JP2004154061A - 単環式カロテノイドの合成に有用な遺伝子、および単環式カロテノイドの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】自然界には微量にしか存在しない単環式カロテノイドを大量に生産する手段を提供する。
【解決手段】種々の単環式カロテノイド合成のキーとなるカロテノイドであるγ−カロチンの合成を担う酵素をコードする遺伝子、及び、この遺伝子を導入・発現した微生物を利用したγ−カロチンを始めとする各種単環式カロテノイドの製造法。
【選択図】 なし
【解決手段】種々の単環式カロテノイド合成のキーとなるカロテノイドであるγ−カロチンの合成を担う酵素をコードする遺伝子、及び、この遺伝子を導入・発現した微生物を利用したγ−カロチンを始めとする各種単環式カロテノイドの製造法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の単環式カロテノイド合成のキーとなるカロテノイドであるγ（ガンマ）−カロチン（γ−カロテン、γ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）の合成を担う酵素をコードする遺伝子、及び、この遺伝子を導入・発現した微生物を利用したγ−カロチンを始めとする各種単環式カロテノイドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ、カロチノイドとも呼ばれる）とは、通常炭素鎖が４０のイソプレン骨格からなる自然界に豊富に存在する色素の総称である。現在までに６００種以上のカロテノイドが単離されている（Ｐｆａｎｄｅｒ， Ｈ．， ｅｄ．， Ｋｅｙ ｔｏ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， １９８７）。最近ではカロテノイドの持つ種々の癌（がん）に対する予防効果が注目されており、数多くの報告がなされている（たとえば、西野輔翼、村越倫明、矢野昌充， Ｆｏｏｄ Ｓｔｙｌｅ ２１， ４， ５３−５５， ２０００； Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ， Ｅ．， Ａｓｃｈｅｒｉｏ， Ａ．， Ｒｉｍｍ， Ｅ． Ｂ．， Ｓｔａｍｐｆｅｒ， Ｍ． Ｊ．， Ｃｏｌｄｉｔｚ， Ｇ． Ａ．， Ｗｉｌｌｅｔ， Ｗ． Ｃ．， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ８７， １７６７−１７７６， １９９５）。
【０００３】
カロテノイドは多様な種類からなるにもかかわらず、現在までに癌の予防試験（ヒト疫学試験、動物投与試験等）に使われてきたカロテノイドの種類はごく限られたものであった。それらのカロテノイドは、β−カロチン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ、β−カロテンとも呼ばれる：化学合成品）、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ、リコピンとも呼ばれる：トマトから抽出）、α−カロチン（α−ｃａｒｏｔｅｎｅ、α−カロテンとも呼ばれる：パーム油から抽出）、ルテイン（ｌｕｔｅｉｎ：マリーゴールドから抽出）、アスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ：オキアミ等から抽出）、フコキサンチン（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ：食用海藻から抽出）等である。これらの色素を用いた癌予防試験の結果、カロテノイドの癌予防効果は、カロテノイドの種類によって異なることが明らかとなってきた。一例として、国立がんセンター研究所の高須賀伸夫らが行ったマウスを用いた実験結果（１９９６年カロテノイド研究談話会報告）を示したい。肺癌（ｄｄｙマウス肺二段階発癌モデル）の発生率は、カロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、リコペンまたはα−カロチン投与マウスが４０％、ルテインまたはアスタキサンチン投与マウスが７０％、β−カロチン投与マウスが１３９％の癌発生率であった（フコキサンチンは未実施）。肝臓癌（マウス自然肝臓癌発癌モデル）の発生率は、同じくカロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、アスタキサンチンまたはフコキサンチン投与マウスが３０％、α−カロチンまたはルテイン投与マウスが５０％、β−カロチン投与マウスが７０％、リコペン投与マウスが１００％の癌発生率であった。皮膚癌（マウス皮膚癌発癌モデル）の発生率は、同じくカロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、フコキサンチンまたはリコペン投与マウスが１０％、アスタキサンチン投与マウスが１００％の癌発生率であった（他のカロテノイドは実施されず）。これら３つの発癌モデルの結果を比較すると、肺癌や皮膚癌の抑制で効果が高かったリコペンの効果が肝臓癌の抑制には効果が無いこと、肝臓癌の抑制で効果が高かったアスタキサンチンの効果が皮膚癌の抑制には効果が無いこと等がわかる。
【０００４】
以上の結果は、６００種類以上あるカロテノイドの中で、実際に動物個体を用いたレベル以上の研究で、癌の予防効果が検討されているものは、高々１０種類に満たないということ、それにもかかわらず、カロテノイドの癌予防効果にはカロテノイドの個性が認められるということを示している。実際に検討されてきたカロテノイドの種類が少ないことの最大の原因は、多量に抽出、精製できるカロテノイドの種類が上記のものに限られているということだと思われる。
【０００５】
上記の問題を解決するための有力な手段として、カロテノイド生合成遺伝子を組み込んだ酵母や大腸菌等で目的とするカロテノイドを多量生産する方法が考えられる。たとえば、キリンビールの三浦らは、本来カロテノイドを生合成できない食用酵母キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）に、カロテノイド生合成遺伝子群を導入・発現させて、アスタキサンチン、β−カロチン、リコペンを０．４〜１．１％合成させるのに成功した（Ｍｉｕｒａ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｓｈｉｍａｄａ， Ｈ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｐ． Ｄ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６４， １２２６−１２２９， １９９８）。この遺伝子組換え法によれば、種々の生合成遺伝子の組み合わせにより、これまで自然界に存在が認められていなかったか、ごく微量しか存在していなかったようなカロテノイドをも多量生産することが可能となる。たとえば、日本医科大学の高市らは、これまでナマズに微量存在しているという報告しかなかったパラシロキサンチン（ｐａｒａｓｉｌｏｘａｎｔｈｉｎ）を組換え大腸菌で主要カロテノイド産物として生産した（Ｔａｋａｉｃｈｉ， Ｓ．， Ｓａｎｄｍａｎｎ， Ｇ．， Ｓｃｈｎｕｒｒ， Ｇ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ａ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４１， ２９１−２９６， １９９６）。また、今まで自然界に報告が無かった“非天然型”のカロテノイドであるアスタキサンチン−β−ジグルコシド（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ−β−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を組換え大腸菌で合成させたという報告もある（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｓｈｉｚｕｒｉ， Ｙ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄ． Ｌｅｔｔ．， ３９， ３７０９−３７１２， １９９８）。これらの例は、両端が環化された（β−イオノン環を持つ）カロテノイドであるが、両端が直鎖のままの非環式カロテノイドの例もある。たとえば、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ大学のＡｌｂｒｅｃｈｔらは、今まで自然界に報告が無かった非環式カロテノイドである１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン（１，１’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，４，３’，４’−ｔｅｔｒａｄｅｈｙｄｒｏｌｙｃｏｐｅｎｅ）を組換え大腸菌に作らせている（Ａｌｂｒｅｃｈｔ， Ｍ．， Ｔａｋａｉｃｈｉ， Ｓ．， Ｓｔｅｉｇｅｒ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｚ． −Ｙ．， Ｓａｎｄｍａｎｎ， Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８， ８４３−８４６， ２０００）。
【０００６】
各種のカロテノイド生産用組換え微生物の作製に最も広く利用されてきたカロテノイド生合成遺伝子は、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌（エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）等）由来のものである。エルウィニア属細菌から取得された遺伝子は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＸ の６遺伝子であり、これらの遺伝子がコードする生合成酵素（ＣｒｔＥ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＸ）の機能は図１に示されている（非特許文献１参照）。アスタキサンチンを生合成させたい場合は、さらに、海洋細菌であるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌［Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＭＢＩＣ０１１４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）等］由来のｃｒｔＺ とｃｒｔＷ 遺伝子が使われている（図１）。エルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ遺伝子を導入・発現させた大腸菌はβ−カロチンを合成するが、これにさらに海洋細菌由来のｃｒｔＺ とｃｒｔＷ 遺伝子を導入・発現させると、その組換え大腸菌はアスタキサンチンを合成するようになる。さらに、このアスタキサンチンを合成する大腸菌にエルウィニア属細菌のｃｒｔＸ遺伝子を導入・発現させると、その組換え大腸菌は“非天然型”のアスタキサンチン−β−ジグルコシドを合成するようになる（図１）。
【０００７】
１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペンのような非環式カロテノイドを合成させる場合は、環化酵素遺伝子であるｃｒｔＹ遺伝子は使わずに、リコペンなどの直鎖状カロテノイドを作らせた大腸菌への導入・発現用に、光合成細菌であるロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ 等）由来の直鎖上カロテノイド修飾酵素遺伝子であるｃｒｔＣ（１’−ヒドラーゼ）、ｃｒｔＤ（３’，４’−デサチュラーゼ）遺伝子などが使用されている。
【０００８】
以上述べてきたように、自然界に存在量が限られているか存在が確認されていなかった“非天然型”のカロテノイドを大腸菌等の微生物に多量生産させるために、カロテノイド生合成遺伝子を利用することが可能であることが示されつつある。しかしながら、この生物工学的方法により現在までに合成されたカロテノイドはいずれも、両端が環化されたカロテノイド（たとえば、アスタキサンチン−β−ジグルコシド、パラシロキサンチン等）か、両端とも環化されない非環式カロテノイド（たとえば、１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン等）のどちらかであった。
【０００９】
一方のみが環化した単環式カロテノイドであるγ−カロチンはパーム油に含まれていることが知られているが、γ−カロチンの含量はパーム油に含まれる全カロテノイドの数％に過ぎなく、多量調製が不可能であった。パーム油カロチンには、６０〜７０％のβ−カロチン、３０〜４０％のα−カロチン、数％のγ−カロチン、リコペンが含まれる。パーム油カロチンには肺癌や肝臓癌などいくつかの癌に対して優れた予防効果があることが知られてきており、微量のγ−カロチンが効いている可能性が高いとされている（ハイアルファ、食品添加物：パーム油カロチン３０％植物油懸濁液、ライオン（株）パンフレット；京都府立医科大学、西野輔翼教授、私信）。しかしながら、γ−カロチンを始めとした単環式カロテノイドは植物界を始め、自然界には微量にしか存在しなく、多量生産することが不可能であり、したがって、種々の癌予防試験の実施もできなかった。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．，Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， Ｍｉｋｉ， Ｗ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７７， ６５７５−６５８４， １９９５）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、γ−カロチンを合成する酵素遺伝子を取得し、この遺伝子を導入・発現させた組換え微生物を利用した、γ−カロチンを始めとした単環式カロテノイドの効率的製造法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＣＦＢ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）グループに属する新種の海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ０３３１３）が単環式カロテノイドのミキソール（ｍｙｘｏｌ）を作ることができ、両端が環化されたカロテノイドの合成が全く確認されないことに着目した。鋭意研究を重ねた結果、本海洋細菌より、リコペンからγ−カロチンを合成する環化酵素遺伝子を取得することに成功した。また、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からリコペンを合成するのに必要なｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌にさらに、本遺伝子を導入・発現させることにより、組換え大腸菌はγ−カロチンを合成できるようになることを確認した。この際、培養条件によっては、γ−カロチンよりさらに環化反応が進んだβ−カロチンも合成されるが、このβ−カロチン合成を抑えてγ−カロチンの収量を向上させる遺伝子も見出した。
本発明は、以上の知見を基に完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明の第一は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００１４】
本発明の第二は、上記遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物である。
【００１５】
本発明の第三は、上記遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子を含む微生物に導入して得られる微生物である。
【００１６】
本発明の第四は、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子を、上記微生物（本発明の第二または第三の微生物）にさらに導入して得られる微生物である。
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド、
（ｆ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド。
【００１７】
本発明の第五は、上記微生物を培地に培養して培養物又は菌体から単環式カロテノイドを得ることを特徴とする、単環式カロテノイドの製造法である。
【００１８】
本発明の第六は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子源の海洋細菌フラボバクテリウム属Ａ９９−３株
目的とする遺伝子の供給源となった海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ ０３３１３）は、パラオ海域のカイメン（Ｈｏｍａｘｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）から分離されたものである。本海洋細菌が作るカロテノイドはミキソールであることが、（株）海洋バイオテクノロジー研究所の横山と幹により同定された。この成果は、平成５年１０月１５日に「ミクソールの製造法およびその用途」として特許出願されている（特開平７−１０７９９３号公報）。また、本菌は、平成５年１０月１２日に寄託されている（寄託番号 Ｐ−１３９０３）。また、本海洋細菌は、ミキソールを生産するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｐ９９−３として論文発表されている（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ，Ｍｉｋｉ， Ｗ．， Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉ．， ６１， ６８４−６８６， １９９５；ここで言う“Ｐ９９−３”はＡ９９−３と同一菌である）。
【００２０】
（株）海洋バイオテクノロジー研究所で１６Ｓ ｒＤＮＡやｇｙｒＢ遺伝子を利用して、本菌の分類上の位置を検討したところ、本菌はＣＦＢ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）グループ内の、新属新種であると考えられた（未発表データ）。最も近い属は、南極等から単離された好冷細菌であるサイコロフレクサス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ）属であった（未発表データ）。
【００２１】
２．海洋細菌フラボバクテリウム属Ａ９９−３株におけるミキソール生合成経路の推定
海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株において推定されたミキソールの生合成経路を図２に示した。リコペンまでの生合成経路はエルウィニア属細菌の経路と同じであると考えられる。次の環化酵素リコペンβ−モノシクラーゼ（ｌｙｃｏｐｅｎｅ β−ｍｏｎｏｃｙｃｌａｓｅ；ＣｒｔＹ−γと呼ぶ）が本菌では独特で、リコペンの片方のみを環化してγ−カロチンを作ると思われる。次にエルウィニア属細菌のｃｒｔＺに相当する遺伝子が働くと、３−ヒドロキシ‐γ−カロチン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−γ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）が生成すると考えられる。γ−カロチンにロドバクター属細菌のｃｒｔＣ（１’−ヒドラーゼ；１’−ｈｙｄｏｌａｓｅ）とｃｒｔＤ（３’４’−デサチュラーゼ；３’４’−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子が働くと、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール（３’４’−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ−１’２’−ｄｉｈｙｄｒｏ−β，ψ−ｃａｒｏｔｅｎ−１’−ｏｌ）が生成すると考えられる。γ−カロチンに、これら３種類の酵素ＣｒｔＺ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤと、２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）等が連続的に働くと、最終産物であるミキソールが生成されると考えられる。
【００２２】
３．環化酵素リコペンβ−モノシクラーゼをコードする遺伝子（本発明の遺伝子）
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードするものである。（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００２３】
（ａ）のペプチドは、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から得られたリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有する３７７個のアミノ酸配列からなるペプチド（ＣｒｔＹ−γとも呼ぶ）である。
【００２４】
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０， ６４８７−６５００， １９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内である。
【００２５】
（ｃ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、更に好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、配列番号１記載の塩基配列により表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
【００２６】
本発明の遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株のコスミドライブラリーを作製し、エルウィニア・ウレドボラ等のエルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌宿主（赤色）に感染させる。感染させた後、大腸菌の色がやや黄色がかった赤色を示すコロニーを選び、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、γ−カロチン、またはその代謝物の単環式カロテノイドを作る菌を探すことにより、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
４．リコペンβ−モノシクラーゼの活性を増強する遺伝子
以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子を本発明のリコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子とともに微生物に導入し発現させると、γ−カロチンを始めとする単環式カロテノイドの収率を上げることができる。（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド、（ｆ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド。
【００２８】
（ｄ）のペプチドは、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から得られたリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する２３９個のアミノ酸配列からなるペプチド（ＣｒｔＡと呼ぶ）である。
【００２９】
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、リコペンβ−モノシクラーゼ活性の増強能を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、リコペンβ−モノシクラーゼ活性の増強能を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１２アミノ酸以内であり、更に好ましくは６アミノ酸以内であり、最も好ましくは３アミノ酸以内である。
【００３０】
（ｆ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は上述の通りである。
【００３１】
上記遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株のコスミドライブラリーを作製し、エルウィニア・ウレドボラ等のエルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌宿主（赤色）に感染させる。感染させた後、大腸菌の色がやや黄色がかった赤色を示すコロニーを選び、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、γ−カロチン、またはその代謝物の単環式カロテノイドを作る菌を探すことにより、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３２】
５．単環式カロテノイドの製造法
本発明の単環式カロテノイドの製造法は、本発明の遺伝子等を、微生物に導入し、この微生物を培地に培養して培養物又は菌体から単環式カロテノイドを得ることを特徴とするものである。ここで、単環式カロテノイドとは、一方の末端のみが環化しているカロテノイドをいい、例えば、γ−カロチン、３−ヒドロキシ−γ−カロチン、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール、ミキソールなどがこれに含まれる。
【００３３】
微生物には、本発明の遺伝子だけでなく、他のカロテノイド生合成遺伝子も導入するが、微生物がもともと他のカロテノイド生合成遺伝子を含むものである場合には、その必要はない。ただし、もともと他のカロテノイド生合成遺伝子を持つ微生物がβ−カロチンまたはその代謝物を作っている場合は、自生のリコペン β−シクラーゼ活性を抑える等の工夫が必要になる場合がある。
【００３４】
使用する微生物としては、大腸菌を例示できるが、これ以外の微生物であってもよい。
【００３５】
他のカロテノイド生合成遺伝子は、少なくとも、ＦＰＰまたはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からリコペンを合成するのに必要とされる遺伝子群を含む。このような遺伝子群の具体例としては、ＦＰＰからＧＧＰＰを合成する酵素遺伝子ｃｒｔＥ、２分子のＧＧＰＰからフィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）を合成する遺伝子ｃｒｔＢ、フィトエンからリコペンを合成するｃｒｔＩ 遺伝子（通常、エルウィニア属細菌由来のもの）などを例示できる。
【００３６】
これらの遺伝子群を適当な発現ベクターに導入し、発現させたい微生物に導入すれば、その組換え微生物はリコペンを作るようになる（基質のＦＰＰはすべての微生物が作ることができる。ＧＧＰＰも微生物によっては合成量が少ないものもあるが、すべての微生物が作ることができる。）。そのリコペン産生微生物に、本発明の遺伝子（リコペンβ−モノシクラーゼをコードする遺伝子、ｃｒｔＹ− γ）をさらに導入・発現させれば、その微生物はγ−カロチンを作るようになる。
【００３７】
上記の組換え微生物に更に、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する遺伝子（ｃｒｔＡ）を導入・発現させれば、その微生物はより多くのγ−カロチンを作るようになる。
【００３８】
更に、このような微生物に、ｃｒｔＺ遺伝子を導入・発現させれば、その微生物は３−ヒドロキシ−γ−カロチンを作るようになり、ｃｒｔＣ及びｃｒｔＤ遺伝子を導入すれば、その微生物は、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール作るようになり、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤと、２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（通常、ロドバクター属細菌由来のもの）等を導入・発現させると、その微生物は、最終産物の単環式カロテノイドであるミキソールを作るようになる。
【００３９】
大腸菌や酵母等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． Ｗ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ２００１）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００４０】
【実施例】
［実施例１］菌株、プラスミド、生育条件
本発明に用いられた菌株とプラスミドを表１に示す。菌株の培養は ３０℃でＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ （ＬＢ） 培地 （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９）を用いて行われた。必要に応じて、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ （Ａｐ：１００ μｇ／ｍｌ）またはｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ （Ｃｍ：２０ μｇ／ｍｌ） を培地に加えた。
【００４１】
【表１】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．
Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｘｏｌ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍａｒｉｎｅ ｓｐｏｎｇｅ． Ｆｉｓｈ． Ｓｃｉ． ６１：６８４−６８６．
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｆ． Ｘ． Ｊｒ， Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ， Ｄ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｇａｎｔｔ， Ｅ． ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ， Ｊ． １９９３． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ， ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３２８： １３０−１３８．
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｂｅｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７： ６５７５−６５８４．
【００４２】
［実施例２］遺伝子操作技術
プラスミドの精製はＱＩＡｐｒｅｐ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換等の通常の遺伝子操作実験は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに示された方法により行った。
【００４３】
［実施例３］フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から染色体ＤＮＡの調製
フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ ０３３１３）を１，０００ｍｌのＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ （ＭＢ） 培地（Ｄｉｆｃｏ製）で、２０℃で３日間培養した。菌体を集菌後、ＳＴＥ緩衝液（１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄し、６８℃で１５分間熱処理した後、５ ｍｇ／ｍｌのリゾチームと１００ μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含むＩ液（５０ ｍＭ グルコース、２５ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に懸濁した。３７℃で１時間インキュベートした後、２５０ μｇ／ｍｌになるようにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに、最終濃度が１％になるようにＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ・Ｎａを加え、よく混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。さらに、フェノール／クロロホルム抽出を数回行った後、２倍量のエタノールをゆっくり加えながら、析出してきた染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、７０％エタノールでリンスした後、２ ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解して、染色体ＤＮＡ調製液とした。
【００４４】
［実施例４］コスミドライブラリーの調製
染色体ＤＮＡの調製液からファージ粒子を得るところまでの実験法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｐｅｒＣｏｓ １ Ｃｏｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔの取り扱い説明書に従って行った。すなわち、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から調製した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、コスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ １のＢａｍＨＩ サイトに連結し、ＬＡＭＢＤＡ ＩＮＮ （Ｗａｋｏ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、エルウィニア・ウレドボラ のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を含むリコペン産生用プラスミドｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを保持している大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ株に、そのファージを感染させ、ＡｐとＣｍの両方に耐性のコロニーをＡｐとＣｍを含むＬＢプレート上に１，０００個得た。
【００４５】
［実施例５］リコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子の単離
ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢ（培地成分からリコペンを合成できる遺伝子を含む）を保持した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ株に、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株のリコペンβ−モノシクラーゼ（ｌｙｃｏｐｅｎｅ β−ｍｏｎｏｃｙｃｌａｓｅ）遺伝子を含むＤＮＡ断片がＳｕｐｅｒＣｏｓ １ ベクターにより導入・発現されていれば、このクローンはリコペンをさらに代謝して、γ−カロチンを作るはずである。リコペンはピンク色を呈するが、γ−カロチンは（オレンジ色を帯びた）黄色を呈するため、プレート上のＡｐとＣｍの両方に耐性の１，０００コロニーから目で見て黄色を帯びたようなコロニーを３００個選んだ。色の変化は不明確であったため、これらの大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いて、フォトダイオードアレー［ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ （ＰＤＡ）］検出を伴った高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った（詳細は実施例８に記載）。ＨＰＬＣの保持時間（３３．１分）と紫外可視吸収スペクトル（λｍａｘ、４３４、４６５、４９４ｎｍ）（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ， １９９７）により、γ−カロチンを生成していると考えられる３クローンを得た。ちなみに、この条件でのリコペン及びβ−カロチンの保持時間はそれぞれ、２３．６分及び４６．６分であった。
【００４６】
３クローンの中の１クローンに含まれていたフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−１株由来の４０ ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＳＣ０６０１と名付け、その後の解析に用いた。
【００４７】
Ｊｅｆｆｒｅｙ， Ｓ． Ｗ．， Ｍａｎｔｏｕｒａ， Ｒ． Ｆ． Ｃ．， ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｓ． Ｗ． （ｅｄｉｔｅｄ）． １９９７． Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ： Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ＵＮＥＳＣＯ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．
【００４８】
［実施例６］ サブクローニングと塩基配列の決定
プラスミドｐＳＣ０６０１の挿入ＤＮＡ断片をいくつかの制限酵素による消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−（Ｔｏｙｏｂｏ）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。これらの大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いて、実施例８のＨＰＬＣ分析により、いくつかのクローンに活性があることを確認した。そのうちの１つである、４．７ ｋｂの ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位に挿入されたプラスミドをｐＢＳ０６０３と名づけ、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） と ｍｏｄｅｌ ３７００ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） を付属のプロトコールに従って用いＤＮＡ断片（４．７ ｋｂ）の塩基配列を両方向決定した。決定された塩基配列はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ， ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解析し、確定したＯＲＦのホモロジー検索はＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９９０）によって行った。
【００４９】
その結果、リコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ− γ）であると考えられる、３７７個のアミノ酸配列をコードする１１３４ ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。この遺伝子にコードされる３７７個のアミノ酸配列は、既存のパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＢＩＣ０１１４３株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）やエルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）等のリコペンβ−シクラーゼ（ＣｒｔＹ：リコペンの両端を環化する酵素）（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ， １９９５）とアミノ酸配列全体にわたって相同性を有していたが、相同性の程度は低かった。すなわち、このフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−１株のリコペンβ−モノシクラーゼ（ＣｒｔＹ−γ）は、パラコッカス属ＭＢＩＣ０１１４３株、及びエルウィニア・ウレドボラのリコペン β−シクラーゼ（ＣｒｔＹ）とそれぞれ、２２％及び１９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
【００５０】
更に、上記のリコペンβ−モノシクラーゼ（ｃｒｔＹ− γ）遺伝子の隣に、２３９個のアミノ酸配列をコードする７２０ ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。この遺伝子にコードされる２３９個のアミノ酸配列は、既存のロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等のＣｒｔＡ［２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）］（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ， １９８９）とアミノ酸配列全体にわたって相同性を有していた。これが、今回、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する遺伝子として発見されたものである。
【００５１】
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ． １９９０． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５５０９−５５１３．
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７： ６５７５−６５８４．
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｇ． Ａ．， Ａｌｂｅｒｔｉ， Ｍ．， Ｌｅａｃｈ， Ｆ．， ａｎｄ Ｈｅａｒｓｔ， Ｊ． Ｅ． １９８９． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１６： ２５４−２６８．
【００５２】
［実施例７］ 色素分析用プラスミドの作製
実施例６で得られたプラスミドｐＢＳ０６０３を材料として用いて、色素分析用に次の２種類のプラスミドを作製した。
ｐＢＳ０６０３から１．５４ ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ断片を除き、代わりに、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（ＢａｍＨＩ末端側は平滑）（Ｔａｋａｒａ）を挿入したプラスミドを作製し、ｐＢＳ０６０３ｄＤＯと名付けた。本プラスミドには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−ベクターに、フラボバクテリウムＡ９９−３株のｃｒｔＹ− γとｃｒｔＡの２遺伝子が挿入されている。次に、リコペンβ−モノシクラーゼ（ｃｒｔＹ− γ）遺伝子のみを大腸菌で発現させるためのプラスミド（ｐＧ０６０４）を以下のようにして作製した。オリゴヌクレオチド５’ ＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴ ３’と５’ ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧ ３’を用いて、プラスミドｐＳＣ０６０１を鋳型としてｃｒｔＹ− γ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、得られた増幅物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製）に、このベクターの取り扱い説明書に従ってクローン化して作製した。ＰＣＲは、９４°Ｃで１０分間の加熱後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分を繰り返し４０回行い、最後に７２℃で１０分間伸長反応を行った。
【００５３】
［実施例８］ 大腸菌に蓄積されたカロテノイドの抽出と解析
プラスミド ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）はリコペンを細胞内に蓄積する。 ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢ とＳｕｐｅｒＣｏｓ １ によるコスミドを含む 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ、またはｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−によりサブクローンされたプラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９、またはｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとｐＧ０６０４を含む大腸菌ＪＭ１０９は、ＣｍとＡｐ を含むＬＢ 培地で２日間、３０℃で振盪培養された（１００ ｒｐｍ）。そして、培養液から菌体を集菌し、アセトンを加え、室温で３０分間撹拌した。抽出液を１４，０００ ｘ ｇで５ 分間（４°Ｃ）遠心し， カロテノイド色素抽出液である上澄み液をＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ製）分析にかけた。条件は、２５°Ｃ で逆相カラム（３．９ ｘ３００ ｍｍ， Ｎｏｖａ−ｐａｋ ＨＲ ６ μｍ Ｃ１８； Ｗａｔｅｒｓ製）を用い、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）−メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）− ２−プロパノール（２−ｐｒｏｐａｎｏｌ）（９０：６：４）で、１ ｍｌ／ｍｉｎの速さで展開し、Ｗａｔｅｒｓ ｍｏｄｅｌ ２９９６ ＰＤＡ 検出器によりモニターした。
【００５４】
プラスミドｐＢＳ０６０３ｄＤＯ（ｃｒｔＹ− γとｃｒｔＡを含む）またはｐＧ０６０４（ｃｒｔＹ− γを含む）がｐＡＣＣＲＴ‐ＥＩＢとともに導入された大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いてＨＰＬＣ分析を行った。その結果、両者のカロテノイド総量はほぼ同じであったが、前者が８５％のγ−カロチンと１５％のβ−カロチンを合成していたのに対して、後者は４０％のγ−カロチンと６０％のβ−カロチンを合成したことが明らかとなった（γ−カロチンの同定は実施例９参照）。なお、両者とも基質のリコペンはほとんど残っていなかった。以上の結果から、ＣｒｔＹ−γはリコペンからγ−カロチンを作るが、培養条件によっては、生成したγ−カロチンの一部をβ−カロチンにまで変換することがわかった。また、ＣｒｔＡがＣｒｔＹ−γと共存すると、γ−カロチンの合成量が増えたことから、フラボバクテリウムＡ９９−３株のＣｒｔＡはリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強することがわかった。なお、上記のｃｒｔＹ− γ遺伝子の変わりに、エルウィニア属細菌のｃｒｔＹ遺伝子をｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとともに用いると、上記と同等の条件では、ほぼ１００％のβ−カロチンが得られ、γ−カロチンは得られない。
【００５５】
［実施例９］ γ−カロチンの同定
プラスミドｐＢＳ０６０３ｄＤＯを、ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、Ａｐ及びＣｍを含むＬＢ培地２，０００ ｍｌで３０℃、２日間培養した（１００ ｒｐｍ）。培養液から集菌した菌体を、３００ ｍｌのアセトンにより抽出した。これを濃縮後、２００ ｍｌのへキサンにより２回抽出した。さらに、へキサン層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、へキサン−酢酸エチル（５０：１）で展開溶出することにより、γ−カロチンと考えられる純品を１ ｍｇ得た。
【００５６】
本物質による紫外−可視吸収スペクトル、ＦＤ−ＭＳスペクトル（日立二重収束質量分析計 Ｍ−２５００）（ｍ／ｅ ５３６）、及び１Ｈ−ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＪＥＯＬα）スペクトルにより、本品はγ−カロチン（β，ψ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）と同定された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、自然界には微量にしか存在しない単環式カロテノイドを大量に生産することが可能になる。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】エルウィニア属細菌およびパラコッカス属細菌における各種カロテノイド合成遺伝子の機能と生合成経路を示す図。
【図２】海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株における各種カロテノイド合成遺伝子の機能と推定されたカロテノイドの生合成経路を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の単環式カロテノイド合成のキーとなるカロテノイドであるγ（ガンマ）−カロチン（γ−カロテン、γ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）の合成を担う酵素をコードする遺伝子、及び、この遺伝子を導入・発現した微生物を利用したγ−カロチンを始めとする各種単環式カロテノイドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ、カロチノイドとも呼ばれる）とは、通常炭素鎖が４０のイソプレン骨格からなる自然界に豊富に存在する色素の総称である。現在までに６００種以上のカロテノイドが単離されている（Ｐｆａｎｄｅｒ， Ｈ．， ｅｄ．， Ｋｅｙ ｔｏ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， １９８７）。最近ではカロテノイドの持つ種々の癌（がん）に対する予防効果が注目されており、数多くの報告がなされている（たとえば、西野輔翼、村越倫明、矢野昌充， Ｆｏｏｄ Ｓｔｙｌｅ ２１， ４， ５３−５５， ２０００； Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ， Ｅ．， Ａｓｃｈｅｒｉｏ， Ａ．， Ｒｉｍｍ， Ｅ． Ｂ．， Ｓｔａｍｐｆｅｒ， Ｍ． Ｊ．， Ｃｏｌｄｉｔｚ， Ｇ． Ａ．， Ｗｉｌｌｅｔ， Ｗ． Ｃ．， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ８７， １７６７−１７７６， １９９５）。
【０００３】
カロテノイドは多様な種類からなるにもかかわらず、現在までに癌の予防試験（ヒト疫学試験、動物投与試験等）に使われてきたカロテノイドの種類はごく限られたものであった。それらのカロテノイドは、β−カロチン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ、β−カロテンとも呼ばれる：化学合成品）、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ、リコピンとも呼ばれる：トマトから抽出）、α−カロチン（α−ｃａｒｏｔｅｎｅ、α−カロテンとも呼ばれる：パーム油から抽出）、ルテイン（ｌｕｔｅｉｎ：マリーゴールドから抽出）、アスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ：オキアミ等から抽出）、フコキサンチン（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ：食用海藻から抽出）等である。これらの色素を用いた癌予防試験の結果、カロテノイドの癌予防効果は、カロテノイドの種類によって異なることが明らかとなってきた。一例として、国立がんセンター研究所の高須賀伸夫らが行ったマウスを用いた実験結果（１９９６年カロテノイド研究談話会報告）を示したい。肺癌（ｄｄｙマウス肺二段階発癌モデル）の発生率は、カロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、リコペンまたはα−カロチン投与マウスが４０％、ルテインまたはアスタキサンチン投与マウスが７０％、β−カロチン投与マウスが１３９％の癌発生率であった（フコキサンチンは未実施）。肝臓癌（マウス自然肝臓癌発癌モデル）の発生率は、同じくカロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、アスタキサンチンまたはフコキサンチン投与マウスが３０％、α−カロチンまたはルテイン投与マウスが５０％、β−カロチン投与マウスが７０％、リコペン投与マウスが１００％の癌発生率であった。皮膚癌（マウス皮膚癌発癌モデル）の発生率は、同じくカロテノイドを投与しないコントロールマウスを１００％とすると、フコキサンチンまたはリコペン投与マウスが１０％、アスタキサンチン投与マウスが１００％の癌発生率であった（他のカロテノイドは実施されず）。これら３つの発癌モデルの結果を比較すると、肺癌や皮膚癌の抑制で効果が高かったリコペンの効果が肝臓癌の抑制には効果が無いこと、肝臓癌の抑制で効果が高かったアスタキサンチンの効果が皮膚癌の抑制には効果が無いこと等がわかる。
【０００４】
以上の結果は、６００種類以上あるカロテノイドの中で、実際に動物個体を用いたレベル以上の研究で、癌の予防効果が検討されているものは、高々１０種類に満たないということ、それにもかかわらず、カロテノイドの癌予防効果にはカロテノイドの個性が認められるということを示している。実際に検討されてきたカロテノイドの種類が少ないことの最大の原因は、多量に抽出、精製できるカロテノイドの種類が上記のものに限られているということだと思われる。
【０００５】
上記の問題を解決するための有力な手段として、カロテノイド生合成遺伝子を組み込んだ酵母や大腸菌等で目的とするカロテノイドを多量生産する方法が考えられる。たとえば、キリンビールの三浦らは、本来カロテノイドを生合成できない食用酵母キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）に、カロテノイド生合成遺伝子群を導入・発現させて、アスタキサンチン、β−カロチン、リコペンを０．４〜１．１％合成させるのに成功した（Ｍｉｕｒａ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｓｈｉｍａｄａ， Ｈ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｐ． Ｄ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６４， １２２６−１２２９， １９９８）。この遺伝子組換え法によれば、種々の生合成遺伝子の組み合わせにより、これまで自然界に存在が認められていなかったか、ごく微量しか存在していなかったようなカロテノイドをも多量生産することが可能となる。たとえば、日本医科大学の高市らは、これまでナマズに微量存在しているという報告しかなかったパラシロキサンチン（ｐａｒａｓｉｌｏｘａｎｔｈｉｎ）を組換え大腸菌で主要カロテノイド産物として生産した（Ｔａｋａｉｃｈｉ， Ｓ．， Ｓａｎｄｍａｎｎ， Ｇ．， Ｓｃｈｎｕｒｒ， Ｇ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ａ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４１， ２９１−２９６， １９９６）。また、今まで自然界に報告が無かった“非天然型”のカロテノイドであるアスタキサンチン−β−ジグルコシド（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ−β−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を組換え大腸菌で合成させたという報告もある（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｓｈｉｚｕｒｉ， Ｙ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄ． Ｌｅｔｔ．， ３９， ３７０９−３７１２， １９９８）。これらの例は、両端が環化された（β−イオノン環を持つ）カロテノイドであるが、両端が直鎖のままの非環式カロテノイドの例もある。たとえば、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ大学のＡｌｂｒｅｃｈｔらは、今まで自然界に報告が無かった非環式カロテノイドである１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン（１，１’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，４，３’，４’−ｔｅｔｒａｄｅｈｙｄｒｏｌｙｃｏｐｅｎｅ）を組換え大腸菌に作らせている（Ａｌｂｒｅｃｈｔ， Ｍ．， Ｔａｋａｉｃｈｉ， Ｓ．， Ｓｔｅｉｇｅｒ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｚ． −Ｙ．， Ｓａｎｄｍａｎｎ， Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８， ８４３−８４６， ２０００）。
【０００６】
各種のカロテノイド生産用組換え微生物の作製に最も広く利用されてきたカロテノイド生合成遺伝子は、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌（エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）等）由来のものである。エルウィニア属細菌から取得された遺伝子は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＸ の６遺伝子であり、これらの遺伝子がコードする生合成酵素（ＣｒｔＥ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＸ）の機能は図１に示されている（非特許文献１参照）。アスタキサンチンを生合成させたい場合は、さらに、海洋細菌であるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌［Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＭＢＩＣ０１１４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）等］由来のｃｒｔＺ とｃｒｔＷ 遺伝子が使われている（図１）。エルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ遺伝子を導入・発現させた大腸菌はβ−カロチンを合成するが、これにさらに海洋細菌由来のｃｒｔＺ とｃｒｔＷ 遺伝子を導入・発現させると、その組換え大腸菌はアスタキサンチンを合成するようになる。さらに、このアスタキサンチンを合成する大腸菌にエルウィニア属細菌のｃｒｔＸ遺伝子を導入・発現させると、その組換え大腸菌は“非天然型”のアスタキサンチン−β−ジグルコシドを合成するようになる（図１）。
【０００７】
１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペンのような非環式カロテノイドを合成させる場合は、環化酵素遺伝子であるｃｒｔＹ遺伝子は使わずに、リコペンなどの直鎖状カロテノイドを作らせた大腸菌への導入・発現用に、光合成細菌であるロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ 等）由来の直鎖上カロテノイド修飾酵素遺伝子であるｃｒｔＣ（１’−ヒドラーゼ）、ｃｒｔＤ（３’，４’−デサチュラーゼ）遺伝子などが使用されている。
【０００８】
以上述べてきたように、自然界に存在量が限られているか存在が確認されていなかった“非天然型”のカロテノイドを大腸菌等の微生物に多量生産させるために、カロテノイド生合成遺伝子を利用することが可能であることが示されつつある。しかしながら、この生物工学的方法により現在までに合成されたカロテノイドはいずれも、両端が環化されたカロテノイド（たとえば、アスタキサンチン−β−ジグルコシド、パラシロキサンチン等）か、両端とも環化されない非環式カロテノイド（たとえば、１，１’−ジヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン等）のどちらかであった。
【０００９】
一方のみが環化した単環式カロテノイドであるγ−カロチンはパーム油に含まれていることが知られているが、γ−カロチンの含量はパーム油に含まれる全カロテノイドの数％に過ぎなく、多量調製が不可能であった。パーム油カロチンには、６０〜７０％のβ−カロチン、３０〜４０％のα−カロチン、数％のγ−カロチン、リコペンが含まれる。パーム油カロチンには肺癌や肝臓癌などいくつかの癌に対して優れた予防効果があることが知られてきており、微量のγ−カロチンが効いている可能性が高いとされている（ハイアルファ、食品添加物：パーム油カロチン３０％植物油懸濁液、ライオン（株）パンフレット；京都府立医科大学、西野輔翼教授、私信）。しかしながら、γ−カロチンを始めとした単環式カロテノイドは植物界を始め、自然界には微量にしか存在しなく、多量生産することが不可能であり、したがって、種々の癌予防試験の実施もできなかった。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．，Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， Ｍｉｋｉ， Ｗ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７７， ６５７５−６５８４， １９９５）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、γ−カロチンを合成する酵素遺伝子を取得し、この遺伝子を導入・発現させた組換え微生物を利用した、γ−カロチンを始めとした単環式カロテノイドの効率的製造法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＣＦＢ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）グループに属する新種の海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ０３３１３）が単環式カロテノイドのミキソール（ｍｙｘｏｌ）を作ることができ、両端が環化されたカロテノイドの合成が全く確認されないことに着目した。鋭意研究を重ねた結果、本海洋細菌より、リコペンからγ−カロチンを合成する環化酵素遺伝子を取得することに成功した。また、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からリコペンを合成するのに必要なｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌にさらに、本遺伝子を導入・発現させることにより、組換え大腸菌はγ−カロチンを合成できるようになることを確認した。この際、培養条件によっては、γ−カロチンよりさらに環化反応が進んだβ−カロチンも合成されるが、このβ−カロチン合成を抑えてγ−カロチンの収量を向上させる遺伝子も見出した。
本発明は、以上の知見を基に完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明の第一は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００１４】
本発明の第二は、上記遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物である。
【００１５】
本発明の第三は、上記遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子を含む微生物に導入して得られる微生物である。
【００１６】
本発明の第四は、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子を、上記微生物（本発明の第二または第三の微生物）にさらに導入して得られる微生物である。
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド、
（ｆ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド。
【００１７】
本発明の第五は、上記微生物を培地に培養して培養物又は菌体から単環式カロテノイドを得ることを特徴とする、単環式カロテノイドの製造法である。
【００１８】
本発明の第六は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子源の海洋細菌フラボバクテリウム属Ａ９９−３株
目的とする遺伝子の供給源となった海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ ０３３１３）は、パラオ海域のカイメン（Ｈｏｍａｘｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）から分離されたものである。本海洋細菌が作るカロテノイドはミキソールであることが、（株）海洋バイオテクノロジー研究所の横山と幹により同定された。この成果は、平成５年１０月１５日に「ミクソールの製造法およびその用途」として特許出願されている（特開平７−１０７９９３号公報）。また、本菌は、平成５年１０月１２日に寄託されている（寄託番号 Ｐ−１３９０３）。また、本海洋細菌は、ミキソールを生産するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｐ９９−３として論文発表されている（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ，Ｍｉｋｉ， Ｗ．， Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉ．， ６１， ６８４−６８６， １９９５；ここで言う“Ｐ９９−３”はＡ９９−３と同一菌である）。
【００２０】
（株）海洋バイオテクノロジー研究所で１６Ｓ ｒＤＮＡやｇｙｒＢ遺伝子を利用して、本菌の分類上の位置を検討したところ、本菌はＣＦＢ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）グループ内の、新属新種であると考えられた（未発表データ）。最も近い属は、南極等から単離された好冷細菌であるサイコロフレクサス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ）属であった（未発表データ）。
【００２１】
２．海洋細菌フラボバクテリウム属Ａ９９−３株におけるミキソール生合成経路の推定
海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株において推定されたミキソールの生合成経路を図２に示した。リコペンまでの生合成経路はエルウィニア属細菌の経路と同じであると考えられる。次の環化酵素リコペンβ−モノシクラーゼ（ｌｙｃｏｐｅｎｅ β−ｍｏｎｏｃｙｃｌａｓｅ；ＣｒｔＹ−γと呼ぶ）が本菌では独特で、リコペンの片方のみを環化してγ−カロチンを作ると思われる。次にエルウィニア属細菌のｃｒｔＺに相当する遺伝子が働くと、３−ヒドロキシ‐γ−カロチン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−γ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）が生成すると考えられる。γ−カロチンにロドバクター属細菌のｃｒｔＣ（１’−ヒドラーゼ；１’−ｈｙｄｏｌａｓｅ）とｃｒｔＤ（３’４’−デサチュラーゼ；３’４’−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子が働くと、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール（３’４’−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ−１’２’−ｄｉｈｙｄｒｏ−β，ψ−ｃａｒｏｔｅｎ−１’−ｏｌ）が生成すると考えられる。γ−カロチンに、これら３種類の酵素ＣｒｔＺ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤと、２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）等が連続的に働くと、最終産物であるミキソールが生成されると考えられる。
【００２２】
３．環化酵素リコペンβ−モノシクラーゼをコードする遺伝子（本発明の遺伝子）
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードするものである。（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
【００２３】
（ａ）のペプチドは、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から得られたリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有する３７７個のアミノ酸配列からなるペプチド（ＣｒｔＹ−γとも呼ぶ）である。
【００２４】
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０， ６４８７−６５００， １９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内である。
【００２５】
（ｃ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、更に好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、配列番号１記載の塩基配列により表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
【００２６】
本発明の遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株のコスミドライブラリーを作製し、エルウィニア・ウレドボラ等のエルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌宿主（赤色）に感染させる。感染させた後、大腸菌の色がやや黄色がかった赤色を示すコロニーを選び、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、γ−カロチン、またはその代謝物の単環式カロテノイドを作る菌を探すことにより、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
４．リコペンβ−モノシクラーゼの活性を増強する遺伝子
以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子を本発明のリコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子とともに微生物に導入し発現させると、γ−カロチンを始めとする単環式カロテノイドの収率を上げることができる。（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド、（ｆ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド。
【００２８】
（ｄ）のペプチドは、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から得られたリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する２３９個のアミノ酸配列からなるペプチド（ＣｒｔＡと呼ぶ）である。
【００２９】
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、リコペンβ−モノシクラーゼ活性の増強能を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、リコペンβ−モノシクラーゼ活性の増強能を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１２アミノ酸以内であり、更に好ましくは６アミノ酸以内であり、最も好ましくは３アミノ酸以内である。
【００３０】
（ｆ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は上述の通りである。
【００３１】
上記遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株のコスミドライブラリーを作製し、エルウィニア・ウレドボラ等のエルウィニア属細菌のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を導入・発現させた大腸菌宿主（赤色）に感染させる。感染させた後、大腸菌の色がやや黄色がかった赤色を示すコロニーを選び、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、γ−カロチン、またはその代謝物の単環式カロテノイドを作る菌を探すことにより、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３２】
５．単環式カロテノイドの製造法
本発明の単環式カロテノイドの製造法は、本発明の遺伝子等を、微生物に導入し、この微生物を培地に培養して培養物又は菌体から単環式カロテノイドを得ることを特徴とするものである。ここで、単環式カロテノイドとは、一方の末端のみが環化しているカロテノイドをいい、例えば、γ−カロチン、３−ヒドロキシ−γ−カロチン、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール、ミキソールなどがこれに含まれる。
【００３３】
微生物には、本発明の遺伝子だけでなく、他のカロテノイド生合成遺伝子も導入するが、微生物がもともと他のカロテノイド生合成遺伝子を含むものである場合には、その必要はない。ただし、もともと他のカロテノイド生合成遺伝子を持つ微生物がβ−カロチンまたはその代謝物を作っている場合は、自生のリコペン β−シクラーゼ活性を抑える等の工夫が必要になる場合がある。
【００３４】
使用する微生物としては、大腸菌を例示できるが、これ以外の微生物であってもよい。
【００３５】
他のカロテノイド生合成遺伝子は、少なくとも、ＦＰＰまたはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からリコペンを合成するのに必要とされる遺伝子群を含む。このような遺伝子群の具体例としては、ＦＰＰからＧＧＰＰを合成する酵素遺伝子ｃｒｔＥ、２分子のＧＧＰＰからフィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）を合成する遺伝子ｃｒｔＢ、フィトエンからリコペンを合成するｃｒｔＩ 遺伝子（通常、エルウィニア属細菌由来のもの）などを例示できる。
【００３６】
これらの遺伝子群を適当な発現ベクターに導入し、発現させたい微生物に導入すれば、その組換え微生物はリコペンを作るようになる（基質のＦＰＰはすべての微生物が作ることができる。ＧＧＰＰも微生物によっては合成量が少ないものもあるが、すべての微生物が作ることができる。）。そのリコペン産生微生物に、本発明の遺伝子（リコペンβ−モノシクラーゼをコードする遺伝子、ｃｒｔＹ− γ）をさらに導入・発現させれば、その微生物はγ−カロチンを作るようになる。
【００３７】
上記の組換え微生物に更に、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する遺伝子（ｃｒｔＡ）を導入・発現させれば、その微生物はより多くのγ−カロチンを作るようになる。
【００３８】
更に、このような微生物に、ｃｒｔＺ遺伝子を導入・発現させれば、その微生物は３−ヒドロキシ−γ−カロチンを作るようになり、ｃｒｔＣ及びｃｒｔＤ遺伝子を導入すれば、その微生物は、３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，ψ−カロチン−１’−オール作るようになり、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤと、２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（通常、ロドバクター属細菌由来のもの）等を導入・発現させると、その微生物は、最終産物の単環式カロテノイドであるミキソールを作るようになる。
【００３９】
大腸菌や酵母等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． Ｗ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ２００１）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００４０】
【実施例】
［実施例１］菌株、プラスミド、生育条件
本発明に用いられた菌株とプラスミドを表１に示す。菌株の培養は ３０℃でＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ （ＬＢ） 培地 （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９）を用いて行われた。必要に応じて、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ （Ａｐ：１００ μｇ／ｍｌ）またはｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ （Ｃｍ：２０ μｇ／ｍｌ） を培地に加えた。
【００４１】
【表１】
Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｘｏｌ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍａｒｉｎｅ ｓｐｏｎｇｅ． Ｆｉｓｈ． Ｓｃｉ． ６１：６８４−６８６．
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｆ． Ｘ． Ｊｒ， Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ， Ｄ．， Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｇａｎｔｔ， Ｅ． ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ， Ｊ． １９９３． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ， ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３２８： １３０−１３８．
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｂｅｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７： ６５７５−６５８４．
【００４２】
［実施例２］遺伝子操作技術
プラスミドの精製はＱＩＡｐｒｅｐ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換等の通常の遺伝子操作実験は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに示された方法により行った。
【００４３】
［実施例３］フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から染色体ＤＮＡの調製
フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株（ＭＢＩＣ ０３３１３）を１，０００ｍｌのＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ （ＭＢ） 培地（Ｄｉｆｃｏ製）で、２０℃で３日間培養した。菌体を集菌後、ＳＴＥ緩衝液（１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄し、６８℃で１５分間熱処理した後、５ ｍｇ／ｍｌのリゾチームと１００ μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含むＩ液（５０ ｍＭ グルコース、２５ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に懸濁した。３７℃で１時間インキュベートした後、２５０ μｇ／ｍｌになるようにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに、最終濃度が１％になるようにＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ・Ｎａを加え、よく混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。さらに、フェノール／クロロホルム抽出を数回行った後、２倍量のエタノールをゆっくり加えながら、析出してきた染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、７０％エタノールでリンスした後、２ ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解して、染色体ＤＮＡ調製液とした。
【００４４】
［実施例４］コスミドライブラリーの調製
染色体ＤＮＡの調製液からファージ粒子を得るところまでの実験法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｐｅｒＣｏｓ １ Ｃｏｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔの取り扱い説明書に従って行った。すなわち、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株から調製した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、コスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ １のＢａｍＨＩ サイトに連結し、ＬＡＭＢＤＡ ＩＮＮ （Ｗａｋｏ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、エルウィニア・ウレドボラ のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ 遺伝子を含むリコペン産生用プラスミドｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを保持している大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ株に、そのファージを感染させ、ＡｐとＣｍの両方に耐性のコロニーをＡｐとＣｍを含むＬＢプレート上に１，０００個得た。
【００４５】
［実施例５］リコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子の単離
ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢ（培地成分からリコペンを合成できる遺伝子を含む）を保持した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ株に、フラボバクテリウム属Ａ９９−３株のリコペンβ−モノシクラーゼ（ｌｙｃｏｐｅｎｅ β−ｍｏｎｏｃｙｃｌａｓｅ）遺伝子を含むＤＮＡ断片がＳｕｐｅｒＣｏｓ １ ベクターにより導入・発現されていれば、このクローンはリコペンをさらに代謝して、γ−カロチンを作るはずである。リコペンはピンク色を呈するが、γ−カロチンは（オレンジ色を帯びた）黄色を呈するため、プレート上のＡｐとＣｍの両方に耐性の１，０００コロニーから目で見て黄色を帯びたようなコロニーを３００個選んだ。色の変化は不明確であったため、これらの大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いて、フォトダイオードアレー［ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ （ＰＤＡ）］検出を伴った高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った（詳細は実施例８に記載）。ＨＰＬＣの保持時間（３３．１分）と紫外可視吸収スペクトル（λｍａｘ、４３４、４６５、４９４ｎｍ）（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ， １９９７）により、γ−カロチンを生成していると考えられる３クローンを得た。ちなみに、この条件でのリコペン及びβ−カロチンの保持時間はそれぞれ、２３．６分及び４６．６分であった。
【００４６】
３クローンの中の１クローンに含まれていたフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−１株由来の４０ ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＳＣ０６０１と名付け、その後の解析に用いた。
【００４７】
Ｊｅｆｆｒｅｙ， Ｓ． Ｗ．， Ｍａｎｔｏｕｒａ， Ｒ． Ｆ． Ｃ．， ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｓ． Ｗ． （ｅｄｉｔｅｄ）． １９９７． Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ： Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ＵＮＥＳＣＯ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．
【００４８】
［実施例６］ サブクローニングと塩基配列の決定
プラスミドｐＳＣ０６０１の挿入ＤＮＡ断片をいくつかの制限酵素による消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−（Ｔｏｙｏｂｏ）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。これらの大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いて、実施例８のＨＰＬＣ分析により、いくつかのクローンに活性があることを確認した。そのうちの１つである、４．７ ｋｂの ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位に挿入されたプラスミドをｐＢＳ０６０３と名づけ、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） と ｍｏｄｅｌ ３７００ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） を付属のプロトコールに従って用いＤＮＡ断片（４．７ ｋｂ）の塩基配列を両方向決定した。決定された塩基配列はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ， ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解析し、確定したＯＲＦのホモロジー検索はＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９９０）によって行った。
【００４９】
その結果、リコペンβ−モノシクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ− γ）であると考えられる、３７７個のアミノ酸配列をコードする１１３４ ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。この遺伝子にコードされる３７７個のアミノ酸配列は、既存のパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＢＩＣ０１１４３株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）やエルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）等のリコペンβ−シクラーゼ（ＣｒｔＹ：リコペンの両端を環化する酵素）（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ， １９９５）とアミノ酸配列全体にわたって相同性を有していたが、相同性の程度は低かった。すなわち、このフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−１株のリコペンβ−モノシクラーゼ（ＣｒｔＹ−γ）は、パラコッカス属ＭＢＩＣ０１１４３株、及びエルウィニア・ウレドボラのリコペン β−シクラーゼ（ＣｒｔＹ）とそれぞれ、２２％及び１９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
【００５０】
更に、上記のリコペンβ−モノシクラーゼ（ｃｒｔＹ− γ）遺伝子の隣に、２３９個のアミノ酸配列をコードする７２０ ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。この遺伝子にコードされる２３９個のアミノ酸配列は、既存のロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等のＣｒｔＡ［２’−モノオキシゲナーゼ（２’−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）］（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ， １９８９）とアミノ酸配列全体にわたって相同性を有していた。これが、今回、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強する遺伝子として発見されたものである。
【００５１】
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ． １９９０． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５５０９−５５１３．
Ｍｉｓａｗａ， Ｎ．， Ｓａｔｏｍｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ａ．， Ｋａｊｉｗａｒａ， Ｓ．， Ｓａｉｔｏ， Ｔ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｍｉｋｉ， Ｗ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７： ６５７５−６５８４．
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｇ． Ａ．， Ａｌｂｅｒｔｉ， Ｍ．， Ｌｅａｃｈ， Ｆ．， ａｎｄ Ｈｅａｒｓｔ， Ｊ． Ｅ． １９８９． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１６： ２５４−２６８．
【００５２】
［実施例７］ 色素分析用プラスミドの作製
実施例６で得られたプラスミドｐＢＳ０６０３を材料として用いて、色素分析用に次の２種類のプラスミドを作製した。
ｐＢＳ０６０３から１．５４ ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ断片を除き、代わりに、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（ＢａｍＨＩ末端側は平滑）（Ｔａｋａｒａ）を挿入したプラスミドを作製し、ｐＢＳ０６０３ｄＤＯと名付けた。本プラスミドには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−ベクターに、フラボバクテリウムＡ９９−３株のｃｒｔＹ− γとｃｒｔＡの２遺伝子が挿入されている。次に、リコペンβ−モノシクラーゼ（ｃｒｔＹ− γ）遺伝子のみを大腸菌で発現させるためのプラスミド（ｐＧ０６０４）を以下のようにして作製した。オリゴヌクレオチド５’ ＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴ ３’と５’ ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧ ３’を用いて、プラスミドｐＳＣ０６０１を鋳型としてｃｒｔＹ− γ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、得られた増幅物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製）に、このベクターの取り扱い説明書に従ってクローン化して作製した。ＰＣＲは、９４°Ｃで１０分間の加熱後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分を繰り返し４０回行い、最後に７２℃で１０分間伸長反応を行った。
【００５３】
［実施例８］ 大腸菌に蓄積されたカロテノイドの抽出と解析
プラスミド ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）はリコペンを細胞内に蓄積する。 ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢ とＳｕｐｅｒＣｏｓ １ によるコスミドを含む 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ、またはｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−によりサブクローンされたプラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９、またはｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとｐＧ０６０４を含む大腸菌ＪＭ１０９は、ＣｍとＡｐ を含むＬＢ 培地で２日間、３０℃で振盪培養された（１００ ｒｐｍ）。そして、培養液から菌体を集菌し、アセトンを加え、室温で３０分間撹拌した。抽出液を１４，０００ ｘ ｇで５ 分間（４°Ｃ）遠心し， カロテノイド色素抽出液である上澄み液をＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ製）分析にかけた。条件は、２５°Ｃ で逆相カラム（３．９ ｘ３００ ｍｍ， Ｎｏｖａ−ｐａｋ ＨＲ ６ μｍ Ｃ１８； Ｗａｔｅｒｓ製）を用い、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）−メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）− ２−プロパノール（２−ｐｒｏｐａｎｏｌ）（９０：６：４）で、１ ｍｌ／ｍｉｎの速さで展開し、Ｗａｔｅｒｓ ｍｏｄｅｌ ２９９６ ＰＤＡ 検出器によりモニターした。
【００５４】
プラスミドｐＢＳ０６０３ｄＤＯ（ｃｒｔＹ− γとｃｒｔＡを含む）またはｐＧ０６０４（ｃｒｔＹ− γを含む）がｐＡＣＣＲＴ‐ＥＩＢとともに導入された大腸菌を液体培養し、菌体をアセトン抽出したものを用いてＨＰＬＣ分析を行った。その結果、両者のカロテノイド総量はほぼ同じであったが、前者が８５％のγ−カロチンと１５％のβ−カロチンを合成していたのに対して、後者は４０％のγ−カロチンと６０％のβ−カロチンを合成したことが明らかとなった（γ−カロチンの同定は実施例９参照）。なお、両者とも基質のリコペンはほとんど残っていなかった。以上の結果から、ＣｒｔＹ−γはリコペンからγ−カロチンを作るが、培養条件によっては、生成したγ−カロチンの一部をβ−カロチンにまで変換することがわかった。また、ＣｒｔＡがＣｒｔＹ−γと共存すると、γ−カロチンの合成量が増えたことから、フラボバクテリウムＡ９９−３株のＣｒｔＡはリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強することがわかった。なお、上記のｃｒｔＹ− γ遺伝子の変わりに、エルウィニア属細菌のｃｒｔＹ遺伝子をｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢとともに用いると、上記と同等の条件では、ほぼ１００％のβ−カロチンが得られ、γ−カロチンは得られない。
【００５５】
［実施例９］ γ−カロチンの同定
プラスミドｐＢＳ０６０３ｄＤＯを、ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢを含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、Ａｐ及びＣｍを含むＬＢ培地２，０００ ｍｌで３０℃、２日間培養した（１００ ｒｐｍ）。培養液から集菌した菌体を、３００ ｍｌのアセトンにより抽出した。これを濃縮後、２００ ｍｌのへキサンにより２回抽出した。さらに、へキサン層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、へキサン−酢酸エチル（５０：１）で展開溶出することにより、γ−カロチンと考えられる純品を１ ｍｇ得た。
【００５６】
本物質による紫外−可視吸収スペクトル、ＦＤ−ＭＳスペクトル（日立二重収束質量分析計 Ｍ−２５００）（ｍ／ｅ ５３６）、及び１Ｈ−ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＪＥＯＬα）スペクトルにより、本品はγ−カロチン（β，ψ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）と同定された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、自然界には微量にしか存在しない単環式カロテノイドを大量に生産することが可能になる。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】エルウィニア属細菌およびパラコッカス属細菌における各種カロテノイド合成遺伝子の機能と生合成経路を示す図。
【図２】海洋細菌フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ａ９９−３株における各種カロテノイド合成遺伝子の機能と推定されたカロテノイドの生合成経路を示す図。
Claims (8)
- 以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。 - 請求項１に記載の遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物。
- 請求項１に記載の遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子を含む微生物に導入して得られる微生物。
- 以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子を、請求項２又は３に記載の微生物にさらに導入して得られる微生物：
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド、
（ｆ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を増強するペプチド。 - 請求項２乃至４のいずれか一項に記載の微生物を培地に培養して培養物又は菌体から単環式カロテノイドを得ることを特徴とする、単環式カロテノイドの製造法。
- 微生物が大腸菌である請求項５に記載の単環式カロテノイドの製造法。
- 他のカロテノイド生合成遺伝子が、少なくとも、ファルネシルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸からリコペンを合成するのに必要とされる遺伝子群を含む、請求項５に記載の単環式カロテノイドの製造法。
- 以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつリコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、リコペンβ−モノシクラーゼ活性を有するペプチド。
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