JP5660543B2 - 新規細菌株、培養物及びカロテノイド色素の製造方法 - Google Patents
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Description
アスタキサンチンは、マダイ、サケ等の魚類;カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類に広く分布している。そこで、天然由来のアスタキサンチンを得る方法として、甲殻類からアスタキサンチンを抽出する方法が提案されている。しかし、抽出効率が低いため抽出量が少なく、コストが高くなるという問題点があった。また、天然資源の減少から、資源確保の点でも商業的に問題点があった。
そこで、アスタキサンチンを産生する細菌が探索され、これまでに、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アルテロモナス属、ピポモナス属、カリオファノン属、エリスロバクター属、パラコッカス属等に属する細菌が報告されている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法を提供することを課題とする。
(1)アルターエリスロバクター属JPCC MB0017−6株(受託番号:NITE BP−808)。
(2)(1)に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
(3)(2)に記載の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物。
(4)(1)に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
本発明のアルターエリスロバクター属JPCC MB0017−6株(受託番号:NITE BP−808)は、アルターエリスロバクター属JPCCMB0017株の変異株である。以下、本明細書において、「アルターエリスロバクター属JPCCMB0017株」のことを「野生株」と略記することがある。また、「アルターエリスロバクター属JPCC MB0017−6株(受託番号:NITE BP−808)」のことを「変異株」と略記することがある。
また、本発明において、「カロテノイド色素」とは、炭素数40のポリエン構造を基本骨格とする色素のことを指し、カロテン、リコペン等の炭化水素や、キサントフィル等のアルコール類を含み、β−カロテン、アスタキサンチン、β−カロテンがアスタキサンチンに変換される過程で生じる種々の有用なカロテノイド色素が例示できる。
カロテノイド色素として、より具体的には、カロテン、リコペン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、ハイドロエキネノン、ルテイン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、β−クリプトキサンチン等が例示できる。
本発明の変異株は、野生株に対して、ケミカルミューテーションを行うことで獲得した。より具体的には、以下の通りである。
野生株は、本出願人により、平成16年12月3日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8(郵便番号 292−0818))に寄託されている(受託番号:NITE P−48)。
また、本発明者らは、寄託にあたり野生株を天然より獲得しており、以下にその獲得手順を示す。
野生株に対して、下記手順でDNAアルキル化剤を使用したケミカルミューテーションを行った。
まず、野生株をマリンブロス(Marine Broth、以下、MBと略記することがある)2216培地(Becton Dickinson社製)で24時間培養し、遠心分離により回収した。
次いで、1×109cellsのJPCCMB0017株を、1.0〜5.0%のエチルメタンスルホネート(EMS)を含む、pH7.0の15mMリン酸緩衝液1ml中で、30℃にて30〜60分間インキュベートし、突然変異誘導を行った。
次いで、得られた菌体をリン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSと略記する)で二回洗浄した後、前記MB2216培地で、30℃にて2時間、復活培養した。
次いで、PBSで洗浄した後、得られた菌体をMB寒天培地に塗布し、30℃にて3〜7日間インキュベートした。
以上により、変異株を獲得した。
獲得した変異株の性質は、コロニーの色以外は、すべて野生株と同じであった。より具体的には、以下の通りである。
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:(0.6−0.7)×(2.0−3.0μm)(伸長型有り)
胞子の有無:−
運動性(鞭毛の着生状態):−
多形性:−
(2−1)培地:マリンアガー(マリンブロス2216(Becton Dickinson社製)+1.5%寒天)
温度:25℃
色素産生:+
色調:赤色
光沢:+
(2−2)培地:マリンブロス2216
温度:25℃
表面発育:−
培地の混濁:+
(2−3)ゼラチン穿刺培養
温度:25℃
生育:−
ゼラチン液化:−
(2−4)リトマス・ミルク
温度:25℃
凝固:−
液化:−
グラム染色性:−
硫酸塩の還元:+
脱窒反応:−
MRテスト:−
VPテスト:+
インドール産生:−
硫化水素の生成:−
デンプンの加水分解:−
クエン酸の利用(Koser):−
クエン酸の利用(Christensen):−
無機窒素源の利用(硝酸塩):−
無機窒素源の利用(アンモニウム塩):−
ウレアーゼ:−
カタラーゼ:+
オキシダーゼ:+
生育(pH5):−
生育(pH8):+
生育(pH9):+
生育(20℃):+(弱)
生育(25℃):+
生育(30℃):+
生育(37℃):+(弱)
生育(塩濃度0%):−
生育(塩濃度1%):+(弱)
生育(塩濃度2%):+
生育(塩濃度3%):+
生育(塩濃度7%):+(弱)
生育(塩濃度10%):−
嫌気的生育性:−
O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
L−アラビノース:−/−
D−グルコース:−/−
D−フラクトース:−/−
マルトース:−/−
ラクトース:−/−
D−ソルビトール:−/−
イノシトール:−/−
D−キシロース:−/−
D−マンノース:−/−
D−ガラクトース:−/−
サークロース:−/−
トレハロース:−/−
D-マンニトール:−/−
グリセリン:−/−
β−ガラクトシダーゼ活性:+
アルギニンジヒドラーゼ活性:−
リジンデカルボキシラーゼ活性:−
トリプトファンデアミナーゼ活性:−
ゼラチナーゼ活性:−
エスクリン分解活性:+(弱)
馬尿酸の分解活性:−
マロン酸利用性:−
オルニチン脱炭酸反応:−
フェニルアラニン脱アミノ反応:−
コアグラーゼ活性:−
溶血性:−
フォスファターゼ活性:+
リパーゼ活性:+
レシチナーゼ活性:−
チトクロームオキシダーゼ活性:+
ブドウ糖:陰性
L−アラビノース:陰性
D−マンノース:陰性
D−マンニトール:陰性
N−アセチル−D−グルコサミン:陰性
マルトース:陰性
グルコン酸カリウム:陰性
n−カプリン酸:陰性
アジピン酸:陰性
d1−リンゴ酸:陰性
クエン酸ナトリウム:陰性
酢酸フェニル:陰性
DNA塩基組成(GC含量):59.1モル%
菌体脂質分析
主要キノン:ユビキノンQ−10
脂肪酸:
10:0 3OH 0.26%
12:0 2OH 0.13%
12:0 3OH 0.30%
14:0 0.17%
13:0 2OH 0.24%
15:0 1.32%
14:0 2OH 3.05%
16:0 5.82%
15:0 2OH 2.58%
17:0 ISO 0.08%
17:1 w8c 2.83%
17:1 w6c 2.95%
17:0 1.39%
16:1 2OH 0.09%
16:0 2OH 1.40%
18:1 w7c 71.90%
18:1 w5c 0.39%
18:0 0.20%
17:0 ISO 3OH 1.61%
18:1 2OH 0.24%
19:0 10 methyl 0.42%
類似脂肪酸をもつ菌種:Sphingomonas paucimobilis
類似度(S.I.):0.267
バクテリオクロロフィル産生(好気下):陰性
スフィンゴ脂質の存在:+
生育における塩(NaCl)要求性:+
変異株の16S rDNAの塩基配列を公知の方法で同定した結果、配列番号1に示す通りであり、野生株と同じであった。
本発明の変異株は、後述するように、同じ条件下でのカロテノイド色素の産生能が野生株よりも際立って高い、新規な細菌である。このように、カロテノイド色素の産生能が高い細菌は、アルターエリスロバクター属に属する細菌ではこれまでに知られていない。
また、本発明の変異株は、多様なカロテノイド色素の産生能を有し、しかも培養温度を調節することで、所望のカロテノイド色素を作り分けることができるという、従来のアルターエリスロバクター属に属する細菌には見られない優れた性質を有する。
本発明のカロテノイド色素の製造方法は、上記本発明の変異株を培養する工程を有するものである。そして、培養温度を適宜調節することで、変異株が産生するカロテノイド色素の組成を調節することができる。
変異株の培養は、野生株と同様の方法で行なうことができる。具体的には、以下の通りである。
前記炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類;エタノール、グリセロール等のアルコール類が例示できる。
炭素源の添加割合は、炭素源の種類にもよるが、概ね0.5〜3.0質量%程度であることが好ましい。
窒素源の添加割合は、窒素源の種類にもよるが、0.01%〜0.1質量%程度であることが好ましい。
無機塩類の添加割合は、無機塩類の種類にもよるが、0.001%〜0.01質量%程度であることが好ましい。
任意成分の添加割合は、任意成分の種類にもよるが、0.01%〜0.5質量%程度であることが好ましい。
アスタキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は20〜30℃であることが好ましく、23〜27℃であることがより好ましい。
エキネノンの産生量を向上させる場合には、培養温度は25〜40℃であることが好ましく、27〜33℃であることがより好ましい。
アドニキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は25〜40℃であることが好ましく、33〜37℃であることがより好ましい。
ゼアキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は30〜45℃であることが好ましく、33〜37℃であることがより好ましい。
カンタキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は25〜45℃であることが好ましく、33〜37℃であることがより好ましい。
β−クリプトキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は35〜45℃であることが好ましく、38〜42℃であることがより好ましい。
β−カロテンの産生量を向上させる場合には、培養温度は35〜45℃であることが好ましく、38〜42℃であることがより好ましい。
例えば、アスタキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のアスタキサンチン含有量を0.04質量%以上、全カロテノイド色素中のアスタキサンチン含有量を30質量%以上とすることができる。
エキネノンの場合、変異株の乾燥菌体中のエキネノン含有量を0.03質量%以上、全カロテノイド色素中のエキネノン含有量を11質量%以上とすることができる。
アドニキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のアドニキサンチン含有量を0.04質量%以上、全カロテノイド色素中のアドニキサンチン含有量を6.5質量%以上とすることができる。
ゼアキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のゼアキサンチン含有量を0.1質量%以上、全カロテノイド色素中のゼアキサンチン含有量を19.5質量%以上とすることができる。
カンタキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のカンタキサンチン含有量を0.005質量%以上、全カロテノイド色素中のカンタキサンチン含有量を1.5質量%以上とすることができる。
β−クリプトキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−クリプトキサンチン含有量を0.05質量%以上、全カロテノイド色素中のβ−クリプトキサンチン含有量を6質量%以上とすることができる。
β−カロテンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−カロテン含有量を0.5質量%以上、全カロテノイド色素中のβ−カロテン含有量を65質量%以上とすることができる。
例えば、培養温度を好ましくは20℃以上、より好ましくは23℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を0.12質量%以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは25℃以上、より好ましくは27℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を0.25質量%以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは30℃以上、より好ましくは33℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を0.55質量%以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは35℃以上、より好ましくは38℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を0.78質量%以上とすることができる。
また培養方法は、静置培養、振とう培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すれば良い。そして、通気培養することが好ましい。
例えば、前記培養物又は沈降物を、必要に応じて洗浄後、凍結乾燥等に供して乾燥菌体を得る。そして、得られた乾燥菌体に有機溶媒を加え、該有機溶媒中にカロテノイド色素を抽出し、必要に応じて該抽出操作を複数回繰り返す。次いで、減圧濃縮等の手法で溶媒を除去することで、カロテノイド色素が得られる。
有機溶媒は、一種を単独で使用しても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は目的に応じて任意に選択すれば良い。
また、これらの有機溶媒は、カロテノイド色素の精製にも使用できる。
<変異株を使用したカロテノイド色素の製造(1)>
MB2216(37.4g)、グルコース3g及び純水1Lを混合して培地を調製し、1Lメディアボトル中で前記培地を121℃にて20分間滅菌処理した。
次いで、前記培地を常温まで冷却した後、これをクリーンベンチ内で1L三角フラスコに200ml分注し、予め10mlのL型試験管中で培養した変異株10mlを、分注した前記培地に植菌した。植菌後の培地のpHは7.6〜7.8であった。
次いで、恒温振とう培養機バイオシェーカー(商品名、タイテック社製)を使用して、培養温度30℃、撹拌速度120rpmの条件で二日間、変異株を振とう培養した。
次いで、培養物を遠心分離して変異株を回収し、凍結乾燥させた後、乳鉢で破砕して、粉末状の乾燥菌体を得た。
そして、得られた乾燥菌体から、ジクロロメタン/メタノール(3/1、体積比)の混合溶媒を使用して、カロテノイド色素を抽出し、分離した。
分離したカロテノイド色素をメタノールに溶解させ、得られた溶液からフィルタを使用して夾雑物を除去し、HPLC分析用サンプルとした。また、分離したカロテノイド色素をアセトンに溶解させ、得られた溶液からフィルタを使用して夾雑物を除去し、吸光スペクトル分析用サンプルとした。そして、下記条件でHPLC分析及び吸光スペクトル分析を行った。HPLC分析時のカロテノイド色素のプロファイルにおけるピーク強度(面積値)の比から、各カロテノイド色素の含有量の比を算出し、吸光スペクトル分析時のデータから、全カロテノイド色素の含有量(カロテノイド色素の総含有量)を算出して、これらの値から、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
HPLC分析器:LC−VPシリーズ(島津製作所社製)
カラム:逆相カラムSymmetry C18(5μm、4.6×250mm)(Waters社製)
カラム温度:40℃
移動相:アセトニトリル/メタノール/2−プロパノール(45/3/2、体積比)の混合溶媒
移動相の流速:0.5mL/分
(吸光スペクトル分析)
分光光度計:UV−2400(島津製作所社製)
セル:1cm幅
<野生株を使用したカロテノイド色素の製造(1)>
変異株に代わり野生株を使用したこと以外は、実施例1と同様に粉末状の乾燥菌体を得て、カロテノイド色素を分離した。
その結果、得られた乾燥菌体1g中の全カロテノイド色素の含有量は0.162mg(0.016質量%)であり、乾燥菌体1g中のアスタキサンチンの含有量は0.01mg(0.001質量%)であった。そして、全カロテノイド色素中のアスタキサンチンの含有量は6.2質量%であった。
<変異株を使用したカロテノイド色素の製造(2)>
大豆タンパク質由来ペプチド:ハイニュートR(商品名、不二製油社製)10g、イースト1g、クエン酸鉄III0.1g、硫酸アンモニウム0.0016g、リン酸水素二ナトリウム0.008g、グルコース3g、人工海水37g及び純水1Lを混合して培地4Lを調製し、微生物培養装置BML−10PI(商品名、エイブル社製)の容量10Lの容器中で、前記培地を121℃にて20分間滅菌処理した。
次いで、前記容器を微生物培養装置の反応部にセットし、前記培地を常温まで冷却した後、クリーンベンチ内で予め1L三角フラスコ中で培養した変異株200mlを、前記培地に植菌した。植菌後の培地のpHは7.6〜7.8であった。
次いで、培養温度25℃、撹拌速度200rpm、通気量1vvm(一分間あたりの通気量(体積)が前記培養液(4.2L)に対して1倍)の条件で二日間、変異株を振とう培養した。
次いで、培養物を遠心分離して変異株を回収し、凍結乾燥させた後、乳鉢で破砕して、粉末状の乾燥菌体を得た。
そして、実施例1と同様の方法で、得られた乾燥菌体からカロテノイド色素を抽出して分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体1g中のカロテノイド色素の組成を表1に示す。
表1から明らかなように、全カロテノイド色素中、アスタキサンチンが最も含有量が高かった。
<変異株を使用したカロテノイド色素の製造(3)>
変異株の培養温度を25℃でなはく30℃としたこと以外は、実施例2と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体1g中のカロテノイド色素の組成を表2に示す。
表2から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。
<変異株を使用したカロテノイド色素の製造(4)>
変異株の培養温度を25℃でなはく35℃としたこと以外は、実施例2と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体1g中のカロテノイド色素の組成を表3に示す。
表3から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。
<変異株を使用したカロテノイド色素の製造(5)>
変異株の培養温度を25℃でなはく40℃としたこと以外は、実施例2と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体1g中のカロテノイド色素の組成を表4に示す。
表4から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。
<野生株を使用したカロテノイド色素の製造(2)>
変異株に代わり野生株を使用したこと、培養温度を25℃でなはく30℃としたこと以外は、実施例2と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体1g中のカロテノイド色素の組成を表5に示す。
一方、変異株を比較例2と同じ培養温度で培養した実施例3では、表2及び5から明らかなように、全カロテノイド色素の含有量は、比較例2の約39倍であった。
そして、カロテノイド色素の含有量は、すべての種類において実施例3の方が比較例2よりも顕著に高かった。比較例2で産生が認められたカロテノイド色素で比較すると、アドニキサンチンは約18倍、β−クリプトキサンチンは約31倍であった。
具体的には、アスタキサンチンは培養温度25℃で、エキネノンは培養温度30℃で、アドニキサンチン、ゼアキサンチン及びカンタキサンチンは培養温度35℃で、β−クリプトキサンチン及びβ−カロテンは培養温度40℃で、それぞれ最も含有量が高くなった。
このように、培養温度を適宜調節することで、所望のカロテノイド色素を効率良く得られた。
Claims (3)
- スフィンゴモナス(Sphingomonas)属JPCC MB0017−6株(受託番号:NITE BP−808)。
- 請求項1に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
- 請求項1に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
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