JP4199919B2 - 新規カロテノイド産生細菌種とそれを用いたカロテノイドの生産方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の技術分野と背景）
本発明は新規細菌種に関する。１６ＳリボソームＲＮＡ分析で決定したところ、この新種はＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に最も類似する。しかし、この新規細菌種はその生活環の少なくともいくつかの段階でカロテノイド含有小胞を産生し、盛んに分泌するという、これまでに見られたことのない現象を示すので、この新規細菌種はおそらく新しい属の最初の分離菌に相当するのだろう。さらに本発明は、β−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン（ａｄｏｎｉｒｕｂｉｎ）、シス−アドニキサンチン（ｃｉｓ−ａｄｎｏｉｘａｎｔｈｉｎ）、アドニキサンチン（ａｄｏｎｉｘａｎｔｈｉｎ）、アスタキサンチン、ゼアキサンチンなど（ただしこれらに限らない）のカロテノイドを、それらを産生し分泌する種を使って生産する方法に関する。
本発明のカロテノイドは飼料添加物、食品添加物、化粧品などとして役立つ天然色素である。以下に詳述するように、とりわけアスタキサンチンは、サケ、マス、マダイなどの養殖魚用の飼料添加物（色調改良剤など）として、また安全な天然食品添加物として、産業上有用である。またアドニキサンチンは、その工業的生産方法が確立されれば、食品添加物としても飼料添加物としてもアスタキサンチンと同様に有望である。
またβ−カロテンは食品添加物、飼料添加物、医薬物質などとして使用されている。エチネノンは食品添加物、飼料添加物などとして有望である。カンタキサンチンは食品添加物、飼料添加物として、また化粧品などに使用されている。そしてゼアキサンチンは食品添加物、飼料添加物などとして使用されている。
【０００２】
カロテノイドは生体に見られる黄色、橙色および赤色の多くを担っている天然色素である。カロテノイドは自然界に広く分布し、様々な生体系で主要な生物学的機能を２つ持っている。これらは光合成において集光性色素として働くとともに、これらは光酸化的損傷から防護する。カロテノイドのこのような生物学的機能、それらが持つ重要な産業上の役割、それらの生合成およびそれらを産生する生物について、以下に述べる。
カロテノイドは、集光アンテナの一部として、光子を吸収し、そのエネルギーをクロロフィルに伝達することにより、４５０〜５７０ｎｍの範囲の光の収集を助けることができる［Ｃｏｇｄｅｌｌ ＲＪおよびＦｒａｎｋ ＨＡ（１９８７）「光合成細菌におけるカロテノイドの機能のしかた」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８９５：６３−７９；Ｃｏｇｄｅｌｌ Ｒ（１９８８）「クロロプラストにおける色素の機能」Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷ編「Ｐｌａｎｔ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ・ロンドン）の１８３−２５５頁；Ｆｒａｎｋ ＨＡ、Ｖｉｏｌｅｔｔｅ ＣＡ、Ｔｒａｕｔｍａｎ ＪＫ、Ｓｈｒｅｖｅ ＡＰ、Ｏｗｅｎｓ ＴＧおよびＡｌｂｒｅｃｈｔ ＡＣ（１９９１）「光合成におけるカロテノイド：構造と光化学」Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ Ｃｈｅｍ ６３：１０９−１１４；Ｆｒａｎｋ ＨＡ、Ｆａｒｈｏｏｓｈ Ｒ、Ｄｅｃｏｓｔｅｒ ＢおよびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＲＬ（１９９２）「光合成におけるカロテノイドからクロロフィルへのエネルギー移動の効率を制御する分子特性」Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）第Ｉ巻の１２５−１２８頁；Ｃｏｇｄｅｌｌ ＲＪおよびＧａｒｄｉｎｅｒ ＡＴ（１９９３）「光合成におけるカロテノイドの機能」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１４：１８５−１９３参照］。カロテノイドは光合成生物における集光アンテナのタンパク質−色素複合体の不可欠な成分であるが、これらは光合成反応中心の重要な成分でもある。
【０００３】
総カロテノイドの大半は集光性複合体ＩＩ中に位置する［Ｂａｓｓｉ Ｒ、Ｐｉｎｅａｗ Ｂ、Ｄａｉｎｅｓｅ ＰおよびＭａｒｑｕａｒｔｔ Ｊ（１９９３）「光化学系ＩＩのカロテノイド結合タンパク質」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１２：２９７−３０２］。光合成活性カロテノタンパク質（ｃａｒｏｔｅｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）の正体と集光系におけるそれらの正確な位置はわかっていない。好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の光合成活性クロロフィル−タンパク質複合体中のカロテノイドは、配向した試料の線二色性分光法によって調べられた［Ｂｒｅｔｏｎ ＪおよびＫａｔｏ Ｓ（１９８７）「光化学系ＩＩにおける色素の配向：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から単離されたコア粒子とそのクロロフィル−タンパク質サブユニットの低温線二色性研究」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８９２：９９−１０７参照］。これらの複合体は、膜面に接近して配向された５０５および４７０ｎｍ付近を吸収するβ−カロテンプールを、主として含有していた。光合成不活性クロロフィル−タンパク質複合体では、そのβ−カロテンが４９５および４６５ｎｍ付近を吸収し、これらの分子は膜面に対して垂直に配向される。
カロテノイドがシアノバクテリアの光化学系（ＰＳ）ＩＩに関係するという証拠は記述されている［Ｓｕｚｕｋｉ ＲおよびＦｕｊｉｔａ Ｙ（１９７７）「光合成反応中心ＩＩの作用によって誘発されるカロテノイド光退色：ＤＣＭＵ感受性」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８：６２５−６３１；Ｎｅｗｍａｎ ＰＪおよびＳｈｅｒｍａｎ ＬＡ（１９７８）「藍藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｄｒｏｒｕｍからの光化学系ＩおよびＩＩ膜粒子の単離と特徴づけ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５０３：３４３−３６１参照］。ＰＳＩＩの反応中心コアには２分子のβ−カロテンがあり［Ｏｈｎｏ Ｔ、Ｓａｔｏｈ ＫおよびＫａｔｏｈ Ｓ（１９８６）「好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から精製した酸素発生複合体の化学組成」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８５２：１−８；Ｇｏｕｎａｒｉｓ Ｋ、Ｃｈａｐｍａｎ ＤＪおよびＢａｒｂｅｒ Ｊ（１９８９）「Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３からのＤ１／Ｄ２／チトクロムｂ−５５９複合体の単離と特徴づけ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９７３：２９６−３０１；Ｎｅｗｅｌｌ ＲＷ、ｖａｎ Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ Ｈ、Ｂａｒｂｅｒ Ｊおよびｖａｎ Ｇｒｏｎｄｅｌｌｅ Ｒ（１９９３）「偏光を用いた光化学系ＩＩの反応中心の分光学的特徴づけ：ＰＳＩＩ反応中心におけるβ−カロテン励起物質の証拠」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０５７：２３２−２３８参照］、それらの正確な機能はまだはっきりしていない［Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）第ＩＩ巻３−１２頁にＳａｔｏｈ Ｋによる総説（１９９２）「ＰＳＩＩ反応中心の構造と機能」がある］。これら２分子の連結した窿Ｊロテンは単離されたＰＳＩＩ反応中心においてクロロフィルＰ６８０を光損傷から保護することが証明されており［Ｄｅ Ｌａｓ Ｒｉｖａｓ Ｊ、Ｔｅｌｆｅｒ ＡおよびＢａｒｂｅｒ Ｊ（１９９３）「２分子の連結したβ−カロテンが単離されたＰＳＩＩ反応中心においてＰ６８０を光損傷から保護する」Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１４２：１５５−１６４参照］、これはＰＳＩＩのＤ１サブユニットの分解からの防護に関係するのかもしれない［Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「フィトエンからリコピンへの不飽和化反応に関与する遺伝子と酵素」（抄録）カロテノイドに関する第１０回国際シンポジウム、トロンヘイムＣＬ１−２参照］。好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の高度に精製された酸素発生ＰＳＩＩ複合体の集光性色素は５０分子のクロロフィルａと７分子のβ−カロテンからなるが、キサントフィル分子は含まない［Ｏｈｎｏ Ｔ、Ｓａｔｏｈ ＫおよびＫａｔｏｈ Ｓ（１９８６）「好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から精製した酸素発生複合体の化学組成」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８５２：１−８参照］。β−カロテンは緑藻類における活性なＰＳＩＩの集合に役割を果たすことが示されている［Ｈｕｍｂｅｃｋ Ｋ、Ｒｏｍｅｒ ＳおよびＳｅｎｇｅｒ Ｈ（１９８９）「活性なＰＳＩＩの集合におけるカロテノイドの重要な役割に関する証拠」Ｐｌａｎｔａ １７９：２４２−２５０参照］。
【０００４】
Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｌｕｒｉｄｕｍから単離されたＰＳＩの複合体（Ｐ７００一個につき４０個のクロロフィルを含有）は平均１．３分子のβ−カロテンを含有していた［Ｔｈｏｒｎｂｅｒ ＪＰ、Ａｌｂｅｒｔｅ ＲＳ、Ｈｕｎｔｅｒ ＦＡ、Ｓｈｉｏｚａｗａ ＪＡおよびＫａｎ ＫＳ（１９７６）「植物光合成単位におけるクロロフィルの組織化」Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８：１３２−１４８参照］。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ６３０１株から得られたＰＳＩ粒子の調製物（Ｐ７００一個につき１３０±５分子のアンテナクロロフィルを含有）には１６分子のカロテノイドが検出された［Ｌｕｎｄｅｌｌ ＤＪ、Ｇｌａｚｅｒ ＡＮ、Ｍｅｌｉｓ ＡおよびＭａｌｋｉｎ Ｒ（１９８５）「シアノバクテリア光化学系Ｉ複合体の特徴づけ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：６４６−６５４参照］。大量のβ−カロテンと、キサントフィル・クリプトキサンチンおよびイソクリプトキサンチンが、好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＰＳＩ色素−タンパク質複合体に検出された［Ｃｏｕｆａｌ Ｊ、Ｈｌａｄｉｋ ＪおよびＳｏｆｒｏｖａ Ｄ（１９８９）「シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓの光化学系Ｉ色素−タンパク質複合体のカロテノイド含量」Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ ２３：６０３−６１６参照］。４つのポリペプチド（分子量６２、６０、１４および１０ｋＤａ）からなる好熱性シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．のＰＳＩのサブユニットタンパク質複合体構造はＰ７００一個につきおよそ１０分子のβ−カロテンを含有していた［Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ、Ｈｉｒｏｔａ ＫおよびＫａｔｏｈ Ｓ（１９８５）「Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から得られる複数の型のＰ７００−クロロフィルα−タンパク質複合体：鉄、キノンおよびカロテノイド含量」Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ Ｒｅｓ ６：１８３−１９２参照］。このカロテノイドは、もっぱら、機能性およびアンテナクロロフィルａを保持する大きなポリペプチドに結合している。これらの複合体の蛍光励起スペクトルから、β−カロテンはＰＳＩにとって効率の良いアンテナとして働くことが示唆された。
【０００５】
上述のように、カロテノイドのもう一つの基本的機能は、クロロフィルの励起三重項状態によって引き起こされる光合成装置における光酸化過程から防護することである。９個以上の炭素−炭素二重結合からなるπ−電子共役を持つカロテノイド分子はクロロフィルから三重項状態エネルギーを吸収することができ、そうすることで、有害な一重項状態酸素ラジカルの形成を防止できる。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．では、カロテノイドの三重項状態が閉じたＰＳＩＩ中心でモニターされたが、約２５ナノ秒というその立ち上がり速度はアンテナ中のクロロフィル三重項からのエネルギー移動に帰される［Ｓｃｈｌｏｄｄｅｒ ＥおよびＢｒｅｔｔｅｌ Ｋ（１９８８）「１１ナノ秒の寿命を持つ閉じた光化学系ＩＩにおける初期電荷分離．Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓから得られる酸素発生性光化学系ＩＩ複合体を使ったフラッシュ吸収分光学」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９３３：２２−３４参照］。ラジカル対形成の収率と比較して低い収率を持つこの過程は、過度の励起による損傷からクロロフィルを保護する上で役割を果たす。
生体内でのカロテノイドの防護的役割は、酸素放出型光合成を行なうすべての生物でカロテノイド生合成を抑制するノルフルラゾンなどの漂白性除草剤の使用によって解明されている［Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ編「Ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｏｎ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ・フロリダ州ボカラトン）の２５−４４頁にＳａｎｄｍａｎｎ ＧとＢｏｇｅｒ Ｐによる総説（１９８９）「除草剤によるカロテノイド生合成の抑制」がある］。明所でのノルフルラゾンによる処理はカロテノイドレベルとクロロフィルレベルの両方の低下をまねくが、暗所ではクロロフィルレベルは変化しない。ピリジノン除草剤フルリドン（ｆｌｕｒｉｄｏｎｅ）で処理されたＯｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｇａｒｄｈｉｉの細胞における光合成効率の抑制は、ミクソキサントフィル、ゼアキサンチンおよびβ−カロテンの相対的存在量の低下（これは結果としてクロロフィル分子の光酸化を引き起こす）が原因であるとされた［Ｃａｎｔｏ ｄｅ Ｌｏｕｒａ Ｉ、Ｄｕｂａｃｑ ＪＰおよびＴｈｏｍａｓ ＪＣ（１９８７）「シアノバクテリアの色素と脂質に対する窒素欠乏の効果」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８３：８３８−８４３参照］。
【０００６】
アンテナクロロフィルの過剰な励起エネルギーを非放射的に放散させるにはゼアキサンチンが必要であることが植物で証明されている［Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ Ｂ（１９９０）「植物中のカロテノイドと光防護：キサントフィル・ゼアキサンチンの役割」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０２０：１−２４；Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ ＢおよびＡｄａｍｓ ＷＷ ＩＩＩ（１９９０）「カロテノイド・ゼアキサンチンとクロロフィル蛍光の高エネルギー状態クエンチング」Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ Ｒｅｓ ２５：１８７−１９７参照］。藻類と植物では、ビオラキサンチンの光誘発性脱エポキシ化によるゼアキサンチンの生成が光防護過程に関係している［Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ ＢとＡｄａｍｓ ＷＷ ＩＩＩによる総説（１９９２）「強い光ストレスに対する植物の光防護その他の反応」Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４３：５９９−６２６がある］。ビオラキサンチンの光誘発性脱エポキシ化と、暗所で起こるその逆反応は「キサントフィルサイクル」として知られている［Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ ＢおよびＡｄａｍｓ ＷＷ ＩＩＩ（１９９２）「強い光ストレスに対する植物の光防護その他の反応」Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４３：５９９−６２６参照］。ゼアキサンチンを含有せず、放射エネルギー放散をおそらく行なうことができないシアノバクテリア地衣類は高い光強度に対して感受性であり、ゼアキサンチンを含有する藻地衣類は強い光ストレスに対して、より耐性である［Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ Ｂ、Ａｄａｍｓ ＷＷ ＩＩＩ、Ｇｒｅｅｎ ＴＧＡ、Ｃｚｙｇａｎ ＦＣおよびＬａｎｇｅ ＯＬ（１９９０）「一方のパートナーがキサントフィルサイクルを持ち一方がキサントフィルサイクルを持たないフィコシンビオデーム（ｐｈｙｃｏｓｙｍｂｉｏｄｅｍｅ）を形成する２つの地衣類における光ストレスに対する感受性の相違」Ｏｅｃｏｌｏｇｉａ ８４：４５１−４５６；Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ ＢおよびＡｄａｍｓ ＷＷ ＩＩＩ（１９９３）「日光順化葉のキサントフィルサイクル、タンパク質ターンオーバーおよび高い耐光性」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０３：１４１３−１４２０；Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ Ｂ（１９９０）「植物中のカロテノイドと光防護：キサントフィル・ゼアキサンチンの役割」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０２０：１−２４参照］。藻類や植物とは対照的に、シアノバクテリアはキサントフィルサイクルを持たない。しかしこれらは、ゼアキサンチンと、クロロフィルの光防護を支持できる他のキサントフィル類とを大量に含有する。
【０００７】
他にもいくつかの機能がカロテノイドに帰されている。カロテノイドが近紫外（ＵＶ）照射によって生成する有害種から防護する可能性は、シアノバクテリアＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ａｌｐｉｃｏｌａのＵＶ耐性変異株でのβ−カロテンの蓄積を示す結果によって示唆される［Ｂｕｃｋｌｅｙ ＣＥおよびＨｏｕｇｈｔｏｎ ＪＡ（１９７６）「藍藻Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ａｌｐｉｃｏｌａの色素沈着に対する近ＵＶ照射の効果の研究」Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０７：９３−９７参照］。このことは、カロテノイドを産生するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞によって、より鮮やかに立証された［Ｔｕｖｅｓｏｎ ＲＷおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現させたクローン化カロテノイド遺伝子による、近紫外光によって活性化された光毒性分子からの防護」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１４：３２３−３３０参照］。カロテノイドは酸素ラジカル種を消滅させるというその能力ゆえに効率のよい抗酸化物質であり、その結果として、酸化的損傷から細胞を保護する。カロテノイドのこの機能は事実上全ての生物で重要である［Ｋｒｉｎｓｋｙ ＮＩ（１９８９）「カロテノイドの抗酸化機能」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ７：６１７−６３５；Ｐａｌｏｚｚａ ＰおよびＫｒｉｎｓｋｙ ＮＩ（１９９２）「生体内および試験管内でのカロテノイドの抗酸化効果；概要」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１３：４０３−４２０参照］。その他の細胞機能も、間接的ではあるとしても、カロテノイドによる影響を受けうる。
シアノバクテリア中のカロテノイドは光走性の主要な光受容体ではないが、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓで観察された光走性反応に対するカロテノイドの影響は、この系でシグナル中間体として作用しうる一重項酸素ラジカルが除去されるためだとされた［Ｎｕｌｔｓｃｈ ＷおよびＳｃｈｕｃｈａｒｔ Ｈ（１９８５）「シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの光走性反応連鎖のモデル」Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４２：１８０−１８４参照］。
【０００８】
花と果実では、カロテノイドは受粉媒介者の誘引と種子の散布を促進する。この側面は農業と強く関係する。果実と花における色素沈着のタイプと程度は、数多くの農作物の最も重要な特徴の一部である。その理由は主に、それら産物の色がしばしば消費者に対するそれらの訴求性を決定し、したがってそれらの市場価値を高めうることにある。
カロテノイドは無毒であるため、これらは食品産業において着色剤としての重要な商業的用途を持っている［Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ ＪＣ（１９８１）「Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｓ ｃｏｌｏｒａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（着色料およびビタミンＡ前駆体としてのカロテノイド）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ・ロンドン）参照］。トマトの実の赤色は、果実の成熟中に有色体に蓄積するリコピンによるものである。高含量（乾燥重量で８０％以上）のリコピンを含有するトマトエキスは、食品用着色料として工業的に利用するため、世界中で商業生産されている。また、魚や鳥の肉、羽根または卵は、与えられた食餌カロテノイドの色をおびており、家禽用の食餌添加物や水産養殖には、このようにカロテノイドがしばしば使用されている。水産養殖では、動物と人間用の補助食品を生産するために、一定のシアノバクテリア種、例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐ．が培養されている［Ｓｏｍｍｅｒ ＴＲ、Ｐｏｔｔｓ ＷＴおよびＭｏｒｒｉｓｓｙ ＮＭ（１９９０）「水産養殖における加工微小藻類の最近の進歩」Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌａｇｉａ ２０４／２０５：４３５−４４３参照］。したがってこれらシアノバクテリア中のカロテノイド（主としてβ−カロテン）の含量はバイオテクノロジーにおいて商業的に重大な意味を持つ。
【０００９】
ほとんどのカロテノイドは８つのＣ₅イソプレノイド単位から構成されたＣ₄₀炭化水素主鎖からなり、一連の共役二重結合を含有する。カロテンは酸素原子を含まず、１個または２個の末端環構造を含有する線状もしくは環化分子である。キサントフィルはカロテンの酸素化誘導体である。様々なグリコシル化カロテノイドとカロテノイドエステルが同定されている。Ｃ₄₀主鎖はさらに延長されてＣ₄₅またはＣ₅₀カロテノイドを与えたり、短縮されてアポカロテノイド（ａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）を与えうる。一部の非光合成細菌はＣ₃₀カロテノイドも合成する。カロテノイドに関する一般的基礎知識は、Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷ（１９８０）「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（カロテノイドの生化学）」第１巻（第二版／Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ・ニューヨーク）と、Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷおよびＢｒｉｔｔｏｎ Ｇ（１９８８）「カロテノイドの分布と分析」Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷ編「Ｐｌａｎｔ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ・ニューヨーク）の６２−１３２頁に見出すことができる。
自然界に存在するカロテノイドはこれまでに６４０種類以上が特徴づけられており、それゆえカロテノイドは微生物、菌類、藻類、植物、動物に見出される様々な色調の黄色、橙色および赤色のほとんどを担っている。カロテノイドは全ての光合成生物と、いくつかの非光合成細菌および菌類によって合成されるが、これらはまた、摂食により、動物界のいたるところに広く分布する。
カロテノイドは、光合成生物と一部の微生物でのみ、イソプレノイド前駆体からデノボ合成され、それらは通例、光合成膜、細胞膜および細胞壁中のタンパク質複合体に蓄積する。
【００１０】
図１に詳述するように、β−カロテンの生合成経路では、４つの酵素が中央（ｃｅｎｔｒａｌ）イソプレノイド経路のゲラニルゲラニルピロリン酸をβ−カロテンに変換する。カロテノイドは一般（ｇｅｎｅｒａｌ）イソプレノイド生合成経路から作られる。この経路は数十年来知られてきたが、最近になってようやく、主に遺伝学と分子生物学を利用して、カロテノイド生合成に関与する分子機序の一部が解明された。これは、フィトエンからカロテンおよびキサントフィルへの変換に関与する酵素の大半が、可溶化すると活性を失う不安定な膜結合型タンパク質であるという事実による［Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｗｅｉｓｓ ＧおよびＫｌｅｉｎｉｇ Ｈ（１９８５）「スイセン有色体の膜結合型カロテノイド生成（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）酵素の可溶化と再構成」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５３：３４１−３４６；Ｂｒａｍｌｅｙ ＰＭ（１９８５）「カロテノイドのインビトロ生合成」Ａｄｖ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２１：２４３−２７９参照］。
しかし、部分活性を保持したＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６７１４株からのカロテノイド生成酵素の可溶化が報告されている［Ｂｒａｍｌｅｙ ＰＭおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９８７）「Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａのカロテノイド生成酵素の可溶化」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ２６：１９３５−１９３９］。
【００１１】
酵素活性の直接測定を可能にするカロテノイド生合成用の純粋なインビトロ系はない。無細胞カロテノイド生成系が開発され［Ｃｌａｒｋｅ ＩＥ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｒａｍｌｅｙ ＰＭおよびＢｏｇｅｒ Ｐ（１９８２）「単離された光合成膜によるカロテン生合成」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １４０：２０３−２０６参照］、シアノバクテリアへの適合がなされている［Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＢｒａｍｌｅｙ ＰＭ（１９８５）「Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓのフィトエン生成系と共役させたＡｐｈａｎｏｃａｐｓａホモジネートによるカロテノイド生合成」Ｐｌａｎｔａ １６４：２５９−２６３；Ｂｒａｍｌｅｙ ＰＭおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９８５）「シアノバクテリアＡｐｈａｎｏｃａｐｓａによるキサントフィルのインビトロおよびインビボ生合成」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ２４：２９１９−２９２２参照］。
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株から得られるフィトエンデサチュラーゼのリポソームでの再構成が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現されたそのポリペプチドの精製後に達成された［Ｆｒａｓｅｒ ＰＤ、Ｌｉｎｄｅｎ ＨおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ過剰発現株からの組換えＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓフィトエンデサチュラーゼの精製と再活性化」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９１：６８７−６９２参照］。
【００１２】
再び図１について述べると、カロテノイドはイソプレノイド前駆体から合成される。イソプレノイド生合成の中央（ｃｅｎｔｒａｌ）経路はアセチル−ＣｏＡのメバロン酸への変換で始まると見ることができる。メバロン酸から一つのＣ₅分子、Ｄ³−イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）が生成するが、これが全ての長鎖イソプレノイドの構成単位である。ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化に続いて、さらに三分子のＩＰＰが化合してＣ₂₀分子であるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を与える。これらの１’−４縮合反応は、プレニルトランスフェラーゼによって触媒される［Ｋｌｅｉｎｉｇ Ｈ（１９８９）「イソプレノイド生合成における色素体の役割」Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：３９−５９参照］。植物では、同じ酵素ＧＧＰＰシンターゼがＤＭＡＰＰからＧＧＰＰに至る反応の全てを行なうという証拠がある［Ｄｏｇｂｏ ＯおよびＣａｍａｒａ Ｂ（１９８７）「アフィニティークロマトグラフィーによるＣａｐｓｉｃｕｍ 有色体からのイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼとゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの精製」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９２０：１４０−１４８；Ｌａｆｅｒｒｉｅｒｅ ＡおよびＢｅｙｅｒ Ｐ（１９９１）「Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａエチオプラストからのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの精製」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２１６：１５６−１６３参照］。
【００１３】
カロテノイド生合成に特有の最初の段階は２分子のＧＧＰＰの頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）縮合によるプレフィトエンピロリン酸（ＰＰＰＰ）の生成である。ピロリン酸エステルの除去に続いて、ＧＧＰＰは無色のＣ₄₀炭化水素分子である１５−ｃｉｓ−フィトエンに変換される。この二段階反応はシアノバクテリアでも植物でも可溶性酵素フィトエンシンターゼ（単一の遺伝子（ｃｒｔＢ）によってコードされる酵素）によって触媒される［Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「カロテノイド生合成酵素フィトエンシンターゼをコードするシアノバクテリア遺伝子の分子クローニングとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２９６：３０５−３１０；Ｒａｙ ＪＡ、Ｂｉｒｄ ＣＲ、Ｍａｕｎｄｅｒｓ Ｍ、Ｇｒｉｅｒｓｏｎ ＤおよびＳｃｈｕｃｈ Ｗ（１９８７）「トマト由来の成熟関連ｃＤＮＡ、ｐＴＯＭ５の配列」Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：１０５８７−１０５８８；Ｃａｍａｒａ Ｂ（１９９３）「植物フィトエンシンターゼ複合体−成分３酵素、免疫学および生合成」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１４：３５２−３６５参照］。この経路のこれ以降の段階はすべて膜内で起こる。４回の不飽和化（脱水素）反応により、フィトエンはフィトフルエン、ζ−カロテン、ノイロスポレンを経てリコピンに変換される。各不飽和化反応によって共役二重結合数は２つずつ増加し、共役二重結合数はフィトエンでの３からリコピンでの１１まで増加する。
【００１４】
フィトエンの酵素的脱水素の分子機序についてわかっていることは比較的少ない［Ｊｏｎｅｓ ＢＬおよびＰｏｒｔｅｒ ＪＷ（１９８６）「高等植物におけるカロテンの生合成」ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ３：２９５−３２４；Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｍａｙｅｒ ＭおよびＫｌｅｉｎｉｇ Ｈ（１９８９）「分子状酸素と中間体の幾何異性状態はスイセン有色体におけるカロテンの不飽和化反応と環化反応に極めて重要である」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８４：１４１−１５０参照］。シアノバクテリア、藻類および植物では、１５−ｃｉｓ−フィトエンからζ−カロテンへの最初の２回の不飽和化反応が単一の膜結合型酵素フィトエンデサチュラーゼによって触媒されることが確証されている［Ｊｏｎｅｓ ＢＬおよびＰｏｒｔｅｒ ＪＷ（１９８６）「高等植物におけるカロテンの生合成」ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ３：２９５−３２４；Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｍａｙｅｒ ＭおよびＫｌｅｉｎｉｇ Ｈ（１９８９）「分子状酸素と中間体の幾何異性状態はスイセン有色体におけるカロテンの不飽和化反応と環化反応に極めて重要である」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８４：１４１−１５０参照］。このζ−カロテン産物はほとんどが全トランス配置にあるので、シス−トランス異性化はこの不飽和化段階で起こると考えられる。シアノバクテリアにおけるフィトエンデサチュラーゼポリペプチドの一次構造は、藻類と植物の同ポリペプチドでも保存されている（６５％を超える残基が同一）［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６；Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍａｎｎ Ｖ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「植物におけるカロテノイド生合成の分子的特徴づけ：トマト中のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子」Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第ＩＩＩ巻（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）１１−１８頁参照］。さらに、同じ阻害剤がこれら２つの系のフィトエンデサチュラーゼを阻害する［Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＢｏｇｅｒ Ｐ（１９８９）「除草剤によるカロテノイド生合成の抑制」Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ編「Ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｏｎ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ・フロリダ州ボカラトン）の２５−４４頁参照］。したがって、おそらくシアノバクテリアと植物ではフィトエンとフィトフルエンの不飽和化を触媒する酵素の生物学的性質と分子的性質がよく似ていて、他の微生物のフィトエンデサチュラーゼのそれら特性とは異なると思われる。そのような相違の一つはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．または菌類から得られるフィトエンデサチュラーゼが、フィトエンをそれぞれノイロスポレン、リコピンまたは３，４−デヒドロリコピンに変換することである。
【００１５】
酸素はこの反応に直接関与するわけではないが、スイセン有色体でのフィトエンの不飽和化［Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｍａｙｅｒ ＭおよびＫｌｅｉｎｉｇ Ｈ（１９８９）「分子状酸素と中間体の幾何異性状態はスイセン有色体におけるカロテンの不飽和化反応と環化反応に極めて重要である」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８４：１４１−１５０参照］と、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株の無細胞系［Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＫｏｗａｌｃｚｙｋ Ｓ（１９８９）「試験管内カロテノイド生成とＡｎａｃｙｓｔｉｓにおけるフィトエンデサチュラーゼ反応の特徴づけ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ １６３：９１６−９２１参照］は、分子状酸素に（おそらくは最終電子受容体として）依存する。シアノバクテリアではデヒドロゲナーゼ−モノオキシゲナーゼの脱水素機構よりデヒドロゲナーゼ−電子伝達酵素の機構が支持された［Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＫｏｗａｌｃｚｙｋ Ｓ（１９８９）「試験管内カロテノイド生成とＡｎａｃｙｓｔｉｓにおけるフィトエンデサチュラーゼ反応の特徴づけ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ １６３：９１６−９２１参照］。一次構造が分析されている全てのフィトエンデサチュラーゼには保存されたＦＡＤ−結合モチーフが存在する［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６；Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍａｎｎ Ｖ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「植物におけるカロテノイド生合成の分子的特徴づけ：トマト中のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子」Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第ＩＩＩ巻（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）の１１−１８頁参照］。コショウのフィトエンデサチュラーゼ酵素はタンパク質結合型ＦＡＤを含有することが明らかにされている［Ｈｕｇｕｅｎｅｙ Ｐ、Ｒｏｍｅｒ Ｓ、Ｋｕｎｔｚ ＭおよびＣａｍａｒａ Ｂ（１９９２）「Ｃａｐｓｉｃｕｍ有色体でフィトフルエンとζ−カロテンの合成を触媒するフラボタンパク質の特徴づけと分子クローニング」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０９：３９９−４０７参照］。フィトエンデサチュラーゼは膜内に位置するので、別途可溶性の酸化還元成分が予想される。この仮説上の成分は、示唆されているようにＮＡＤ（Ｐ）⁺を利用するか［Ｍａｙｅｒ ＭＰ、Ｎｉｅｖｅｌｓｔｅｉｎ ＶおよびＢｅｙｅｒ Ｐ（１９９２）「Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓの有色体から得られるＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素−カロテン不飽和化反応に関与すると思われる酸化還元媒介因子−の精製と特徴づけ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０：３８９−３９８参照］、例えばキノンなどの他の電子および水素運搬体を利用しうる。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６７１４株とＡｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３株におけるフィトエンデサチュラーゼの細胞での位置は、特異的抗体を使って、主として（８５％）、光合成チラコイド膜中であると決定された［Ｓｅｒｒａｎｏ Ａ、Ｇｉｍｅｎｅｚ Ｐ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９０）「光合成無機栄養原核生物におけるフィトエンデサチュラーゼの免疫細胞化学的な位置決定と機能決定」Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３６：２４６５−２４６９参照］。
【００１６】
シアノバクテリア藻類と植物では、ζ−カロテンがノイロスポレンを経てリコピンに変換される。単一の酵素によって行なわれると予想されるその酵素的機序については、ほとんどわかっていない［Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｖｉｏｑｕｅ ＡおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「ζ−カロテンデサチュラーゼをコードするカロテノイド生合成遺伝子の異種相補性によるＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０からの単離」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １０６：９９−１０４］。Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．ＰＣＣ７１２０株中のζ−カロテンデサチュラーゼの推定アミノ酸配列はフィトエンデサチュラーゼに見出されるものに似たジヌクレオチド結合モチーフを含有する。
リコピンは２回の環化反応によってβ−カロテンに変換される。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＦＸ Ｊｒ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｇａｎｔｔ ＥおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「β−カロテンの生合成を触媒する酵素リコピンシクラーゼのシアノバクテリア遺伝子のクローニングとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの機能的発現」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３２８：１３０−１３８参照］と、植物［Ｃａｍａｒａ ＢおよびＤｏｇｂｏ Ｏ（１９８６）「Ｃａｐｓｉｃｕｍ有色体膜由来のリコピンシクラーゼの証明と可溶化」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８０：１７２−１８４参照］では、これら２つの環化反応が単一の酵素リコピンシクラーゼによって触媒されるという証拠が得られている。この膜結合型酵素はトリエチルアミン化合物ＣＰＴＡとＭＰＴＡによって阻害される［Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＢｏｇｅｒ Ｐ（１９８９）「除草剤によるカロテノイド生合成の抑制」Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ編「Ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｏｎ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ・フロリダ州ボカラトン）の２５−４４頁参照］。シアノバクテリアはβ−環化のみを行なうので、ε−カロテン、δ−カロテンおよびα−カロテンとそれらの酸素化誘導体を含有しない。竓ツは、線状リコピン分子の末端にあるＣ−１，２二重結合がＣ−５，６二重結合の位置に折りたたまれた後、Ｃ−６からプロトンを失うと、「カルボニウムイオン」中間体の生成を経て形成される。７，８結合が二重結合でない環状カロテンは報告されていない。したがってこの反応には、完全な不飽和化（例えばリコピンの場合）か、少なくとも半分子の不飽和化（例えばノイロスポレンの場合）が必須である。リコピンの環化は酸素を必要としない脱水素反応を伴う。この反応の補因子はまだわかっていない。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株のリコピンシクラーゼポリペプチドにはジヌクレオチド結合ドメインが見出されていることから、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）またはＦＡＤがリコピンシクラーゼと結びつけられる。
【００１７】
ヒドロキシ、メトキシ、オキソ、エポキシ、アルデヒドまたはカルボン酸部分などの様々な酸素含有側鎖の付加によって様々なキサントフィル種が生成する。キサントフィルの生成についてはほとんどわかっていない。β−カロテンのヒドロキシル化には、混合機能酸素添加酵素反応に分子状酸素が必要である。
全経路の酵素をコードする遺伝子のクラスターが紅色光合成細菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ［Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＧＡ、Ａｌｂｅｒｔｉ Ｍ、Ｌｅａｃｈ ＦおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９８９）「Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのカロテノイド生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列、編成およびタンパク質産物の性質」Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１６：２５４−２６８参照］と、非光合成細菌Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ［Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｗｏｏｄｓ ＷＳおよびＴｕｖｅｓｏｎ ＲＷ（１９９０）「Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａと形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株におけるカロテノイドの同定」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７１：７７−８２；Ｈｕｎｄｌｅ ＢＳ、Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｋｌｅｉｎｉｇ Ｈ、Ｅｎｇｌｅｒｔ ＨおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９９１）「Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのカロテノイドとＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａカロテノイド遺伝子クラスターを保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株」Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ５４：８９−９３；Ｓｃｈｎｕｒｒ Ｇ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９１）「Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのカロテノイド生成遺伝子クラスターのマッピングと６遺伝子の機能的同定」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７８：１５７−１６２参照］およびＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ［Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ、Ｙａｍａｎｏ Ｓ、Ｉｚａｗａ Ｉ、Ｎａｋａｍｕｒａ ＫおよびＨａｒａｓｈｉｍａ Ｋ（１９９０）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける遺伝子産物の機能解析によるＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａカロテノイド生合成経路の解明」Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７２：６７０４−６７１２参照］からクローニングされている。２つの遺伝子、ＧＧＰＰシンターゼのａｌ−３［Ｎｅｌｓｏｎ ＭＡ、Ｍｏｒｅｌｌｉ Ｇ、Ｃａｒａｔｔｏｌｉ Ａ、Ｒｏｍａｎｏ ＮおよびＭａｃｉｎｏ Ｇ（１９８９）「青色光によって調節されるＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａカロテノイド生合成遺伝子（ａｌｂｉｏ−３）の分子クローニングとホワイトカラー遺伝子の産物」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１２７１−１２７６；Ｃａｒａｔｔｏｌｉ Ａ、Ｒｏｍａｎｏ Ｎ、Ｂａｌｌａｒｉｏ Ｐ、Ｍｏｒｅｌｌｉ ＧおよびＭａｃｉｎｏ Ｇ（１９９１）「Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａカロテノイド生合成遺伝子（ａｌｂｉｎｏ ３）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：５８５４−５８５９参照］と、フィトエンデサチュラーゼのａｌ−１［Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＴＪ、Ｌａｕｔｅｒ ＦＲ、Ｒｕｓｓｏ ＶＥＡおよびＹａｎｏｆｓｋｙ Ｃ（１９９０）「Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのカロテノイド生合成遺伝子ａｌ−１のクローニング、配列決定および光調節」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：５０６４−５０７０参照］が、カビＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからクローニングされている。しかし、シアノバクテリアや植物から対応する遺伝子をクローニングするために、これらの遺伝子を異種分子プローブとして使用する試みは、十分な配列類似性がないために不成功に終わっている。
【００１８】
カロテノイド合成酵素の最初の「植物型」遺伝子は分子遺伝学的方法を使ってシアノバクテリアからクローニングされた。フィトエンデサチュラーゼの遺伝子をクローニングするための第一段階として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株で、フィトエンデサチュラーゼ特異的阻害剤ノルフルラゾンに耐性な突然変異株がいくつか分離された［Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＢｏｇｅｒ Ｐ（１９９０）「漂白性除草剤ノルフラゾンに抗して選択されるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ突然変異株の生化学的特徴づけ」Ｐｅｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３６：４６−５１参照］。次にノルフルラゾン耐性を付与する遺伝子が、野生型株を除草剤耐性に形質転換することによってクローニングされた［Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｐｅｃｋｅｒ ＩおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９１）「除草剤ノルフルラゾンに対する耐性の分子的根拠」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６：９６７−９７４；Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９０）「シアノバクテリア中のノルフルラゾン耐性遺伝子のクローニング」Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ４５ｃ：４８２−４８６参照］。クローニングされたその遺伝子（以前はｐｄｓと呼ばれていたが、現在はｃｒｔＰと呼ばれている）がフィトエンデサチュラーゼをコードすることは、各種の証拠によって示された。最も決定的な証拠は、形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでのフィトエンデサチュラーゼ活性の機能的発現だった［Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９１）「様々なフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの機能的相補性と蓄積されたカロテンの分析」Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ４６ｃ：１０４５−１０５１；Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６参照］。ｃｒｔＰ遺伝子はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株からも同様の方法によってクローニングされた［Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｅｒｅｚ ＩＭおよびＶｉｏｑｕｅ Ａ（１９９２）「Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３から得られるフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列と除草剤ノルフルラゾンに対する耐性を付与する新しい突然変異の特徴づけ」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８：９８１−９８３参照］。
【００１９】
次に、シアノバクテリアのｃｒｔＰ遺伝子は、藻［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍａｎｎ Ｖ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「植物におけるカロテノイド生合成の分子的特徴づけ：トマト中のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子」Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第ＩＩＩ巻（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）の１１−１８頁参照］と高等植物［Ｂａｒｔｌｅｙ ＧＥ、Ｖｉｉｔａｎｅｎ ＰＶ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＳｃｏｌｎｉｋ ＰＡ（１９９１）「カロテノイド生合成経路の一酵素フィトエンデサチュラーゼをコードするダイズｃＤＮＡの分子クローニングと光合成細菌における発現」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：６５３２−６５３６；Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６参照］から相同遺伝子をクローニングするための分子プローブとして使用された。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７９４２株とＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣ６８０３株中のフィトエンデサチュラーゼはそれぞれ４７４および４６７アミノ酸残基からなり、それらの配列は高度に保存されている（同一性７４％、類似性８６％）。計算分子量は５１ｋＤａで、わずかに疎水性であるものの（疎水親水指数−０．２）、脂質二重層膜を貫通するのに足りる長さの疎水領域は含まない。シアノバクテリアのフィトエンデサチュラーゼの一次構造は、緑藻Ｄｕｎａｌｌｉｅｌｌａ ｂａｒｄａｗｉｌから得られる酵素（６１％同一で８１％類似；［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍａｎｎ Ｖ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ、Ｂｏｇｅｒ ＰおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「植物におけるカロテノイド生合成の分子的特徴づけ：トマト中のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子」Ｍｕｒａｔａ Ｎ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第ＩＩＩ巻（Ｋｌｕｗｅｒ・ドルドレヒト）の１１−１８頁参照］）と、トマト［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６参照］、コショウ［Ｈｕｇｕｅｎｅｙ Ｐ、Ｒｏｍｅｒ Ｓ、Ｋｕｎｔｚ ＭおよびＣａｍａｒａ Ｂ（１９９２）「Ｃａｐｓｉｃｕｍ有色体でフィトフルエンとζ−カロテンの合成を触媒するフラボタンパク質の特徴づけと分子クローニング」Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０９：３９９−４０７参照］およびダイズ［Ｂａｒｔｌｅｙ ＧＥ、Ｖｉｉｔａｎｅｎ ＰＶ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＳｃｏｌｎｉｋ ＰＡ（１９９１）「カロテノイド生合成経路の一酵素フィトエンデサチュラーゼをコードするダイズｃＤＮＡの分子クローニングと光合成細菌における発現」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：６５３２−６５３６参照］から得られる酵素（６２−６５％同一で約７９％類似；［Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ（１９９３）「シアノバクテリアにおけるカロテノイド生合成の初期段階の分子的解析：フィトエンシンターゼとフィトエンデサチュラーゼ」エルサレム・ヘブライ大学の博士論文参照］）で高度に保存されている。真核生物のフィトエンデサチュラーゼポリペプチドの方が大きい（６４ｋＤａ）が、それらは色素体への輸入中に、シアノバクテリアの酵素と同等のサイズを持つ成熟型にプロセッシングされる。
【００２０】
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのカロテノイド酵素には、ｃｒｔＩ遺伝子産物フィトエンデサチュラーゼを含めて、高度の構造的類似性がある［Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＧＡ、Ｈｕｎｄｌｅ ＢＳおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９９３）「光合成生物と非光合成生物から得られるカロテノイド生合成遺伝子産物の進化的保存と構造上の類似性」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１４：２９７−３１１に概説されている］。上述したように、フィトエンデサチュラーゼの一次構造の高度な保存は酸素放出型光合成生物間にも存在する。しかし「植物型」ｃｒｔＰ遺伝子産物と「細菌型」フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ遺伝子産物）の間には、アミノ末端にあるＦＡＤ結合配列を除くと、ほとんど配列類似性がない（同一性１９〜２３％、類似性４２〜４７％）。ｃｒｔＰとｃｒｔＩは同じ先祖遺伝子から派生したのではなく、それらは収束進化により独立して発生したのだという仮説が立てられている［Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｓａｎｄｍａｎｎ ＧおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９２）「フィトエンのζ−カロテンへの変換を触媒する単一のポリペプチドはトマト果実の成熟中に転写調節される」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４９６２−４９６６参照］。この仮説は、これら２つのタイプの酵素によって触媒される脱水素反応順序が異なることと、それらの阻害剤に対する感受性が異なることによって裏付けられる。
【００２１】
フィトエンデサチュラーゼの場合のように決定的ではないものの、シアノバクテリアと植物およびシアノバクテリアと他の微生物との間には、フィトエンシンターゼの構造にも同様の差異が見られる。フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ遺伝子（以前はｐｓｙと呼ばれていた）は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株のゲノム中で、ｃｒｔＰに隣接して、同じオペロン内に同定された［Ｂａｒｔｌｅｙ ＧＥ、Ｖｉｉｔａｎｅｎ ＰＶ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＳｃｏｌｎｉｋ ＰＡ（１９９１）「カロテノイド生合成経路の一酵素フィトエンデサチュラーゼをコードするダイズｃＤＮＡの分子クローニングと光合成細菌における発現」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：６５３２−６５３６参照］。この遺伝子は−０．４の疎水性指数を持つ３０７アミノ酸の３６ｋＤａポリペプチドをコードする。シアノバクテリアのフィトエンシンターゼの推定アミノ酸配列はトマトのフィトエンシンターゼで高度に保存されている（５７％同一で７０％類似；Ｒａｙ ＪＡ、Ｂｉｒｄ ＣＲ、Ｍａｕｎｄｅｒｓ Ｍ、Ｇｒｉｅｒｓｏｎ ＤおよびＳｃｈｕｃｈ Ｗ（１９８７）「トマト由来の成熟関連ｃＤＮＡ、ｐＴＯＭ５の配列」Ｎｕｃｌ Ａｃｄｓ Ｒｅｓ １５：１０５８７−１０５８８）が、他の細菌由来のｃｒｔＢ配列ではあまり保存されていない（整列中に１０箇所のギャップを入れて２９〜３２％同一、４８〜５０％類似）。両タイプの酵素は共に、多様な生物のプレニルトランスフェラーゼ中にも見出される２つの保存された配列モチーフを含有する［Ｂａｒｔｌｅｙ ＧＥ、Ｖｉｉｔａｎｅｎ ＰＶ、Ｐｅｃｋｅｒ Ｉ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＪおよびＳｃｏｌｎｉｋ ＰＡ（１９９１）「カロテノイド生合成経路の一酵素フィトエンデサチュラーゼをコードするダイズｃＤＮＡの分子クローニングと光合成細菌における発現」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：６５３２−６５３６；Ｃａｒａｔｔｏｌｉ Ａ、Ｒｏｍａｎｏ Ｎ、Ｂａｌｌａｒｉｏ Ｐ、Ｍｏｒｅｌｌｉ ＧおよびＭａｃｉｎｏ Ｇ（１９９１）「Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａカロテノイド生合成遺伝子（ａｌｂｉｎｏ ３）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：５８５４−５８５９；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＧＡ、Ｈｕｎｄｌｅ ＢＳおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９９３）「光合成生物と非光合成生物から得られるカロテノイド生合成遺伝子産物の進化的保存と構造上の類似性」Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１４：２９７−３１１；Ｍａｔｈ ＳＫ、Ｈｅａｒｓｔ ＪＥおよびＰｏｕｌｔｅｒ ＣＤ（１９９２）「Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのｃｒｔＥ遺伝子はゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：６７６１−６７６４；Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ（１９９３）「シアノバクテリアにおけるカロテノイド生合成の初期段階の分子的解析：フィトエンシンターゼとフィトエンデサチュラーゼ」エルサレム・ヘブライ大学の博士論文参照］。このポリペプチド中のこれらの領域は２分子のＧＧＰＰが縮合する際のピロリン酸エステルの結合および／または除去に関与すると考えられる。
【００２２】
ζ−カロテンデサチュラーゼをコードするｃｒｔＱ遺伝子（以前はｚｄｓと呼ばれていた）は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．のｃｒｔＢおよびｃｒｔＥ遺伝子とシアノバクテリアのｃｒｔＰ遺伝子とを保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞中のシアノバクテリアゲノムＤＮＡの発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．ＰＣＣ７１２０株からクローニングされた［Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ、Ｖｉｏｑｕｅ ＡおよびＳａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「ζ−カロテンデサチュラーゼをコードするカロテノイド生合成遺伝子の異種相補性によるＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０からの単離」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １０６：９９−１０４］。これらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞はζ−カロテンを産生するので、リコピンを産生する褐赤色に着色したコロニーが、ζ−カロテン産生細胞の帯黄色背景上に同定できた。予想されるＡｎａｂａｅｎａ ｓｐ．ＰＣＣ７１２０株由来のζ−カロテンデサチュラーゼは４９９アミノ酸残基からなる５６ｋＤａポリペプチドである。意外なことに、その一次構造は「植物型」（ｃｒｔＰ遺伝子産物）フィトエンデサチュラーゼで保存されていないが、細菌型酵素（ｃｒｔＩ遺伝子産物）とはかなりの配列類似性を持つ［Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｇ（１９９３）「フィトエンからリコピンへの不飽和化反応に関与する遺伝子と酵素」（抄録）カロテノイドに関する第１０回国際シンポジウム、トロンヘイムＣＬ１−２参照］。シアノバクテリアのｃｒｔＱ遺伝子と他の微生物のｃｒｔＩ遺伝子は共通する祖先から進化して生じたのかもしれない。
【００２３】
リコピンシクラーゼのｃｒｔＬ遺伝子（以前はｌｃｙと呼ばれていた）は、ｃｒｔＰの場合と基本的に同じクローニング法を使って、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株からクローニングされた。この遺伝子は、リコピンシクラーゼの阻害剤２−（４−メチルフェノキシ）トリエチルアミン塩酸塩（ＭＰＴＡ）を使用して、野生型の除草剤耐性への形質転換によって単離された［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＦＸ Ｊｒ、Ｃｈａｍｏｖｉｔｚ Ｄ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｇａｎｔｔ ＥおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９３）「β−カロテンの生合成を触媒する酵素リコピンシクラーゼのシアノバクテリア遺伝子のクローニングとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの機能的発現」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３２８：１３０−１３８参照］。リコピンシクラーゼは単一の遺伝子産物の産物で、リコピンのβ−カロテンへの二重環化反応を触媒する。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２株中のｃｒｔＬ遺伝子産物は４１１アミノ酸残基の４６ｋＤａポリペプチドである。これはＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａまたはＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのｃｒｔＹ遺伝子産物（リコピンシクラーゼ）に対して配列類似性を持たない。
β−カロテンヒドロキシラーゼの遺伝子（ｃｒｔＺ）とゼアキサンチングリコシラーゼの遺伝子（ｃｒｔＸ）は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ［Ｈｕｎｄｌｅ Ｂ、Ａｌｂｅｒｔｉ Ｍ、Ｎｉｅｖｅｌｓｔｅｉｎ Ｖ、Ｂｅｙｅｒ Ｐ、Ｋｌｅｉｎｉｇ Ｈ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＧＡ、Ｂｕｒｋｅ ＤＨおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９９４）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現されたＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ Ｅｈｏ１０カロテノイド遺伝子の機能割り当て」Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５４：４０６−４１６；Ｈｕｎｄｌｅ ＢＳ、Ｏｂｒｉｅｎ ＤＡ、Ａｌｂｅｒｔｉ Ｍ、Ｂｅｙｅｒ ＰおよびＨｅａｒｓｔ ＪＥ（１９９２）「Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ由来のゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼの機能的発現と二リン酸結合部位候補」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：９３２１−９３２５参照］と、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ［Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ、Ｙａｍａｎｏ Ｓ、Ｉｚａｗａ Ｉ、Ｎａｋａｍｕｒａ ＫおよびＨａｒａｓｈｉｍａ Ｋ（１９９０）「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける遺伝子産物の機能解析によるＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａカロテノイド生合成経路の解明」Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７２：６７０４−６７１２参照］からクローニングされている。
【００２４】
単細胞淡水緑藻Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは不利な生育条件にさらされたときや、リン酸欠乏、窒素欠乏、成長培地中の高濃度の塩または強い光強度などの様々な環境ストレス後に、大量の（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンを蓄積する［Ｙｏｎｇ ＹＹＲおよびＬｅｅ ＹＫ（１９９１）Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ ３０ ２５７−２６１；Ｄｒｏｏｐ ＭＲ（１９５４）Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０：３９１−３９７；Ａｎｄｒｅｗｅｓ Ａ．Ｇ、Ｂｏｒｃｈ Ｇ、Ｌｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ ＳおよびＳｎａｔｚｋｅ Ｇ（１９７４）Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ Ｓｃａｎｄ Ｂ２８：７３０−７３６参照］。この過程でこの藻の栄養細胞は嚢子を形成し、その色を緑から赤色に変化させる。β−カロテンをカンタキサンチンに変換する酵素β−Ｃ−４−オキシゲナーゼをコードするＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ由来のｃＤＮＡ（ｃｒｔＯと命名された）と、β−カロテンヒドロキシラーゼ（例えばＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ ｃｒｔＺ遺伝子産物）を発現させる異種系でのその発現による（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンの産生とは、Ｈａｒｋｅｒ Ｍ、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ（１９９７）「藻類のβ−Ｃ−４−オキシゲナーゼ遺伝子ｃｒｔＯを発現させるトランスジェニックシアノバクテリアでのケトカロテノイドの生合成」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０４：１２９−１３４に記述されている。
【００２５】
ケトカロテノイドであるアスタキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン−４，４’−ジオン）はβ−カロテンの酸化型として水生甲殻類で初めて記述された。後に、アスタキサンチンは多くの海洋動物と藻類に極めて一般的であることがわかった。しかし、アスタキサンチンを他のカロテノイドからデノボ合成できる動物はわずかであり、これらの大半はそれを食物から摂取する。植物界では主としてシアノバクテリア、藻類および地衣類の一部の種にアスタキサンチンが見出される。しかしこれは高等植物種の花弁にもまれに見出される［Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷ（１９８０）「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（カロテノイドの生化学）」第１巻（第二版・Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ・ロンドン／ニューヨーク）参照］。図２はアスタキサンチンの生合成経路を表す。
動物における強力な抗酸化剤としてのアスタキサンチンの機能は証明されている［Ｍｉｋｉ Ｗ（１９９１）「動物カロテノイドの生物学的機能と活性」Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ Ｃｈｅｍ ６３：１４１参照］。アスタキサンチンは脂質過酸化の強力な阻害剤であり、生体膜の酸化的損傷からの保護に積極的な役割を果たすことが示されている［Ｐａｌｏｚｚａ ＰおよびＫｒｉｎｓｋｙ ＮＩ（１９９２）「生体内および試験管内でのカロテノイドの抗酸化効果；概要」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１３：４０３−４２０；Ｋｕｒａｓｈｉｇｅ Ｍ、Ｏｋｉｍａｓｕ Ｅ、Ｉｎｏｕｅ ＭおよびＵｔｓｕｍｉ Ｋ（１９９０）「アスタキサンチンによる生体膜の酸化的損傷の抑制」Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｍｅｄ ＮＭＲ ２２：２７参照］。アスタキサンチンの化学的予防効果も研究されていて、そこではアスタキサンチンがマウスの誘発性膀胱癌の発生率を有意に低下させることが示されている［Ｔａｎａｋａ Ｔ、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｙ、Ｓｕｚｕｉ Ｍ、Ｋｏｊｉｍａ Ｔ、Ｏｋｕｍｕｒａ ＡおよびＭｏｒｉ Ｈ（１９９４）「天然カロテノイド・アスタキサンチンによるマウス膀胱発癌性の化学的予防」Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１５参照］。またアスタキサンチンが抗体産生を増進することによって免疫調節効果を発揮することも証明されている［Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ Ｈ、Ｚｈａｎｇ ＬおよびＴｏｍｉｔａ Ｙ（１９９３）「カロテノイドの免疫調節作用の研究ＩＩ．アスタキサンチンはポリクローナルＢ細胞活性を促進することなくＴ依存抗原に対するインビトロ抗体産生を増進する」Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ １９：２６９；Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ Ｈ、Ｈｉｌｌ ＪＲ、Ｙｏｓｈｉｆｕｍｉ ＴおよびＧｏｏｄ ＲＡ（１９９１）「カロテノイドの免疫調節作用の研究Ｉ．インビトロ培養系でのネズミリンパ球の機能と細胞表面マーカー発現に対するβ−カロテンとアスタキサンチンの効果」Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ １６：９３参照］。アスタキサンチンの生物医学的性質の完全な解明はこれからであるが、初期の結果は、これが免疫系から正の反応を引き出すと共に、癌と腫瘍の予防に重要な役割を果たし得ることを示唆している。
【００２６】
アスタキサンチンはサケ科の魚と小エビの主要カロテノイド色素であり、卵、身および皮に魅力的な着色を施している［Ｔｏｒｒｉｓｅｎ ＯＪ、Ｈａｒｄｙ ＲＷ、Ｓｈｅａｒｅｒ ＫＤ（１９８９）「サケ科の色素沈着−サケ科魚類におけるカロテノイドの沈着と代謝」Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｃｉ １：２０９参照］。１９９１年の全世界のサケの水揚げは約７２０，０００メートルトンで、そのうちの２５〜３０％は様々な水産養殖施設で生産されたものである［Ｍｅｙｅｒｓ ＳＰ（１９９４）「世界の水産養殖の発達、飼料配合物、カロテノイドの役割」Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ Ｃｈｅｍ ６６：１０６９参照］。これは西暦２０００年までに４６０，０００メートルトンまで増加すると設定されている［Ｂｊｏｒｎｄａｈｌ Ｔ（１９９０）「Ｔｈｅ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ（サケ水産養殖の経済学）」（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ・オックスフォード）の１頁参照］。サケ科魚類の赤色は消費者への訴求効果があり、それゆえに最終製品の価格を左右する。動物はカロテノイドを合成できず、一次生産者（海藻類と植物プランクトン）から食物連鎖によってそれらの色素を獲得する。集約的養殖で成長した動物の色は、通常、最適ではない。したがって水産養殖では生産者がかなりの費用をかけてカロテノイド含有栄養物を人工的に添加する。
【００２７】
アスタキサンチンは商業的に使用される最も高価なカロテノイド化合物である（現在−１９９５年の市場価値は２５００〜３５００ドル／ｋｇである）。これは主として、多種多様な水生動物に着色を施す栄養補助剤として使用される。極東では、鶏肉に特有の色素沈着が起こるように家禽への給餌にも使用される。またこれは食品産業にとって望ましく効果的な非毒性着色法であり、化粧品にも有用である。最近、アスタキサンチンが人体で強力な抗酸化剤であり、それゆえに望ましい食品添加物であることが報告された。
天然の（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンに供給量に制限がある。これは甲殻類種から工業的に抽出されている［Ｔｏｒｒｉｓｅｎ ＯＪ、Ｈａｒｄｙ ＲＷ、Ｓｈｅａｒｅｒ ＫＤ（１９８９）「サケ科の色素沈着−サケ科魚類におけるカロテノイドの沈着と代謝」Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｃｉ １：２０９参照］。アスタキサンチンの（３Ｒ，３’Ｒ）立体異性体はＰｈａｆｆｉａから生産される［酵母の一種；Ａｎｄｒｅｗｓ ＡＧ、Ｐｈａｆｆ ＨＪおよびＳｔａｒｒ ＭＰ（１９７６）「赤色発酵酵母Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａのカロテノイド」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第１５巻１００３−１００７頁参照］。（３Ｓ，３’Ｓ）−、（３Ｓ，３’Ｒ）−、（３Ｒ，３’Ｒ）−異性体の１：２：１混合物である合成アスタキサンチンは、現在、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社によって生産され、「ＣＡＲＯＰＨＹＬＬ ＰＩＮＫ」という名前で高価格（約２５００ドル／ｋｇ）で販売されている［Ｍａｙｅｒ Ｈ（１９９４）「カロテノイド合成について」Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ Ｃｈｅｍ第６６巻９３１−９３８頁参照］。最近、ケト化合物生合成に関与するｃｒｔＷと名付けられた新しい遺伝子が、アスタキサンチンなどのケトカロテノイドを産生する海洋細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｃａｃｕｍとＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＰＣ−１から単離された。Ｅｒｗｉｎｉａカロテノイド生成遺伝子によりβ−カロテンを蓄積するように操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにｃｒｔＷ遺伝子を導入したところ、そのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体はアスタキサンチンの合成経路における前駆体カンタキサンチンを合成した［Ｍｉｓａｗａ Ｎ、Ｋａｊｉｗａｒａ Ｓ、Ｋｏｎｄｏ Ｋ、Ｙｏｋｏｙａｍａ Ａ、Ｓａｔｏｍｉ Ｙ、Ｓａｉｔｏ Ｔ、Ｍｉｋｉ ＷおよびＯｈｔａｎｉ Ｔ（１９９５）「単一の遺伝子による炭化水素β−カロテン中のメチレン基のケト基への変換によるカンタキサンチン生合成」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ第２０９巻８６７−８７６頁参照］。したがって、水産養殖で飼料補助剤として、また様々な他の工業的用途に有用な化学物質として使用するには、（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンの比較的安価な供給源を見出すことが望ましい。
【００２８】
アスタキサンチンがマダイ、サケ、マスなどの魚と、小エビ、カニ、エビ、クリルなどの甲殻類に含まれることは知られている［日本水産学会編「海洋生物のカロテノイド」（１９７８）］。アスタキサンチンを産生する微生物としては、紅色酵母Ｐｈａｆｆｌａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００９，１９７６］、ブレビバクテリウム［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２７，１９６９］、緑藻Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１］が知られている。化学合成法としては、β−カロテンの変換［Ｐｒｕｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５７，７４１，１９８５］とホスホニウム塩からの合成［Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．６４，２４３６，１９８１］が知られている。
しかしクリルやエビなどの天然産物中のアスタキサンチン含量は極めて低く、その抽出は困難であるため、既知のアスタキサンチン生産法は費用が高く、有利でない。また、それら資源の供給安定性にも問題がある。さらに、紅色酵母Ｐｈａｆｆｌａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａの成長速度が遅くアスタキサンチン生産性が低いことは、このケトカロテノイド供給源を産業上の観点からは実用的でないものにしている。
緑藻Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの成長速度も低く、その培養は汚染されやすく、アスタキサンチンの抽出はこの藻が厚い細胞壁を持つために極めて困難である。したがって藻類からのアスタキサンチンの工業的生産は困難である。
アドニキサンチンは金魚とコイに含まれることが知られているが［日本水産学会編「海洋生物のカロテノイド」（１９７８）］、アドニキサンチンの化学合成は困難であると考えられる。アドニキサンチンの工業的生産法は知られていない。
【００２９】
β−カロテンの生産法としては、β−イオノンからの合成［Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６３（１），４５，１９９１］と、ニンジン、サツマイモ、カボチャなどの緑黄野菜からの抽出が知られているが［天然着色料ハンドブック編集委員会編「天然着色料ハンドブック」（１９７９）光琳］、これらの方法は生産コストが高い。
微生物によるβ−カロテンの生産方法としては藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａによる生産［Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７０，１８１，１９９１］とカビＢｌａｋｅｓｌｅａによる生産［Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７０，１８１，１９９１］が知られている。細菌によるβ−カロテンの生産も、米国特許第５，６０７，８３９号に記載の特定細菌種について知られている。
エチネノンは天然産物、例えばオニヒトデなどのヒトデや、マダイなどの魚の内臓、ウニ、ロブスターなどの甲殻類の内臓などから抽出される［日本水産学会編「海洋生物のカロテノイド」（１９８７）］。しかし微生物によるエチネノンの生産は米国特許第５，６０７，８３９号に記載の属不詳の一種についてのみ知られている。
カンタキサンチンは数種のキノコ［Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｚｅｔｔｅ，１１２，２２８−２３２，１９５０］、魚類、甲殻類など［日本水産学会編「海洋生物のカロテノイド」（１９７８）］に含まれることが知られている。
微生物によるエチネノンの生産例としては、ブレビバクテリウム属に属する微生物による生産［Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５５（１０），２５０５，１９８９］や、ロドコッカス属に属する微生物による生産［日本国公開特許公報２−１３８９９６号］がある。また、化学合成法としては、β−カロテンの酸化［Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１４２７，１９５６］と、新規化合物３−オキソ−Ｃ₁₅ホスホニウム塩からの合成［Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５１，８７５，１９７９］が知られている。
【００３０】
ゼアキサンチンの生産法としては、オキソイソホロンの不斉還元によって得られるヒドロキシケトンから出発する化学合成［Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１），４５，１９９１］、トウモロコシの種子からの抽出［「生体色素」（１９７４）朝倉書店］およびフラボバクテリウムを用いる方法［「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第二版（ニューヨーク・Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）第１巻５２９−５４４頁の「Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（カロテノイド）」 ］が知られている。
このようにアスタキサンチンなどのカロテノイドを産生し分泌する細菌の必要性は広く認識されており、それらの細菌を得ることは著しく有利である。というのは、それらの細菌は容易に入手できるカロテノイド供給源になるからである。
本発明の他の特徴と利点は、特許請求の範囲と以下の説明から明らかになるだろう。
【００３１】
（発明の要約）
本発明は、１６ＳリボゾームＲＮＡ分析で決定したところＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属の細菌に最も類似する、新規細菌種を提供する。この新種は、本発明のもう一つの側面を構成するカロテノイド含有小胞を産生し、分泌する。その１６ＳリボソームＲＮＡがＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に類似することから、以下、この新種をＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株と呼ぶが、おそらくこの新規細菌は新しい属の最初の分離菌に相当するのだろう。
現在Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属には相異なる８つの種が関連づけられており、そのうちの一つはある生育条件下に黄色色素を呈するものの、いずれもカロテノイドを産生しない。さらに、原核生物界に属する種で、（分解過程とは対立ものとして）その生活環中にその成長培地に相当量のカロテノイドを分泌するものは、今までのところ知られていない。また、科学上知られている細菌種で成長培地にカロテノイド含有小胞を分泌するものはない。
したがって、本発明はさらに、β−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、ゼアキサンチンなど（ただしこれらに限らない）のカロテノイドを生産する方法であって、炭素源、窒素源および無機物質源を含む栄養培地で細菌種を培養し、その細菌細胞、そこから分泌された小胞および／またはその成長培地から個々のカロテノイド色素もしくはカロテノイド色素の混合物を回収することからなる方法を提供する。
【００３２】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、例示を目的として、後述する添付の図面を参照して本発明を説明する。
本発明は新規細菌種を提供する。１６ＳリボソームＲＮＡホモロジー分析で決定すると、本発明の新規細菌種は、現在知られているすべての細菌属のうちＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に最も類似する。しかし、この新種はカロテノイド小胞を産生し分泌するという未だかつて報告されたことのない現象を示すので、これは新しい属の最初の分離菌であると考えられる。さらに本発明は、成長培地にカロテノイドを分泌する細菌種を使ってカロテノイドを生産する方法と、そのようにして得られる産物および調製物をいくつか提供する。
特許請求の範囲を含む本明細書で使用する「小胞」という用語は、実質上球状の親油性の任意の物体であって、生命の形でないもの、すなわち繁殖できないものを指す。この用語のこのような用法は生物学の分野では受け入れられている。
原核生物分類法はしばしば新しい知見および／または既存の知見の新しい評価によって改変されることに留意すべきである。したがって、本発明の新規細菌種がカロテノイドを産生するのに対して、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する他の既知の種はいずれもカロテノイドを産生しないことから、この新規細菌種はまだ知られていない新しい属の一種であると仮定される。またこの新種が小胞の形でカロテノイドを分泌するという事実は、この新種が新しい属の最初の標本であるという概念を補強するものである。
特許請求の範囲を含む本明細書で使用する「最も類似する」という用語は先行技術の細菌属だけに適用され、その類似性は１６ＳリボソームＲＮＡ相同性分析に基づく。したがって一態様として本発明は、１６ＳリボソームＲＮＡに関する限りＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属の種に最も類似する任意のカロテノイド産生細菌種に関する。もう一つの態様として本発明は、任意のカロテノイド産生および分泌細菌種に関する。
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属は代謝的にはかなりの多様性を示すグラム陰性の球菌または短桿菌からなる。代表的な種は広範な有機化合物で好気的に生育できる。いくつかの種は硝酸塩を電子受容体として使用することにより、無機的にも生育でき、代表的な種の一部は化学合成独立栄養成長の電子受容体として水素を使用できる。この属は、系統発生論的には、プロテオバクテリアのα−３サブクラスに属する。
【００３３】
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属では現在次の８つの種が認識されている：Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（この属の基準種）［Ａ．Ｂａｌｏｗｓ、Ｈ．Ｇ．Ｔｒｕｐｅｒ、Ｍ．ＤｗｏｒｋｉｎおよびＫ．−Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ編「ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ： ｅｃｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（原核生物．細菌の生物学に関するハンドブック：生態生理学、分離、同定、応用）」第２版第３巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ・ニューヨーク）の２３２１−２３３４頁ｖａｎ Ｖｅｒｓｅｖｅｌｄ，Ｈ．Ｗ．およびＡ．Ｈ．Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ（１９９２）「Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属」；Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎ，Ｓ．、Ｍ．Ｔ．Ｍｏｓｓ、Ｊ．Ｌ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｊ．Ｈｅｒｍｏｎ−ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｊ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（１９８９）「多様な細菌からＤＮＡを単離するための簡単な酵素法」Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：５９−６４］、Ｐ．ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ［Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．、Ａ． ＨｉｒａｉｓｈｉおよびＨ．Ｋｕｒａｉｓｈｉ（１９９５）「チオシアネート資化性通性化学合成無機栄養生物の新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ（新種）と、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓ（新組合せ）としてのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属への属の改訂を伴う帰属変更」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４６９−１４７７］、Ｐ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ（かつてはＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓとして知られていた）［Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．、Ａ． ＨｉｒａｉｓｈｉおよびＨ．Ｋｕｒａｉｓｈｉ（１９９５）「チオシアネート資化性通性化学合成無機栄養生物の新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ（新種）と、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓ（新組合せ）としてのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属へのその属の改訂を伴う帰属変更」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４６９−１４７７］、Ｐ．ｋｏｃｕｒｉｉ［Ｏｈａｒａ，Ｍ．、Ｙ．Ｋａｔａｙａｍａ、Ｍ．Ｔｓｕｚａｋｉ、Ｓ．ＮａｋａｍｏｔｏおよびＨ．Ｋｕｒａｉｓｈｉ（１９９０）「テトラメチルアンモニウム同化性細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｋｏｃｕｒｉｉ（新種）」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４０：２９２−２９６］、Ｐ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ［Ｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．、Ｊ．Ｔａｍａｏｋａ、Ｋ．ＳｕｚｕｋｉおよびＫ．Ｋｏｍａｇａｔａ（１９８９）「好アルカリ性通性メチロトローフ細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ（新種）」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：１１６−１２１］、Ｐ．ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ［Ｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．、Ｈ．Ａｒａｋｉ、Ｈ．Ｏｙａｎａｇｉ、Ｋ．ＳｕｚｕｋｉおよびＫ．Ｋｏｍａｇａｔａ（１９９０）「Ｎ，Ｎ’−ヂメチルホルムアミドを資化する新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｓと新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４０：２８７−２９１］、およびＰ．ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ［Ｓｉｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｆ．Ａ．Ｒａｉｎｅｙ、Ｅ．ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔおよびＪ．Ｗｉｎｔｅｒ（１９９６）「土壌由来の新しいグラム陰性アセトン分解性硝酸塩還元性細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ（新種）」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ４６：１１２５−１１３０］。
【００３４】
先にＰ．ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓとして知られていた株は、最近、その系統発生的関係からＨａｌｏｍｏｎａｓ属に移された［Ｄｏｂｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＰ．Ｄ．Ｆｒａｎｚｍａｎｎ（１９９６）「属Ｄｅｌｅｙａ（Ｂａｕｍａｎｎら，１９８３）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ（Ｖｒｅｅｌａｎｄら，１９８０）およびＨａｌｏｖｉｂｒｉｏ（Ｆｅｎｄｒｉｃｈ １９８８）と種Ｐａｒａｃｏｃｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＧｉｂｂｏｎｓ １９５２）の単一の属Ｈａｌｏｍｏｎａｓへの統一と属Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒの科Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅへの配置」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：５５０−５５８］。
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属の既知の８種はいずれもカロテノイドを産生しない。
栄養寒天平板上で汚染菌として現れたグラム陰性の明橙色球状細菌が、以下に詳述するように分離され、特徴づけられた。
表現型による特徴づけと、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列比較に基づく系統分析により、この細菌はＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属のこれまで知られていなかった種として分類されるべきであることが明らかになった。ここに我々は、この分離菌にＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ（新種）という名前を提案し、その特徴を記載する。
【００３５】
さらに、既に上述したように、また下記の実施例で詳しく証明するように、この新規細菌種は専用の小胞に入れられたカロテノイドを産生しかつ分泌するという、どの原核生物にも未だかつて報告されたことのない現象を示す。したがって本発明の新規細菌種はおそらく新しい属の最初の分離菌に相当するものと思われる。
この新しい分離菌の重要な特徴は様々なカロテノイドの産生と培地へのそれらの小胞性分泌とであるが、これまでに知られている細菌種で、その生活環中にカロテノイドを産生しかつ分泌するものはない。したがってもう一つの側面からみれば本発明は、（分解に関係する分泌に対立するものとして）その生活環中にカロテノイドを分泌する任意の細菌種、具体的にはカロテノイド小胞を分泌する株に関する。
カロテノイド分泌は小胞性であるので、本発明のもう一つの側面は、カロテノイド含有小胞、それを含む調製物および培地に関する。
この新しい分離菌はβ−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンを産生し分泌する。したがって本発明のもう一つの側面は、ここに記述するような本発明のカロテノイド生産法のいずれかに従って生産されたカロテノイドに関する。
【００３６】
したがって本発明のもう一つの態様は、β−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチン（ただしこれらに限らない）などといった少なくとも一つのカロテノイド色素の生産方法に関する。これらのカロテノイドのいくつかを図３にその化学式で表す。
本方法は次の段階を含む。第一に、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に最も類似する細菌種を、炭素源、窒素源および無機物質源を含む液体または固体栄養培地で培養してその成長、カロテノイド色素の産生、および好ましくはそれらの成長培地への分泌を維持する。第二に、個々のカロテノイド色素またはカロテノイド色素の混合物を培地および／またはその種の細胞から回収する。収量が最大になるように精密な生育および回収法を設計する方法は、当業者にはわかるだろう。
本発明によれば、カロテノイドを分泌する任意の細菌種、またはカロテノイドを産生しＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に最も類似する（本明細書でいうところの「最も類似する」）任意の種を使用できる。
これらの細菌のうち、具体的な一微生物としてＰ．ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株を挙げることができる。この株は本発明者らによって新たに分離され、ブダペスト条約に基づき、１９９７年６月４日に、ＤＳＭ１１５７４株としてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）に寄託されている。
Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。
【００３７】
本微生物を用いるカロテノイド生産用の培地は、例えば次のとおりである。すなわち、それは、生産微生物の成長に必要な炭素源、窒素源および無機塩と、必要であれば、特別な必須物質（例えばビタミン、アミノ酸、核酸など）とを含有する。
炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトースなどの糖類；酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、マロン酸などの有機酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、グリセロールなどのアルコール；ダイズ油、米ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、亜麻仁油などの油脂が挙げられる。炭素源の添加量はその炭素源の種類に応じて変動するが、通常は培地１リットルあたり１〜１００ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。
窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素などが単独で、または組み合わせて使用される。窒素源の添加量はその窒素源の種類に応じて変動するが、通常は培地１リットルあたり０．１〜３０ｇ、好ましくは１〜１０ｇである。
無機塩類としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸第一マンガン、塩化第一マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸第二銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどを単独でまたは組み合わせて使用できる。無機酸の量はその無機塩の種類に応じて変動するが、通常は培地１リットルあたり０．００１〜１０ｇである。
【００３８】
特別な必須物質としては、ビタミン、核酸、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、乾燥酵母などを単独でまたは組み合わせて使用できる。特別な必須物質の使用量はその物質の種類に応じて変動するが、通常は培地１リットルにつき０．２〜２００ｇ、好ましくは３〜１００ｇである。
培地のｐＨ値５をｐＨ２〜１２、好ましくは６〜９に調節する。培養は１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の温度で１〜２０日間、好ましくは１〜４日間、振盪または曝気／撹拌によって提供される好気条件下に行なわれる。
最後にカロテノイドをその培養から分離、精製できる。すなわち、微生物細胞を培養から遠心分離やろ過などの従来の手段で分離し、その細胞または培地を適当な溶媒による抽出処理にかける。抽出前に行なってもよい好ましい段階として、カロテノイドが充填された小胞を、例えば限外ろ過やろ過などによって、培地から回収してもよい。
抽出用の溶媒としては、カロテノイドが溶解する任意の物質を使用できる。例えばアセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ベンゼン、二硫化炭素、ジエチルエーテルなどの有機溶媒を使用し、好ましくはクロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールを使用する。精製は吸着、溶出、溶解などの従来の方法を単独で行なうか、好ましくは組み合わせて行なうことによって実施できる。
【００３９】
本発明によれば、多くの場合、β−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンが同時に生産され、培養細胞および／または培地中に存在する。
したがって本発明の一実施の形態として、上述のカロテノイドまたはその他のいずれか一つを、上述の方法で個別に得ることができる。あるいは、カロテノイドの混合物を得ることもできる。このように本発明のカロテノイド生産方法には、個々のカロテノイドの生産方法と、カロテノイドの混合物の生産方法が含まれる。
アスタキサンチンとアドニキサンチンは、例えば吸着／溶出カラムクロマトグラフィー、微分抽出、向流抽出および分画晶出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）などといった従来のカロテノイド相互分離法に従って互いに分離できる。また、個々のカロテノイドを生産するために、培地組成、培養条件などを制御することによって所望のカロテノイドを優先的に生成させることもできる。
【００４０】
例えば生産されるカロテノイドの比は、好気条件を変えることによって変化させることができる。例えば生産されるカロテノイドの比は、フラスコ振盪培養時の培地の量または振盪速度によって、もしくは曝気／撹拌培養時の空気供給速度または撹拌速度を変えることによって、変化させることができる。
また特定のカロテノイドを優先的に生産するために、生産微生物を突然変異誘発（例えばその生産微生物の人工的突然変異誘発など）によって、突然変異型微生物が所望のカロテノイドを特に優先的に産生するように改良することもできる。そのような突然変異誘発処理には、例えばＸ線照射、ＵＶ照射などの物理的方法；Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の使用などといった化学的方法；および遺伝子組換え技術などの生物学的方法がある。
そのような改良型突然変異体を用いたカロテノイドの生産方法は本発明のカロテノイド生産方法に包含される。
本方法によって生産されるアスタキサンチンでは、（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンの純度がほとんど１００％である。エビ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、サケ、マス、マダイなどの天然産物に含まれるアスタキサンチン中の（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンの比率は高いことが知られている。一方、Ｐｈａｆｆｌａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａは（３Ｒ，３’Ｒ）−アスタキサンチンを高い比率で含有することが知られており、その絶対配置は天然産物の大半に含まれるアスタキサンチンのそれとは反対である。
【００４１】
本方法によって生産されるアスタキサンチンは、そのほとんど１００％が（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンであり、その絶対配置は自然界に存在するアスタキサンチンの大半と同じであるため、本方法によって生産されるアスタキサンチンは産業上価値がある。また（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンの化学合成は知られているが（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６１，２６０９，１９７８）、光学的に純粋な（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンを出発物質として使用するので、その方法は高コストで、産業上有利でない。
また、本方法によって生産されるアスタキサンチンは実質的に全トランス−アスタキサンチンを含有する。全トランス−アスタキサンチンは天然型であり、本生産微生物はそれらが天然型アスタキサンチンを産生するという点で有利である。シス−アスタキサンチンから全トランス−アスタキサンチンを製造することは困難だが、シス−アスタキサンチンが必要な場合は、既知の方法に従って全トランス−アスタキサンチンからこれを得ることができる。
以下、実施例に言及する。下記の実施例は上述の説明と共に本発明を例証するものである。
【００４２】
（実施例）
下記実施例では次のプロトコルと実験上の細目を参照する。
《生物源》 これ以降Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ＭＨ１株またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ（新種）と呼ぶ株は栄養寒天平板を汚染する単一の明橙色コロニーとして現れた。
《培地および培養条件》 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ＭＨ１株は通例、１リットルあたり１０ｇのバクトトリプトン、５ｇのバクト酵母エキスおよび５ｇのＮａＣｌを含む培地（ｐＨ７．０）中、２５℃で生育させた。液体培養は振とう水槽で生育させた。固体培地には１リットルあたり１５ｇのバクト寒天を加えた。下記実施例に明記するように、この培地の組成は、ＮａＮＯ₃、デンプン、より高濃度のＮａＣｌ、および他の成分の添加によって変更された。
《顕微鏡法》 培養物は位相差光学装置を装着したツァイス・スタンダード顕微鏡を使って調べ、写真撮影した。
《生理学的および生化学的特徴づけ》 カタラーゼ、チトクロムオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルギニンデヒドロラーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、アミラーゼの存在、硝酸塩での嫌気的成長などといった諸性質に関する試験を、Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ａ．Ｊ．およびＪ．Ｇ．Ｃｏｌｌｅｅ（１９７１）「定型的生化学試験」（Ｊ．Ｒ．ＮｏｒｒｉｓおよびＤ．Ｗ．Ｒｉｂｂｏｎｓ編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ・ロンドン）第６Ａ巻の１〜３２頁）に記述されているような標準的方法を使って行なった。
【００４３】
選択した生理学的特徴を、９種類の代謝能（硝酸塩の還元、トリプトファンからのインドールの生成、グルコースからの酸生成、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、ゼラチンとエスクリンの加水分解およびβ−ガラクトシダーゼ）と１２種類の炭素源（グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、グルコン酸、カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸およびフェニル酢酸）での好気的成長について調べるＡＰＩ２０ＮＥシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス・マーシーレトワール）で決定した。すべてのＡＰＩテストは製造者の指示に従って行なった。
他の炭素源の資化性を試験するために、９５基質のＢｉｏｌｏｇ社（カリフォルニア州ヘイワード）ＳＦ−Ｎ ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅマイクロタイタープレートを使用した。細胞をＡＰＩ２０ＮＥシステムのＡＵＸ培地（１リットルあたり２ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．５ｇの寒天、８２．８ｍｇの無機塩基、２５０ｍｇのアミノ酸類、４５．９ｍｇのビタミン類／栄養物質および４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する）に懸濁した。各１４０μｌをＢｉｏｌｏｇ社マイクロタイタープレートのウェルに加え、３０℃で２〜３日培養した後、成長に関してウェルを調べた。
選択した基質での成長を、さらに、１リットルあたり０．５ｇのバクトトリプトン、０．２５ｇのバクト酵母エキス、５ｇのＮａＣｌおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含む液体培地３０ｍｌを使って、１００ｍｌエルレンマイヤー・フラスコで試験した。この低栄養培地に１リットルあたり被験物質２．５ｇを補足し、成長を非補足培地での成長と比較した。
【００４４】
脂肪酸分析は、基本的にＳｉｌｌｅｒ Ｈ、Ｒａｉｎｅｙ ＦＡ、Ｓｔａｃｋｂｅｒａｎｄｔ ＥおよびＷｉｎｔｅｒ Ｊ（１９９６）「土壌由来の新しいグラム陰性アセトン分解性硝酸塩還元性細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ（新種）の分離と特徴づけ」Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：１１２５−１１３０に記述されているように行なった。ポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの生成は、乾燥細胞ペレットをクロロホルムで抽出し、その抽出物を乾燥し、濃硫酸と共に加熱した後にクロトネートの生成を分光法で評価することによって試験した。
《ＤＮＡ塩基組成》 ＤＮＡはＶｉｓｕｖａｎａｔｈａｎらに従ってヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィーによって分離、精製した［Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎ，Ｓ．、Ｍ．Ｔ．Ｍｏｓｓ、Ｊ．Ｌ． Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｊ．Ｈｅｒｍｏｎ−ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｊ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（１９８９）「多様な細菌からＤＮＡを単離するための簡単な酵素法」Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：５９−６４］。Ｇ＋Ｃ含量は、Ｍｅｓｂａｈらが記述しているように高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて決定した［Ｍｅｓｂａｈ，Ｍ．、Ｕ．ＰｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎおよびＷ．Ｂ．Ｗｈｉｔｍａｎ（１９８９）「高性能液体クロマトグラフィーによるデオキシリボ核酸のＧ＋Ｃ含量の正確な測定」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：１５９−１６７］。
《１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の配列決定》 ゲノムＤＮＡ抽出、１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲによる増幅およびそのＰＣＲ産物の精製は記述されているように行なった［Ｄｅ Ｓｏｅｔｅ，Ｇ．（１９８３）「近接データに追加の木をフィッティングするための最小二乗アルゴリズム」Ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｋａ ４８：６２１−６２６］。精製したＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TMダイ・ターミネーター・シーケンシング・レディ・リアクション・キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ・ドイツ）を製造者のプロトコルに指示されているように使用して配列決定した。配列決定反応をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーを用いて電気泳動した。得られた配列データを整列エディタａｅ２［Ｍａｉｄａｋ、Ｂ．Ｌ．、Ｇ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、Ｎ．Ｌａｒｓｅｎ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＣａｕｇｈｅｙおよびＣ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ（１９９６）「リボソーマルデータ−ベースプロジェクト（ＲＤＰ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：８２−８５］に入力し、手動で整列し、プロテオバクテリアのα−亜門のＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒグループに属する代表的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と比較した。比較のために１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をリボソーマル・データベース・プロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）のＥＭＢＬデータベースから入手した［Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．、Ｇ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、Ｎ．Ｌａｒｓｅｎ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＣａｕｇｈｅｙおよびＣ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ（１９９６）「リボソーマルデータ−ベースプロジェクト（ＲＤＰ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：８２−８５］。系統樹状図を構築するために、ＰＨＹＬＩＰパッケージ［Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．（１９９３）ＰＨＹＬＩＰ（系統推定パッケージ）バージョン３．５．１、ワシントン大学（シアトル）遺伝学部］の演算を使用した。２つずつの進化の距離をＪｕｋｅｓとＣａｎｔｏｒの補正による類似度％から計算した［Ｈ．Ｎ．Ｍｕｎｒｏ編「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ・ニューヨーク）の２１−１３２頁、Ｊｕｋｅｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ（１９６９）「タンパク質分子の進化」］。系統樹は進化の距離に基づく近隣結合法によって構築した［Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．およびＭ．Ｎｅｉ（１９８７）「近隣結合法：系統樹の新しい再構築法」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５］。系統樹状図の構築にはＤｅ Ｓｏｅｔｅの最小二乗距離法［Ｄｅ Ｓｏｅｔｅ，Ｇ．（１９８３）「近接データに追加の木をフィッティングするための最小二乗アルゴリズム」Ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｋａ ４８：６２１−６２６］を使用した。木（ｔｒｅｅ）の根（ｒｏｏｔ）はＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ３３９４２^Tの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列をこの分析に含めることによって決定した。
【００４５】
《ヌクレオチド配列アクセッション番号》 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＤＳＭ １１５７４の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列にはＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースアクセッション番号Ｙ１２７０３が割り当てられている。
《カロテノイド分析》 Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ細胞の一部を１３，０００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、水で１回洗浄した。Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉによって分泌される小胞の一部を超遠心機中４０，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８、ローターＳＷ５０．１、１９２，０００ｇ）での超遠心分離によって収集した。細胞、小胞を２００μｌのアセトンに再懸濁し、暗所にて６５℃で１０分間インキュベートした。細胞除去培地抽出のために、１０μｌの培地を２００μｌのアセトンと混合し、暗所にて６５℃で１０分間インキュベートした。試料を再び１３，０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離し、色素を含有するアセトン上清をきれいなチューブに入れた。その色素抽出物をＮ₂の気流下に送風乾固し、分析に必要になるまで−２０℃で保存した。
逆相ＨＰＬＣは２ｃｍの保護カラムをつけたＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ２，５μｍカラム（２５．０ｃｍ×０．４６ｃｍ）を使って行なった。０−６０％Ａ（０−１０分）、６０−７６％Ａ（１０−１５分）、７６％Ａ（１５−２２分）、７６−１００％Ａ（２２．１−２８．０分）の溶媒勾配を毎分１ｍｌの流速で使用した（Ａ＝酢酸エチル、Ｂ＝アセトニトリル／水（９／１ｖ／ｖ））。溶媒はＣＭ４０００三相ポンプシステムを用いて送出した。試料は２０μｌずつオンラインＲｈｅｏｄｙｎｅインジェクターユニットを通して注入した。ＨＰ１０４０Ａダイオードアレイ検出器を使って、スペクトルをオンラインで監視し、クロマトグラムを積分した。
【００４６】
ＴＬＣはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ₂₅₄シリカプレートで行なった。Ｒ_F値はそれぞれジエチルエーテル（ＴＬＣ系１）とヘキサン／酢酸エチル（３／２ ｖ／ｖ）（ＴＬＣ系２）の溶媒系に関するものである。
【００４７】
ＵＶ／可視電子吸収スペクトルは、再蒸留した、またはＨＰＬＣ用の、アセトンとジエチルエーテル中で記録した。各スペクトルはＣｅｃｉｌ ＣＥ ５５０１コンピューティング・ダブルビームＵＶ／可視分光光度計を使って記録した。微細構造の程度は％ＩＩＩ／ＩＩのピーク高の比として表され、ここに０値を２つの吸収ピーク間の最小値とし、最長波長吸収波長のピーク高をＩＩＩ、中央吸収波長のそれをＩＩと名付ける。微細構造を伴わない単一吸収ピークを示すアスタキサンチンなどの共役ケトカロテノイドの場合は、％ＩＩＩ値が０である。
質量分析は、低分解能（約１０００）で作動するＶＧ７０７０Ｈ二重収束磁気セクタ質量分析計で陽イオンＥＩを用いて行なった。データの収集と処理はＦｉｎｎｉｇａｎ社ＩＮＣＯＳ２３００データシステムで行なった。フルスキャンＭＳを、加速電圧２ｋＶ、総サイクルタイム３．５秒で４０〜７００のｍ／ｚ範囲にわたって記録した。プローブ温度は周囲温度から約３００℃まで約５分間で徐々に昇温した。スペクトルは７０ｅＶのイオン化ポテンシャルで記録した。
《電子顕微鏡法》 電子顕微鏡用の標本は０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の３％グルタルアルデヒドで終夜固定し、同緩衝液中で洗浄し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の１％ＯｓＯ₄で２時間、後固定した。脱水は一連のエチルアルコールとプロピレンオキサイド濃度中で行ない、Ｅｐｏｎ−８１２に包埋した。超薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した後、Ｊｅｏｌ−１０００ＣＸ電子顕微鏡で観察した。
《キラリティ立体配置》アスタキサンチンのキラリティー立体配置は、アスタキサンチンから誘導したジアステレオ異性カンファン酸エステルのＨＰＬＣによって決定した［Ｒｅｎｓｔｒｏｍ Ｂ，Ｂｏｒｃｈ Ｇ、Ｓｋｕｌｂｅｒｇ ＭおよびＬｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｓ（１９８１）「Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓから得られる（３Ｓ，３Ｓ）−アスタキサンチンの光学純度」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ２０：２５６１−２５６５］。
【００４８】
実施例１
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ＭＨ１の形態学的特徴
図４に示すように、Ｐｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株は、サイズが１〜２ｘ１〜１．５μｍの球菌ないし短桿菌を形成した。これは主としてペアおよび４〜５細菌までの短い鎖またはクラスターからなった。細胞は非運動性で、胞子を形成しなかった。ＭＨ１株はグラム陰性に染色された。寒天上のコロニーは平滑、平坦で明るい橙色だった。
実施例２
生理学的および生化学的特徴づけ
至適成長温度は２５〜３０℃だった。３５℃では成長が不十分だった。至適温度における標準的成長培地での倍加時間は２．３時間だった。培地中のＮａＣｌ濃度を１リットルあたり６ｇに増やすと成長が遅く、ＮａＣｌが１リットルあたり８ｇを超えると成長が起こらなかった。
次の炭素およびエネルギー源を成長に使用することができた：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノース、マルトース、セロビオース、Ｄ−ラクトース、メリビオース、スクロース、ツラノース、Ｄ−トレハロース、ゲントビオース（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｅ）、ラクツロース、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、グリセロール、エリトリトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、キシリトール、ｍ−イノシトール、アドニトール、Ｄ−アラビトール、プロピオン酸、シス−アコニット酸、クエン酸、ＤＬ−乳酸、マロン酸、キナ酸、コハク酸、リンゴ酸、ギ酸、Ｌ−アラニンおよびアラニンアミド。エスクリンとｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが加水分解された（β−グルコシダーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性）。Ｌ−フコース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、デキストリン、グリコーゲン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、β−メチルＤ−グルコシド、ＤＬ−α−グリセロールリン酸、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、メタノール、２，３−ブタンジオール、メチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン塩酸塩、ジメチルホルムアミド、Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ８０、酢酸、α−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ケト酪酸、α−ケト吉草酸、カプリン酸、アジピン酸、フェニル酢酸、メチルピルビン酸、グリシン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニルグリシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、Ｌ−スレオニン、ＤＬ−カルニチン、γ−アミノ酪酸、イノシン、ウリジンおよびチミジンでは、成長が起こらなかった。デンプンは加水分解されなかった。ゼラチン加水分解は弱いか、起こらなかった。アルギニンジヒドロラーゼ活性とウレアーゼ活性は検出されなかった。インドールはトリプトファンから生成しなかった。
【００４９】
代謝は偏性好気性である。チトクロームオキシダーゼ反応とカタラーゼ反応は陽性だった。硝酸塩は嫌気的成長を支えず、亜硝酸塩に還元されなかった。グルコースは発酵されなかった。
脂肪酸プロフィール（Ｃ１８：１が７９．４％、Ｃ１８：０が５．０％、Ｃ１０：０が６．２％、２つの未知ピークが合わせて９．４％）は、プロテオバクテリアのα−サブグループに特有のものである。ポリ−β−ヒドロキシアルカノエートは検出されなかった。
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ＭＨ１株の著しく際立った特徴はその強い橙色である。一定の成長培地で赤黄色コロニーを形成すると記載されているＰ．ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓを除くと［Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．、Ａ．ＨｉｒａｉｓｈｉおよびＨ．Ｋｕｒａｉｓｈｉ（１９９５）「チオシアネート資化性通性化学合成無機栄養生物の新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ（新種）と、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓ（新組合せ）としてのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属への属の改訂を伴う帰属変更」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４６９−１４７７］、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属の他の種はすべて無色である。
実施例３
ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
ＨＰＬＣ分析によって決定されたＭＨ１株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は６６モル％だった。
実施例４
ＭＨ１株の系統発生的関係
ＭＨ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の約９５％を、ＰＣＲ増幅した１６Ｓ ｒＤＮＡの直接配列決定によって決定した。１６Ｓ ｒＲＮＡ系統学のみに基づいて（下記表１の類似度値と図５の系統樹を参照されたい）、ＭＨ１株はプロテオバクテリアのα−亜門のＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒグループ内のＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に最も類似することを決定できた。 最も高い１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子類似度値はＭＨ１株とＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ ＪＣＭ ７３６４^T（９６．３％）またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｓ ＪＣＯＭ ７６８６^T（９６．２％）の間に存在する。ＭＨ１株はＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属の他の種とは遠い関係しかなく（配列類似度は９６．３〜９３．６％）、またこれはカロテノイドを産生し分泌するので、ＭＨ１株はここに初めて報告される新しい属の一員であるとみなしうる。
【００５０】
表１はＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉとそれに関連するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．に関する１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列の類似度行列である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子類似度値は整列した配列を一組ずつ比較することによって計算した。
ＭＨ１株の表現型特性は改訂されたＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属の記載の枠内に当てはまった［Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．、Ａ． ＨｉｒａｉｓｈｉおよびＨ．Ｋｕｒａｉｓｈｉ（１９９５）「チオシアネート資化性通性化学合成無機栄養生物の新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ（新種）と、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｖｅｒｓｕｔｕｓ（新組合せ）としてのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属への属の改訂を伴う帰属変更」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４６９−１４７７］。我々はＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ＭＨ１株を、イスラエルの遺伝学研究の先駆者である故Ｍｅｎａｓｈｅ Ｍａｒｃｕｓ教授に敬意を表して、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉと名付けることを提案する。
【表１】

下記表２にＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株と、以前に記載されたＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属の代表種との特性の比較を要約する。
【表２】

１．Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ、
２．Ｐ．ｄｅｎｔｒｉｆｉｃａｎｓ、
３．Ｐ．ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ、
４．Ｐ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ、
５．Ｐ．ｋｏｃｕｒｉｉ、
６．Ｐ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ、
７．Ｐ．ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、
８．Ｐ．ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、
９．Ｐ．ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、ｗ＝弱い反応、±＝不定、ＮＲ＝報告なし。Ｐ．ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓは黄色に着色しているので、これを東京大学分子細胞生物学研究所（１１３東京都文京区弥生）ＩＡＭカルチャーコレクション細菌セクションから入手し、カロテノイド産生について調べた。上記方法の項に挙げた方法のいずれを使ってもカロテノイドは検出できなかった。
【００５１】
実施例５
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉによるカロテノイド合成
次のカロテノイドを、上記方法の項に記述したように生育したＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の細胞、培地および／または小胞から回収した。
β−カロテン：Ｒ_F＝０．９８（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．９８（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでβ−カロテン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ（４２６）４５３および４７７（アセトン）；（４２６）４４９および４７６（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝２２。ＭＳ ｍ／ｚ ５３６［Ｍ］⁺、４４４［Ｍ−９２］⁺、４３０［Ｍ−１０６］⁺。
エチネノン：Ｒ_F＝０．９２（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．９４（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでエチネノン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４６０（アセトン）；４５７（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５５０［Ｍ］⁺、４５８［Ｍ−９２］⁺。
β−クリプトキサンチン：Ｒ_F＝０．８４（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．８０（ＴＬＣ２）、標品は入手不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ （４２６）４５４および４７８（アセトン）；（４２３）４５３および４７７（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝２７。ＭＳを行なうには量が不十分。
カンタキサンチン：Ｒ_F＝０．７１（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．６５（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでカンタキサンチン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４７０（アセトン）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５６４［Ｍ］⁺、４７２［Ｍ−９２］⁺。
アドニルビン：Ｒ_F＝０．６５（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．５８（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでアドニルビン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４７３（アセトン）；４６５（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５８０［Ｍ］⁺、４８８［Ｍ−９２］⁺。
シス−アドニキサンチン：Ｒ_F＝０．５７（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．５１（ＴＬＣ２）、標品は入手不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４６５（アセトン）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５８２［Ｍ］⁺、５８０［Ｍ−２］⁺、５６４［Ｍ−１８］⁺、４９０［Ｍ−９２］⁺。
アドニキサンチン：Ｒ_F＝０．５９（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．５１（ＴＬＣ２）、標品は入手不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４６５（アセトン）；４６３（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５８２［Ｍ］⁺、５８０［Ｍ−２］⁺、５６４［Ｍ−１８］⁺、５０９［Ｍ−７３］⁺、４９０［Ｍ−９２］⁺。
アスタキサンチン：Ｒ_F＝０．５５（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．４８（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでアスタキサンチン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ ４７４（アセトン）、ＮａＢＨ₄還元後に（４２８）４５１、４７８；４７０（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝０。ＭＳ ｍ／ｚ ５９６［Ｍ］⁺、５７８［Ｍ−１６］⁺、５６４［Ｍ−３２］⁺、４９０［Ｍ−１０６］⁺。
ゼアキサンチン：Ｒ_F＝０．４３（ＴＬＣ１）、Ｒ_F＝０．４３（ＴＬＣ２）、ＴＬＣとＨＰＬＣでゼアキサンチン標品と分離不可能。Ｖｉｓλ_max ｎｍ （４２６）４５３および４７７（アセトン）；（４２６）４４９および４７６（ジエチルエーテル）、％ＩＩＩ／ＩＩ＝４５。ＭＳを行なうには量が不十分。
【００５２】
表３にＰ．ｍａｒｃｕｓｉｉ細胞中の上記カロテノイドの総含有量と分布を示す。
【表３】

実施例６
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉの透過型電子顕微鏡法
Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の細胞による成長培地へのカロテノイド排出という現象を、透過型電子顕微鏡を使って調べた。この機構に特定の細胞構造が関与する可能性と、そのような構造が細胞のどの発育段階で現れるかを決定した。
図６ａは、ＯＤ₆₀₀が０．７の細胞密度の懸濁培養中の、対数増殖期中期の典型的細胞を示す。少数の親油性小球（小胞）が分裂細胞内にはっきりと見える。これら小球の数はその切片の位置により細胞ごとにかなり異なる。培養が加齢するにつれて小球の数は増加するが、細胞内にはより小さい小球も多数みえるようになる。これは、ＯＤ₆₀₀が１．３の細胞密度の対数増殖期後期の細胞を示す図６ｂで観察できる。大きい小球は細胞の周縁部に移動し、細胞周辺腔に入ることが観察される。次にそれらの小球は細胞壁を横切って細胞外に現れる小さい円状の小胞中に移動する。これら小球の細胞壁からの疱状突起は、最初はまだ細胞の表面に結合したままの暗く染まった（従って親油性の）小胞の形成をもたらす。この現象は図６ｃではっきりと識別できる。これ以降の段階では、図６ｄにみられるように、細胞の表面がこれらの小胞で覆われるようになり、完全に独立した物体を形成し、ついにはそれが成長培地中に放出される。
ＯＤ₆₀₀が１．５８の細胞密度の増殖定常期の懸濁培養から採取した培地の分析により、これらの小胞が培地中に独立した物体として存在することがわかる（図７）。これら小胞のカロテノイド分析により、それらが主としてアドニキサンチンを含有することが明らかになった（下記表４）。これらの小胞は簡単なサイズ分離技術、例えば分画遠心法や濾過など（ただしこれらに限らない）によって、細菌細胞から容易に分離できる。分画遠心法では、細胞をまず成長培地から第一の速度で除去し、小胞はその後に、より高い速度での遠心分離（例えば超遠心）によって除去される。
【００５３】
細胞培養の加齢中の細胞内でのカロテノイド蓄積は細菌細胞内に見られる暗く染まった親油性小球の出現と完全に相関する。さらに、液体成長培地中に放出された小胞の出現は、細胞外でのカロテノイドの出現と相関する。最後に、成長培地からの超遠心分離によって単離された精製小胞調製物には、主としてケトカロテノイドが認められる（表４参照）。
【表４】

Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ培養の培養中に観察される成長培地の変色の原因となるのは、これらカロテノイド含有小胞の排出である。さらに、分泌された（すなわち培地に関係する）カロテノイドの実質上全てが小胞画分内にあることが定量的に確認された。
実施例７
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉによって産生されるアスタキサンチンのキラリティ立体配置の決定
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉによって産生されるアスタキサンチンのキラリティ立体配置を、そのアスタキサンチンから誘導したジアステレオ異性カンファン酸エステルのＨＰＬＣによって決定した［Ｒｅｎｓｔｒｏｍ Ｂ，Ｂｏｒｃｈ Ｇ、Ｓｋｕｌｂｅｒｇ ＭおよびＬｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｓ（１９８１）「Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓから得られる（３Ｓ，３Ｓ’）−アスタキサンチンの光学純度」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ２０：２５６１−２５６５］。この分析により、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉは純粋な（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンを合成することが証明された。
このように本発明は、カロテノイド類、とりわけ（３Ｓ，３’Ｓ）アスタキサンチンを分泌する新規細菌種（これはカロテノイド精製工程を簡便にする）を提供することにより、現在知られている構成の欠点にうまく対処するものである。
本発明を限られた数の態様について説明したが、数多くの変更、修正および他の応用を施しうることは理解されるだろう。
【配列表】
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １４３０塩基対
（Ｂ）型： 核酸
（Ｃ）鎖の数： 二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号１：

【図面の簡単な説明】
【図１】 β−カロテン生合成の一般（ｇｅｎｅｒａｌ）生化学経路を示す図である。この経路では全ての分子が全トランス配置で描かれている。図中、ＩＰＰはイソペンテニルピロリン酸、ＤＭＡＰＰはジメチルアリルピロリン酸、ＧＰＰはゲラニルピロリン酸、ＦＰＰはファルネシルピロリン酸、ＧＧＰＰはゲラニルゲラニルピロリン酸、ＰＰＰＰはプレフィトエンピロリン酸である。
【図２】 アスタキサンチンの生合成経路を示す図である。
【図３】 新種Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株によって産生されるいくつかのカロテノイドを示す図である。
【図４】 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の位相差顕微鏡写真である。線分は１０μｍに相当する。
【図５】 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属の代表種とプロテオバクテリアのα−分岐内の関連種のなかでのＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の位置を示す樹状図である。目盛線は１００ヌクレオチドあたり１０ヌクレオチド置換を示す。
【図６】 ａ〜ｄはそれぞれ対数増殖期中期、対数増殖期後期、増殖定常期初期、増殖定常期後期におけるＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株の電子顕微鏡写真である（倍率×４０，０００）。
【図７】 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株によって分泌される単離された小胞の電子顕微鏡写真である（倍率×２００，０００）。

Claims (17)

1. （ａ）Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属の細菌種を炭素源、窒素源および無機物質源を含む栄養培地中で培養し、（ｂ）個々のカロテノイド色素またはカロテノイド色素の混合物を回収する各段階を含む、少なくとも一つのカロテノイド色素の生産方法であって、前記細菌種が、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ ＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎにＤＳＭ１１５７４として寄託されているＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株である、前記生産方法。
2. 前記少なくとも一つのカロテノイド色素がβ−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される、請求項１記載の生産方法。
3. 前記回収が前記培地から行なわれる、請求項１記載の生産方法。
4. 前記回収が前記細菌種の細胞から行なわれる、請求項１記載の生産方法。
5. 前記細菌が、小胞に入った前記カロテノイド色素を分泌する、請求項１記載の生産方法。
6. Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ ＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎにＤＳＭ１１５７４として寄託されている、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ ＭＨ１株。
7. 前記回収が前記小胞から行なわれる、請求項５記載の生産方法。
8. 少なくとも一つのカロテノイド色素の生産のための、請求項６記載の細菌種の使用。
9. カロテノイド含有小胞の生産のための、請求項６記載の細菌種の使用。
10. 少なくとも一つのカロテノイドを含む、請求項６記載の細菌種を培養している成長培地。
11. 少なくとも一つのカロテノイド色素の生産のための、請求項１０記載の成長培地の使用。
12. 前記少なくとも一つのカロテノイド色素がβ−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される、請求項１０記載の成長培地。
13. 前記少なくとも一つのカロテノイド色素がβ−カロテン、エチネノン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビン、シス−アドニキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される、請求項１１記載の使用。
14. 段階（ｂ）が：（ｂ１）前記細菌種の細胞をペレット化するのに足りる第一の速度で前記液体培地を遠心分離し、（ｂ２）カロテノイド含有小胞を含む上清を収集し、（ｂ３）そのカロテノイド含有小胞をペレット化するのに足りる第二の速度でその上清を遠心分離する各段階を含む、請求項７記載の生産方法。
15. さらに、（ｂ４）前記小胞のペレットを収集する段階を含む、請求項１４記載の生産方法。
16. 段階（ｂ）が、サイズ分離技術を使用して、前記カロテノイド含有小胞を前記細菌種の細胞から分離する段階を含む、請求項５記載の生産方法。
17. 前記サイズ分離技術が、分画遠心法と濾過とからなる群より選択される、請求項１６記載の生産方法。

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