 ttagaagcta cggtaggacc taaagctgtt gagatgaagc aaaacgccat gaaatggaag 1320 gaagctgctg aagccgcggt cgccgaaggt ggctcaagtg accaaaacat acgttacttt 1380 actgatgaca tcgtgaaagc aaatgagtcc gagattgcta gaaagtgtat cggctctaac 1440 gaattcccgg tgtcagtcgt tgttaaatct aatgagaaag tggatgagtt agtcggatca 1500 tccgca 1506 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgggatccat ggtctccgag agtctag 27 <210> 8 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gataaaaagg 1260 tgtatagaca tggttatgaa cggaggtgaa aagggagaag agatgcgtcg taacgcacag 1320 aagtggaaag aactagctcg tgaagccgtt aaagagggag gaagttctta tatgaactta 1380 aaagccttcg tgcaagaagt aggaaaaggt tgt 1413 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgggatccat ggttcaacct catgtcct 28 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cccaagctta caaccttttc ctacttcttg c 31 <210> 13 <211> 555 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant FaGT2 <400> 13 Met Gly Ser Glu Ser Leu Val His Val Phe Leu Val Ser Phe Ile Gly 1 5 10 15 Gln Gly His Val Asn Pro Leu Leu Arg Leu Gly Lys Arg Leu Ala Ala 20 25 30 Lys Gly Leu Leu Val Thr Phe Cys Thr Ala Glu Cys Val Gly Lys Glu 35 40 45 Met Arg Lys Ser Asn Gly Ile Thr Asp Glu Pro Lys Pro Val Gly Asp 50 55 60 Gly Phe Ile Arg Phe Glu Phe Phe Lys Asp Arg Trp Ala Glu Asp Glu 65 70 75 80 Pro Met Arg Gln Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Glu Leu Val 85 90 95 Gly Lys Glu Val Ile Pro Glu Met Ile Lys Lys Asn Ala Glu Gln Gly 100 105 110 Arg Pro Val Ser Cys Leu Ile Asn Asn Pro Phe Ile Pro Trp Val Cys 115 120 125 Asp Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu Pro Ser Ala Met Leu Trp Val Gln 130 135 140 Ser Ala Ala Cys Leu Ala Ala Tyr Tyr His Tyr Tyr His Gly Leu Val 145 150 155 160 Pro Phe Pro Ser Glu Ser Asp Met Phe Cys Asp Val Gln Ile Pro Ser 165 170 175 Met Pro Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Val Pro Ser Phe Leu Tyr Pro Thr 180 185 190 Ser Pro Tyr Pro Phe Leu Arg Arg Ala Ile Leu Gly Gln Tyr Gly Asn 195 200 205 Leu Glu Lys Pro Phe Cys Ile Leu Met Asp Thr Phe Gln Glu Leu Glu 210 215 220 Ser Glu Ile Ile Glu Tyr Met Ala Arg Leu Cys Pro Ile Lys Ala Val 225 230 235 240 Gly Pro Leu Phe Lys Asn Pro Lys Ala Gln Asn Ala Val Arg Gly Asp 245 250 255 Phe Met Glu Ala Asp Asp Ser Ile Ile Gly Trp Leu Asp Thr Lys Pro 260 265 270 Lys Ser Ser Val Val Tyr Ile Ser Phe Gly Ser Val Val Tyr Leu Lys 275 280 285 Gln Glu Gln Val Asp Glu Ile Ala His Gly Leu Leu Ser Ser Gly Val 290 295 300 Ser Phe Ile Trp Val Met Lys Pro 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gaacttagag aagccgtttt gtatccttat ggatacgttt 660 caagaactag agtctgaaat aattgaatat atggccagat tatgtcccat aaaggccgtc 720 gggccattgt tcaagaatcc caaggctcaa aacgcggtta gaggcgactt tatggaagcc 780 gatgactcaa tcatcggatg gttggacaca aaacccaaga gttcagttgt ttacattagc 840 ttcgggagcg ttgtatactt aaagcaggag caagtggatg aaattgctca cggactttta 900 tcatccggcg tgtcttttat atgggtgatg aaacctcctc atccggatag cggatttgaa 960 ttgttggtat taccagaagg tttcctagaa aaggcgggag accgtggaaa agttgtgcaa 1020 tggagtccac aagaaaagat attagaacac ccttcaactg catgttttgt gacacactgc 1080 gggtggaata gtacgatgga aagtttaacc agcgggatgc ccgtggtcgc gtttccacag 1140 tggggggatc aggtaactga cgcgaagtac ctagtggatg aatttaaggt aggagttagg 1200 atgtgcagag gcgaggccga ggacagggtg attcctagag acgaggttga aaagtgtctt 1260 ttggaagcta cgtctggttc aaaagctgca gagatgaaac aaaatgcgct taagtggaaa 1320 gctgctgcag aggctgcgtt ctccgaagga ggatcttcag ataggaatct gcaagccttc 1380 gtcgacgaag tcagacgtat tagcgccagc ttaaattcta agtcctctgc tgtcggctat 1440 gtcaagagta agatcaacgg agtggtggaa tatgtcgata gtaagttaaa cgggaaagcc 1500 gccccggtgg aggaggcgaa cactcgtaca aatggcatcg caaaggtaga acaacctaag 1560 gcagcaaacg gcaaggtgga aatagctgaa ttaactccga ttaatggcaa ggttgagatt 1620 gccgaactga agccaataaa cgggaaagtc gagttagtag agtca 1665 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgggatccat gggtagtgag tctt 24 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccaagcttt gactctacta actcgactt 29 <210> 17 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant StUGT <400> 17 Met Val Gln Pro His Val Leu Leu Val Thr Phe Pro Ala Gln Gly His 1 5 10 15 Ile Asn Pro Ser Leu Gln Phe Ala Lys Arg Leu Ile Lys Met Gly Ile 20 25 30 Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser Val Phe Ala His Arg Arg Met Ala Lys 35 40 45 Thr Ala Ala Ser Asn Ala Pro Lys Gly Leu Asn Leu Ala Ala Phe Ser 50 55 60 Asp Gly Phe Asp Asp Gly Phe Lys Ser Asn Val Asp Asp Ser Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Met Ser Glu Ile Arg Ser Arg Gly Ser Gln Thr Leu Arg Asp Ile 85 90 95 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aattaagatg ggcatcgagg ttacctttac tacaagcgtc 120 ttcgcccaca gacgtatggc gaagacggct gcttccaacg ctcccaaggg ccttaatctg 180 gccgccttct cagatggttt tgatgatggc ttcaaatcta atgtcgatga ttcaaagcgt 240 tatatgtctg agattagatc taggggcagc cagaccctgc gtgacattat cttaaagagt 300 agcgacgaag gaaggcccgt aacaagtcta gtatataccc tactattgcc ttgggctgct 360 gaagtagcaa gggagctgca tattccttca gctttgttat ggattcagcc agcgacagtc 420 ctagacatat attattatta cttcaatggc tacgaagatg agatgaaatg tagctcaaac 480 gatcctaatt ggtcaataca attacctcgt ttgcccttac ttaagtccca agatttaccc 540 tctttccttg tgtcctctag ctccaaggat gataaataca gctttgctct accaacgttc 600 aaagaacaac ttgacactct tgacggagag gagaatccca aggtcttagt gaatacgttt 660 gacgccctag aattagagcc gttaaaagca atcgagaagt ataatcttat cgggattgga 720 cctctaattc cgtcttcatt cctgggcggg aaagattcac tagaaagtag cttcggaggc 780 gatttatttc agaaaagcga cgatgattac atggaatggc taaacactaa acccaaatct 840 tcaattgtgt acatttcctt cggttcacta cttaacctat ccagaaatca aaaagaggaa 900 atcgcaaaag ggttaattga aatcaagcgt ccttttctgt gggtcattag ggatcaggaa 960 aatataaagg aggtggagaa ggaggaagag aagttaagct gcatgatgga gctggaaaaa 1020 caaggtaaaa ttgttccttg gtgtagccaa ctagaggtat taactcatcc ctccctggga 1080 tgcttcgtaa gccattgtgg atggaacagt acacttgaaa gtttatcttc aggcgtgccc 1140 gtggtcgcct tccctcactg gacagaccaa ggtactaacg cgaaattaat agaagatgtt 1200 tggaagacag gtgtacgtat gcgtgttagc gaggatggcg tcgtcgaatc agaggagatt 1260 aaaagatgta tagagatagt gatggatggg ggcgagaaag gcgaggaaat gagaaaaaac 1320 gctcagaaat ggaaagaact agccagggaa gcggtgaagg agggggggag cagtgaggtc 1380 aacctaaagg cttttgtgca ggaagtggga aaatcttgt 1419 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccggaattca tggttcaacc tcatgtgctt 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccgctcgaga caagattttc ccacttcctg 30 <210> 21 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant CaUGT3 <400> 21 Met Ala Thr Glu Gln Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ile Leu Met 1 5 10 15 Phe Pro Trp 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ccccgtcatt 720 agccttaaca ataatgatca gggacaaggg aacaaagacg aggacgaaat cattcaatgg 780 ttggacaaaa aaagtcatag aagctccgtg tttgtttcat tcggtagtga atacttcctt 840 aacatgcaag agattgaaga gatagccatt ggtcttgagc tgtctaatgt caacttcatc 900 tgggttttga ggtttcccaa aggtgaagat acgaaaatag aagaggtgct accggaagga 960 tttctagata gggtgaagac caaagggaga atagtgcatg gctgggcccc acaggctcgt 1020 attctgggtc atccatctat aggtgggttt gtatcccatt gtggctggaa cagtgtgatg 1080 gaaagtattc aaatcggtgt gcccatcatt gcgatgccga tgaatttaga ccaacctttc 1140 aatgcaaggc ttgtcgtgga aattggtgtg ggtattgagg tcggcaggga cgagaacggg 1200 aaacttaaaa gggaacgtat cggtgaggtc attaaggaag ttgcaatcgg aaagaagggg 1260 gagaagctta gaaaaaccgc gaaagacctg ggccagaagc taagggaccg tgagaaacag 1320 gattttgatg agcttgcagc gacgctgaag caattgtgcg ta 1362 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgggatccat ggccaccgaa cagca 25 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 acgcgtcgac tacgcacaat tgcttcagc 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Val Phe Ser Tyr Phe Cys Asn Leu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe Pro Asp Ile Tyr Leu Arg Lys Ile 165 170 175 Glu Gln Val Lys Leu Gly Glu Met Leu Glu Lys Ser Ala Lys Asp Gln 180 185 190 Asp Pro Asp Asp Glu Glu Arg Leu Val Asp Glu Tyr Lys Gln Ile Ala 195 200 205 Leu Ile Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp Phe Leu 210 215 220 Leu Glu Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro Val Gln 225 230 235 240 Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asp Met Glu Leu Ile Asp Trp Leu 245 250 255 Gly Ser Lys Asp Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu 260 265 270 Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Leu Gly Leu Glu 275 280 285 Leu Ser Asn Val Asn Phe Val Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys Gly Glu 290 295 300 Glu Gln Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu Arg Ile 305 310 315 320 Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln Leu Arg Ile 325 330 335 Leu Asn His Thr Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp Asn 340 345 350 Ser Val Met Glu Ser Ile 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acagagcgta ttggagagaa tctaagggct 1260 aagatgcgtg atatttcaat gaacctaaac agtattagcg gagaggagat ggacgcagct 1320 gctcatgaac ttatacagtt ctgtaagatc aacaccaat 1359 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgggatccat gggaactcaa gttacagaa 29 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 acgcgtcgac attggtgttg atcttacaga ac 32 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cggaattcat ggcgaacaaa gaagagg 27 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cccaagcttt taggtctccg cttgatgc 28 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gctctagaag gaggattaca aaatgactgc tgtcgttctc c 41 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 cggaattcct agagcttgcg gaagag 26 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ggaagatctg ctgtgcaggt cgtaaa 26 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ataagaatgc ggccgcgaaa cgcaaaaagg cca 33 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 aagagcguct agaaggagga ttacaaaa 28 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 agctgatugt actgagagtg caccat 26 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gctctagaag aggattacaa aatggttcaa cctcatgtcc 40 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tccccccggg ttaacaacct tttcctactt cttg 34 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tccccccggg aggaggacag ctaaatggcc accgaacagc 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaggaaaaaa gcggccgctt atacgcacaa ttgcttcagc 40

Claims (11)

1. 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 GjUGT1 효소 또는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 NtUGT 효소를 포함하는, 크로신-2 생산용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 GjUGT1 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 NtUGT 효소는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 크로신-2 생산용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 크로세틴 및 UDP-글루코스를 추가로 포함하는 것인, 크로신-4 생산용 조성물.
   
4. GjUGT1 효소(서열번호 1) 또는 NtUGT 효소(서열번호 9)의 존재하에, 크로세틴과 UDP-글루코스를 반응시켜서 크로신-2를 포함하는 반응물을 수득하는 단계를 포함하는, 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 반응은 20 내지 40℃의 온도조건 및 10 내지 240분의 시간조건에서 수행되는 것인, 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법.
   
6. 가르데니아 자스미노이데스(Gardenia jasminoides) 균주로부터 유래된 GjUGT1 유전자 또는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 균주로부터 유래된 NtUGT 유전자가 도입된 형질전환체 또는 이의 배양산물를 포함하는 크로신-2 생산용 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 GjUGT1 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 NtUGT 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것인, 크로신-2 생산용 조성물.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 형질전환체는 크로세틴 생합성 유전자가 추가로 도입된 것인, 크로신-2 생산용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 크로세틴 생합성 유전자는 CsCCD2의 유전자 및 aldH 유전자인 것인, 크로신-2 생산용 조성물.
   
10. GjUGT1 유전자(서열번호 1) 또는 NtUGT 유전자(서열번호 10)가 도입된 형질전환체를 크로세틴과 UDP-글루코스가 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 배양을 통해 수득한 배양물로부터 크로신-2를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 크로세틴으로부터 크로신-2를 생산하는 방법.
    
    
    

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