CN113717910B - 一种三酶共表达重组菌及其在(s)-香茅醇合成中的应用 - Google Patents

一种三酶共表达重组菌及其在(s)-香茅醇合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三酶共表达重组菌及其合成(S)‑香茅醛中的应用，所述重组菌是将老黄酶NemR‑PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的编码基因共同导入宿主细胞构建而成。本发明利用共表达老黄酶NemR‑PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌一锅法级联催化400mM(E/Z)‑柠檬醛的二步还原，反应24h补加表达葡萄糖脱氢酶BmGDHM6重组菌湿菌体，反应36h后底物完全转化为产物(S)‑香茅醇，产物e.e.值>99％，化学选择性和对映体选择性高；方法绿色高效，条件温和，操作简单，适合大规模工业生产。

Description

一种三酶共表达重组菌及其在(S)-香茅醇合成中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种老黄酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢共表达重组菌及其在整细胞催化选择性还原(E/Z)-柠檬醛合成(S)-香茅醇中的应用。
(二)背景技术
香茅醇作为一种重要的香料原料，常用于配制玫瑰香型、柑桔香型的香料和高档香水。香茅醇同时也是一种重要的食用型香料，用于制作鲜花饼、烘焙食品、饮料和糖果等食物。香茅醇还具有药用价值，包括体外的抗细菌和抗真菌作用，以及体内的止痛和抗惊厥作用。(S)-香茅醇还是手性合成中的重要中间体，可用于合成全顺式的玫瑰醚，该化合物香气幽雅。
香茅醇和(S)-香茅醇的合成方法包括化学法和生物法。化学法以香叶醇、柠檬醛或者香茅醛为底物，通过加氢合成香茅醇。在诸多底物中，柠檬醛作为大宗化学品，更具价格优势。然而，化学法选择性还原柠檬醛合成香茅醇仍极具挑战。这是因为柠檬醛含有两个C＝C和一个C＝O基团，化学还原会生成香茅醛、香茅醛、橙花醇、香叶醇以及3,7-二甲基辛醇等产物，副产物众多。此外，大宗柠檬醛是(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，而(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的还原产物往往光学性质是互补的，因而产物的光学纯化不高。与化学法相比，生物法中的酶具有高化学选择性和高对映体选择性，是替代化学法的理性选择。然而，目前生物法合成香茅醇的报道并不多。2011年，马来西亚大学报道了在连续密闭气体循环生物反应器中，利用酿酒酵母(贝克酵母II型)静息细胞将香叶醇生物转化为香茅醇。2021年，GuozhenJiang等人利用代谢工程技术构建了一种重组酿酒酵母，该酵母在分批发酵中香茅醇产量可达8.30g/L。
与已有的生物法不同，我们基于多酶级联催化(E/Z)-柠檬醛两步还原生成(S)-香茅醇：老黄酶不对称还原E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醛，醇脱氢酶催化(S)-香茅醛的进一步还原生成(S)-香茅醛，葡萄糖脱氢酶则起到驱动辅酶循环的作用。对于多酶催化体系，通过多酶共表达构建整细胞催化剂，构建一锅法催化工艺，可以简化催化剂的制备，避免细胞与细胞之间的跨膜屏障，有利于酶的稳定性，有助于提高催化效率。具体地，我们选择了源自斯氏普罗威登斯菌Providencia stuartii具有高活力和严格(S)-对映体选择性的老黄酶NemR-PS、取源自约克氏菌Yokenella sp.WZY002高活力热稳定性好的醇脱氢酶YsADH和源自巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium底物耐受性强葡萄糖脱氢酶突变子BmGDHM6来构建共表达该三酶的重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6，以该重组菌为整细胞催化剂，实现了高效选择性还原(E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醇。目前，尚未见共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的构建报道，也未见利用共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6重组菌两步还原(E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醇的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种三酶共表达重组菌以及利用所构建的重组菌催化(E/Z)-柠檬醛的还原生成(S)-香茅醇的新方法，所述三酶为老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6，该方法具有高效、化学选择性和对映体选择性专一、绿色环保、条件温和等优点，避免了化学法中常见的选择性低、条件苛刻、副产物多等问题。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种三酶共表达重组菌，所述共表达重组菌是将老黄酶NemR-PS编码基因、醇脱氢酶YsADH编码基因和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因共同导入宿主细胞构建而成，所述老黄酶NemR-PS编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，醇脱氢酶YsADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
所述老黄酶NemR-PS氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，醇脱氢酶YsADH氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；葡萄糖脱氢酶BmGDHM6氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明所述共表达重组菌按如下方法构建：将所述醇脱氢酶YsADH编码基因插入pACYCDuet-1载体上的第一克隆位点Nco I和Hind III之间，将所述老黄酶NemR-PS编码基因插入pACYCDUet-1载体上的第二克隆位点Nde I和Xho I之间，得到第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；将所述葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因插入载体pET28b上的EcoR I和Hind III之间，得到第二重组载体pET28b-BmGDHM6；将第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；利用CaCl2法将重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS制成感受态细胞，然后将第二重组载体pET28b-BmGDHM6导入该感受态中，得到共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6。
第二方面，本发明还提供一种三酶共表达重组菌在还原(E/Z)-柠檬醛合成(S)-香茅醇中的应用，所述应用为：以三酶共表达重组菌(优选E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6)经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以(E/Z)-柠檬醛为底物，以葡萄糖为辅底物，加入助溶剂和/或辅酶NADP+(是指辅酶NADP+可以添加，也可以不添加)，以pH 5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～45℃、0～700rpm条件下转化反应12～48h，获得含(S)-香茅醇的反应液，反应液分离纯化，获得(S)-香茅醇；所述助溶剂为1-丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或二甲基亚砜(DMSO)，优选异丙醇。
进一步，所述转化体系中，催化剂加入量以转化体系体积计为10～100g/L(优选100g/L)；底物加入终浓度以转化体系体积计为50～400mM(优选400mM)；所述葡萄糖加入终浓度为底物加入浓度的3倍；所述NADP+加入终浓度以转化体系体积计为0.1～1.0mM(优选0.4mM)；所述的助溶剂体积加入量以转化体系体积计为10～40％(优选20％)，所述缓冲液为pH7.5～9.0、50mM Tris-HCl或pH 6.0～7.0、50mM PIPES或pH 5.0～5.5、50mM柠檬酸溶液，优选pH 6.5、50mM PIPES缓冲液。
进一步，在反应过程中，通过补加含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体提高转化率，即补加表达BmGDHM6的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6湿菌体。所述反应过程中工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6湿菌体的补加量以转化体系体积计为20～80g/L，优选50g/L，补加的时间点为反应进程的12、24或者36h。
进一步，所述的三酶共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体按如下方法制备：将三酶共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-80℃条件下保存备用。
进一步，所述的含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6湿菌体按如下方法制备：将重组质粒pET28b-BmGDHM6导入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，得到工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6。将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-80℃条件下保存备用。
本发明反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，有机相经减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，得到产物(S)-香茅醇。
本发明利用重组菌诱导产生的老黄酶NemR-PS催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醛，醇脱氢酶YsADH催化(S)-香茅醛生成(S)-香茅醇，葡萄糖脱氢酶以及葡萄糖实现NADPH循环，是一种新型高效的(S)-香茅醇合成方法(图1)。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在于：本发明提供了共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌，以及利用所述重组菌一锅法三酶级联催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇(图1)。所述方法高效，比如，400mM底物(E/Z)-柠檬醛在36h内完全转化为产物(S)-香茅醇；所述方法具有高选择性，产物为光学纯的(S)-香茅醇，没有检测到(R)-香茅醇，通过补加葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的工程菌，有效地消除了副产物(橙花醇和香叶醇)和中间产物(S)-香茅醛，提高了转化率，高纯度的产物有利于后续的产物分离精制。所述方法绿色高效，条件温和，操作简单，适合大规模工业生产。
(四)附图说明
图1为重组菌一锅法三酶级联催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的反应示意图。
图2为单独表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌所制得的粗酶液的SDS-PAGE检测。其中泳道M对应的是Protein Marker；泳道1对应的是对照组，该粗酶液由未经诱导的含有老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的编码基因的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6重组菌制得的粗酶液；泳道2对应的是单独表达醇脱氢酶YsADH工程菌所制得的粗酶液，醇脱氢酶YsADH大小约37kD；泳道3对应的是单独表达老黄酶NemR-PS工程菌所制得的粗酶液，老黄酶NemR-PS大小约39kDa；泳道4对应的是单独表达葡萄糖脱氢酶BmGDHM6工程菌所制得的粗酶液，葡萄糖脱氢酶BmGDHM6大小约31kDa。
图3为共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌所制得的粗酶液的SDS-PAGE检测。其中泳道M对应的是Protein Marker；泳道1对应的是对照组，该粗酶液由未经诱导的含有老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的编码基因的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6重组菌制得的粗酶液；泳道2对应的是共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌诱导培养所制得的粗酶液，老黄酶NemR-PS大小约39kDa、醇脱氢酶YsADH大小约37kDa和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6大小约31kDa。
图4为温度对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图5为pH对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图6为转速对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图7为辅酶NADP+浓度对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图8为辅酶FMN浓度对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图9为助溶剂对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图10为底物浓度对重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的影响。
图11不补加单独表达BmGDHM6湿菌体的反应进程。
图12在12h补加单独表达BmGDHM6湿菌体的反应进程。
图13在24h补加单独表达BmGDHM6湿菌体的反应进程。
图14在36h补加单独表达BmGDHM6湿菌体的反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物领域常规实验方法进行，如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的实验方法，或者按照制造厂商所建议的实验方法。
实施例1、老黄酶NemR-PS编码基因的获取
利用已公开的来源于斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii；Department ofInfectious Diseases,National Institute of Health Dr.Ricardo Jorge,Lisbon,Portugal)老黄酶NemR-PS编码基因(GenBank登录号为KNZ86848)，经过密码子优化后，人工合成(杭州擎科生物技术有限公司提供基因合成服务)该老黄酶NemR-PS编码基因，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例2、醇脱氢酶编码基因的获取
利用已公开的来源于约克氏菌(Yokenella sp.)CCTCC NO.M2013099(已在专利申请2013101888839中公开)的醇脱氢酶YsADH编码基因(GenBank登录号为KF887947)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)该醇脱氢酶编码基因，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
实施例3、葡萄糖脱氢酶编码基因的获取
来源于巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶BmGDH的GenBank登录号为AAA22475，对葡萄糖脱氢酶BmGDH氨基酸序列进行Q252L/E170K/S100P/K166R/V72I/K137R多位点替换获得突变子BmGDHM6(已在专利申请2020103075429中公开)。突变子BmGDHM6编码基因经过密码子优化后人工合成(杭州擎科生物技术有限公司提供基因合成服务)，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
实施例4、单独、共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌构建
1、单独表达的工程菌
将老黄酶NemR-PS编码基因、醇脱氢酶YsADH编码基因和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因分别插入到质粒pET28b上Nco I和Xho I位点，得到重组质粒pET28b-NemR-PS、pET28b-YsADH和pET28b-BmGDHM6。将重组质粒pET28b-NemR-PS、pET28b-YsADH和pET28b-BmGDHM6分别导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-NemR-PS、E.coli BL21(DE3)/pET28b-YsADH和E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6。工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-NemR-PS、E.coli BL21(DE3)/pET28b-YsADH和E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6经提取质粒测序表明，老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6分别插入无误。
2、共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌
将醇脱氢酶YsADH编码基因插入质粒pACYCDuet-1上的第一克隆位点Nco I和HindIII之间，将老黄酶NemR-PS编码基因插入pACYCDUet-1载体上的第二克隆位点Nde I和XhoI之间，得到重组质粒pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS。将重组质粒pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养12h，得种子液。重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS经提取质粒测序表明，醇脱氢酶YsADH和老黄酶NemR-PS的编码基因插入无误。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD600至0.4，冰上冷却半小时，取菌液离心后弃去上清液，用冰上预冷的100mM氯化钙水溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，然后4℃和4000rpm下离心收集菌体，再用冰上预冷的100mM氯化钙水溶液轻轻悬浮细胞制成E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS感受态细胞。将重组质粒pET28b-BmGDHM6导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS中，获得共表达重组菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6。共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6经提取质粒测序表明，老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的编码基因插入无误。
实施例5、单独表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的工程菌与共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌的诱导表达
1、单独表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的工程菌的诱导表达
将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-NemR-PS、E.coli BL21(DE3)/pET28b-YsADH和E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6分别接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂。
2、共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的重组菌的诱导表达
将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂。
实施例6、老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的比酶活测定
1、粗酶液的制备
(1)单独表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的工程菌粗酶液
称取实施例5步骤1得到的湿菌体1g，分别加入15mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)充分重悬菌体后，然后在冰浴(0℃)条件下对菌悬液进行超声破碎。在600W下超声破碎10min，工作2s，间歇6s，以相同条件重复破碎3次。破碎菌液在4℃和12000rpm下离心10min，所得到的上清液即为目的蛋白的粗酶液。将目的蛋白的粗酶液用截留分子量为10kDa的超滤管在4℃和5000rpm下离心30min进行浓缩。离心结束后，去除沉淀，得到的上层溶液即为浓缩后的目的蛋白的粗酶液，并进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE如图2(泳道2，3和4)所示，泳道1为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6重组菌制备的粗酶液，醇脱氢酶YsADH(泳道2)、老黄酶NemR-PS(泳道3)和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6(泳道4)在大肠杆菌中均成功单独表达。
(2)共表达重组菌粗酶液
称取实施例5步骤2得到的湿菌体1g，粗酶液的制备方法同步骤(1)，SDS-PAGE如图3(泳道2)所示，以未诱导的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6重组菌制备的粗酶液为对照，老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6在大肠杆菌中成功共表达。
2、蛋白浓度测定
根据BCA法蛋白质浓度测定试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，测得的线性关系公式为Y＝0.4478X，其中Y：是562nm处的吸光度值，X：为BSA溶液浓度(mg/mL)，标准偏差为R2＝0.9905。然后根据标准蛋白浓度曲线计算蛋白浓度，进而计算比酶活。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
经蛋白浓度测定，单独老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6工程菌制得的粗酶液蛋白浓度分别为8.21mg/mL、7.85mg/mL和8.63mg/mL。
共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6重组菌制得的粗酶液蛋白浓度为8.49mg/mL。
3、酶活测定
(1)醇脱氢酶的比酶活测定
醇脱氢酶的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定在340nm处吸光值的变化来计算酶活。比酶活测定体系：100μg粗酶液(以粗酶液的蛋白浓度计)，20mM(S)-香茅醛，0.4mM NADPH，加50mM PIPES缓冲液(pH 7.0)补足1mL。(S)-香茅醛用异丙醇作为溶剂预先配成1M的储液。酶活力单位(U)定义：在30℃下，每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。醇脱氢酶YsADH的体积酶活力及比活力计算公式如公式1和公式2：
①ΔA为1min之内吸光值的变化；
②V1、V2分别为反应液的总体积和添加的酶液体积，mL；
③6220为NAD(P)H在340nm下的摩尔消光系数，
④L为光程距离，为1cm；t为反应时间，1min；
(2)老黄酶的比酶活测定
老黄酶的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定340nm处吸光值的变化来计算酶活。酶活检测体系为：100μg粗酶液(以粗酶液的蛋白浓度计)，20mM(E/Z)-柠檬醛，0.4mM NADPH，加50mM PIPES缓冲液(pH 7.0)补足1mL。(E/Z)-柠檬醛用异丙醇作为溶剂预先配成1M的储液。酶活力单位(U)定义：在30℃下，每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。老黄酶NemR-PS的体积酶活力及比活力计算公式如上公式1和公式2。
(3)葡萄糖脱氢酶的比酶活测定
葡萄糖脱氢酶的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定340nm处吸光值的变化来计算酶活。酶活检测体系为：100μg粗酶液(以粗酶液的蛋白浓度计)，20mM葡萄糖，0.4mM NADP+，加50mM PIPES缓冲液(pH 7.0)补足1mL。(E/Z)-柠檬醛用异丙醇作为溶剂预先配成1M的储液。酶活力单位(U)定义：在30℃下，每分钟生成1μmol NADPH所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的体积酶活力及比活力计算公式如上公式1和公式2。
经比酶活测定，在单独老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6工程菌所制得的粗酶液中，老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶的比酶活分别是0.17U/mg，0.47U/mg和0.34U/mg。
经比酶活测定，在共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6重组菌所制得的粗酶液中，老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶的比酶活分别是0.13U/mg，0.20U/mg和0.19U/mg。
实施例7、催化体系的最适温度
以共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6为生物催化剂，优化一锅法多酶级联催化(E/Z)-柠檬醛还原生成(S)-香茅醇的反应体系与反应条件。
探究催化体系的最适温度，反应体系组成：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、0.2mM NADP+、体积浓度20％的异丙醇、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、实施例5制备的E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应条件选取20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，搅拌转速为200rpm。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应12h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图4所示，在30℃时转化率最高，因而确定催化反应的最适温度为30℃。
实施例8、催化体系的最适pH
进一步探究催化体系的最适pH。反应体系组成：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、0.2mM NADP+、体积浓度20％的异丙醇、50mM柠檬醛缓冲液(pH5.0和5.5)或PIPES缓冲液(pH6.0、6.5和7.0)或Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8.0、8.5和9.0)、实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应pH范围包括5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。在30℃和200rpm下反应12h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图5所示，在pH 6.5时转化率最高，因而催化反应的最适pH为6.5。
实施例9、催化体系的最适搅拌速度
根据以上实例的探究条件，确定反应体系：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、0.2mM NADP+、体积浓度20％的异丙醇、50mM PIPES缓冲液(pH 6.5)、实施例5制备的E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应温度30℃，转速范围包括0rpm、100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm和700rpm。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应12h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图6所示，在400rpm转速时转化率最高，因而催化反应的最适转速为400rpm。
实施例10、催化体系的最适辅酶添加量
1、探究辅酶NADP+的最适添加量
进一步探究催化体系的辅酶NADP+最适添加量。反应体系：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、辅酶NADP+的浓度(0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM)、体积浓度20％的异丙醇、50mM PIPES缓冲液(pH 6.5)、实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应温度30℃，转速400rpm，反应12h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图7所示，NADP+浓度在0.4～1.0mM范围时，随着NADP+浓度增加转化率并没有显著增加，因此NADP+的最适添加量为0.4mM。
2、探究辅酶FMN的最适添加量
根据步骤1，确定催化体系中辅酶NADP+的最适添加量为0.4mM。进一步探究辅酶FMN的最适添加量。反应体系：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、0.4mMNADP+、辅酶FMN(0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM)、体积浓度20％的异丙醇、50mM PIPES缓冲液(pH6.5)、实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应温度30℃，转速400rpm，反应12h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图8所示，在0～1.0mM范围内随着FMN的浓度增加转化率没有显著提高。因此，从催化效果和经济成本考虑，催化反应体系中不添加辅酶FMN。
实施例11、催化体系的最适助溶剂
根据以上实例的探究条件，确定反应体系：200mM(E/Z)-柠檬醛、600mM葡萄糖、0.4mM NADP+、体积浓度20％的助溶剂、50mM PIPES缓冲液(pH 6.5)、实施例5制备的E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。助溶剂分别为1-丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇和二甲基亚砜(DMSO)中的一种。反应温度30℃，转速400rpm，反应12h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1MNaOH水溶液。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图9所示，当助溶剂为异丙醇或DMSO时，转化率较高。考虑到后续产物分离纯化时异丙醇更容易通过减压蒸馏去除，因而催化反应体系中选取异丙醇为助溶剂。
实施例12、重组细胞催化不同浓度(E/Z)-柠檬醛的二步还原
根据以上实例的探究条件，反应体系中分别以50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM和400mM(E/Z)-柠檬醛底物，其余为：3倍底物浓度的葡萄糖、0.4mM NADP+、体积浓度20％的异丙醇、50mM PIPES缓冲液(pH 6.5)、实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。反应温度30℃，转速400rpm，反应12h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图10所示，当底物浓度不高于200mM时，转化率均大于98％；随着底物浓度逐步增加到400mM，转化率逐步下降，同时剩余的底物、中间产物(S)-香茅醛和副产物(橙花醇和香叶醇)逐步增加。
实施例13、通过补加单独表达BmGDHM6湿菌体去除中间产物(S)-香茅醛和副产物(橙花醇和香叶醇)
为了消除反应过程中的中间产物(S)-香茅醛和副产物(橙花醇和香叶醇)，确定反应体系：400mM(E/Z)-柠檬醛、1200mM葡萄糖、0.4mM NADP+、体积浓度20％的异丙醇、50mMPIPES缓冲液(pH 6.5)、实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDHM6湿菌体0.1g，总体系为10mL。以不补加单独表达BmGDHM6湿菌体作为对照组，实验组补加的是50g/L实施例5方法诱导表达所得的E.coli BL21(DE3)/pET28b-BmGDHM6湿菌体，补加的时间点分别是12、24和36h。反应温度30℃，转速400rpm，反应总时间为48h。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。每6h取样，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物计算转化率(实施例14方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图11所示，当不补加单独表达BmGDHM6湿菌体时，副产物橙花醇和香叶醇在前6h快速积累，之后至48h逐步被消耗完全；而中间产物(S)-香茅醛则在48h反应进程是逐步积累的趋势。我们推测是三个酶中的BmGDHM6丧失了活性，因而补加单独表达BmGDHM6湿菌体是有必要的。分别在反应的12(图12)、24(图13)和36h(图14)补加单独表达BmGDHM6湿菌体，中间产物(S)-香茅醛和副产物(橙花醇和香叶醇)完成消耗的对应时间分别为42、36和48h。补加单独表达BmGDHM6湿菌体不仅缩短了反应时间，也消除了中间产物(S)-香茅醛和副产物(橙花醇和香叶醇)，有助于提高转化率，并且有利于后续的产物分离纯化。乙酸乙酯萃取获得的有机相经减压蒸馏去除乙酸乙酯，即可获得高纯度的产物(S)-香茅醇。
从实施例7到实施例13中的所有催化反应，产物(S)-香茅醇e.e.值均>99％，所建立的(S)-香茅醇合成方法具有严格的(S)-对映体选择性。
实施例14、利用气相色谱法检测底物、中间产物、产物和副产物的色谱条件
(E)-柠檬醛、(Z)-柠檬醛、(S)-香茅醛、(R)-香茅醛、橙花醇、香叶醇、(S)-香茅醇和(R)-香茅醇的气相色谱定量方法如下：Agilent 6890N手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器FID，250℃；载气，N2；载气流量，3mL/min；分流比，1:19；进样量，1.0μL；进样口温度，250℃。升温程序：初始温度90℃，以20℃/min升温至160℃，保持2min，随后以20℃/min升温至180℃，保持3min。按出峰顺序，保留时间分别为：(S)-香茅醛，20.128min；(R)-香茅醛，21.098min；橙花醇，27.208min；香茅醇，27.480min；香叶醇，28.419min；(E)-柠檬醛，28.842min；(Z)-柠檬醛，29.890min。
上述色谱方法不能区分(S)-香茅醇和(R)-香茅醇，因而建立了一种专门分析(S)-香茅醇和(R)-香茅醇的方法，如下：Agilent 6890N手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器FID，250℃；载气，N2；载气流量，3mL/min；分流比，1:19；进样量，1.0μL；进样口温度，250℃。升温程序：初始温度75℃，保持30min，以0.4℃/min升温至120℃，保持10min，随后以20℃/min升温至180℃，保持3min。(S)-香茅醇和(R)-香茅醇的保留时间分别为95.481min和96.249min。
利用气相色谱法检测底物、中间产物、产物和副产物时，色谱定量方法采用的是外标法，每个物质所对应的标准曲线汇总如表1。
表1气相色谱法检测底物、中间产物、产物和副产物时的标准曲线
注：Y为浓度，单位为mmol/L；X为色谱峰积分面积。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种三酶共表达重组菌及其在(S)-香茅醇合成中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)
<400> 1
atgagccaga aaaagctgtt tacgccgctg aaagttggta ccctgaccgc accgaatcgt 60
atttttatgg cgccgctgac ccgcctgcgt agcattgaac cgggcgatat tccgacgccg 120
ctgatgggcg aatattatcg ccagcgtgcc accgcaggcc tgattattag cgaagcaacc 180
cagattagtg cacagtcaaa aggttatgca ggtgcaccag gtctgcatag cgcagaacag 240
attgcagcat ggaaaaagat tacctcaacc gttcatgaag caggtggtcg tattgcagta 300
cagctgtggc atacgggtcg tattagtcat gttagcctgc agccgaacgg tctggcaccg 360
gttgcaccgt cagcaatttc agccggcaca cgtaccagtc tgcgtgatga aaatggtcgt 420
gccattcgtg tagataccag catgccgcgt gcactggaaa ccgaagaaat tccggcaatt 480
gttaatgatt ttcgccaggc agttgcaaat gcccgtgaag ctggttttga tatggctgaa 540
ctgcatgcag cacatggtta tctgctgcat cagtttctga gcccgtcagc aaatcatcgt 600
accgatcagt atggcggtac ccgtgaaaat cgtgcacgtt ttctgctgga tgttgttgat 660
gcagtttgtg cagaatgggg tagcgaacat attggtattc gtattagtcc gattggtacc 720
tttcagaata cagataatgg tcctaatgaa gttgatgatg ctctgtatct gattgaagaa 780
ctggataaac gtcatattgc atatctgcat ctgagcgaac cggattgggc aggtggtcag 840
ccatataccg atgattttcg tcagaaagtt cgtgaacgtt ttcatggtgt tattattggt 900
gcaggcgcat atacgacaga aaaagcagaa aatctgattg aaaaaggtct gattgatgca 960
gttgcctttg gtcgtgattt tattgcgaat ccggatctgg ttgtgcgtct gaaaaataaa 1020
gcagcactga acccacagcg tccggaaagc ttttatggtg gtggtgccga aggttatacc 1080
gattatccga gcctgtaa 1098
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)
<400> 2
Met Ser Gln Lys Lys Leu Phe Thr Pro Leu Lys Val Gly Thr Leu Thr
1 5 10 15
Ala Pro Asn Arg Ile Phe Met Ala Pro Leu Thr Arg Leu Arg Ser Ile
20 25 30
Glu Pro Gly Asp Ile Pro Thr Pro Leu Met Gly Glu Tyr Tyr Arg Gln
35 40 45
Arg Ala Thr Ala Gly Leu Ile Ile Ser Glu Ala Thr Gln Ile Ser Ala
50 55 60
Gln Ser Lys Gly Tyr Ala Gly Ala Pro Gly Leu His Ser Ala Glu Gln
65 70 75 80
Ile Ala Ala Trp Lys Lys Ile Thr Ser Thr Val His Glu Ala Gly Gly
85 90 95
Arg Ile Ala Val Gln Leu Trp His Thr Gly Arg Ile Ser His Val Ser
100 105 110
Leu Gln Pro Asn Gly Leu Ala Pro Val Ala Pro Ser Ala Ile Ser Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Thr Ser Leu Arg Asp Glu Asn Gly Arg Ala Ile Arg Val
130 135 140
Asp Thr Ser Met Pro Arg Ala Leu Glu Thr Glu Glu Ile Pro Ala Ile
145 150 155 160
Val Asn Asp Phe Arg Gln Ala Val Ala Asn Ala Arg Glu Ala Gly Phe
165 170 175
Asp Met Ala Glu Leu His Ala Ala His Gly Tyr Leu Leu His Gln Phe
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Ala Asn His Arg Thr Asp Gln Tyr Gly Gly Thr Arg
195 200 205
Glu Asn Arg Ala Arg Phe Leu Leu Asp Val Val Asp Ala Val Cys Ala
210 215 220
Glu Trp Gly Ser Glu His Ile Gly Ile Arg Ile Ser Pro Ile Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Asn Thr Asp Asn Gly Pro Asn Glu Val Asp Asp Ala Leu Tyr
245 250 255
Leu Ile Glu Glu Leu Asp Lys Arg His Ile Ala Tyr Leu His Leu Ser
260 265 270
Glu Pro Asp Trp Ala Gly Gly Gln Pro Tyr Thr Asp Asp Phe Arg Gln
275 280 285
Lys Val Arg Glu Arg Phe His Gly Val Ile Ile Gly Ala Gly Ala Tyr
290 295 300
Thr Thr Glu Lys Ala Glu Asn Leu Ile Glu Lys Gly Leu Ile Asp Ala
305 310 315 320
Val Ala Phe Gly Arg Asp Phe Ile Ala Asn Pro Asp Leu Val Val Arg
325 330 335
Leu Lys Asn Lys Ala Ala Leu Asn Pro Gln Arg Pro Glu Ser Phe Tyr
340 345 350
Gly Gly Gly Ala Glu Gly Tyr Thr Asp Tyr Pro Ser Leu
355 360 365
<210> 3
<211> 1062
<212> DNA
<213> 约克氏菌(Yokenella sp.)
<400> 3
atgtctatta taaaaagcta tgccgcaaaa gaggcgggca gcgaactcga actttacgaa 60
tatgatgccg gtgaactcag gccggaagat gtcgaggtgc aggtcgacta ctgcggtatc 120
tgccattccg atctttccat gatcgacaac gaatggggat tctctcagta tccgctggtt 180
gccgggcatg aagtgattgg ccgcgtggcg gcgctcggca gtgcggcgca ggaaaaaggg 240
gtgaaagttg gtcagcgcgt gggcgtaggc tggacggcgc gcagctgtgg gcattgcgat 300
gcatgtatca gcggtaatca gattaactgc ctggaaggcg ccgtagccac cattctcaac 360
cgtggcggtt ttgccgagaa actgcgggca gactggcagt gggtgatccc gcttccggag 420
agcatcgata ttgagtcggc aggtcctctg ttatgcggcg gtattacggt ttttaaacct 480
ctgctgatgc accacatcac cgcgaccagt cgcgtggggg tgatcggcat cggcggtctt 540
gggcacattg ccattaaact gttgcacgca atgggctgtg aagtgaccgc attcagctcg 600
aatccgtcga aagaacagga agtgctggca atgggggcgg ataaagtcgt gaacagtcgc 660
gatccagacg cgttaaatgc gctggcaggc cagtttgatc tcattatcaa caccgttaat 720
gtcgacctcg actggcagcc ctactttgaa gcgctggcct atggcggcca tttccacacc 780
gtcggcgcag tgatgaagcc gctgccggtt ccggcgttta cattgattgc tggcgatcgc 840
agcatctccg gctcagcaac cggtacgccc tatgagctgc gcaaattgat gaagtttgcc 900
gggcgcagca aggtctcgcc gacgacagag ctgttcccaa tgtcgcaaat caacgaagcc 960
atccagcacg ttcgcgacgg caaagcgcgt taccgcgtgg tactgcaagc cgacttttga 1020
aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact ga 1062
<210> 4
<211> 339
<212> PRT
<213> 约克氏菌(Yokenella sp.)
<400> 4
Met Ser Ile Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Ser Glu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Gly Glu Leu Arg Pro Glu Asp Val Glu
20 25 30
Val Gln Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile
35 40 45
Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu
50 55 60
Val Ile Gly Arg Val Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Glu Lys Gly
65 70 75 80
Val Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys
85 90 95
Gly His Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Leu Glu
100 105 110
Gly Ala Val Ala Thr Ile Leu Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu
115 120 125
Arg Ala Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Ser Ile Asp Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro
145 150 155 160
Leu Leu Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly
165 170 175
Ile Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Met Gly
180 185 190
Cys Glu Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ser Lys Glu Gln Glu Val
195 200 205
Leu Ala Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Asp Ala
210 215 220
Leu Asn Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu Ile Ile Asn Thr Val Asn
225 230 235 240
Val Asp Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu Ala Leu Ala Tyr Gly Gly
245 250 255
His Phe His Thr Val Gly Ala Val Met Lys Pro Leu Pro Val Pro Ala
260 265 270
Phe Thr Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Ile Ser Gly Ser Ala Thr Gly
275 280 285
Thr Pro Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Lys Phe Ala Gly Arg Ser Lys
290 295 300
Val Ser Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met Ser Gln Ile Asn Glu Ala
305 310 315 320
Ile Gln His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg Tyr Arg Val Val Leu Gln
325 330 335
Ala Asp Phe
<210> 5
<211> 786
<212> DNA
<213> 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 5
atgtataaag atctggaagg taaagtggtg gtgattacag gtagcagcac gggtctgggt 60
aaaagcatgg caattcgttt tgcgacggaa aaagcgaaag ttgttgtgaa ttatcgtagc 120
aaagaagatg aagcaaatag cgtgctggaa gaaattaaaa aggtgggtgg tgaagcaatc 180
gcagttaaag gtgatgttac agtggaaagc gatattatta atctggttca gagcgcaatc 240
aaagaatttg gtaaactgga tgttatgatc aacaatgcag gtctggaaaa tccggttccg 300
agtcatgaaa tgagcctgag cgattggaat aaagtgatcg ataccaatct gaccggcgca 360
tttctgggta gccgtgaagc aattaaatat tttgttgaaa acgatatccg tggtaccgtt 420
attaatatgt catctgttca tgaaaaaatt ccgtggccgc tgtttgttca ttatgcagca 480
agcaaaggtg gtatgcgtct gatgaccaaa accctggcac tggaatatgc accgaaaggt 540
attcgtgtta ataatattgg tccgggtgca attaataccc cgattaatgc agaaaaattt 600
gcagatccgg aacagcgtgc agatgttgaa agcatgattc cgatgggtta tattggtgaa 660
ccggaagaaa ttgcagcagt tgcagcatgg ctggcaagca gcgaagcaag ctatgttacc 720
ggtattaccc tgtttgcaga tggtggtatg accctgtatc cgagctttca ggcaggtcgt 780
ggttaa 786
<210> 6
<211> 261
<212> PRT
<213> 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 6
Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala
20 25 30
Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Ile Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Arg Gly Thr Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Arg Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (10)

1.一种三酶共表达重组菌，其特征在于所述共表达重组菌是将老黄酶NemR-PS编码基因、醇脱氢酶YsADH编码基因和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因共同导入宿主细胞构建而成；所述老黄酶NemR-PS编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，醇脱氢酶YsADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述三酶共表达重组菌，其特征在于所述共表达重组菌按如下方法构建：将所述醇脱氢酶YsADH编码基因插入pACYCDuet-1载体上的第一克隆位点Nco I和HindIII之间，将所述老黄酶NemR-PS编码基因插入pACYCDUet-1载体上的第二克隆位点Nde I和Xho I之间，得到第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；将所述葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因插入载体pET28b上的EcoR I和Hind III之间，得到第二重组载体pET28b-BmGDHM6；将第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；然后将第二重组载体pET28b-BmGDHM6导入重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS感受态细胞中，得到所述的共表达重组菌。
3.一种权利要求1所述三酶共表达重组菌在还原(E/Z)-柠檬醛合成(S)-香茅醇中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以共表达重组菌经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以(E/Z)-柠檬醛为底物，以葡萄糖为辅底物，加入助溶剂和/或辅酶NADP+，以pH 5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～45℃、0～700rpm条件下转化反应12～48h，获得含(S)-香茅醇的反应液，反应液分离纯化，获得(S)-香茅醇；所述助溶剂为1-丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或二甲基亚砜。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂加入量以转化体系体积计为10～100g/L；底物加入终浓度以转化体系体积计为50～400mM；所述葡萄糖加入终浓度为底物加入浓度的3倍；所述NADP+加入终浓度以转化体系体积计为0～1.0mM；所述助溶剂体积加入量以转化体系体积计为10～40％。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于在反应过程中，补加含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于湿菌体的补加量以转化体系体积计为20～80g/L，补加的时间点为反应进程的12h、24h或者36h。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述共表达重组菌的湿菌体按如下方法制备：将共表达重组菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体按如下方法制备：将含葡萄糖脱氢酶BmGDHM6编码基因的工程菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分后，减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，得到产物(S)-香茅醇。
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