KR101801908B1

KR101801908B1 - 알부틴의 제조방법

Info

Publication number: KR101801908B1
Application number: KR1020160078150A
Authority: KR
Inventors: 송재경; 이훈상
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2017-11-27

Abstract

본 발명은 알부틴의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 효소를 이용한 UDP 재사용을 통해 알부틴을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 UDP 재사용 반응이 수반된 효소에 의한 다단계 반응을 원-스텝 반응으로 수행함으로써 알부틴 제조비용을 절감하고, 산업화를 통해 효율적으로 알부틴을 대량 생산할 수 있다.

Description

알부틴의 제조방법 {Method for Preparing of Arbutin}

본 발명은 알부틴의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 효소를 이용한 UDP 재사용을 통해 알부틴을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

대부분 천연물질은 자연적인 당화 반응을 통해 생물학적, 생화학적 반응에 관여하며, 그 중 많은 천연 물질들이 생물학적 특성으로 인한 약물 및 약물을 유도하는데 이용된다 (Griffith et al., Curr Opin Biotechnol 16:622-630, 2005). 비당체 (aglycone)에 당이 부착되는 것을 당화 (glycosylation)라고 하며 이를 통해 천연 물질의 다양성이 결정되며 소수성 화합물의 용해도 증가, 불안정한 분자의 안정성 향상, 독소 감소 및 생물학적 활성 변경 등이 나타난다 (Desmet et al., Chemistry 18:10786-10801, 2012).

알부틴 (arbutin)은 배당체로써, 하이드로퀴논 (hydroquinone)과 글리코오스 (glycose)가 에테르 (ether) 결합된 형태로 하이드로퀴논 β-D-글루코시드 (hydroquinone β-D-glucoside)를 말하며, 고산 식물인 월귤 나무, 고케모모 와 베어베리, 크렌베리 같은 식물에서 추출된 활성 성분으로 몸속에서 하이드로퀴논 (hydroquinone) 및 항균, 소독제의 특성을 가지는 페놀 (phenol agent)로 변환된다. 예로부터 상기 식물의 추출물은 방광염, 요로감염, 이뇨작용, 신장 결석 치료에 사용되어 왔다. 또한, 비정상적인 세포 축적에 의한 기미, 주근깨, 점 등의 생성을 억제하고 광노화에 의한 피부 병변들 중 과다 멜라닌 생합성을 저해하며(식약청 고시), 흑색종 세포의 멜라닌 합성을 억제하는 효과를 가진다. 이러한 추출물은 하이드로퀴논 (hydroquinone)에 비해 미백 기능은 약하나 피부에 대한 자극이나 세포 독성, 냄새가 없어 안정성이 뛰어나다.

알부틴 (arbutin)은 당의 결합에 따라 알파-알부틴 (alpha-arbutin)과 베타-알부틴 (beta-arbutin)으로 나누어지며 알파-알부틴은 베타-알부틴보다 적은 함량으로 매우 빠르고 효과적으로 피부 미백 작용에 관여하며, 가수분해 및 효소적 가수분해에 더욱 안정적이다. 그러나, 알파-알부틴은 이러한 우수성에도 불구하고 베타-알부틴에 비해 고가의 가격으로 인해 많은 사용이 어렵다. 따라서, 기존에 판매중인 알파-알부틴의 화학적 합성법이 아닌 효소 반응인 원스텝 (one-step) 공정 및 세포 공정을 이용한, 산업화를 위한 대량 생산방법 대한 연구가 진행중이다.

이에, 본 발명자들은 효소 반응인 원스텝 (one-step) 공정을 이용한 효율적인 산업화를 통해 알부틴을 대량 생산하고자 예의 노력한 결과, UDP-α-D-글루코스 보다 저렴한 글루코스-1-포스페이트를 출발물질로 하여 UDP 재사용에 필요한 5가지 효소인 YjiC/YdhE, galU, ACK, UMK에 의한 다단계 반응을 UDP 재사용을 수반한 원-스텝 반응으로 수행하여 베타-알부틴을 대량생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 UDP 재사용 반응이 수반된 효소 반응인 원스텝 (one-step) 공정을 이용한 알부틴을 대량 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK), 아세테이트 키나아제 (ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제 (YjiC 또는 YdhE)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질과 하이드로퀴논 (hydroquinone)을 반응시켜 알부틴 (arbutin)을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알부틴 (arbutin)을 회수하는 단계를 포함하는 알부틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 UDP 재사용 반응이 수반된 효소에 의한 다단계 반응을 원-스텝 반응으로 수행함으로써 알부틴 제조비용을 절감하고, 산업화를 통해 효율적으로 알부틴을 대량 생산할 수 있다.

도 1은 효소반응에 사용된 5가지 효소의 발현을 확인한 것이다. (A)는 1: 불용성 YjiC (45kDa), 2: 수용성 YjiC (45kDa), 3: 불용성 ACK (38kDa), 4: 수용성 ACK (38kDa), 5와 6: 수용성 GalU (38kDa), 7과 8: 수용성 UMK (27kDa)이며, (B)는 1과 3: 수용성 YjiC (45kDa), 2와 4: 불용성 YjiC (45kDa), 6,8 및 10: 수용성 YdhE (40kDa), 7, 9 및 11: 불용성 YdhE (40kDa)이다.
도 2는 효소반응인 원-스텝 (one-step) 반응공정을 나타낸 도식도이다.
도 3은 표준물질의 HPLC-PDA 분석 결과이다. (a) 하이드로퀴논 (Hydroquinone) 및 (b) 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (hydroquinone 4-O-glucoside ; 베타-알부틴)
도 4는 YjiC 및 YdhE 당전이 효소에 의한 하이드로퀴논 당화반응의 HPLC-PDA 분석 결과이다. (A)는 YjiC 당전이 효소 반응에 의한 하이드로퀴논 당화 반응이며, (B)는 YdhE 당전이 효소 반응에 의한 하이드로퀴논 당화 반응이다. (i) 효소반응 15분, (ii) 효소반응 30 분, (iii) 효소반응 60분, (iv) 효소반응 90 분, (vi) 효소반응 120분.
도 5는 UDP 재사용 반응에 의한 하이드로퀴논 당화반응에 대한 HPLC-PDA 분석 결과이다. (i) 효소반응 0시간, (ii) 효소반응 1시간, (iii) 효소반응 2시간, (iv) 효소반응 3시간, (v) 효소반응 4시간 30분, (vi) 효소반응 6시간.
도 6은 각 표준물질에 대한 Mass 스펙트럼 분석 결과이다. (a) 하이드로퀴논 및 (b) 알부틴.
도 7은 UDP 재사용 반응에 의한 하이드로퀴논 당화반응의 결과 Mass 스펙트럼 분석이다.
도 8은 하이드로퀴논 농도에 따른 시간별 결과 분석이다.
도 8a는 1mM (UMP) : 1mM (하이드로퀴논), 도 8b는 1mM (UMP) : 3mM (하이드로퀴논), 도 8c는 1mM (UMP) : 5mM (하이드로퀴논), 도 8d는 1mM (UMP) : 10mM (하이드로퀴논), 도 8e는 0.4mM (UMP) : 10mM (하이드로퀴논)이다.
도 9a는 표준 샘플 알파-알부틴 NMR 분석이다.
도 9b는 표준 샘플 베타-알부틴 NMR 분석이다.
도 9c는 효소반응에 의해 합성된 알부틴 NMR 분석이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 알부틴을 화학적 합성법이 아닌 효소반응으로 합성하고, 산업화를 위해 UMP를 기질로 재생 반응이 포함된 원-스텝 공정으로 생산하였다. 효소반응으로 UMP를 재생하고 UDP-글루코스를 생산하기 위해 GalU, ACK, UMK의 3개 관련 효소를 이용하였으며, 당전이 효소로 YjiC, YdhE의 2가지 효소의 원-스텝 반응을 통해 베타-알부틴을 합성하였다. 합성한 베타-알부틴을 HPLC-PDA 및 Mass 분석, NMR 분석을 통해 구조를 확인 하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK), 아세테이트 키나아제 (ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제 (YjiC 또는 YdhE)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질과 하이드로퀴논 (hydroquinone)을 반응시켜 알부틴 (arbutin)을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알부틴 (arbutin)을 회수하는 단계를 포함하는 알부틴의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 알부틴은 하이드로퀴논 1,4-O-디글루코시드 (hydroquinone 1,4-O-diglucoside; 알파-알부틴) 또는 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (hydroquinone 4-O-glucoside; 베타-알부틴)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 베타-알부틴인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

알부틴은 유기화합물로서, 하이드로퀴논과 글리코스 (glycose)가 에테르(ether) 결합으로 구성되어 있으며, 당의 결합에 따라 하이드로퀴논 1,4-O-디글루코시드 (알파-알부틴)과 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (베타-알부틴)으로 나누어진다. 알부틴은 tyrosinase의 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 형성을 억제하므로 피부 미백용으로 사용될 수 있다.

[화학식 1]

알파-알부틴

[화학식 2]

베타-알부틴

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실트랜스퍼라제 (YjiC 또는 YdhE)는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) DSM 13 =ATCC 14580 유래인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU)는 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 유래일 수 있으며, 아세테이트 키나아제 (ACK)는 Escherichia coli genome assembly NCTC9001 유래일 수 있고, 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK)는 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 효소반응에 사용된 효소인 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK)의 DNA 염기서열은 서열번호 1로 표시될 수 있으며, 아세테이트 키나아제 (ACK)의 DNA 염기서열은 서열번호 2로 표시될 수 있으며, UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU)의 DNA 염기서열은 서열번호 3으로 표시될 수 있으고, 글리코실트랜스퍼라제 YjiC 및 YdhE의 DNA 염기서열은 서열번호 4 및 5로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 원-스텝 반응공정은 UDP-α-D-글루코스의 저렴한 출발 물질인 글루코스-1-포스페이트 (glucose-1-phosphate)를 시작으로 3가지 효소인 UMK, ACK, GalU를 사용하여 UDP-글루코스를 합성하고, UDP를 재사용 (recycle)하면서 YjiC 또는 YdhE 당전이 효소에 의해 결과물을 합성하는 시스템이다.

즉, 본 발명에 있어서, UDP (uridine diphosphate) 재사용을 수반하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 원-스텝 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "UDP 재사용을 수반하는"이란 하이드로퀴논을 글리코실트랜스퍼라제 (YjiC 또는 YdhE)의 존재하에 UDP-D-글루코스를 포함하는 기질과 반응시켜 알부틴을 생성하는 일차 반응에서, UDP-D-글루코스가 재생되는 반응과정이 동시에 수행되는 것을 의미한다. UDP-D-글루코스가 재생되는 과정은 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK)가 UMP (uridine monophosphate)를 UDP (uridine diphosphate)로 전환할 수 있으며, 아세테이트 키나아제(ACK)가 UDP (uridine diphosphate)를 UTP (uridine triphosphate)로 전환할 수 있고, UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU)가 UTP (uridine triphosphate) 및 글루코스 1-포스페이트를 UDP-D-글루코스로 전환시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 글루코스 1-포스페이트가 UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU)에 의해 UDP-D-글루코스로 전환되며, UDP-D-글루코스는 하이드로퀴논을 글리코실트랜스퍼라제 (YjiC 또는 YdhE)의 존재하에서 알부틴을 생성시키는 반응에 이용된다. 이러한, UDP 재사용 (recycle) 과정은 효소반응을 통한 하이드로퀴논으로부터 알부틴을 생성하는 원-스텝 반응에 포함되어 있다.

본 발명은 알부틴을 효소반응을 통해 저렴하고, 효율적으로 생산을 하는 것에 관한 것으로, 고가의 UDP-글루코스를 재사용 (recycle)할 수 있는 반응을 도입하여 원-스텝 반응으로 알부틴을 성공적으로 합성하였다. 원-스텝 공정의 단점으로는 지속적인 pH의 감소가 있으나, 지속적으로 반응 혼합물의 pH를 유지하면 알부틴의 생산성을 높일 수 있다. 본 발명에서는 4가지 종류의 효소를 이용한 효소방법인 원-스텝 공정을 통해 베타-알부틴을 생산하였다. 생산물은 HPCL-PDA 및 Mass분석, NMR분석을 통해 확인하고, 대량생산을 위한 효소반응에서 UMP의 양을 최소로 하기 위해 재사용 (recycle) 시스템을 통하여 원-스텝 공정을 진행하였다.

[실시예]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.

실시예 1: 원-스텝 효소반응에 사용되는 5가지 효소의 제조

1-1 : 플라스미드 및 배양조건

5가지 효소에 대한 유전자 재조합 벡터로는 UMP kinase (UMK-pET15b), acetate kinase (ACK-pET24ma), UDP-α-D-glucose synthase (GalU-pET24ma), glycosyltransferase (YjiC-pET28a, YdhE-pET28a)를 사용하였다. 단백질 과발현을 위한 숙주로 E. coli BL21 (DE3)를 사용하였다. E. coli를 배양하기 위해 각 균주 배양 조건에 맞는 항생제 (암피실린 100 μg/mL 이하 및 카나마이신 50 μg/mL 이하)를 포함한 액체 및 고체 배지를 사용하였으며, 37℃에서 성장 후 20℃에서 24시간 발현시켰다.

1-2: 단백질 발현

발현 벡터에 재조합된 UMP kinase (UMK-pET15b), acetate kinase (ACK-pET24ma), UDP-α-D-glucose synthase (GalU-pET24ma), glycosyltransferase(YjiC-pET28a, YdhE-pET28a)를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 3시간 동안 각 조건에 맞는 항생제를 사용하여 성장시킨 후 발현을 위해 250ml shake 플라스크를 이용하여 LB배지 100ml와 재조합 균주 2ml를 넣어 OD 값 0.5~0.6까지 성장시킨다. 성장한 대장균에 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 0.5mM을 넣어 준 후, 20℃에서 각각 24시간 동안 발현시켰다. 배양된 균은 3,000rpm, 4℃에서 원심분리 하였으며, 10% 글리세롤 (pH 7.5)이 포함된 50mM Tris-HCl 버퍼를 사용하여 2번 세척해 주었다. 세척후 배양한 균을 초음파 분쇄하고, 12% SDS-PAGE 전기영동 후 염색하여 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 재조합 단백질, UMK(27 kDa), ACK(38 kDa), GalU(38 kDa), YjiC(45 kDa), YdhE(40 kDa)이 E. coli BL21 (DE3)에서 발현되었으며, 발현된 각 단백질을 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다 (도 1). 5가지 효소들은 하이드로퀴논 당화반응과 당전이의 핵심반응물인 UDP-글루코스 재사용을 위해 사용하였다.

실시예 2: 효소반응

효소 반응은 기본 반응인 UDP-글루코스를 이용한 일차반응과 원-스텝 반응으로 일차반응의 전체 반응물은 50mM Tris-HCl 버퍼, 12mM MgCl₂, 5mM UDP-글루코스, 2mM 하이드로퀴논, 40% YjiC/YdhE의 200ul로 반응시켰다. 원-스텝 반응의 전체 반응물은 200mM Tris-HCl 버퍼, 12mM MgCl₂, 3mM UMP, 30mM D-glucose-1-phosphate, 60mM acetyl phosphate, 1mM ATP, 5mM 하이드로퀴논, 5%YjiC, 5% GalU, 5% UMK, 10% ACK의 200ul로 반응시켰다. 모든 반응은 37℃에서 배양하고, 시간에 따라 샘플을 얻어 400ul 메탄올에 희석 후 10분 동안 12,000rpm, 4℃에서 원심분리 하였으며, 반응 혼합물을 HPLC-PDA 분석하였다.

HPLC-PDA 분석은 280nm의 UV 흡광도에 역상 컬럼을 사용하였다. 이동상은 용매 A (0.05% TFA water)와 용매 B (100% 아세토니트릴 (acetonitrile), CH₃CN)로 구성하였으며, 총 유량은 25분으로 된 프로그램에 1ml/min으로 유지하였다. 아세토니트릴 (acetonitrile)의 비율은 다음과 같이 설정하였다: 0-40% (0-15 min), 40-75% (15-20 min), 75-0% (20-25%). 확인된 반응 혼합물은 Mass 분석을 통해 결과를 확인하였으며, prep-HPLC를 통해 결과물을 분리한 후 NMR 분석을 통해 구조를 확인하였다.

2-1: YjiC 및 YdhE 당전이 효소에 의한 하이드로퀴논 당화반응

먼저 YjiC 및 YdhE 당전이 효소 당화반응에 의한 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (알부틴)을 합성하기 위해, YjiC 및 YdhE에 의해 UDP-D-글루코스를 기질로 하여 하이드로퀴논이 당화 반응하였다. 반응 조건은 전체 반응물은 50mM Tris-HCl 버퍼, 12mM MgCl₂, 5mM UDP-글루코스, 2mM 하이드로퀴논, 40% YjiC/YdhE의 200ul로 반응시켰다.

그 결과, 2개의 각각 당전이 효소 (YjiC 및 YdhE), UDP-D-글루코스와 하이드로퀴논이 반응한 결과, 2가지 결과물이 얻어진다. 대부분은 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (베타-알부틴)가 합성되고, 미량이 하이드로퀴논 1,4-O-디글루코시드 (알파-알부틴)가 합성된다. 반응한 혼합물의 HPLC-PDA 분석에 의해 두 개의 새로운 피크가 나타난 것으로 확인되었으며, 2시간 반응 후 당전이 효소 YjiC를 기준으로 YdhE가 약 2배의 수득률을 보였으며 YjiC는 평균 30%, YdhE는 평균 60%의 수득률을 보였다 (도 4).

2-2: UDP 재사용 반응에 의한 하이드로퀴논 당화반응

UDP (uridine diphosphate) 재사용 반응 (recycle)에 의한 하이드로퀴논 당화반응을 위해, UDP에서 UDP-글루코스로 합성하는 효소로서 당전이 효소 이외에 UMP kinase, acetate kinase, UDP-α-D-glucose synthase의 4가지 효소를 사용하였다. 먼저 UMK 효소반응에 의해 UMP가 UDP가 되며, ACK의 활성에 의해 UDP는 UTP가 되며, GalU 반응에 의해 UTP와 glucose-1-phosphate는 UDP-D-글루코스로 합성된다. 마지막으로 YjiC/YdhE 반응에 의해 UDP-D-글루코스는 하이드로퀴논 당화반응을 한다. 사용된 UDP-D-글루코스는 UDP로 분리되었다가 다시 ACK와 GalU에 의해 UDP-D-글루코스로 재생성 되고 반응에 참여하게 된다. UDP 재사용 반응 (recycle)에 의한 하이드로퀴논 당화반응은 원-스텝 반응으로 진행되며, 반응 결과는 HPLC-PDA 분석하였다.

원-스텝 반응의 조건은 전체 반응물을 200mM Tris-HCl 버퍼, 12mM MgCl₂, 3mM UMP, 30mM D-glucose-1-phosphate, 60mM acetyl phosphate, 1mM ATP, 5mM 하이드로퀴논, 5% YjiC, 5% GalU, 5% UMK, 10% ACK의 200ul로 반응시켰다.

그 결과, 실시예 2-1의 분석 결과와 유사한 2개의 새로운 피크가 확인되었다 (도 5). 수득률 또한 가장 최적의 조건에서 평균 50%를 기록하였다.

실시예 3: 반응 결과물의 Mass 분석 및 NMR 분석

3-1: 반응 결과물의 Mass 분석

실시예 2의 원-스텝 (One-step) 반응 결과물을 Mass 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, Rf=6.7분 피크 결과물의 분자량은 295.0794으로 하이드로퀴논에 당이 1개 붙어 있는 하이드로퀴논 4-O-글루코시드 (베타-알부틴)인 것으로 결론을 내렸으며, Rf=4.4분 결과물은 하이드로퀴논에 당이 2개 붙은 분자량 457.1322으로 하이드로퀴논 1,4-O-디글루코시드 (알파-알부틴)로 분석되었다 (도 6 및 7).

3-2: 알부틴의 NMR 분석

반응 결과물의 입체 구조를 분석하기 위해 prep-HPLC에 의해 분리를 하였으며, 분리된 결과물은 NMR 분석을 통해 구조를 확인한 결과 표준 물질인 알파-알부틴과 베타-알부틴의 J값을 반응 혼합물인 알부틴과 비교하였을 때 J값이 베타-알부틴과 동일한 7.7Hz값으로 확인되어, 베타-알부틴이 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 9a~c)

실시예 4: UMP ( uridine monophosphate ) 를 이용한 재사용 시스템의 효율

UMP를 이용한 재사용 시스템의 효율을 비교하기 위해 전체 반응물을 200mM Tris-HCl 버퍼, 12mM MgCl₂, 30mM D-glucose-1-phosphate, 60mM acetyl phosphate, 1mM ATP, UMP, 하이드로퀴논, 5% YjiC, 5% GalU, 5% UMK, 10% ACK의 200ul로 반응시켰다. UMP의 농도를 하이드로퀴논과 비교해서 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 1:25 (UMP : Hydroquinone)으로 UMP의 양을 희석하여 진행하였다. 반응은 37℃에서 총 3시간 반응시켰으며, 0시간, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분, 180분 반응물을 각 500ul 메탄올에 희석 후 10분 동안 12,000rpm, 4℃에서 원심분리하여, 반응 혼합물을 HPLC-PDA 280nm에서 분석하였다.

그 결과, 반응은 전체적으로 비슷한 반응 곡선을 나타냈으며, 1:1 반응에서 평균 하이드로퀴논 양의 50%, 1:3 반응에서 47%, 1:5 반응에서 49%, 1:10 반응에서 32%, 1:25 반응에서 18%의 수득률을 보였다 (표 1). 또한, 1:25 반응에서는 UMP 양의 4.5배수 가량의 알부틴이 생산되었다 (도 8).

하이드로퀴논과 UMP의 비율에 따른 수득률, 합성량 및 UMP당 알부틴 생성량

반응물 (90분 반응 )	수득률	합성된 양	UMP당 알부틴 생성량
Hydroquinone (1mM)/UMP (1mM)	54%	0.54mM	54%
Hydroquinone (3mM)/UMP (1mM)	53%	1.58mM	158%
Hydroquinone (5mM)/UMP (1mM)	42%	2.11mM	211%
Hydroquinone (10mM)/UMP (1mM)	29%	2.92mM	292%
Hydroquinone (10mM)/UMP (0.4mM)	18%	1.8mM	450%

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> Method for Preparing of Arbutin <130> P16-B174 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atggctacca atgcaaaacc cgtctataaa cgcattctgc ttaagttgag tggcgaagct 60 ctgcagggca ctgaaggctt cggtattgat gcaagcatac tggatcgtat ggctcaggaa 120 atcaaagaac tggttgaact gggtattcag gttggtgtgg tgattggtgg gggtaacctg 180 ttccgtggcg ctggtctggc gaaagcgggt atgaaccgcg ttgtgggcga ccacatgggg 240 atgctggcga ccgtaatgaa cggcctggca atgcgtgatg cactgcaccg cgcctatgtg 300 aacgctcgtc tgatgtccgc tattccattg aatggcgtgt gcgacagcta cagctgggca 360 gaagctatca gcctgttgcg caacaaccgt gtggtgatcc tctccgccgg tacaggtaac 420 ccgttcttta ccaccgactc agcagcttgc ctgcgtggta tcgaaattga agccgatgtg 480 gtgctgaaag caaccaaagt tgacggcgtg tttaccgctg atccggcgaa agatccaacc 540 gcaaccatgt acgagcaact gacttacagc gaagtgctgg aaaaagagct gaaagtcatg 600 gacctggcgg ccttcacgct ggctcgtgac cataaattac cgattcgtgt tttcaatatg 660 aacaaaccgg gtgcgctgcg 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atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780 atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840 gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900 cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gccaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960 atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc accggtggta tcggtgaaaa tgccgcgatg 1020 gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080 aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140 gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200 tga 1203 <210> 3 <211> 909 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atggctgcca ttaatacgaa agtcaaaaaa gccgttatcc ccgttgcggg attaggaacc 60 aggatgttgc cggcgacgaa agccatcccg aaagagatgc tgccacttgt cgataagcca 120 ttaattcaat acgtcgtgaa tgaatgtatt gcggctggca ttactgaaat tgtgctggtt 180 acacactcat ctaaaaactc tattgaaaac cactttgata ccagttttga actggaagca 240 atgctggaaa aacgtgtaaa acgtcaactg cttgatgaag tgcagtctat ttgtccaccg 300 cacgtgacta ttatgcaagt tcgtcagggt ctggcgaaag 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tatatttcaa tgggaaccgt acttggcaaa 720 actgcggatt ttttcaatat gtgcattgat gcttttcgtg atttcgacgg caaggttgtc 780 atcgccgctg gcgaaaaatc ggactacgcg gaaattaaag aagtgccgga gcattttatc 840 atcgccccgt atgtgccgca attagaggtg cttaaagagg ccgatgtgtt catcacgcac 900 ggcggcatga acagcgtcaa tgaaggcatc cattaccgtg tcccgatggt tgtgcttccg 960 catgataaag atcagccgat gatcgcccag cgcttgaaag agctgaatgc gggatatcct 1020 ctgtttgcag aagaagtgaa tgctgaaaga ttgagagatg cagcagaaca agtgctcact 1080 gacggaaaat atcaggaagg tattcaaaaa attgatgaaa gcttcagcaa ctgcatggac 1140 attaaagatg cattggcgcg tattgatgaa tatacggcgc ggaaaaaagt cgctgcagcc 1200 ataacagaaa gccgctacta a 1221

Claims

다음 단계를 포함하는 베타-알부틴 (하이드로퀴논 4-O-글루코시드; hydroquinone 4-O-glucoside)의 제조방법:
(a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK), 아세테이트 키나아제 (ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU) 및 YdhE 글리코실트랜스퍼라제의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질과 하이드로퀴논 (hydroquinone)을 반응시켜 베타-알부틴 (β-arbutin)을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 베타-알부틴 (β-arbutin)을 회수하는 단계.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포미스 (Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 UDP (uridine diphosphate) 재사용을 수반하는 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 원-스텝 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 유리딘 모노포스페이트 키나아제 (UMK)는 UMP (uridine monophosphate)를 UDP (uridine diphosphate)로 전환시키는 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 아세테이트 키나아제 (ACK)는 UDP (uridine diphosphate)를 UTP (uridine triphosphate)로 전환시키는 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 UDP-알파-D-글루코스 합성효소 (GalU)는 UTP (uridine triphosphate) 및 글루코스 1-포스페이트를 UDP-D-글루코스로 전환시키는 것을 특징으로 하는 베타-알부틴의 제조방법.